RU2788850C1 - Штамм бактерий Bacillus licheniformis 47018, обладающий способностью продуцировать термостабильную альфа-амилазу - Google Patents
Штамм бактерий Bacillus licheniformis 47018, обладающий способностью продуцировать термостабильную альфа-амилазу Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788850C1 RU2788850C1 RU2022127252A RU2022127252A RU2788850C1 RU 2788850 C1 RU2788850 C1 RU 2788850C1 RU 2022127252 A RU2022127252 A RU 2022127252A RU 2022127252 A RU2022127252 A RU 2022127252A RU 2788850 C1 RU2788850 C1 RU 2788850C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amylase
- activity
- alpha
- enzyme
- bacillus licheniformis
- Prior art date
Links
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 title claims abstract description 36
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 title claims abstract description 29
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 title abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 40
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 37
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 30
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 24
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 24
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 24
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 23
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 23
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 23
- 239000002609 media Substances 0.000 description 21
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 17
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 14
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000003625 amylolytic Effects 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 229940025131 Amylases Drugs 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 4
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-Dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 3
- 241000311115 Bacillus paralicheniformis ATCC 9945a Species 0.000 description 3
- -1 EDTA ions Chemical class 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 3
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001603 reducing Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HMFKFHLTUCJZJO-UHFFFAOYSA-N 2-{2-[3,4-bis(2-hydroxyethoxy)oxolan-2-yl]-2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy}ethyl dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCCOCC(OCCO)C1OCC(OCCO)C1OCCO HMFKFHLTUCJZJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 241001468256 Bacillus cohnii Species 0.000 description 2
- 241001249117 Bacillus mojavensis Species 0.000 description 2
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N PMSF Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 240000001016 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N n-butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFTUSFFYSRNFBA-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-5-nitrosalicylic acid Chemical compound NC1=CC([N+]([O-])=O)=CC(C(O)=O)=C1O JFTUSFFYSRNFBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229940075612 Bacillus cereus Drugs 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 241001619326 Cephalosporium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N Decane Chemical compound CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010048653 Enzyme inhibition Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N Iodine aqueous Chemical compound [K+].I[I-]I DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000235003 Saccharomycopsis Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 1
- 229910001420 alkaline earth metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005039 chemical industry Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N isooctane Chemical compound CC(C)CC(C)(C)C NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 229940094933 n-dodecane Drugs 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N o-xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bacillus licheniformis 47018, депонированный в ВКПМ под регистрационным номером ВКМВ В-14248 и являющийся продуцентом термостабильной альфа-амилазы. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента штаммов-продуцентов альфа-амилазы. 2 ил., 3 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в химической, пищевой, ферментационной, фармацевтической промышленности; в отраслях, связанных с переработкой крахмала.
Ферменты применяются в различных областях, таких как производство продуктов питания, корма для животных, моющие средства, косметика, пивоварение и текстильная промышленность, бумажная промышленность, фармацевтика, а также в качестве инструментов для научных исследований и разработок.
Амилазы относятся к одному из классов широко применяемых в настоящее время гидролитических ферментов. Амилаза катализирует расщепление крахмала до глюкозы и ее олигомеров. Гидролитические амилазы можно разделить на две широкие категории: эндоамилазы, которые гидролизуют внутреннюю часть молекулы крахмала, и экзоамилазы, которые последовательно расщепляют крахмал с нередуцирующих концов [1].
Альфа-амилаза обнаружена в растениях и животных, а также у микроорганизмов, принадлежащих к археям и бактериям. Однако в промышленности находят применение ферменты только грибного и бактериального происхождения. Бактерии видов Bacillus subtilis, В. licheniformis, В. amyloliquefaciens, В. cereus и В. megaterium и грибы, таких родов как: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Saccharomycopsis, Candida, Cephalosporium и Neurospora являются основными микроорганизмами, продуцирующими амилазу [2].
