RU2787934C1 - Biomimetic material suppressing ice growth and cryopreserving solution containing this material - Google Patents
Biomimetic material suppressing ice growth and cryopreserving solution containing this material Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787934C1 RU2787934C1 RU2021123840A RU2021123840A RU2787934C1 RU 2787934 C1 RU2787934 C1 RU 2787934C1 RU 2021123840 A RU2021123840 A RU 2021123840A RU 2021123840 A RU2021123840 A RU 2021123840A RU 2787934 C1 RU2787934 C1 RU 2787934C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ice
- solution
- pva
- growth
- water
- Prior art date
Links
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims abstract description 191
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 177
- 239000002977 biomimetic material Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 230000001629 suppression Effects 0.000 title abstract description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 136
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 96
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 93
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 claims abstract description 49
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 498
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 218
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 160
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 157
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 120
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 113
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 91
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 86
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 81
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 73
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims description 62
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 claims description 57
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 57
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 claims description 56
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 55
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 55
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 50
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims description 49
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 48
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims description 44
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 41
- 239000002826 coolant Substances 0.000 claims description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 38
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 229940024606 Amino Acids Drugs 0.000 claims description 35
- 229940021015 I.V. solution additive Amino Acids Drugs 0.000 claims description 35
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 35
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 31
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 31
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 31
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 26
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 26
- 238000004088 simulation Methods 0.000 claims description 25
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 22
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 22
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 20
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 claims description 20
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 18
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N Glucono δ-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 claims description 17
- 229960003681 Gluconolactone Drugs 0.000 claims description 17
- 235000012209 glucono delta-lactone Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000000182 glucono-delta-lactone Substances 0.000 claims description 17
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 15
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 14
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 claims description 13
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 12
- 210000003954 Umbilical Cord Anatomy 0.000 claims description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 12
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 12
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 12
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 11
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 11
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 11
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 11
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 claims description 11
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 10
- 230000002338 cryopreservative Effects 0.000 claims description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 9
- -1 saccharide anhydride Chemical class 0.000 claims description 9
- 229960002429 Proline Drugs 0.000 claims description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000003592 biomimetic Effects 0.000 claims description 8
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 claims description 8
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 claims description 6
- 230000000737 periodic Effects 0.000 claims description 6
- 229960003589 Arginine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004020 conductor Substances 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 5
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229920002892 amber Polymers 0.000 claims description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- 238000005381 potential energy Methods 0.000 claims description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003767 Alanine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002449 Glycine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 229960002885 Histidine Drugs 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 210000003856 Spermatozoa Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000004308 accommodation Effects 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000110 cooling liquid Substances 0.000 claims description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- VUKAUDKDFVSVFT-UHFFFAOYSA-N 2-[6-[4,5-bis(2-hydroxypropoxy)-2-(2-hydroxypropoxymethyl)-6-methoxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)-5-methoxyoxane-3,4-diol Chemical compound COC1C(OC)C(OC2C(C(O)C(OC)C(CO)O2)O)C(COC)OC1OC1C(COCC(C)O)OC(OC)C(OCC(C)O)C1OCC(C)O VUKAUDKDFVSVFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000000577 Adipose Tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003754 Fetus Anatomy 0.000 claims description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 2
- 210000003958 Hematopoietic Stem Cells Anatomy 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N Trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 claims description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000002840 non-reducing disaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000004072 triols Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 30
- 238000007792 addition Methods 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 148
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 72
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 64
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 54
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 39
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 36
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 34
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 25
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N Ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 15
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 12
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 12
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 10
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 8
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 8
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 8
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000002609 media Substances 0.000 description 6
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium;hexafluorophosphate Chemical compound F[P-](F)(F)(F)(F)F.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 5
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 5
- 230000001850 reproductive Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 5
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 4
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 4
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 4
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;trifluoroborane Chemical compound FB(F)F.CCOCC KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N (2S)-1-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGYJSURPYAAOMM-UHFFFAOYSA-N 2-ethenoxy-2-methylpropane Chemical compound CC(C)(C)OC=C PGYJSURPYAAOMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOFELREXGAFOI-UHFFFAOYSA-N 4-methylpiperidine Chemical compound CC1CCNCC1 UZOFELREXGAFOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940019746 Antifibrinolytic amino acids Drugs 0.000 description 2
- 108010053481 Antifreeze Proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 2
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N Carbon tetrachloride Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036698 Distribution coefficient Effects 0.000 description 2
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M Propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N Rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 2
- HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N (2S)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3H-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 1
- AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tris[(dimethylamino)methyl]phenol Chemical compound CN(C)CC1=CC(CN(C)C)=C(O)C(CN(C)C)=C1 AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N Bromoacetic acid Chemical compound OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006414 CCl Chemical group ClC* 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- LIKFHECYJZWXFJ-UHFFFAOYSA-N Dimethyldichlorosilane Chemical compound C[Si](C)(Cl)Cl LIKFHECYJZWXFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@@]2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N 0.000 description 1
- 108091006822 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N N,N'-Diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 1
- 101700019262 PVA Proteins 0.000 description 1
- 229940055695 Pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- IPNPIHIZVLFAFP-UHFFFAOYSA-N Phosphorus tribromide Chemical compound BrP(Br)Br IPNPIHIZVLFAFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003014 Totipotent Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 210000002444 Unipotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N butyl vinyl ether Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000001082 cryoprotectant Effects 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000005712 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal Effects 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atoms Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic Effects 0.000 description 1
- 125000000914 phenoxymethylpenicillanyl group Chemical group CC1(S[C@H]2N([C@H]1C(=O)*)C([C@H]2NC(COC2=CC=CC=C2)=O)=O)C 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 201000001204 progressive myoclonus epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявок на патент Китая №№2019102824189, 2019102824225, 2019102824174, 201910282416Х и 2019102819867, поданных в Национальное управление по интеллектуальной собственности Китая 9 апреля 2019 года, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.This application claims priority on the basis of Chinese Patent Applications Nos. 2019102824189, 2019102824225, 2019102824174, 201910282416X, and 2019102819867 filed with the National Intellectual Property Office of China on April 9, 2019, each of which is incorporated herein in its entirety by reference.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Настоящее изобретение относится к технической области биомедицинских материалов и в частности к биомиметическому материалу, подавляющему рост льда, и криоконсервирующему раствору, содержащему этот материал.The present invention relates to the technical field of biomedical materials and in particular to a biomimetic material that inhibits the growth of ice and a cryopreservation solution containing this material.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Криоконсервация представляет собой сохранение биологического материала при сверхнизких температурах, замедляющих или останавливающих метаболизм и деление клеток, с возможностью продолжения их развития после восстановления нормальных физиологических температур. С момента ее создания данная технология стала одной из самых незаменимых исследовательских методик в области естественных наук и была широко принята повсеместно. В последнее время, ввиду нарастающего напряжения современной жизни, год от года наблюдается тенденция к снижению репродуктивной способности у людей, и, соответственно, сохранение репродуктивной способности становится все более и более насущным. Важным средством сохранения репродуктивной способности становится криоконсервация половых клеток человека (сперматозоидов и ооцитов), гонадных тканей и т.п. Кроме того, поскольку мировая человеческая популяция становится все более возрастной, быстро растет потребность в криоконсервации донорских человеческих клеток, тканей или органов, которые могут быть использованы для регенеративной медицины и трансплантации органов. Следовательно, вопрос эффективной криоконсервации ресурсов ценных клеток, тканей и органов на случай непредвиденных ситуаций становится научно-технической проблемой, требующей неотложного решения.Cryopreservation is the preservation of biological material at ultra-low temperatures, slowing down or stopping metabolism and cell division, with the possibility of continuing their development after the restoration of normal physiological temperatures. Since its inception, this technology has become one of the most indispensable research techniques in the life sciences and has been widely adopted worldwide. Recently, due to the increasing stress of modern life, year by year there is a tendency to reduce the reproductive capacity of people, and, accordingly, the preservation of reproductive capacity is becoming more and more urgent. Cryopreservation of human germ cells (spermatozoa and oocytes), gonadal tissues, etc. becomes an important means of preserving reproductive ability. In addition, as the world's human population continues to age, there is a rapidly increasing need for cryopreservation of donor human cells, tissues, or organs that can be used for regenerative medicine and organ transplantation. Consequently, the issue of effective cryopreservation of valuable cell, tissue and organ resources in case of unforeseen situations becomes a scientific and technical problem requiring an urgent solution.
В настоящее время наиболее распространенным способом криоконсервации является витрификация. Технология витрификации предполагает применение проникающего или непроникающего криопротектора. И хотя жидкость внутри и снаружи клетки может быть витрифицирована непосредственно в ходе процесса быстрой заморозки, что позволяет избегать повреждений, связанных с формированием кристаллов льда в процессе замораживания, криоконсервирующие реагенты, известные из современного уровня техники, не обеспечивают эффективного сдерживания роста кристаллов льда в ходе процесса размораживания, что приводит к повреждениям клеток. Поскольку механизмы подавления роста льда у антифризных белков и биомиметических материалов, подавляющих рост льда, на молекулярном уровне все еще неоднозначны и вызывают споры, научно-исследовательские работы в области биомиметических материалов, подавляющих рост льда, базируются на методе «проб и ошибок», т.е. эффект подавления роста льда проверяют у конкретного материала, испытываемого в качестве ингибитора роста льда, что связано с высокой трудоемкостью процесса исследований и низкой вероятностью успеха. Криоконсервирующие реагенты, обычно используемые в настоящее время, характеризуются проблемами, связанными с их неспособностью эффективно сдерживать рост кристаллов льда в ходе процесса размораживания, а также с их высокой токсичностью.Currently, the most common method of cryopreservation is vitrification. Vitrification technology involves the use of a penetrating or non-penetrating cryoprotectant. Although the fluid inside and outside the cell can be vitrified directly during the flash freezing process, avoiding the damage associated with the formation of ice crystals during the freezing process, the cryopreservation reagents known in the state of the art do not effectively control the growth of ice crystals during the process. thawing, which leads to cell damage. Since the mechanisms for inhibiting ice growth in antifreeze proteins and biomimetic materials that inhibit ice growth are still ambiguous and controversial at the molecular level, research work in the field of biomimetic materials that inhibit ice growth is based on the “trial and error” method, i. e. the effect of inhibiting the growth of ice is tested in a specific material tested as an inhibitor of the growth of ice, which is associated with a high laboriousness of the research process and a low success rate. Cryopreservation reagents commonly used today are characterized by problems associated with their inability to effectively control the growth of ice crystals during the thawing process, as well as their high toxicity.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION
Для преодоления недостатков существующего уровня техники в настоящем изобретении предложен способ молекулярного проектирования биомиметических материалов, подавляющих рост льда, и способ скрининга материалов, подавляющих рост льда, руководствуясь которыми исследователи могут целенаправленно синтезировать и отбирать биомиметический материал, подавляющий рост льда. В настоящем изобретении также предложен биомиметический материал, подавляющий рост льда, полученный согласно указанному способу, и криоконсервирующий реагент, содержащий указанный материал.To overcome the shortcomings of the prior art, the present invention provides a method for molecular engineering of ice growth inhibiting biomimetic materials and a screening method for ice growth inhibiting materials, by which researchers can specifically synthesize and select an ice growth inhibiting biomimetic material. The present invention also provides a biomimetic material that inhibits the growth of ice, obtained according to the specified method, and cryopreservation reagent containing the specified material.
В настоящем изобретении предложены следующие технические решения:The present invention proposes the following technical solutions:
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен способ молекулярного проектирования материалов, подавляющих рост льда, включающий следующие стадии:According to a first aspect of the present invention, a method for molecular engineering of ice growth inhibiting materials is provided, comprising the steps of:
(1) создание библиотеки структур молекул соединений, в которой указанные молекулы соединений содержат гидрофильную группу и группу, имеющую сродство ко льду;(1) creating a library of compound molecular structures in which said compound molecules contain a hydrophilic group and a group having an affinity for ice;
(2) моделирование и оценивание способности каждой из молекул соединений распределяться по межфазной границе «лед-вода» путем применения моделирования методом молекулярной динамики (MD); и(2) modeling and evaluating the ability of each of the compound molecules to distribute along the ice-water interface by applying molecular dynamics (MD) modeling; and
(3) скрининг (отбор) молекул соединений, подавляющих рост льда, с желаемой степенью сродства ко льду и воде согласно стадии (2).(3) screening (selection) of molecules of compounds that inhibit the growth of ice, with the desired degree of affinity for ice and water according to stage (2).
Согласно настоящему изобретению основная цепь молекулы, подавляющей рост льда, представляет собой углеродную цепь или пептидную цепь.According to the present invention, the backbone of the ice growth inhibiting molecule is a carbon chain or a peptide chain.
Согласно настоящему изобретению указанная гидрофильная группа представляет собой функциональную группу, способную к образованию нековалентного взаимодействия с молекулой воды, например, путем образования водородной связи, ван-дер-ваальсового взаимодействия, электростатического взаимодействия, гидрофобного взаимодействия или π-π взаимодействия с водой; в качестве иллюстрации гидрофильная группа может быть выбрана из по меньшей мере одной из таких групп, как гидроксильная группа (-ОН), аминогруппа (-NH2), карбоксильная группа (-СООН), амидогруппа (-CONH2) и т.п. или, например, из молекул соединений, таких как гидрофильные аминокислоты, например, пролин (L-Pro), аргинин (L-Arg) и лизин (L-Lys), глюконодельталактон (GDL) и сахарид, или их молекулярных фрагментов.According to the present invention, said hydrophilic group is a functional group capable of forming a non-covalent interaction with a water molecule, for example, by hydrogen bonding, van der Waals interaction, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, or π-π interaction with water; by way of illustration, the hydrophilic group may be selected from at least one of hydroxyl group (-OH), amino group (-NH 2 ), carboxyl group (-COOH), amido group (-CONH 2 ) and the like. or, for example, from compound molecules such as hydrophilic amino acids, for example, proline (L-Pro), arginine (L-Arg) and lysine (L-Lys), gluconodeltalactone (GDL) and saccharide, or molecular fragments thereof.
Согласно настоящему изобретению указанная группа, имеющая сродство ко льду, представляет собой функциональную группу, способную к образованию нековалентного взаимодействия со льдом, например, путем образования водородной связи, ван-дер-ваальсового взаимодействия, электростатического взаимодействия, гидрофобного взаимодействия или π-π взаимодействия со льдом; в качестве иллюстрации группа, имеющая сродство ко льду, может быть выбрана из гидроксила (-ОН), аминогруппы (-NH2), фенила (-С6Н5) и пирролидинила (-C4H8N) или, например, из молекул соединений, таких как аминокислоты, имеющие сродство ко льду, такие как глутамин (L-Gln), треонин (L-Thr) и аспарагиновая кислота (L-Asn), бензольное кольцо (С6H6) и пирролидин (C4H9N), и их молекулярных фрагментов.According to the present invention, said group having an affinity for ice is a functional group capable of forming a non-covalent interaction with ice, for example, by hydrogen bonding, van der Waals interaction, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, or π-π interaction with ice. ; by way of illustration, a group having an affinity for ice may be selected from hydroxyl (-OH), amino (-NH 2 ), phenyl (-C 6 H 5 ) and pyrrolidinyl (-C 4 H 8 N) or, for example, from compound molecules such as amino acids having an affinity for ice such as glutamine (L-Gln), threonine (L-Thr) and aspartic acid (L-Asn), benzene ring (C 6 H 6 ) and pyrrolidine (C 4 H 9 N), and their molecular fragments.
Согласно настоящему изобретению материал, подавляющий рост льда, может быть образован путем связывания гидрофильной группы и группы, имеющей сродство ко льду, посредством ковалентной связи.According to the present invention, the ice growth inhibiting material can be formed by linking a hydrophilic group and a group having an affinity for ice through a covalent bond.
Согласно настоящему изобретению материал, подавляющий рост льда, может быть образован из гидрофильной группы и группы, имеющей сродство ко льду, посредством нековалентной связи, например, за счет ионного взаимодействия.According to the present invention, the ice growth inhibiting material can be formed from a hydrophilic group and a group having an affinity for ice through a non-covalent bond, for example, through ionic interaction.
Согласно настоящему изобретению указанный способ дополнительно включает стадию (4): стадию синтеза молекул соединения, подавляющего рост льда (материала, подавляющего рост льда), например, посредством известных способов химического синтеза, таких как реакция полимеризации, реакция конденсации, или способа биологической ферментации с использованием бактерий, полученных методами генной инженерии.According to the present invention, said method further includes step (4): a step of synthesizing molecules of an ice growth inhibiting compound (ice growth inhibiting material), for example, by known chemical synthesis methods such as a polymerization reaction, a condensation reaction, or a biological fermentation method using bacteria obtained by genetic engineering.
В настоящем изобретении также предложен подавляющий рост льда материал, полученный способом молекулярного проектирования согласно первому аспекту данного изобретения.The present invention also provides an ice growth inhibiting material obtained by the molecular design method according to the first aspect of the present invention.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен способ скрининга материалов, подавляющих рост льда, включающий следующие стадии: (а) определение сродства материала, подавляющего рост льда, к воде и (b) определение способности материала, подавляющего рост льда, распределяться по межфазной поверхности «лед-вода».According to a second aspect of the present invention, there is provided a method for screening ice growth inhibiting materials, comprising the steps of: (a) determining the affinity of the ice growth inhibiting material for water, and (b) determining the ability of the ice growth inhibiting material to spread over an ice- water".
В качестве варианта воплощения настоящего изобретения стадию (а) можно реализовать такими способами, как определение растворимости, константы гидратации, степени диспергирования и коэффициента диффузии материала, подавляющего рост льда, в воде и/или расчет количества межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулами материала, подавляющего рост льда, и молекулами воды; в частности, количество межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулами материала, подавляющего рост льда, и молекулами воды, определяют с помощью MD моделирования, а степень диспергирования материала, подавляющего рост льда, в водном растворе определяют с помощью метода динамического светорассеяния.As an embodiment of the present invention, step (a) can be implemented by methods such as determining the solubility, hydration constant, degree of dispersion, and diffusion coefficient of the ice growth inhibiting material in water and/or calculating the amount of intermolecular hydrogen bonds formed between the molecules of the ice inhibiting material. growth of ice, and water molecules; in particular, the amount of intermolecular hydrogen bonds formed between the molecules of the ice growth inhibiting material and water molecules is determined by MD simulation, and the degree of dispersion of the ice growth inhibiting material in an aqueous solution is determined by the dynamic light scattering method.
В качестве варианта воплощения настоящего изобретения стадию (b) можно реализовать путем определения количества материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда на межфазной границе «лед-вода», и/или сродство материала, подавляющего рост льда, ко льду можно определять путем расчета количества межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулами материала, подавляющего рост льда, и молекулами воды в структуре льда; в частности, количество межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулами материала, подавляющего рост льда, и молекулами воды в структуре льда, определяют с помощью, например, MD моделирования, или количество молекул материала, подавляющего рост льда, адсорбированных на поверхности льда определяют на межфазной границе «лед-вода» в ходе эксперимента по адсорбции материала льдом.As an embodiment of the present invention, step (b) can be performed by determining the amount of ice growth inhibiting material adsorbed on the ice surface at the ice-water interface and/or the affinity of the ice growth inhibiting material to ice can be determined by calculating the number of intermolecular hydrogen bonds formed between the molecules of the material that inhibits the growth of ice and the water molecules in the ice structure; in particular, the number of intermolecular hydrogen bonds formed between the molecules of the ice growth inhibiting material and water molecules in the ice structure is determined by, for example, MD modeling, or the number of ice growth inhibiting material molecules adsorbed on the surface of the ice is determined at the interface "ice-water" during the experiment on the adsorption of material by ice.
Согласно настоящему изобретению эксперимент по адсорбции материала льдом включает определение количества материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда.According to the present invention, the material adsorption experiment on ice includes determining the amount of ice growth inhibiting material adsorbed on the surface of the ice.
Согласно настоящему изобретению количество материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда, = (масса материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда (m1)) / (общая масса материала, подавляющего рост льда, содержащаяся в исходном растворе, содержащем материал, подавляющий рост льда (m2)) × 100%.According to the present invention, the amount of ice growth inhibiting material adsorbed on the ice surface = (mass of ice growth inhibiting material adsorbed on the ice surface (m 1 )) / (total mass of ice growth inhibiting material contained in the initial solution containing the material , suppressing the growth of ice (m 2 )) × 100%.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения эксперимент по адсорбции материала льдом включает следующие стадии:In one embodiment of the present invention, the material adsorption experiment on ice includes the following steps:
S1: взятие навески материала, подавляющего рост льда, массой m2 с приготовлением водного раствора материала, подавляющего рост льда, и охлаждение до температуры переохлаждения;S1: taking a sample of the material that inhibits the growth of ice, mass m 2 with the preparation of an aqueous solution of the material that inhibits the growth of ice, and cooling to a supercooling temperature;
S2: внесение в водный раствор предварительно охлажденного стержня регулирования температуры, так чтобы вызывать рост слоя льда на поверхности стержня регулирования температуры, при этом водный раствор постоянно перемешивают, давая возможность материалу, подавляющему рост льда, равномерно адсорбироваться на поверхности слоя льда, а температуру водного раствора и стержня регулирования температуры поддерживают на уровне температуры переохлаждения раствора; иS2: Introducing the pre-cooled temperature control rod into the aqueous solution so as to cause the ice layer to grow on the surface of the temperature control rod, while the aqueous solution is constantly stirred, allowing the ice growth inhibiting material to be uniformly adsorbed on the surface of the ice layer, and the temperature of the aqueous solution and the temperature control rod is maintained at the subcooling temperature of the solution; and
S3: определение количества m1 материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда.S3: determination of the amount m 1 of the ice growth inhibiting material adsorbed on the surface of the ice.
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения стержень регулирования температуры представляет собой изделие в форме стержня, выполненное из теплопроводящего материала. Изделие в форме стержня может быть сплошным или полым внутри. Если стержень регулирования температуры внутри полый, то в его полой внутренней полости обеспечивается протекание охлаждающей жидкости, а температуру стержня регулирования температуры можно контролировать путем регулирования температуры охлаждающей жидкости, и таким образом контролируется скорость роста блока льда.According to an embodiment of the present invention, the temperature control rod is a rod-shaped product made of a heat-conducting material. The product in the form of a rod may be solid or hollow inside. If the temperature control rod is hollow inside, the cooling liquid is allowed to flow in its hollow interior, and the temperature of the temperature control rod can be controlled by adjusting the temperature of the coolant, and thus the growth rate of the ice block is controlled.
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения стержень регулирования температуры может быть предварительно охлажден одним из таких способов, как замораживание жидким азотом, сухим льдом, с помощью охлаждающего устройства со сверхнизкими температурами и т.п.According to an embodiment of the present invention, the temperature control rod may be pre-cooled by one of the methods such as liquid nitrogen freezing, dry ice, ultra-low temperature cooling apparatus, and the like.
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения степень переохлаждения и время адсорбции на протяжении эксперимента по адсорбции материала льдом поддерживают неизменными, так чтобы площадь поверхности льда, сформировавшегося на поверхности стержня регулирования температуры, оставалась неизменной в пределах допустимой погрешности.According to an embodiment of the present invention, the degree of supercooling and the adsorption time during the material-ice adsorption experiment are kept constant so that the surface area of the ice formed on the surface of the temperature control rod remains unchanged within an allowable error.
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения водный раствор материала, подавляющего рост льда, с различными концентрациями для проведения эксперимента по адсорбции материала льдом готовят таким образом, чтобы можно было оценить применимые диапазоны концентраций того же материала, подавляющего рост льда, в конкретных областях применения.According to an embodiment of the present invention, an aqueous solution of different concentrations of an ice-inhibiting material for conducting an ice adsorption experiment is prepared so that applicable concentration ranges of the same ice-inhibiting material in particular applications can be evaluated.
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения материал, подавляющий рост льда, на стадии S1, может быть мечен флуоресцентной меткой, например, флуоресцеином, и указанный флуоресцеин может быть выбран из по меньшей мере одного из следующих соединений: флуоресцеина изотиоцианата (FITC), тетраэтилродамина (RB200), тетраметилродамина изотиоцианата (TRITC), пропидий иодида (PI) и т.п. Специалистам в данной области техники понятно, что флуоресцентная метка служит для определения количества материала, подавляющего рост льда, и таким образом, если количество адсорбированного материала, подавляющего рост льда, может быть точно измерено другими средствами или сам материал способен поглощать в ультрафиолетовом или флуоресцентном спектре, применение флуоресцентной метки не требуется.According to an embodiment of the present invention, the ice growth inhibiting material in step S1 may be labeled with a fluorescent label, such as fluorescein, and said fluorescein may be selected from at least one of the following compounds: fluorescein isothiocyanate (FITC), tetraethylrhodamine (RB200) , tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), propidium iodide (PI) and the like. Those skilled in the art will appreciate that the fluorescent label serves to determine the amount of ice growth inhibiting material, and thus, if the amount of adsorbed ice growth inhibiting material can be accurately measured by other means, or the material itself is capable of absorbing in the ultraviolet or fluorescent spectrum, the use of a fluorescent label is not required.
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения стадия S3 включает следующее:According to an embodiment of the present invention, step S3 comprises the following:
S3а: извлечение блока льда после адсорбции, промывка поверхности льда очищенной водой и плавление блока льда с получением адсорбционного раствора материала, подавляющего рост льда; иS3a: removing the ice block after adsorption, washing the surface of the ice with purified water, and melting the ice block to obtain an adsorption solution of the ice growth inhibiting material; and
S3b: определение объема V полученного плавлением адсорбционного раствора материала, подавляющего рост льда, определение массово-объемной концентрации (с) материала, подавляющего рост льда, в адсорбционном растворе и расчет массы (m1) материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда, посредством формулы m1=cV.S3b: determining the volume V of the melted adsorption solution of the ice growth inhibiting material, determining the mass-volume concentration (c) of the ice growth inhibiting material in the adsorption solution, and calculating the mass (m 1 ) of the ice growth inhibiting material adsorbed on the surface of the ice, by means of the formula m 1 =cV.
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения на стадии S3b концентрацию с можно определять способами, известными из уровня техники, такими как спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой области спектра и флуоресцентная спектроскопия.According to an embodiment of the present invention, in step S3b, the concentration c can be determined by methods known in the art, such as ultraviolet and visible spectroscopy and fluorescence spectroscopy.
Согласно настоящему изобретению указанный способ применяют для скрининга материала для подавления роста кристаллов льда, такого как ПВС, полиаминокислоты, антифризные белки и полипептиды.According to the present invention, this method is used to screen an ice crystal growth inhibitor material such as PVA, polyamino acids, antifreeze proteins and polypeptides.
Согласно настоящему изобретению после стадии (а) и/или стадии (b) способ дополнительно включает стадию (с): оценку сродства материала к воде и характеристик способности материала распределяться по межфазной поверхности «лед-вода», причем материал с высокой способностью к такому распределению имеет и хорошие показатели по подавлению роста льда.According to the present invention, after step (a) and/or step (b), the method further comprises step (c): evaluating the affinity of the material for water and the characteristics of the ability of the material to distribute along the ice-water interface, and the material with high ability to such distribution It also has good performance in suppressing the growth of ice.
В качестве специальной схемы оценки на стадии (с) настоящего изобретения предложено следующее: чем меньшее количество материала, подавляющего рост кристаллов льда, требуется для покрытия определенной площади поверхности льда, тем лучше показатели распределения этого материала, т.е. удовлетворительным является коэффициент распределения S>0, где S=γI-W - (γIRIA-I+γIria-W), где γI-W является константой, т.е. межфазная энергия на границе раздела «лед-вода» γI-W выше суммы межфазных энергий на границах раздела «материал-лед» и «материал-вода» γIRIA-I+γIRIA-W (где γIRIA-I - межфазная энергия на границе раздела «материал-лед»; γIRIA-W - межфазная энергия на границе раздела «материал-вода»).As a specific evaluation scheme in step (c) of the present invention, the smaller the amount of ice crystal growth inhibiting material required to cover a given ice surface area, the better the spreading performance of that material, i.e. satisfactory is the distribution coefficient S>0, where S=γ IW - (γ IRIA-I +γ Iria-W ), where γ IW is a constant, i.e. interfacial energy at the “ice-water” interface γ IW is higher than the sum of interfacial energies at the “material-ice” and “material-water” interfaces γ IRIA-I + γ IRIA-W (where γ IRIA-I is the interfacial energy at the interface section "material-ice"; γ IRIA-W - interfacial energy at the interface "material-water").
В настоящем изобретении термин «температура переохлаждения» относится к температуре, которая ниже температуры замерзания воды, но при которой вода еще не заморожена и не закристаллизована. При комнатной температуре 25°С температура переохлаждения обычно находится в диапазоне от -0,01 до -0,5°С, например, равна -0,1°С. В настоящем изобретении также предложено устройство для проведения экспериментов по адсорбции материалов льдом, включающее многослойную полость для размещения жидкости, стержень регулирования температуры и температурный регулятор, где многослойная полость для размещения жидкости последовательно включает (перечисляя изнутри наружу) полость для адсорбции материала льдом, полость бани и полость для размещения охлаждающей жидкости; при этом стержень регулирования температуры установлен в полости для адсорбции материала льдом, и температуру стержня регулирования температуры и полости для размещения жидкости регулируют посредством температурного регулятора.In the present invention, the term "subcooling temperature" refers to a temperature that is below the freezing point of water, but at which the water is not yet frozen and crystallized. At a room temperature of 25°C, the subcooling temperature is typically in the range -0.01 to -0.5°C, eg -0.1°C. The present invention also provides an apparatus for conducting material adsorption experiments on ice, including a multilayer liquid accommodating cavity, a temperature control rod, and a temperature controller, wherein the multilayer liquid accommodating cavity successively includes (listed from inside to outside) an ice material adsorption cavity, a bath cavity, and a cavity for placing a coolant; wherein the temperature control rod is installed in the material adsorption cavity by ice, and the temperature of the temperature control rod and the liquid accommodation cavity are controlled by the temperature controller.
В устройстве для проведения экспериментов по адсорбции материалов льдом согласно настоящему изобретению стержень регулирования температуры имеет полую структуру и выполнен из теплопроводящего материала, а полая структура стержня регулирования температуры имеет входное отверстие для жидкости и выходное отверстие для жидкости; температурный регулятор представляет собой жидкостной регулятор температуры и снабжен концевым отверстием для выпуска и концевым отверстием для возврата охлаждающей жидкости; при этом два конца полости для размещения охлаждающей жидкости имеют входное отверстие для жидкости и выходное отверстие для жидкости; причем концевое отверстие для выпуска охлаждающей жидкости температурного регулятора, входное отверстие для жидкости стержня регулирования температуры, выходное отверстие стержня регулирования температуры, входное отверстие резервуара для размещения охлаждающей жидкости, выходное отверстие резервуара для размещения охлаждающей жидкости и концевое отверстие для возврата охлаждающей жидкости температурного регулятора последовательно соединены трубками, по которым протекает охлаждающая жидкость.In the ice adsorption experiment apparatus of the present invention, the temperature control rod has a hollow structure and is made of a heat-conducting material, and the temperature control rod hollow structure has a liquid inlet and a liquid outlet; the temperature controller is a liquid temperature controller and is provided with an outlet end hole and a coolant return end hole; wherein the two ends of the cavity for accommodating the coolant have a liquid inlet and a liquid outlet; wherein the coolant outlet end of the temperature controller, the liquid inlet of the temperature control rod, the outlet of the temperature control rod, the inlet of the coolant accommodating reservoir, the outlet of the coolant accommodating reservoir, and the coolant return end of the temperature controller are connected in series. tubes through which coolant flows.
