RU2788456C2 - Highly effective encapsulation of hydrophilic compounds in unilamellar liposomes - Google Patents
Highly effective encapsulation of hydrophilic compounds in unilamellar liposomes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788456C2 RU2788456C2 RU2019130015A RU2019130015A RU2788456C2 RU 2788456 C2 RU2788456 C2 RU 2788456C2 RU 2019130015 A RU2019130015 A RU 2019130015A RU 2019130015 A RU2019130015 A RU 2019130015A RU 2788456 C2 RU2788456 C2 RU 2788456C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hydrophilic
- paragraphs
- compound
- composition
- lipid solution
- Prior art date
Links
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 title claims abstract description 86
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title abstract description 195
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 84
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 58
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 claims abstract description 54
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 52
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 49
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000000249 desinfective Effects 0.000 claims abstract description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 92
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 68
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 35
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- 229920002521 Macromolecule Polymers 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Chemical class 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 claims description 10
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 claims description 8
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 8
- 229940067631 Phospholipids Drugs 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 6
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 5
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002357 osmotic agent Substances 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical class 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000007842 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 4
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 claims description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920005615 natural polymer Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000002335 preservative Effects 0.000 claims description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 229920001059 synthetic polymer Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 abstract description 16
- 239000002778 food additive Substances 0.000 abstract 2
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 abstract 2
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 31
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 15
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 13
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 13
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 12
- 229940055729 Papain Drugs 0.000 description 11
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 11
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 10
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 9
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 8
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 7
- 239000000727 fraction Substances 0.000 description 7
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 6
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 3
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 2
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 2
- VAJLRIOJDADNAT-UHFFFAOYSA-N Chlorin E6 Chemical compound N1C(C=C2C(C(CCC(O)=O)C(=N2)C(CC(O)=O)=C2C(=C(C)C(=C3)N2)C(O)=O)C)=C(C)C(C=C)=C1C=C1C(C)=C(CC)C3=N1 VAJLRIOJDADNAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036698 Distribution coefficient Effects 0.000 description 2
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 2
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 2
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 2
- 150000003700 vitamin C derivatives Chemical class 0.000 description 2
- MCCACAIVAXEFAL-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(2,4-dichlorophenyl)-2-[(2,4-dichlorophenyl)methoxy]ethyl]imidazole;nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O.ClC1=CC(Cl)=CC=C1COC(C=1C(=CC(Cl)=CC=1)Cl)CN1C=NC=C1 MCCACAIVAXEFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWVJHCQQUFDPLU-YEUCEMRASA-N 2,3-bis[[(Z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KWVJHCQQUFDPLU-YEUCEMRASA-N 0.000 description 1
- SHCCKWGIFIPGNJ-NSUCVBPYSA-N 2-aminoethyl [(2R)-2,3-bis[(Z)-octadec-9-enoxy]propyl] hydrogen phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SHCCKWGIFIPGNJ-NSUCVBPYSA-N 0.000 description 1
- 208000007502 Anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000036912 Bioavailability Effects 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101700050656 FH10 Proteins 0.000 description 1
- 101700021071 FH15 Proteins 0.000 description 1
- 101700004883 FH20 Proteins 0.000 description 1
- LAZPBGZRMVRFKY-HNCPQSOCSA-N Levamisole hydrochloride Chemical compound Cl.C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 LAZPBGZRMVRFKY-HNCPQSOCSA-N 0.000 description 1
- 229960005040 Miconazole Nitrate Drugs 0.000 description 1
- 108020004459 Small Interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000036335 Tissue distribution Effects 0.000 description 1
- 229960003636 Vidarabine Drugs 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 229940046009 Vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant Effects 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000035514 bioavailability Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- KYKAJFCTULSVSH-UHFFFAOYSA-N chloro(fluoro)methane Chemical compound F[C]Cl KYKAJFCTULSVSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion media Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 235000007144 ferric diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011706 ferric diphosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- CADNYOZXMIKYPR-UHFFFAOYSA-B iron(3+);phosphonato phosphate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O CADNYOZXMIKYPR-UHFFFAOYSA-B 0.000 description 1
- 230000000622 irritating Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- -1 lipid compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical compound COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- HGASFNYMVGEKTF-UHFFFAOYSA-N octan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCCCCCO HGASFNYMVGEKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- ZTHWFVSEMLMLKT-CAMOTBBTSA-N vidarabine monohydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZTHWFVSEMLMLKT-CAMOTBBTSA-N 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 150000003712 vitamin E derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Настоящее изобретение относится к области фармацевтической технологии и в частности к высокоэффективной инкапсуляции в липосомы гидрофильных веществ. Конкретнее, настоящее изобретение относится к униламеллярным липосомам (УЛ) с одним липидным бислоем, окружающим гидрофильное пространство, причем указанное гидрофильное пространство содержит по меньшей мере одно гидрофильное соединение, и к жидкой композиции, содержащей такие униламеллярные липосомы. Также настоящее изобретение относится к способу инкапсуляции гидрофильных соединений в униламеллярные липосомы (УЛ) и к применению указанных УЛ при производстве лекарственных средств, косметических продуктов, пищевых добавок или дезинфицирующих средств.The present invention relates to the field of pharmaceutical technology and in particular to the highly efficient encapsulation of hydrophilic substances into liposomes. More specifically, the present invention relates to unilamellar liposomes (UL) with a single lipid bilayer surrounding a hydrophilic space, said hydrophilic space containing at least one hydrophilic compound, and to a liquid composition containing such unilamellar liposomes. The present invention also relates to a method for encapsulating hydrophilic compounds in unilamellar liposomes (ULs) and to the use of said ULs in the manufacture of medicines, cosmetics, nutritional supplements or disinfectants.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Липосомы представляют собой маленькиевезикулы, имеющие мембрану, состоящую из липидного бислоя - аналогично клеточной мембране - окружающего гидрофильное пространство. Характерным признаком является амфифильный характер молекул мембраны, которые обладают гидрофильной головой и гидрофобным хвостом. В мембране липосом амфифильные молекулы расположены таким образом, что гидрофильные части находятся в контакте с водной средой внутри и снаружи липосомы, в то время как гидрофобные части расположены внутри двойного слоя. Молекулы мембраны соединены между собой посредством нековалентных взаимодействий. Липосомы имеют один или более двойных липидных слоев и могут иметь размер от 25 нм до 100 мкм. Форма и размер везикул зависят, в числе прочего, от свойств окружающей водной фазы, точного химического состава мембраны и способа их получения.Liposomes are small vesicles having a membrane consisting of a lipid bilayer - similar to a cell membrane - surrounding a hydrophilic space. A characteristic feature is the amphiphilic nature of the membrane molecules, which have a hydrophilic head and a hydrophobic tail. In the membrane of liposomes, the amphiphilic molecules are arranged in such a way that the hydrophilic parts are in contact with the aqueous medium inside and outside the liposome, while the hydrophobic parts are located inside the bilayer. Membrane molecules are interconnected through non-covalent interactions. Liposomes have one or more lipid bilayers and can range in size from 25 nm to 100 µm. The shape and size of the vesicles depend, among other things, on the properties of the surrounding aqueous phase, the precise chemical composition of the membrane, and how they were prepared.
Липосомы широко применяют в фармакологических и косметических составах, например, для увеличения растворимости амфифильных и гидрофобных соединений, что приводит к увеличению их биодоступности (см., например, Kshirsagar, N.A., Pandya, S.K., Kirodian, В.G., and Sanath, S. (2005) Liposomal drug delivery system from laboratory to clinic, J. Postgrad. Med. 51, S5-S15; или Kalhapure, R.S., Suleman, N., Mocktar, C, Seedat, N., and Govender, T. (2015) Nanoengineered Drug Delivery Systems for Enhancing Antibiotic Therapy, J Pharm Sci-Us 104, 872-905). Использование липосом в качестве систем доставки лекарственных средств способствует целевой и избирательной транспортировке указанного лекарственного средства в соответствующие места организма человека. Это уменьшает побочные действия лекарственного средства в составе липосом и увеличивает эффективность и широту терапии, поскольку позволяет вводить меньшие дозы.Liposomes are widely used in pharmacological and cosmetic formulations, for example, to increase the solubility of amphiphilic and hydrophobic compounds, resulting in an increase in their bioavailability (see, for example, Kshirsagar, N.A., Pandya, S.K., Kirodian, B.G., and Sanath, S (2005) Liposomal drug delivery system from laboratory to clinic, J. Postgrad Med. 51, S5-S15 or Kalhapure, R.S., Suleman, N., Mocktar, C, Seedat, N., and Govender, T. ( 2015) Nanoengineered Drug Delivery Systems for Enhancing Antibiotic Therapy, J Pharm Sci-Us 104, 872-905). The use of liposomes as drug delivery systems promotes targeted and selective transport of said drug to appropriate sites in the human body. This reduces the side effects of the drug in the liposomes and increases the effectiveness and breadth of therapy, because it allows you to enter smaller doses.
По существу, липосомные составы пригодны для большинства соединений благодаря специальным физико-химическим характеристикам липосомы. В водной липосомной дисперсии вещества с высоким коэффициентом распределения обнаруживаются только внутри липидного бислоя, независимо от их структуры или от размера липосом, в то время как вещества с низким коэффициентом распределения могут как находиться в дисперсии или разбавленном водном растворе дисперсии, так и быть инкапсулированными в гидрофильном пространстве липосом.As such, liposome formulations are suitable for most compounds due to the special physicochemical characteristics of the liposome. In an aqueous liposomal dispersion, substances with a high distribution coefficient are found only within the lipid bilayer, regardless of their structure or the size of the liposomes, while substances with a low distribution coefficient can either be in the dispersion or a dilute aqueous solution of the dispersion, or be encapsulated in a hydrophilic space of liposomes.
Тем не менее, в настоящее время фактическое терапевтическое применение заключенных в липосомы гидрофильных соединений незначительно по причине отсутствия универсального способа высокоэффективной инкапсуляции гидрофильных веществ в липосомы. Пассивная инкапсуляция, включающая получение липосом путем гидратации сухой липидной пленки посредством встряхивания в водном растворе, содержащем инкапсулируемое гидрофильное соединение, приводит к очень низкой эффективности инкапсуляции, часто не превышающей нескольких процентов. Кроме того, липосомы, полученные указанным способом, представляют собой мультиламеллярные везикулы (МЛВ), сильно варьирующиеся по размеру и форме (см., например, WO 01/13887, ЕР 1565164). Способ пассивной инкапсуляции можно модифицировать, подвергая дисперсию гидратированного липида гомогенизации (см., например, ЕР 0776194 A1, PL 396706 A1, PL 399298 A1, PL 388134 А1 и PL 399592 А1) или ультразвуковому воздействию (см., например, PL 389430 А1; или Watwe, R. М., и Bellare, J. R. (1995) Manufacture of Liposomes - a Review, Curr Sci India 68, 715-724) для получения суспензий с везикулами меньшего размера и более однородных по размерам. Тем не менее, указанные методики обычно приводят к получению суспензий низкой вязкости, в которых водная дисперсионная среда недостаточно структурирована липидными структурами, что, в свою очередь, приводит к низкой эффективности инкапсуляции. Обычно только около 5-15% от общего количества введенного в липидную пленку лекарственного средства инкапсулируется в везикулы. Кроме того, высокая энергия, применяемая во время гомогенизации или ультразвукового воздействия, вызывает нестабильность суспензии липосом, обусловленную окислением, и увеличивает риск функционального разложения чувствительных активных веществ, таких как белки или супрамолекулярные ассоциаты.However, at present, the actual therapeutic use of liposome-encapsulated hydrophilic compounds is negligible due to the lack of a universal method for highly efficient encapsulation of hydrophilic substances in liposomes. Passive encapsulation, involving the production of liposomes by hydration of a dry lipid film by agitation in an aqueous solution containing the hydrophilic compound to be encapsulated, results in very low encapsulation efficiency, often not exceeding a few percent. In addition, the liposomes obtained by this method are multilamellar vesicles (MLV), which vary greatly in size and shape (see, for example, WO 01/13887, EP 1565164). The passive encapsulation method can be modified by subjecting the hydrated lipid dispersion to homogenization (see, for example, EP 0776194 A1, PL 396706 A1, PL 399298 A1, PL 388134 A1 and PL 399592 A1) or ultrasonic treatment (see, for example, PL 389430 A1; or Watwe, R. M. and Bellare, J. R. (1995) Manufacture of Liposomes - a Review, Curr Sci India 68, 715-724) to obtain smaller and more uniform vesicle suspensions. However, these techniques usually result in low viscosity suspensions in which the aqueous dispersion medium is not sufficiently structured with lipid structures, which in turn leads to low encapsulation efficiency. Typically, only about 5-15% of the total amount of drug introduced into the lipid film is encapsulated in vesicles. In addition, the high energy applied during homogenization or sonication causes instability of the liposome suspension due to oxidation and increases the risk of functional degradation of sensitive active substances such as proteins or supramolecular associates.
