RU2787724C1 - Set of recombinant plasmid dna for obtaining recombinant viruses sendai strain moscow (options) - Google Patents
Set of recombinant plasmid dna for obtaining recombinant viruses sendai strain moscow (options) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787724C1 RU2787724C1 RU2021136460A RU2021136460A RU2787724C1 RU 2787724 C1 RU2787724 C1 RU 2787724C1 RU 2021136460 A RU2021136460 A RU 2021136460A RU 2021136460 A RU2021136460 A RU 2021136460A RU 2787724 C1 RU2787724 C1 RU 2787724C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- sendai virus
- plasmid
- moscow
- strain
- Prior art date
Links
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 75
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title abstract description 26
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims abstract description 137
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 27
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 21
- 229920000401 Three prime untranslated region Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 101710016786 P/C Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 229920002033 ribozyme Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101700021643 VP4A Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims abstract description 6
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 claims description 22
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 claims description 22
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 18
- 230000002068 genetic Effects 0.000 claims description 18
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 17
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 claims description 7
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 229920001320 Leader sequence (mRNA) Polymers 0.000 claims description 5
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 abstract description 27
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 abstract description 10
- 108091005938 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 abstract description 10
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000003612 virological Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 abstract description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 4
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 abstract description 4
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 101700078745 LEAF Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 33
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 28
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 9
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000000174 oncolytic Effects 0.000 description 7
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 5
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 4
- 101700002316 HN Proteins 0.000 description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000002601 intratumoral Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 4
- 102000033243 CDKN2A Human genes 0.000 description 3
- 101710022338 CDKN2A Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 229920001941 Hammerhead ribozyme Polymers 0.000 description 3
- 206010025650 Malignant melanoma Diseases 0.000 description 3
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 3
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108010003152 bacteriophage T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 108090001102 hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 2
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 2
- 241000726041 Human respirovirus 1 Species 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon beta Proteins 0.000 description 2
- 229960001388 Interferon-beta Drugs 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 101700013618 OCA2 Proteins 0.000 description 2
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 2
- 108010019761 Sendai virus P protein Proteins 0.000 description 2
- 206010041823 Squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000009030 carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic Effects 0.000 description 2
- 102000008187 gag Gene Products Human genes 0.000 description 2
- 108010060555 gag Gene Products Proteins 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000000316 virotherapy Methods 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N ADRIAMYCIN Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100009641 CXCL10 Human genes 0.000 description 1
- 101710032181 CXCL10 Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960004679 Doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 102000033180 ERVK-6 Human genes 0.000 description 1
- 101710038044 ERVK-6 Proteins 0.000 description 1
- 101710027967 ERVW-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108060003023 F Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 101700054771 GCA Proteins 0.000 description 1
- 208000005721 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 Hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003630 Histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 1
- 210000002751 Lymph Anatomy 0.000 description 1
- 101700061402 MTRX Proteins 0.000 description 1
- 210000000138 Mast Cells Anatomy 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108009000330 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 210000004693 NK cell Anatomy 0.000 description 1
- 101700062818 NP Proteins 0.000 description 1
- 229940100662 Nasal Drops Drugs 0.000 description 1
- 108010061543 Neutralizing Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 102000004873 Nucleocapsid Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100016028 OCA2 Human genes 0.000 description 1
- 101710040922 Os08g0547100 Proteins 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 241001113283 Respirovirus Species 0.000 description 1
- 101710042981 SHMT1 Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101710023234 Segment 5 Proteins 0.000 description 1
- 101710017884 Segment-8 Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000144282 Sigmodon Species 0.000 description 1
- 241000144290 Sigmodon hispidus Species 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000003932 Urinary Bladder Anatomy 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005626 Viral Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010059722 Viral Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 201000003963 colon carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000001586 eradicative Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 201000008808 fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative Effects 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 201000001820 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 101710026800 lyc Proteins 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 230000017156 mRNA modification Effects 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 101700045377 mvp1 Proteins 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 230000000771 oncological Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003319 supportive Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к вариантам рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащим полноразмерную ДНК-копию генома вируса Сендай и гены структурных белков нуклеокапсида N, Р и вирусной полимеразы L, и может быть использовано в биотехнологии, в частности, в генетической инженерии для конструирования рекомбинантных вариантов вируса Сендай штамма Москва, содержащих встройки трансгенов противоопухолевых белков или протективно-значимых антигенов патогенных агентов, с целью разработки на их основе противоопухолевых лекарственных средств и векторных вакцин против инфекционных заболеваний.The invention relates to recombinant plasmid DNA variants containing a full-length DNA copy of the Sendai virus genome and the genes for the structural proteins of the N, P nucleocapsid and viral polymerase L, and can be used in biotechnology, in particular, in genetic engineering for constructing recombinant variants of the Sendai virus of the Moscow strain containing inserts of transgenes of antitumor proteins or protectively significant antigens of pathogenic agents in order to develop antitumor drugs and vector vaccines against infectious diseases on their basis.
Вирус Сендай, также известный как вирус парагриппа мышей 1 типа, или гемагглютинирующий японский вирус, принадлежит к роду Respirovirus семейства Paramyxoviridae. Геном вируса представлен минус цепью РНК длиной 15384 нуклеотида и содержит шесть генов, кодирующих белки [Beaty, 2017; Zainutdinov, 2016] [1, 2]. Из них два гена кодируют поверхностные гликопротеины HN (гемагглютинин-нейраминидаза) и F (белок слияния), три кодируют нуклеокапсидные белки N (нуклеопротеин), Р (фосфопротеин) и L (полимераза), и один - негликозилированный внутренний матриксный белок М. Вирус Сендай вызывает легко передающуюся инфекцию дыхательных путей у мышей, хомяков, морских свинок, крыс и иногда - у свиней. Вирус Сендай способен распространяться как воздушно-капельным путем, так и при непосредственном контакте. Его можно обнаружить в колониях мышей по всему миру, но считается, что он непатогенен для людей [Matveeva, 2015] [3]. Очевидная безопасность вируса и многообещающие данные доклинических и начальных клинических исследований свидетельствуют, что вирус Сендай является перспективным кандидатом для создания на его основе векторных вакцин и противоопухолевых препаратов [Russell, 2021; Matveeva, 2015] [4, 3].Sendai virus, also known as murine parainfluenza
В мировой практике вакцинные и противораковые свойства вируса Сендай исследуются уже более 20 лет. Живой немодифицированный вирус Сендай использовали в виде капель в нос взрослым и детям для оценки иммуногенности по отношению к вирусу человеческого парагриппа 1-го типа. Результаты первой фазы клинических испытаний показали, что вирус Сендай не вызывал существенных побочных эффектов ни у взрослых, ни у детей, но эффективно индуцировал перекрестный иммунный ответ против вируса парагриппа человека 1-го типа [Adderson, 2015] [5]. Также первую фазу клинических испытаний успешно прошла вакцина SeVRSV, которая представляет собой рекомбинантный вирус Сендай, несущий встройку трансгена белка слияния респираторно-синцитиального вируса человека [Huang, 2021] [6]. Это фактически дивакцина, которая защищает против парагриппа человека I типа за счет векторной составляющей (вирус Сендай) и против респираторно-синцитиального вируса человека за счет экспрессии трансгена протективно-значимого белка слияния этого вируса. Исследование, проведенное на взрослом контингенте, показало безопасность и иммуногенность вакцины SeVRSV. Результаты стимулируют дальнейшие исследования SeVRSV в группах детей, которые наиболее часто подвержены инфекциям - мишеням данной вакцины.In world practice, the vaccine and anticancer properties of the Sendai virus have been studied for more than 20 years. Live unmodified Sendai virus was used as nasal drops in adults and children to assess immunogenicity against
Разработка векторной вакцины против ВИЧ-инфекции на основе вируса Сендай, находится на втором этапе клинических испытаний. Эта вакцина представляет собой рекомбинантный вирус Сендай, экспрессирующий трансген gag-белка ВИЧ-1. У людей она вызывает мощную индукцию Т-клеточного ответа и продукцию специфических нейтрализующих антител к белку gag в режиме прайм-буст [Nyombayire, 2017] [7].The development of a vector vaccine against HIV infection based on the Sendai virus is at the second stage of clinical trials. This vaccine is a recombinant Sendai virus that expresses the HIV-1 gag protein transgene. In humans, it causes a powerful induction of a T-cell response and the production of specific neutralizing antibodies to the gag protein in a prime-boost mode [Nyombayire, 2017] [7].