В устройстве для проведения экспериментов по адсорбции материалов льдом многослойная полость для размещения жидкости снабжена крышкой.In the device for carrying out experiments on the adsorption of materials by ice, the multilayer cavity for placing the liquid is provided with a lid.
При применении устройства полость для адсорбции материала льдом предполагается наполнять водным раствором материала, подавляющего рост льда, и полость бани в среднем слое предполагается заполнять средой для бани, имеющей заданную температуру, например, это может быть водяная баня, ледяная баня или масляная баня; после достижения заданной температуры охлаждающей жидкости охлаждающая жидкость подается из температурного регулятора и поступает в полую структуру стержня регулирования температуры, чтобы регулировать температуру стержня регулирования температуры, затем выходит из выходного отверстия для жидкости стержня регулирования температуры и поступает в полость для размещения охлаждающей жидкости в наружном слое, обеспечивая заданный уровень температуры для среды, используемой в бане, и затем проходит через выходное отверстие резервуара для размещения охлаждающей жидкости и концевое отверстие для возврата охлаждающей жидкости температурного регулятора и поступает в температурный регулятор для циркуляции.When using the apparatus, the ice material adsorption cavity is supposed to be filled with an aqueous solution of the ice growth inhibiting material, and the bath cavity in the middle layer is supposed to be filled with a bath medium having a predetermined temperature, for example, it can be a water bath, an ice bath, or an oil bath; after reaching the set temperature of the coolant, the coolant is supplied from the temperature controller and enters the hollow structure of the temperature control rod to adjust the temperature of the temperature control rod, then exits the liquid outlet of the temperature control rod and enters the coolant housing cavity in the outer layer, providing a predetermined temperature level for the medium used in the bath, and then passes through the outlet of the coolant storage tank and the coolant return end of the temperature controller, and enters the temperature controller for circulation.
Способ молекулярного проектирования и способ скрининга материалов, подавляющих рост льда, согласно настоящему изобретению могут быть реализованы как по отдельности, так и в комбинации. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения предложен комплексный способ проектирования и скрининга материалов, подавляющих рост льда, включающий последовательно: стадии проектирования молекул согласно первому аспекту изобретения и стадии скрининга материалов, подавляющих рост льда, согласно второму аспекту настоящего изобретения.The molecular engineering method and the screening method for ice growth inhibiting materials according to the present invention can be implemented either alone or in combination. In one embodiment, the present invention provides an integrated method for designing and screening ice growth inhibiting materials, comprising in sequence: the steps of designing molecules according to the first aspect of the invention and the steps of screening materials that inhibit the growth of ice, according to the second aspect of the present invention.
В частности указанный способ включает следующие стадии:In particular, said method comprises the following steps:
(1) создание библиотеки структур молекул соединений, в которой указанные молекулы соединений содержат гидрофильную группу и группу, имеющую сродство ко льду;(1) creating a library of compound molecular structures in which said compound molecules contain a hydrophilic group and a group having an affinity for ice;
(2) моделирование и оценка способности каждой молекулы соединения распределяться по межфазной поверхности «лед-вода» путем применения моделирования методом молекулярной динамики (MD); и(2) modeling and evaluating the ability of each compound molecule to distribute over the ice-water interface by applying molecular dynamics (MD) modeling; and
(3) скрининг молекул соединений, подавляющих рост льда, с желаемой степенью сродства ко льду и воде согласно стадии (2);(3) screening molecules of compounds that inhibit the growth of ice, with the desired degree of affinity for ice and water according to stage (2);
(4) синтезирование отобранных в ходе скрининга молекул соединений, подавляющих рост льда (материала, подавляющего рост льда), имеющих желаемое сродство ко льду и воде;(4) synthesizing screened molecules of ice growth inhibiting compounds (ice growth inhibiting material) having the desired affinity for ice and water;
(5) определение сродства материала, подавляющего рост льда, к воде; и(5) determination of the affinity of the material that inhibits the growth of ice to water; and
(7) определение показателей способности материала, подавляющего рост льда, распределяться по межфазной поверхности «лед-вода».(7) determination of indicators of the ability of the material that suppresses the growth of ice to be distributed over the interfacial surface "ice-water".
Согласно техническим решениям, предложенным в настоящем изобретении, за стадией (7) следует стадия (с) по дальнейшей оценке показателей способности материала, подавляющего рост льда, распределяться по межфазной поверхности «лед-вода», причем материал с высокой способностью к такому распределению имеет хорошие показатели по подавлению роста льда.According to the technical solutions proposed in the present invention, step (7) is followed by step (c) to further evaluate the performance of the ability of the material that inhibits the growth of ice to be distributed over the ice-water interface, and the material with high ability to such distribution has good ice growth suppression performance.
В качестве специальной схемы оценки на стадии (с) настоящего изобретения предложено следующее: чем меньшее количество материала, подавляющего рост льда, требуется для покрытия определенной площади поверхности льда, тем лучше показатели распределения этого материала, т.е. удовлетворительным является коэффициент распределения S>0, где S=γI-W - (γIRIA-I+γIRIA-W), γI-W является константой, т.е. межфазная энергия на границе раздела «лед-вода» γI-W выше суммы межфазных энергий на границах раздела «материал-лед» и «материал-вода» γIRIA-I+γIRIA-W (где γIRIA-I - межфазная энергия на границе раздела «материал-лед»; γIRIA-W - межфазная энергия на границе раздела «материал-вода»).As a specific evaluation scheme in step (c) of the present invention, the smaller the amount of ice growth inhibiting material required to cover a certain ice surface area, the better the spreading performance of that material, i.e. satisfactory is the distribution coefficient S>0, where S=γ IW - (γ IRIA-I +γ IRIA-W ), γ IW is a constant, i.e. interfacial energy at the “ice-water” interface γ IW is higher than the sum of interfacial energies at the “material-ice” and “material-water” interfaces γ IRIA-I + γ IRIA-W (where γ IRIA-I is the interfacial energy at the interface section "material-ice"; γ IRIA-W - interfacial energy at the interface "material-water").
Согласно упомянутым выше способам молекулярного проектирования и скрининга авторы настоящего изобретения обнаружили, что тактичность гидроксильных групп также влияет на способность поливинилового спирта (ПВС) контролировать рост кристаллов льда, и кроме того, было обнаружено, что ПВС со специфической диадной синдиотактичностью обладает превосходной способностью контролировать рост кристаллов льда, при этом ПВС должен иметь диадную синдиотактичность (r) в пределах 45%-60% и молекулярную массу в пределах 10-500 кДа, и в более предпочтительном варианте ПВС должен иметь диадную синдиотактичность (r) в пределах 50%-55% и молекулярную массу в пределах 10-30 кДа.According to the above molecular design and screening methods, the present inventors found that the tacticity of hydroxyl groups also affects the ability of polyvinyl alcohol (PVA) to control the growth of ice crystals, and furthermore, it was found that PVA with specific dyad syndiotacticity has an excellent ability to control crystal growth. ice, while PVA should have a dyad syndiotacticity (r) in the range of 45%-60% and a molecular weight in the range of 10-500 kDa, and in a more preferred embodiment, PVA should have a dyad syndiotacticity (r) in the range of 50%-55% and molecular weight in the range of 10-30 kDa.
Согласно настоящему изобретению также проектировали и синтезировали различные пептидные соединения, такие как дипептидные, трипептидные, пептоидные и гликопептидные соединения, которые также показали отличную способность в контролировании роста ледяных кристаллов.The present invention also designed and synthesized various peptide compounds such as dipeptide, tripeptide, peptoid and glycopeptide compounds, which also showed excellent ability in controlling the growth of ice crystals.
Пептидные соединения получают путем реакции аминокислот, имеющих сродство ко льду, таких как треонин (L-Thr), глутамин (L-Gln), аспарагиновая кислота (L-Asn) и т.п., с другими гидрофильными аминокислотами, которые могут быть выбраны из аргинина, пролина, аланина и т.п., или с глюконодельталактоном (GDL) или сахаридами. Пептидные соединения состоят из аминокислот, содержащих группу, имеющую сродство ко льду, и аминокислот, содержащих гидрофильную группу. В одном варианте воплощения аминокислоты, входящие в состав пептидных соединений, представляют собой аминокислоты двух или более типов или аминокислоты одного или более типов и GDL или сахариды.Peptide compounds are obtained by reacting amino acids having an affinity for ice, such as threonine (L-Thr), glutamine (L-Gln), aspartic acid (L-Asn) and the like, with other hydrophilic amino acids which may be selected. from arginine, proline, alanine, and the like, or with gluconodeltalactone (GDL) or saccharides. Peptide compounds are composed of amino acids containing a group having an affinity for ice and amino acids containing a hydrophilic group. In one embodiment, the amino acids included in the peptide compounds are two or more types of amino acids, or one or more types of amino acids and GDL or saccharides.
Согласно настоящему изобретению также было установлено, что некоторые специфические аминокислоты или полиаминокислоты обладают отличной способностью в контролировании роста ледяных кристаллов.According to the present invention, it has also been found that certain specific amino acids or polyamino acids have excellent ability in controlling the growth of ice crystals.
Указанные аминокислоты представляют собой аминокислоты, содержащие группу, имеющую сродство ко льду, и гидрофильную группу, а указанные полиаминокислоты представляют собой гомополимеры аминокислот, например, полиаминокислота представляет собой гомополимер аминокислоты, выбранной из аргинина, треонина, пролина, лизина, гистидина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина и т.п.; степень полимеризации равна предпочтительно 2-40, более предпочтительно 2-20, например, 6, 8, 15 или 20; например, полиаминокислота представляет собой одну из таких полиаминокислот, как поли-L-пролин, поли-L-аргинин, или комбинацию из двух или более таких полиаминокислот.Said amino acids are amino acids containing an ice affinity group and a hydrophilic group, and said polyamino acids are amino acid homopolymers, for example, polyamino acid is an amino acid homopolymer selected from arginine, threonine, proline, lysine, histidine, glutamic acid, aspartic acids, glycine, and the like; the degree of polymerization is preferably 2-40, more preferably 2-20, such as 6, 8, 15 or 20; for example, the polyamino acid is one of such polyamino acids as poly-L-proline, poly-L-arginine, or a combination of two or more of these polyamino acids.
В качестве иллюстрации аминокислоту выбирают из одной или двух таких аминокислот, как аргинин, треонин, пролин, лизин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глицин и т.п., например, это может быть комбинация аргинина и треонина.By way of illustration, the amino acid is selected from one or two of the amino acids arginine, threonine, proline, lysine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, glycine, and the like, for example, it may be a combination of arginine and threonine.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложен криоконсервирующий раствор, содержащий материал, подавляющий рост льда, спроектированный способом согласно первому аспекту настоящего изобретения, или материал, подавляющий рост льда, отобранный способом скрининга согласно второму аспекту настоящего изобретения. В одном из вариантов воплощения данного изобретения материал, подавляющий рост льда, представляет собой одно или комбинацию одного или более из таких соединений, как ПВС, аминокислота или полиаминокислота и/или пептидное соединение; указанный криоконсервирующий раствор также содержит полиол, водорастворимый сахарид (или его производное, например, водорастворимую целлюлозу) и буфер.According to a third aspect of the present invention, there is provided a cryopreservation solution containing an ice growth inhibiting material designed by the method according to the first aspect of the present invention, or an ice growth inhibiting material selected by the screening method according to the second aspect of the present invention. In one embodiment of the present invention, the ice growth inhibiting material is one or a combination of one or more of PVA, an amino acid or polyamino acid, and/or a peptide compound; said cryopreservation solution also contains a polyol, a water-soluble saccharide (or a derivative thereof, such as water-soluble cellulose), and a buffer.
В одном из вариантов воплощения данного изобретения криоконсервирующий раствор содержит пептидное соединение и в частности содержит на 100 мл 0,1-50 г пептидного соединения, 0-6,0 г ПВС, 0-9,0 г полиаминокислоты, 0-15 мл ДМСО, 5-45 мл полиола, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, 0-30 мл сыворотки, при этом остальное количество составляет буфер.In one embodiment of this invention, the cryopreservation solution contains a peptide compound and in particular contains per 100 ml 0.1-50 g of the peptide compound, 0-6.0 g of PVA, 0-9.0 g of polyamino acid, 0-15 ml of DMSO, 5-45 ml of polyol, water-soluble saccharide at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, 0-30 ml of serum, while the rest is buffer.
В одном из вариантов воплощения данного изобретения криоконсервирующий раствор содержит ПВС и в частности содержит на 100 мл 0,01-6,0 г ПВС, 0-50 г пептидного соединения, 0-9,0 г полиаминокислоты, 0-15 мл ДМСО, 5-45 мл полиола, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, 0-30 мл сыворотки, при этом остальное количество составляет буфер.In one embodiment of the present invention, the cryopreservation solution contains PVA and in particular contains per 100 ml 0.01-6.0 g PVA, 0-50 g peptide compound, 0-9.0 g polyamino acid, 0-15 ml DMSO, 5 -45 ml of polyol, water-soluble saccharide at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, 0-30 ml of serum, while the rest is buffer.
В одном из вариантов воплощения данного изобретения криоконсервирующий раствор содержит аминокислоту или полиаминокислоту и в частности содержит на 100 мл 0,1-50 г аминокислоты или полиаминокислоты, 0-6,0 г ПВС, 0-15 мл ДМСО, 5-45 мл полиола, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, 0-30 мл сыворотки, при этом остальное количество составляет буфер. Согласно настоящему изобретению содержание аминокислоты и/или полиаминокислоты в криоконсервирующем растворе может быть в пределах 0,5-50 г, предпочтительно в пределах 1,0-35 г на 100 мл. Например, содержание аминокислоты может составлять 5,0-35 г, предпочтительно 15-25 г в присутствии аминокислоты; содержание полиаминокислоты может составлять 0,5-9,0 г, предпочтительно 1,0-5,0 г в присутствии полиаминокислоты.In one embodiment of the present invention, the cryopreservation solution contains an amino acid or a polyamino acid, and in particular contains per 100 ml 0.1-50 g of an amino acid or a polyamino acid, 0-6.0 g of PVA, 0-15 ml of DMSO, 5-45 ml of a polyol, water-soluble saccharide at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, 0-30 ml of serum, while the rest is a buffer. According to the present invention, the content of the amino acid and/or polyamino acid in the cryopreservation solution may be in the range of 0.5-50 g, preferably in the range of 1.0-35 g per 100 ml. For example, the amino acid content may be 5.0-35 g, preferably 15-25 g in the presence of the amino acid; the content of the polyamino acid may be 0.5-9.0 g, preferably 1.0-5.0 g in the presence of the polyamino acid.
Согласно настоящему изобретению полиол может представлять собой полиол, имеющий 2-5 атомов углерода, предпочтительно диол, имеющий 2-3 атома углерода, и/или триол, например, любой из таких полиолов, как этиленгликоль, пропиленгликоль и глицерин; предпочтительным вариантом является этиленгликоль.According to the present invention, the polyol may be a polyol having 2-5 carbon atoms, preferably a diol having 2-3 carbon atoms and/or a triol, for example any of polyols such as ethylene glycol, propylene glycol and glycerin; the preferred option is ethylene glycol.
Согласно настоящему изобретению водорастворимый сахарид может представлять собой по меньшей мере один из таких вариантов, как невосстанавливающий дисахарид, водорастворимый полисахарид, водорастворимая целлюлоза и гликозид, и, например, может быть выбран из сахарозы, трегалозы, гидроксипропилметилцеллюлозы и полисахарозы; предпочтительным вариантом является сахароза. Водорастворимый сахарид может защищать клеточные мембраны и препятствовать седиментации клеток.According to the present invention, the water-soluble saccharide may be at least one of a non-reducing disaccharide, a water-soluble polysaccharide, a water-soluble cellulose, and a glycoside, and, for example, may be selected from sucrose, trehalose, hydroxypropyl methylcellulose, and polysucrose; the preferred option is sucrose. The water-soluble saccharide can protect cell membranes and prevent cell sedimentation.
Согласно настоящему изобретению буфер может быть выбран из по меньшей мере одного из DPBS, HEPES-буферизованного HTF или другого буфера для культивирования клеток.According to the present invention, the buffer may be selected from at least one of DPBS, HEPES-buffered HTF, or other cell culture buffer.
Согласно настоящему изобретению сыворотка может содержать человеческий сывороточный альбумин или его заместитель, такой как додецилсульфат натрия, для криоконсервации материала человеческого происхождения, и может содержать фетальную бычью сыворотку или бычий сывороточный альбумин для криоконсервации материала не человеческого происхождения.According to the present invention, the serum may contain human serum albumin or its substitute, such as sodium dodecyl sulfate, for cryopreservation of material of human origin, and may contain fetal bovine serum or bovine serum albumin for cryopreservation of material of non-human origin.
Согласно настоящему изобретению содержание ДМСО в криоконсервирующем растворе составляет 0-10 мл, предпочтительно 1,0-7,5 мл, например, 1,5-5 мл, на 100 мл. В другом варианте воплощения данного изобретения содержание ДМСО в криоконсервирующем растворе составляет 0 в 100 мл.According to the present invention, the content of DMSO in the cryopreservation solution is 0-10 ml, preferably 1.0-7.5 ml, for example 1.5-5 ml, per 100 ml. In another embodiment of this invention, the content of DMSO in the cryopreservation solution is 0 per 100 ml.
Согласно настоящему изобретению содержание сыворотки в криоконсервирующем растворе составляет 0,1-30 мл, например, 5,0-20 мл и 10-15 мл на 100 мл. В другом варианте воплощения данного изобретения содержание сыворотки в криоконсервирующем растворе составляет 0 в 100 мл.According to the present invention, the serum content of the cryopreservation solution is 0.1-30 ml, for example 5.0-20 ml and 10-15 ml per 100 ml. In another embodiment of the invention, the serum content of the cryopreservation solution is 0 per 100 ml.
Согласно настоящему изобретению содержание водорастворимого сахарида в криоконсервирующем растворе составляет 0,1-1,0 моль/л, например, 0,1-0,8 моль/л и 0,2-0,6 моль/л в 100 мл, в частности, например, 0,25 моль/л, 0,5 моль/л или 1,0 моль/л.According to the present invention, the content of water-soluble saccharide in the cryopreservation solution is 0.1-1.0 mol/l, for example, 0.1-0.8 mol/l and 0.2-0.6 mol/l in 100 ml, in particular , for example, 0.25 mol/l, 0.5 mol/l or 1.0 mol/l.
Согласно настоящему изобретению содержание полиола в криоконсервирующем растворе составляет 5,0-40 мл, например, 6,0-20 мл и 9-15 мл в 100 мл.According to the present invention, the content of the polyol in the cryopreservation solution is 5.0-40 ml, for example 6.0-20 ml and 9-15 ml per 100 ml.
Согласно настоящему изобретению рН криоконсервирующего раствора составляет 6,5-7,6, например, 6,9-7,2. Согласно настоящему изобретению пептидные соединения или аминокислоты и полиаминокислоты имеют вышеуказанные значения.According to the present invention, the pH of the cryopreservation solution is 6.5-7.6, for example 6.9-7.2. According to the present invention, peptide compounds or amino acids and polyamino acids have the above meanings.
Согласно настоящему изобретению ПВС выбирают из одного или комбинации из двух или более ПВС, таких как изотактический ПВС, синдиотактический ПВС и атактический ПВС. Например, ПВС имеет диадную синдиотактичность в пределах 15%-65%, в частности, например, в пределах 40%-60% или 53%-55%. Предпочтителен атактический ПВС, например, ПВС с диадной синдиотактичностью в пределах 45%-65%.According to the present invention, the PVA is selected from one or a combination of two or more PVA, such as isotactic PVA, syndiotactic PVA and atactic PVA. For example, PVA has a dyad syndiotacticity in the range of 15%-65%, in particular, for example, in the range of 40%-60% or 53%-55%. Atactic PVA is preferred, eg PVA with dyad syndiotacticity in the range of 45%-65%.
Согласно настоящему изобретению ПВС может быть выбран из ПВС с молекулярной массой 10-500 кДа или более, например, 10-30 кДа, 30-50 кДа, 80-90 кДа или 200-500 кДа.According to the present invention, PVA can be selected from PVA with a molecular weight of 10-500 kDa or more, such as 10-30 kDa, 30-50 kDa, 80-90 kDa or 200-500 kDa.
Согласно настоящему изобретению ПВС может быть выбран из ПВС, имеющих степень гидролиза более 80%, например, 80%-99%, 82%-87%, 87%-89%, 89%-99% или 98%-99%.According to the present invention, PVA can be selected from PVA having a degree of hydrolysis of more than 80%, for example, 80%-99%, 82%-87%, 87%-89%, 89%-99% or 98%-99%.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл: 0,5-50 г аминокислоты, 5,0-45 мл полиола, 0-10 мл ДМСО, 0,1-30 мл сыворотки, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер. Предпочтительно криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл: 2,0-20 г L-Arg, 1,0-10 г L-Thr, 5,0-15 мл этиленгликоля, 5,0-10 мл ДМСО, 5,0-20 мл сыворотки, сахарозу в концентрации 0,1-1,0 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер DPBS.In one embodiment of the present invention, the cryopreservation solution contains the following components per 100 ml: 0.5-50 g of amino acid, 5.0-45 ml of polyol, 0-10 ml of DMSO, 0.1-30 ml of serum, water-soluble saccharide at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, while the rest is the buffer. Preferably, the cryopreservation solution contains the following components per 100 ml: 2.0-20 g L-Arg, 1.0-10 g L-Thr, 5.0-15 ml ethylene glycol, 5.0-10 ml DMSO, 5. 0-20 ml of serum, sucrose at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, with the rest being DPBS buffer.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл: 0,5-9,0 г полиаминокислоты, 5,0-45 мл полиола, 0-10 мл ДМСО, 5,0-20 мл сыворотки, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер. Предпочтительно криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в расчете на объем 100 мл: 1,0-8,0 г поли-L-пролина или поли-L-аргинина, 5-45 мл этиленгликоля, 0,1-10 мл ДМСО, 5,0-20 мл сыворотки, сахарозу в концентрации 0,1-1,0 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер DPBS.In one of the embodiments of the present invention, the cryopreservation solution contains the following components per 100 ml: 0.5-9.0 g of polyamino acid, 5.0-45 ml of polyol, 0-10 ml of DMSO, 5.0-20 ml of serum, water-soluble saccharide at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, while the rest is a buffer. Preferably, the cryopreservation solution contains the following components, based on a volume of 100 ml: 1.0-8.0 g of poly-L-proline or poly-L-arginine, 5-45 ml of ethylene glycol, 0.1-10 ml of DMSO, 5.0 -20 ml of serum, sucrose at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, with the rest being DPBS buffer.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в расчете на объем 100 мл: 0,01-6,0 г ПВС, 5,0-45 мл полиола, 0,1-30 мл сыворотки, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер.In one embodiment of the present invention, the cryopreservation solution contains the following components per 100 ml volume: 0.01-6.0 g of PVA, 5.0-45 ml of polyol, 0.1-30 ml of whey, water-soluble saccharide at a concentration of 0 ,1-1.0 mol/l, while the rest is the buffer.
Предпочтительно криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл: 0,01-6,0 г ПВС, 5,0-30 мл этиленгликоля, 10-20 мл сыворотки, сахарозу в концентрации 0,1-0,6 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер DPBS.Preferably, the cryopreservation solution contains the following components per 100 ml: 0.01-6.0 g of PVA, 5.0-30 ml of ethylene glycol, 10-20 ml of serum, sucrose at a concentration of 0.1-0.6 mol/l, the remainder being the DPBS buffer.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл: 1,0-5,0 г ПВС, 5,0-20 мл полиола, 0,1-10 мл ДМСО, 0,1-20 мл сыворотки, водорастворимый сахарид в концентрации 0,2-0,8 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер. Предпочтительно криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл: 1,0-4,0 г ПВС, 5,0-15 мл этиленгликоля, 4-10 мл ДМСО, 10-20 мл сыворотки, сахарозу в концентрации 0,2-0,6 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер DPBS.In one embodiment of the present invention, the cryopreservation solution contains the following components per 100 ml: 1.0-5.0 g PVA, 5.0-20 ml polyol, 0.1-10 ml DMSO, 0.1-20 ml serum, a water-soluble saccharide at a concentration of 0.2-0.8 mol/l, with the rest being a buffer. Preferably, the cryopreservation solution contains the following components per 100 ml: 1.0-4.0 g of PVA, 5.0-15 ml of ethylene glycol, 4-10 ml of DMSO, 10-20 ml of serum, sucrose at a concentration of 0.2-0 .6 mol/l, with the rest being DPBS buffer.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в объеме 100 мл: 0,1-6,0 г ПВС, 10-45 мл полиола, водорастворимый сахарид в концентрации 0,2-1,0 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер. Предпочтительно криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в объеме 100 мл: 1,0-5,0 г ПВС, 5,0-20 мл этиленгликоля, сахарозу в концентрации 0,2-0,6 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер DPBS.In one of the embodiments of the present invention, the cryopreservation solution contains the following components in a volume of 100 ml: 0.1-6.0 g of PVA, 10-45 ml of polyol, water-soluble saccharide at a concentration of 0.2-1.0 mol/l, while the rest is the buffer. Preferably, the cryopreservation solution contains the following components in a volume of 100 ml: 1.0-5.0 g of PVA, 5.0-20 ml of ethylene glycol, sucrose at a concentration of 0.2-0.6 mol/l, while the rest is DPBS buffer .
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в объеме 100 мл: 0,5-9,0 г полиаминокислоты, 5,0-45 мл полиола, 0,1-6 г ПВС, 0-20 мл сыворотки, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер. Предпочтительно криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в объеме 100 мл: 1,0-8,0 г поли-L-пролина или поли-L-аргинина, 5-45 мл этиленгликоля, 0,1-6 г ПВС, 5,0-20 мл сыворотки, сахарозу в концентрации 0,1-1,0 моль/л, при этом остальное количество составляет буфер DPBS.In one embodiment of the present invention, the cryopreservation solution contains the following components in a volume of 100 ml: 0.5-9.0 g of polyamino acid, 5.0-45 ml of polyol, 0.1-6 g of PVA, 0-20 ml of serum, water-soluble saccharide at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, while the rest is a buffer. Preferably, the cryopreservation solution contains the following components in a volume of 100 ml: 1.0-8.0 g of poly-L-proline or poly-L-arginine, 5-45 ml of ethylene glycol, 0.1-6 g of PVA, 5.0-20 ml of serum, sucrose at a concentration of 0.1-1.0 mol/l, while the rest is buffer DPBS.
В настоящем изобретении дополнительно представлен способ приготовления криоконсервирующего раствора, включающий следующие стадии:The present invention further provides a method for preparing a cryopreservation solution, comprising the following steps:
(1) взятие навески одной или нескольких аминокислот или полиаминокислоты, ПВС и пептидного соединения, растворение по отдельности в порции буфера и доведение рН с получением раствора;(1) taking a sample of one or more amino acids or polyamino acids, PVA and peptide compounds, dissolving separately in a portion of the buffer and adjusting the pH to obtain a solution;
(2) растворение водорастворимого сахарида в другой порции буфера, и после полного растворения водорастворимого сахарида добавление других компонентов, за исключением сыворотки, с получением раствора; и(2) dissolving the water-soluble saccharide in another portion of the buffer, and after completely dissolving the water-soluble saccharide, adding other components, with the exception of whey, to obtain a solution; and
(3) охлаждение растворов, полученных на стадии (1) и стадии (2), до комнатной температуры, после чего их смешивают, регулируют рН и доводят до заданного объема буфером с получением криоконсервирующего раствора.(3) cooling the solutions obtained in stage (1) and stage (2) to room temperature, after which they are mixed, adjust the pH and bring to a predetermined volume with a buffer to obtain a cryopreservative solution.
Согласно способу приготовления криоконсервирующего раствора, предложенного в настоящем изобретении, если криоконсервирующий раствор содержит сыворотку, то эту сыворотку добавляют при применении криоконсервирующего раствора.According to the method for preparing the cryopreservation solution of the present invention, if the cryopreservation solution contains serum, then this serum is added when the cryopreservation solution is used.
Согласно способу приготовления, раскрытого в данном документе, ПВС растворяют путем нагревания на теплой бане и перемешивания, и, например, нагревание производят на водяной бане или на масляной бане; например, температура водяной бани составляет 65-85°С или 70-80°С; перемешивание представляет собой механическое перемешивание, например, с помощью магнитной мешалки.According to the preparation method disclosed herein, PVA is dissolved by heating in a warm bath and stirring, and, for example, heating is performed in a water bath or an oil bath; for example, the temperature of the water bath is 65-85°C or 70-80°C; the stirring is mechanical stirring, for example with a magnetic stirrer.
Согласно способу приготовления, раскрытого в данном документе, растворение водорастворимого сахарида представляет собой растворение с помощью ультразвука.According to the method of preparation disclosed in this document, the dissolution of water-soluble saccharide is dissolution using ultrasound.
Криоконсервирующий раствор, раскрытый в данном документе, можно применять в комбинации с замораживающим уравновешивающим раствором. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения предложен замораживающим уравновешивающий раствор, содержащий в расчете на 100 мл 5,0-45 мл полиола и буфер (остающийся объем до 100 мл).The cryopreservation solution disclosed herein can be used in combination with a freezing equilibration solution. In one embodiment, the present invention provides a freezing equilibration solution containing, per 100 ml, 5.0-45 ml of polyol and a buffer (remaining volume up to 100 ml).