Амилазы имеют потенциальное применение в большом количестве промышленных процессов, таких как детергентная, пищевая, ферментационная и фармацевтическая промышленность. Термостабильные щелочные ферменты представляют особый интерес для применения в промышленности. Преимущества использования в промышленных процессах амилаз, устойчивых широком диапазоне показателя кислотно-основных свойств раствора (рН) и температуры, заключаются в снижении риска загрязнения, исходящего от мезофильных микроорганизмов, увеличении скорости диффузии и растворимости субстрата, активности в присутствии денатурирующего агента, а также в работоспособности в широком диапазоне температур и рН. Многие термофильные микроорганизмы обладают генами, кодирующими ферменты гидролиза крахмала, в своих геномах, даже несмотря на то, что они живут в средах, где крахмал встречается редко. Термофильные бактерии являются надежными источниками термостабильных амилаз [3].
Требования к оптимальному функционированию амилаз в основном касаются рН среды, устойчивости к окислению, устойчивости к хелатирующим агентам и температуре. Бактериальные альфа-амилазы имеют более высокие оптимальные температуры, по сравнению с альфа-амилазами, выделенными из грибов.
Бактерии Bacillus sp. широко используются для производства термостабильной альфа-амилазы для различных промышленных применений. Бактерии В. subtilis, В. stearothermophilus, В. licheniformis и В. amyloliquefaciens известны как хорошие продуценты термостабильной альфа-амилазы и они широко используются для коммерческого производства данного фермента для различных приложений.
Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий, обладающих способностью продуцировать альфа-амилазу, обладающую стабильностью при высоких температурах и в широком диапазоне показателя кислотно-основных свойств раствора (рН).
Известен штамм бактерий Bacillus sp. Ferdowsicous, продуцирующий ацидофильную альфа-амилазу с мол. массой 53 кДа, стабильной в диапазоне рН от 3,5 до 7,0 с оптимальной температурой для активности около 70°С. Активность фермента снижалась за счет ионов Zn2+ и EDTA, ингибировалась Hg2+, в то время как Ва2+, Fe2+, Na+, Mg2+, K+, Са2+, PMSF, Triton Х-100 и бета-меркаптоэтанол повышали ее активность примерно на 15% [4].
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis KIBGE-HAS, продуцирующий внеклеточную альфа-амилазу, обладающую относительно высокой термостабильностью (сохранял 62% своей активности при 70°С в течение 15 минут). Ионы металлов, таких как Mn2+, Са2+, Со2+, K+, Mg2+ и Fe3+, активировали фермент, в то время как Hg2+, Ва2+, Cu2+, Na+и Al3+ сильно ингибировали активность. В присутствии анионного детергента SDS и неионогенного детергента Triton Х-100, активность фермента была в 2,9 и 1,8 раза выше, чем в контроле, соответственно, а неионогенные детергенты Tween 20 и Tween 80 проявляли незначительное ингибирующее действие на активность фермента [5].
Известен штамм бактерий Bacillus tequilensisaa RG-01, который показал максимальную продукцию альфа-амилазы (8100 Ед/мл) в присутствии ионов крахмала, пептона и Са2+ при 55°С, рН 7,0 в течение 24 часов инкубации. Фермент был стабилен в присутствии н-додекана, изооктана, н-декана, ксилола, толуола, н-гексана, н-бутанола и циклогексана, соответственно. Присутствие бензола, метанола и этанола незначительно снижало стабильность амилазы соответственно. Фермент продемонстрировал 100% активность при 55°С и рН 7,0 с устойчивостью 119% и 127% при 55°С и рН 7,0, соответственно. Фермент также был стабильным в присутствии детергентов SDS, Tween 40, Tween 60 и Tween 80 (1%). Только ТритонХ-100 показал умеренное ингибирующее действие (5%) на активность амилазы [6].