Успешно прошла доклинические исследования интраназальная вакцина на основе рекомбинантного вируса Сендай SeV-MPV-Ft, который несет встройку трансгена усеченного белка слияния F метапневмовируса человека (hMPV). Инфекции, вызванные hMPV, представляют серьезный риск для здоровья детей раннего возраста, особенно в случае преждевременных родов. Лицензированной вакцины не существует, и нет стандартного лечения инфекций hMPV кроме поддерживающей терапии. Вакцина SeV-MPV-Ft индуцирует образование вируснейтрализующих антител и 100%-ную защиту от заражения hMPV в чувствительной модели хлопковых крыс [Russell, 2017] [8].An intranasal vaccine based on the recombinant Sendai virus SeV-MPV-Ft, which carries the transgene of the truncated fusion protein F of the human metapneumovirus (hMPV), has successfully passed preclinical studies. hMPV infections pose a serious health risk to young children, especially in preterm births. There is no licensed vaccine, and there is no standard treatment for hMPV infections other than supportive care. The SeV-MPV-Ft vaccine induces the formation of virus-neutralizing antibodies and 100% protection against hMPV infection in a sensitive cotton rat model [Russell, 2017] [8].
Таким образом, вирус Сендай является перспективным вектором для создания вакцин, особенно для респираторных вирусных инфекций. Его основным преимуществом по сравнению с другими векторными кандидатами является способность, не вызывая заболевания, реплицироваться в клетках бронхиального эпителия человека, а также в некоторых категориях дендритных клеток. Рекомбинантный вирус Сендай способен доставить и в клетки бронхиального эпителия человека, и в его дендритные клетки как чужеродные вирусные антигены, так и продукт своего репликационного цикла, а именно двухцепочечную РНК, которая является мощным патоген-ассоциированным паттерном, индуцирующим иммунную реакцию организма [Зайчук, 2020] [9].Thus, the Sendai virus is a promising vector for creating vaccines, especially for respiratory viral infections. Its main advantage over other vector candidates is its ability to replicate without causing disease in human bronchial epithelial cells, as well as in certain categories of dendritic cells. The recombinant Sendai virus is able to deliver both foreign viral antigens and the product of its replication cycle, namely double-stranded RNA, which is a powerful pathogen-associated pattern that induces the body's immune response, both into human bronchial epithelial cells and its dendritic cells [Zaichuk, 2020 ] [nine].
В ряде работ было показано, что вирус Сендай, как природные штаммы, так и рекомбинантные варианты, может интенсивно распространяться в опухолевых клетках и уничтожать их, не затрагивая окружающие их нормальные клетки [Matveeva, 2015; Zimmermann, 2014] [10, 11]. Такое действие вируса часто приводит к ингибированию роста опухолей у модельных животных. Среди протестированных ксенотрансплантационных моделей опухолей человека были клетки фибросаркомы, панкреатической эпителиоидной карциномы и клетки рака толстой кишки [Kinoh, 2004] [12]. Также на мышиных моделях с применением рекомбинантного вируса Сендай, экспрессирующего трансген интерлейкина-2, было продемонстрировано существенное подавление роста опухоли, и даже полное рассасывание сформировавшихся опухолей мозга [Iwadate, 2005] [13]. Сходные результаты были получены с рекомбинантным вирусом Сендай, содержащим встройку трансгена интерферона-бета, в случае ксенотрансплантации мышам клеток саркомы и рака простаты человека [Kinoh, 2008; Tatsuta, 2009] [14, 15]. На крысиных ксенотрансплантационных моделях было показано, что рекомбинантный вирус Сендай с высокой эффективностью уничтожает человеческие опухоли меланомы, гепатоцеллюлярного рака, нейробластомы, плоскоклеточного рака и рака простаты [Yonemitsu, 2008] [16]. Противоопухолевая эффективность вируса Сендай была продемонстрирована на сингенных мышиных моделях [Tanaka, 2019] [17], причем было показано, что даже после УФО-инактивации препараты вируса Сендай эффективны против карциномы толстой кишки [Kurooka, 2007; Kawano, 2007] [18, 19], мочевого пузыря [Kawano, 2008] [20] и карцином почки [Fujihara, 2008] [21]. Эффективность УФО-инактивированного вируса Сендай была также показана на мышиной ксенотрансплантационной модели человеческого рака простаты [Hui, 2014] [22]. Во всех указанных исследованиях вирус Сендай приводил к полной регрессии опухолей или к серьезному подавлению их роста. Препарат УФО-инактивированного вируса Сендай прошел также I/IIa фазу клинических испытаний при внутриопухолевом введении пациентам с прогрессирующей меланомой стадии IIIC или IV с метастазами в коже или лимфе. Полные или частичные ответы наблюдались примерно в половине леченных случаев [Kiyohara, 2020] [23].A number of studies have shown that the Sendai virus, both natural strains and recombinant variants, can intensively spread in tumor cells and destroy them without affecting the surrounding normal cells [Matveeva, 2015; Zimmermann, 2014] [10, 11]. This action of the virus often leads to inhibition of tumor growth in model animals. Among the xenotransplantation human tumor models tested were fibrosarcoma, pancreatic epithelioid carcinoma, and colon cancer cells [Kinoh, 2004] [12]. Also, in mouse models using the recombinant Sendai virus expressing the interleukin-2 transgene, a significant suppression of tumor growth was demonstrated, and even complete resorption of formed brain tumors [Iwadate, 2005] [13]. Similar results were obtained with a recombinant Sendai virus containing an insertion of the interferon-beta transgene in the case of xenotransplantation of human sarcoma and prostate cancer cells into mice [Kinoh, 2008; Tatsuta, 2009] [14, 15]. In rat xenotransplantation models, it was shown that the recombinant Sendai virus destroys human tumors of melanoma, hepatocellular carcinoma, neuroblastoma, squamous cell carcinoma, and prostate cancer with high efficiency [Yonemitsu, 2008] [16]. The antitumor efficacy of the Sendai virus has been demonstrated in syngeneic mouse models [Tanaka, 2019] [17], and it has been shown that even after UV inactivation, Sendai virus preparations are effective against colon carcinoma [Kurooka, 2007; Kawano, 2007] [18, 19], bladder [Kawano, 2008] [20], and kidney carcinomas [Fujihara, 2008] [21]. The effectiveness of UV-inactivated Sendai virus was also shown in a mouse xenotransplantation model of human prostate cancer [Hui, 2014] [22]. In all of these studies, the Sendai virus resulted in complete regression of tumors or severe suppression of their growth. A UV-inactivated Sendai virus preparation has also passed phase I/IIa clinical trials for intratumoral administration in patients with advanced stage IIIC or IV melanoma with skin or lymph metastases. Complete or partial responses were observed in about half of the treated cases [Kiyohara, 2020] [23].