Замораживающий уравновешивающий раствор, раскрытый в данном документе, дополнительно и необязательно содержит 0-15 мл ДМСО, 0-30 мл сыворотки и/или 0-5,0 г ПВС.The freezing equilibration solution disclosed herein additionally and optionally contains 0-15 ml of DMSO, 0-30 ml of serum and/or 0-5.0 g of PVA.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в данном документе, содержание полиола составляет 6,0-28 мл, например, 7,0-20 мл или 10-15 мл.In the freezing equilibration solution disclosed herein, the content of the polyol is 6.0-28 ml, for example 7.0-20 ml or 10-15 ml.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в данном документе, содержание ДМСО составляет 0,1-15 мл, например, 1,0-10 мл или 5,0-7,5 мл. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения содержание ДМСО равно 0.The freeze equilibration solution disclosed herein has a DMSO content of 0.1-15 ml, such as 1.0-10 ml or 5.0-7.5 ml. In one embodiment of the present invention, the DMSO content is 0.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в данном документе, содержание сыворотки составляет 0,1-30 мл, например, 5,0-20 мл или 10-15 мл. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения содержание сыворотки равно 0.In the freezing equilibration solution disclosed herein, the serum content is 0.1-30 ml, for example 5.0-20 ml or 10-15 ml. In one embodiment of the present invention, the serum content is 0.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в данном документе, содержание ПВС составляет 0,1-5,0 г, например, 0,1 г, 0,5 г, 1,0 г или 2,0 г. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения содержание ПВС равно 0.The freeze balance solution disclosed herein has a PVA content of 0.1-5.0 g, such as 0.1 g, 0.5 g, 1.0 g, or 2.0 g. In one embodiment of the present invention, the PVA content is 0.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в данном документе, полиол, сыворотку и буфер можно выбирать из таких же вариантов, какие используются и в криоконсервирующем растворе. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения, если криоконсервирующий раствор не содержит сыворотку, то в замораживающий уравновешивающий раствор добавляют ПВС.In the freezing equilibration solution disclosed herein, the polyol, serum and buffer can be selected from the same options as used in the cryopreservation solution. In one embodiment of the present invention, if the cryopreservation solution does not contain serum, then PVA is added to the freezing equilibration solution.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения замораживающий уравновешивающий раствор в расчете на 100 мл содержит 5,0-7,5 мл полиола, 5,0-7,5 мл ДМСО, 10-20 мл сыворотки и буфер (остающийся объем до 100 мл).In one embodiment of the present invention, the freezing equilibration solution per 100 ml contains 5.0-7.5 ml of polyol, 5.0-7.5 ml of DMSO, 10-20 ml of serum and buffer (remaining volume up to 100 ml) .
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения замораживающий уравновешивающий раствор в расчете на 100 мл содержит 7,5-15 мл полиола, 10-20 мл сыворотки и буфер (остающийся объем до 100 мл).In one embodiment of the present invention, the freezing equilibration solution per 100 ml contains 7.5-15 ml of polyol, 10-20 ml of serum and buffer (remaining volume up to 100 ml).
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения замораживающий уравновешивающий раствор в расчете на 100 мл содержит 1,0-5,0 г ПВС, 7,5-15 мл полиола и буфер (остающийся объем до 100 мл).In one embodiment of the present invention, the freezing equilibration solution per 100 ml contains 1.0-5.0 g of PVA, 7.5-15 ml of polyol and buffer (remaining volume up to 100 ml).
В настоящем изобретении дополнительно представлен способ приготовления замораживающего уравновешивающего раствора, включающий растворение каждого компонента в буфере, хранение сыворотки отдельно и добавление сыворотки к замораживающему уравновешивающему раствору при его применении.The present invention further provides a method for preparing a freezing equilibration solution, comprising dissolving each component in a buffer, storing the serum separately, and adding the serum to the freezing equilibration solution when it is used.
Криоконсервирующий реагент содержит упомянутый выше замораживающий уравновешивающий раствор и упомянутый выше криоконсервирующий раствор, причем указанный замораживающий уравновешивающий раствор и указанный криоконсервирующий раствор представлены независимо.The cryopreservation reagent contains the aforementioned freezing equilibration solution and the aforementioned cryopreservation solution, wherein said freezing equilibration solution and said cryopreservation solution are presented independently.
В криоконсервирующем реагенте, раскрытом в данном документе, если криоконсервирующий раствор не содержит сыворотку, то в замораживающий уравновешивающий раствор добавляют ПВС.In the cryopreservation reagent disclosed herein, if the cryopreservation solution does not contain serum, then PVA is added to the freezing equilibration solution.
В частности, если содержание ДМСО в криоконсервирующем растворе равно 0, то замораживающий уравновешивающий раствор в расчете на 100 мл содержит 0-5,0 г ПВС, 7,5-15 мл полиола, 10-20 мл сыворотки и буфер (остающийся объем до 100 мл). Если содержания ДМСО и сыворотки в криоконсервирующем растворе одновременно равны 0, то замораживающий уравновешивающий раствор в расчете на 100 мл содержит 1,0-5,0 г ПВС, 7,5-15 мл полиола и буфер (остающийся объем до 100 мл).In particular, if the content of DMSO in the cryopreservation solution is 0, then the freezing equilibration solution per 100 ml contains 0-5.0 g of PVA, 7.5-15 ml of polyol, 10-20 ml of serum and buffer (the remaining volume is up to 100 ml). If the contents of DMSO and serum in the cryopreservation solution are simultaneously equal to 0, then the freezing balancing solution per 100 ml contains 1.0-5.0 g of PVA, 7.5-15 ml of polyol and buffer (the remaining volume is up to 100 ml).
Криоконсервирующий раствор или замораживающий уравновешивающий раствор, раскрытые в данном документе, можно применять для криоконсервации различных клеток, тканей и органов. Различные типы клеток включают, но не ограничиваются ими, половые клетки, такие как ооциты и сперматозоиды, и различные стволовые клетки, такие как пуповинные мезенхимальные стволовые клетки; различные типы тканей включают, но не ограничиваются ими, овариальные ткани, эмбриональные ткани и оплодотворенные яйцеклетки; различные типы органов включают, но не ограничиваются ими, яичники или другие органы млекопитающих.The cryopreservation solution or freezing equilibration solution disclosed herein can be used to cryopreserve a variety of cells, tissues, and organs. Various cell types include, but are not limited to, germ cells such as oocytes and spermatozoa, and various stem cells such as umbilical cord mesenchymal stem cells; various tissue types include, but are not limited to, ovarian tissues, fetal tissues, and fertilized eggs; various types of organs include, but are not limited to, ovaries or other mammalian organs.
Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение упомянутых выше криоконсервирующего раствора или замораживающего уравновешивающего раствора, или комбинации этих растворов для криоконсервации клеток, тканей и органов. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения упомянутые выше криоконсервирующий раствор или замораживающий уравновешивающий раствор, или комбинацию этих растворов применяют для криоконсервации ооцитов; в одном из вариантов воплощения настоящего изобретения упомянутые выше криоконсервирующий раствор или замораживающий уравновешивающий раствор, или комбинацию этих растворов применяют для криоконсервации эмбрионов; в одном из вариантов воплощения настоящего изобретения упомянутые выше криоконсервирующий раствор или криоконсервирующий уравновешивающий раствор, или комбинацию этих растворов применяют для криоконсервации овариальных тканей или овариальных органов; в одном из вариантов воплощения настоящего изобретения упомянутые выше криоконсервирующий раствор или замораживающий уравновешивающий раствор, или комбинацию этих растворов применяют для криоконсервации стволовых клеток.In addition, the present invention proposes the use of the aforementioned cryopreservation solution or freezing equilibration solution, or a combination of these solutions for cryopreservation of cells, tissues and organs. In one embodiment of the present invention, the aforementioned cryopreservation solution or freezing equilibration solution, or a combination of these solutions, is used to cryopreserve oocytes; in one embodiment of the present invention, the aforementioned cryopreservation solution or freezing equilibration solution, or a combination of these solutions, is used to cryopreserve embryos; in one embodiment of the present invention, the cryopreservation solution or cryopreservation equilibration solution mentioned above, or a combination of these solutions, is used to cryopreserve ovarian tissues or ovarian organs; in one embodiment of the present invention, the aforementioned cryopreservation solution or freezing equilibration solution, or a combination of these solutions, is used to cryopreserve stem cells.
В настоящем изобретении также предложен способ замораживания и размораживания клеток или эмбрионов, включающий следующее:The present invention also provides a method for freezing and thawing cells or embryos, comprising the following:
(1) помещение клеток или эмбрионов в криоконсервирующий раствор, раскрытый в данном документе, с получением суспензии клеток, и замораживание ее; и(1) placing the cells or embryos in the cryopreservation solution disclosed herein to form a cell suspension and freezing it; and
(2) помещение клеток или эмбрионов в размораживающий раствор для размораживания.(2) placing the cells or embryos in a thawing solution for thawing.
Согласно раскрытому в данном документе способу замораживания и размораживания клетки или эмбрионы сначала помещают в уравновешивающий раствор для достижения равновесия, после чего их помещают в криоконсервирующий раствор.According to the method of freezing and thawing disclosed herein, cells or embryos are first placed in an equilibrating solution to achieve equilibrium, after which they are placed in a cryopreserving solution.
В настоящем изобретении дополнительно предложен способ криоконсервации стволовых клеток, в котором применяют микрокапельный метод. Например, способ криоконсервации стволовых клеток включает следующие стадии: добавление к стволовым клеткам криоконсервирующего раствора, пипетирование смеси для диспергирования стволовых клеток с получением суспензии стволовых клеток, и помещение суспензии стволовых клеток на предметное стекло для замораживания и криоконсервация в жидком азоте (при -196°С).The present invention further provides a method for cryopreservation of stem cells, which uses a microdroplet method. For example, the stem cell cryopreservation method includes the following steps: adding a cryopreservation solution to the stem cells, pipetting the stem cell dispersion mixture to obtain a stem cell suspension, and placing the stem cell suspension on a glass slide for freezing and cryopreservation in liquid nitrogen (at -196°C ).
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения размораживание криоконсервированных стволовых клеток включает помещение предметного стекла с замороженными стволовыми клетками в среду а-МЕМ и размораживание клеток при температуре 37°С.According to an embodiment of the present invention, thawing cryopreserved stem cells involves placing a glass slide with frozen stem cells in a-MEM medium and thawing the cells at 37°C.
Согласно варианту воплощения настоящего изобретения упомянутые стволовые клетки представляют собой различные стволовые клетки, которые известны в данной области техники и способны к дифференциации, такие как тотипотентные, плюрипотентные или унипотентные стволовые клетки, включая, но не ограничиваясь ими, эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки различных типов (например, мезенхимальные стволовые клетки пуповины, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки и т.п.According to an embodiment of the present invention, said stem cells are various stem cells that are known in the art and capable of differentiation, such as totipotent, pluripotent, or unipotent stem cells, including, but not limited to, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells of various types (eg, umbilical cord mesenchymal stem cells, adipose tissue mesenchymal stem cells, and bone marrow mesenchymal stem cells), hematopoietic stem cells, and the like.
В настоящем изобретении дополнительно предложен способ криоконсервации органов и/или тканей, включающий помещение органов и/или тканей в замораживающий уравновешивающий раствор для достижения равновесия, затем помещение органов и/или тканей в криоконсервирующий раствор, далее помещение органов и/или тканей на предметное стекло для замораживания и криоконсервацию в жидком азоте.The present invention additionally provides a method for cryopreserving organs and/or tissues, including placing organs and/or tissues in a freezing balancing solution to achieve equilibrium, then placing organs and/or tissues in a cryopreserving solution, then placing organs and/or tissues on a glass slide for freezing and cryopreservation in liquid nitrogen.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения орган и/или ткань представляют собой овариальную ткань или овариальный орган, которые могут представлять собой срез овариальной ткани или цельную овариальную ткань.In one embodiment of the present invention, the organ and/or tissue is an ovarian tissue or an ovarian organ, which may be a section of ovarian tissue or whole ovarian tissue.
В настоящей заявке на изобретение термины «криоконсервация» и «криогенная консервация» имеют одно и то же значение и используются взаимозаменяемо для обозначения консервации вещества, или клетки, ткани или органа при низких температурах с сохранением их исходной физико-химической и/или биологической активности, а также их физиологических и биохимических функций.In this application for the invention, the terms "cryopreservation" and "cryogenic preservation" have the same meaning and are used interchangeably to refer to the preservation of a substance, or cell, tissue or organ at low temperatures, while maintaining their original physico-chemical and / or biological activity, as well as their physiological and biochemical functions.
В настоящей заявке на изобретение термины «молекула, подавляющая рост льда» и «материал, подавляющий рост льда» имеют одно и то же значение и относятся к соединению, способному подавлять рост кристаллов льда в водном растворе. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения молекула, подавляющая рост льда, имеет хорошие показатели распределения по межфазной поверхности границы раздела «лед-вода» и способна снизить размер зерен ледяных кристаллов, или молекула, подавляющая рост льда, не имеет теплового гистерезиса или имеет достаточно малый тепловой гистерезис, чтобы значительно сократить формирование ледяных кристаллов в водном растворе.In the present application, the terms "ice growth inhibiting molecule" and "ice growth inhibiting material" have the same meaning and refer to a compound capable of inhibiting the growth of ice crystals in an aqueous solution. In one embodiment of the present invention, the ice growth inhibiting molecule has good distribution characteristics across the ice-water interface and is able to reduce the grain size of ice crystals, or the ice growth inhibiting molecule has no thermal hysteresis or has a sufficiently small thermal hysteresis to greatly reduce the formation of ice crystals in aqueous solution.
ПреимуществаAdvantages
1. В настоящем изобретении впервые установлен механизм контролирования роста кристаллов льда в смешанной фазе «лед-вода» молекулами, подавляющими рост льда. От материала, подавляющего рост льда, требуется хорошее сродство как ко льду, так и к воде. Сродство молекул, подавляющих рост льда, ко льду может обеспечить хорошую адсорбцию молекул, подавляющих рост льда, на поверхности льда; сродство этих молекул к воде может обеспечить улучшенное распределение этих молекул по границе раздела «лед-вода», позволяющее покрывать максимальную площадь поверхности льда как можно меньшим количеством материала. Исходя из установленного механизма подавления роста льда, предложена идея проектирования молекул, подавляющих рост льда, со сродством как ко льду, так и к воде, что обеспечивает новый способ синтеза материалов, подавляющих рост льда.1. The present invention establishes for the first time a mechanism for controlling the growth of ice crystals in the mixed phase "ice-water" by molecules that inhibit the growth of ice. The material that inhibits the growth of ice requires good affinity for both ice and water. The affinity of the ice growth inhibiting molecules to ice can ensure good adsorption of the ice growth inhibiting molecules on the ice surface; the affinity of these molecules for water can provide an improved distribution of these molecules along the ice-water interface, allowing the maximum surface area of the ice to be covered with as little material as possible. Based on the established ice growth inhibition mechanism, the idea of designing ice growth inhibiting molecules with affinity for both ice and water is proposed, providing a new way to synthesize ice growth inhibiting materials.
2. В настоящем изобретении в процесс проектирования молекулярной структуры материала, подавляющего рост льда, впервые включено MD моделирование, посредством которого проводят оценку сродства молекул, подавляющих рост льда, ко льду и воде, прогнозируют показатели ингибирования процесса роста льда для проектируемого материала, подавляющего рост льда, и таким образом получают возможность добиться оптимизации его структуры.2. In the present invention, for the first time, MD modeling is included in the process of designing the molecular structure of an ice growth inhibiting material, by which the affinity of ice growth inhibiting molecules to ice and water is estimated, the ice growth inhibition performance of the designed ice growth inhibiting material is predicted. , and thus get the opportunity to achieve optimization of its structure.
3. В настоящем изобретении сочетание предложенного механизма подавления роста льда с MD моделированием позволяет хорошо преодолевать ограничение, связанное с тем, что в процессе исследований и разработки материала, подавляющего рост льда, материалы, известные в данной области техники, можно подвергать анализу на показатели пригодности и скринингу только с применением экспериментального подхода - метод «проб и ошибок», обеспечивает новую идеологию в проектировании молекулярных структур и способно значительно ускорить разработку и применение материалов, контролирующих рост льда.3. In the present invention, the combination of the proposed ice growth suppression mechanism with MD modeling can well overcome the limitation that in the process of research and development of an ice growth suppressing material, materials known in the art can be analyzed for suitability and screening only using an experimental approach - the method of "trial and error", provides a new ideology in the design of molecular structures and can significantly accelerate the development and application of materials that control the growth of ice.
4. Криоконсервирующий раствор, предложенный в настоящем изобретении, имеет своим преимуществом широкую доступность, хорошую биологическую совместимость, низкую токсичность, высокую безопасность и значительное сокращение количества используемого ДМСО, и при его применении даже без добавления ДМСО может обеспечить равные или даже более высокие показатели выживаемости клеток, чем у промышленного криоконсервирующего раствора, содержащего ДМСО в количествах не менее 15% и обычно применяемого в современной клинической практике. Раскрытый в данном описании криоконсервирующий раствор также имеет своим преимуществом простоту состава, легкодоступные исходные материалы и низкую стоимость, и может широко применяться для криоконсервации различных клеток и тканей, таких как ооциты, эмбрионы, стволовые клетки, овариальные ткани и овариальные органы, с сохранением их хорошей биологической активности.4. The cryopreservation solution of the present invention has the advantage of wide availability, good biocompatibility, low toxicity, high safety, and a significant reduction in the amount of DMSO used, and when used even without the addition of DMSO, it can provide equal or even higher cell survival rates. than the commercial cryopreservation solution containing DMSO in amounts of at least 15% and commonly used in modern clinical practice. The cryopreservation solution disclosed herein also has the advantage of simplicity of composition, readily available raw materials and low cost, and can be widely used for cryopreservation of various cells and tissues, such as oocytes, embryos, stem cells, ovarian tissues and ovarian organs, while maintaining their good biological activity.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
ФИГ. 1: Схема молекулярной структуры материала, подавляющего рост льда;FIG. 1: Diagram of the molecular structure of the material that inhibits the growth of ice;
ФИГ. 2: Агрегационные состояния атактического ПВС (а-ПВС) и изотактического ПВС (i-ПВС) на межфазной границе «лед-вода», полученные методом MD моделирования;FIG. Fig. 2: Aggregation states of atactic PVA (a-PVA) and isotactic PVA (i-PVA) at the ice-water interface obtained by MD simulation;
ФИГ. 3: Спектр протонного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для а-ПВС, синтезированного в Примере 1;FIG. 3: Proton nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum for a-PVA synthesized in Example 1;
ФИГ. 4: Спектры протонного ЯМР для PBVE и i-ПВС, синтезированных в Примере 1, где спектр А относится к PBVE, а спектр В относится к i-ПВС;FIG. 4: Proton NMR spectra of PBVE and i-PVA synthesized in Example 1, where spectrum A refers to PBVE and spectrum B refers to i-PVA;
ФИГ. 5: Кривые гель-проникающей хроматографии (ГПХ) для PBVE, синтезированного в Примере 1;FIG. 5: Gel Permeation Chromatography (GPC) curves for PBVE synthesized in Example 1;
ФИГ. 6: Распределения по размерам частиц дисперсий а-ПВС (А) и i-ПВС (В) в воде при различных концентрациях, определенные в эксперименте по динамическому светорассеянию (DLS);FIG. 6: Particle size distributions of α-PVA (A) and i-PVA (B) dispersions in water at various concentrations determined in a dynamic light scattering (DLS) experiment;
ФИГ. 7: Микрофотографии роста ледяных кристаллов в растворах двух типов ПВС, где снимок А относится к а-ПВС, а снимок В относится к i-ПВС; С показывает зависимость между средним размером крупнейших зерен льда (MLGS), выраженным в % относительно величины этого показателя в буфере PBS, и концентрацией для этих двух типов ПВС;FIG. 7: Photomicrographs of the growth of ice crystals in solutions of two types of PVA, where picture A refers to a-PVA and picture B refers to i-PVA; C shows the relationship between the average size of the largest ice grains (MLGS), expressed in % relative to the value of this indicator in the PBS buffer, and the concentration for these two types of PVA;
ФИГ. 8: Топография ледяных кристаллов, модифицированных а-ПВС (снимки А и В) и i-ПВС (снимки С и D), в очищенной воде;FIG. 8: Topography of ice crystals modified with α-PVA (images A and B) and i-PVA (images C and D) in purified water;
ФИГ. 9: Модели молекулярных структур двух типов ПВС, полученные методом MD моделирования;FIG. 9: Models of molecular structures of two types of PVA obtained by MD simulation;
ФИГ. 10: Площади контактируемой поверхности для молекул двух типов ПВС с молекулами воды в жидкой воде и молекулами воды в структуре льда на межфазной границе «лед-вода» при 240 K, полученные методом MD моделирования, где верхняя часть фигуры показывает 3 результата для молекул а-ПВС, а нижняя часть фигуры показывает 3 результата для молекул i-ПВС;FIG. 10: Contact surface areas for molecules of two types of PVA with water molecules in liquid water and water molecules in the structure of ice at the ice-water interface at 240 K, obtained by MD simulation, where the upper part of the figure shows 3 results for molecules a- PVA, and the lower part of the figure shows 3 results for i-PVA molecules;
ФИГ. 11: Вероятности агрегации для двух типов ПВС в водном растворе, полученные методом MD моделирования и вычислений;FIG. 11: Aggregation probabilities for two types of PVA in aqueous solution obtained by MD modeling and calculation;
ФИГ. 12: Количество межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулами двух типов ПВС и молекулами воды при 240 K в водном растворе, и количество межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулами двух типов ПВС и молекулами воды в жидкой фазе и в структуре льде при 240 K на межфазной границе «лед-вода» (данные получены методом MD моделирования и вычислений);FIG. 12: The number of intermolecular hydrogen bonds formed between molecules of two types of PVA and water molecules at 240 K in aqueous solution, and the number of intermolecular hydrogen bonds formed between molecules of two types of PVA and water molecules in the liquid phase and in the ice structure at 240 K at the interfacial “ice-water” boundary (data obtained by MD modeling and calculations);
ФИГ. 13: Оптические микрофотографии, показывающие подавление процесса роста кристаллов льда при использовании GDL-L-Thr (соединения формулы (6)), и статистическая диаграмма гранулометрического состава зерен льда;FIG. 13: Optical micrographs showing the suppression of the process of growth of ice crystals using GDL-L-Thr (compound of formula (6)), and a statistical diagram of the particle size distribution of ice grains;
ФИГ. 14: Топография ледяного кристалла, модифицированного GDL-L-Thr, в очищенной воде;FIG. 14: GDL-L-Thr modified ice crystal topography in purified water;
ФИГ. 15: Оптические микрофотографии, показывающие подавление процесса роста кристаллов льда при использовании GDL-L-Ser (соединения формулы (7)), и статистическая диаграмма гранулометрического состава зерен льда;FIG. 15: Optical micrographs showing the suppression of the growth of ice crystals using GDL-L-Ser (compound of formula (7)), and a statistical chart of the particle size distribution of ice grains;
ФИГ. 16: Оптические микрофотографии, показывающие подавление процесса роста кристаллов льда при использовании GDL-L-Val (соединения формулы (8)), и статистическая диаграмма гранулометрического состава зерен льда;FIG. 16: Optical micrographs showing the suppression of the growth of ice crystals using GDL-L-Val (compound of formula (8)), and a statistical chart of the particle size distribution of ice grains;
ФИГ. 17: Оптические микрофотографии, показывающие подавление процесса роста кристаллов льда при использовании короткоцепочечного пептида TR, приготовленного в Примере 3, и статистическая диаграмма гранулометрического состава зерен льда;FIG. 17: Optical micrographs showing the inhibition of the ice crystal growth process using the short chain TR peptide prepared in Example 3 and a statistical plot of ice grain size distribution;
ФИГ. 18: Топография ледяного кристалла, модифицированного короткоцепочечным пептидом TR, приготовленным в Примере 3, в очищенной воде;FIG. 18: Topography of an ice crystal modified with the TR short chain peptide prepared in Example 3 in purified water;
ФИГ. 19: Результаты подавления процесса роста ледяных кристаллов при использовании пептоидов R-COOH, R-СН3 и R-CH2CH3, приготовленных в Примере 8;FIG. 19: Results of inhibiting the growth of ice crystals using the peptoids R-COOH, R-CH 3 and R-CH 2 CH 3 prepared in Example 8;
ФИГ. 20: Топографии ледяных кристаллов, модифицированных пептоидами R-COOH (A), R-СН3 (В) и R-CH2CH3 (С), приготовленными в Примере 8, в очищенной воде;FIG. 20: Topographies of ice crystals modified with peptoids R-COOH (A), R-CH 3 (B) and R-CH 2 CH 3 (C) prepared in Example 8 in purified water;
ФИГ. 21: Схема эксперимента по адсорбции материалов льдом и устройства для его проведения;FIG. 21: Scheme of the experiment on the adsorption of materials on ice and devices for its implementation;
ФИГ. 22: Графики зависимости количества адсорбированного льдом материала от концентрации двух типов ПВС, полученных в Примере 9;FIG. 22: Graphs of the amount of material adsorbed on ice versus the concentration of the two types of PVA obtained in Example 9;
ФИГ. 23: Микрофотографии роста ледяных кристаллов в растворах DPBS при использовании двух типов ПВС, где снимок А относится к а-ПВС, а снимок В относится к i-ПВС;FIG. 23: Photomicrographs of ice crystal growth in DPBS solutions using two types of PVA, where picture A refers to a-PVA and picture B refers to i-PVA;
ФИГ. 24: Снимок окрашенного среза свежего (незамороженного) овариального органа новорожденной мыши 3-дневного возраста;FIG. 24: Photograph of a stained section of a fresh (non-frozen) ovarian organ of a 3-day-old neonatal mouse;
ФИГ. 25: Снимок окрашенного среза криоконсервированного овариального органа, полученный в Сравнительном варианте реализации 8 после размораживания;FIG. 25: Stained section of a cryopreserved ovarian organ taken in
ФИГ. 26: Снимок окрашенного среза криоконсервированного овариального органа, полученный в Варианте применения 13 после размораживания;FIG. 26: Image of a stained section of a cryopreserved ovarian organ obtained in
ФИГ. 27: Снимок окрашенного среза криоконсервированного овариального органа, полученный в Варианте применения 14 после размораживания;FIG. 27: Image of a stained section of a cryopreserved ovarian organ obtained in
ФИГ. 28: Снимок окрашенного среза криоконсервированного овариального органа, полученный в Варианте применения 15 после размораживания;FIG. 28: Image of a stained section of a cryopreserved ovarian organ obtained in
ФИГ. 29: Снимок окрашенного среза свежей (незамороженной) овариальной ткани половозрелой мыши;FIG. 29: Stained section of fresh (not frozen) ovarian tissue from a mature mouse;
ФИГ. 30: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Сравнительном варианте воплощения 9 после размораживания;FIG. 30: Stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in
ФИГ. 31: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 16 после размораживания;FIG. 31: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in
ФИГ. 32: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 17 после размораживания;FIG. 32: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in Application 17 after thawing;
ФИГ. 33: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 18 после размораживания;FIG. 33: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in
ФИГ. 34: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 26 после размораживания;FIG. 34: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in
ФИГ. 35: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 27 после размораживания;FIG. 35: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in Application 27 after thawing;
ФИГ. 36: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 28 после размораживания;FIG. 36: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in
ФИГ. 37: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 29 после размораживания;FIG. 37: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in Application 29 after thawing;
ФИГ. 38: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 30 после размораживания;FIG. 38: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in
ФИГ. 39: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 31 после размораживания;FIG. 39: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in Application 31 after thawing;
ФИГ. 40: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 37 после размораживания; иFIG. 40: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in Application 37 after thawing; and
ФИГ. 41: Снимок окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани, полученный в Варианте применения 38 после размораживания.FIG. 41: Image of a stained section of cryopreserved ovarian tissue obtained in Application 38 after thawing.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Способ приготовления согласно настоящему изобретению будет более подробно проиллюстрирован на представленных далее частных примерах. Следует понимать, что представленные далее примеры являются лишь показательными иллюстрациями и пояснениями к настоящему изобретению, и их не следует интерпретировать как исчерпывающие описания, определяющие объем правовой охраны настоящего изобретения. Все методики, разрабатываемые на основании вышеупомянутого содержания настоящего изобретения, подпадают под общий объем правовой охраны настоящего изобретения.The method of preparation according to the present invention will be illustrated in more detail in the following specific examples. It should be understood that the following examples are only illustrative illustrations and explanations of the present invention, and should not be interpreted as exhaustive descriptions that determine the scope of legal protection of the present invention. All methods developed on the basis of the above content of the present invention fall under the general scope of legal protection of the present invention.
Если иное не оговорено особо, экспериментальные методы, используемые в последующих примерах, представляют собой обычные традиционные методы. Если иное не оговорено особо, реактивы, материалы и т.п., используемые в последующих примерах, относятся к серийно выпускаемым товарам, представленным на рынке.Unless otherwise stated, the experimental methods used in the following examples are conventional conventional methods. Unless otherwise stated, the reagents, materials, and the like used in the following examples refer to commercially available products on the market.
А. Молекулярное проектирование материала, подавляющего рост льдаA. Molecular Design of an Ice Growth Inhibiting Material
Центральную молекулу материала, подавляющего рост льда, можно спроектировать в сочетании с различными группами, имеющими сродство с водой, и с группами, имеющими сродство со льдом, соединенными посредством ковалентных связей или нековалентных связей, таких как ионные связи.The core molecule of the ice growth inhibiting material can be designed in combination with various water affinity groups and ice affinity groups bonded through covalent bonds or non-covalent bonds such as ionic bonds.
Раскрытый в данном описании способ молекулярного проектирования материала, подавляющего рост льда, включает следующие стадии:Disclosed in this description, the method of molecular design of the material that inhibits the growth of ice, includes the following steps:
(1) создание библиотеки структур молекул соединений, в которой молекулы соединений содержат гидрофильную группу и группу, имеющую сродство ко льду;(1) creating a library of compound molecular structures in which the compound molecules contain a hydrophilic group and a group having an affinity for ice;
(2) моделирование и оценивание способности указанных молекул соединений распределяться по межфазной границе «лед-вода» путем применения метода молекулярной динамики (MD); и(2) modeling and evaluating the ability of these compound molecules to be distributed along the ice-water interface by applying the molecular dynamics (MD) method; and
(3) скрининг молекул, подавляющих рост льда, с желаемой степенью сродства ко льду и воде.(3) screening for ice growth inhibiting molecules with the desired degree of affinity for ice and water.
Согласно настоящему изобретению основная цепь молекулы, подавляющей рост кристаллов льда, представляет собой углеродную цепь или пептидную цепь.According to the present invention, the main chain of the ice crystal growth inhibiting molecule is a carbon chain or a peptide chain.
Согласно настоящему изобретению MD моделирование на стадии (2) можно проводить с использованием программных пакетов GROMACS, AMBER, CHARMM, NAMD или LAMMPS.According to the present invention, the MD simulation in step (2) can be carried out using the GROMACS, AMBER, CHARMM, NAMD or LAMMPS software packages.