Известен штамм бактерий Bacillus mojavensis SA, продуцирующий термостабильную альфа-амилазу, которая продемонстрировала оптимум значений рН и температуры (9,0 и 55°С). Фермент показал высокую стабильность в широком диапазоне рН и температуры. Кроме того, неочищенный фермент был относительно стабилен по отношению к неионогенным (Tween 20, Tween 80 и Тритон Х-100) и анионным (SDS) поверхностно-активным веществам, а также к окислителям. Также, неочищенный фермент показал отличную стабильность по отношению к различным твердым и жидким моющим средствам [7].
Известен штамм алкалифильных бактерий Bacillus cereus SP-CH11, выделенный из отложений озера Chilika Lake, Odisha, который продемонстрировал интенсивный рост и продукцию альфа-амилазы при рН 10. Очищенный фермент альфа-амилаза АА11 был высокостабильным при рН 9.0, сохраняя при этом 88-100% функциональной жизнеспособности в диапазоне температур от 35-65°С. Фермент был стабильным с порошкообразными и жидкими детергентами [8].
Известен штамм бактерий Bacillus cohnii US 147, продуцирующий альфа-амилазу, проявляющую активность при кислом и щелочном рН и проявляющую максимальную активность в отношении крахмала при рН 9 и 70°С. Фермент был стабилен при рН 9 в течение 72 часов и сохранял половину своей активности после инкубации при 70°С в течение 150 минут. Частичное ингибирование фермента (15%, 25%, 23%, 20% и 22%) было получено с помощью 1 мМ SDS, 1 мМ NaBO3, 1 мМ Н2О2, 1 мМ Zn2+ и 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), соответственно. Амилаза восстанавливала свою первоначальную активность при добавлении 10 мМ Са2+ к 5 мМ EDTA [9].
Известен штамм Bacillus licheniformis АТСС9945а, продуцирующий высокоэффективную альфа-амилазу, расщепляющую сырой крахмал. Очищенный фермент имел оптимальный рН 6,5 и оптимальную температуру 90°С. Очищенная альфа-амилаза в присутствии CaCl2 сохраняла 55% своей активности через 6 ч инкубации при 70°С, ионы Ni2+ и Са2+ слегка стимулировали, a Hg2+ полностью ингибировала активность альфа-амилазы. В отличие от термостабильной альфа-амилазы, термолабильная альфа-амилаза Bacillus licheniformis АТСС9945а активна и стабильна при температурах выше 90°С. Кроме того, реакционная способность термолабильной альфа-амилазы намного меньше зависит от присутствия ионов Са2+ и от применяемого рН, чем ее термостабильный аналог [10].
Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм Bacillus sp. A3-15, выделенный из образцов компоста, который продуцирует термостабильную альфа-амилазу. Фермент частичной очистки показал оптимальную активность при рН 11,0 и температуре 70°С. Фермент был высокоактивен (95%) в щелочном диапазоне рН (10,0-11,5), и был почти полностью активен при температурах до 100°С. Активность фермента усиливалась в присутствии 5 мМ CaCl2 (130%) и ингибировалась 5 мМ ZnCl2, NaCl, Na-сульфидом, EDTA, PMSF (3 мМ), мочевиной (8М) и SDS (1%). Фермент был стабильным приблизительно на 70% при рН 10,0-11,0 и 60°С в течение 24 часов [11].
Недостатком этого штамма является то, что продуцируемый им фермент ингибируется ионами щелочноземельных металлов, так, например, при 5 мМ концентрации хлорида натрия данный фермент уже частично ингибируется.
Задачей изобретения является получение бактериального штамма -продуцента металл независимой высокоактивной альфа-амилазы, стабильной в широком диапазоне температуры (30-90°С) и широком диапазоне значений рН (6,5-11), устойчивой к присутствию в среде высоких концентраций ионов металлов, за исключением Fe, Mn и Mg.
Технический результат: расширение ассортимента штаммов - продуцентов альфа-амилазы, устойчивой к присутствию в среде высоких концентраций ионов металлов, стабильной в широком диапазоне температуры и значений рН среды, а также упрощение условий культивирования штамма.