Мы работаем с уникальным по своим характеристикам российским штаммом Москва вируса Сендай [Zainutdinov, 2016] [2], который в ряде случайных клинических исследований в России продемонстрировал хороший противоопухолевый потенциал. В начале и середине 1990-х годов под руководством В.М. Сенина в клиниках Москвы и Санкт-Петербурга штамм Москва вируса Сендай был использован для лечения больных-добровольцев, имеющих разнообразные карциномы третьей и четвертой стадии заболевания. У ряда больных были отмечены длительные ремиссии заболевания, даже в случаях, когда опухоли были признаны неоперабельными и вирус использовали в качестве монотерапии. В некоторых случаях наблюдалось рассасывание первичных опухолей и метастазов, исчезали все обьективные и субъективные признаки онкологического заболевания. Иногда отсутствие признаков заболевания отмечались и спустя 5-10 и более лет после одного или двух курсов терапии вирусом Сендай [Matveeva, 2015] [24]. Краткие истории болезни этих больных приведены в тексте опубликованного патента [Сенин, 2014] [25]. Опубликованы также данные по полной или частичной ремиссии тучноклеточных раковых опухолей (мастоцитом) у собак при внутриопухолевых инъекциях вируса Сендай штамма Москва [Ilyinskaya, 2018] [26].We are working with a unique Russian strain of the Moscow Sendai virus [Zainutdinov, 2016] [2], which has demonstrated good antitumor potential in a number of random clinical trials in Russia. In the early and mid-1990s, under the leadership of V.M. Senin in clinics in Moscow and St. Petersburg, the Moscow strain of the Sendai virus was used to treat volunteer patients with various carcinomas of the third and fourth stages of the disease. A number of patients had long-term remissions of the disease, even in cases where the tumors were considered inoperable and the virus was used as monotherapy. In some cases, resorption of primary tumors and metastases was observed, all objective and subjective signs of oncological disease disappeared. Sometimes the absence of signs of the disease was noted even 5–10 years or more after one or two courses of therapy with the Sendai virus [Matveeva, 2015] [24]. Brief case histories of these patients are given in the text of the published patent [Senin, 2014] [25]. Data on complete or partial remission of mast cell cancerous tumors (mastocytes) in dogs with intratumoral injections of the Sendai virus of the Moscow strain have also been published [Ilyinskaya, 2018] [26].
Первичная нуклеотидная последовательность штамма Москва была определена с участием авторов подаваемого изобретения и депонирована в базу данных «GenBank» под номером КР717417.1. Эта последовательность легла в основу создания набора рекомбинантных плазмидных ДНК для получения рекомбинантных вариантов вируса Сендай штамма Москва. Набор включает пять плазмидных конструкций, содержащих: (1) полноразмерную ДНК-копию генома вируса с сайтом для встройки трансгенов в 3'-некодирующую лидерную последовательность, расположенную перед геном N; (2) полноразмерную ДНК-копию генома вируса с сайтом для встройки трансгенов между генами Р и М; (3) ген N; (4) ген Р; (5) ген L. Экспрессия генов N (нуклеопротеин), Р (фосфопротеин) и L (полимераза) является необходимым элементом оживления рекомбинантных вариантов вируса; они обеспечивают упаковку и последующую репликацию геномной РНК, которая транскрибируется с плазмид, содержащих ее полногеномную ДНК-копию.The primary nucleotide sequence of the Moscow strain was determined with the participation of the authors of the submitted invention and deposited in the GenBank database under the number КР717417.1. This sequence formed the basis for creating a set of recombinant plasmid DNA for obtaining recombinant variants of the Sendai virus of the Moscow strain. The kit includes five plasmid constructs containing: (1) a full-length DNA copy of the virus genome with a site for inserting transgenes into a 3' non-coding leader sequence located before the N gene; (2) a full-length DNA copy of the virus genome with a site for inserting transgenes between the P and M genes; (3) N gene; (4) P gene; (5) the L gene. Expression of the N (nucleoprotein), P (phosphoprotein) and L (polymerase) genes is a necessary element for reviving recombinant virus variants; they provide packaging and subsequent replication of genomic RNA, which is transcribed from plasmids containing its full genome DNA copy.
Наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является патент US9637758B2 [Hurwitz, 2018] [27]. В прототипе описаны рекомбинантные плазмидные ДНК, с помощью которых авторы конструировали рекомбинантные варианты вируса Сендай штамма Enders, несущие встройку репортерного трансгена люциферазы и некоторых других трансгенов в межгенные промежутки Р-М, M-F и F-HN генома вируса. Уникальные сайты распознавания NotI были клонированы в межгенные соединения Р-М, M-F и F-HN плазмиды вирусного генома PSEV на основе Эндерса с использованием сайтов клонирования, описанных ранее [Tokusumi et al. 2002, Virus Res 86: 33-38]. Ген люциферазы светлячка был амплифицирован методом ПЦР с использованием базового вектора pGL3 (Promega) и пары праймеров, помеченных ASCI, субклонированных в плазмиду-челнок, содержащую межгенный переход вируса Сендай и фланкирующие сайты рестрикции NotI [Токусуми и др. 2002, Virus Res 86: 33-38], а затем подклонирован в уникальный сайт NotI каждой из плазмид вирусного генома PSEV. В плазмиде PSEV-luc(M-F) начальный сигнал перед белком F был изменен с AGGGATAAAG (SEQ. ID. №: 19) на AGGGTGAAAG (SEQ.ID. №: 20) с использованием набора для мутагенеза, направленного на сайт QuikChange ™ (Stratagene Corp). Рекомбинантные SEV были извлечены из плазмид генома PSEV, как описано ранее [Zhan et al. 2008, Вакцина 26: 3480-3488].The closest to the claimed invention (prototype) is patent US9637758B2 [Hurwitz, 2018] [27]. The prototype describes recombinant plasmid DNA, with the help of which the authors constructed recombinant variants of the Sendai virus of the Enders strain carrying the insertion of the luciferase reporter transgene and some other transgenes into the intergenic intervals P-M, M-F and F-HN of the virus genome. Unique NotI recognition sites were cloned into the P-M, M-F, and F-HN intergenic junctions of the Enders-based PSEV viral genome plasmid using the cloning sites described previously [Tokusumi et al. 2002, Virus Res 86: 33-38]. The firefly luciferase gene was amplified by PCR using the base vector pGL3 (Promega) and a pair of ASCI-tagged primers subcloned into a shuttle plasmid containing the Sendai virus intergene transition and flanking NotI restriction sites [Tokusumi et al. 2002, Virus Res 86: 33 -38], and then cloned into the unique NotI site of each of the plasmids of the PSEV viral genome. In the PSEV-luc(M-F) plasmid, the initial signal upstream of the F protein was changed from AGGGATAAAG (SEQ. ID. NO: 19) to AGGGTGAAAG (SEQ. ID. NO: 20) using the QuikChange™ site-directed mutagenesis kit (Stratagene Corp). Recombinant SEVs were derived from PSEV genome plasmids as described previously [Zhan et al. 2008, Vaccine 26: 3480-3488].
Однако используемый набор плазмид не обеспечивает достаточную широту возможностей конструирования рекомбинантных вариантов вирусов Сендай вследствие наличия единственного уникального сайта NotI.However, the set of plasmids used does not provide sufficient breadth of possibilities for constructing recombinant variants of Sendai viruses due to the presence of a single unique NotI site.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение возможности конструирования рекомбинантных вариантов вируса Сендай с заданными свойствами за счет использования для встройки трансгенов полилинкер, содержащий несколько уникальных сайтов рестрикции (BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII), не встречающихся в геноме вируса Сендай штамма Москва.The technical result of the claimed invention is the expansion of the possibility of constructing recombinant variants of the Sendai virus with desired properties by using a polylinker for inserting transgenes containing several unique restriction sites (BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII) that are not found in the genome of the Sendai virus strain Moscow.