Согласно настоящему изобретению, при проведении MD моделирования на стадии (2) модель молекулы воды можно выбрать из таких моделей, как ТIР3Р, ТIР4Р, TIP4P/2005, SPC, ТIР3Р, ТIР5Р и SPC/E, при этом для моделирования молекулы воды предпочтительно брать модель ТIР4Р/2005.According to the present invention, when performing MD simulation in step (2), the water molecule model can be selected from models such as TIP3P, TIP4P, TIP4P/2005, SPC, TIP3P, TIP5P and SPC/E, and it is preferable to take the model for water molecule simulation TIP4P/2005.
Согласно настоящему изобретению, при проведении MD моделирования на стадии (2) параметры силового поля берут, используя одно из таких силовых полей, как GROMOS, ESFF, силовое поле MM, AMBER, CHARMM, COMPASS, UFF, CVFF и другие силовые поля.According to the present invention, when performing MD simulation in step (2), the force field parameters are taken using one of the force fields such as GROMOS, ESFF, MM force field, AMBER, CHARMM, COMPASS, UFF, CVFF and other force fields.
Согласно настоящему изобретению, при проведении MD моделирования на стадии (2) моделирование и расчет выполняют по взаимодействиям между молекулами материала, подавляющего рост льда, по взаимодействиям между молекулами материала, подавляющего рост льда, и молекулами воды в жидкой фазе и по взаимодействиям между молекулами материала, подавляющего рост льда, и молекулами воды в структуре льда. Взаимодействия включают образование водородной связи, ван-дер-ваальсовое взаимодействие, электростатическое взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, π-π взаимодействие и т.п.According to the present invention, when performing MD simulation in step (2), simulation and calculation are performed on the interactions between the molecules of the ice growth inhibiting material, on the interactions between the molecules of the ice growth inhibiting material and water molecules in the liquid phase, and on the interactions between the molecules of the material, overwhelming growth of ice, and water molecules in the structure of ice. Interactions include hydrogen bonding, van der Waals interaction, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, π-π interaction, and the like.
Согласно настоящему изобретению, при проведении MD моделирования на стадии (2), когда смоделированные и рассчитанные молекулы взаимодействуют, производят соответствующую корректировку температуры и давления. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения для регулирования температуры и давления используют регулятор температуры V-rescale (модифицированный Berendsen) и регулятор давления.According to the present invention, when performing MD simulation in step (2), when the simulated and calculated molecules interact, the temperature and pressure are adjusted accordingly. In one embodiment of the present invention, a V-rescale temperature controller (modified by Berendsen) and a pressure controller are used to control temperature and pressure.
Согласно настоящему изобретению, при проведении MD моделирования на стадии (2) молекулярную конфигурацию молекулы соединения поддерживают путем выбора параметра потенциальной энергии. Предпочтительно выбирать такой параметр потенциальной энергии, чтобы молекулярная конфигурация молекулы соединения сохранялась и при повышенных температурах.According to the present invention, when performing MD simulation in step (2), the molecular configuration of the compound molecule is maintained by selecting the potential energy parameter. It is preferable to choose such a potential energy parameter that the molecular configuration of the compound molecule is preserved even at elevated temperatures.
Согласно настоящему изобретению, на стадии (2) задают периодические граничные условия для направления х, направления у и направления z, если моделируется система водного раствора; в случае моделировании смешанной системы «лед-вода» периодические граничные условия задают для направления х и направления у.According to the present invention, in step (2), periodic boundary conditions are set for the x-direction, y-direction, and z-direction if an aqueous solution system is being modeled; in the case of modeling a mixed ice-water system, periodic boundary conditions are set for the x-direction and the y-direction.
Согласно настоящему изобретению, при проведении MD моделирования на стадии (2) выбирают кубический или октаэдрический блок воды, и предпочтительным является кубический блок воды с размерами 3,9 × 3,6 × 1,0 нм3.According to the present invention, when performing MD modeling in step (2), a cubic or octahedral water block is selected, and a cubic water block of 3.9 x 3.6 x 1.0 nm 3 is preferred.
В конкретном варианте воплощения настоящего изобретения в процессе молекулярно-динамических расчетов при MD моделировании температуру и давление регулируют с помощью регулятора температуры V-rescale (модифицированного Berendsen) и регулятора давления.In a specific embodiment of the present invention, during molecular dynamics calculations in MD simulation, temperature and pressure are controlled by a V-rescale temperature controller (modified by Berendsen) and a pressure controller.
При MD моделировании и расчетах главным условием для определения существования водородной связи являются энергетические критерии или геометрические критерии, предпочтительно геометрические критерии; если расстояние (шаг) между атомами кислорода меньше 0,35 нм, а угол НО…Н меньше 30 градусов, то образуется водородная связь между двумя гидроксильными группами или между гидроксильной группой и молекулой воды.In MD modeling and calculations, the main condition for determining the existence of a hydrogen bond is energy criteria or geometric criteria, preferably geometric criteria; if the distance (step) between oxygen atoms is less than 0.35 nm, and the angle HO ... H is less than 30 degrees, then a hydrogen bond is formed between two hydroxyl groups or between a hydroxyl group and a water molecule.
В конкретном варианте воплощения настоящего изобретения материал, подавляющий рост льда, может представлять собой соединение, имеющее в качестве основной цепи углеродную цепь с заместителями в виде группы, имеющей сродство ко льду, и гидрофильной группы; материал, подавляющий рост льда, может содержать группу, которая является одновременно гидрофильной и имеющей сродство ко льду, такую как гидроксильная группа и аминогруппа, и может дополнительно содержать группу, имеющую сродство ко льду, и гидрофильную группу по отдельности. Например, молекулярная структура материала, подавляющего рост льда, спроектирована так, чтобы в ней имелось повторяющееся звено -[СH2-СНОН]-.In a particular embodiment of the present invention, the ice growth inhibiting material may be a compound having as a main chain a carbon chain substituted with an ice affinity group and a hydrophilic group; the ice growth inhibiting material may contain a group that is both hydrophilic and ice affinity, such as a hydroxyl group and an amino group, and may further contain an ice affinity group and a hydrophilic group separately. For example, the molecular structure of a material that inhibits the growth of ice is designed to have a repeating unit -[CH 2 -CHOH]-.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения молекула материала, подавляющего рост льда, представляет собой ПВС (поливиниловый спирт). ПВС выбирают из одного или комбинации двух или более из таких вариантов, как изотактический ПВС, синдиотактический ПВС и атактический ПВС. Например, ПВС имеет диадную синдиотактичность 15%-65%, в частности, например, 40%-60% или 53%-55%. Предпочтителен атактический ПВС, например, ПВС с диадной синдиотактичностью 45%-65%. ПВС может быть выбран из ПВС, имеющего молекулярную массу 10-500 кДа или более, например 10-30 кДа, 30-50 кДа, 80-90 кДа или 200-500 кДа. ПВС может быть выбран из ПВС, имеющего степень гидролиза более 80%, например, 80%-99%, 82%-87%, 87%-89%, 89%-99% или 98%-99%.In one embodiment of the present invention, the ice growth inhibiting material molecule is PVA (polyvinyl alcohol). The PVA is selected from one or a combination of two or more of isotactic PVA, syndiotactic PVA, and atactic PVA. For example, PVA has a dyad syndiotacticity of 15%-65%, in particular, for example, 40%-60% or 53%-55%. Atactic PVA is preferred, eg PVA with 45%-65% dyad syndiotacticity. The PVA may be selected from PVA having a molecular weight of 10-500 kD or more, such as 10-30 kD, 30-50 kD, 80-90 kD or 200-500 kD. The PVA may be selected from PVA having a degree of hydrolysis greater than 80%, such as 80%-99%, 82%-87%, 87%-89%, 89%-99%, or 98%-99%.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения молекула материала, подавляющего рост льда, представляет собой пептидное соединение. Пептидные соединения получают реакцией аминокислот, имеющих сродство ко льду, таких как треонин (L-Thr), глутамин (L-Gln) и аспарагиновая кислота (L-Asn), с другими гидрофильными аминокислотами, которые могут быть выбраны из аргинина, пролина, аланина и т.п. или GDL, или сахаридов.In one embodiment of the present invention, the ice growth inhibiting material molecule is a peptide compound. Peptide compounds are prepared by reacting amino acids having an affinity for ice, such as threonine (L-Thr), glutamine (L-Gln), and aspartic acid (L-Asn), with other hydrophilic amino acids, which may be selected from arginine, proline, alanine etc. or GDL, or saccharides.
Пептидное соединение состоит из не менее чем двух аминокислотных звеньев, например, 2-8 аминокислотных звеньев, в частности 2-5, например, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных звеньев, при этом все аминокислотные звенья разные. В указанном пептидном соединении мольное соотношение аминокислот, имеющих сродство ко льду, таких как треонин, и других гидрофильных аминокислот составляет (0,1-3): 1, предпочтительно (0,5-2): 1. Расположение аминокислот, имеющих сродство ко льду, и других гидрофильных аминокислот в структуре пептидного соединения особенно не ограничивается, и они могут быть присоединены посредством аминокислотных связующих групп или химических связей, известных из уровня техники. Например, аминокислоты, имеющие сродство ко льду, и гидрофильные аминокислоты могут располагаться поочередно, или несколько аминокислот, имеющих сродство ко льду, или гидрофильных аминокислот могут быть соединены между собой, образуя фрагмент из аминокислот, имеющих сродство ко льду, или фрагмент из гидрофильных аминокислот, который затем связывают с гидрофильной аминокислотой (или фрагментом из гидрофильных аминокислот) или с аминокислотой, имеющей сродство ко льду (или фрагментом из аминокислот, имеющих сродство ко льду), соответственно.A peptide compound consists of at least two amino acid units, for example 2-8 amino acid units, in particular 2-5, for example 2, 3, 4, 5 or 6 amino acid units, all amino acid units being different. In said peptide compound, the molar ratio of amino acids having an affinity for ice, such as threonine, and other hydrophilic amino acids is (0.1-3):1, preferably (0.5-2):1. Arrangement of amino acids having an affinity for ice , and other hydrophilic amino acids in the structure of the peptide compound is not particularly limited, and they can be attached through amino acid linking groups or chemical bonds known in the art. For example, amino acids having an affinity for ice and hydrophilic amino acids can be arranged alternately, or several amino acids having an affinity for ice or hydrophilic amino acids can be connected together, forming a fragment of amino acids having an affinity for ice, or a fragment of hydrophilic amino acids, which is then linked to a hydrophilic amino acid (or hydrophilic amino acid moiety) or an ice-affinity amino acid (or ice-affinity amino acid moiety), respectively.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения пептидное соединение представляет собой по меньшей мере одно из таких соединений, как L-Thr-L-Arg (TR), L-Thr-L-Pro (TP), L-Arg-L-Thr (RT), L-Pro-L-Thr (PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr (TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr (TPT), L-Ala-L-Ala-L-Thr (AAT) или L-Thr-L-Cys-L-Thr (TCT).In one embodiment of the present invention, the peptide compound is at least one of L-Thr-L-Arg (TR), L-Thr-L-Pro (TP), L-Arg-L-Thr ( RT), L-Pro-L-Thr (PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr (TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr (TPT), L-Ala-L- Ala-L-Thr (AAT) or L-Thr-L-Cys-L-Thr (TCT).
В другом варианте воплощения пептидное соединение представляет собой GDL-L-аминокислоту, например, GDL-L-Thr, GDL-L-Ser или GDL-L-Val.In another embodiment, the peptide compound is a GDL-L-amino acid, such as GDL-L-Thr, GDL-L-Ser, or GDL-L-Val.
В еще одном варианте воплощения пептидное соединение имеет одну из структур, представленных формулами (1)-(8):In yet another embodiment, the peptide compound has one of the structures represented by formulas (1)-(8):
Приведенные выше пептидные соединения можно синтезировать посредством способа синтеза полипептидов, известного в данной области техники, такого как способ твердофазного синтеза.The above peptide compounds can be synthesized by a polypeptide synthesis method known in the art, such as a solid phase synthesis method.
Раскрытый в данном документе способ приготовления включает следующие стадии: набухание смолы, ковалентное связывание набухшей смолы с аминокислотой, аминогруппа которой защищена, снятие защиты, добавление другой аминокислоты, аминогруппа которой защищена, для реакции конденсации, снятие защиты, отщепление и очистка.The preparation method disclosed herein includes the steps of swelling the resin, covalently binding the swollen resin to an amino acid whose amino group is protected, deprotection, adding another amino acid whose amino group is protected to a condensation reaction, deprotection, cleavage, and purification.
Производное гликопептида можно приготовить посредством известного способа, используя реакцию аминокислоты с сахаридом. Например, производное гликопептида можно приготовить реакцией глюконодельталактона или других сахаридов с аминокислотой в органическом растворителе или путем применения способа твердофазного синтеза. Глюконодельталактон (GDL) растворяют в органическом растворителе, аминокислоту и щелочной катализатор смешивают с органическим растворителем и полученную смесь добавляют к раствору GDL для реагирования при 55-60°С после полного растворения аминокислоты и щелочного катализатора, и после завершения реакции белый осадок отфильтровывают, и фильтрат выпаривают досуха, получая сырой продукт.The glycopeptide derivative can be prepared by a known method using the reaction of an amino acid with a saccharide. For example, a glycopeptide derivative can be prepared by reacting gluconodeltalactone or other saccharides with an amino acid in an organic solvent, or by using a solid phase synthesis method. Gluconodeltalactone (GDL) is dissolved in an organic solvent, an amino acid and an alkali catalyst are mixed with an organic solvent, and the resulting mixture is added to a GDL solution for reaction at 55-60°C after the amino acid and alkali catalyst are completely dissolved, and after completion of the reaction, the white precipitate is filtered off, and the filtrate evaporated to dryness to give the crude product.
Согласно способу приготовления, раскрытому в данном документе, органический растворитель можно выбирать из метанола, этанола и т.п.According to the preparation method disclosed herein, the organic solvent may be selected from methanol, ethanol, and the like.
В одном из вариантов реализации производное гликопептида получают, используя способ твердофазного синтеза, включающий: набухание смолы, ковалентное связывание набухшей смолы с аминокислотой, аминогруппа которой защищена, снятие защиты, добавление сахарида (такого как GDL с раскрытым циклом) для проведения реакции конденсации, отщепление и очистка. GDL-L-Val и GDL-L-Ser синтезировали, руководствуясь способом, использовавшимся для синтеза GDL-L-Thr.In one embodiment, the glycopeptide derivative is prepared using a solid phase synthesis method comprising: swelling the resin, covalently linking the swollen resin to an amino acid whose amino group is protected, deprotection, adding a saccharide (such as ring-opened GDL) to carry out the condensation reaction, cleavage, and cleaning. GDL-L-Val and GDL-L-Ser were synthesized following the method used to synthesize GDL-L-Thr.
В настоящем изобретении дополнительно предложено пептидное соединение формулы (9):The present invention further provides a peptide compound of formula (9):
где R выбирают из замещенного или незамещенного алкила, а заместитель можно выбирать из -ОН, -NH2, -СООН, -CONH2 и т.п. Например, R представляет собой замещенный или незамещенный C1-6 алкил, и предпочтительно R представляет собой -СН3, -СН2СН3, -СН2СН2СООН; n представляет собой целое число, равное не менее 1 и не более 1000, и, например, может представлять собой целое число в диапазоне от 1 до 100. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения n представляет собой целое число, такое как 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.where R is selected from substituted or unsubstituted alkyl and the substituent can be selected from -OH, -NH 2 , -COOH, -CONH 2 and the like. For example, R is substituted or unsubstituted C 1-6 alkyl, and preferably R is -CH 3 , -CH 2 CH 3 , -CH 2 CH 2 COOH; n is an integer equal to at least 1 and not more than 1000, and, for example, may be an integer in the range from 1 to 100. In some embodiments of the present invention, n is an integer such as 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения соединение формулы (9) имеет структуру одного из следующих типов:In one embodiment of the present invention, the compound of formula (9) has a structure of one of the following types:
Согласно настоящему изобретению соединение формулы (9) получают, используя следующий путь синтеза:According to the present invention, the compound of formula (9) is obtained using the following synthetic route:
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения молекула материала, подавляющего рост льда, представляет собой аминокислоту или полиаминокислоту. В настоящем изобретение дополнительно предложено применение упомянутой выше молекулы материала, подавляющего рост льда, такой как ПВС, пептидное соединение, аминокислота и полиаминокислота, для контроля роста кристаллов льда в водном растворе и применение пептидного соединения при приготовлении криоконсервирующего раствора для клеток или тканей.In one embodiment of the present invention, the ice growth inhibiting material molecule is an amino acid or a polyamino acid. The present invention further provides the use of the above-mentioned ice growth inhibiting material molecule such as PVA, a peptide compound, an amino acid, and a polyamino acid to control the growth of ice crystals in an aqueous solution, and the use of the peptide compound in preparing a cryopreservative solution for cells or tissues.
Материалы, подавляющие рост льда, спроектированные и полученные согласно настоящему изобретению, такие как ПВС, пептидное соединение, аминокислота и полиаминокислота, применяют при приготовлении криоконсервирующего раствора для криоконсервации клеток, тканей, органов и т.п.The ice growth inhibiting materials designed and produced according to the present invention, such as PVA, peptide compound, amino acid, and polyamino acid, are used in the preparation of a cryopreservation solution for cryopreservation of cells, tissues, organs, and the like.
[Пример 1][Example 1]
(1) Проектирование молекулярной структуры соединения:(1) Designing the molecular structure of the compound:
Проектировали молекулы соединения, имеющие повторяющееся звено -[СН2-СНОН]-, для получения библиотеки молекулярных структур, которая включает молекулярные модели атактического и изотактического ПВС.Compound molecules having a repeating unit -[CH 2 -CHOH]- were designed to obtain a library of molecular structures that includes molecular models of atactic and isotactic PVA.
(2) Эксперимент по MD моделированию:(2) MD simulation experiment:
Разность в сродстве атактического ПВС и изотактического ПВС ко льду и воде прогнозировали в экспериментах по MD моделированию.The difference in the affinity of atactic PVA and isotactic PVA for ice and water was predicted in MD modeling experiments.
a. MD моделирование проводили с использованием GROMACS 5.1, а в качестве модели воды использовали модель ТГР4Р/2005, имеющую температуру плавления около 252,5K. Параметры взаимодействия молекул ПВС получали с использованием силового поля GROMOS54A7, и использовали скачкообразный алгоритм интегрирования с величиной шага интегрирования в 2 фс. Электростатическое взаимодействие рассчитывали по методу РМЕ, а радиусы отсечения для кулоновского потенциала и потенциала L-J составляли 1,0 нм в обоих случаях. Для регулирования температуры и давления использовали регулятор температуры V-rescale (модифицированный Berendsen) и регулятор давления. Временную константу установили на значение 0,1 пс.a. MD modeling was carried out using GROMACS 5.1, and the TGR4P/2005 model having a melting point of about 252.5K was used as a water model. The interaction parameters of PVA molecules were obtained using the GROMOS54A7 force field, and a stepwise integration algorithm was used with an integration step of 2 fs. The electrostatic interaction was calculated by the PME method, and the cutoff radii for the Coulomb potential and the L-J potential were 1.0 nm in both cases. A V-rescale temperature controller (modified by Berendsen) and a pressure controller were used to control temperature and pressure. The time constant was set to 0.1 ps.
b. Моделировали и выбирали для исследований соединения с молекулярными цепочками, имеющими 7 повторяющихся звеньев. Файлы топологии молекул ПВС генерировали посредством АТВ, и чтобы поддерживать тактичности двух типов молекул ПВС, требовалось соответствующим образом отрегулировать функции потенциала двухгранного угла углеродной цепи в этих молекулах.b. Compounds with molecular chains having 7 repeating units were modeled and selected for research. The topology files of PVA molecules were generated by ATB, and in order to maintain the tacticity of the two types of PVA molecules, it was necessary to adjust the potential functions of the dihedral angle of the carbon chain in these molecules accordingly.
c. Периодические граничные условия задавали для направления х, направления у и направления z, если моделировали системы водных растворов этих ПВС; в случае моделировании смешанных систем «лед-вода» периодические граничные условия задавали для направления х и направления у. Все системы моделировали до 120 нc, а для анализа использовали данные за последние 60 нc.c. Periodic boundary conditions were set for the x direction, the y direction, and the z direction if systems of aqueous solutions of these PVAs were modeled; in the case of modeling mixed ice-water systems, periodic boundary conditions were set for the x direction and the y direction. All systems were simulated up to 120 ns, and data for the last 60 ns were used for analysis.
Сначала использовали системы водных растворов рассматриваемых молекул. В системе, имеющей только одну цепочку ПВС, использовали в целом 1491 молекулу воды, давление составило 1 атм, а температуры составили 240K, 250K, 260K, 270K, 300K и 330K.First, systems of aqueous solutions of the considered molecules were used. In the system having only one PVA chain, a total of 1491 water molecules were used, the pressure was 1 atm, and the temperatures were 240K, 250K, 260K, 270K, 300K and 330K.
В системах, взятых для исследования взаимодействий молекул ПВС со льдом, 6 молекулярных цепочек ПВС помещали в блок воды размерами 3,9 × 3,6 × 1,0 нм3; блок льда, включающий 1100 молекул воды, уравновешивали при 240К в течение 10 нc, после чего блок льда помещали под блоком воды вдоль оси z. Размер смешанной системы в направлении z увеличивали до 10 нм, и смешанную систему «лед-вода» помещали в центр блока воды.In the systems taken to study the interactions of PVA molecules with ice, 6 PVA molecular chains were placed in a block of water with dimensions of 3.9 × 3.6 × 1.0 nm 3 ; an ice block containing 1100 water molecules was equilibrated at 240 K for 10 ns, after which the ice block was placed under the water block along the z axis. The size of the mixed system in the z direction was increased to 10 nm, and the mixed ice-water system was placed in the center of the water block.
Файлы топологии молекул ПВС генерировали посредством АТВ, и затем эти файлы топологии использовали непосредственно. Чтобы поддерживать тактичности двух типов молекул ПВС, параметры потенциальной энергии устанавливали на значение 50 ккал/моль, так чтобы молекулярные конфигурации этих двух типов молекул ПВС могли сохраняться и при повышенных температурах.Topology files of PVA molecules were generated by ATB, and then these topology files were used directly. In order to maintain the tacticity of the two types of PVA molecules, the potential energy parameters were set to 50 kcal/mol, so that the molecular configurations of these two types of PVA molecules could be maintained at elevated temperatures.
Модели молекулярных структур для двух типов ПВС, полученные MD моделированием, показаны на ФИГ. 9.Models of molecular structures for two types of PVA obtained by MD modeling are shown in FIG. nine.
(3) Оценка моделирования(3) Simulation evaluation
Молекула а-ПВС способна эффективно генерировать водородное связывание с поверхностью льда и таким образом адсорбироваться на поверхности льда, поскольку трехкратная величина расстояния между соседними группами ОН в ней соответствует размеру кристаллической решетки льда. В молекуле i-ПВС изменяется только направление гидроксильных групп, но не изменяется расстояние между соседними группами ОН, так что и i-ПВС, и а-ПВС имеют аналогичную способность адсорбироваться льдом. Тем не менее, согласно результатам MD моделирования, количество межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулой а-ПВС и молекулами воды, больше количества межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулой i-ПВС и молекулами воды, что указывает на более сильное сродство к воде у а-ПВС, чем у i-ПВС. Кроме того, состояния 6 молекулярных цепочек ПВС у межфазной границы «лед-вода», полученные в ходе MD моделирования, показывают, что молекулы а-ПВС имеют тенденцию больше распределяться вдоль межфазной границы «лед-вода» ввиду их хорошего сродства как ко льду, так и к воде, тогда как молекулы i-ПВС имеют тенденцию больше агрегироваться у межфазной границы «лед-вода» ввиду их более слабого сродства к воде (см. ФИГ. 2).The α-PVA molecule is able to efficiently generate hydrogen bonding with the ice surface and thus be adsorbed on the ice surface, since three times the distance between neighboring OH groups in it corresponds to the size of the ice crystal lattice. In the i-PVA molecule, only the direction of the hydroxyl groups changes, but the distance between neighboring OH groups does not change, so that both i-PVA and a-PVA have a similar ability to be adsorbed on ice. However, according to the results of MD modeling, the number of intermolecular hydrogen bonds formed between the α-PVA molecule and water molecules is greater than the number of intermolecular hydrogen bonds formed between the i-PVA molecule and water molecules, which indicates a stronger affinity for water in a -PVA than i-PVA. In addition, the states of the 6 PVA molecular chains at the ice-water interface obtained from MD simulations show that α-PVA molecules tend to be more distributed along the ice-water interface due to their good affinity for both ice, and to water, while i-PVA molecules tend to aggregate more at the ice-water interface due to their weaker affinity for water (see FIG. 2).
MD моделирование показывает величины контактируемой площади для двух типов молекул ПВС с молекулами воды у межфазной границы «лед-вода» при 240К, из которых видно, что контактируемая площадь а-ПВС больше контактируемой площади i-ПВС, еще раз подтверждая, что показатели распределения вдоль межфазной границы «лед-вода» у а-ПВС лучше, чем у i-ПВС (см. ФИГ. 10). Вероятность агрегации в водном растворе, рассчитанная при MD моделировании, у i-ПВС очевидно выше, чем у а-ПВС (ФИГ. 11). При 240К количество водородных связей, образующихся между этими двумя типами молекул ПВС и молекулами воды в структуре льда вдоль межфазной границы «лед-вода», аналогично, однако, количество водородных связей, образующихся между молекулой а-ПВС и молекулами воды вдоль межфазной границы «лед-вода» и в свободном водном растворе, очевидно больше, чем у i-ПВС. Следовательно, а-ПВС может лучше распределяться вдоль межфазной границы «лед-вода», тогда как i-ПВС больше агрегируется (см. ФИГ. 12).MD simulation shows the contact area values for two types of PVA molecules with water molecules at the ice-water interface at 240 K, from which it can be seen that the contact area of a-PVA is greater than the contact area of i-PVA, confirming once again that the distribution indices along the interfacial interface "ice-water" in a-PVA is better than in i-PVA (see FIG. 10). The probability of aggregation in aqueous solution, calculated from MD modeling, is clearly higher for i-PVA than for a-PVA (FIG. 11). At 240 K, the number of hydrogen bonds formed between these two types of PVA molecules and water molecules in the ice structure along the ice-water interface is similar, however, the number of hydrogen bonds formed between the α-PVA molecule and water molecules along the ice-water interface. -water" and in a free aqueous solution, obviously more than i-PVA. Therefore, a-PVA can be better distributed along the ice-water interface, while i-PVA aggregates more (see FIG. 12).
Таким образом, многочисленные результаты MD моделирования показывают, что а-ПВС имеет более высокие показатели распределения вдоль межфазной границы «лед-вода» ввиду более сильного сродства его молекулярной структуры к молекулам воды, и поэтому оказывает более сильный эффект в подавлении роста льда, чем i-ПВС.Thus, numerous results of MD modeling show that a-PVA has higher distribution indices along the ice-water interface due to the stronger affinity of its molecular structure for water molecules, and therefore has a stronger effect in suppressing ice growth than i -PVS.