Поставленная задача достигается получением умеренно термофильного штамма Bacillus licheniformis 47018, обладающего способностью продуцировать металл независимую высокоактивную альфа-амилазу, устойчивую к присутствию в среде высоких концентраций ионов металлов, стабильную в широком диапазоне температуры и значений рН среды.
Штамм бактерий Bacillus licheniformis 47018 выделен из природного материала - образца воды и грунта источника Термофильный на Восточном термальном поле кальдеры вулкана Узон, Камчатка, в результате целенаправленного поиска.
Полученный штамм бактерий Bacillus licheniformis 47018 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером В-14248.
Штамм Bacillus licheniformis 47018 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки: грамположительные палочки 1×3-4 мкм, растут на средах LB-бульон, LB-агар, среде Пфеннига и других минеральных средах с крахмалом. При росте на агаризованной среде LB образует круглые колонии кремового цвета. Профиль колоний выпуклый, размеры варьируют от 4 до 5 мм.
Физиолого-биохимические признаки: аэроб или факультативный анаэроб, термотолерантен. Оптимальная температура роста 55°С. Растет в пределах рН среды от 6.0 до 10.0 с оптимумом 7.0. Штамм характеризуется способностью использовать крахмал, пептон и др.
Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим действием.
Штамм является непатогенным и не включен в списки, приведенные в санитарных правилах СП 1.3.2322-08; штамм не несет опасных генетических конструкций.
Штамм идентифицирован на основании анализа последовательности полного генома.
Хранение штамма осуществляют на среде LB или Пфеннига с глицерином при температуре -70°С.
Для культивирования штамма применяют среды следующего состава: Среда LB (г/л): хлорид натрия - (5.0) 10.0; триптон - 10.0; дрожжевой экстракт - 5.0.
Среда Пфеннига (г/л): KH2PO4 - 0.5; NH4Cl - 0.5; MgSO4 х 7H2O - 0.5; KCl - 0.5; NaCl - 0.5; CaCl2 х 2H2O - 0.05; NaHCO3 - 1.5, крахмал - 1.5.
Активность фермента, устойчивость фермента к ионам металлов, термо- и рН-стабильность, температурный оптимум и оптимум рН доказаны экспериментальными методами.
Активность фермента определялась с использованием крахмала в качестве субстрата методом Фишера-Штейна [12].
Предлагаемый штамм бактерий Bacillus licheniformis 47018, обладающий амилолитическими свойствами, имеет ряд преимуществ перед известными штаммами, заключающихся в следующем.
1. Предлагаемый штамм продуцирует металл независимую высоко активную альфа-амилазу, пригодную к использованию в химической промышленности и отраслях, связанных с переработкой крахмала.
2. Штамм бактерий Bacillus licheniformis 47018 продуцирует альфа-амилазу, стабильную в широком диапазоне температуры (30-90°С) и рН среды (6,5-11), устойчивую к присутствию в среде высоких концентраций ионов металлов, за исключением (Fe, Mn и Mg), что позволяет применять данный штамм и фермент в различных областях, таких как производство продуктов питания, корма для животных, моющие средства, косметика, пивоварение и текстильная промышленность, бумажная промышленность, фармацевтика, а также в качестве инструментов для научных исследований и разработок.
3. Штамм Bacillus licheniformis 47018 является термотолерантным и алкалифильным. Культура демонстрирует интенсивный рост в диапазоне температур: от 32 до 60°С и рН 7-10, что позволяет использовать данный штамм в производстве.
4. Штамм бактерий Bacillus licheniformis 47018 не требует сложных условий культивирования, поскольку потребляет различные, в том числе крахмалсодержащие субстраты.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые, и фермент, выделенный из него, характеризуется уникальным комплексом свойств, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Продуктивность штамма Bacillus licheniformis 47018 в зависимости от стадии роста культуры.