Указанный технический результат достигается созданием первого варианта набора рекомбинантных плазмидных ДНК для получения рекомбинантных вирусов Сендай штамма Москва, включающий четыре плазмидных конструкций:The specified technical result is achieved by creating the first version of a set of recombinant plasmid DNA for obtaining recombinant Sendai viruses of the Moscow strain, which includes four plasmid constructs:
- первую плазмидную конструкцию pET15b-N, представленную на физической и генетической карте на фиг. 1, обеспечивающую экспрессию гена N, кодирующего нуклеопротеин вируса Сендай штамма Москва в трансформированных клетках эукариот, продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7, имеющую последовательность SEQ ID No.: 1, размер 7231 п. н. и молекулярную массу 4,8 мегадальтон и состоящую из BamHI-NcoI векторного фрагмента плазмиды pET15b (5638 п. н.), включающего участок начала репликации ori, ген бета-лактамазы, придающей устойчивость к ампициллину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, между которыми встроен ген N (позиции нуклеотидов 120-1694, GenBank: КР717417.1), фланкированный модифицированной последовательностью 5'-CCTAGGGTCGACCAATTG, содержащей сайты рестриктаз AvrII (вместо NcoI в позиции 5316 п. н. исходной плазмиды pET15b), SalI и MfeI;- the first plasmid construct pET15b-N shown in the physical and genetic map in FIG. 1, providing the expression of the N gene encoding the nucleoprotein of the Sendai virus strain Moscow in transformed eukaryotic cells producing T7 phage RNA polymerase having the sequence of SEQ ID No.: 1,
- вторую плазмидную конструкцию pET15b-Р, представленную на физической и генетической карте на фиг. 2, обеспечивающую экспрессию гена Р, кодирующего фосфопротеин вируса Сендай штамма Москва, в трансформированных клетках эукариот, продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7, имеющую последовательность SEQ ID No.: 2, размер 7351 п. н. и молекулярную массу 4,9 мегадальтон и состоящую из BamHI-Ncol векторного фрагмента плазмиды pET15b (5638 п. н.), включающего участок начала репликации ori, ген бета-лактамазы, придающей устойчивость к ампициллину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, между которыми встроен ген Р (позиции нуклеотидов 1844-3550 с заменой С→А в позиции 1972 для удаления альтернативной рамки считывания, GenBank: КР717417.1), фланкированный последовательностью 5'-CCTAGG (сайт рестриктазы Avr II в позиции 5316 п. н.);- the second plasmid construct pET15b-P shown in the physical and genetic map in FIG. 2, which ensures the expression of the P gene encoding the phosphoprotein of the Sendai virus of the Moscow strain in transformed eukaryotic cells producing T7 phage RNA polymerase having the sequence of SEQ ID No.: 2,
- третью плазмидную конструкцию pET15b-L, представленную на физической и генетической карте на фиг. 3, обеспечивающую экспрессию гена I, кодирующего полимеразу вируса Сендай штамма Москва, в трансформированных клетках эукариот, продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7, имеющую последовательность SEQ ID No.: 3, размер 12351 п. н. и молекулярную массу 8,2 мегадальтон и состоящую из BamHI-NcoI векторного фрагмента плазмиды pET15b (5638 п. н.), включающего участок начала репликации ori, ген бета-лактамазы, придающей устойчивость к ампициллину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, между которыми встроен ген L (позиции нуклеотидов 8556-15245, GenBank: КР717417.1), фланкированный последовательностями 5'-CCTAGGGTCGAC (сайт рестриктаз Avr II и SaiI) и CCCGGGCTCGA-3', содержащей сайт рестриктазы XmaI;- the third plasmid construct pET15b-L shown in the physical and genetic map in FIG. 3, which ensures the expression of gene I, encoding the polymerase of the Sendai virus of the Moscow strain, in transformed eukaryotic cells producing phage T7 RNA polymerase having the sequence of SEQ ID No.: 3,
- четвертую плазмидную конструкцию pSen2-MCS(N), представленную на физической и генетической карте на фиг. 7, обеспечивающую транскрипцию геномной рекомбинантной РНК вируса Сендай штамма Москва со встройкой трансгенов перед геном N в трансформированных клетках эукариот, продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7, имеющую последовательность SEQ ID No.: 4, размер 18184 п. н. и молекулярную массу 12 мегадальтон и состоящую из SbfI-NarI векторного фрагмента плазмиды pUC 19 (2483 п. н.), включающего участок начала репликации ori, ген бета-лактамазы, придающей устойчивость к ампициллину, и встройки, в которой последовательно расположены: промотор РНК-полимеразы фага Т7, рибозим-молот, копия ДНК 3'-НТО генома вируса Сендай штамма Москва (позиции нуклеотидов 1-104, GenBank: КР717417.1), полилинкер для встройки трансгенов, включающий пять уникальных сайтов для эндонуклеаз рестрикции BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII, сигнал терминации транскрипции трансгена, сигнал реинициации транскрипции последующего гена для РНК-полимеразы вируса Сендай, ген N (позиции нуклеотидов 120-1694, GenBank: КР717417.1), ген Р (позиции нуклеотидов 1844-3550, GenBank: КР717417.1), ген М (позиции нуклеотидов 3669-4715, GenBank: КР717417.1), ген F (позиции нуклеотидов 4866-6563, GenBank: КР717417.1), ген HN (позиции нуклеотидов 6693-8420, GenBank: КР717417.1), ген L (позиции нуклеотидов 8556-15245, GenBank: КР717417.1), копия ДНК 5'-НТО генома вируса Сендай штамма Москва (позиции нуклеотидов 15312-15384, GenBank: КР717417.1), геномный рибозим вируса гепатита D, терминатор РНК-полимеразы фага Т7.- the fourth plasmid construct pSen2-MCS(N), shown in the physical and genetic map in FIG. 7, providing transcription of the genomic recombinant RNA of the Sendai virus of the Moscow strain with the insertion of transgenes before the N gene in transformed eukaryotic cells producing T7 phage RNA polymerase having the sequence SEQ ID No.: 4,
Указанный технический результат достигается также созданием второго варианта набора рекомбинантных плазмидных ДНК для получения рекомбинантных вирусов Сендай штамма Москва, включающий четыре плазмидных конструкций:The specified technical result is also achieved by creating the second version of the set of recombinant plasmid DNA for obtaining recombinant Sendai viruses of the Moscow strain, which includes four plasmid constructs:
- первую плазмидную конструкцию pET15b-N, представленную на физической и генетической карте на фиг. 1, обеспечивающую экспрессию гена N, кодирующего нуклеопротеин вируса Сендай штамма Москва в трансформированных клетках эукариот, продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7, имеющую последовательность SEQ ID No.: 1, размер 7231 п. н. и молекулярную массу 4,8 мегадальтон и состоящую из BamHI-Ncol векторного фрагмента плазмиды pET15b (5638 п. н.), включающего участок начала репликации ori, ген бета-лактамазы, придающей устойчивость к ампициллину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, между которыми встроен ген N (позиции нуклеотидов 120-1694, GenBank: КР717417.1), фланкированный модифицированной последовательностью 5'-CCTAGGGTCGACCAATTG, содержащей сайты рестриктаз AvrII (вместо NcoI в позиции 5316 п. н. исходной плазмиды pET15b), SaiI и MfeI;- the first plasmid construct pET15b-N shown in the physical and genetic map in FIG. 1, providing the expression of the N gene encoding the nucleoprotein of the Sendai virus strain Moscow in transformed eukaryotic cells producing T7 phage RNA polymerase having the sequence of SEQ ID No.: 1,
- вторую плазмидную конструкцию pET15b-Р, представленную на физической и генетической карте на фиг. 2, обеспечивающую экспрессию гена Р, кодирующего фосфопротеин вируса Сендай штамма Москва, в трансформированных клетках эукариот, продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7, имеющую последовательность SEQ ID No.: 2 размер 7351 п. н. и молекулярную массу 4,9 мегадальтон и состоящую из BamHI-NcoI векторного фрагмента плазмиды pET15b (5638 п. н.), включающего участок начала репликации ori, ген бета-лактамазы, придающей устойчивость к ампициллину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, между которыми встроен ген Р (позиции нуклеотидов 1844-3550 с заменой С→А в позиции 1972 для удаления альтернативной рамки считывания, GenBank: КР717417.1), фланкированный последовательностью 5'-CCTAGG (сайт рестриктазы Avr II в позиции 5316 п. н.);- the second plasmid construct pET15b-P shown in the physical and genetic map in FIG. 2, which ensures the expression of the P gene encoding the phosphoprotein of the Sendai virus of the Moscow strain in transformed eukaryotic cells producing T7 phage RNA polymerase having the sequence SEQ ID No.: 2,