(4) Синтез спроектированных молекул ПВС(4) Synthesis of engineered PVA molecules
(4.1) Приготовление атактического поливинилового спирта а-ПВС с молекулярной массой, равной приблизительно 13-23 кДа, и диадной синдиотактичностью r, равной приблизительно 55%(4.1) Preparation of atactic polyvinyl alcohol a-PVA with a molecular weight of approximately 13-23 kDa and a dyad syndiotacticity r of approximately 55%
Винилацетат (VAc, Sigma-Aldrich), из которого удален ингибитор, растворяли в 100 мл растворителя (метанола) в круглодонной колбе объемом 250 мл в атмосфере аргона, так чтобы получить 25-45% раствор VAc. После охлаждения полученного раствора до -5°С к нему осторожно по каплям добавляли 80 мМ 2,2'-азобис(2-метилпропионитрила) (Sigma-Aldrich). Затем раствору давали нагреться до комнатной температуры, после чего его перемешивали в течение 15 часов, разбавляли 1 л ацетона и по каплям добавляли к метанолу, получая белый осадок. Указанный осадок промывали метанолом, фильтровали и сушили в сушильном шкафу при 60°С под вакуумом в течение 6,0 часов, в результате чего получали твердое вещество белого цвета. Это твердое белое вещество растворяли в метаноле с получением раствора концентрацией (10 масс. %), и затем через этот раствор пропускали аргон для удаления из него кислорода. Затем к указанному раствору по каплям добавляли 25%-ный метанольный раствор гидроксида калия, и реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов. После перемешивания реакционную смесь разбавляли 2М раствором хлористоводородной кислоты и добавляли к 2,0М метанольному раствору аммиака для осаждения, в результате чего получали атактический поливиниловый спирт (а-ПВС). Спектр протонного ЯМР (ФИГ. 3) показывает, что полученное соединение представляет собой полностью гидролизованный а-ПВС.Vinyl acetate (VAc, Sigma-Aldrich) that had had the inhibitor removed was dissolved in 100 ml solvent (methanol) in a 250 ml round bottom flask under argon to give a 25-45% VAc solution. After the resulting solution was cooled to -5° C., 80
(4.2) Приготовление изотактического поливинилового спирта i-ПВС с молекулярной массой примерно 14-26 кДа и изотактичностью m, равной примерно 84%:(4.2) Preparation of i-PVA isotactic polyvinyl alcohol with a molecular weight of about 14-26 kDa and an isotacticity m of about 84%:
a. Приготовление поли-трет-бутилвинилового эфира (PBVE). Третбутилвиниловый эфир (t-BVE, Sigma-Aldrich) растворяли в 100 мл сухого толуола в круглодонной колбе объемом 250 мл в атмосфере аргона, в результате чего получали 2,5%-ный толуольный раствор t-BVE. После охлаждения полученного раствора до -78°С к нему осторожно по каплям добавляли 0,2 мМ диэтилэфирата трехфтористого бора (BF3⋅OEt2, Sigma-Aldrich), и через 2,0 часа дополнительно добавляли еще 0,2 мМ BF3⋅OEt2. Затем полученный раствор перемешивали при -78°С в течение 3,0 часов, после чего реакцию останавливали путем добавления небольшого количества метанола. Реакционный раствор по каплям добавляли в 2,0 л метанола при быстром перемешивании, в результате чего получали осадок светло-желтого цвета. Этот осадок промывали метанолом, фильтровали и сушили в сушильном шкафу при 60°С под вакуумом в течение 6,0 часов, в результате чего получали порошок твердого вещества светло-желтого цвета, которое, как показал спектр протонного ЯМР (ФИГ. 4А), представляло собой PBVE. Молекулярную массу синтезированного PBVE регулировали путем варьирования концентраций диэтилэфирата трехфтористого бора и третбутилвинилового эфира. Были успешно синтезированы разные образцы PBVE с различными молекулярными массами, что подтверждали хроматограммами гель-проникающей хроматографии (ГПХ), полученными с использованием тетрагидрофурановой (ТГФ) системы со скоростью потока 1 мл/мин (см. ФИГ. 5).a. Preparation of poly-tert-butyl vinyl ether (PBVE). Tert-butyl vinyl ether (t-BVE, Sigma-Aldrich) was dissolved in 100 ml dry toluene in a 250 ml round bottom flask under argon to give a 2.5% toluene solution of t-BVE. After cooling the resulting solution to -78°C, 0.2 mM boron trifluoride diethyl etherate (BF 3 ⋅OEt 2 , Sigma-Aldrich) was carefully added dropwise to it, and after 2.0 hours an additional 0.2 mM BF 3 ⋅ OEt 2 . Then the resulting solution was stirred at -78°C for 3.0 hours, after which the reaction was stopped by adding a small amount of methanol. The reaction solution was added dropwise to 2.0 L of methanol with rapid stirring, whereby a light yellow precipitate was obtained. This precipitate was washed with methanol, filtered and dried in an oven at 60° C. under vacuum for 6.0 hours to give a light yellow solid powder which was shown by proton NMR spectrum (FIG. 4A) to be a PBVE. The molecular weight of the synthesized PBVE was controlled by varying the concentrations of boron trifluoride diethyl etherate and tert-butyl vinyl ether. Different samples of PBVE with different molecular weights were successfully synthesized, as confirmed by gel permeation chromatography (GPC) chromatograms obtained using a tetrahydrofuran (THF) system with a flow rate of 1 ml/min (see FIG. 5).
b. Приготовление сухого газообразного бромистого водорода (НВr). К 10 мл 48% водного раствора бромистого водорода (НВr, Alfa Aesar) в двугорлой колбе объемом 100 мл по каплям добавляли 5,0-30 мл трехбромистого фосфора (РВr3, Aladdin). Выделяющийся газ последовательно пропускали через тетрахлорметан (ССl4), красный фосфор (Р, Alfa Aesar) и хлористый кальций (СаСl2), в результате чего получали сухой газообразный НВr.b. Preparation of dry gaseous hydrogen bromide (HBr). To 10 ml of a 48% aqueous solution of hydrogen bromide (HBr, Alfa Aesar) in a 100 ml two-neck flask was added dropwise 5.0-30 ml of phosphorus tribromide (PBr 3 , Aladdin). The evolved gas was successively passed through carbon tetrachloride (CCl 4 ), red phosphorus (P, Alfa Aesar) and calcium chloride (CaCl 2 ) to give dry gaseous HBr.
c. Приготовление изотактического поливинилового спирта (изотактический-ПВС, i-ПВС). Навеску 0,5 г PBVE растворяли в 15 мл сухого толуола в атмосфере аргона, после чего сухой аргон непрерывно пропускали через полученный раствор для удаления из него кислорода. Затем через вышеуказанный не содержащий кислорода раствор PBVE при 0°С пропускали сухой газообразный НВr, приготовленный на стадии (b). Примерно через 5,0 минут начинал выпадать светло-желтый осадок, и пропускание сухого газообразного НВr через раствор продолжали вплоть до прекращения выпадения осадка. Вышеуказанный реакционный раствор вливали в 200 мл метанольного раствора аммиака (2,0М). Полученный осадок промывали метанолом, фильтровали и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 60°С в течение 6,0 часов, в результате чего получали порошок твердого вещества светло-желтого цвета. Как показывает спектр протонного ЯМР (ФИГ. 4А), гидролиз PBVE прошел полностью, в результате чего получили твердый i-ПВС.c. Preparation of isotactic polyvinyl alcohol (isotactic-PVA, i-PVA). A portion of 0.5 g of PBVE was dissolved in 15 ml of dry toluene in an argon atmosphere, after which dry argon was continuously passed through the resulting solution to remove oxygen from it. The dry gaseous HBr prepared in step (b) was then passed through the above oxygen-free PBVE solution at 0°C. After about 5.0 minutes, a light yellow precipitate began to form and bubbling of dry HBr gas through the solution was continued until precipitation ceased. The above reaction solution was poured into 200 ml of a methanolic ammonia solution (2.0M). The resulting precipitate was washed with methanol, filtered and dried in a vacuum oven at 60° C. for 6.0 hours to give a light yellow solid powder. As shown by the proton NMR spectrum (FIG. 4A), the hydrolysis of PBVE was complete, resulting in a solid i-PVA.
(5) Верификация эффекта подавления роста льда у синтезированного ПВС (5.1) Эксперимент по динамическому светорассеянию (DLS) Распределение по размерам частиц дисперсий двух типов ПВС (а-ПВС с молекулярной массой примерно 13-23 кДа и диадной синдиотактичностью r, равной примерно 55% (Sigma-Aldrich); i-ПВС с молекулярной массой примерно 14-26 кДа и изотактичностью m, равной примерно 84%) в водном растворе при 25°С определяли в DLS эксперименте, и эксперимент проводили на приборе Nano ZS (Malvern Instruments) с термостатируемой камерой и лазером He-Ne 4 мВт (λ=632,8 нм), при этом угол рассеяния составлял 173°. Сначала готовили водные растворы а-ПВС и i-ПВС с концентрациями 1,0 мг/мл, 4,0 мг/мл, 10 мг/мл и 20 мг/мл, затем примерно по 1,0 мл каждого раствора ПВС добавляли в одноразовые полистироловые кюветы толщиной 12 мм для измерений.(5) Verification of the ice growth suppression effect of synthesized PVA (5.1) Dynamic light scattering (DLS) experiment Particle size distribution of dispersions of two types of PVA (a-PVA with a molecular weight of about 13-23 kDa and a dyad syndiotacticity r of about 55% (Sigma-Aldrich); i-PVA with a molecular weight of about 14-26 kDa and an isotacticity m of about 84%) in an aqueous solution at 25°C was determined in a DLS experiment, and the experiment was carried out on a Nano ZS instrument (Malvern Instruments) with thermostatically controlled chamber and a 4 mW He-Ne laser (λ=632.8 nm), while the scattering angle was 173°. First, aqueous solutions of a-PVA and i-PVA were prepared at concentrations of 1.0 mg/ml, 4.0 mg/ml, 10 mg/ml and 20 mg/ml, then approximately 1.0 ml of each PVA solution was added to
Результаты DLS эксперимента показывают, что при одинаковых концентрациях растворов а-ПВС имеет гораздо меньший размер частиц, диспергированных в водном растворе, чем i-ПВС (см. ФИГ. 6). Это означает, что по сравнению с а-ПВС i-ПВС в водном растворе имеет тенденцию находиться в агрегированном состоянии. Это согласуется с результатами MD моделирования, показывающими, что количество внутримолекулярных водородных связей у а-ПВС меньше, чем у i-ПВС, а количество межмолекулярных водородных связей, образующихся между молекулами а-ПВС и молекулами воды, больше количества таких же связей, образующихся между молекулами i-ПВС и молекулами воды.The results of the DLS experiment show that at the same concentrations of solutions, a-PVA has a much smaller particle size dispersed in an aqueous solution than i-PVA (see FIG. 6). This means that, compared with a-PVA, i-PVA tends to be in an aggregated state in aqueous solution. This is consistent with the results of MD modeling, which show that the number of intramolecular hydrogen bonds in α-PVA is less than in i-PVA, and the number of intermolecular hydrogen bonds formed between α-PVA molecules and water molecules is greater than the number of the same bonds formed between i-PVA molecules and water molecules.
(5.2) Количественный анализ на активность по подавлению перекристаллизации льда (IRI)(5.2) Quantitative assay for ice recrystallization inhibition (IRI) activity
Активность по IRI оценивали с применением способа «замораживания брызг», в котором образец растворяют и диспергируют в растворе буфера DPBS, после чего 10-30 мкл полученного раствора капают на поверхность чистого кремниевого диска, предварительно охлажденного до -60°С с высоты не менее 1,0 м; замороженные образцы раствора медленно нагревали до -6°С со скоростью 10°С в минуту на предметном столике с системой нагрева-охлаждения и «отжигали» при этой же температуре в течение 30 минут; размеры ледяных кристаллов наблюдали и регистрировали с помощью поляризационного микроскопа и высокоскоростной фотокамеры. Образцы на предметном столике с системой нагрева-охлаждения герметизировали, чтобы обеспечивать поддержание их внутренней влажности на уровне примерно 50%. Процедуру повторяли не менее трех раз для каждого образца, а размеры ледяных кристаллов измеряли с помощью нано-измерителя Nano Measurer 1.2 с погрешностью результата, равной стандартному отклонению.IRI activity was assessed using a "splash freeze" method in which the sample is dissolved and dispersed in a DPBS buffer solution, after which 10-30 μl of the resulting solution is dropped onto the surface of a clean silicon disk pre-cooled to -60°C from a height of at least 1 .0 m; frozen samples of the solution were slowly heated to -6°C at a rate of 10°C per minute on an object stage with a heating-cooling system and "annealed" at the same temperature for 30 minutes; the sizes of ice crystals were observed and recorded using a polarizing microscope and a high-speed camera. Samples on a heating-cooling stage were sealed to maintain their internal moisture at about 50%. The procedure was repeated at least three times for each sample, and the sizes of ice crystals were measured using a Nano Measurer 1.2 nanometer with a result error equal to the standard deviation.
(5.3) Наблюдение топологии льда (DIS) и измерение теплового гистерезиса (ТН)(5.3) Observation of ice topology (DIS) and measurement of thermal hysteresis (TH)
Наблюдения DIS и измерения ТН проводили с использованием нанолитрового осмометра. Сначала нагревали стеклянную трубку на пламени спиртовки до начала плавления с одновременным ее оттягиванием, так чтобы получился очень тонкий капилляр с микроскопическим просветом, который затем соединяли с микрошприцем. Иммерсионное масло с повышенной вязкостью наносили на диск с микронными лунками, и водный раствор, в котором растворен исследуемый материал, выдавливали в микролунки с помощью микрошприца. Капельки раствора быстро замораживали путем регулирования температуры и затем медленно нагревали, добиваясь формирования монокристалла льда. Затем монокристалл льда медленно охлаждали с точностью 0,01°С и проводили наблюдения DIS и измерения ТН с помощью микроскопа, снабженного высокоскоростной фотокамерой.DIS observations and TH measurements were made using a nanoliter osmometer. First, a glass tube was heated on the flame of an alcohol lamp until melting began, with its simultaneous withdrawal, so that a very thin capillary with a microscopic lumen was obtained, which was then connected to a microsyringe. Immersion oil with increased viscosity was applied to a disk with micron wells, and an aqueous solution in which the test material was dissolved was squeezed out into microwells using a microsyringe. The droplets of the solution were rapidly frozen by temperature control and then heated slowly to form an ice single crystal. Then, the ice single crystal was slowly cooled with an accuracy of 0.01° C., and DIS observations and TH measurements were made using a microscope equipped with a high-speed camera.
Способность а-ПВС (Mw 13-23 кДа) подавлять рост ледяных кристаллов гораздо лучше, чем у i-ПВС (Mw 14-26 кДа) с аналогичной молекулярной массой (см. ФИГ. 7). Как можно видеть на ФИГ. 7А, размер частиц в растворе а-ПВС гораздо меньше, чем в растворе i-ПВС при одинаковых концентрациях растворов. Как можно видеть на ФИГ. 7В, показатель среднего размера крупнейших кристаллов (MLGS) при образовании льда в присутствии а-ПВС относительно этого показателя в буфере DPBS после 2,0 мг/мл достигает минимума, составляющего 20% (относительно MLGS ледяных кристаллов в буфере DPBS). Величина MLGS для i-ПВС с различными молекулярными массами относительно MLGS в буфере DPBS возрастает с ростом концентрации и при 10 мг/мл достигает минимума, который составляет всего лишь приблизительно 50% (относительно MLGS ледяных кристаллов в буфере DPBS). При этом MLGS не убывает с ростом концентрации, а слегка повышается, и продолжает повышаться до 20 мг/мл. i-ПВС (Mw 14-26 кДа) со степенью полимеризации более 333 с большим трудом растворяется при концентрациях более 30 мг/мл. Соответственно, ввиду ограничения в растворимости i-ПВС, IRI-активность i-ПВС оптимально составляет 50% относительно MLGS в DPBS при концентрации 10 мг/мл, тогда как IRI-активность а-ПВС оптимально составляет 20% относительно MLGS в DPBS при концентрации 2,0 мг/мл. Это согласуется с полученными при MD моделировании выводами о том, что а-ПВС более легко распределяется вдоль межфазной границы «лед-вода», чем i-ПВС, за счет чего а-ПВС способен лучше подавлять рост кристаллов льда даже при более низких дозировках, чем i-ПВС.The ability of a-PVA (M w 13-23 kDa) to suppress the growth of ice crystals is much better than i-PVA (M w 14-26 kDa) with a similar molecular weight (see FIG. 7). As can be seen in FIG. 7A, the particle size in the α-PVA solution is much smaller than in the i-PVA solution at the same solution concentrations. As can be seen in FIG. 7B, the average largest crystal size (MLGS) index for ice formation in the presence of α-PVA relative to that in DPBS buffer after 2.0 mg/ml reaches a minimum of 20% (relative to ice crystal MLGS in DPBS buffer). The MLGS value for i-PVA with various molecular weights relative to MLGS in DPBS buffer increases with increasing concentration and at 10 mg/ml reaches a minimum of only about 50% (relative to MLGS of ice crystals in DPBS buffer). At the same time, MLGS does not decrease with increasing concentration, but slightly increases, and continues to increase up to 20 mg/ml. i-PVA (M w 14-26 kDa) with a degree of polymerization of more than 333 dissolves with great difficulty at concentrations of more than 30 mg/ml. Accordingly, due to the solubility limitation of i-PVA, the IRI activity of i-PVA is optimally 50% relative to MLGS in DPBS at a concentration of 10 mg/mL, while the IRI activity of a-PVA is optimally 20% relative to MLGS in DPBS at a concentration of 2 .0 mg/ml. This is consistent with the findings from MD modeling that α-PVA is more readily distributed along the ice-water interface than i-PVA, due to which α-PVA is better able to suppress the growth of ice crystals even at lower dosages. than i-PVA.
Можно видеть, что результаты MD моделирования и результаты реальных подтверждающих экспериментов хорошо согласуются между собой. Показатели подавления роста кристаллов льда для материала, подавляющего рост льда, могут быть точно предсказаны с помощью MD моделирования, и соответственно молекулярное проектирование материалов, подавляющих рост льда, можно применять с достаточно высокой эффективностью.It can be seen that the results of MD simulations and the results of real confirmatory experiments are in good agreement with each other. The ice growth inhibition performance of an ice growth inhibiting material can be accurately predicted by MD simulation, and accordingly, the molecular design of ice growth inhibiting materials can be applied with sufficiently high efficiency.
Соединения с формулами (1)-(9) были спроектированы таким же способом молекулярного проектирования, синтезированы и исследованы на эффекты по подавлению роста льда.Compounds with formulas (1) to (9) were designed by the same molecular design method, synthesized, and tested for ice growth suppression effects.
[Пример 2] Синтез соединения формулы (1)[Example 2] Synthesis of the compound of formula (1)
(1) 2-хлортритилхлоридную смолу помещали в реакционную пробирку и добавляли ДХМ (20 мл/г). Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Затем растворитель удаляли с помощью воронки Шотта путем отсасывания вакуумом. К полученному остатку добавляли трехкратный мольный избыток Fmoc-L-Pro-OH и восьмикратный мольный избыток DIEA, после чего добавляли ДМФА для растворения. Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Для блокировки концевых групп применяли обработку метанолом в течение 30 минут.(1) 2-chlorotrityl chloride resin was placed in a reaction tube and DCM (20 ml/g) was added. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. The solvent was then removed with a Schott funnel by vacuum suction. To the resulting residue were added a three-fold molar excess of Fmoc-L-Pro-OH and an eight-fold molar excess of DIEA, after which DMF was added to dissolve. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. Methanol treatment for 30 minutes was used to block the end groups.
(2) Удаляли растворитель (ДМФА). Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г) и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(2) The solvent (DMF) was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol three times, then the ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(3) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), в реакционную пробирку добавляли двукратный избыток Fmoc-L-Thr(tBu)-ОН, растворенный в как можно меньшем количестве ДМФА, и двукратный избыток HBTU. Сразу после этого добавляли восьмикратный избыток DIEA, и смесь оставляли реагировать в течение 30 минут.(3) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), into a reaction tube a twofold excess of Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, dissolved in as little DMF as possible, and a twofold excess of HBTU were added. Immediately thereafter, an eightfold excess of DIEA was added and the mixture was allowed to react for 30 minutes.
(4) После удаления раствора отсасыванием отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Отсутствие окраски смеси свидетельствовало об отрицательной реакции, т.е. о том, что реакция завершена.(4) After the solution was removed by suction, a small amount of resin was collected and washed with ethanol three times, then ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. The absence of color in the mixture indicated a negative reaction, i.e. that the reaction is complete.
(5) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), растворитель удаляли. Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г) и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом, добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(5) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol, ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(6) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДХМ (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания растворителя вакуумом.(6) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DCM (15 ml/g, twice), the resin was dried by suction of the solvent by vacuum.
(7) Полученный продукт отщепляли от смолы с помощью отщепляющей жидкости (15 мл/г, TFA:вода:EDT:Tis=95:1:2:2, об/об) в течение 90 мин. Отщепляющую жидкость выпаривали насухо продувкой азотом, остаток лиофилизировали, и в итоге получали сырой продукт полипептида.(7) The resulting product was cleaved from the resin with a cleaving liquid (15 ml/g, TFA:water:EDT:Tis=95:1:2:2, v/v) for 90 minutes. The cleavage liquid was evaporated to dryness by purging with nitrogen, the residue was lyophilized to give the crude polypeptide product.
(8) Полипептид очищали и подвергали солевой трансформации или обессоливанию методом ВЭЖХ. Условия хроматографирования: tR=6,1 мин, колонка для очистки: модель Kromasil 100-5С18, 4,6 мм*250 мм, градиент подвижной фазы: ацетонитрил с 0,1% TFA и водный раствор с 0,1% TFA, 0 мин. - 1:99, 20 мин - 1:9. Очищенный раствор лиофилизировали и получали очищенный продукт L-Thr-L-Pro (обозначаемый как TP). Выход составлял примерно 80%.. Масс-спектр показал [М+Н]+ при 217,3.(8) The polypeptide was purified and subjected to salt transformation or desalting by HPLC. Chromatography conditions: t R =6.1 min, purification column: model Kromasil 100-5C18, 4.6 mm * 250 mm, mobile phase gradient: acetonitrile with 0.1% TFA and an aqueous solution with 0.1% TFA, 0 min. - 1:99, 20 min - 1:9. The purified solution was lyophilized to give the purified product L-Thr-L-Pro (referred to as TP). The yield was about 80%. The mass spectrum showed [M+H] + at 217.3.
[Пример 3] Синтез соединения формулы (2)[Example 3] Synthesis of the compound of formula (2)
(1) 2-хлортритилхлоридную смолу помещали в реакционную пробирку и добавляли ДХМ (20 мл/г). Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Затем растворитель удаляли с помощью воронки Шотта путем отсасывания вакуумом. К полученному остатку добавляли трехкратный мольный избыток Fmoc-L-Thr(tBu)-OH и восьмикратный мольный избыток DIEA, после чего добавляли ДМФА для растворения. Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Для блокировки концевых групп применяли обработку метанолом в течение 30 минут.(1) 2-chlorotrityl chloride resin was placed in a reaction tube and DCM (20 ml/g) was added. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. The solvent was then removed with a Schott funnel by vacuum suction. A 3-fold molar excess of Fmoc-L-Thr(tBu)-OH and an 8-fold molar excess of DIEA were added to the obtained residue, after which DMF was added to dissolve. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. Methanol treatment for 30 minutes was used to block the end groups.
(2) Удаляли растворитель (ДМФА). Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(2) The solvent (DMF) was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol three times, then the ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(3) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), в реакционную пробирку добавляли двукратный избыток Fmoc-L-Arg(Pbf)-ОН, растворенный в как можно меньшем количестве ДМФА, и двукратный избыток HBTU. Сразу после этого добавляли восьмикратный избыток DIEA, и смесь оставляли реагировать в течение 30 минут.(3) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), into a reaction tube a twofold excess of Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH, dissolved in as little DMF as possible, and a twofold excess of HBTU were added. Immediately thereafter, an eightfold excess of DIEA was added and the mixture was allowed to react for 30 minutes.
(4) После удаления раствора отсасыванием отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Отсутствие окраски смеси свидетельствовало об отрицательной реакции, т.е. о том, что реакция завершена.(4) After the solution was removed by suction, a small amount of resin was collected and washed with ethanol three times, then ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. The absence of color in the mixture indicated a negative reaction, i.e. that the reaction is complete.
(5) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), растворитель удаляли. Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом, добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(5) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol, ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(6) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДХМ (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания растворителя вакуумом.(6) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DCM (15 ml/g, twice), the resin was dried by suction of the solvent by vacuum.
(7) Полученный продукт отщепляли от смолы с помощью отщепляющей жидкости (15 мл/г, TFA:вода:EDT:Tis=95:1:2:2, об/об) в течение 90 мин. Затем отщепляющую жидкость выпаривали насухо продувкой азотом, остаток лиофилизировали, и в итоге получали сырой продукт полипептида.(7) The resulting product was cleaved from the resin with a cleaving liquid (15 ml/g, TFA:water:EDT:Tis=95:1:2:2, v/v) for 90 minutes. The cleaving liquid was then evaporated to dryness by purging with nitrogen, the residue was lyophilized to give the crude polypeptide product.
(8) Полипептид очищали и подвергали солевой трансформации или обессоливанию методом ВЭЖХ. Условия хроматографирования: tR=4,8 мин, колонка для очистки: модель Kromasil 100-5С18, 4,6 мм*250 мм, градиент подвижной фазы: ацетонитрил с 0,1% TFA и водный раствор с 0,1% TFA, 0 мин. - 1:99, 20 мин - 1:4. Очищенный раствор лиофилизировали и получали очищенный продукт L-Thr-L-Arg (или TR). Выход составлял примерно 80%. Масс-спектр показал [М+Н]+ при 276,2.(8) The polypeptide was purified and subjected to salt transformation or desalting by HPLC. Chromatography conditions: t R =4.8 min, purification column: model Kromasil 100-5C18, 4.6 mm * 250 mm, mobile phase gradient: acetonitrile with 0.1% TFA and an aqueous solution with 0.1% TFA, 0 min. - 1:99, 20 min - 1:4. The purified solution was lyophilized to give the purified L-Thr-L-Arg (or TR) product. The yield was about 80%. The mass spectrum showed [M+H] + at 276.2.
[Пример 4] Синтез соединения формулы (3)[Example 4] Synthesis of the compound of formula (3)
(1) 2-хлортритилхлоридную смолу помещали в реакционную пробирку и добавляли ДХМ (20 мл/г). Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Затем растворитель удаляли с помощью воронки Шотта путем отсасывания вакуумом. К полученному остатку добавляли трехкратный мольный избыток Fmoc-L-Thr(tBu)-OH и восьмикратный мольный избыток DIEA, после чего добавляли ДМФА для растворения. Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Для блокировки концевых групп применяли обработку метанолом в течение 30 минут.(1) 2-chlorotrityl chloride resin was placed in a reaction tube and DCM (20 ml/g) was added. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. The solvent was then removed with a Schott funnel by vacuum suction. A 3-fold molar excess of Fmoc-L-Thr(tBu)-OH and an 8-fold molar excess of DIEA were added to the obtained residue, after which DMF was added to dissolve. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. Methanol treatment for 30 minutes was used to block the end groups.
(2) Удаляли растворитель (ДМФА). Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(2) The solvent (DMF) was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol three times, then the ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(3) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), в реакционную пробирку добавляли двукратный избыток Fmoc-Arg(Pbf)-ОН, растворенный в как можно меньшем количестве ДМФА, и двукратный избыток HBTU. Сразу после этого добавляли восьмикратный избыток DIEA, и смесь оставляли реагировать в течение 30 минут.(3) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), into a reaction tube a twofold excess of Fmoc-Arg(Pbf)-OH, dissolved in as little DMF as possible, and a twofold excess of HBTU were added. Immediately thereafter, an eightfold excess of DIEA was added and the mixture was allowed to react for 30 minutes.
(4) После удаления раствора отсасыванием отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Отсутствие окраски смеси свидетельствовало об отрицательной реакции, т.е. о том, что реакция завершена.(4) After the solution was removed by suction, a small amount of resin was collected and washed with ethanol three times, then ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. The absence of color in the mixture indicated a negative reaction, i.e. that the reaction is complete.
(5) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), растворитель удаляли. Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом, добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(5) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol, ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(6) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания растворителя вакуумом.(6) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), the resin was dried by suction of the solvent by vacuum.
(7) Стадии (3)-(5) повторяли для связывания аминокислоты Fmoc-L-Thr(tBu)-OH. После того, как продукт, полученный в результате данной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДХМ (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания растворителя вакуумом.(7) Steps (3)-(5) were repeated to bind the amino acid Fmoc-L-Thr(tBu)-OH. After the product resulting from this reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DCM (15 ml/g, twice), the resin was dried by suction of the solvent under vacuum .
(8) Полученный продукт отщепляли от смолы с помощью отщепляющей жидкости (15 мл/г, TFA:вода:EDT:Tis=95:1:2:2, об/об) в течение 90 мин. Затем отщепляющую жидкость выпаривали насухо продувкой азотом, остаток лиофилизировали, и в итоге получали сырой продукт полипептида.(8) The resulting product was cleaved from the resin with a cleaving liquid (15 ml/g, TFA:water:EDT:Tis=95:1:2:2, v/v) for 90 minutes. The cleaving liquid was then evaporated to dryness by purging with nitrogen, the residue was lyophilized to give the crude polypeptide product.
(9) Полипептид очищали и подвергали солевой трансформации или обессоливанию методом ВЭЖХ. Условия хроматографирования: tR=3,9 мин, колонка для очистки: модель Kromasil 100-5С18, 4,6 мм*250 мм, градиент подвижной фазы: ацетонитрил с 0,1% TFA и водный раствор с 0,1% TFA, 0 мин. - 1:99, 20 мин - 1:4. Очищенный раствор лиофилизировали и получали очищенный продукт L-Thr-L-Arg-L-Thr (или TRT). Выход составлял примерно 75%. Масс-спектр показал [М+Н]+ при 377,4.(9) The polypeptide was purified and subjected to salt transformation or desalting by HPLC. Chromatography conditions: t R =3.9 min, purification column: model Kromasil 100-5C18, 4.6 mm * 250 mm, mobile phase gradient: acetonitrile with 0.1% TFA and an aqueous solution with 0.1% TFA, 0 min. - 1:99, 20 min - 1:4. The purified solution was lyophilized to give the purified L-Thr-L-Arg-L-Thr (or TRT) product. The yield was about 75%. The mass spectrum showed [M+H] + at 377.4.
[Пример 5] Синтез соединения формулы (4)[Example 5] Synthesis of the compound of formula (4)
(1) 2-хлортритилхлоридную смолу помещали в реакционную пробирку и добавляли ДХМ (20 мл/г). Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Затем растворитель удаляли с помощью воронки Шотта путем отсасывания вакуумом. К полученному остатку добавляли трехкратный мольный избыток Fmoc-L-Thr(tBu)-OH и восьмикратный мольный избыток DIEA, после чего добавляли ДМФА для растворения. Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Для блокировки концевых групп применяли обработку метанолом в течение 30 минут.(1) 2-chlorotrityl chloride resin was placed in a reaction tube and DCM (20 ml/g) was added. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. The solvent was then removed with a Schott funnel by vacuum suction. A 3-fold molar excess of Fmoc-L-Thr(tBu)-OH and an 8-fold molar excess of DIEA were added to the obtained residue, after which DMF was added to dissolve. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. Methanol treatment for 30 minutes was used to block the end groups.
(2) Удаляли растворитель (ДМФА). Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(2) The solvent (DMF) was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol three times, then the ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(3) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), в реакционную пробирку добавляли двукратный избыток Fmoc-L-Pro-OH, растворенный в как можно меньшем количестве ДМФА, и двукратный избыток HBTU. Сразу после этого добавляли восьмикратный избыток DIEA, и смесь оставляли реагировать в течение 30 минут.(3) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), into a reaction tube a twofold excess of Fmoc-L-Pro-OH, dissolved in as little DMF as possible, and a twofold excess of HBTU were added. Immediately thereafter, an eightfold excess of DIEA was added and the mixture was allowed to react for 30 minutes.
(4) После удаления раствора отсасыванием отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Отсутствие окраски смеси свидетельствовало об отрицательной реакции, т.е. о том, что реакция завершена.(4) After the solution was removed by suction, a small amount of resin was collected and washed with ethanol three times, then ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. The absence of color in the mixture indicated a negative reaction, i.e. that the reaction is complete.
(5) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), растворитель удаляли. Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом, добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(5) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol, ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(6) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания растворителя вакуумом.(6) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), the resin was dried by suction of the solvent by vacuum.
(7) Стадии (3)-(5) повторяли для связывания аминокислоты Fmoc-L-Thr(tBu)-OH. После того, как продукт, полученный в результате данной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДХМ (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания растворителя вакуумом.(7) Steps (3)-(5) were repeated to bind the amino acid Fmoc-L-Thr(tBu)-OH. After the product resulting from this reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DCM (15 ml/g, twice), the resin was dried by suction of the solvent under vacuum .
(8) Полученный продукт отщепляли от смолы с помощью отщепляющей жидкости (15 мл/г, TFA:вода:EDT:Tis=95:1:2:2, об/об) в течение 90 мин. Затем отщепляющую жидкость выпаривали насухо продувкой азотом, остаток лиофилизировали, и в итоге получали сырой продукт полипептида.(8) The resulting product was cleaved from the resin with a cleaving liquid (15 ml/g, TFA:water:EDT:Tis=95:1:2:2, v/v) for 90 minutes. The cleaving liquid was then evaporated to dryness by purging with nitrogen, the residue was lyophilized to give the crude polypeptide product.
(9) Полипептид очищали и подвергали солевой трансформации или обессоливанию методом ВЭЖХ. Условия хроматографирования: tR=7,6 мин, колонка для очистки: модель Kromasil 100-5С18, 4,6 мм*250 мм, градиент подвижной фазы: ацетонитрил с 0,1% TFA и водный раствор с 0,1% TFA, 0 мин. - 1:99, 20 мин - 2:8. Очищенный раствор лиофилизировали и получали очищенный продукт L-Thr-L-Pro-L-Thr (или ТРТ). Выход составлял примерно 70%. Масс-спектр показал [М+Н]+ при 318,3.(9) The polypeptide was purified and subjected to salt transformation or desalting by HPLC. Chromatography conditions: t R =7.6 min, purification column: model Kromasil 100-5C18, 4.6 mm * 250 mm, mobile phase gradient: acetonitrile with 0.1% TFA and an aqueous solution with 0.1% TFA, 0 min. - 1:99, 20 min - 2:8. The purified solution was lyophilized to give the purified L-Thr-L-Pro-L-Thr (or TPT) product. The yield was about 70%. The mass spectrum showed [M+H] + at 318.3.