От 100 мл жидкой культуры Bacillus licheniformis 47018, выращенной на среде Пфеннига с добавлением 1% крахмала, отбирали 1,5 мл суспензии, осаждали клетки центрифугированием при 3000 g. Анализ содержания белка в культуральной жидкости определяли по Брэдфорду [13] с использованием набора «Quick Start Bradford 1xDye Reagent», согласно инструкции производителя.
Результаты измерения содержания белка в культуральной жидкости приведены в Таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что на 2-е сутки культивирования содержание белка в культуральной жидкости резко возрастает и далее продолжает увеличиваться, достигая максимума на 5-е сутки.
Пример 2.
Оценка амилолитической активности штамма Bacillus licheniformis 47018.
Для выявления амилолитической активности использовали плотную питательную среду - картофельный агар. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом на чашки Петри с картофельным агаром и инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение суток. По окончании инкубирования выросшие культуры в чашках заливали 5 мл раствора Люголя и в течение 5 мин наблюдали за появлением прозрачных зон вокруг посевов. Среда, содержащая крахмал, окрашивалась в синий цвет.
В результате определения амилолитической активности Bacillus licheniformis 47018 установлена зона гидролиза крахмала - 8-12 мм. Штамм Bacillus licheniformis 47018 обладает ярко выраженными амилолитическими свойствами.
Пример 3.
Оценка активности альфа-амилазы штамма Bacillus licheniformis 47018.
Амилазную активность фермента определяли в культуральной жидкости (КЖ) Bacillus licheniformis 47018 по стандартным протоколам на спектрофотометре и выражали в МЕ/мг белка. Активность амилазы определяли путем измерения высвобождения редуцирующего сахара из растворимого крахмала. Ферментативную реакцию проводили по Фишеру-Штейну в течение 5 минут [12]. Оптическую плотность (OD) полученного окрашенного раствора измеряли при 546 нм по отношению к контролю. Анализ ферментов во всех случаях проводили в трех повторах и результаты являются средними по трем определениям. Калибровка проведена по мальтозе. Одна единица ферментативной активности определяется как количество фермента, необходимое для высвобождения одного мкмоль мальтозы в минуту в условиях анализа. Концентрацию белка в КЖ определяли по Брэдфорду с использованием набора «Quick Start Bradford 1xDye Reagent», согласно инструкции производителя [13].
Сущность метода заключается в восстановлении 3,5-динитросалициловой кислоты (ДНСК) до 3-амино-5-нитросалициловой кислоты, обладающей красно-оранжевой окраской, интенсивность которой определяют колориметрически при длине волны 546 нм. Для данной методики отбирался супернатант, полученный путем центрифугирования (центрифугирование проводили при 4000 g в течение 10 минут при 5°С) клеточной культуры бактерий. Полученный супернатант в дальнейшем смешивался с 1% раствором крахмала в соответствующем буфере и инкубировался в течении 5-20 минут, после чего к реакционной смеси добавлялось два объема 1% ДНСК. Полученная смесь в дальнейшем прогревалась при 95°С в течение 10 мин, после чего смесь охлаждалась до комнатной температуры.
При использовании спектрофотометра ПЭ-5400УФ оптическую плотность регистрировали в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм против контрольных проб на реактивы и субстрат.
Результаты определения ферментативной активности амилазы в культуральной жидкости (КЖ) штамма Bacillus licheniformis 47018 представлены в таблице 2.
Таким образом, активность амилазы Bacillus licheniformis 47018 составила 2472 МЕ/мг белка в КЖ, и 185000 МЕ/мг белка после хроматографической очистки на DEAE-целлюлозе.
Пример 4.
Влияние ионов металлов на ферментативную активность амилазы Bacillus licheniformis 47018
Для определения влияния ионов металлов на активность амилазы штамма Bacillus licheniformis 47018 был использован трис-глициновый буфер рН 9,4. Раствор субстрата - 1% крахмал в 50 мМ трис-глициновом буфере рН 9,4. Ферментативную реакцию по Фишеру-Штейну проводили при 60°С в течение 40 минут. Для оценки влияния ионов использовали 12,5 мМ (концентрация в реакционной среде) растворы соответствующих солей. Растворы солей изготавливались в 50 мМ трис-глициновом буфере рН 9,4.