- третью плазмидную конструкцию pET15b-L, представленную на физической и генетической карте на фиг. 3, обеспечивающую экспрессию гена L, кодирующего полимеразу вируса Сендай штамма Москва, в трансформированных клетках эукариот, продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7, имеющую последовательность SEQ ID No.: 3, размер 12351 п. н. и молекулярную массу 8,2 мегадальтон и состоящую из BamHI-NcoI векторного фрагмента плазмиды pET15b (5638 п. н.), включающего участок начала репликации ori, ген бета-лактамазы, придающей устойчивость к ампициллину, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, между которыми встроен ген L (позиции нуклеотидов 8556-15245, GenBank: КР717417.1), фланкированный последовательностями 5'-CCTAGGGTCGAC (сайт рестриктаз Avr II и SaiI) и CCCGGGCTCGA-3', содержащей сайт рестриктазы XmaI;- the third plasmid construct pET15b-L shown in the physical and genetic map in FIG. 3, which ensures the expression of the L gene encoding the polymerase of the Sendai virus of the Moscow strain in transformed eukaryotic cells producing T7 phage RNA polymerase having the sequence of SEQ ID No.: 3,
- четвертую плазмидную конструкцию pSen2-MCS(M), представленную на физической и генетической карте на фиг. 8, обеспечивающую транскрипцию геномной рекомбинантной РНК вируса Сендай штамма Москва со встройкой трансгенов перед геном М в трансформированных клетках эукариот, продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7, имеющую последовательность SEQ ID No.: 5, размер 18184 п. н. и молекулярную массу 12 мегадальтон и состоящую из SbfI-NarI векторного фрагмента плазмиды pUC19 (2483 п. н.), включающего участок начала репликации ori, ген бета-лактамазы, придающей устойчивость к ампициллину, и встройки, в которой последовательно расположены: промотор РНК-полимеразы фага Т7, рибозим-молот, копия ДНК 3'-НТО генома вируса Сендай штамма Москва (позиции нуклеотидов 1-104, GenBank: КР717417.1), ген N (позиции нуклеотидов 120-1694, GenBank: КР717417.1), ген Р (позиции нуклеотидов 1844-3550, GenBank: КР717417.1), полилинкер для встройки трансгенов, включающий пять уникальных сайтов для эндонуклеаз рестрикции BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII, сигнал терминации транскрипции трансгена, сигнал реинициации транскрипции последующего гена для РНК-полимеразы вируса Сендай, ген М (позиции нуклеотидов 3669-4715, GenBank: КР717417.1), ген F (позиции нуклеотидов 4866-6563, GenBank: КР717417.1), ген HN (позиции нуклеотидов 6693-8420, GenBank: КР717417.1), ген L (позиции нуклеотидов 8556-15245, GenBank: КР717417.1), копия ДНК 5'-НТО генома вируса Сендай штамма Москва (позиции нуклеотидов 15312-15384, GenBank: КР717417.1), геномный рибозим вируса гепатита D, терминатор РНК-полимеразы фага Т7.- the fourth plasmid construct pSen2-MCS(M), shown in the physical and genetic map in FIG. 8, providing transcription of the genomic recombinant RNA of the Sendai virus of the Moscow strain with the insertion of transgenes before the M gene in transformed eukaryotic cells producing T7 phage RNA polymerase having the sequence SEQ ID No.: 5, size 18184 bp. and a molecular weight of 12 megadaltons and consisting of the SbfI-NarI vector fragment of the plasmid pUC19 (2483 bp), including the site of the origin of replication ori, the beta-lactamase gene, which confers resistance to ampicillin, and an insert in which the following are sequentially located: the RNA- phage T7 polymerase, hammerhead ribozyme, DNA copy of the 3'-UTR genome of the Sendai virus strain Moscow (nucleotide positions 1-104, GenBank: KP717417.1), gene N (nucleotide positions 120-1694, GenBank: KP717417.1), gene P (nucleotide positions 1844-3550, GenBank: KP717417.1), a polylinker for inserting transgenes, including five unique sites for restriction endonucleases BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII, a signal for terminating transgene transcription, a signal for reinitiating transcription of the subsequent gene for RNA- Sendai virus polymerase, M gene (nucleotide positions 3669-4715, GenBank: KP717417.1), F gene (nucleotide positions 4866-6563, GenBank: KP717417.1), HN gene (nucleotide positions 6693-8420, GenBank: KP717417.1 ), L gene (nucleotide positions 8556 -15245, GenBank: KP717417.1), DNA copy of the 5'-UTR genome of the Sendai virus of the Moscow strain (nucleotide positions 15312-15384, GenBank: KP717417.1), genomic ribozyme of hepatitis D virus, terminator of T7 phage RNA polymerase.
Преимущество заявляемого изобретения состоит, прежде всего, в использовании российского штамма Москва вируса Сендай, обладающего высокой природной онколитической активностью. Во-вторых, для встройки трансгенов мы ввели полилинкер, содержащий несколько уникальных сайтов рестрикции (BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII), в отличие от единственного NotI сайта прототипа. Введение дополнительных сайтов, не встречающихся в геноме вируса Сендай штамма Москва, расширяет возможности конструирования рекомбинантных вариантов вируса. Для получения рекомбинантных векторных вакцин на основе вируса Сендай, в отличие от прототипа, мы создали рекомбинантную плазмидную ДНК pSen2-MCS(N), которая обеспечивает встройку трансгенов в 3'-нетранслируемую область генома вируса Сендай штамма Москва, расположенную перед геном N. Позиция трансгена в этом районе обеспечивает максимальный уровень продукции белка вследствие наличия 3'>5' градиента уровня экспрессии генов в геноме парамиксовирусов [Makowska, 2020] [28]. Высокий уровень продукции протективно-значимых белков-иммуногенов в вакцинных конструктах обеспечит большую эффективность иммунного ответа и защиту от соответствующего патогена. Еще одна созданная нами рекомбинантная плазмидная ДНК pSen2-MCS(M) обеспечивает встройку трансгенов перед геном М в геномном промежутке Р-М генома вируса Сендай штамма Москва Этот район лучше использовать для встройки трансгенов биологически-активных белков в онколитических рекомбинантных вариантах вируса Сендай, для осуществления функциональной активности которых не требуется высокий уровень экспрессии трансгена и которые часто обладают токсичностью для клеток (гены онкотоксических белков, например).The advantage of the claimed invention lies, first of all, in the use of the Russian strain of the Moscow Sendai virus, which has a high natural oncolytic activity. Secondly, for the insertion of transgenes, we introduced a polylinker containing several unique restriction sites (BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII), in contrast to the single NotI site of the prototype. The introduction of additional sites that are not found in the genome of the Sendai virus of the Moscow strain expands the possibilities of constructing recombinant variants of the virus. To obtain recombinant vector vaccines based on the Sendai virus, in contrast to the prototype, we created recombinant plasmid DNA pSen2-MCS(N), which ensures the insertion of transgenes into the 3'-untranslated region of the genome of the Sendai virus of the Moscow strain, located before the N gene. Position of the transgene in this region provides the maximum level of protein production due to the presence of a 3'>5' gradient in the level of gene expression in the genome of paramyxoviruses [Makowska, 2020] [28]. A high level of production of protectively significant immunogen proteins in vaccine constructs will provide a more effective immune response and protection against the corresponding pathogen. Another recombinant plasmid DNA created by us, pSen2-MCS(M), ensures the insertion of transgenes upstream of the M gene in the genomic interval P-M of the genome of the Sendai virus of the Moscow strain. whose functional activity does not require a high level of transgene expression and which often have toxicity to cells (genes of oncotoxic proteins, for example).