В другой группе методик инкапсуляции гидрофильных соединений в липосомы применяют смесь веществ с различной полярностью. Тем не менее, указанные методики не подходят для инкапсуляции большинства белков или других сложных молекулярных структур, поскольку неполярные растворители, применяемые в указанных методиках, необратимо изменяют структуру таких молекул. Кроме того, эффективность инкапсуляции в указанных методиках также неудовлетворительна. Например, в ЕР 0514435 В1 описан способ получения композиции липосомного геля, в котором фосфолипиды (15-30% масс.) растворяют путем встряхивания в водном растворе, содержащем одноатомный спирт в количестве 14-20% по массе, и полученные липосомы нагружают гидрофильными соединениями путем гомогенизации. Указанный способ обеспечивает структурирование водной фазы везикулами с липидными мембранами с малой вероятностью, что делает эффективность инкапсуляции низкой, в то время как одноатомные спирты обладают денатурирующими и раздражающими свойствами. В DE 4003783 А1 описан способ получения дисперсий липосом путем энергичного перемешивания фосфолипидов растительного происхождения в концентрациях до 30% по массе в присутствии одноатомного спирта (этанола или 2-пропанола) в количестве 15-20% по массе. В данном случае полученная содержащая липосомы водная дисперсия также не структурирована, и ожидается низкая эффективность инкапсуляции. Другой недостаток указанного способа заключается в том, что полученные путем перемешивания липосомы неоднородны по размерам.In another group of techniques for encapsulating hydrophilic compounds into liposomes, a mixture of substances with different polarity is used. However, these techniques are not suitable for the encapsulation of most proteins or other complex molecular structures because the non-polar solvents used in these techniques irreversibly change the structure of such molecules. In addition, the efficiency of encapsulation in these techniques is also unsatisfactory. For example, EP 0514435 B1 describes a method for preparing a liposome gel composition in which phospholipids (15-30% by weight) are dissolved by shaking in an aqueous solution containing a monohydric alcohol in an amount of 14-20% by weight, and the resulting liposomes are loaded with hydrophilic compounds by homogenization. This method provides low probability of structurization of the aqueous phase by vesicles with lipid membranes, which makes encapsulation efficiency low, while monohydric alcohols have denaturing and irritating properties. DE 4003783 A1 describes a process for the preparation of liposome dispersions by vigorous stirring of plant phospholipids in concentrations up to 30% by weight in the presence of a monohydric alcohol (ethanol or 2-propanol) in an amount of 15-20% by weight. In this case, the resulting liposome-containing aqueous dispersion is also not structured, and low encapsulation efficiency is expected. Another disadvantage of this method is that the liposomes obtained by mixing are heterogeneous in size.
Изменение полярности водного раствора, обеспечивающее образование липосом, также может быть достигнуто при использовании галогенированных углеводородов в качестве растворителя (WO 96/40061 А1) или при впрыскивании липидов, растворенных в хлор фторугл ер одном растворителе («фреон»), в водный раствор при высокой температуре (US 4752425). Однако ни в каком из указанных способов не достигается эффективность инкапсуляции гидрофильного вещества более 50%. Кроме того, необходимость применения высоких температур для испарения растворителей препятствует применению указанных способов для инкапсуляции белков и супрамолекулярных ассоциатов.Reversing the polarity of an aqueous solution to form liposomes can also be achieved by using halogenated hydrocarbons as a solvent (WO 96/40061 A1) or by injecting lipids dissolved in a chlorofluorocarbon single solvent ("Freon") into an aqueous solution at high temperature (US 4752425). However, none of these methods achieves more than 50% hydrophilic encapsulation efficiency. In addition, the need to use high temperatures to evaporate solvents precludes the use of these methods for the encapsulation of proteins and supramolecular associates.
Другая альтернативная методика инкапсуляции гидрофильных веществ в липосомы включает образование комплексов гидрофильных частиц активного вещества с высоким электростатическим зарядом и амфифильных противоионов. В результате образуется амфифильный комплекс, который затем покрывают липидами. Указанный способ требует работы со смесями с различными полярностями, что технологически сложно. Кроме того, указанный способ можно применять только к сильно заряженным молекулам, т.е. нуклеиновым кислотам (см, например, Oh, Y. К., и Park, Т. G. (2009) siRNA delivery systems for cancer treatment Adv Drug Deliv Rev 61, 850-862), и он не подходит для инкапсуляции белков, которые денатурируются в присутствии гидрофобных жидкостей.Another alternative technique for encapsulating hydrophilic substances in liposomes involves the formation of complexes of hydrophilic active substance particles with a high electrostatic charge and amphiphilic counterions. As a result, an amphiphilic complex is formed, which is then coated with lipids. This method requires working with mixtures with different polarities, which is technologically difficult. In addition, this method can only be applied to highly charged molecules, i.e. nucleic acids (see, for example, Oh, Y. K., and Park, T. G. (2009) siRNA delivery systems for cancer treatment Adv Drug Deliv Rev 61, 850-862) and is not suitable for encapsulating proteins that denatured in the presence of hydrophobic liquids.
В качестве попытки значительно увеличить эффективность инкапсуляции гидрофильных пуриновых нуклеозидов и получить высокие внутрилипосомные концентрации лекарственных средств, в WO 95/15762 описан способ получения липосомных составов, включающий получение мультиламеллярных липосом, содержащих видарабин (или его производное), и воздействие на липосомы лиофилизации, управляемой регидратации и, необязательно, экструзии под давлением. Тем не менее, после экструзии достигалась максимальная эффективность инкапсуляции только 45%.As an attempt to significantly increase the encapsulation efficiency of hydrophilic purine nucleosides and obtain high intraliposomal drug concentrations,
Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение липосом, содержащих гидрофильные соединения, а также способа получения таких липосом, причем указанные липосомы и способ в значительной степени преодолевают обсуждаемые выше проблемы известного уровня техники.Therefore, it is an object of the present invention to provide liposomes containing hydrophilic compounds, as well as a method for producing such liposomes, said liposomes and method largely overcoming the problems of the prior art discussed above.
Конкретнее, целью настоящего изобретения является обеспечение липосом, стабильно инкапсулирующих большие количества гидрофильных соединений независимо от их прочих физико-химических свойств, таких как размер или заряд, включая, например, ионы, белки, пептиды, углеводы, природные и синтетические полимеры, нуклеиновые кислоты и производные нуклеиновых кислот, которые денатурируются в присутствии гидрофобных жидкостей.More specifically, it is an object of the present invention to provide liposomes that stably encapsulate large amounts of hydrophilic compounds regardless of their other physicochemical properties such as size or charge, including, for example, ions, proteins, peptides, carbohydrates, natural and synthetic polymers, nucleic acids, and derivatives of nucleic acids that denature in the presence of hydrophobic liquids.
Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа инкапсуляции таких гидрофильных соединений в гидрофильное пространство липосом с эффективностью инкапсуляции до 100%. Неожиданно было обнаружено, что указанные цели достигаются при помощи настоящего изобретения.It is also an object of the present invention to provide a method for encapsulating such hydrophilic compounds in the hydrophilic space of liposomes with an encapsulation efficiency of up to 100%. Surprisingly, it was found that these objects are achieved using the present invention.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
В первом аспекте настоящего изобретения предложена униламеллярная липосома (УЛ) с одним липидным бислоем, окружающим гидрофильное пространство, причем УЛ содержит: (i) по меньшей мере одно гидрофобное соединение, образующее липидный бислой, и (ii) пропиленгликоль или глицерин, причем гидрофильное пространство содержит по меньшей мере одно гидрофильное соединение, растворенное в гидрофильном растворителе, причем концентрация гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет по меньшей мере 80% от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа.In a first aspect of the present invention, a unilamellar liposome (UL) is provided with a single lipid bilayer surrounding a hydrophilic space, wherein the UL contains: (i) at least one hydrophobic compound forming a lipid bilayer, and (ii) propylene glycol or glycerol, the hydrophilic space comprising at least one hydrophilic compound dissolved in the hydrophilic solvent, wherein the concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent is at least 80% of the saturation concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent at 20° C. and 101 kPa.
В варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, массовое отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, к пропиленгликолю или глицерину составляет от 2:1 до 1:1.In an embodiment of the UL according to the first aspect, the weight ratio of at least one hydrophobic lipid bilayer forming compound to propylene glycol or glycerol is between 2:1 and 1:1.
В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, массовое отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, к по меньшей мере одному гидрофильному соединению составляет от 100:1 до 1:3, от 50:1 до 1:2 или от 25:1 до 1:1.In another embodiment of the UL according to the first aspect, the weight ratio of at least one hydrophobic lipid bilayer forming compound to at least one hydrophilic compound is 100:1 to 1:3, 50:1 to 1:2, or 25 :1 to 1:1.
В другом варианте реализации настоящего изобретения, УЛ содержит по меньшей мере одно гидрофобное соединение в количестве от 15 до 40%, от 16 до 39%, от 17 до 38%, от 18 до 37%, от 19 до 35%, от 20 до 30%, от 21 до 25% или от 22 до 24% от массы УЛ, и предпочтительно, от 20 до 40% от массы УЛ.In another embodiment of the present invention, the UL contains at least one hydrophobic compound in an amount of 15 to 40%, 16 to 39%, 17 to 38%, 18 to 37%, 19 to 35%, 20 to 30%, 21 to 25% or 22 to 24% by weight UL, and preferably 20 to 40% by weight UL.
В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, по меньшей мере одно гидрофильное соединение выбрано из группы, состоящей из: (i) низкомолекулярных гидрофильных веществ с молекулярной массой от 100 Да до 1500 Да, от 200 Да до 1400 Да, от 300 Да до 1200 Да или от 500 Да до 1000 Да; и (ii) гидрофильных макромолекул с молекулярной массой от 1500 Да до 300 кДа, от 2 кДа до 280 кДа, от 5 кДа до 250 кДа, от 10 кДа до 200 кДа или от 50 кДа до 200 кДа.In another embodiment of the UL according to the first aspect, at least one hydrophilic compound is selected from the group consisting of: (i) low molecular weight hydrophilic substances with a molecular weight of 100 Da to 1500 Da, 200 Da to 1400 Da, 300 Da to 1200 Yes or from 500 Da to 1000 Da; and (ii) hydrophilic macromolecules with a molecular weight of 1500 Da to 300 kDa, 2 kDa to 280 kDa, 5 kDa to 250 kDa, 10 kDa to 200 kDa, or 50 kDa to 200 kDa.
В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, по меньшей мере одно гидрофильное соединение выбрано из группы, состоящей из ионов, белков, пептидов, углеводов, природных и синтетических полимеров, нуклеиновых кислот, производных нуклеиновых кислот и комбинаций указанных соединений.In another embodiment of the UL according to the first aspect, at least one hydrophilic compound is selected from the group consisting of ions, proteins, peptides, carbohydrates, natural and synthetic polymers, nucleic acids, nucleic acid derivatives, and combinations of these compounds.
В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, концентрация насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет от 1 г до 500 г на 1000 мл гидрофильного растворителя, предпочтительно, от 10 г до 200 г. In another embodiment of the UL according to the first aspect, the saturation concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent is from 1 g to 500 g per 1000 ml of hydrophilic solvent, preferably from 10 g to 200 g.
В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, гидрофильный растворитель выбран из группы, состоящей из воды, водного буферного раствора, водного солевого раствора, водного раствора моно- или дисахарида и комбинаций указанных вариантов.In another embodiment of the UL according to the first aspect, the hydrophilic solvent is selected from the group consisting of water, an aqueous buffer solution, an aqueous saline solution, an aqueous mono- or disaccharide solution, and combinations of these options.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ инкапсуляции гидрофильных соединений в УЛ, включающий следующие стадии: (а) обеспечение раствора липида, содержащего по меньшей мере одно гидрофобное соединение и многоатомный спирт, выбранный из пропиленгликоля и глицерина; (b) обеспечение водной фазы, содержащей по меньшей мере одно гидрофильное соединение; (с) получение раствора гидратированного липида путем смешивания раствора липида со стадии (а) с водной фазой со стадии (b); и (d) экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при температуре менее 80°С, причем по меньшей мере одно гидрофобное соединение образует однородную популяцию УЛ, причем указанные УЛ составляют более 50% от общего объема водной фазы.In a second aspect of the present invention, there is provided a method for encapsulating hydrophilic compounds in UL, comprising the steps of: (a) providing a lipid solution containing at least one hydrophobic compound and a polyhydric alcohol selected from propylene glycol and glycerol; (b) providing an aqueous phase containing at least one hydrophilic compound; (c) obtaining a hydrated lipid solution by mixing the lipid solution from step (a) with the aqueous phase from step (b); and (d) extruding the hydrated lipid solution from step (c) at a temperature of less than 80°C, wherein at least one hydrophobic compound forms a homogeneous population of ULs, said ULs making up more than 50% of the total volume of the aqueous phase.
В одном варианте реализации способа согласно второму аспекту, по меньшей мере одно гидрофильное соединение инкапсулируют в УЛ с эффективностью инкапсуляции, выбранной из по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.In one embodiment of the method according to the second aspect, at least one hydrophilic compound is encapsulated in the UL with an encapsulation efficiency selected from at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.
В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, многоатомный спирт содержится в растворе гидратированного липида на стадии (с) в концентрации от 5 до 30%, от 10 до 25%, от 15 до 22% или от 18 до 20% от массы раствора гидратированного липида.In another embodiment of the method according to the second aspect, the polyhydric alcohol is contained in the hydrated lipid solution in step (c) at a concentration of 5 to 30%, 10 to 25%, 15 to 22%, or 18 to 20% by weight of the hydrated lipid solution. lipid.
В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, общая концентрация по меньшей мере одного гидрофобного соединения в растворе гидратированного липида на стадии (с) составляет от 15 до 40%, от 16 до 39%, от 17 до 38%, от 18 до 37%, от 19 до 35%, от 20 до 30%, от 21 до 25% или от 22 до 24% от массы указанного раствора гидратированного липида, и предпочтительно от 20 до 40% от массы указанного раствора гидратированного липида.In another embodiment of the method according to the second aspect, the total concentration of at least one hydrophobic compound in the hydrated lipid solution in step (c) is 15 to 40%, 16 to 39%, 17 to 38%, 18 to 37%. , 19 to 35%, 20 to 30%, 21 to 25% or 22 to 24% by weight of said hydrated lipid solution, and preferably 20 to 40% by weight of said hydrated lipid solution.