Влияние ионов металлов в концентрации 12,5 мМ (концентрация в реакционной среде) на активность амилазы приведено в таблице 3.
Активность фермента возрастает в присутствии K, Na и Ni. Полностью подавляют активность альфа-амилазы ионы Fe, Mn и Mg.
Пример 5.
Определение зависимости активности альфа-амилазы штамма Bacillus licheniformis 47018 от рН среды.
Рабочий диапазон рН альфа-амилазы Bacillus licheniformis 47018 определяли при температуре 30°С. Для определения активности фермента при различных значениях рН среды использовали соответствующие буферные растворы.
Для приготовления субстрата для определения рН оптимума фермента 2% водный раствор крахмала разбавлялся в 2 раза соответствующим буферным раствором с необходимым значением рН. При оценке рабочего диапазона рН использовались следующие буферные растворы: для рН 6,0-7,0 использовали 50 мМ калий-фосфатный буферный раствор, для рН 7,5-11,0 использовали 50 мМ трис-глициновый буферный раствор. Реакционную смесь выдерживали при 30°С в течение 1 часа. Все анализы были выполнены, по крайней мере, в трех повторах, и результаты были представлены в процентах относительной активности (фиг. 1). Процедура анализа проводилась следующим образом:
250 мкл субстрата в соответствующем буферном растворе прогревался в течение 5 минут при 50°С в водяном термостате с перемешиванием, далее к прогретому раствору субстрата добавлялся равный объем буферного раствора ферментного препарата (в минус контроль добавляли равный объем буферного раствора не содержащего фермента). Ферментативную реакцию проводили в течение 10 минут при 50°С, реакцию останавливали добавлением 750 мкл 1% раствора ДНСК.
Опытные и контрольные пробы выдерживали до проявления окраски в течение 10 минут на кипящей водяной бане. Оптическую плотность измеряли при λ=546 нм.
На фиг. 1 представлена зависимость активности амилазы от рН среды реакционной смеси при 30°С. Максимальную активность в эксперименте принимали за 100%, остальные результаты выражали в процентах от максимального значения. Максимальные значения амилолитической активности фермента наблюдались в диапазоне рН 8,9-9,4.
Пример 6.
Определение температурного диапазона активности альфа-амилазы штамма Bacillus licheniformis 47018.
Для определения температурного диапазона активности амилазы штамма Bacillus licheniformis 47018 в качестве субстрата использовали 1% раствор крахмала в 50 мМ трис-HCl буфере с рН 8,5 и 50 мМ трис-глициновом буфере рН 9,5.
На фиг. 2 представлена зависимость активности фермента при разных рН в зависимости от температурного режима хода ферментативной реакции. Максимальную активность в эксперименте принимали за 100%, остальные результаты выражали в процентах от максимального значения.
При обоих значениях рН фермент сохраняет более 50% активности в температурном диапазоне от 40 до 80°С. При температуре 90°С фермент сохраняет 50% активности при рН 9,5 и 40% при рН 8,5. При рН 8,5 при 30°С амилаза теряет 60% активности, в то время как при рН 9,5 60% активности фермента сохраняется. При обоих значениях рН фермент имеет максимальную активность при 60°С.
Таким образом, получен штамм Bacillus licheniformis 47018, продуцирующий металл независимую высокоактивную альфа-амилазу, устойчивую к присутствию в среде высоких концентраций ионов металлов, стабильную в широком диапазоне температуры (30-90°С) и значений рН среды (6,5-11).
Источники информации
1. Rani Gupta, Paresh Gigras, Harapriya Mohapatra, Vineet Kumar Goswami, Bhavna Chauhan, Microbial O±-amylases: a biotechnological perspective // Process Biochemistry, Volume 38, Issue 11, 2003, P. 1599-1616.