[Пример 6] Синтез соединения формулы (5)[Example 6] Synthesis of the compound of formula (5)
(1) 2-хлортритилхлоридную смолу помещали в реакционную пробирку и добавляли ДХМ (20 мл/г). Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Затем растворитель удаляли с помощью воронки Шотта путем отсасывания вакуумом. К полученному остатку добавляли трехкратный мольный избыток Fmoc-L-Thr(tBu)-OH и восьмикратный мольный избыток DIEA, после чего добавляли ДМФА для растворения. Полученную смесь встряхивали в течение 30 минут. Для блокировки концевых групп применяли обработку метанолом в течение 30 минут.(1) 2-chlorotrityl chloride resin was placed in a reaction tube and DCM (20 ml/g) was added. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. The solvent was then removed with a Schott funnel by vacuum suction. A 3-fold molar excess of Fmoc-L-Thr(tBu)-OH and an 8-fold molar excess of DIEA were added to the obtained residue, after which DMF was added to dissolve. The resulting mixture was shaken for 30 minutes. Methanol treatment for 30 minutes was used to block the end groups.
(2) Удаляли растворитель (ДМФА). Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(2) The solvent (DMF) was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a 20% solution of piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol three times, then the ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(3) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), в реакционную пробирку добавляли двукратный избыток Fmoc-L-Ala-OH, растворенный в как можно меньшем количестве ДМФА, и двукратный избыток HBTU. Сразу после этого добавляли восьмикратный избыток DIEA, и смесь оставляли реагировать в течение 30 минут.(3) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), into a reaction tube a twofold excess of Fmoc-L-Ala-OH, dissolved in as little DMF as possible, and a twofold excess of HBTU were added. Immediately thereafter, an eightfold excess of DIEA was added and the mixture was allowed to react for 30 minutes.
(4) После удаления раствора отсасыванием отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом три раза, затем добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Отсутствие окраски смеси свидетельствовало об отрицательной реакции, т.е. о том, что реакция завершена.(4) After the solution was removed by suction, a small amount of resin was collected and washed with ethanol three times, then ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. The absence of color in the mixture indicated a negative reaction, i.e. that the reaction is complete.
(5) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), растворитель удаляли. Затем добавляли раствор 20% пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 5 минут растворитель удаляли. Затем снова добавляли раствор 20% пиперидина в ДМФА (10 мл/г), и через 15 минут раствор пиперидина удаляли. Отбирали небольшое количество смолы и промывали ее этанолом, добавляли реактив нингидрина и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялась темно-синяя окраска, что свидетельствовало о положительной реакции.(5) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), the solvent was removed. Then a solution of 20% piperidine in DMF (10 ml/g) was added and after 5 minutes the solvent was removed. Then a solution of 20% piperidine in DMF (10 ml/g) was added again, and after 15 minutes the piperidine solution was removed. A small amount of resin was taken and washed with ethanol, ninhydrin reagent was added and heated at 105-110°C for 5 minutes. A dark blue color appeared, indicating a positive reaction.
(6) После того, как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания растворителя вакуумом.(6) After the product obtained from the above reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DMF (15 ml/g, twice), the resin was dried by suction of the solvent by vacuum.
(7) Стадии (3)-(5) повторяли для связывания аминокислоты Fmoc-L-Ala-OH. После того, как продукт, полученный в результате данной реакции, последовательно промывали ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДХМ (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания растворителя вакуумом.(7) Steps (3)-(5) were repeated to bind the amino acid Fmoc-L-Ala-OH. After the product resulting from this reaction was washed successively with DMF (15 ml/g, twice), methanol (15 ml/g, twice) and DCM (15 ml/g, twice), the resin was dried by suction of the solvent under vacuum .
(8) Полученный продукт отщепляли от смолы с помощью отщепляющей жидкости (15 мл/г, TFA:вода:EDT:Tis=95:1:2:2, об/об) в течение 90 мин. Затем отщепляющую жидкость выпаривали насухо продувкой азотом, остаток лиофилизировали, и в итоге получали сырой продукт полипептида.(8) The resulting product was cleaved from the resin with a cleaving liquid (15 ml/g, TFA:water:EDT:Tis=95:1:2:2, v/v) for 90 minutes. The cleaving liquid was then evaporated to dryness by purging with nitrogen, the residue was lyophilized to give the crude polypeptide product.
(9) Полипептид очищали и подвергали солевой трансформации или обессоливанию методом ВЭЖХ. Условия хроматографирования: tR=7,9 мин, колонка для очистки: модель Kromasil 100-5С18, 4,6 мм*250 мм, градиент подвижной фазы: ацетонитрил с 0,1% TFA и водный раствор с 0,1% TFA, 0 мин. - 1:99, 20 мин - 1:9. Очищенный раствор лиофилизировали и получали очищенный продукт L-Thr-L-Pro-L-Thr (или ТРТ). Выход составлял примерно 70%. Масс-спектр показал [М-8Н]+ при 260,1.(9) The polypeptide was purified and subjected to salt transformation or desalting by HPLC. Chromatography conditions: t R = 7.9 min, purification column: model Kromasil 100-5C18, 4.6 mm * 250 mm, mobile phase gradient: acetonitrile with 0.1% TFA and an aqueous solution with 0.1% TFA, 0 min. - 1:99, 20 min - 1:9. The purified solution was lyophilized to give the purified L-Thr-L-Pro-L-Thr (or TPT) product. The yield was about 70%. The mass spectrum showed [M-8H] + at 260.1.
[Пример 7] Синтез соединений формулы (6), формулы (7) и формулы (8) Приготовление соединения формулы (6):[Example 7] Synthesis of compounds of formula (6), formula (7) and formula (8) Preparation of compound of formula (6):
(1) GDL-L-Thr приготавливали с применением способа твердофазного синтеза.(1) GDL-L-Thr was prepared using a solid phase synthesis method.
(2) Очистка методом ВЭЖХ. Условия хроматографирования: tR=3,4 мин, колонка для очистки: тип SHIMADZU Intertsil ODS-SP (4,6 мм*250 мм*5 мкм), градиент подвижной фазы: ацетонитрил с 0,1% TFA и водный раствор с 0,1% TFA, 0,01-20 минут - 1:99, 20-30 минут -21:79, 30-40 минут - 100:0, 40-50 минут - 1:99. Выход составлял около 50%. Масс-спектр показал [М-Н]+ при 296,099.(2) Purification by HPLC. Chromatography conditions: t R =3.4 min, purification column: type SHIMADZU Intertsil ODS-SP (4.6 mm*250 mm*5 µm), mobile phase gradient: acetonitrile with 0.1% TFA and aqueous solution with 0 .1% TFA, 0.01-20 minutes - 1:99, 20-30 minutes - 21:79, 30-40 minutes - 100:0, 40-50 minutes - 1:99. The yield was about 50%. The mass spectrum showed [M-H] + at 296.099.
Соединение GDL-L-Thr, приготовленное с применением способа твердофазного синтеза, имеет более высокую чистоту, и его легче выделять. Экспериментальные результаты показывают, что GDL-L-Thr, приготовленное с применением способа твердофазного синтеза, обладает повышенной чистотой и имеет хорошую способность в подавлении роста ледяных кристаллов (см. ФИГ. 13).The GDL-L-Thr compound prepared using the solid phase synthesis method has a higher purity and is easier to isolate. Experimental results show that GDL-L-Thr prepared using the solid phase synthesis method has an increased purity and has a good ability to suppress the growth of ice crystals (see FIG. 13).
Оба соединения с формулами (7) и (8) можно получать способом твердофазного синтеза. [Пример 8] Синтез соединения формулы (9)Both compounds with formulas (7) and (8) can be obtained by the method of solid phase synthesis. [Example 8] Synthesis of the compound of formula (9)
(1) В пробирку для синтеза полипептида вливали раствор дихлордиметилсилана в ДХМ, и после выдержки в течение 30 минут пробирку высушивали на воздухе перед дальнейшим использованием.(1) A solution of dichlorodimethylsilane in DCM was poured into a polypeptide synthesis tube, and after standing for 30 minutes, the tube was air-dried before further use.
(2) В пробирку для синтеза помещали 100 мг смолы, добавляли 2 мл ДМФА и пропускали ток азота. Смола набухала в течение 10 минут, после чего ее фильтровали путем отсасывания под вакуумом.(2) 100 mg of resin was placed in a synthesis tube, 2 ml of DMF was added, and nitrogen flow was passed through. The resin swelled for 10 minutes, after which it was filtered by suction under vacuum.
(3) Для снятия защиты добавляли 1 мл раствора 4-метилпиперидина в ДМФА, который удаляли через 5 минут. Затем снова добавляли 1 мл раствора 4-метилпиперидина в ДМФА, который удаляли через 15 минут. Смесь барботировали азотом и фильтровали с отсасыванием под вакуумом.(3) 1 ml of a solution of 4-methylpiperidine in DMF was added to deprotect, which was removed after 5 minutes. Then 1 ml of a solution of 4-methylpiperidine in DMF was added again, which was removed after 15 minutes. The mixture was sparged with nitrogen and filtered with suction under vacuum.
(4) Полученную смесь промывали ДМФА 5 раз, барботировали азотом и фильтровали с отсасыванием под вакуумом.(4) The resulting mixture was washed with
(5) К смеси последовательно добавляли 0,5 мл 2М раствора бромуксусной кислоты в ДМФА и раствор N,N-диизопропилкарбодиимида в ДМФА, барботировали в течение 20 минут, фильтровали с отсасыванием под вакуумом и промывали ДМФА 3 раза.(5) 0.5 ml of a 2M bromoacetic acid solution in DMF and a solution of N,N-diisopropylcarbodiimide in DMF were successively added to the mixture, sparged for 20 minutes, suction filtered under vacuum, and washed with
(6) Затем к смеси добавляли 1 мл 1М раствора первичного амина в ДМФА, барботировали в течение 30 минут, промывали ДМФА и промывали дихлорметаном (3 раза).(6) Then, 1 ml of a 1M solution of primary amine in DMF was added to the mixture, sparged for 30 minutes, washed with DMF and washed with dichloromethane (3 times).
(7) Стадии (5) и (6) повторяли до тех пор, пока не была достигнута желаемая молекулярная масса.(7) Steps (5) and (6) were repeated until the desired molecular weight was reached.
(8) Затем к смеси добавляли 4 мл отщепляющей жидкости, перемешивали до однородности и продували азотом досуха. В заключение продукт лиофилизировали и затем очищали с получением очищенного продукта.(8) Then, 4 ml of cleaving liquid was added to the mixture, stirred until homogeneous, and purged with nitrogen to dryness. Finally, the product was lyophilized and then purified to give a purified product.
В полученном пептоиде R представляет собой -СН3, -СН2СН3 или -СН2СН2СООН. Масс-спектр показывает [М+Н]+ при 444,6, если R=-СН3, [М+Н]+ при 528,8, если R=-СН2СН3, иIn the resulting peptoid, R is -CH 3 , -CH 2 CH 3 or -CH 2 CH 2 COOH. Mass spectrum shows [M+H] + at 444.6 if R=-CH 3 , [M+H] + at 528.8 if R=-CH 2 CH 3 , and
[Эксперимент по оценке подавления перекристаллизации льда (TRI)][Ice Recrystallization Inhibition Evaluation Experiment (TRI)]
Активность по IRI оценивали с применением способа «замораживания брызг», в котором образец растворяют и диспергируют в растворе буфера DPBS, после чего 10-30 мкл полученного раствора капают на поверхность чистого кремниевого диска, предварительно охлажденного до -60°С с высоты не менее 1,0 м. Замороженные образцы раствора медленно нагревали до -6°С со скоростью 10°С в минуту на предметном столике с системой нагрева-охлаждения и «отжигали» при этой температуре в течение 30 минут. Размеры ледяных кристаллов наблюдали и регистрировали с помощью поляризационного микроскопа и высокоскоростной фотокамеры. Образцы на предметном столике с системой нагрева-охлаждения герметизировали, чтобы обеспечить поддержание их внутренней влажности на уровне примерно 50%. Процедуру повторяли не менее трех раз для каждого образца, а размеры ледяных кристаллов измеряли с помощью нано-измерителя Nano Measurer 1.2 с погрешностью результата, равной стандартному отклонению.IRI activity was assessed using a "splash freeze" method in which the sample is dissolved and dispersed in a DPBS buffer solution, after which 10-30 μl of the resulting solution is dropped onto the surface of a clean silicon disk pre-cooled to -60°C from a height of at least 1 0 m. Frozen samples of the solution were slowly heated to -6°C at a rate of 10°C per minute on an object table with a heating-cooling system and "annealed" at this temperature for 30 minutes. The sizes of ice crystals were observed and recorded using a polarizing microscope and a high-speed camera. Samples on a heating-cooling stage were sealed to ensure that their internal moisture content was maintained at approximately 50%. The procedure was repeated at least three times for each sample, and the sizes of ice crystals were measured using a Nano Measurer 1.2 nanometer with a result error equal to the standard deviation.
Наблюдения топологии льда (DIS) и измерения теплового гистерезиса (ТН) проводили с использованием нанолитрового осмометра. Сначала нагревали стеклянную трубку на пламени спиртовки до начала плавления с одновременным ее оттягиванием, так чтобы получился очень тонкий капилляр с микроскопическим просветом, который затем соединяли с микрошприцем. Иммерсионное масло с повышенной вязкостью наносили на диск с микронными лунками, после чего водный раствор, в котором растворен исследуемый материал, выдавливали в микролунки с помощью микрошприца. Капельки раствора быстро замораживали путем регулирования температуры и затем медленно нагревали, добиваясь формирования монокристалла льда. Затем монокристалл льда медленно охлаждали с точностью 0,01°С и проводили наблюдения DIS и измерения ТН с помощью микроскопа, снабженного высокоскоростной фотокамерой.Ice topology observations (DIS) and thermal hysteresis (TH) measurements were performed using a nanoliter osmometer. First, a glass tube was heated on the flame of an alcohol lamp until melting began, with its simultaneous withdrawal, so that a very thin capillary with a microscopic lumen was obtained, which was then connected to a microsyringe. Immersion oil with increased viscosity was applied to a disk with micron wells, after which the aqueous solution in which the test material was dissolved was squeezed out into microwells using a microsyringe. The droplets of the solution were rapidly frozen by temperature control and then heated slowly to form an ice single crystal. Then, the ice single crystal was slowly cooled with an accuracy of 0.01° C., and DIS observations and TH measurements were made using a microscope equipped with a high-speed camera.
Испытания на IRI-активность проводили способом «замораживания брызг» на 20 мкл DPBS раствора соединения TR, приготовленного в Примере 3. Величины MLGS (как % относительно их значений в буфере DPBS) показаны на ФИГ. 17. Величины MLGS в случае соединения TR, связанного химическими связями, очевидно меньше, чем в случае DPBS растворов аргинина и треонина при тех же концентрациях.Tests for IRI activity were performed by the "freeze spray" method on 20 μl of DPBS solution of TR compound prepared in Example 3. MLGS values (as % relative to their values in DPBS buffer) are shown in FIG. 17. The MLGS values in the case of a chemically bonded TR compound are obviously smaller than in the case of DPBS solutions of arginine and threonine at the same concentrations.
Деионизированные водные растворы соединения TR, приготовленного в Примере 3, брали для наблюдений DIS с использованием нанолитрового осмометра. Было установлено, что соединение TR оказывает слабый модифицирующий эффект на топографию ледяных кристаллов (при степени переохлаждения -0,1°С, от -0,4°С до 0,01°С), как это показано на ФИГ. 18. Никакого теплового гистерезиса (ТН) не наблюдали.Deionized aqueous solutions of the TR compound prepared in Example 3 were taken for DIS observations using a nanoliter osmometer. The compound TR was found to have a weak modifying effect on the topography of ice crystals (at the degree of supercooling -0.1°C, from -0.4°C to 0.01°C), as shown in FIG. 18. No thermal hysteresis (TH) was observed.
Испытания на IRI-активность проводили способом «замораживания брызг» на 20 мкл DPBS растворов соединений GDL-L-Thr, GDL-L-Ser и GDL-L-Val, приготовленных в Примере 7. Величины MLGS (как % относительно их значений в буфере DPBS) показаны на ФИГ. 13 и ФИГ. 15-16. Величины MLGS в случае соединений GDL-L-Thr, GDL-L-Ser и GDL-L-Val, связанных химическими связями, очевидно меньше, чем в случае DPBS растворов GDL и аминокислот при тех же концентрациях, и меньше, чем в случае DPBS растворов смесей GDL с аминокислотами при тех же концентрациях.Tests for IRI activity were performed by the "freeze spray" method on 20 μl of DPBS solutions of compounds GDL-L-Thr, GDL-L-Ser and GDL-L-Val prepared in Example 7. MLGS values (as % relative to their values in buffer DPBS) are shown in FIG. 13 and FIG. 15-16. The MLGS values in the case of GDL-L-Thr, GDL-L-Ser and GDL-L-Val compounds linked by chemical bonds are obviously less than in the case of DPBS solutions of GDL and amino acids at the same concentrations, and less than in the case of DPBS solutions of mixtures of GDL with amino acids at the same concentrations.
Деионизированные водные растворы соединения GDL-L-Thr, приготовленного в Примере 7, брали для наблюдений DIS с использованием нанолитрового осмометра. Было установлено, что соединение GDL-L-Thr оказывает слабый модифицирующий эффект на топографию ледяных кристаллов (при степени переохлаждения -0,1°С, от -0,4°С до 0,01°С), как это показано на ФИГ. 14. Никакого теплового гистерезиса (ТН) не наблюдали.Deionized aqueous solutions of the GDL-L-Thr compound prepared in Example 7 were taken for DIS observations using a nanoliter osmometer. It was found that the compound GDL-L-Thr has a weak modifying effect on the topography of ice crystals (at the degree of supercooling -0.1°C, from -0.4°C to 0.01°C), as shown in FIG. 14. No thermal hysteresis (TH) was observed.
Испытания на IRI-активность проводили способом «замораживания брызг» на 20 мкл DPBS растворов соединений, приготовленных в Примере 8. Величины MLGS (как % относительно их значений в буфере DPBS) показаны на ФИГ. 19.Tests for IRI activity were performed by the "freeze spray" method on 20 μl DPBS solutions of the compounds prepared in Example 8. MLGS values (as % relative to their values in DPBS buffer) are shown in FIG. nineteen.
Деионизированные водные растворы трех пептоидов, приготовленных в Примере 8, брали для наблюдений DIS с использованием нанолитрового осмометра. Было установлено, что пептоиды, в которых R=-СН3 и -СН2СН3, имели довольно очевидные модифицирующие эффекты на топографию ледяных кристаллов, а пептоиды, в которых R=-СН2СН2СООН, не оказывали никакого модифицирующего эффекта на топографию ледяных кристаллов (при степени переохлаждения -0,1°С, от -0,4°С до 0,01°С). Полученная топография показана на ФИГ. 20. Никакого теплового гистерезиса (ТН) в случае всех трех пептоидов не обнаруживали.Deionized aqueous solutions of the three peptoids prepared in Example 8 were taken for DIS observations using a nanoliter osmometer. It was found that peptoids in which R=-CH 3 and -CH 2 CH 3 had fairly obvious modifying effects on the topography of ice crystals, and peptoids in which R=-CH 2 CH 2 COOH had no modifying effect on topography of ice crystals (at the degree of supercooling -0.1°C, from -0.4°C to 0.01°C). The resulting topography is shown in FIG. 20. No thermal hysteresis (TH) was found for all three peptoids.
Приведенные выше результаты показывают, что полученные пептидные соединения обладают активностью в подавлении роста ледяных кристаллов и оказывают модифицирующее воздействие на топографию ледяных кристаллов. В частности, соединение формулы (9), в котором R=-СН3 или -СН2СН3, обладает отличным модифицирующим эффектом на топографию ледяных кристаллов при отсутствии ТН и может проявлять эффект контролирования роста ледяных кристаллов. Соответственно, указанное соединение можно использовать в составе криоконсервирующего раствора.The above results show that the obtained peptide compounds have activity in inhibiting the growth of ice crystals and have a modifying effect on the topography of ice crystals. In particular, the compound of formula (9) in which R=-CH 3 or -CH 2 CH 3 has an excellent ice crystal topography modifying effect in the absence of TH, and can exhibit an ice crystal growth control effect. Accordingly, said compound can be used as part of a cryopreservation solution.
В. Оценка показателей подавления роста льда и скрининг материалов, подавляющих рост льдаB. Evaluation of Ice Growth Inhibition Performance and Screening of Ice Growth Inhibiting Materials
Количество материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда, выражается как (масса материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда (m1)) / (общая масса материала, подавляющего рост льда, содержащаяся в исходном растворе, содержащем материал, подавляющий рост льда (m2)) × 100%.The amount of ice growth inhibiting material adsorbed on the ice surface is expressed as (mass of ice growth inhibiting material adsorbed on the ice surface (m 1 )) / (total mass of ice growth inhibiting material contained in the initial solution containing the inhibiting material). ice growth ( m2 )) × 100%.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения эксперимент по адсорбции материала льдом включает следующие стадии:In one embodiment of the present invention, the material adsorption experiment on ice includes the following steps:
S1: взятие навески материала, подавляющего рост льда, массой m2 с приготовлением водного раствора материала, подавляющего рост льда, после чего его охлаждают до температуры переохлаждения (ниже температуры кристаллизации);S1: taking a sample of the material that inhibits the growth of ice, mass m 2 with the preparation of an aqueous solution of the material that inhibits the growth of ice, after which it is cooled to a supercooling temperature (below the crystallization temperature);
S2: размещение в водном растворе предварительно охлажденного стержня регулирования температуры, так чтобы вызывать рост слоя льда на поверхности стержня регулирования температуры, при этом водный раствор постоянно перемешивают, давая возможность материалу, подавляющему рост льда, равномерно адсорбироваться по поверхности ледяного слоя, а температуру водного раствора и температуру стержня регулирования температуры постоянно поддерживают на уровне температуры переохлаждения; иS2: Placing a pre-cooled temperature control rod in an aqueous solution so as to cause a layer of ice to grow on the surface of the temperature control rod, while the aqueous solution is constantly agitated, allowing the ice growth inhibiting material to be evenly adsorbed on the surface of the ice layer, and the temperature of the aqueous solution and the temperature of the temperature control rod is constantly maintained at the subcooling temperature; and
S3: определение количества материала, подавляющего рост льда, адсорбированного на поверхности льда.S3: determination of the amount of ice growth inhibiting material adsorbed on the ice surface.
Для проведения эксперимента по адсорбции материалов льдом использовали устройство, показанное на ФИГ. 21. Указанное устройство включает многослойную полость для размещения жидкости, стержень регулирования температуры и температурный регулятор, где многослойная полость для размещения жидкости последовательно включает (перечисляя изнутри наружу) полость для адсорбции материала льдом, полость бани и полость для размещения охлаждающей жидкости. Стержень регулирования температуры установлен в полости для адсорбции материала льдом. Температуру стержня регулирования температуры и полости для размещения жидкости задают посредством температурного регулятора. Стержень регулирования температуры имеет полую структуру и выполнен из теплопроводящего материала, и полая структура стержня регулирования температуры имеет входное отверстие для жидкости и выходное отверстие для жидкости. Температурный регулятор представляет собой регулятор температуры жидкостей и снабжен концевым отверстием для выпуска охлаждающей жидкости и концевым отверстием для возврата охлаждающей жидкости. Два конца полости для размещения жидкости также имеют входное отверстие для жидкости и выходное отверстие для жидкости, концевое отверстие для выпуска охлаждающей жидкости температурного регулятора, входное отверстие для жидкости стержня регулирования температуры, выходное отверстие для жидкости стержня регулирования температуры, входное отверстие резервуара для размещения охлаждающей жидкости, выходное отверстие резервуара для размещения охлаждающей жидкости и концевое отверстие для возврата охлаждающей жидкости температурного регулятора последовательно соединены трубками, по которым протекает охлаждающая жидкость. Многослойная полость для размещения жидкости снабжена крышкой. При использовании полость для адсорбции материала льдом предполагается наполнять водным раствором материала, подавляющего рост льда, и полость бани в среднем слое предполагается заполнять средой для бани, имеющей заданную температуру, например, это может быть водяная баня, ледяная баня или масляная баня. После достижения заданной температуры охлаждающей жидкости, охлаждающая жидкость вытекает из температурного регулятора и подается в полую структуру стержня регулирования температуры, чтобы обеспечить регулирование температуры стержня регулирования температуры, затем выходит из выходного отверстия для жидкости стержня регулирования температуры и поступает в полость для размещения охлаждающей жидкости в наружном слое, обеспечивая заданный уровень температуры для среды, используемой в бане. Затем охлаждающая жидкость протекает через выходное отверстие для жидкости резервуара для размещения охлаждающей жидкости и концевое отверстие для возврата охлаждающей жидкости температурного регулятора и поступает в температурный регулятор для циркуляции.The apparatus shown in FIG. 21. Said device includes a multilayer liquid accommodating cavity, a temperature control rod, and a temperature controller, wherein the multilayer liquid accommodating cavity sequentially includes (listing from inside to outside) an ice material adsorption cavity, a bath cavity, and a cooling liquid accommodating cavity. The temperature control rod is installed in the cavity for material adsorption by ice. The temperature of the temperature control rod and the liquid accommodating cavity is set by a temperature controller. The temperature control rod has a hollow structure and is made of a heat-conducting material, and the hollow structure of the temperature control rod has a liquid inlet and a liquid outlet. The temperature controller is a liquid temperature controller and is provided with a coolant outlet end hole and a coolant return end hole. The two ends of the liquid accommodating cavity also have a liquid inlet and a liquid outlet, a temperature controller coolant outlet end, a temperature control rod liquid inlet, a temperature control rod liquid outlet, a coolant accommodating reservoir inlet , the outlet of the coolant storage tank and the coolant return end of the temperature controller are connected in series with pipes through which the coolant flows. The multilayer cavity for liquid placement is provided with a lid. In use, the ice material adsorption cavity is contemplated to be filled with an aqueous solution of the ice growth inhibiting material, and the bath cavity in the middle layer is contemplated to be filled with a bath medium having a predetermined temperature, such as a water bath, an ice bath, or an oil bath. After reaching the predetermined temperature of the coolant, the coolant flows out of the temperature controller and enters the hollow structure of the temperature control rod to ensure the temperature control of the temperature control rod, then exits the liquid outlet of the temperature control rod and enters the coolant housing cavity in the outer layer, providing a given temperature level for the environment used in the bath. Then, the coolant flows through the liquid outlet of the coolant accommodation tank and the coolant return end of the temperature controller, and enters the temperature controller for circulation.
[Пример 9][Example 9]
а-ПВС: молекулярная масса, равная примерно 13-23 кДа, диадная синдиотактичность r, равная примерно 55% (Sigma-Aldrich);a-PVA: molecular weight about 13-23 kDa, dyad syndiotacticity r about 55% (Sigma-Aldrich);
i-ПВС: молекулярная масса, равная примерно 14-26 кДа, изотактичность m, равная примерно 84%.i-PVA: molecular weight about 14-26 kDa, isotactic m about 84%.
(1) Измерение показателей распределения двух типов ПВС вдоль межфазной границы «лед-вода»(1) Measurement of the distribution indices of two types of PVA along the ice-water interface
Количества двух типов ПВС, адсорбированных на поверхности льда, определяли путем проведения эксперимента по адсорбции материалов льдом. Устройство для проведения эксперимента показана на ФИГ. 21.The amounts of two types of PVA adsorbed on the ice surface were determined by conducting an experiment on the adsorption of materials on ice. The device for conducting the experiment is shown in FIG. 21.
a. Образцы а-ПВС и i-ПВС маркировали флуоресцентной меткой FITC Изомер I.a. The α-PVA and i-PVA samples were labeled with the FITC Isomer I fluorescent label.
b. Меченные FITC водные растворы (по 40 мл) двух типов ПВС с различными концентрациями разливали в лабораторные стаканы, которые затем помещали в рециркуляционную охлаждающую баню, и температуру растворов и стержня регулирования температуры доводили до -0,1°С.b. FITC-labeled aqueous solutions (40 ml each) of two types of PVA at different concentrations were poured into beakers, which were then placed in a recirculating cooling bath, and the temperature of the solutions and the temperature control rod was brought to -0.1°C.
c. Стержень регулирования температуры перед погружением в предварительно охлажденные меченные FITC водные растворы ПВС сначала погружали в жидкий азот на 1 минуту для предварительного охлаждения. Затем стержень регулирования температуры быстро опускали в предварительно охлажденные меченные FITC водные растворы ПВС, так чтобы инициировать образование предельно тонкого слоя льда на поверхности стержня регулирования температуры, с тем чтобы инициировать дальнейшее нарастание льда.c. The temperature control rod was first immersed in liquid nitrogen for 1 minute to pre-cool before being immersed in pre-cooled FITC-labeled aqueous PVA solutions. The temperature control rod was then quickly dipped into the pre-cooled FITC labeled aqueous PVA solutions so as to initiate the formation of an extremely thin layer of ice on the surface of the temperature control rod in order to initiate further ice growth.
d. Меченные FITC водные растворы ПВС непрерывно перемешивали магнитной мешалкой при температуре переохлаждения -0,1°С в течение 1,0 часа, чтобы обеспечить равномерную и постепенную адсорбцию ПВС на поверхности льда. Степень переохлаждения и время адсорбции поддерживали неизменными на протяжении всего адсорбционного эксперимента, так чтобы площадь поверхности образующегося льда сохранялась практически неизменной в пределах допустимой погрешности.d. FITC-labeled PVA aqueous solutions were continuously stirred with a magnetic stirrer at a supercooling temperature of -0.1°C for 1.0 hour to ensure uniform and gradual adsorption of PVA on the ice surface. The degree of supercooling and adsorption time were kept constant throughout the entire adsorption experiment, so that the surface area of the resulting ice remained practically unchanged within the margin of error.
e. Сформировавшийся блок льда извлекали из раствора, и поверхность льда споласкивали очищенной водой для удаления с его поверхности раствора. Затем блок льда размораживали.e. The formed ice block was removed from the solution, and the ice surface was rinsed with purified water to remove the solution from its surface. The ice block was then thawed.
f. Количество ПВС, адсорбированного на поверхности льда, получали из отношения массы растворенного ПВС в ледяном блоке, и массы растворенного ПВС в исходном растворе. Концентрацию раствора ПВС определяли методом спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой области, а объем раствора определяли пипеткой и мерным цилиндром.f. The amount of PVA adsorbed on the ice surface was obtained from the ratio of the mass of dissolved PVA in the ice block and the mass of dissolved PVA in the initial solution. The concentration of the PVA solution was determined by spectrophotometry in the ultraviolet and visible region, and the volume of the solution was determined with a pipette and a measuring cylinder.