В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, по меньшей мере одно гидрофобное соединение выбрано из фосфолипидов, сфинголипидов или стеролов, предпочтительно, из фосфатидилхолина, и более предпочтительно, из очищенного соевого фосфатидилхолина.In another embodiment of the method according to the second aspect, at least one hydrophobic compound is selected from phospholipids, sphingolipids or sterols, preferably from phosphatidylcholine, and more preferably from purified soybean phosphatidylcholine.
В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, стадия (b) включает регулирование рН водной фазы, предпочтительно до рН в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2.In another embodiment of the method according to the second aspect, step (b) comprises adjusting the pH of the aqueous phase, preferably to a pH in the range of 5.0 to 7.5, 6.0 to 7.4, or 7.0 to 7.2 .
В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, стадия (d) включает экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при температуре менее 60°С, менее 40°С или менее 30°С, предпочтительно, при 20°С.In another embodiment of the process according to the second aspect, step (d) comprises extruding the hydrated lipid solution from step (c) at a temperature of less than 60°C, less than 40°C or less than 30°C, preferably at 20°C.
В другом варианте реализации, способ согласно второму аспекту включает дополнительную стадию (е), на которой многоатомный спирт, выбранный из пропиленгликоля и глицерина, удаляют из экструдиро ванного раствора гидратированного липида, полученного на стадии (d), предпочтительно, указанный многоатомный спирт удаляют из указанного экструдированного раствора гидратированного липида путем ультрафильтрации.In another embodiment, the method according to the second aspect comprises an additional step (e) in which a polyhydric alcohol selected from propylene glycol and glycerol is removed from the extruded hydrated lipid solution obtained in step (d), preferably said polyhydric alcohol is removed from said extruded hydrated lipid solution by ultrafiltration.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложена УЛ, полученная при помощи способа согласно второму аспекту настоящего изобретения.In a third aspect of the present invention, there is provided an UL obtained by the method according to the second aspect of the present invention.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложена жидкая композиция, содержащая по меньшей мере одну УЛ согласно первому или третьему аспектам настоящего изобретения.In a fourth aspect of the present invention, there is provided a liquid composition comprising at least one UL according to the first or third aspects of the present invention.
В одном варианте реализации указанного четвертого аспекта жидкая композиция обладает по меньшей мере одним из следующих свойств: (i) рН в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2; (ii) осмолярность в диапазоне от 30 мОсм до 400 мОсм, от 40 мОсм до 300 мОсм или от 50 мОсм до 200 мОсм; (iii) общее мольное отношение гидрофильных соединений к гидрофобным соединениям между 10-5 и 1. В предпочтительном варианте реализации жидкая композиция представляет собой водную композицию.In one embodiment of said fourth aspect, the liquid composition has at least one of the following properties: (i) a pH in the range of 5.0 to 7.5, 6.0 to 7.4, or 7.0 to 7.2 ; (ii) an osmolarity in the range of 30 mOsm to 400 mOsm, 40 mOsm to 300 mOsm, or 50 mOsm to 200 mOsm; (iii) a total molar ratio of hydrophilic compounds to hydrophobic compounds between 10 -5 and 1. In a preferred embodiment, the liquid composition is an aqueous composition.
В другом варианте реализации четвертого аспекта настоящего изобретения жидкая композиция дополнительно содержит по меньшей мере один наполнитель, предпочтительно, указанный наполнитель выбран из группы, состоящей из: буферных агентов, осмотически активных агентов, консервантов, антиоксидантов, вкусоароматических агентов, ароматических агентов и комбинаций указанных добавок; предпочтительно, указанные осмотические агенты выбраны из одновалентных солей или сахаров, предпочтительно, из хлорида натрия и сахарозы.In another embodiment of the fourth aspect of the present invention, the liquid composition further comprises at least one excipient, preferably, said excipient is selected from the group consisting of: buffering agents, osmotically active agents, preservatives, antioxidants, flavoring agents, flavoring agents, and combinations of these additives; preferably, said osmotic agents are selected from monovalent salts or sugars, preferably from sodium chloride and sucrose.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к УЛ согласно первому или третьему аспектам, или к композиции согласно четвертому аспекту, для применения в терапии.In a fifth aspect, the present invention provides an UL according to the first or third aspects, or a composition according to the fourth aspect, for use in therapy.
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к применению УЛ согласно первому или третьему аспектам, или композиции согласно четвертому аспекту, в качестве лекарственного средства, косметического продукта, пищевой добавки или дезинфицирующего средства.In a sixth aspect, the present invention relates to the use of an UL according to the first or third aspects, or a composition according to the fourth aspect, as a drug, cosmetic product, dietary supplement or disinfectant.
ЧЕРТЕЖИBLUEPRINTS
Фиг. 1: Графическое представление изменений вязкости в зависимости от скорости вращения шпинделя. График иллюстрирует результаты реометрических измерений, описанных в Примере 8. Испытанные образцы липосом содержали различные концентрации липида (10, 15, 20, 25% по массе) и были получены с использованием различных параметров экструзии. ФХ10%: концентрация липида в образце до экструзии 10% от массы указанного образца; ФХ15%: концентрация липида в образце до экструзии 15% от массы указанного образца; ФХ20%: концентрация липида в образце до экструзии 20% от массы указанного образца; ФХ25%: концентрация липида в образце до экструзии 25% от массы указанного образца; ФХ-MLV: образец без экструзии; ФХ-УЛ КТ: образец экструдирован при комнатной температуре, ФХ-УЛ Т70: образец экструдирован при 70°С.Fig. 1: Graphical representation of viscosity changes with spindle speed. The graph illustrates the results of the rheometric measurements described in Example 8. The liposome samples tested contained various lipid concentrations (10, 15, 20, 25% by weight) and were obtained using different extrusion parameters. FH10%: lipid concentration in the sample before
Фиг. 2: Графическое представление значений вязкости в зависимости от концентрации липида. График иллюстрирует результаты реометрических измерений, описанных в Примере 8. Испытанные образцы липосом содержали различные концентрации липида (10, 15, 20, 25% по массе) и были получены с использованием различных параметров экструзии. Подробности см. в описании Фиг. 1.Fig. 2: Graphical representation of viscosity values as a function of lipid concentration. The graph illustrates the results of the rheometric measurements described in Example 8. The liposome samples tested contained various lipid concentrations (10, 15, 20, 25% by weight) and were obtained using different extrusion parameters. See the description of FIG. for details. 1.
Фиг. 3А, Фиг. 3В: Графическое представление распределения липосом по размеру и корреляционных данных. На графике показано распределение липосом по размеру в образцах, полученных в Примере 8, по данным динамического рассеяния света (ДРС) с подобранными корреляционными функциями, представляющими распределение частиц в измеренном образце, нанесенными на график. На Фиг. 3А показано распределение по размеру липосом в образцах, полученных с одним циклом экструзии, с содержанием липида 10% по массе. Коэффициент полидисперсности (Kn) этих образцов составляет по меньшей мере 0,2 (Kn>0,2). На Фиг. 3В показано распределение по размеру липосом в образцах, полученных с одним циклом экструзии, с содержанием липида 30% по массе. Коэффициент полидисперсности этих образцов составляет менее 0,2 (Kn<0,2).Fig. 3A, Fig. 3B: Graphical representation of liposome size distribution and correlation data. The graph shows the distribution of liposomes in size in the samples obtained in Example 8, according to dynamic light scattering (DLS) with fitted correlation functions representing the distribution of particles in the measured sample plotted. On FIG. 3A shows the size distribution of liposomes in samples obtained with a single extrusion cycle, with a lipid content of 10% by weight. The polydispersity coefficient (K n ) of these samples is at least 0.2 (K n >0.2). On FIG. 3B shows the size distribution of liposomes in samples obtained with a single extrusion cycle, with a lipid content of 30% by weight. The polydispersity coefficient of these samples is less than 0.2 (K n <0.2).
Фиг. 4: Графическое представление зависимости размера липосом от концентрации липида и числа циклов экструзии при комнатной температуре. График иллюстрирует размеры липосом в образцах, полученных в Примере 8 путем экструзии при комнатной температуре, в зависимости от концентрации липида и числа циклов экструзии, необходимых для получения образцов с Kn<0,2. Для содержания липида 20-40% по массе были получены образцы с весьма однородным распределением липосом по размерам уже после первого цикла экструзии.Fig. 4: Graphical representation of liposome size versus lipid concentration and number of extrusion cycles at room temperature. The graph illustrates the sizes of liposomes in samples obtained in Example 8 by extrusion at room temperature, depending on the concentration of lipid and the number of extrusion cycles required to obtain samples with K n <0.2. For a lipid content of 20-40% by weight, samples with a very uniform size distribution of liposomes were obtained already after the first extrusion cycle.
Фиг. 5: Графическое представление эмиссионных спектров образцов инкапсулированного в УЛ декстрана с флуоресцентной меткой (ФИТЦ-меченый) и папаина. График иллюстрирует спектры пермеата и ретентата, полученных при ультрафильтрации и фракционировании образцов, описанных в Примере 9. Декстран-ФИТЦ Mr 5000 ФХ 16% пермеат: эмиссионный спектр пермеата из образцов, содержащих инкапсулированный в УЛ меченый ФИТЦ декстран, 5 кДа, с общей концентрацией фосфатидилхолина (ФХ) 16% от массы образца; Декстран-ФИТЦ Mr 5000 ФХ 16% ретентат: эмиссионный спектр ретентата 6 из образцов, содержащих инкапсулированный в УЛ меченый ФИТЦ декстран, 5 кДа, с общей концентрацией ФХ 16% от массы образца; Папаин Mr 23000 ФХ 16% пермеат: эмиссионный спектр пермеата из образцов, содержащих инкапсулированный в УЛ папаин, 23 кДа, с общей концентрацией ФХ 16% от массы образца; Папаин Mr 23000 ФХ 16% ретентат: эмиссионный спектр ретентата из образцов, содержащих инкапсулированный в УЛ папаин, 23 кДа, с общей концентрацией ФХ 16% от массы образца.Fig. 5: Graphical representation of the emission spectra of samples of UL-encapsulated fluorescently labeled dextran (FITC-labeled) and papain. The graph illustrates the spectra of permeate and retentate obtained by ultrafiltration and fractionation of the samples described in Example 9. Dextran-
Фиг. 6: Графическое представление эффективности инкапсуляции декстрана с флуоресцентной меткой (ФИТЦ-меченый) и папаина. График иллюстрирует эффективность инкапсуляции декстрана с флуоресцентной меткой, с молекулярной массой 5 кДа, и папаина с молекулярной массой 23 кДа, при помощи способа, описанного в Примере 9, в зависимости от концентрации липида в полученной суспензии УЛ.Fig. 6: Graphical representation of the encapsulation efficiency of fluorescently labeled dextran (FITC-labeled) and papain. The graph illustrates the encapsulation efficiency of 5 kDa fluorescently labeled dextran and 23 kDa papain using the method described in Example 9 as a function of lipid concentration in the resulting UL suspension.
Фиг. 7А, 7В: Изображение образцов, содержащих гидрофильные макромолекулы, инкапсулированные в гидрофильное пространство УЛ согласно настоящему изобретению. Изображения были получены при помощи просвечивающей электронной микроскопии. На Фиг. 7А показан инкапсулированный в УЛ нефракционированный гепарин. Гидродинамический диаметр структуры: 150 нм. На Фиг. 7 В показан инкапсулированный в УЛ полимер поливинилпирролидон (PVP) с ковалентно связанной молекулой хлорина Е6, с молекулярной массой 12 кДа. Гидродинамический диаметр структуры: 130 нм.Fig. 7A, 7B: Image of samples containing hydrophilic macromolecules encapsulated in the hydrophilic space of the UL according to the present invention. Images were obtained using transmission electron microscopy. On FIG. 7A shows UL-encapsulated unfractionated heparin. Hydrodynamic structure diameter: 150 nm. On FIG. 7B shows UL-encapsulated polyvinylpyrrolidone (PVP) polymer with a covalently linked chlorin E6 molecule,
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION
Перед тем, как настоящее изобретение будет ниже описано более подробно, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реактивами, указанными в настоящем описании, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что применяемая терминология используется только для описания конкретных вариантов реализации, и не предназначена ограничивать объем настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины в настоящем описании имеют значения, обыкновенно понимаемые средним специалистом в данной области техники.Before the present invention is described in more detail below, it should be understood that the present invention is not limited to the particular methodology, protocols, and reagents described herein, as they may vary. It should also be understood that the terminology used is only used to describe specific embodiments, and is not intended to limit the scope of the present invention, which will be limited only by the appended claims. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms in this specification have the meanings commonly understood by one of ordinary skill in the art.
В тексте настоящего описания ссылаются на некоторые документы. Каждый из указанных документов (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), как выше, так и ниже, полностью включены в настоящее описание посредством ссылок. Ничто в настоящем описании не должно рассматриваться как допущение, что настоящее изобретение неправомочно по причине противопоставления источника информации с более ранним приоритетом.In the text of the present description, reference is made to certain documents. Each of these documents (including all patents, patent applications, scientific publications, manufacturer's specifications, instructions, etc.), both above and below, are incorporated herein by reference in their entirety. Nothing in the present description should be taken as an admission that the present invention is invalid by reason of contrasting the source of information with an earlier priority.
Ниже будут описаны элементы настоящего изобретения. Указанные элементы приведены с конкретными вариантами реализации, тем не менее, следует понимать, что их можно комбинировать любым образом в любом количестве для создания дополнительных вариантов реализации. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты реализации не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение только явно описанными вариантами реализации. Настоящее описание следует рассматривать как вспомогательное и включающее варианты реализации, сочетающие явно описанные варианты реализации с любым числом описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных в настоящей заявке элементов следует рассматривать как описанные в настоящем описании, если контекстом явно не предписывается иное.The elements of the present invention will be described below. These elements are given with specific implementation options, however, it should be understood that they can be combined in any way in any number to create additional implementation options. The various examples described and preferred embodiments should not be construed as limiting the present invention to the expressly described embodiments. The present description should be considered as ancillary and includes implementation options that combine the expressly described implementation options with any number of the described and/or preferred elements. In addition, any permutations and combinations of all elements described in this application should be considered as described in this description, unless the context clearly dictates otherwise.