2. Marc J.E.C van der Maarel, Bart van der Veen, Joost C.M Uitdehaag, Hans Leemhuis, Dijkhuizen L. Properties and applications of starch-converting enzymes of the alpha-amylase family // Journal of Biotechnology, Volume 94, Issue 2,2002, P. 137-155.
3. Irfan M., Nadeem M., Syed Q., Baig S. Production of thermo-stable α-amylase from Bacillus sp. in solid state fermentation // Journal of Applied Science Research. 2011; 7(5):607-617.
4. Asoodeh A., Chamani J., Lagzian M. A novel thermostable, acidophilic alpha-amylase from a new thermophilic "Bacillus sp. Ferdowsicous" isolated from Ferdows hot mineral spring in Iran: Purification and biochemical characterization // Int. J. Biol. Macromol. - 2010. - Vol. 46, №3. - P. 289-97
5. Bano S., Ul Qader S.A., Aman A., Azhar A. Partial purification and some properties of alpha-amylase from Bacillus subtilis KIBGE-HAS // Indian J. Biochem. Biophys. - 2009. - Vol. 46, №5. - P. 401-404
6. Tiwari S., Shukla N., Mishra P., Gaur R. Enhanced production and characterization of a solvent stable amylase from solvent tolerant Bacillus tequilensis RG-01: thermostable and surfactant resistant // Scientific World Journal - 2014:972763
7. Hammami A., Fakhfakh N., Abdelhedi O., Nasri M., Bayoudh A. Proteolytic and amylolytic enzymes from a newly isolated Bacillus mojavensis SA: Characterization and applications as laundry detergent additive and in leather processing // Int. J. Biol. Macromol. - 2018. - Vol. 108. - P. 56-68
8. Priyadarshini S., Pradhan S.K., Ray P. Production, characterization and application of thermostable, alkaline α-amylase (AA11) from Bacillus cereus strain SP-CH11 isolated from Chilika Lake // Int. J. Biol. Macromol. - 2020. - Vol. 145. - P. 804-812
9. Ghorbel R.E., Maktouf S., Massoud E.B., Bejar S., Chaabouni S.E. New thermostable amylase from Bacillus cohnii US147 with a broad pH applicability // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2009. - Vol. 157, №1. - P. 50-60
10. Bozic N., Ruiz J., Lopez-Santin J., Vujcic V. Production and properties of the highly efficient raw starch digesting α-amylase from a Bacillus licheniformis ATCC9945a // Biochem. Eng. J. - 2011. - Vol. 53, №2. - P. 203-209
11. Arikan B. Highly thermostable, thermophilic, alkaline, SDS and chelator resistant amylase from a thermophilic Bacillus sp. isolate A3-15 // Bioresour. Technol. - 2008. - Vol. 99, №8. - P. 3071-6
12. Fischer E.H., Stein E.A. (1960) The Enzymes, 2nd ed., Boyer, P.D., Lardy, H., Myrback, K. (eds.), Vol. 4, pp. 313-343, Academic Press, New York
13. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal Biochem. 1976 May 7; 72:248-54.