В экспериментах по адсорбции льдом количества а-ПВС и i-ПВС, адсорбированные при каждой концентрации, показаны на ФИГ. 22. Можно видеть, что количество а-ПВС, адсорбированное на поверхности льда, увеличивается с 16,3% при концентрации 0,2 мг/мл до 28,7% при концентрации 1,0 мг/мл, а при концентрациях свыше 1,0 мг/мл количество а-ПВС, адсорбированное на поверхности льда, достигает насыщения на уровне приблизительно 36,5%. Количество i-ПВС, адсорбированное на поверхности льда, при концентрациях до 1,0 мг/мл составляет от 0% до 19,3% и меньше, чем количество а-ПВС, адсорбированное на поверхности льда, при тех же концентрациях. При низких концентрациях количества обоих типов ПВС, адсорбированных на поверхности льда, далеки от насыщения, и площадь поверхности льда, покрытая i-ПВС, меньше площади поверхности льда, покрытой а-ПВС.In ice adsorption experiments, the amounts of a-PVA and i-PVA adsorbed at each concentration are shown in FIG. 22. It can be seen that the amount of a-PVA adsorbed on the ice surface increases from 16.3% at a concentration of 0.2 mg / ml to 28.7% at a concentration of 1.0 mg / ml, and at concentrations above 1, At 0 mg/ml, the amount of a-PVA adsorbed on the ice surface reaches a saturation level of approximately 36.5%. The amount of i-PVA adsorbed on the ice surface at concentrations up to 1.0 mg/ml ranges from 0% to 19.3% and is less than the amount of a-PVA adsorbed on the ice surface at the same concentrations. At low concentrations, the amounts of both types of PVA adsorbed on the ice surface are far from saturation, and the surface area of ice covered with i-PVA is less than the surface area of ice covered with α-PVA.
Количество i-ПВС, адсорбированное на поверхности льда, превышает количество а-ПВС, адсорбированное на поверхности льда, когда концентрация i-ПВС равна 1,2 мг/мл и более. При этом количество i-ПВС, адсорбированное на поверхности льда, достигает насыщения при концентрации 2,0 мг/мл и составляет примерно 56,5%. Кроме того, установлено, что количество i-ПВС, требуемое для насыщения, гораздо больше количества а-ПВС, требуемого для насыщения, при адсорбции на поверхности льда одинакового размера. Таким образом, а-ПВС может покрывать поверхность льда более эффективно.The amount of i-PVA adsorbed on the ice surface exceeds the amount of a-PVA adsorbed on the ice surface when the concentration of i-PVA is 1.2 mg/mL or more. In this case, the amount of i-PVA adsorbed on the ice surface reaches saturation at a concentration of 2.0 mg/ml and is approximately 56.5%. In addition, it has been found that the amount of i-PVA required for saturation is much greater than the amount of α-PVA required for saturation when adsorbed on the surface of ice of the same size. Thus, a-PVA can cover the ice surface more efficiently.
(2) Количественный анализ активности в подавлении перекристаллизации льда (ГОЛ)(2) Quantitative analysis of activity in the suppression of ice recrystallization (IOL)
Активность в подавлении перекристаллизации льда (ГОЛ) оценивали с применением способа «замораживания брызг», в котором два типа ПВС по отдельности растворяли и диспергировали в растворах буфера DPBS. Затем по 10-30 мкл полученного раствора капали на поверхность чистого кремниевого диска, предварительно охлажденного до -60°С с высоты не менее 1,0 м. Замороженные образцы раствора медленно нагревали до -6°С со скоростью 10°С в минуту на предметном столике с системой нагрева-охлаждения и «отжигали» при этой температуре в течение 30 минут. Размеры ледяных кристаллов наблюдали и регистрировали с помощью поляризационного микроскопа и высокоскоростной фотокамеры. Образцы на предметном столике с системой нагрева-охлаждения герметизировали, чтобы гарантировать сохранение их внутренней влажности на уровне примерно 50%. Процедуру повторяли не менее трех раз для каждого образца, а размеры ледяных кристаллов измеряли с помощью нано-измерителя Nano Measurer 1.2 с погрешностью результата, равной стандартному отклонению.Ice recrystallization suppression (IOL) activity was evaluated using a "splash freeze" method in which two types of PVA were separately dissolved and dispersed in DPBS buffer solutions. Then, 10-30 µl of the resulting solution was dropped onto the surface of a clean silicon disk, previously cooled to -60°C from a height of at least 1.0 m. The frozen samples of the solution were slowly heated to -6°C at a rate of 10°C per minute on a subject table with a heating-cooling system and “annealed” at this temperature for 30 minutes. The sizes of ice crystals were observed and recorded using a polarizing microscope and a high-speed camera. Samples on a heating-cooling stage were sealed to ensure that their internal moisture content was maintained at approximately 50%. The procedure was repeated at least three times for each sample, and the sizes of ice crystals were measured using a Nano Measurer 1.2 nanometer with a result error equal to the standard deviation.
Результат показан на ФИГ. 23, из которого видно, что размеры частиц а-ПВС значительно меньше, чем у i-ПВС, при одних и тех же концентрациях. Это говорит о том, что способность подавлять рост ледяных кристаллов у а-ПВС гораздо выше, чем у i-ПВС.The result is shown in FIG. 23, which shows that the particle size of a-PVA is much smaller than that of i-PVA at the same concentrations. This suggests that the ability to suppress the growth of ice crystals in a-PVA is much higher than that of i-PVA.
Согласно результатам, полученным в Примере 9, i-ПВС обладает более слабым сродством к воде, чем а-ПВС. Следовательно, i-ПВС имеет тенденцию находиться в более агрегированном состоянии, как в водном растворе, так и на поверхности раздела фаз «лед-вода», тогда как а-ПВС может хорошо распределяться в водном растворе и на поверхности раздела «лед-вода». Количество i-ПВС, требуемое для достижения насыщения в процессе адсорбции на поверхности льда, гораздо больше, чем количество а-ПВС, требуемое для достижения насыщения при адсорбции на поверхности льда такого же размера. Следовательно, по сравнению с i-ПВС, а-ПВС является лучшим материалом, подавляющим рост льда, и лучше выполняет функцию по ингибированию роста ледяных кристаллов при более низких концентрациях.According to the results obtained in Example 9, i-PVA has a weaker affinity for water than a-PVA. Therefore, i-PVA tends to be in a more aggregated state, both in aqueous solution and at the ice-water interface, while a-PVA can be well distributed in aqueous solution and at the ice-water interface. . The amount of i-PVA required to achieve saturation when adsorbed on an ice surface is much greater than the amount of a-PVA required to achieve saturation when adsorbed on an ice surface of the same size. Therefore, compared with i-PVA, α-PVA is a better ice growth inhibiting material and better performs the function of inhibiting the growth of ice crystals at lower concentrations.
С. Составление рецептуры криоконсервирующего раствора, его приготовление и варианты примененияC. Formulation of the cryopreservation solution, its preparation and uses
[Пример 10] Приготовление криоконсервирующего раствора, содержащего ПВС в качестве материала, подавляющего рост льда[Example 10] Preparation of a cryopreservation solution containing PVA as an ice growth inhibiting material
1. Приготовление криоконсервирующих растворов: криоконсервирующие растворы готовили согласно приведенным ниже рецептурам.1. Preparation of cryopreservation solutions: cryopreservation solutions were prepared according to the recipes below.
Криоконсервирующий раствор А содержит следующие компоненты на 100 мл:Cryopreservation solution A contains the following ingredients per 100 ml:
Процедура приготовления раствора: Навеску 2,0 г ПВС растворяли в 25 мл буфера DPBS на водяной бане при 80°С с магнитной мешалкой с нагревом. После полного растворения ПВС и охлаждения раствора до комнатной температуры доводили рН до 7,0, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 17 г (0,05 моль) (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору добавляли 10 мл этиленгликоля и 10 мл ДМСО, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, рН полученного раствора корректировали, и его объем доводили до 80 мл буфером. Сыворотку в объеме 20 мл хранили отдельно и добавляли в криоконсервирующий раствор при его применении.Solution Preparation Procedure: A 2.0 g portion of PVA was dissolved in 25 ml of DPBS buffer in a water bath at 80° C. with a heated magnetic stirrer. After complete dissolution of PVA and cooling of the solution to room temperature, the pH was adjusted to 7.0, as a result of which
Криоконсервирующий раствор В содержит следующие компоненты на 100 мл:Cryopreservation solution B contains the following ingredients per 100 ml:
Процедура приготовления раствора: Навеску 2,0 г ПВС растворяли в 20 мл буфера DPBS на водяной бане при 80°С с магнитной мешалкой с нагревом, и рН полученного раствора доводили до 7,1, в результате чего получали Раствор 1. Навески 8,0 г L-Arg и 4,0 г L-Thr растворяли в 20 мл буфера DPBS, и рН полученного раствора доводили до 7,1, в результате чего получали Раствор 2. Навеску сахарозы 17 г (0,05 моль) (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли с помощью ультразвука в 20 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору добавляли 10 мл этиленгликоля, в результате чего получали Раствор 3. После достижения комнатной температуры Раствор 1, Раствор 2 и Раствор 3 смешивали до однородности, рН полученного раствора корректировали, и его объем доводили до 80 мл буфером. Сыворотку в объеме 20 мл хранили отдельно и добавляли в криоконсервирующий раствор при его применении.Solution preparation procedure: A 2.0 g sample of PVA was dissolved in 20 ml of DPBS buffer in a water bath at 80°C with a heated magnetic stirrer, and the pH of the resulting solution was adjusted to 7.1, resulting in
Криоконсервирующий раствор С содержит следующие компоненты на 100 мл:Cryopreservation solution C contains the following ingredients per 100 ml:
Процедура приготовления раствора: Навеску 2,0 г ПВС растворяли в 25 мл буфера DPBS на водяной бане при 80°С с магнитной мешалкой с нагревом, и рН полученного раствора доводили до 6,9, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 17 г (0,05 моль) (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору добавляли 10 мл этиленгликоля, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, рН полученного раствора корректировали, и его объем доводили до 80 мл буфером. Сыворотку в объеме 20 мл хранили отдельно и добавляли в криоконсервирующий раствор при его применении.Solution preparation procedure: A 2.0 g portion of PVA was dissolved in 25 ml of DPBS buffer in a water bath at 80° C. with a heated magnetic stirrer, and the pH of the resulting solution was adjusted to 6.9, resulting in
Криоконсервирующий раствор С1 содержит следующие компоненты на 100 мл:Cryopreservation solution C1 contains the following components per 100 ml:
Процедура приготовления раствора такая же, как и для криоконсервирующего раствора С. Криоконсервирующий раствор D содержит следующие компоненты на 100 мл:The procedure for preparing the solution is the same as for cryopreservation solution C. Cryopreservation solution D contains the following components per 100 ml:
Процедура приготовления раствора: Навеску 2,0 г ПВС растворяли в 30 мл буфера DPBS на водяной бане при 80°С с магнитной мешалкой с нагревом, и рН полученного раствора доводили до 7,0, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 17 г (0,05 моль) (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору добавляли 10 мл этиленгликоля, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, рН полученного раствора корректировали, и его объем доводили до 100 мл буфером для дальнейшего применения.Solution preparation procedure: A 2.0 g sample of PVA was dissolved in 30 ml of DPBS buffer in a water bath at 80°C with a heated magnetic stirrer, and the pH of the resulting solution was adjusted to 7.0, resulting in
Криоконсервирующий раствор Е содержит следующие компоненты на 100 мл:Cryopreservation solution E contains the following ingredients per 100 ml:
Процедура приготовления раствора: Навеску 2,0 г ПВС растворяли в 25 мл буфера DPBS на водяной бане при 80°С с магнитной мешалкой с нагревом, и рН полученного раствора доводили до 7,0, в результате чего получали Раствор 1. Навеску 1,5 г поли-L-пролина (со степенью полимеризации, равной 15) растворяли с помощью ультразвука в дополнительных 20 мл буфера DPBS, и рН полученного раствора доводили до 7,0, в результате чего получали Раствор 2. Навеску сахарозы 17 г (0,05 моль) (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору добавляли 10 мл этиленгликоля, в результате чего получали Раствор 3. После достижения комнатной температуры Раствор 1, Раствор 2 и Раствор 3 смешивали до однородности, рН полученного раствора корректировали, и его объем доводили до 100 мл буфером для дальнейшего применения.Solution preparation procedure: A 2.0 g sample of PVA was dissolved in 25 ml of DPBS buffer in a water bath at 80°C with a heated magnetic stirrer, and the pH of the resulting solution was adjusted to 7.0, resulting in
Криоконсервирующий раствор F содержит следующие компоненты на 100 мл:Cryopreservation solution F contains the following ingredients per 100 ml:
Процедура приготовления такая же, как и для криоконсервирующего раствора Е, а сыворотку добавляют в криоконсервирующий раствор при его применении.The preparation procedure is the same as for cryopreservation solution E, and the serum is added to the cryopreservation solution when it is used.
2. Приготовление замораживающих уравновешивающих растворов: замораживающие уравновешивающие растворы готовили согласно приведенным ниже рецептурам.2. Preparation of freezing equilibration solutions: Freezing equilibration solutions were prepared according to the recipes below.
Замораживающий уравновешивающий раствор а: 7,5 мл этиленгликоля и 7,5 мл ДМСО добавляли к 65 мл буфера DPBS и перемешивали до однородности, а 20 мл сыворотки добавляли в замораживающий уравновешивающий раствор при его применении.Freeze equilibration solution a: 7.5 ml of ethylene glycol and 7.5 ml of DMSO were added to 65 ml of DPBS buffer and mixed until homogeneous, and 20 ml of serum was added to the freezing equilibration solution when it was used.
Замораживающий уравновешивающий раствор b: 7,5 мл этиленгликоля растворяли в 72,5 мл буфера DPBS и перемешивали до однородности, а 20 мл сыворотки добавляли в замораживающий уравновешивающий раствор при его применении.Freeze equilibrate solution b: 7.5 ml of ethylene glycol was dissolved in 72.5 ml of DPBS buffer and mixed until homogeneous, and 20 ml of serum was added to the freeze equilibration solution when it was used.
Замораживающий уравновешивающий раствор с: 2,0 г ПВС растворяли в 50 мл буфера DPBS на водяной бане при 80°С с магнитной мешалкой с нагревом, и после полного растворения ПВС рН полученного раствора доводили до 7,0. Затем к раствору добавляли 7,5 мл этиленгликоля, перемешивали до однородности, корректировали рН, а объем доводили до 100 мл для дальнейшего применения.Freezing equilibration solution c: 2.0 g of PVA was dissolved in 50 ml of DPBS buffer in a water bath at 80°C with a magnetic stirrer with heating, and after complete dissolution of PVA, the pH of the resulting solution was adjusted to 7.0. Then, 7.5 ml of ethylene glycol was added to the solution, stirred until homogeneous, the pH was adjusted, and the volume was adjusted to 100 ml for further use.
Сравнительный пример:Comparative example:
Замораживающий уравновешивающий раствор а содержит, в расчете на 1 мл, 7,5% (об/об) ДМСО, 7,5% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и остальной объем - буфер DPBS;Freezing equilibration solution a contains, per 1 ml, 7.5% (v/v) DMSO, 7.5% (v/v) ethylene glycol, 20% (v/v) fetal bovine serum and the remainder of the buffer DPBS ;
Криоконсервирующий раствор №1 содержит, в расчете на 1 мл, 15% (об/об) ДМСО, 15% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки, 0,5М сахарозы и остальной объем - буфер DPBS;Cryopreservation solution No. 1 contains, per 1 ml, 15% (v / v) DMSO, 15% (v / v) ethylene glycol, 20% (v / v) fetal bovine serum, 0.5 M sucrose and the rest of the volume - buffer DPBS;
Замораживающий уравновешивающий раствор №2 содержит, в расчете на 1 мл, 7,5% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и остальной объем - буфер DPBS;Freeze
Криоконсервирующий раствор №2 содержит, в расчете на 1 мл, 10% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки, 0,5М сахарозы и остальной объем - буфер DPBS;Cryopreservation solution No. 2 contains, per 1 ml, 10% (v/v) ethylene glycol, 20% (v/v) fetal bovine serum, 0.5 M sucrose and the remaining volume - buffer DPBS;
Криоконсервирующий раствор №3 содержит, в расчете на 1 мл, 10% (об/об) ДМСО, 15% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и остальной объем - среда а-МЕМ (USA, Invitrogen, С12571500 ВТ).Cryopreservation solution No. 3 contains, per 1 ml, 10% (v/v) DMSO, 15% (v/v) fetal bovine serum and the rest of the volume - a-MEM medium (USA, Invitrogen, C12571500 BT).
Размораживающие растворы, использовавшиеся в Примере 10 и сравнительных примерах, имели три следующих рецептуры:The thawing solutions used in Example 10 and comparative examples had the following three formulations:
Размораживающий раствор №1 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS) и размораживающий раствор IV (содержащий 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS).
Размораживающий раствор №2 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл и остальной объем - буфер DPBS) и размораживающий раствор IV (содержащий ПВС в концентрации 20 мг/мл и остальной объем - буфер DPBS).
Размораживающий раствор №3 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, полипролин в концентрации 10 мг/мл и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, полипролин в концентрации 5,0 мг/мл и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, полипролин в концентрации 2,5 мг/мл и остальной объем - буфер DPBS) и размораживающий раствор IV (содержащий ПВС в концентрации 20 мг/мл и остальной объем - буфер DPBS).
[Пример применения 1] Ооциты и эмбрионы подвергали криоконсервации с применением замораживающих уравновешивающих растворов и криоконсервирующих растворов из представленных выше примеров и сравнительных примеров согласно схемам, приведенным в Таблице 1 и Таблице 2, соответственно. Показатели выживаемости в различных вариантах воплощения настоящего изобретения определяли как среднее из показателей выживаемости в 3-12 повторных экспериментах.[Application Example 1] Oocytes and embryos were cryopreserved using freezing equilibration solutions and cryopreservation solutions from the above examples and comparative examples according to the schemes shown in Table 1 and Table 2, respectively. Survival rates in various embodiments of the embodiment of the present invention was determined as the average of survival rates in 3-12 repeated experiments.
1. Криоконсервация ооцитов1. Cryopreservation of oocytes
Мышиные ооциты сначала уравновешивали в замораживающем уравновешивающем растворе в течение 5 минут, затем помещали в приготовленный криоконсервирующий раствор на 1 минуту. Уравновешенные ооциты в криоконсервирующем растворе помещали в криоконсервационную соломинку, затем быстро опускали в жидкий азот (-196°С) и постоянно сохраняли их в нем после герметизации несущего стержня. При необходимости размораживания замороженные ооциты уравновешивали в размораживающем растворе I при 37°С в течение 5 минут, и затем последовательно уравновешивали в размораживающих растворах II-IV по 3 минуты в каждом. Затем размороженные ооциты культивировали в течение 2 часов, подсчитывали количество выживших клеток и рассчитывали показатели выживаемости (см. Таблицу 1).Mouse oocytes were first equilibrated in the freezing equilibration solution for 5 minutes, then placed in the prepared cryopreservation solution for 1 minute. The balanced oocytes in the cryopreservation solution were placed in a cryopreservation straw, then quickly immersed in liquid nitrogen (-196°C) and kept permanently there after the carrier rod was sealed. If thawing was required, frozen oocytes were equilibrated in thawing solution I at 37°C for 5 minutes, and then sequentially equilibrated in thawing solutions II-IV for 3 minutes each. Then, the thawed oocytes were cultured for 2 hours, the number of surviving cells was counted and survival rates were calculated (see Table 1).
2. Криоконсервация эмбрионов2. Cryopreservation of embryos
Мышиные эмбрионы сначала уравновешивали в замораживающем уравновешивающем растворе в течение 5 минут, затем помещали в криоконсервирующий раствор, приготовленный в соответствии с рецептурами, указанными в приведенных выше примерах и сравнительных примерах, на 50 секунд. Уравновешенные эмбрионы в криоконсервирующем растворе вводили в криоконсервационную соломинку, затем быстро опускали в жидкий азот (-196°С) и постоянно сохраняли в нем после герметизации несущего стержня. При необходимости размораживания замороженные эмбрионы уравновешивали в размораживающем растворе I при 37°С в течение 3 минут, и затем последовательно уравновешивали в размораживающих растворах II-IV по 3 минуты в каждом. Затем размороженные эмбрионы культивировали в течение 2 часов, подсчитывали количество выживших эмбрионов и рассчитывали показатели выживаемости (см. Таблицу 2).Mouse embryos were first equilibrated in a freezing equilibration solution for 5 minutes, then placed in a cryopreservation solution prepared in accordance with the formulations indicated in the above examples and comparative examples for 50 seconds. The equilibrated embryos in the cryopreservation solution were introduced into a cryopreservation straw, then quickly immersed in liquid nitrogen (-196°C) and permanently kept in it after the carrier rod was sealed. If thawing was required, frozen embryos were equilibrated in thawing solution I at 37°C for 3 minutes, and then sequentially equilibrated in thawing solutions II-IV for 3 minutes each. The thawed embryos were then cultured for 2 hours, the number of surviving embryos was counted, and survival rates were calculated (see Table 2).
Приведенные выше данные говорят о том, что при применении предложенного криоконсервирующего раствора показатель выживаемости может быть не меньше 90% и даже составлять 100%, и скорость размораживания при криоконсервации может достигать или быть значительно выше, чем у промышленного серийного криоконсервирующего раствора, содержащего 15% ДМСО, который сейчас обычно применяется в клинической практике. Как можно видеть из сравнения варианта применения 1 (с включением 10% ДМСО), Сравнительного варианта реализации 2 (с включением 7,5% ДМСО) и Сравнительного варианта реализации 1 (с использованием промышленного серийного раствора для криоконсервации ооцитов, содержащего 15% ДМСО), показатель выживаемости ооцитов значительно повышается по мере добавления ПВС. Варианты применения 2-3 также показывают, что криоконсервирующий раствор может демонстрировать более высокие показатели выживаемости ооцитов или эмбрионов при добавлении небольших количеств ДМСО или вообще без добавления ДМСО, что позволяет решить одну из проблем промышленного криоконсервирующего раствора, обычно применяемого в клинической практике, связанную с высокой концентрацией ДМСО, приводящей к значительным повреждениям клеток. Кроме того, варианты применения 5 и 7-9 показывают, что повышенных показателей выживаемости ооцитов или эмбрионов можно добиваться и без добавления ДМСО и сыворотки в замораживающие растворы, уравновешивающие растворы и размораживающие растворы. Криоконсервирующий раствор, не содержащий ДМСО или не содержащий сыворотки, решает проблему короткого срока годности, опасности введения паразитарных биологических загрязнителей и т.п., связанной с сывороткой, содержащейся в промышленных серийных криоконсервирующих растворах, обычно применяемых в клинической практике в настоящее время.The above data indicate that when using the proposed cryopreservation solution, the survival rate can be at least 90% and even be 100%, and the defrosting rate during cryopreservation can reach or be significantly higher than that of an industrial serial cryopreservation solution containing 15% DMSO which is now commonly used in clinical practice. As can be seen from the comparison of Application 1 (incorporating 10% DMSO), Comparative Embodiment 2 (incorporating 7.5% DMSO), and Comparative Embodiment 1 (using a commercial commercial oocyte cryopreservation solution containing 15% DMSO), the oocyte survival rate increases significantly with the addition of PVA. Applications 2-3 also show that cryopreservation solution can demonstrate higher survival rates of oocytes or embryos with the addition of small amounts of DMSO or no addition of DMSO, which solves one of the problems of commercial cryopreservation solution commonly used in clinical practice, associated with high concentration of DMSO, leading to significant cell damage. In addition,
[Пример применения 2] Криоконсервация человеческих пуповинных мезенхимальных стволовых клеток[Application Example 2] Cryopreservation of human umbilical cord mesenchymal stem cells
Человеческие пуповинные мезенхимальные стволовые клетки подвергали криоконсервации с применением криоконсервирующих растворов, предложенных в приведенных выше примерах и сравнительных примерах, и согласно схеме, представленной в Таблице 3.Human umbilical cord mesenchymal stem cells were cryopreserved using the cryopreservation solutions provided in the above examples and comparative examples and according to the scheme presented in Table 3.
Криоконсервацию человеческих пуповинных мезенхимальных стволовых клеток проводили микрокапельным способом по следующей процедуре: расщепление человеческих пуповинных мезенхимальных стволовых клеток в чашке Петри с использованием 25% раствора панкреатина в течение 2 минут, помещение человеческих пуповинных мезенхимальных стволовых клеток после расщепления в культуральный раствор (10% FBS+культуральная среда а-МЕМ) того же объема, мягкое пипетирование до полного выпадения стволовых клеток, перенос клеток в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл для центрифугирования в течение 5 минут при 1000 об/мин, отбрасывание надосадочной жидкости (отделение клеток от культуральной среды), добавление 10 мкл замораживающего раствора в нижнюю часть центрифужной пробирки, мягкое пипетирование для диспергирования кластеров стволовых клетко, помещение 10 мкл замораживающего раствора со стволовыми клетками на предметное стекло для замораживания и криоконсервация раствора в жидком азоте (-196°С). При необходимости размораживания соломинку с клетками и замораживающим раствором помещают непосредственно в культуральную среду при 37°С для оттаивания. После размораживания клетки подкрашивают трипановым синим для определения показателей выживаемости, и количество клеток подсчитывают с использованием прибора JIMBIO-FIL. Показатель выживаемости представляет собой отношение числа живых клеток к общему числу имеющихся клеток (см. Таблицу 3).Cryopreservation of human umbilical cord mesenchymal stem cells was carried out by microdroplet method according to the following procedure: splitting of human cord mesenchymal stem cells in a Petri dish using 25% pancreatin solution for 2 minutes, placing human cord mesenchymal stem cells after splitting into a culture solution (10% FBS + culture a-MEM medium) of the same volume, gentle pipetting until complete shedding of stem cells, transfer of cells to a 1.5 ml centrifuge tube for centrifugation for 5 minutes at 1000 rpm, discarding the supernatant (separation of cells from the culture medium), adding 10 µl of freezing solution to the bottom of the centrifuge tube, gentle pipetting to disperse stem cell clusters, placing 10 µl of freezing solution with stem cells on a glass slide for freezing, and cryopreserving the solution in liquid nitrogen (-196°C). If thawing is required, the straw with cells and freezing solution is placed directly into the culture medium at 37° C. to thaw. After thawing, the cells are stained with trypan blue to determine survival rates, and the number of cells is counted using the JIMBIO-FIL instrument. The survival rate is the ratio of the number of living cells to the total number of available cells (see Table 3).
Когда раскрытый в данном документе криоконсервирующий раствор применяют для криоконсервации человеческих пуповинных мезенхимальных стволовых клеток, показатели выживаемости стволовых клеток могут достигать значений 92,4% и 72,2% (в вариантах применения 12 и 10, соответственно) даже без добавлений ДМСО. Кроме того, показатель выживаемости может составлять 77,1% даже без добавлений ДМСО и сыворотки, достигая уровня выживаемости уже известного замораживающего реагента. Это означает, что предлагаемый замораживающий реагент может при замораживании стволовых клеток обладать такой же эффективностью, что и традиционный замораживающий раствор, а скорость размораживания предложенного реагента при криоконсервации может достигать или даже быть значительно выше, чем у обычно применяемого сегодня криоконсервирующего раствора, содержащего 10% ДМСО (см. Сравнительный вариант реализации 7). Криоконсервирующий эффект при применении замораживающего раствора на основе ПВС значительно превосходит криоконсервирующий эффект, наблюдающийся без использования ПВС, как это можно видеть из Сравнительного варианта реализации 6.When the cryopreservation solution disclosed herein is used to cryopreserve human umbilical cord mesenchymal stem cells, stem cell survival rates can reach values of 92.4% and 72.2% (in
[Пример применения 3] Криоконсервация овариальных органов и овариальных тканей Овариальные органы новорожденных мышей возрастом до 3 дней и срезы овариальных тканей половозрелых мышей подвергали криоконсервации посредством замораживающих уравновешивающих растворов и криоконсервирующих растворов, предложенных в приведенных выше примерах и сравнительных примерах, и согласно схемам, представленным в Таблице 4 и Таблице 5.[Application Example 3] Cryopreservation of Ovarian Organs and Ovarian Tissues Ovarian organs of neonatal mice up to 3 days old and sections of ovarian tissues of adult mice were cryopreserved with the freezing equilibration solutions and the cryopreservation solutions proposed in the above examples and comparative examples, and according to the schemes presented in Table 4 and Table 5.
Цельные овариальные органы или срезы овариальных тканей сначала уравновешивали в уравновешивающем растворе при комнатной температуре в течение 25 минут, после чего помещали в приготовленный криоконсервирующий раствор на 15 минут. Затем цельные овариальные органы или срезы овариальных тканей помещали в криоконсервационную соломинку и погружали в жидкий азот для консервации. После размораживания цельные овариальные органы или срезы овариальных тканей помещали в культуральный раствор (10% FBS+а-МЕМ) в инкубаторе при 37°С в присутствии 5% СО2 на 2 часа для дальнейшего размораживания. Затем цельные овариальные органы или срезы овариальных тканей фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида, заливали в парафин и подвергали окрашиванию НЕ (гематоксилином и эозином), после чего анализировали их морфологию. Результаты показаны на ФИГ. 24-33, где ФИГ. 24 представляет собой снимок среза свежего, незамороженного овариального органа, а ФИГ. 29 представляет собой снимок среза свежей, незамороженной овариальной ткани.Whole ovarian organs or sections of ovarian tissues were first equilibrated in an equilibrating solution at room temperature for 25 minutes, after which they were placed in the prepared cryopreservation solution for 15 minutes. Then whole ovarian organs or sections of ovarian tissues were placed in a cryopreservation straw and immersed in liquid nitrogen for preservation. After thawing, whole ovarian organs or sections of ovarian tissues were placed in a culture solution (10% FBS+a-MEM) in an incubator at 37°C in the presence of 5% CO 2 for 2 hours for further thawing. Then, whole ovarian organs or sections of ovarian tissues were fixed in a 4% paraformaldehyde solution, embedded in paraffin, and stained with HE (hematoxylin and eosin), after which their morphology was analyzed. The results are shown in FIG. 24-33, where FIG. 24 is a sectional photograph of a fresh, unfrozen ovarian organ, and FIG. 29 is a sectional photograph of fresh, unfrozen ovarian tissue.