В настоящем описании и формуле изобретения, если контекстом не предписывается иное, слово «содержать» и его варианты, такие как «содержит» и «содержащий», следует понимать как подразумевающее включение указанного числа или стадии, или группы чисел или стадий, но не исключение любого другого числа или стадии, или группы чисел или стадий. В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число соответствующих объектов, если контекстом явно не предписывается иное.In the present description and claims, unless the context otherwise dictates, the word "comprise" and its variants, such as "comprises" and "comprising", should be understood as implying the inclusion of the specified number or stage, or group of numbers or stages, but not exclusion any other number or stage, or group of numbers or stages. In the present specification and the appended claims, the singular forms include the plural of the respective entities, unless the context clearly dictates otherwise.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
В следующей части будут подробнее описаны различные аспекты настоящего изобретения. Каждый описанный аспект можно комбинировать с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или выгодный, можно комбинировать с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или выгодные.In the following part, various aspects of the present invention will be described in more detail. Each aspect described can be combined with any other aspect or aspects, unless explicitly stated otherwise. In particular, any feature indicated as being preferred or advantageous may be combined with any other feature or features indicated as being preferred or advantageous.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что большие количества гидрофильных соединений можно стабильно инкапсулировать в униламеллярные липосомы согласно настоящему изобретению. А именно, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что гидрофильное соединение, растворенное в гидрофильном растворителе, может быть инкапсулировано в гидрофильное пространство униламеллярной липосомы (УЛ) в концентрации по меньшей мере 80% от концентрации насыщения указанного гидрофильного соединения в указанном гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа, в том случае, если УЛ содержит пропиленгликоль или глицерин.The present inventors have surprisingly found that large amounts of hydrophilic compounds can be stably encapsulated in the unilamellar liposomes of the present invention. Namely, the present inventors surprisingly found that a hydrophilic compound dissolved in a hydrophilic solvent can be encapsulated in the hydrophilic space of a unilamellar liposome (UL) at a concentration of at least 80% of the saturation concentration of said hydrophilic compound in said hydrophilic solvent at 20°C. and 101 kPa if the UL contains propylene glycol or glycerin.
Успешная инкапсуляция таких больших количеств гидрофильных соединений в униламеллярные липосомы обеспечивает несколько преимуществ, в зависимости от пути введения указанных липосом. При парентеральном введении, как внутривенным, так и внутримышечным путем, липосомы могут обеспечивать управляемое замедленное высвобождение инкапсулированного гидрофильного компонента в течение длительного промежутка времени, и уменьшение побочных действий гидрофильного соединения благодаря ограничению концентрации свободного гидрофильного соединения в кровотоке. Липосомы могут изменять распределение в тканях и усвоение гидрофильных соединений в терапевтически желательном направлении, и увеличивать приемлемость терапии благодаря обеспечению возможности менее частого введения соединения.The successful encapsulation of such large amounts of hydrophilic compounds in unilamellar liposomes provides several advantages, depending on the route of administration of said liposomes. When administered parenterally, both intravenously and intramuscularly, liposomes can provide a controlled, sustained release of the encapsulated hydrophilic component over an extended period of time, and reduce the side effects of the hydrophilic compound by limiting the concentration of the free hydrophilic compound in the bloodstream. Liposomes can alter tissue distribution and uptake of hydrophilic compounds in a therapeutically desirable direction, and increase the acceptability of therapy by allowing less frequent administration of the compound.
Следовательно, согласно первому аспекту настоящего изобретения предложена униламеллярная липосома (УЛ) с одним липидным бислоем, окружающим гидрофильное пространство, причем указанная УЛ содержит: (i) по меньшей мере одно гидрофобное соединение, образующее липидный бислой, и (ii) пропиленгликоль или глицерин, причем гидрофильное пространство содержит по меньшей мере одно гидрофильное соединение, растворенное в гидрофильном растворителе, причем концентрация гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет по меньшей мере 80% от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа.Therefore, according to the first aspect of the present invention, there is provided a unilamellar liposome (UL) with a single lipid bilayer surrounding a hydrophilic space, said UL comprising: (i) at least one hydrophobic compound forming a lipid bilayer, and (ii) propylene glycol or glycerol, wherein the hydrophilic space contains at least one hydrophilic compound dissolved in the hydrophilic solvent, wherein the concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent is at least 80% of the saturation concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent at 20° C. and 101 kPa.
Униламеллярная липосома (УЛ)Unilamellar liposome (UL)
Термин «униламеллярная липосома» или «УЛ» в настоящем описании относится к везикуле, образованной одним липидным бислоем, который окружает гидрофильное пространство. Указанный пузырек может иметь любую форму, включая эллипсоиды, дискоиды, грушевидные везикулы, чашевидные везикулы, почковидные везикулы и сферические везикулы. Предпочтительно, униламеллярная липосома согласно настоящему изобретению имеет по существу сферическую форму.The term "unilamellar liposome" or "UL" as used herein refers to a vesicle formed by a single lipid bilayer that surrounds a hydrophilic space. Said vesicle may be of any shape, including ellipsoids, discoids, pear-shaped vesicles, cup-shaped vesicles, kidney-shaped vesicles, and spherical vesicles. Preferably, the unilamellar liposome of the present invention has a substantially spherical shape.
УЛ согласно настоящему изобретению могут представлять собой мелкие униламеллярные везикулы (МУВ) с диаметром до 100 нм, или большие униламеллярные везикулы (БУВ) с диаметром свыше 100 нм вплоть до 1 мкм. Предпочтительно, чтобы диаметр УЛ согласно настоящему изобретению составлял от 50 до 250 нм, от 100 до 200 нм или от 130 до 150 нм. Термин «диаметр» в настоящем описании относится к гидродинамическому диаметру, который следует понимать как размер гипотетической твердой сферы, диффундирующей так же, как измеряемая частица. Подходящие способы определения гидродинамического диаметра УЛ согласно настоящему изобретению, такие как динамическое рассеяние света (ДРС), известны специалистам в данной области техники.ULs according to the present invention may be small unilamellar vesicles (SVM) with a diameter of up to 100 nm, or large unilamellar vesicles (LVB) with a diameter of over 100 nm up to 1 μm. Preferably, the diameter of the UL according to the present invention is 50 to 250 nm, 100 to 200 nm, or 130 to 150 nm. The term "diameter" in the present description refers to the hydrodynamic diameter, which should be understood as the size of a hypothetical hard sphere, diffusing in the same way as the measured particle. Suitable methods for determining the hydrodynamic diameter of an UL according to the present invention, such as dynamic light scattering (DLS), are known to those skilled in the art.
УЛ согласно настоящему изобретению можно применять в терапии, или для получения лекарственного средства, косметического продукта, пищевой добавки или дезинфицирующего средства.The UL according to the present invention can be used in therapy, or for the preparation of a drug, cosmetic product, nutritional supplement, or disinfectant.
Липидный бислойlipid bilayer
Термин «липидный бислой» в настоящем описании относится к замкнутой структуре, состоящей из двух липидных слоев, образованных самосборкой гидрофобных соединений.The term "lipid bilayer" in the present description refers to a closed structure consisting of two lipid layers formed by the self-assembly of hydrophobic compounds.
Гидрофобное соединениеhydrophobic compound
Термин «гидрофобное соединение» в настоящем описании относится к амфифильным липидным соединениям, содержащим одновременно полярные и неполярные участки. Предпочтительно указанное гидрофобное соединение выбрано из фосфолипидов, сфинголипидов и стеролов. Более предпочтительно, указанное гидрофобное соединение представляет собой фосфатидилхолин, еще более предпочтительно, очищенный соевый фосфатидилхолин.The term "hydrophobic compound" in the present description refers to amphiphilic lipid compounds containing both polar and non-polar sites. Preferably said hydrophobic compound is selected from phospholipids, sphingolipids and sterols. More preferably, said hydrophobic compound is a phosphatidylcholine, even more preferably a purified soybean phosphatidylcholine.
В описанной в настоящей заявке УЛ неполярные цепи гидрофобных соединений направлены внутрь липидного бислоя, обращенные друг к другу, и таким образом составляют неполярную область между двумя полярными областями. Полученное таким образом липофильное внутреннее пространство между двумя липидными слоями действует как барьер проницаемости для гидрофильных веществ, как в направлении внутрь, так и в направлении наружу.In the UL described herein, non-polar chains of hydrophobic compounds are directed inside the lipid bilayer, facing each other, and thus constitute a non-polar region between two polar regions. The lipophilic interior space thus obtained between the two lipid layers acts as a permeability barrier for hydrophilic substances, both inwards and outwards.
Полярные группы гидрофобных соединений обращены к окружающей среде и к внутреннему пространству замкнутой структуры, образованной липидным бислоем.The polar groups of hydrophobic compounds face the environment and the interior of the closed structure formed by the lipid bilayer.
Предпочтительно, чтобы в УЛ согласно настоящему изобретению массовое отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, и пропиленгликоля или глицерина, содержащегося в УЛ, составляло от 2:1 до 1:1. Подходящие способы определения указанного массового отношения хорошо известны специалисту в данной области техники, такие как ультрацентрифугирование для разделения соединений, ВЭЖХ с детектором испарительного рассеяния света (HPLC-ELSD) для определения концентрации гидрофобного соединения и газовая хроматография (ГХ) для определения концентрации пропиленгликоля и глицерина (см., например, Elmoslemany RM, Abdallah OY, El-Khordagui LK, Khalafallah NM. Propylene Glycol Liposomes as a Topical Delivery System for Miconazole Nitrate: Comparison with Conventional Liposomes. AAPS PharmSciTech. 2012;13(2):723-731. doi:10.1208/sl2249-012-9783-6).Preferably, in the UL according to the present invention, the weight ratio of at least one hydrophobic compound forming a lipid bilayer and propylene glycol or glycerol contained in the UL is from 2:1 to 1:1. Suitable methods for determining said weight ratio are well known to those skilled in the art, such as ultracentrifugation to separate compounds, HPLC with an evaporative light scattering detector (HPLC-ELSD) to determine the concentration of a hydrophobic compound, and gas chromatography (GC) to determine the concentration of propylene glycol and glycerol ( see, for example, Elmoslemany RM, Abdallah OY, El-Khordagui LK, Khalafallah NM Propylene Glycol Liposomes as a Topical Delivery System for Miconazole Nitrate: Comparison with Conventional Liposomes AAPS PharmSciTech 2012;13(2):723-731. doi:10.1208/sl2249-012-9783-6).
Также предпочтительно, чтобы УЛ согласно настоящему изобретению содержала по меньшей мере одно гидрофобное соединение в количестве от 15 до 40%, от 16 до 39%, от 17 до 38%, от 18 до 37%, от 19 до 35%, от 20 до 30%, от 21 до 25% или от 22 до 24% от массы УЛ, и более предпочтительно, от 20 до 40% от массы УЛ.It is also preferred that the UL according to the present invention contains at least one hydrophobic compound in an amount of 15 to 40%, 16 to 39%, 17 to 38%, 18 to 37%, 19 to 35%, 20 to 30%, 21 to 25%, or 22 to 24% by weight UL, and more preferably 20 to 40% by weight UL.
Также предпочтительно, чтобы отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, и по меньшей мере одного гидрофильного соединения, содержащегося в гидрофильном пространстве описанной УЛ, находилось в диапазоне от 100:1 до 1:3, от 50:1 до 1:2 или от 25:1 до 1:1. Указанное массовое отношение в УЛ можно определить при помощи способов, известных специалисту в данной области техники, например, путем экстракции гидрофобного соединения с последующим определением концентрации гидрофобного соединения при помощи ВЭЖХ с детектором испарительного рассеяния света. Выбор соответствующего метода анализа для определения гидрофильного соединения, в зависимости от физико-химических свойств указанного гидрофильного соединения, лежит в области компетенции среднего практикующего специалиста в данной области техники.Also preferably, the ratio of at least one hydrophobic compound forming a lipid bilayer and at least one hydrophilic compound contained in the hydrophilic space of the described UL is in the range from 100:1 to 1:3, from 50:1 to 1: 2 or from 25:1 to 1:1. Said weight ratio in UL can be determined using methods known to the person skilled in the art, for example, by extracting the hydrophobic compound and then determining the concentration of the hydrophobic compound using HPLC with an evaporative light scattering detector. The choice of an appropriate method of analysis for the determination of a hydrophilic compound, depending on the physico-chemical properties of said hydrophilic compound, lies within the purview of the average practitioner in the art.
В одном варианте реализации УЛ согласно настоящему изобретению не содержит заряженных липидов.In one embodiment, the UL according to the present invention does not contain charged lipids.
Гидрофильное пространствоhydrophilic space
Термин «гидрофильное пространство» в настоящем описании относится к пространству, объединенному полярной внутренней поверхностью замкнутой структуры, образованной липидным бислоем. Гидрофильное пространство УЛ согласно настоящему изобретению содержит гидрофильный растворитель и по меньшей мере одно гидрофильное соединение, растворенное в указанном гидрофильном растворителе.The term "hydrophilic space" in the present description refers to the space united by the polar inner surface of the closed structure formed by the lipid bilayer. The hydrophilic space of the UL according to the present invention contains a hydrophilic solvent and at least one hydrophilic compound dissolved in said hydrophilic solvent.