Claims (1)
- Штамм Bacillus licheniformis 47018, депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-14248, обладающий способностью продуцировать термостабильную альфа-амилазу.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2788850C1 true RU2788850C1 (ru) | 2023-01-25 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2177995C2 (ru) * | 1998-02-05 | 2002-01-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов |
| RU2324734C1 (ru) * | 2006-09-15 | 2008-05-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis вкм в-2396 d - продуцент термостабильной альфа-амилазы |
| CN101514327A (zh) * | 2008-02-19 | 2009-08-26 | 无锡德冠生物科技有限公司 | 一种耐酸高温淀粉酶菌株及其生产耐酸高温淀粉酶的方法 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2177995C2 (ru) * | 1998-02-05 | 2002-01-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов |
| RU2324734C1 (ru) * | 2006-09-15 | 2008-05-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis вкм в-2396 d - продуцент термостабильной альфа-амилазы |
| CN101514327A (zh) * | 2008-02-19 | 2009-08-26 | 无锡德冠生物科技有限公司 | 一种耐酸高温淀粉酶菌株及其生产耐酸高温淀粉酶的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ARIKAN B. Highly thermostable, thermophilic, alkaline, SDS and chelator resistant amylase from a thermophilic Bacillus sp. isolate A3-15. Bioresour Technol. 2008 May; 99(8):3071-6. doi: 10.1016/j.biortech.2007.06.019. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chakraborty et al. | Isolation and characterization of novel α-amylase from marine Streptomyces sp. D1 | |
| Sahay et al. | Study on the potential of cold-active lipases from psychrotrophic fungi for detergent formulation | |
| Chakraborty et al. | Characterization and stability studies on surfactant, detergent and oxidant stable α-amylase from marine haloalkaliphilic Saccharopolyspora sp. A9 | |
| Kanthi Kiran et al. | Production of surfactant and detergent-stable, halophilic, and alkalitolerant alpha-amylase by a moderately halophilic Bacillus sp. strain TSCVKK | |
| Aguilar et al. | Purification and characterization of an extracellular α-amylase produced by Lactobacillus manihotivorans LMG 18010T, an amylolytic lactic acid bacterium | |
| Asgher et al. | A thermostable α-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing | |
| Arikan | Highly thermostable, thermophilic, alkaline, SDS and chelator resistant amylase from a thermophilic Bacillus sp. isolate A3-15 | |
| Amoozegar et al. | Production of an extracellular thermohalophilic lipase from a moderately halophilic bacterium, Salinivibrio sp. strain SA‐2 | |
| Laxman et al. | Optimization and scale up of production of alkaline protease from Conidiobolus coronatus | |
| Burhan et al. | Enzymatic properties of a novel thermostable, thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic Bacillus sp. isolate ANT-6 | |
| Salihi et al. | Production and biochemical characterization of an alkaline protease from Aspergillus oryzae CH93 | |
| Li et al. | Characterization of an organic solvent-tolerant α-amylase from a halophilic isolate, Thalassobacillus sp. LY18 | |
| Yassin et al. | Screening and Characterization of Thermostable Amylase‐Producing Bacteria Isolated from Soil Samples of Afdera, Afar Region, and Molecular Detection of Amylase‐Coding Gene | |
| Patel et al. | Production of extracellular halo-alkaline protease from a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus sp. isolated from seawater in Western India | |
| Singh et al. | Partial purification and characterization of a heat stable α-amylase from a thermophilic actinobacteria, Streptomyces sp. MSC702 | |
| Satheesh Kumar et al. | Purification and characterization of highly thermostable α-amylase from thermophilic Alicyclobacillus acidocaldarius | |
| Wang et al. | Characterization and optimization of amylase production in WangLB, a high amylase-producing strain of Bacillus | |
| Marlida et al. | Purification and characterization of sago starch-degrading glucoamylase from Acremonium sp. endophytic fungus | |
| Abel-Nabey et al. | Production, optimization and characterization of extracellular amylase from halophilic Bacillus lichineformis AH214 | |
| Sindhu et al. | Optimization of process parameters for the production of alkaline protease from Penicillium godlewskii SBSS 25 and its application in detergent industry | |
| Al-Qodah | Determination of kinetic parameters of∝-amylase producing thermophile Bacillus sphaericus | |
| Sayem et al. | Effect of temperature, pH and metal ions on the activity and stability of alkaline protease from novel Bacillus licheniformis MZK03 | |
| Oziengbe et al. | Production of a thermostable α-amylase and its assay using Bacillus licheniformis isolated from excavated land sites in Ibadan, Nigeria | |
| Hasan et al. | Influence of culture conditions on lipase production by Bacillus sp. FH5 | |
| Mathew et al. | Isolation and characterization of alpha amylase isolated from a hot water spring in Sri Lanka |