Технической задачей изобретения является получение набора из четырех рекомбинантных плазмидных ДНК, три из которых экспрессируют гены N, P и L вируса Сендай штамма Москва (вспомогательные плазмиды), а четвертая содержит полногеномную копию ДНК геномной РНК вируса Сендай штамма Москва, в которую введены структурные элементы для встройки и экспрессии трансгенов в 3'-нетранслируемой области (НТО) вирусного генома, расположенной перед геном N (первый вариант четвертой плазмиды) или между генами Р и М (второй вариант четвертой плазмиды). Полученный набор плазмид обеспечивает оживление рекомбинантных вариантов вируса Сендай штамма Москва, которое мы подтвердили на примере модельного трансгена зеленого флюоресцентного белка EGFP.The technical objective of the invention is to obtain a set of four recombinant plasmid DNA, three of which express the N, P and L genes of the Sendai virus of the Moscow strain (auxiliary plasmids), and the fourth contains a genome-wide copy of the DNA of the genomic RNA of the Sendai virus of the Moscow strain, which introduced structural elements for insertion and expression of transgenes in the 3'-untranslated region (NTR) of the viral genome located before the N gene (the first version of the fourth plasmid) or between the P and M genes (the second version of the fourth plasmid). The resulting set of plasmids ensures the revival of recombinant variants of the Sendai virus of the Moscow strain, which we confirmed using the model transgene of the green fluorescent protein EGFP as an example.
Поставленная задача решается путем введения в плазмиду pET15b (Sigma-Aldrich, Cat. No. 69661-3; база данных SnapGene snapgene.com) [29] ДНК-копий фрагментов генома вируса Сендай штамма Москва, соответствующих генам N, Р и L, под контроль высокоэффективного промотора РНК-полимеразы фага Т7 с получением плазмид pET15b-N (Фиг. 1), pET15b-Р (Фиг. 2) и pET15b-L (Фиг. 3) (Пример 1). Сборка полногеномной копии ДНК вируса Сендай штамма Москва осуществляется в плазмиде pUC19 (база данных SnapGene snapgene.com) [30] в 6 этапов с получением промежуточной плазмиды pSen2 (Фиг. 5, пример 2). Транскрипция геномной РНК вируса Сендай осуществляется с плазмидной ДНК pSen2 высокопроизводительной РНК-полимеразой фага Т7. Точность размера генома вируса Сендай в процессе транскрипции вирусной РНК на матрице pSen2 контролируется рибозимами типа молот [Beaty et al, 2017] [1] и вируса гепатита D [Leyrer, 1998] [31], встроенными по 5'- и 3'-концам геномной кДНК соответственно. Необходимость контроля длины РНК объясняется тем, что у генома вируса Сендай, как и у всех парамиксовирусов, есть необычное свойство: он подчиняется «правилу шести» и имеет полигексамерную длину (6n+0), что затрудняет рекомбинацию и обеспечивает высокую стабильность РНК-геномов парамиксовирусов в природе [Matsumoto, 2018] [32]. Для встройки трансгенов в две области генома в плазмиду pSen2 введена одинаковая инсерция: полилинкер с уникальными сайтами для крупнощепящих эндонуклеаз рестрикции BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII, за которым следует сигнал терминации транскрипции трансгена и сигнал реинициации для транскрипции последующего гена (Фиг. 6). В результате были получены рекомбинантные плазмидные ДНК: pSen2-MCS(N) для встройки трансгенов перед геном N (Фиг. 7) и pSen2-MCS(M) для встройки трансгенов между генами Р и М(Фиг. 8).This problem is solved by introducing into the pET15b plasmid (Sigma-Aldrich, Cat. No. 69661-3; SnapGene snapgene.com database) [29] DNA copies of fragments of the Sendai virus genome of the Moscow strain corresponding to the N, P, and L genes under control of the highly efficient T7 RNA polymerase promoter to obtain plasmids pET15b-N (Fig. 1), pET15b-P (Fig. 2) and pET15b-L (Fig. 3) (Example 1). Assembly of a genome-wide copy of the DNA of the Sendai virus strain Moscow is carried out in the pUC19 plasmid (SnapGene snapgene.com database) [30] in 6 steps to obtain an intermediate plasmid pSen2 (Fig. 5, example 2). Transcription of Sendai virus genomic RNA is carried out with pSen2 plasmid DNA by high-throughput T7 phage RNA polymerase. The accuracy of the size of the Sendai virus genome during transcription of viral RNA on the pSen2 template is controlled by ribozymes of the hammer type [Beaty et al, 2017] [1] and hepatitis D virus [Leyrer, 1998] [31] inserted at the 5'- and 3'-ends genomic cDNA, respectively. The need to control the length of RNA is explained by the fact that the Sendai virus genome, like all paramyxoviruses, has an unusual property: it obeys the “rule of six” and has a polyhexamer length (6n + 0), which makes recombination difficult and ensures high stability of paramyxovirus RNA genomes. in nature [Matsumoto, 2018] [32]. To insert transgenes into two regions of the genome, the same insertion was introduced into the pSen2 plasmid: a polylinker with unique sites for large-cleaving restriction endonucleases BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII, followed by the transgene transcription termination signal and the reinitiation signal for transcription of the subsequent gene (Fig. 6 ). As a result, recombinant plasmid DNAs were obtained: pSen2-MCS(N) for insertion of transgenes before the N gene (Fig. 7) and pSen2-MCS(M) for insertion of transgenes between the P and M genes (Fig. 8).
В качестве тестового трансгена для проверки «работоспособности» созданного набора рекомбинантных плазмидных ДНК для получения (оживления) рекомбинантных вариантов вируса Сендай был использован ген зеленого флюоресцентного белка EGFP (позиции 679-1398, база данных SnapGene snapgene.com [33]. Получены два рекомбинантных варианта вируса Сендай штамма Москва: Sen2-EGFP(N) со встройкой трансгена EGFP перед геном N и Sen2-EGFP(M) со встройкой трансгена EGFP между генами Р и М (Фиг. 9).The EGFP green fluorescent protein gene (positions 679-1398, SnapGene snapgene.com database [33]) was used as a test transgene to test the “performance” of the created set of recombinant plasmid DNA for obtaining (revitalizing) recombinant variants of the Sendai virus. Two recombinant variants were obtained Sendai virus strain Moscow: Sen2-EGFP(N) with the insertion of the EGFP transgene upstream of the N gene and Sen2-EGFP(M) with the insertion of the EGFP transgene between the P and M genes (Fig. 9).