Гидрофильный растворительhydrophilic solvent
Термин «гидрофильный растворитель» в настоящем описании относится к любому растворителю, не смешивающемуся с октанолом. Предпочтительно, указанный термин относится к любому растворителю с величиной относительной диэлектрической проницаемости в диапазоне 75,0-80,1 при 20°С. В способе согласно настоящему описанию гидрофильный растворитель может быть выбран из группы, состоящей из воды, водного буферного раствора, водного солевого раствора, водного раствора моно- или дисахарида и комбинаций указанных вариантов.The term "hydrophilic solvent" in the present description refers to any solvent that is immiscible with octanol. Preferably, said term refers to any solvent with a relative dielectric constant in the range of 75.0-80.1 at 20°C. In the process of the present disclosure, the hydrophilic solvent may be selected from the group consisting of water, an aqueous buffer solution, an aqueous saline solution, an aqueous mono- or disaccharide solution, and combinations thereof.
Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% от массы гидрофильного растворителя содержалось в гидрофильном пространстве УЛ согласно настоящему изобретению. Наиболее предпочтительно, чтобы 100% от массы гидрофильного растворителя содержалось в гидрофильном пространстве УЛ согласно настоящему изобретению.Preferably, at least 90%, at least 95%, or at least 99% by weight of the hydrophilic solvent is contained in the hydrophilic space of the UL according to the present invention. Most preferably, 100% by weight of the hydrophilic solvent is contained in the hydrophilic space of the UL according to the present invention.
Гидрофильное соединениеhydrophilic compound
Термин «гидрофильное соединение» в настоящем описании относится к любому соединению с отрицательным значением log Р (Р = коэффициент распределения октанол-вода). Коэффициент распределения можно определить при помощи любого способа, известного в данной области техники (см., например, J. Sangster: Octanol-WaterPartition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol.2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997). Предпочтительно, гидрофильное соединение выбрано из группы, состоящей из ионов, белков, пептидов, углеводов, природных и синтетических полимеров, нуклеиновых кислот, производных нуклеиновых кислот и комбинаций указанных соединений.The term "hydrophilic compound" as used herein refers to any compound with a negative log P value (P = octanol-water partition coefficient). The partition coefficient can be determined using any method known in the art (see, for example, J. Sangster: Octanol-WaterPartition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester , 1997). Preferably, the hydrophilic compound is selected from the group consisting of ions, proteins, peptides, carbohydrates, natural and synthetic polymers, nucleic acids, nucleic acid derivatives, and combinations of these compounds.
Также предпочтительно, чтобы по меньшей мере одно гидрофильное соединение было выбрано из группы, состоящей из: (i) низкомолекулярных гидрофильных веществ с молекулярной массой от 100 Да до 1500 Да, от 200 Да до 1400 Да, от 300 Да до 1200 Да или от 500 Да до 1000 Да; и (ii) гидрофильных макромолекул с молекулярной массой от 1500 Да до 300 кДа, от 2 кДа до 280 кДа, от 5 кДа до 250 кДа, от 10 кДа до 200 кДа или от 50 кДа до 200 кДа.Also preferably, at least one hydrophilic compound is selected from the group consisting of: (i) low molecular weight hydrophilic substances with a molecular weight of 100 Da to 1500 Da, 200 Da to 1400 Da, 300 Da to 1200 Da, or 500 Yes up to 1000 Yes; and (ii) hydrophilic macromolecules with a molecular weight of 1500 Da to 300 kDa, 2 kDa to 280 kDa, 5 kDa to 250 kDa, 10 kDa to 200 kDa, or 50 kDa to 200 kDa.
Концентрация гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе, содержащемся в УЛ согласно настоящему изобретению, составляет по меньшей мере 80% от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа.The concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent contained in the UL according to the present invention is at least 80% of the saturation concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent at 20° C. and 101 kPa.
Термин «концентрация насыщения» в настоящем описании обозначает такую концентрацию гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа, при которой гидрофильный растворитель не способен растворить больше гидрофильного соединения, и дополнительные количества указанного гидрофильного соединения будут образовывать отдельную фазу, т.е. осадок. Подходящие способы определения концентрации насыщения гидрофильного соединения хорошо известны специалисту в данной области техники, например, метод колбы или колоночный метод, согласно руководству ОЭСР (OECD) для испытания растворимости в воде химикатов (см. Руководство ОЭСР для испытания химикатов, Часть 1, Испытание №1-5 Растворимость в воде).The term "saturation concentration" in the present specification means that concentration of a hydrophilic compound in a hydrophilic solvent at 20° C. and 101 kPa at which the hydrophilic solvent is unable to dissolve more of the hydrophilic compound and additional amounts of said hydrophilic compound will form a separate phase, i.e. sediment. Suitable methods for determining the saturation concentration of a hydrophilic compound are well known to those skilled in the art, for example, the flask method or the column method, according to the OECD guidelines for testing chemicals in water solubility (see OECD guidelines for testing chemicals,
Предпочтительно, концентрация насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет от 1 г до 500 г на 1000 мл гидрофильного растворителя, более предпочтительно, от 10 г до 200 г на 1000 мл гидрофильного растворителя.Preferably, the saturation concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent is 1 g to 500 g per 1000 ml of the hydrophilic solvent, more preferably 10 g to 200 g per 1000 ml of the hydrophilic solvent.
Кроме того, предпочтительно, чтобы общее мольное отношение гидрофильных соединений к гидрофобным соединениям, содержащимся в УЛ согласно настоящему изобретению, составляло более 1:100000.In addition, it is preferable that the total molar ratio of hydrophilic compounds to hydrophobic compounds contained in the UL according to the present invention was more than 1:100,000.
Способ согласно настоящему изобретениюMethod according to the present invention
Кроме того, авторы настоящего изобретения разработали способ высокоэффективной инкапсуляции гидрофильных соединений в униламеллярные липосомы. Неожиданно было обнаружено, что более 50% от общего объема водной фазы, содержащей гидрофильное соединение, может быть стабильно инкапсулировано в УЛ с использованием многоатомного спирта, выбранного из пропиленгликоля и глицерина, в качестве растворителя гидрофобного соединения, образующего липидный бислой.In addition, the authors of the present invention have developed a method for highly efficient encapsulation of hydrophilic compounds in unilamellar liposomes. Surprisingly, it has been found that more than 50% of the total volume of the aqueous phase containing the hydrophilic compound can be stably encapsulated in UL using a polyhydric alcohol selected from propylene glycol and glycerol as the solvent for the hydrophobic compound forming the lipid bilayer.
Следовательно, второй аспект настоящего изобретения относится к способу инкапсуляции гидрофильных соединений в УЛ, включающему следующие стадии: обеспечение раствора липида, содержащего по меньшей мере одно гидрофобное соединение и многоатомный спирт, выбранный из пропиленгликоля и глицерина; обеспечение водной фазы, содержащей по меньшей мере одно гидрофильное соединение; получение раствора гидратированного липида путем смешивания раствора липида со стадии (а) с водной фазой со стадии (b); и экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при температуре менее 80°С, причем по меньшей мере одно гидрофобное соединение образует однородную популяцию УЛ, причем указанные УЛ содержат более 50% от общего объема водной фазы.Therefore, the second aspect of the present invention relates to a method for encapsulating hydrophilic compounds in UL, comprising the following steps: providing a lipid solution containing at least one hydrophobic compound and a polyhydric alcohol selected from propylene glycol and glycerol; providing an aqueous phase containing at least one hydrophilic compound; obtaining a hydrated lipid solution by mixing the lipid solution from step (a) with the aqueous phase from step (b); and extruding the hydrated lipid solution from step (c) at a temperature of less than 80°C, wherein at least one hydrophobic compound forms a homogeneous population of ULs, said ULs containing more than 50% of the total volume of the aqueous phase.
Предпочтительно, указанные УЛ содержат более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95%, более 98% или более 99% от общего объема водной фазы.Preferably, said ULs contain more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, more than 85%, more than 90%, more than 95%, more than 98%, or more than 99% of the total the volume of the aqueous phase.
Эффективность инкапсуляцииEncapsulation efficiency
Вышеописанный способ согласно настоящему изобретению способствует получению стабильной содержащей УЛ суспензии с четко определенным распределением по размерам при помощи простого способа низкоэнергетической экструзии при комнатной температуре, при обеспечении высокой структурной стабильности инкапсулированного гидрофильного соединения и высокой эффективности инкапсуляции, соответственно.The above-described method of the present invention facilitates the production of a stable UL-containing slurry with a well-defined size distribution by a simple low-energy extrusion process at room temperature, while providing high structural stability of the encapsulated hydrophilic compound and high encapsulation efficiency, respectively.
По меньшей мере одно гидрофильное соединение может быть инкапсулировано в УЛ с эффективностью инкапсуляции, выбранной из по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.The at least one hydrophilic compound may be encapsulated in the UL with an encapsulation efficiency selected from at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.
В контексте настоящего изобретения термин «эффективность инкапсуляции» относится к величине «а», выраженной в процентах [%], которую определяют согласно следующей формуле:In the context of the present invention, the term "encapsulation efficiency" refers to the value "a", expressed as a percentage [%], which is determined according to the following formula:
а=(Ctot - Cout)/Ctot a \u003d (C tot - C out ) / C tot
где «Cout» относится к концентрации гидрофильного соединения в той части водной фазы, которая остается вне гидрофильного пространства УЛ в образце, а «Ctot» относится к общей концентрации гидрофильного соединения в образце. Значения «Cout» и «Ctot» определяют при помощи спектроскопии.where “C out ” refers to the concentration of the hydrophilic compound in that part of the aqueous phase that remains outside the hydrophilic space of the UL in the sample, and “C tot ” refers to the total concentration of the hydrophilic compound in the sample. The values "C out " and "C tot " are determined by spectroscopy.
Эффективная инкапсуляция гидрофильных соединений при помощи способа согласно настоящему изобретению достигается в результате высокого отношения инкапсулированного объема водной фазы, содержащей по меньшей мере одно гидрофильное соединение, к объему указанной водной фазы, остающейся снаружи УЛ. Это означает, что по меньшей мере половина от общего объема водной фазы, обеспеченной на стадии (b) способа согласно настоящему изобретению, содержится внутри липосом, полученных при помощи способа согласно настоящему изобретению.The effective encapsulation of hydrophilic compounds by the method of the present invention is achieved as a result of the high ratio of the encapsulated volume of the aqueous phase containing at least one hydrophilic compound to the volume of said aqueous phase remaining outside the UL. This means that at least half of the total volume of the aqueous phase provided in step (b) of the method of the present invention is contained within the liposomes produced by the method of the present invention.
Следовательно, композиция, полученная в способе согласно настоящему изобретению, содержит однородную совокупность УЛ, причем указанные УЛ содержат более 50%, более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95%, более 98% или более 99% от общего объема водной фазы.Therefore, the composition obtained in the method according to the present invention contains a homogeneous set of ULs, and these ULs contain more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, more than 85 %, more than 90%, more than 95%, more than 98% or more than 99% of the total volume of the aqueous phase.
На стадии (b) способа согласно настоящему изобретению водная фаза, содержащая по меньшей мере одно гидрофильное соединение, может быть получена путем растворения указанного по меньшей мере одного гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе. Предпочтительно, концентрация гидрофильного соединения в водной фазе, обеспеченной на стадии (b), составляет по меньшей мере 80% от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа. Концентрация насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе может находиться в диапазоне от 1 г до 500 г на 1000 мл гидрофильного растворителя, и предпочтительно, в диапазоне от 10 г до 200 г на 1000 мл гидрофильного растворителя.In step (b) of the method according to the present invention, an aqueous phase containing at least one hydrophilic compound can be obtained by dissolving said at least one hydrophilic compound in a hydrophilic solvent. Preferably, the concentration of the hydrophilic compound in the aqueous phase provided in step (b) is at least 80% of the saturation concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent at 20° C. and 101 kPa. The saturation concentration of the hydrophilic compound in the hydrophilic solvent may be in the range of 1 g to 500 g per 1000 ml of the hydrophilic solvent, and preferably in the range of 10 g to 200 g per 1000 ml of the hydrophilic solvent.
Стадия (b) способа согласно настоящему изобретению может дополнительно включать регулировку рН водной фазы, предпочтительно, до рН в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2. Предпочтительно осуществлять указанную регулировку рН при температуре 20°С. Подходящие способы измерения и регулировки рН жидких растворов известны специалистам в данной области техники.Step (b) of the process according to the present invention may further comprise adjusting the pH of the aqueous phase, preferably to a pH in the range of 5.0 to 7.5, 6.0 to 7.4, or 7.0 to 7.2. Preferably, said pH adjustment is carried out at a temperature of 20°C. Suitable methods for measuring and adjusting the pH of liquid solutions are known to those skilled in the art.
В способе согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы многоатомный спирт содержался в растворе гидратированного липида на стадии (с) в концентрации от 5 до 30%, от 10 до 25%, от 15 до 22% или от 18 до 20% от массы раствора гидратированного липида.In the method according to the present invention, it is preferred that the polyhydric alcohol is contained in the hydrated lipid solution in step (c) at a concentration of 5 to 30%, 10 to 25%, 15 to 22%, or 18 to 20% by weight of the hydrated lipid solution. .
Концентрация гидрофобного соединенияHydrophobic Compound Concentration
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при высокой концентрации по меньшей мере одного гидрофобного соединения, содержащегося в растворе гидратированного липида, полученном на стадии (с) способа согласно настоящему изобретению, получают суспензию УЛ с высокой плотностью расположения липидных бислоев указанных УЛ. Следовательно, общая концентрация по меньшей мере одного гидрофобного соединения в растворе гидратированного липида, полученном на стадии (с), может составлять от 15 до 40%, от 16 до 39%, от 17 до 38%, от 18 до 37%, от 19 до 35%, от 20 до 30%, от 21 до 25% или от 22 до 24% от массы указанного раствора гидратированного липида.In addition, the inventors of the present invention have found that at a high concentration of at least one hydrophobic compound contained in the hydrated lipid solution obtained in step (c) of the method of the present invention, a suspension of ULs with a high lipid bilayer density of said ULs is obtained. Therefore, the total concentration of at least one hydrophobic compound in the hydrated lipid solution obtained in step (c) may be from 15 to 40%, from 16 to 39%, from 17 to 38%, from 18 to 37%, from 19 up to 35%, from 20 to 30%, from 21 to 25% or from 22 to 24% by weight of said hydrated lipid solution.