Как можно видеть из ФИГ. 24-28, по отношению к Сравнительному варианту реализации 8, где не применяли поливиниловый спирт, и свежим, незамороженным овариальным органам, схемы, предложенные в вариантах применения 13-15, отличаются следующим: исходная структура фолликул остается относительно нетронутой, интерстициальная структура остается относительно нетронутой, цитоплазма клеток относительно однородна и слегка окрашена в относительно небольшом количестве, а сокращения ядер и глубокое окрашивание относительно умеренны, кровеносные сосуды имеют нетронутую структуру стенок и минимальное сужение просвета, цитоплазма клеток эндотелия относительно однородна и слегка окрашена в относительно небольшом количестве, а сокращения ядер и глубокое окрашивание относительно умеренны. Как можно видеть, варианты применения 13-15 показывают лучшие эффекты при криоконсервации овариальных органов.As can be seen from FIG. 24-28, with respect to
Как можно видеть из ФИГ. 29-33, по отношению к Сравнительному варианту реализации 9 и свежим, незамороженным овариальным тканям, схемы, предложенные в вариантах применения 16-18, отличаются следующим: структура антральных фолликул остается относительно нетронутой, интерстициальная структура остается относительно нетронутой, цитоплазма клеток относительно однородна и слегка окрашена в относительно небольшом количестве, а сокращения ядер и глубокое окрашивание относительно умеренны. Можно видеть, что раскрытый в данном описании криоконсервирующий раствор показывает лучший эффект при криоконсервации овариальных тканей, чем криоконсервирующий раствор, традиционно принятый из уровня техники.As can be seen from FIG. 29-33, with respect to
Можно видеть, что раскрытый в данном описании криоконсервирующий раствор, приготовленный с применением биомиметического материала, подавляющего рост льда, на основе ПВС, в качестве основного компонента, оказывает хороший ингибирующий эффект на рост кристаллов льда, может быть приготовлен с уменьшенным содержанием ДМСО в системе консервации и даже без содержания ДМСО, поддерживает хорошую биологическую совместимость и может одновременно применяться для криоконсервации ооцитов, эмбрионов, стволовых клеток, репродуктивных органов и тканей, позволяя достигать высоких показателей выживаемости клеток и хорошей биологической активности.It can be seen that the cryopreservation solution disclosed herein, prepared using the biomimetic ice growth inhibiting material based on PVA as the main component, has a good inhibitory effect on the growth of ice crystals, can be prepared with a reduced content of DMSO in the preservation system and even without DMSO content, maintains good biocompatibility and can be simultaneously used for cryopreservation of oocytes, embryos, stem cells, reproductive organs and tissues, allowing to achieve high cell survival rates and good biological activity.
[Пример 11] Приготовление криоконсервирующего раствора, содержащего аминокислоты в качестве материала, подавляющего рост льда[Example 11] Preparation of a cryopreservation solution containing amino acids as an ice growth inhibiting material
Криоконсервирующий раствор G содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:Cryopreservation solution G contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления раствора (общий объем: 100 мл): Навески 16 г L-Arg и 8 г L-Thr растворяли в 25 мл буфера DPBS, и рН полученного раствора доводили до 6,9, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 17 г (0,05 моль) (конечная концентрация сахарозы в итоговом криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору последовательно добавляли 10 мл этиленгликоля и 10 мл ДМСО, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, рН полученного раствора корректировали до уровня 6,9, и его объем доводили до 80 мл буфером DPBS. Фетальную бычью сыворотку в объеме 20 мл хранили отдельно и добавляли в криоконсервирующий раствор перед его применением.Solution preparation procedure (total volume: 100 ml): 16 g L-Arg and 8 g L-Thr were dissolved in 25 ml DPBS buffer and the resulting solution was adjusted to pH 6.9 to give
Криоконсервирующий раствор Н содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:Cryopreservation solution H contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления раствора: Навеску 1,5 г поли-L-пролина (со степенью полимеризации равной 15) растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и рН полученного раствора доводили до 6,8, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 17 г (0,05 моль) растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору последовательно добавляли 10 мл этиленгликоля и 10 мл ДМСО, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, рН полученного раствора корректировали до уровня 7,0, и его объем доводили до 80 мл буфером DPBS. Сыворотку в объеме 20 мл хранили отдельно и добавляли в криоконсервирующий раствор перед его применением.Solution Preparation Procedure: A weighed portion of 1.5 g of poly-L-proline (degree of polymerization equal to 15) was dissolved by sonication in 25 ml of DPBS buffer and the pH of the resulting solution was adjusted to 6.8, resulting in
Криоконсервирующий раствор I содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:Cryopreservation solution I contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления раствора (в расчете на 100 мл раствора): Навеску 1,5 г поли-L-аргинина (со степенью полимеризации равной 8) растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и рН полученного раствора доводили до 7,0, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 17 г (0,05 моль) растворяли с помощью ультразвука в 20 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору последовательно добавляли 10 мл этиленгликоля и 10 мл ДМСО, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, рН полученного раствора корректировали до уровня 7,0, и его объем доводили до 80 мл буфером DPBS. Сыворотку в объеме 20 мл хранили отдельно и добавляли в криоконсервирующий раствор перед его применением.Solution preparation procedure (per 100 ml solution): A weighed portion of 1.5 g of poly-L-arginine (with a degree of polymerization equal to 8) was dissolved by ultrasound in 25 ml of DPBS buffer, and the pH of the resulting solution was adjusted to 7.0, in as a result,
Криоконсервирующий раствор J содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:Cryopreservation solution J contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления такая же, как и для криоконсервирующего раствора I.The preparation procedure is the same as for cryopreservation solution I.
Криоконсервирующий раствор K содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:Cryopreservation solution K contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления такая же, как и для криоконсервирующего раствора I.The preparation procedure is the same as for cryopreservation solution I.
Криоконсервирующий раствор L содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:Cryopreservation solution L contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления такая же, как и для криоконсервирующего раствора G.The preparation procedure is the same as for cryopreservation solution G.
Приготовление замораживающих уравновешивающих растворов: замораживающие уравновешивающие растворы готовили согласно приведенным ниже рецептурам.Preparation of freezing equilibration solutions: Freezing equilibration solutions were prepared according to the following recipes.
Замораживающий уравновешивающий раствор а: 7,5 мл этиленгликоля и 7,5 мл ДМСО добавляли к 65 мл буфера DPBS и перемешивали до однородности, а 20 мл сыворотки добавляли в замораживающий уравновешивающий раствор перед его применением.Freeze equilibration solution a: 7.5 ml of ethylene glycol and 7.5 ml of DMSO were added to 65 ml of DPBS buffer and mixed until homogeneous, and 20 ml of serum was added to the freezing equilibration solution before its use.
Замораживающий уравновешивающий раствор b: 7,5 мл этиленгликоля растворяли в 72,5 мл буфера DPBS и перемешивали до однородности, а 20 мл сыворотки добавляли в замораживающий уравновешивающий раствор перед его применением.Freeze equilibrate solution b: 7.5 ml of ethylene glycol was dissolved in 72.5 ml of DPBS buffer and mixed until homogeneous, and 20 ml of serum was added to the freeze equilibration solution before its use.
Сравнительный пример 2:Comparative example 2:
Замораживающий уравновешивающий раствор а содержит, в расчете на 1 мл, 7,5% (об/об) ДМСО, 7,5% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и остальной объем - буфер DPBS;Freezing equilibration solution a contains, per 1 ml, 7.5% (v/v) DMSO, 7.5% (v/v) ethylene glycol, 20% (v/v) fetal bovine serum and the remainder of the buffer DPBS ;
Криоконсервирующий раствор №1 содержит, в расчете на 1 мл, 15% (об/об) ДМСО, 15% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки, 0,5М сахарозы и остальной объем - буфер DPBS.Cryopreservation solution No. 1 contains, per 1 ml, 15% (v / v) DMSO, 15% (v / v) ethylene glycol, 20% (v / v) fetal bovine serum, 0.5 M sucrose and the rest of the volume - buffer DPBS.
Криоконсервирующий раствор №3 содержит, в расчете на 1 мл, 10% (об/об) ДМСО, 15% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и остальной объем - культуральная среда а-МЕМ (USA, Invitrogen, С12571500 ВТ).Cryopreservation solution No. 3 contains, per 1 ml, 10% (v/v) DMSO, 15% (v/v) fetal bovine serum and the rest of the culture medium a-MEM (USA, Invitrogen, C12571500 BT).
Размораживающие растворы, использовавшиеся в Примере 11 и Сравнительном примере 2, имели следующую рецептуру:The thawing solutions used in Example 11 and Comparative Example 2 were formulated as follows:
Размораживающий раствор №1 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS) и размораживающий раствор IV (содержащий 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS). [Пример применения 4] Криоконсервация ооцитов и эмбрионов
Ооциты и эмбрионы подвергали криоконсервации с применением замораживающих уравновешивающих растворов и криоконсервирующих растворов, предложенных в Примере 11 и Сравнительном примере 2, согласно схемам, представленным в Таблице 6 и Таблице 7. Способы замораживания и размораживания были те же, что и в примере применения 1.Oocytes and embryos were cryopreserved using the freezing equilibration solutions and cryopreservation solutions proposed in Example 11 and Comparative Example 2, according to the schemes presented in Table 6 and Table 7. The freezing and thawing methods were the same as in Application Example 1.
Как можно видеть из данных, представленных в Таблицах 6 и 7, при применении раскрытого в данном описании криоконсервирующего раствора для криоконсервации ооцитов и эмбрионов, после снижения содержания ДМСО и EG (этиленгликоля) показатель выживаемости ооцитов может достигать не менее 95%, а показатель выживаемости эмбрионов может достигать 100%. Скорость размораживания после криоконсервации для раскрытого в данном описании криоконсервирующего раствора может достигать или быть значительно выше, чем у промышленного серийного криоконсервирующего раствора, содержащего 15% ДМСО, который сейчас широко применяется в клинической практике (см. Сравнительные варианты реализации 10-11). Криоконсервирующий эффект при добавлении биомиметического аминокислотного материала, подавляющего рост льда, значительно превосходит криоконсервирующий эффект, наблюдающийся без добавления биомиметического аминокислотного материала, подавляющего рост льда.As can be seen from the data presented in Tables 6 and 7, when using the cryopreservation solution disclosed in this description for cryopreservation of oocytes and embryos, after reducing the content of DMSO and EG (ethylene glycol), the survival rate of oocytes can reach at least 95%, and the survival rate of embryos can reach 100%. The thawing rate after cryopreservation for the cryopreservation solution disclosed herein can reach or be significantly higher than commercial commercial cryopreservation solution containing 15% DMSO, which is now widely used in clinical practice (see Comparative Embodiments 10-11). The cryopreservative effect with the addition of the biomimetic amino acid material that inhibits ice growth is significantly superior to the cryopreservative effect observed without the addition of the biomimetic amino acid material that inhibits ice growth.
[Пример применения 5] Криоконсервация человеческих пуповинных мезенхимальных стволовых клеток[Application Example 5] Cryopreservation of human umbilical cord mesenchymal stem cells
Человеческие пуповинные мезенхимальные стволовые клетки подвергали криоконсервации с применением криоконсервирующих растворов, предложенных в Примере 11 и Сравнительном примере 2, согласно схеме, представленной в Таблице 8. Способы замораживания и размораживания были те же, что и в примере применения 2.Human umbilical cord mesenchymal stem cells were cryopreserved using the cryopreservation solutions provided in Example 11 and Comparative Example 2 according to the scheme shown in Table 8. The freezing and thawing methods were the same as in Application Example 2.
Когда раскрытый в данном документе криоконсервирующий раствор применяют для криоконсервации человеческих пуповинных мезенхимальных стволовых клеток, показатели выживаемости стволовых клеток могут достигать значений не менее 80% при добавлении лишь небольших количеств ДМСО (7,5%) или даже без добавления ДМСО (например, как в вариантах применения 23-25). Это означает, что предлагаемый замораживающий реагент при замораживании стволовых клеток может не только обладать такой же эффективностью, что и традиционный замораживающий раствор, но и показывать скорость размораживания при криоконсервации значительно более высокую, чем у обычно применяемого сегодня криоконсервирующего раствора, содержащего 10% ДМСО (см. Сравнительный вариант реализации 13). Криоконсервирующий эффект при добавлении биомиметического аминокислотного материала, подавляющего рост льда, значительно превосходит криоконсервирующий эффект, наблюдающийся без добавления биомиметического аминокислотного материала, подавляющего рост льда (см. Сравнительные варианты реализации 14 и 15).When the cryopreservation solution disclosed herein is used for cryopreservation of human umbilical cord mesenchymal stem cells, stem cell survival rates can reach values of at least 80% with the addition of only small amounts of DMSO (7.5%) or even without the addition of DMSO (for example, as in embodiments applications 23-25). This means that the proposed freezing reagent for stem cell freezing can not only have the same efficiency as a traditional freezing solution, but also show a thawing rate during cryopreservation significantly higher than that of a cryopreservation solution commonly used today containing 10% DMSO (see Comparative implementation 13). The cryopreservative effect with the addition of the ice growth inhibiting biomimetic amino acid material is significantly superior to the cryopreservation effect observed without the addition of the ice growth inhibiting biomimetic amino acid material (see
[Пример применения 6] Криоконсервация овариальных органов и овариальных тканей[Application Example 6] Cryopreservation of Ovarian Organs and Ovarian Tissues
Овариальные органы новорожденных мышей возрастом до 3 дней и срезы овариальных тканей половозрелых мышей подвергали криоконсервации с применением замораживающих уравновешивающих растворов и криоконсервирующих растворов, предложенных в Примере 11 и Сравнительном примере 2, согласно схемам, представленным в Таблице 9 и Таблице 10. Способы замораживания и размораживания овариальных органов и овариальных тканей половозрелых мышей представлены в примере применения 3.Ovarian organs of newborn mice up to 3 days old and sections of ovarian tissues of mature mice were subjected to cryopreservation using freezing equilibrating solutions and cryopreserving solutions proposed in Example 11 and Comparative Example 2, according to the schemes presented in Table 9 and Table 10. Methods for freezing and thawing ovarian organs and ovarian tissues of mature mice are presented in Application Example 3.
[Пример 11] Приготовление криоконсервирующего раствора, содержащего пептидное соединение в качестве материала, подавляющего рост льда Криоконсервирующий раствор М содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:[Example 11] Preparation of a cryopreservation solution containing a peptide compound as an ice growth inhibiting material The cryopreservation solution M contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления раствора (в расчете на 100 мл раствора): Навеску 28 г TR растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и рН полученного раствора доводили до 7,0, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 0,05 моль растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору последовательно добавляли 10 мл этиленгликоля и 7,5 мл ДМСО, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, корректировали рН полученного раствора, и его объем доводили до 80 мл буфером DPBS. Сыворотку в объеме 20 мл добавляли в криоконсервирующий раствор перед его применением.Solution preparation procedure (based on 100 ml solution): A 28 g sample of TR was dissolved by sonication in 25 ml of DPBS buffer and the pH of the resulting solution was adjusted to 7.0, resulting in
Криоконсервирующий раствор N содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:Cryopreservation solution N contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления раствора (в расчете на 100 мл раствора): Навеску 28 г ТРТ растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и рН полученного раствора доводили до 7,0, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 0,05 моль растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору последовательно добавляли 10 мл этиленгликоля и 7,5 мл ДМСО, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, корректировали рН полученного раствора, и его объем доводили до 80 мл буфером DPBS. Сыворотку в объеме 20 мл добавляли в криоконсервирующий раствор перед его применением.Solution preparation procedure (per 100 ml solution): A 28 g portion of TPT was dissolved by sonication in 25 ml of DPBS buffer and the resulting solution was adjusted to pH 7.0 to give
Криоконсервирующий раствор О содержит следующие компоненты в расчете на 100 мл раствора:Cryopreservation solution O contains the following components per 100 ml of solution:
Процедура приготовления раствора (в расчете на 100 мл раствора): Навеску 28 г TR растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и рН полученного раствора доводили до 7,0, в результате чего получали Раствор 1. Навеску сахарозы 0,05 моль растворяли с помощью ультразвука в 25 мл буфера DPBS, и после полного растворения сахарозы к полученному раствору последовательно добавляли 10 мл этиленгликоля, в результате чего получали Раствор 2. После достижения комнатной температуры Раствор 1 и Раствор 2 смешивали до однородности, корректировали рН полученного раствора, и его объем доводили до 80 мл буфером DPBS. Сыворотку в объеме 20 мл хранили добавляли в криоконсервирующий раствор перед его применением.Solution preparation procedure (based on 100 ml solution): A 28 g sample of TR was dissolved by sonication in 25 ml of DPBS buffer and the pH of the resulting solution was adjusted to 7.0, resulting in
Приготовление замораживающих уравновешивающих растворов: замораживающие уравновешивающие растворы готовили согласно приведенным ниже рецептурам.Preparation of freezing equilibration solutions: Freezing equilibration solutions were prepared according to the following recipes.
Замораживающий уравновешивающий раствор а: 7,5 мл этиленгликоля и 7,5 мл ДМСО добавляли к 65 мл буфера DPBS и перемешивали до однородности, а 20 мл сыворотки добавляли в замораживающий уравновешивающий раствор перед его применением.Freeze equilibration solution a: 7.5 ml of ethylene glycol and 7.5 ml of DMSO were added to 65 ml of DPBS buffer and mixed until homogeneous, and 20 ml of serum was added to the freezing equilibration solution before its use.
Сравнительный пример 3:Comparative example 3:
Замораживающий уравновешивающий раствор а содержит, в расчете на 1 мл, 7,5% (об/об) ДМСО, 7,5% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и остальной объем - буфер DPBS;Freezing equilibration solution a contains, per 1 ml, 7.5% (v/v) DMSO, 7.5% (v/v) ethylene glycol, 20% (v/v) fetal bovine serum and the remainder of the buffer DPBS ;
Криоконсервирующий раствор №1 содержит, в расчете на 1 мл, 15% (об/об) ДМСО, 15% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки, 0,5М сахарозы и остальной объем - буфер DPBS.Cryopreservation solution No. 1 contains, per 1 ml, 15% (v / v) DMSO, 15% (v / v) ethylene glycol, 20% (v / v) fetal bovine serum, 0.5 M sucrose and the rest of the volume - buffer DPBS.
Криоконсервирующий раствор №3 содержит, в расчете на 1 мл, 10% (об/об) ДМСО, 15% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и остальной объем - культуральная среда а-МЕМ (USA, Invitrogen, С12571500 ВТ).Cryopreservation solution No. 3 contains, per 1 ml, 10% (v/v) DMSO, 15% (v/v) fetal bovine serum and the rest of the culture medium a-MEM (USA, Invitrogen, C12571500 BT).
Размораживающие растворы, применявшиеся в Примере 12 и Сравнительном примере 3, имели следующую рецептуру:The thawing solutions used in Example 12 and Comparative Example 3 were formulated as follows:
Размораживающий раствор №1 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS) и размораживающий раствор IV (содержащий 20% сыворотки и остальной объем - буфер DPBS).
[Пример применения 7] Криоконсервация ооцитов и эмбрионов[Application Case 7] Cryopreservation of Oocytes and Embryos
Ооциты и эмбрионы подвергали криоконсервации с применением замораживающих уравновешивающих растворов и криоконсервирующих растворов, предложенных в Примере 13 и Сравнительном примере 3, согласно схемам, представленным в Таблице 11 и Таблице 12. Способы замораживания и размораживания были те же, что и в примере применения 1.Oocytes and embryos were cryopreserved using the freezing equilibration solutions and cryopreservation solutions proposed in Example 13 and Comparative Example 3 according to the schemes shown in Table 11 and Table 12. The freezing and thawing methods were the same as in Application Example 1.
Как можно видеть из данных, представленных в Таблицах 11 и 12, раскрытые в данном описании полипептиды можно применять для криоконсервации ооцитов и эмбрионов, и при этом показатели выживаемости ооцитов и эмбрионов могут достигать уровней, характерных для промышленного серийного криоконсервирующего раствора (содержащего 15% ДМСО), путем добавления гораздо меньшего количества ДМСО (7,5%). Данные, полученные в вариантах применения 32 и 34, показывают, что полипептиды TR оказывают более выраженный криоконсервирующий эффект на ооциты и эмбрионы.As can be seen from the data presented in Tables 11 and 12, the polypeptides disclosed herein can be used for cryopreservation of oocytes and embryos, and the survival rates of oocytes and embryos can reach levels characteristic of commercial commercial cryopreservation solution (containing 15% DMSO) , by adding a much smaller amount of DMSO (7.5%). The data obtained in applications 32 and 34 show that TR polypeptides have a more pronounced cryopreservative effect on oocytes and embryos.
[Пример применения 8] Криоконсервация человеческих пуповинных мезенхимальных стволовых клеток[Application Example 8] Cryopreservation of human umbilical cord mesenchymal stem cells
Человеческие пуповинные мезенхимальные стволовые клетки подвергали криоконсервации с применением криоконсервирующих растворов, предложенных в Примере 12 и Сравнительном примере 3, согласно схеме, представленной в Таблице 13. Способы замораживания и размораживания были те же, что и в примере применения 2.Human umbilical cord mesenchymal stem cells were cryopreserved using the cryopreservation solutions provided in Example 12 and Comparative Example 3 according to the scheme shown in Table 13. Freezing and thawing methods were the same as in Application Example 2.
Как можно видеть из результатов, представленных в Таблице 13, раскрытый в данном документе криоконсервирующий раствор, не содержащий ДМСО или содержащий лишь небольшое количество ДМСО (7,5%), может иметь показатели выживаемости клеток, сравнимые с показателями, характерными для промышленного серийного криоконсервирующего раствора (содержащего 10% ДМСО), известного из уровня техники. Таким образом, значительно уменьшается количество ДМСО, т.е. снижается вероятность повреждения и токсического поражения клеток этим реагентом, а устойчивость к замораживанию-размораживанию и активность стволовых клеток после криоконсервации может быть значительно повышена.As can be seen from the results presented in Table 13, the cryopreservation solution disclosed herein containing no DMSO or containing only a small amount of DMSO (7.5%) can have cell survival rates comparable to those of commercial commercial cryopreservation solution. (containing 10% DMSO), known from the prior art. Thus, the amount of DMSO is significantly reduced, i.e. the probability of damage and toxic damage to cells by this reagent is reduced, and the resistance to freezing-thawing and the activity of stem cells after cryopreservation can be significantly increased.
[Пример применения 9] Криоконсервация овариальных органов и овариальных тканей[Application Example 9] Cryopreservation of Ovarian Organs and Ovarian Tissues
Овариальные органы новорожденных мышей возрастом до 3 дней и срезы овариальных тканей половозрелых мышей подвергали криоконсервации с применением замораживающих уравновешивающих растворов и криоконсервирующих растворов, предложенных в Примере 12 и Сравнительном примере 3, согласно схемам, представленным в Таблице 14 и Таблице 15. Способы замораживания-размораживания овариальных органов и овариальных тканей половозрелых мышей представлены в примере применения 3.Ovarian organs of newborn mice up to 3 days old and sections of ovarian tissues of mature mice were subjected to cryopreservation using freezing equilibrating solutions and cryopreserving solutions proposed in Example 12 and Comparative Example 3, according to the schemes presented in Table 14 and Table 15. organs and ovarian tissues of mature mice are presented in Application Example 3.
Как можно видеть из ФИГ. 24, 25 и 40 по отношению к сравнительным вариантам реализации, где не применяли биомиметический пептидный материал, подавляющий рост льда (ФИГ. 25 и 30), снимок среза размороженного овариального органа, подвергнутого криоконсервации в криоконсервирующем растворе согласно варианту применения 37, показывает, что исходная структура фолликул остается относительно нетронутой, интерстициальная структура остается относительно нетронутой, цитоплазма клеток относительно однородна и слегка окрашена в относительно небольшом количестве, а сокращения ядер и глубокое окрашивание относительно умеренны, кровеносные сосуды имеют нетронутую структуру стенок и минимальное сужение просвета, цитоплазма клеток эндотелия относительно однородна и слегка окрашена в относительно небольшом количестве, а сокращения ядер и глубокое окрашивание относительно умеренны. Таким образом, вариант применения 37 показывают лучшие эффекты при криоконсервации овариальных органов.As can be seen from FIG. 24, 25 and 40, with respect to comparative embodiments where no biomimetic ice growth inhibiting peptide material was used (FIGS. 25 and 30), a sectional image of a thawed ovarian organ cryopreserved in the cryopreservation solution of application 37 shows that the original the structure of the follicles remains relatively intact, the interstitial structure remains relatively intact, the cytoplasm of the cells is relatively uniform and slightly stained in a relatively small amount, and the contractions of the nuclei and deep staining are relatively moderate, the blood vessels have an intact wall structure and minimal narrowing of the lumen, the cytoplasm of the endothelial cells is relatively uniform and lightly stained in relatively small amounts, and nuclear contractions and deep staining are relatively moderate. Thus, application 37 shows the best effects in cryopreservation of ovarian organs.
Как можно видеть из ФИГ. 29, 30 и 41, по сравнению со свежими, незамороженными овариальными тканями половозрелых мышей, рассмотренными в Сравнительном варианте реализации 22, схема, предложенная в варианте применения 38, отличаются следующим: структуры фолликул в фазе роста и антральных фолликул остается относительно нетронутой. Можно видеть, что раскрытый в данном описании криоконсервирующий раствор показывает лучший эффект при криоконсервации овариальных тканей, чем криоконсервирующий раствор, традиционно принятый из уровня техники.As can be seen from FIG. 29, 30 and 41, compared to the fresh, non-frozen ovarian tissues of adult mice discussed in
Можно видеть, что раскрытый в данном описании криоконсервирующий раствор, приготовленный с применением биомиметического пептидного материала, подавляющего рост льда, может одновременно применяться для криоконсервации ооцитов, эмбрионов, стволовых клеток, репродуктивных органов и тканей, позволяя достигать высоких показателей выживаемости клеток и хорошей биологической активности.It can be seen that the cryopreservation solution disclosed herein, prepared using a biomimetic peptide material that inhibits the growth of ice, can be simultaneously used for cryopreservation of oocytes, embryos, stem cells, reproductive organs and tissues, allowing high cell survival rates and good biological activity to be achieved.
Выше приведены некоторые примеры реализации настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается вышеприведенными вариантами воплощениями. Любые модификации, улучшения, аналоги и т.п., сделанные без отступления от существа и объема настоящего изобретения, безусловно подпадают под действие правовой охраны настоящего изобретения.The above are some examples of implementation of the present invention. However, the present invention is not limited to the above embodiments. Any modifications, improvements, analogues, etc., made without departing from the essence and scope of the present invention, are unconditionally subject to the legal protection of the present invention.
Claims (85)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910282418.9 | 2019-04-09 | ||
| CN201910281986.7 | 2019-04-09 | ||
| CN201910282416.X | 2019-04-09 | ||
| CN201910282422.5 | 2019-04-09 | ||
| CN201910282417.4 | 2019-04-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787934C1 true RU2787934C1 (en) | 2023-01-13 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2303631C1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Транс-Технологии" | Method for production of mesenchymal stem cells and biotransplant using the same |
| CN104839144A (en) * | 2015-04-30 | 2015-08-19 | 北京大学第三医院 | Vitrification freezing fluid of oocytes |
| RU2014113706A (en) * | 2011-10-07 | 2015-11-20 | Юниверсити Оф Уорик | APPLICATION OF SYNTHETIC JANUS PARTICLES TO PREVENT OR REDUCE CRYSTAL GROWTH |
| CN107183008A (en) * | 2017-05-27 | 2017-09-22 | 魏方萌 | A kind of placenta mesenchyma stem cell frozen stock solution and its cryopreservation methods |
| CN109497044A (en) * | 2018-12-28 | 2019-03-22 | 深圳市昱杰生物科技有限公司 | A kind of Mammalian Embryo frozen stock solution and cryopreservation methods |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2303631C1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Транс-Технологии" | Method for production of mesenchymal stem cells and biotransplant using the same |
| RU2014113706A (en) * | 2011-10-07 | 2015-11-20 | Юниверсити Оф Уорик | APPLICATION OF SYNTHETIC JANUS PARTICLES TO PREVENT OR REDUCE CRYSTAL GROWTH |
| CN104839144A (en) * | 2015-04-30 | 2015-08-19 | 北京大学第三医院 | Vitrification freezing fluid of oocytes |
| CN107183008A (en) * | 2017-05-27 | 2017-09-22 | 魏方萌 | A kind of placenta mesenchyma stem cell frozen stock solution and its cryopreservation methods |
| CN109497044A (en) * | 2018-12-28 | 2019-03-22 | 深圳市昱杰生物科技有限公司 | A kind of Mammalian Embryo frozen stock solution and cryopreservation methods |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qin et al. | Bioinspired l-proline oligomers for the cryopreservation of oocytes via controlling ice growth | |
| DK2804475T3 (en) | Cryopreservation of Cells, Tissues and Organs | |
| Deller et al. | Ice recrystallisation inhibition by polyols: comparison of molecular and macromolecular inhibitors and role of hydrophobic units | |
| EP2605644B1 (en) | Method of forming vitrification droplets | |
| Diaz-Dussan et al. | Trehalose-based polyethers for cryopreservation and three-dimensional cell scaffolds | |
| JP2022528772A (en) | DMSO-free cryopreservation solution and its preparation method and application | |
| RU2787934C1 (en) | Biomimetic material suppressing ice growth and cryopreserving solution containing this material | |
| CN111793111A (en) | Application of cryopreservation liquid containing peptide compounds in stem cell cryopreservation | |
| AU2020256938B2 (en) | Biomimetic ice-inhibiting material and cryopreservation liquid containing same | |
| KR101954120B1 (en) | Composition for cryopreservation of stem cells having improved cryopreservation effect and method using the same | |
| JP2022131878A (en) | Method for producing frozen kidney cells and frozen kidney cells | |
| Ali et al. | Development of vitrification solutions | |
| Deleray et al. | Synthetic antifreeze glycoproteins with potent ice-binding activity | |
| CN115152746A (en) | New application of all-methyl cyclodextrin | |
| WO2020207152A1 (en) | Serum-free cryopreservation solution and preparation method and application thereof | |
| CN111226909B (en) | Vitrification thawing solution and thawing method for ovum and cleavage stage embryo | |
| Flynn | CD95 and the MRL-lpr Mouse Model | |
| RU2785227C1 (en) | Cryopreserving solution not containing dmso and its production method and use | |
| CN111790327B (en) | Molecular design method of ice control material | |
| Dissanayake et al. | Enhanced Cryopreservation Efficacies of Ice Recrystallization Inhibiting Nanogels | |
| Janabi | Investigating Small Amine Molecules as Ice Recrystallization Inhibitors | |
| CN115251038A (en) | Cryopreservation liquid containing silk fibroin and application and controlled freezing storage method thereof | |
| CN117958253A (en) | Application of limonin, inositol and/or L-proline in pig semen cryopreservation | |
| WO2023122672A1 (en) | Cryopreservation compositions and methods using red blood cells | |
| CN110004107A (en) | The method that a kind of pretreatment of cell surface and cell directional thaw |