Физические карты рекомбинантных плазмидных ДНК pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L, pSen2-MCS(N) и pSen2-MCS(M), являющихся предметом изобретения, представлены на Фиг. 1, 2, 3, 7 и 8, соответственно. Свойства полученных рекомбинантных плазмидных ДНК представлены в таблице 1 выше.Physical maps of the recombinant plasmid DNA pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L, pSen2-MCS(N) and pSen2-MCS(M) of the invention are shown in FIG. 1, 2, 3, 7 and 8, respectively. The properties of the obtained recombinant plasmid DNA are presented in table 1 above.
Общие свойства плазмид:General properties of plasmids:
- содержат участок начала репликации (ori);- contain an origin of replication (ori);
- содержат в качестве генетического маркера ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных клеток Е. coli к ампициллину (Ар);- contain as a genetic marker gene bla β-lactamase, which determines the resistance of transformed E. coli cells to ampicillin (Ap);
- содержат промотор РНК-полимеразы фага Т7 (П Т7), с которого начинается транскрипция мРНК генов N, Р и L или геномных РНК вируса Сендай штамма Москва;- contain the promoter of T7 phage RNA polymerase (P T7), from which the transcription of mRNA of the N, P and L genes or genomic RNA of the Sendai virus of the Moscow strain begins;
-содержат терминатор РНК-полимеразы фага Т7 (Т Т7), на котором заканчивается транскрипция РНК.- contain the T7 phage RNA polymerase terminator (T T7), at which RNA transcription ends.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. Фиг. 1. Физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pET15b-N. Вертикальная черта в верхней части плазмидной ДНК обозначает начало отсчета п. н. (нуклеотид №1). В скобках приведены позиции нуклеотидов в плазмидной ДНК, соответствующие обозначенным элементам конструкта. OriThe invention is illustrated by the following graphics. Fig. 1. Physical map of recombinant plasmid DNA pET15b-N. The vertical bar at the top of the plasmid DNA indicates the origin of the bp. (nucleotide number 1). In parentheses are the positions of nucleotides in plasmid DNA corresponding to the designated elements of the construct. Ori
- участок начала репликации; Ар - ген bla β-лактамазы. П Т7 - промотор РНК-полимеразы фага Т7 (направление транскрипции указано стрелкой). Т Т7 - терминатор РНК-полимеразы фага Т7.- site of origin of replication; Ap - gene bla β-lactamase. P T7 - T7 phage RNA polymerase promoter (the direction of transcription is indicated by an arrow). T T7 - terminator of T7 phage RNA polymerase.
Фиг. 2. Физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pET15b-Р. Вертикальная черта в верхней части плазмидной ДНК обозначает начало отсчета п. н. (нуклеотид №1). В скобках приведены позиции нуклеотидов в плазмидной ДНК, соответствующие обозначенным элементам конструкта. Ori - участок начала репликации; Ар - ген bla β-лактамазы. П Т7 - промотор РНК-полимеразы фага Т7 (направление транскрипции указано стрелкой). Т Т7 - терминатор РНК-полимеразы фага Т7.Fig. 2. Physical map of recombinant plasmid DNA pET15b-P. The vertical bar at the top of the plasmid DNA indicates the origin of the bp. (nucleotide number 1). In parentheses are the positions of nucleotides in plasmid DNA corresponding to the designated elements of the construct. Ori - site of origin of replication; Ap - gene bla β-lactamase. P T7 - T7 phage RNA polymerase promoter (the direction of transcription is indicated by an arrow). T T7 - terminator of T7 phage RNA polymerase.
Фиг.3. Физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pET15b-L. Вертикальная черта в верхней части плазмидной ДНК обозначает начало отсчета п. н. (нуклеотид №1). В скобках приведены позиции нуклеотидов в плазмидной ДНК, соответствующие обозначенным элементам конструкта. Ori - участок начала репликации; Ар - ген bla β-лактамазы. П Т7 - промотор РНК-полимеразы фага Т7 (направление транскрипции указано стрелкой). Т Т7 - терминатор РНК-полимеразы фага Т7.Fig.3. Physical map of pET15b-L recombinant plasmid DNA. The vertical bar at the top of the plasmid DNA indicates the origin of the bp. (nucleotide number 1). In parentheses are the positions of nucleotides in plasmid DNA corresponding to the designated elements of the construct. Ori - site of origin of replication; Ap - gene bla β-lactamase. P T7 - T7 phage RNA polymerase promoter (the direction of transcription is indicated by an arrow). T T7 - terminator of T7 phage RNA polymerase.
Фиг. 4. Выявление белка Р вируса Сендай в лизатах клеток 293-Т7, трансформированных плазмидой pET15b-Р. Лизаты клеток готовили через 48 часов после трансформации 2 мкг ДНК pET15b-Р с реагентом Lipofectamine™ LTX Plus (Invitrogen, Cat. 15338). Для лизиса клеток использовали RIPA (Sigma, Cat. R0278). 1 - лизат 293-Т7+pET15b-P; 2 - лизат 293-Т7 (отрицательный контроль). М - маркер молекулярных масс (Thermo Scientific, Cat. 26634). В качестве первичных антител использовали иммунную сыворотку овцы (1:5000). В качестве вторичных антител использовали конъюгат с щелочной фосфатазой anti-sheep IgG осла (1:5000) (Sigma, А5187).Fig. 4. Detection of the Sendai virus P protein in lysates of 293-T7 cells transformed with the pET15b-P plasmid. Cell lysates were prepared 48 hours after transformation with 2 μg pET15b-P DNA with Lipofectamine™ LTX Plus reagent (Invitrogen, Cat. 15338). RIPA (Sigma, Cat. R0278) was used for cell lysis. 1 - lysate 293-T7+pET15b-P; 2 - lysate 293-T7 (negative control). M - molecular weight marker (Thermo Scientific, Cat. 26634). Sheep immune serum (1:5000) was used as the primary antibody. Alkaline phosphatase conjugate anti-sheep donkey IgG (1:5000) (Sigma, A5187) was used as secondary antibody.
Фиг. 5. Схема сборки промежуточной плазмидной ДНК pSen2, содержащей ДНК-копию геномной РНК вируса Сендай штамма Москва. Сборка включает 6 этапов. 1 этап: получение плазмиды pUC19-FrO, содержащей синтетически полученный ДНК-фрагмент с 3'-НТО генома вируса, регуляторными последовательностями (промотор, терминатор, рибозимы) и полилинкер; 2-4 этапы: на основе pUC19-Fr0 получаются 3 плазмиды pUC19-Fr1, pUC19-Fr2 и pUC19-Fr3, содержащие 3 фрагмента генома вируса Сендай; 5-6 этапы: объединение трех клонированных фрагментов генома в единую полноразмерную цепь ДНК.Fig. Fig. 5. Scheme of assembly of the intermediate plasmid DNA pSen2 containing a DNA copy of the genomic RNA of the Sendai virus of the Moscow strain. Assembly includes 6 stages. Stage 1: obtaining a plasmid pUC19-FrO containing a synthetically obtained DNA fragment with a 3'-UTR of the virus genome, regulatory sequences (promoter, terminator, ribozymes) and a polylinker; 2-4 stages: based on pUC19-Fr0, 3 plasmids pUC19-Fr1, pUC19-Fr2 and pUC19-Fr3 are obtained, containing 3 fragments of the Sendai virus genome; 5-6 stages: combining three cloned genome fragments into a single full-length DNA chain.