Особенно предпочтительно, чтобы общая концентрация по меньшей мере одного гидрофобного соединения в растворе гидратированного липида, полученном на стадии (с), составляла от 20 до 40% от массы указанного раствора гидратированного липида, от 20 до 30% от массы указанного раствора гидратированного липида или от 30 до 40% от массы указанного раствора гидратированного липида. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что один цикл экструзии такой концентрированной суспензии УЛ дополнительно улучшает эффективность инкапсуляции способа согласно настоящему описанию до 99% и обеспечивает высокую вязкость суспензии УЛ, не менее 4000 сП (6 об./мин, КТ) без применения дополнительных гелеобразующих или загущающих агентов. Предпочтительно, вязкость получаемой суспензии УЛ составляет по меньшей мере 5000 сП, по меньшей мере 7000 сП или по меньшей мере 10000 сП (6 об./мин, КТ).It is particularly preferred that the total concentration of at least one hydrophobic compound in the hydrated lipid solution obtained in step (c) is from 20 to 40% by weight of said hydrated lipid solution, from 20 to 30% by weight of said hydrated lipid solution, or from 30 to 40% by weight of said hydrated lipid solution. The present inventors have found that one extrusion cycle of such a concentrated UL slurry further improves the encapsulation efficiency of the process of the present disclosure to 99% and provides a high UL slurry viscosity of at least 4000 cP (6 rpm, CT) without the use of additional gelling or thickening agents. agents. Preferably, the viscosity of the resulting UL slurry is at least 5000 centipoise, at least 7000 centipoise, or at least 10,000 centipoise (6 rpm, CT).
По меньшей мере одно гидрофобное соединение может быть выбрано из фосфолипидов, сфинголипидов или стеролов. Предпочтительно, по меньшей мере одно гидрофобное соединение выбрано из фосфатидилхолина, более предпочтительно, из очищенного соевого фосфатидилхолина. В одном из вариантов реализации раствор гидратированного липида на стадии (с) не содержит заряженных липидов.The at least one hydrophobic compound may be selected from phospholipids, sphingolipids, or sterols. Preferably, at least one hydrophobic compound is selected from phosphatidylcholine, more preferably from purified soybean phosphatidylcholine. In one embodiment, the hydrated lipid solution in step (c) does not contain charged lipids.
ЭкструзияExtrusion
Экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) на стадии (d) можно осуществлять при температуре менее 80°С, менее 60°С или менее 40°С.The extrusion of the hydrated lipid solution from step (c) to step (d) can be carried out at a temperature of less than 80°C, less than 60°C or less than 40°C.
Неожиданно было обнаружено, что способ согласно настоящему изобретению обеспечивает инкапсуляцию гидрофильных макромолекул в описанные УЛ с эффективностью, превышающей 95%, уже после одного цикла экструзии при комнатной температуре.Surprisingly, it has been found that the method according to the present invention encapsulates hydrophilic macromolecules in the described ULs with an efficiency in excess of 95% after only one extrusion cycle at room temperature.
Следовательно, предпочтительно, чтобы стадия (d) способа согласно настоящему изобретению включала экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при температуре менее 30°С, и более предпочтительно, при комнатной температуре (20°С). Кроме того, предпочтительно, чтобы способ согласно настоящему изобретению включал один цикл экструзии. Наиболее предпочтительно, стадия (d) способа согласно настоящему изобретению включает экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при комнатной температуре (20°С) в единственном цикле экструзии.Therefore, it is preferred that step (d) of the process of the present invention comprises extruding the hydrated lipid solution from step (c) at a temperature of less than 30°C, and more preferably at room temperature (20°C). Furthermore, it is preferred that the process according to the present invention comprises one extrusion cycle. Most preferably, step (d) of the process of the present invention comprises extruding the hydrated lipid solution from step (c) at room temperature (20° C.) in a single extrusion cycle.
Термин «цикл экструзии» в настоящем описании относится к одному проходу раствора гидратированного липида со стадии (с) через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.The term "extrusion cycle" as used herein refers to one pass of the hydrated lipid solution from step (c) through a polycarbonate filter with a pore diameter of 100 nm.
Дополнительные стадии способаAdditional process steps
За стадией экструзии (d) способа согласно настоящему изобретению может следовать дополнительная стадия (f) удаления глицерина или пропиленгликоля из содержащей УЛ суспензии, полученной на стадии экструзии (d). Предпочтительно, указанное удаление многоатомного спирта осуществляют путем ультрафильтрации. В особенно предпочтительных вариантах реализации содержащую УЛ суспензию, полученную на стадии экструзии (d), пропускают через систему ультрафильтрации (например, MicroKros MWCO 70kD лабораторного масштаба или коммерчески доступные кассеты для более крупных синтезов), а затем промывают изоосмотической водной фазой. Количество многоатомного спирта, остающегося в суспензии липосом после стадии ультрафильтрации, пропорционально объемной доле образца и применяемой водной фазы. Предпочтительно, указанное количество составляет менее 1%, менее 0,8%, менее 0,5%, менее 0,4%, менее 0,3%, менее 0,2% или менее 0,1% от массы содержащей УЛ суспензии.The extrusion step (d) of the method of the present invention may be followed by an additional step (f) of removing glycerol or propylene glycol from the UL-containing slurry obtained in the extrusion step (d). Preferably, said removal of the polyhydric alcohol is carried out by ultrafiltration. In particularly preferred embodiments, the UL-containing slurry obtained from extrusion step (d) is passed through an ultrafiltration system (e.g., laboratory scale MicroKros MWCO 70kD or commercially available cassettes for larger syntheses) and then washed with an iso-osmotic aqueous phase. The amount of polyhydric alcohol remaining in the liposome suspension after the ultrafiltration step is proportional to the volume fraction of the sample and the aqueous phase used. Preferably, said amount is less than 1%, less than 0.8%, less than 0.5%, less than 0.4%, less than 0.3%, less than 0.2%, or less than 0.1% by weight of the UL-containing suspension.
Способ согласно настоящему изобретению может включать дополнительную стадию разбавления содержащей УЛ суспензии, полученной на стадии (d) или (е), предпочтительно, путем добавления солевого раствора, более предпочтительно, стерильного солевого раствора.The method of the present invention may include the additional step of diluting the UL-containing suspension obtained in step (d) or (e), preferably by adding saline, more preferably sterile saline.
Альтернативно, указанная дополнительная стадия способа может включать лиофилизацию или высушивание распылением содержащей УЛ суспензии, полученной на стадии (d) или (е), для обеспечения твердой содержащей липосомы композиции, такой как порошок липосом.Alternatively, said additional process step may include freeze-drying or spray drying the UL-containing suspension obtained in step (d) or (e) to provide a solid liposome-containing composition, such as a liposome powder.
НаполнителиFillers
Способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать введение по меньшей мере одного наполнителя, который может быть выбран из группы, состоящей из: буферных агентов, осмотически активных агентов, консервантов, антиоксидантов, вкусоароматических агентов, ароматических агентов и комбинаций указанных добавок. Предпочтительно, указанные осмотические агенты выбраны из одновалентных солей или сахаров, более предпочтительно, из хлорида натрия и сахарозы. Кроме того, предпочтительно, чтобы способ согласно настоящему изобретению включал введение осмотического агента в таком количестве, чтобы осмолярность конечного продукта находилась в диапазоне от 30 мОсм до 400 мОсм.The method according to the present invention may further include the introduction of at least one excipient, which may be selected from the group consisting of: buffering agents, osmotically active agents, preservatives, antioxidants, flavoring agents, flavoring agents and combinations of these additives. Preferably, said osmotic agents are selected from monovalent salts or sugars, more preferably from sodium chloride and sucrose. Furthermore, it is preferred that the method according to the present invention comprises administering an osmotic agent in such an amount that the osmolarity of the final product is in the range of 30 mOsm to 400 mOsm.
Композиции согласно настоящему изобретениюCompositions according to the present invention
В третьем аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая по меньшей мере одну УЛ согласно настоящему изобретению. В четвертом аспекте настоящего изобретения предложена композиция, полученная при помощи способа согласно настоящему изобретению.In a third aspect of the present invention, there is provided a composition comprising at least one UL according to the present invention. In a fourth aspect of the present invention, there is provided a composition obtained by the method of the present invention.
В контексте настоящего изобретения термин «композиция» относится как к композиции согласно третьему аспекту, так и к композиции согласно четвертому аспекту, соответственно, и включает жидкие, полутвердые и твердые композиции. Композиция согласно настоящему изобретению может представлять собой жидкую композицию, предпочтительно, водную жидкую композицию, такую как водный раствор или суспензия, или полутвердую композицию, такую как мазь или гель.In the context of the present invention, the term "composition" refers to both the composition according to the third aspect and the composition according to the fourth aspect, respectively, and includes liquid, semi-solid and solid compositions. The composition according to the present invention may be a liquid composition, preferably an aqueous liquid composition such as an aqueous solution or suspension, or a semi-solid composition such as an ointment or gel.
Композиция согласно настоящему изобретению может также представлять собой твердую композицию, предпочтительно, порошкообразную композицию, такую как лиофилизированная или высушенная распылением порошкообразная композиция.The composition according to the present invention may also be a solid composition, preferably a powder composition such as a lyophilized or spray dried powder composition.
Композиция согласно настоящему описанию может быть выбрана из фармацевтической композиции, косметической композиции, пищевой композиции, композиции пищевой добавки или композиции дезинфицирующего средства. В случае если композиция согласно настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, предпочтительно, чтобы гидрофильное соединение представляло собой фармацевтически активный агент или лекарственное соединение.The composition according to the present disclosure may be selected from a pharmaceutical composition, a cosmetic composition, a food composition, a dietary supplement composition, or a disinfectant composition. In case the composition according to the present invention is a pharmaceutical composition, it is preferable that the hydrophilic compound is a pharmaceutically active agent or a drug compound.
Композиция согласно настоящему описанию может дополнительно содержать по меньшей мере один наполнитель. Предпочтительно, указанный наполнитель выбран из группы, состоящей из: буферных агентов, осмотически активных агентов, консервантов, антиоксидантов, вкусоароматических агентов, ароматических агентов и комбинаций указанных добавок; предпочтительно, указанные осмотические агенты выбраны из одновалентных солей или сахаров, более предпочтительно, из хлорида натрия и сахарозы.The composition according to the present description may additionally contain at least one filler. Preferably, said excipient is selected from the group consisting of: buffering agents, osmotically active agents, preservatives, antioxidants, flavoring agents, flavoring agents, and combinations of these additives; preferably, said osmotic agents are selected from monovalent salts or sugars, more preferably from sodium chloride and sucrose.
Предпочтительно, композиция согласно настоящему изобретению обладает по меньшей мере одним из следующих свойств: (i) рН в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2; (ii) осмолярность в диапазоне от 30 мОсм до 400 мОсм, от 40 мОсм до 300 мОсм или от 50 мОсм до 200 мОсм; и/или (iii) общее мольное отношение гидрофильных соединений к гидрофобным соединениям между 10-5 и 1.Preferably, the composition according to the present invention has at least one of the following properties: (i) pH in the range of 5.0 to 7.5, 6.0 to 7.4, or 7.0 to 7.2; (ii) an osmolarity in the range of 30 mOsm to 400 mOsm, 40 mOsm to 300 mOsm, or 50 mOsm to 200 mOsm; and/or (iii) a total molar ratio of hydrophilic compounds to hydrophobic compounds between 10 -5 and 1.
Кроме того, предпочтительно, чтобы композиция согласно настоящему описанию имела вязкость по меньшей мере 4000 сП (6 об./мин, КТ), по меньшей мере 5000 сП (6 об./мин, КТ), по меньшей мере 7000 сП (6 об./мин, КТ) или по меньшей мере 10000 сП (6 об./мин, КТ).In addition, it is preferable that the composition according to the present description has a viscosity of at least 4000 cP (6 rpm, CT), at least 5000 cP (6 rpm, CT), at least 7000 cP (6 rpm ./min, CT) or at least 10,000 cP (6 rpm, CT).
Применение УЛ и композиции согласно настоящему изобретениюThe use of UL and compositions according to the present invention
Описанные униламеллярные липосомы (УЛ) или композицию можно применять в качестве лекарственного средства, косметического продукта, пищевой добавки или дезинфицирующего средства, соответственно. В одном из вариантов реализации УЛ или композицию согласно настоящему изобретению применяют в терапии.Described unilamellar liposomes (UL) or composition can be used as a drug, cosmetic product, food supplement or disinfectant, respectively. In one embodiment, the implementation of the UL or the composition according to the present invention is used in therapy.
Описанную композицию можно применять без дополнительных модификаций в качестве дерматологического или косметического продукта в форме мази.The described composition can be used without further modification as a dermatological or cosmetic product in the form of an ointment.
Описанную композицию можно также применять в разведенной форме. Если гидрофильное вещество, инкапсулированное в УЛ, предназначено для системного применения в качестве медицинского продукта, композицию согласно настоящему изобретению предпочтительно разбавляют изотоническим раствором, который не изменяет количество гидрофильного соединения, инкапсулированного в УЛ. Такие разбавленные суспензии УЛ можно применять для введения пептидов, полных белков, полимеров, сахаров или нуклеиновых кислот в терапевтических применениях. В настоящее время фармацевтическое применение таких соединений ограничено по причине их незамедлительного удаления из физиологических текучих сред. Это особенно важно для перорального введения, при котором белки, полимеры, сахара или нуклеиновые кислоты гидролизуются в процессе пищеварения.The described composition can also be used in diluted form. If the hydrophilic substance encapsulated in the UL is intended for systemic use as a medicinal product, the composition of the present invention is preferably diluted with an isotonic solution that does not change the amount of the hydrophilic compound encapsulated in the UL. Such diluted UL suspensions can be used to administer peptides, complete proteins, polymers, sugars or nucleic acids in therapeutic applications. Currently, the pharmaceutical use of such compounds is limited due to their immediate removal from physiological fluids. This is especially important for oral administration, in which proteins, polymers, sugars or nucleic acids are hydrolyzed during digestion.
Следовательно, в целом, главные препятствия для разработки и терапевтического применения биологических лекарственных средств преодолеваются благодаря настоящему изобретению.Therefore, in general, the main obstacles to the development and therapeutic application of biological drugs are overcome thanks to the present invention.
Настоящее изобретение описано при помощи следующих примеров, которые следует рассматривать только как иллюстрации, а не как ограничения объема настоящего изобретения.The present invention is described using the following examples, which should be considered only as illustrations and not as limitations on the scope of the present invention.
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
1000 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) растворяли в 750 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 3250 мг водной фазы, содержащей 5 мг декстрана с флуоресцентной меткой (Mr 5 кДа) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.1000 mg of Phospholipone 90G (Lipoid AG) was dissolved in 750 mg of propylene glycol (Chempur) with stirring (4 h, RT) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained, and then mixed with 3250 mg of an aqueous phase containing 5 mg of dextran with a fluorescent label (
В результате получали суспензию липосом с концентрацией липида 20% от массы суспензии, причем 96% меченого декстрана было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).The result was a suspension of liposomes with a lipid concentration of 20% by weight of the suspension, with 96% of the labeled dextran encapsulated in unilamellar liposomes (UL).
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
1500 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) растворяли в 1000 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 2500 мг водной фазы, содержащей 5 мг декстрана с флуоресцентной меткой (Mr 5 кДа) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.1500 mg of Phospholipone 90G (Lipoid AG) was dissolved in 1000 mg of propylene glycol (Chempur) with stirring (4 h, RT) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained, and then mixed with 2500 mg of an aqueous phase containing 5 mg of dextran with a fluorescent label (
В результате получали суспензию липосом с концентрацией липида 30% от массы суспензии, причем 96% меченого декстрана было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).The result was a suspension of liposomes with a lipid concentration of 30% by weight of the suspension, with 96% of the labeled dextran encapsulated in unilamellar liposomes (UL).
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
2000 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) растворяли в 1000 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 2000 мг водной фазы, содержащей 5 мг декстрана с флуоресцентной меткой (Mr 5 кДа) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.2000 mg of Phospholipone 90G (Lipoid AG) was dissolved in 1000 mg of propylene glycol (Chempur) with stirring (4 h, RT) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained, and then mixed with 2000 mg of an aqueous phase containing 5 mg of dextran with a fluorescent label (
В результате получали суспензию липосом с концентрацией липида 40% от массы суспензии, причем 99% меченого декстрана было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).The result was a suspension of liposomes with a lipid concentration of 40% by weight of the suspension, with 99% of the labeled dextran encapsulated in unilamellar liposomes (UL).
ПРИМЕР 4EXAMPLE 4
1500 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) растворяли в 1000 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 2500 мг водной фазы, содержащей 50 мг папаина (Mr 23 кДа) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.1500 mg of Phospholipone 90G (Lipoid AG) was dissolved in 1000 mg of propylene glycol (Chempur) with stirring (4 h, RT) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained, and then mixed with 2500 mg of an aqueous phase containing 50 mg of papain (
В результате получали суспензию липосом с концентрацией липида 30% от массы суспензии, причем 99% папаина было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).The result was a suspension of liposomes with a lipid concentration of 30% by weight of the suspension, with 99% of papain encapsulated in unilamellar liposomes (UL).
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
Сильно концентрированный продукт витамина С для применения в качестве добавки или пищевой добавки при лечении рака получали с использованием следующих ингредиентов:A highly concentrated vitamin C product for use as a supplement or dietary supplement in the treatment of cancer was prepared using the following ingredients:
Продукт получали, растворяя 210 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 180 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ, 60 об./мин) до получения однородного желтого раствора липида. Полученный раствор смешивали (12 ч, КТ, 200 об./мин) с 590 мг водной фазы, содержащей 210 мг витамина С в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Последовательно добавляли ЭДТА, натуральный ароматизатор и подсластитель, и перемешивали (0,5 ч, КТ, 60 об./мин) для получения готового продукта.The product was prepared by dissolving 210 mg of Phospholipone 90G (Lipoid AG) in 180 mg of propylene glycol (Chempur) with stirring (4 h, RT, 60 rpm) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained. The resulting solution was mixed (12 h, RT, 200 rpm) with 590 mg of an aqueous phase containing 210 mg of vitamin C in phosphate buffer solution (0.01 M, pH 7.2). The resulting mixture was once extruded through a polycarbonate filter with a pore diameter of 100 nm. EDTA, natural flavor and sweetener were added sequentially and mixed (0.5 h, RT, 60 rpm) to obtain the final product.
ПРИМЕР 6EXAMPLE 6
Сильно концентрированный состав железа для применения в качестве добавки или пищевой добавки при лечении анемии получали с использованием следующих ингредиентов:A highly concentrated iron formulation for use as a supplement or dietary supplement in the treatment of anemia was prepared using the following ingredients:
Продукт получали, растворяя 220 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 180 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ, 60 об./мин) до получения однородного желтого раствора липида. Полученный раствор смешивали (12 ч, КТ, 200 об./мин) с 580 мг водной фазы, содержащей 20 мг дифосфата железа(III) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Последовательно добавляли витамин Е в качестве антиоксиданта, натуральный ароматизатор и подсластитель, и перемешивали (0,5 ч, КТ, 60 об./мин) для получения готового продукта.The product was prepared by dissolving 220 mg of Phospholipone 90G (Lipoid AG) in 180 mg of propylene glycol (Chempur) with stirring (4 h, RT, 60 rpm) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained. The resulting solution was mixed (12 h, RT, 200 rpm) with 580 mg of an aqueous phase containing 20 mg of iron(III) diphosphate in phosphate buffer solution (0.01 M, pH 7.2). The resulting mixture was once extruded through a polycarbonate filter with a pore diameter of 100 nm. Vitamin E as an antioxidant, natural flavor and sweetener were added successively and mixed (0.5 h, RT, 60 rpm) to obtain the final product.
ПРИМЕР 7EXAMPLE 7
Медицинский продукт для применения в генной терапии получали с использованием следующих ингредиентов:A medical product for use in gene therapy was obtained using the following ingredients:
Продукт получали, растворяя 240 мг фосфатидилхолина, 10 мг метилсульфата N-[1-(2,3-диолеилокси)-пропил]-N,NJ,N-триметиламмония (DOTAP) и 20 мг 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE) в 200 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ, 60 об./мин) до получения однородного желтого раствора липида. Полученный раствор смешивали (12 ч, КТ, 200 об./мин) с 530 мг водной фазы, содержащей 20 мг дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в фосфатно-солевом буферном растворе 1х (ФСБ). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Полученный продукт лиофилизировали или разбавляли солевым раствором для непосредственного применения.The product was obtained by dissolving 240 mg of phosphatidylcholine, 10 mg of N-[1-(2,3-dioleyloxy)-propyl]-N,NJ,N-trimethylammonium methyl sulfate (DOTAP) and 20 mg of 1,2-dioleyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine (DOPE) in 200 mg propylene glycol (Chempur) with stirring (4 h, RT, 60 rpm) until a homogeneous yellow lipid solution is obtained. The resulting solution was mixed (12 h, RT, 200 rpm) with 530 mg of an aqueous phase containing 20 mg of deoxyribonucleic acid (DNA) in 1x phosphate buffered saline (PBS). The resulting mixture was once extruded through a polycarbonate filter with a pore diameter of 100 nm. The resulting product was lyophilized or diluted with saline for direct use.
ПРИМЕР 8EXAMPLE 8
Для оптимизации способа получения униламеллярных липосом (УЛ) было получено несколько содержащих липосомы образцов с использованием составов и параметров, показанных в Таблице 1, и определены вязкость и распределение липосом по размерам в указанных образцах.To optimize the method for preparing unilamellar liposomes (UL), several liposome-containing samples were prepared using the compositions and parameters shown in Table 1, and the viscosity and size distribution of liposomes in these samples were determined.
На первой стадии способа получения образцов, содержащих униламеллярные липосомы (УЛ), получали раствор липида путем смешивания фосфатидилхолина и пропиленгликоля и выдержки полученной смеси в течение нескольких часов при комнатной температуре до полного растворения фосфатидилхолина. К полученному прозрачному желтому раствору липида добавляли дистиллированную воду в количестве, необходимом для получения готового образца массой 10 г. Образец энергично перемешивали до получения однородной белой суспензии фосфолипида.At the first stage of the method for obtaining samples containing unilamellar liposomes (UL), a lipid solution was obtained by mixing phosphatidylcholine and propylene glycol and keeping the resulting mixture for several hours at room temperature until complete dissolution of phosphatidylcholine. Distilled water was added to the obtained transparent yellow lipid solution in the amount necessary to obtain a finished sample weighing 10 g. The sample was vigorously stirred until a homogeneous white suspension of the phospholipid was obtained.
Полученную суспензию мультиламеллярных липосом (МЛП) разделяли на три равные части. Одну часть подвергали определению вязкости (некалиброванная часть). Две другие части калибровали путем экструзии через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 100 нм. Экструзию проводили при комнатной температуре (КТ) или при 70°С, соответственно, до получения однородного распределения по размерам полученных униламеллярных липосом (УЛ) в образце.The resulting suspension of multilamellar liposomes (MLP) was divided into three equal parts. One part was subjected to the determination of viscosity (non-calibrated part). The other two parts were calibrated by extrusion through polycarbonate filters with a pore diameter of 100 nm. The extrusion was carried out at room temperature (RT) or at 70° C., respectively, until a uniform size distribution of the obtained unilamellar liposomes (UL) in the sample was obtained.
Вязкость полученных содержащих липосомы образцов определяли на реометре Брукера, снабженном системой измерения конус-плоскость. Небольшое количество образца (0,1-0,2 г) помещали в термостатируемую измерительную камеру и проводили определение изменения вязкости в зависимости от скорости вращения конуса. Измерения проводили при комнатной температуре (20°С). Результаты измерений вязкости показаны на Фиг. 1 и Фиг. 2.The viscosity of the resulting liposome-containing samples was determined on a Bruker rheometer equipped with a cone-plane measuring system. A small amount of the sample (0.1-0.2 g) was placed in a thermostatically controlled measuring chamber and the change in viscosity was determined depending on the speed of rotation of the cone. The measurements were carried out at room temperature (20°C). The results of the viscosity measurements are shown in FIG. 1 and FIG. 2.
Кроме того, определяли распределение липосом по размерам в полученных образцах при помощи динамического рассеяния света (ДРС) при помощи прибора Malvern ZetaSizer Nano ZS, после разбавления образцов дистиллированной водой в соотношении 1:100. Результаты определения размеров показаны на Фиг. 3А, Фиг. 3В и Фиг. 4.In addition, the size distribution of liposomes in the obtained samples was determined using dynamic light scattering (DLS) using a Malvern ZetaSizer Nano ZS instrument, after diluting the samples with distilled water in a ratio of 1:100. The sizing results are shown in FIG. 3A, Fig. 3B and FIG. four.
Результатыresults
В результате оптимизации способа получения униламеллярных липосом (УЛ) было обнаружено, что образование УЛ наблюдается после экструзии при низком давлении при комнатной температуре. Кроме того, было обнаружено, что предпочтительное количество липида в экструдированных образцах составляет по меньшей мере 20% по массе. Кроме того, было обнаружено, что концентрация липида, большая или равная 20% по массе, способствует получению монодисперсной совокупности липосом (Kn<0,2) при однократном пропускании через поликарбонатный фильтр, в отличие от образцов, содержащих меньшие количества липида.As a result of optimizing the method for producing unilamellar liposomes (UL), it was found that the formation of UL is observed after extrusion at low pressure at room temperature. In addition, it was found that the preferred amount of lipid in the extruded samples is at least 20% by weight. In addition, a lipid concentration greater than or equal to 20% by weight was found to produce a monodisperse population of liposomes (K n <0.2) with a single pass through a polycarbonate filter, in contrast to samples containing lower amounts of lipid.
ПРИМЕР 9EXAMPLE 9
Для демонстрации высокой эффективности способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению в отношении гидрофильных макромолекул были получены образцы согласно Примерам 1-4 путем смешивания раствора липида в пропиленгликоле с водным раствором гидрофильного полимера с флуоресцентной меткой (ФИТЦ-меченый декстран, 5 кДа) или белка (папаин с молекулярной массой 23 кДа),соответственно, и экструзии полученных суспензий через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Концентрация липида в полученных суспензиях УЛ составляла от 20% до 40% от массы указанных суспензий.To demonstrate the high efficiency of the encapsulation method according to the present invention with respect to hydrophilic macromolecules, samples were obtained according to Examples 1-4 by mixing a lipid solution in propylene glycol with an aqueous solution of a hydrophilic polymer with a fluorescent label (FITC-labeled dextran, 5 kDa) or protein (papain with
Размер УЛ подтверждали при помощи методики ДРС, как описано в Примере 8, после разбавления образца дистиллированной водой в соотношении 1:100.The size of the UL was confirmed using the DLS technique as described in Example 8 after diluting the sample with distilled water in a ratio of 1:100.
Концентрации инкапсулированного в УЛ полимера с флуоресцентной меткой или белка определяли при помощи спектроскопии. Для этого образцы подвергали ультрафильтрации через кассету Biomax-50 (Merck Millipore) с пороговым диапазоном 140-300 кДа для определения концентрации гидрофильного соединения в обеих частях, а именно снаружи липосом (фракция пермеат) и внутри липосом (фракция ретентат). Получали стационарные эмиссионные спектры флуоресценции на спектрофлуориметре Thermo Scientific Nicolet Evolution 100 UV-VIS. Диапазон длин волн возбуждения устанавливали 280 нм и 490 нм для папаина и декстрана с флуоресцентной меткой (ФИТЦ-декстран), соответственно.The concentrations of the fluorescently labeled polymer or protein encapsulated in the UL were determined by spectroscopy. To do this, the samples were subjected to ultrafiltration through a Biomax-50 cassette (Merck Millipore) with a threshold range of 140-300 kDa to determine the concentration of the hydrophilic compound in both parts, namely outside the liposomes (permeate fraction) and inside the liposomes (retentate fraction). Stationary fluorescence emission spectra were obtained on a Thermo
Эффективность инкапсуляции определяли согласно приведенной выше формуле. Коротко, эффективность инкапсуляции «а», выраженную в процентах [%], определяли согласно следующей формуле:Encapsulation efficiency was determined according to the above formula. Briefly, the encapsulation efficiency "a", expressed as a percentage [%], was determined according to the following formula:
а=(Ctot - Cout)/Ctot a \u003d (C tot - C out ) / C tot
где «Cout» относится к концентрации гидрофильного соединения в той части водной фазы, которая остается вне гидрофильного пространства УЛ в образце, а «Ctot» относится к общей концентрации гидрофильного соединения в образце.where “C out ” refers to the concentration of the hydrophilic compound in that part of the aqueous phase that remains outside the hydrophilic space of the UL in the sample, and “C tot ” refers to the total concentration of the hydrophilic compound in the sample.
Результатыresults
Во всех образцах однородная совокупность УЛ, со средним диаметром около 100 нм и Kn<0,2, была получена после одного цикла экструзии, при этом почти 100% декстрана или папаина, соответственно, были инкапсулированы в УЛ. Эмиссионные спектры фильтрата (пермеата) и инкапсулированной в УЛ водной фракции (ретентата) для образцов, содержащих папаин и декстран с флуоресцентной меткой, соответственно, показаны на Фиг. 5.In all samples, a homogeneous UL population, with an average diameter of about 100 nm and K n <0.2, was obtained after one extrusion cycle, with almost 100% dextran or papain, respectively, encapsulated in the UL. The emission spectra of the filtrate (permeate) and the UL-encapsulated aqueous fraction (retentate) for samples containing fluorescently labeled papain and dextran, respectively, are shown in FIG. five.
Конкретнее, способ согласно настоящему изобретению показал достижение инкапсуляции указанных гидрофильных макромолекул в указанные УЛ с эффективностью, превышающей 95%. Расчетная эффективность инкапсуляции показана на Фиг. 6 в зависимости от концентрации липида в образце.More specifically, the method of the present invention has been shown to achieve encapsulation of said hydrophilic macromolecules in said ULs with an efficiency greater than 95%. The calculated encapsulation efficiency is shown in FIG. 6 depending on the lipid concentration in the sample.
ПРИМЕР 10EXAMPLE 10
Для подтверждения высокой эффективности представленной методики инкапсуляции для гидрофильных макромолекул, а также целостности полученных структур, были получены изображения составов УЛ согласно настоящему изобретению, содержащих нефракционированный гепарин и ПВП с ковалентно связанной молекулой хлорина Е6, соответственно, при помощи просвечивающей электронной микроскопии (см. Фиг. 7). Полученные изображения подтверждают эффективность инкапсуляции гидрофильных макромолекул в УЛ согласно настоящему изобретению и высокую эффективность способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению.To confirm the high efficiency of the presented encapsulation technique for hydrophilic macromolecules, as well as the integrity of the obtained structures, images of the UL formulations according to the present invention containing unfractionated heparin and PVP with a covalently bound chlorin E6 molecule, respectively, were obtained using transmission electron microscopy (see Fig. 7). The obtained images confirm the efficiency of encapsulation of hydrophilic macromolecules in the UL according to the present invention and the high efficiency of the encapsulation method according to the present invention.
ПРИМЕР 11EXAMPLE 11
Для дальнейшей демонстрации высокой эффективности способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению для гидрофильных макромолекул, растворяли 1000 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 1000 мг глицерина (РСС, Poland) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 2000 мг водного раствора, содержащего 10 мг альбумина (Mr более 66 кДа) в 0,1 М NaCl. Эффективность инкапсуляции определяли, как описано в Примере 9 выше.To further demonstrate the high efficiency of the encapsulation method according to the present invention for hydrophilic macromolecules, 1000 mg of Phospholipone 90G (Lipoid AG) was dissolved in 1000 mg of glycerol (PCC, Poland) with stirring (4 h, RT) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained, and then mixed with 2000 mg of an aqueous solution containing 10 mg of albumin (M r more than 66 kDa) in 0.1 M NaCl. Encapsulation efficiency was determined as described in Example 9 above.
В результате получали суспензию УЛ с концентрацией липида 25% от массы указанной суспензии, причем 83% альбумина было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).The result was a suspension of UL with a lipid concentration of 25% by weight of said suspension, with 83% of albumin encapsulated in unilamellar liposomes (UL).
ПРИМЕР 12EXAMPLE 12
Для дальнейшей демонстрации высокой эффективности способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению для гидрофильных макромолекул, растворяли 25 г Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 25 г глицерина (РСС, Poland) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 50 г водной фазы, содержащей 0,5% масс./масс, гепарина в 0,1 М NaCl. Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Для оценки эффективности инкапсуляции полученные суспензии УЛ подвергали ультрафильтрации через кассету Biomax-50 (Merck Millipore) с пороговым диапазоном 140-300 кДа для определения концентрации гидрофильного соединения в обеих частях, а именно снаружи липосом (фракция пермеат) и внутри липосом (фракция ретентат). Концентрации растворенного и инкапсулированного в УЛ гепарина определяли при помощи ВЭЖХ с детектором испарительного рассеяния света и колонкой ГПХ.To further demonstrate the high efficiency of the encapsulation method according to the present invention for hydrophilic macromolecules, 25 g of Phospholipone 90G (Lipoid AG) was dissolved in 25 g of glycerol (PCC, Poland) with stirring (4 h, RT) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained, and then mixed with 50 g of the aqueous phase containing 0.5% wt./mass, heparin in 0.1 M NaCl. The resulting mixture was once extruded through a polycarbonate filter with a pore diameter of 100 nm. To evaluate the efficiency of encapsulation, the resulting UL suspensions were subjected to ultrafiltration through a Biomax-50 cassette (Merck Millipore) with a threshold range of 140–300 kDa to determine the concentration of the hydrophilic compound in both parts, namely, outside the liposomes (permeate fraction) and inside the liposomes (retentate fraction). The concentrations of heparin dissolved and encapsulated in the UL were determined using HPLC with an evaporative light scattering detector and a GPC column.
В результате получали суспензии УЛ с концентрацией липида 25% от массы указанной суспензии, причем 56% гепарина было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).As a result, UL suspensions were obtained with a lipid concentration of 25% by weight of said suspension, with 56% of heparin being encapsulated in unilamellar liposomes (UL).
ПРИМЕР 13EXAMPLE 13
Для дальнейшей демонстрации высокой эффективности способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению для гидрофильных макромолекул, растворяли 30 г Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 20 г глицерина (РСС, Poland) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 50 г водной фазы, содержащей 0,5% масс./масс, гепарина в 0,1 М NaCl. Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Для оценки эффективности инкапсуляции полученные суспензии УЛ подвергали ультрафильтрации через кассету Biomax-50 (Merck Millipore) с пороговым диапазоном 140-300 кДа для определения концентрации гидрофильного соединения в обеих частях, а именно снаружи липосом (фракция пермеат) и внутри липосом (фракция ретентат). Концентрации растворенного и инкапсулированного в УЛ гепарина определяли при помощи ВЭЖХ с детектором испарительного рассеяния света и колонкой ГПХ.To further demonstrate the high efficiency of the encapsulation method according to the present invention for hydrophilic macromolecules, 30 g of Phospholipone 90G (Lipoid AG) was dissolved in 20 g of glycerol (PCC, Poland) with stirring (4 h, RT) until a homogeneous yellow lipid solution was obtained, and then mixed with 50 g of the aqueous phase containing 0.5% wt./mass, heparin in 0.1 M NaCl. The resulting mixture was once extruded through a polycarbonate filter with a pore diameter of 100 nm. To evaluate the efficiency of encapsulation, the resulting UL suspensions were subjected to ultrafiltration through a Biomax-50 cassette (Merck Millipore) with a threshold range of 140–300 kDa to determine the concentration of the hydrophilic compound in both parts, namely, outside the liposomes (permeate fraction) and inside the liposomes (retentate fraction). The concentrations of heparin dissolved and encapsulated in the UL were determined using HPLC with an evaporative light scattering detector and a GPC column.
В результате получали суспензии УЛ с концентрацией липида 30% от массы указанной суспензии, причем 80% гепарина было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).As a result, UL suspensions were obtained with a lipid concentration of 30% by weight of said suspension, with 80% of the heparin being encapsulated in unilamellar liposomes (UL).
Claims (47)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17162568.4 | 2017-03-23 | ||
| EP17162568 | 2017-03-23 | ||
| PCT/EP2018/057400 WO2018172504A1 (en) | 2017-03-23 | 2018-03-23 | High-efficiency encapsulation of hydrophilic compounds in unilamellar liposomes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019130015A RU2019130015A (en) | 2021-04-23 |
| RU2019130015A3 RU2019130015A3 (en) | 2021-04-23 |
| RU2788456C2 true RU2788456C2 (en) | 2023-01-19 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4687661A (en) * | 1983-06-29 | 1987-08-18 | Daiichi Seiyaku Co., Ltd. | Method for producing liposomes |
| RU2574926C9 (en) * | 2004-05-03 | 2020-06-16 | Ипсен Биофарм Лтд. | Liposomal compositions applicable for drug delivery |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4687661A (en) * | 1983-06-29 | 1987-08-18 | Daiichi Seiyaku Co., Ltd. | Method for producing liposomes |
| RU2574926C9 (en) * | 2004-05-03 | 2020-06-16 | Ипсен Биофарм Лтд. | Liposomal compositions applicable for drug delivery |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RINGHIERI P. et al. The influence of liposomal formulation on the incorporation and retention of PNA oligomers // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2016. Vol. 145(1). P. 462-469. ELMOSLEMANY R.M. et al. Propylene Glycol Liposomes as a Topical Delivery System for Miconazole Nitrate: Comparison with Conventional Liposomes // AAPS PharmSciTech. 2012. Vol. 13(2). P. 723-731. ROY B. et al. Influence of Lipid Composition, pH, and Temperature on Physicochemical Properties of Liposomes with Curcumin as Model Drug // J Oleo Sci. 2016. Vol. 65(5). P. 399-411. KULKARNI S.B. et al. Factors affecting microencapsulation of drugs in liposomes // J Microencapsul. 1995. Vol. 12(3). P. 229-246. KONGKANERAMIT L. et al. Development of curcumin liposome formulations using polyol dilution method // Songklanakarin J. Sci. Technol. 2016. Vol. 38(6). P. 605-610. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Laouini et al. | Preparation, characterization and applications of liposomes: state of the art | |
| Jadhav et al. | Novel vesicular system: an overview | |
| US11759424B2 (en) | High-efficiency encapsulation of hydrophilic compounds in unilamellar liposomes | |
| Pinto et al. | Niosomes as nano-delivery systems in the pharmaceutical field | |
| Kuznetsova et al. | Cationic liposomes mediated transdermal delivery of meloxicam and ketoprofen: Optimization of the composition, in vitro and in vivo assessment of efficiency | |
| Dwivedi et al. | Review on preparation and characterization of liposomes with application | |
| Gupta et al. | QbD-based optimization of raloxifene-loaded cubosomal formulation for transdemal delivery: Ex vivo permeability and in vivo pharmacokinetic studies | |
| EP3616726B1 (en) | Protein particle wrapped with medicine insoluble in water and preparation method therefor | |
| ES2909245T3 (en) | Method for producing liposomes | |
| Bangale et al. | Stealth liposomes: a novel approach of targeted drug delivery in cancer therapy | |
| RU2788456C2 (en) | Highly effective encapsulation of hydrophilic compounds in unilamellar liposomes | |
| JP2009132629A (en) | Method for producing liposome preparation | |
| WO2020058892A1 (en) | Deformable liposomes containing micelles | |
| RU2514000C1 (en) | Liposomal composition and method of its preparation | |
| Wasankar et al. | Liposome as a drug delivery system-a review | |
| JPWO2005021012A1 (en) | Gemcitabine encapsulated drug carrier | |
| Petrović et al. | Vesicular drug carriers as delivery systems | |
| Nadaf et al. | Novel liposome derived nanoparticulate drug delivery system: fabrication and prospects | |
| JP2012102043A (en) | Method for producing univesicular liposome, univesicular liposome dispersion and dry powder thereof, and method for producing the univesicular liposome dispersion and dry powder thereof | |
| Raulkar et al. | LIPOSOME AS DRUG DELIVERY SYSTEM: AN OVERVIEW AND THERAPEUTIC APPLICATION | |
| Naeem | Liposomes: A novel drug delivery system | |
| Nikolaisen | Influence of environmental tonicity changes on lipophilic drug release from liposomes | |
| Mor | A BRIEF REVIEW ON LIPOSOME–AS DRUG CARRIER | |
| Somasundaram | International Journal of Pharmacy and Analytical Research (IJPAR) | |
| Ansari et al. | Available Online through Research Article |