Фиг. 6. Схема рекомбинантного генома вируса Сендай штамма Москва с введением трансгенов в две области генома: перед геном N и перед геном М. Синтез геномной РНК рекомбинантных штаммов вируса Сендай осуществляется с плазмидной ДНК под контролем РНК-полимеразы фага Т7 - указано стрелкой. ПТ7 - промотор, ТТ7 - терминатор РНК-полимеразы фага Т7. Точность размера генома контролируется рибозимами, встроенными по концам геномной РНК (риб). Для встройки трансгенов в две области генома введена одинаковая инсерция: полилинкер с уникальными сайтами для крупнощепящих эндонуклеаз рестрикции, за полилинкером введен сигнал терминации транскрипции трансгена и сигнал реинициации для транскрипции последующего гена.Fig. Fig. 6. Scheme of the recombinant genome of the Sendai virus of the Moscow strain with the introduction of transgenes into two regions of the genome: before the N gene and before the M gene. PT7 - promoter, TT7 - terminator of T7 phage RNA polymerase. The size accuracy of the genome is controlled by ribozymes inserted at the ends of the genomic RNA (rib). For the insertion of transgenes into two regions of the genome, the same insertion was introduced: a polylinker with unique sites for large-cutting restriction endonucleases; after the polylinker, a transgene transcription termination signal and a reinitiation signal for transcription of the next gene were introduced.
Фиг. 7. Физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pSen2-MCS(N). Вертикальная черта в верхней части плазмидной ДНК обозначает начало отсчета п. н. (нуклеотид №1). В скобках приведены позиции нуклеотидов в плазмидной ДНК, соответствующие обозначенным элементам конструкта. Ori - участок начала репликации; Ар - ген bla β-лактамазы. П Т7 - промотор РНК-полимеразы фага Т7. Т Т7 - терминатор РНК-полимеразы фага Т7. Стрелками указано направление транскрипции.Fig. 7. Physical map of recombinant plasmid DNA pSen2-MCS(N). The vertical bar at the top of the plasmid DNA indicates the origin of the bp. (nucleotide number 1). In parentheses are the positions of nucleotides in plasmid DNA corresponding to the designated elements of the construct. Ori - site of origin of replication; Ap - gene bla β-lactamase. P T7 - T7 phage RNA polymerase promoter. T T7 - terminator of T7 phage RNA polymerase. The arrows indicate the direction of transcription.
Фиг. 8. Физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pSen2-MCS(M). Вертикальная черта в верхней части плазмидной ДНК обозначает начало отсчета п. н. (нуклеотид №1). В скобках приведены позиции нуклеотидов в плазмидной ДНК, соответствующие обозначенным элементам конструкта. Ori - участок начала репликации; Ар - ген bla β-лактамазы. П Т7 - промотор РНК-полимеразы фага Т7. Т Т7 - терминатор РНК-полимеразы фага Т7. Стрелками указано направление транскрипции.Fig. 8. Physical map of recombinant plasmid DNA pSen2-MCS(M). The vertical bar at the top of the plasmid DNA indicates the origin of the bp. (nucleotide number 1). In parentheses are the positions of nucleotides in plasmid DNA corresponding to the designated elements of the construct. Ori - site of origin of replication; Ap - gene bla β-lactamase. P T7 - T7 phage RNA polymerase promoter. T T7 - terminator of T7 phage RNA polymerase. The arrows indicate the direction of transcription.
Фиг. 9. Оживление рекомбинантных вариантов Sen2-EGFP(N) и Sen2-EGFP(M) вируса Сендай штамма Москва. (А) Клетки 293-Т7, трансфицированные смесью плазмид pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L и pSen2 (контроль автофлюоресценции - нет зеленого свечения); (Б) клетки 293-Т7, трансформированные плазмидой pEGFP-N1 (Пример 3) (положительный контроль - все клетки флюоресцируют); (В) интактные клетки 293-Т7 (отрицательный контроль); (Г) клетки 293-Т7, трансфицированные смесью плазмид pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L и pSen2-EGFP(N) (флюоресцирующие клетки содержат оживленный рекомбинантный вирус Sen2-EGFP(N); (Д) клетки 293-Т7, трансфицированные смесью плазмид pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L и pSen2-EGFP(M) (флюоресцирующие клетки содержат оживленный рекомбинантный вирус Sen2-EGFP(M). Визуализация клеток проведена на микроскопе «Axiovert» 40 CFL ZEISS с использованием светофильтров для зеленой люминесценции. 20Х увеличение.Fig. 9. Resuscitation of recombinant variants Sen2-EGFP(N) and Sen2-EGFP(M) of the Sendai virus of the Moscow strain. (A) 293-T7 cells transfected with a mixture of plasmids pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L and pSen2 (autofluorescence control - no green light); (B) 293-T7 cells transformed with pEGFP-N1 plasmid (Example 3) (positive control - all cells fluoresce); (B) intact 293-T7 cells (negative control); (D) 293-T7 cells transfected with a mixture of pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L, and pSen2-EGFP(N) plasmids (fluorescent cells contain reactivated recombinant Sen2-EGFP(N) virus; (E) 293-T7 cells , transfected with a mixture of plasmids pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L and pSen2-EGFP(M) (fluorescent cells contain the revived recombinant Sen2-EGFP(M) virus. Cells were visualized on an Axiovert 40 CFL ZEISS microscope using light filters for green luminescence 20X magnification.
Ниже приведены примеры получения заявляемых плазмидных конструкций.Below are examples of obtaining the claimed plasmid constructs.
Пример 1. Конструирование вспомогательных плазмид pET15b-N, pET15b-P и pET15b-L (Фиг. 1-4).Example 1 Construction of helper plasmids pET15b-N, pET15b-P and pET15b-L (FIGS. 1-4).
Все три вспомогательные плазмиды сконструированы по одной схеме на основе плазмиды pET15b [29], в которой экспрессия трансгенов осуществляется под контролем промотора высокоэффективной РНК-полимеразы фага Т7. Этапы конструирования плазмид следующие:All three auxiliary plasmids were constructed according to the same scheme based on the pET15b plasmid [29], in which transgene expression is controlled by the promoter of the highly efficient T7 phage RNA polymerase. The steps for constructing plasmids are as follows:
Этап 1. Из плазмидной ДНК pET15b с использованием эндонуклеаз Nco I и BamH I вырезали фрагмент 70 п. н. (позиции 389-320, база данных SnapGene snapgene.com) [29], вместо которого по тем же сайтам рестрикции NcoI и BamH I встраивали синтетически полученный фрагмент ДНК (ООО «Биосинтез», г. Новосибирск) следующей структуры:
Синтетический фрагмент ДНК для встройки в плазмиду pET15b был рассчитан таким образом, чтобы он содержал уникальные сайты рестрикции (подчеркнуты), которых нет ни в плазмиде pET15b, ни в генах N, Р и L вируса Сендай штамма Москва. Полученную плазмиду обозначили pET15b1.The synthetic DNA fragment for insertion into the pET15b plasmid was calculated in such a way that it contained unique restriction sites (underlined), which are absent neither in the pET15b plasmid, nor in the N, P, and L genes of the Sendai virus of the Moscow strain. The resulting plasmid was designated pET15b1.
Этап 2. Гены N, Р и L получали методом ОТ-ПЦР с использованием геномной РНК вируса Сендай штамма Москва в качестве матрицы и в качестве праймеров следующие олигонуклеотиды, представленные в таблице 2.
В результате были получены ДНК-копии генов N, Р и L вируса Сендай, которые рестриктазно-лигазным методом встраивали в плазмиду pET15b1 по соответствующим сайтам рестрикции с получением промежуточных плазмид pET15b-N1, pET15b-Р1 и pET15b-L1. Структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием.As a result, DNA copies of the N, P, and L genes of the Sendai virus were obtained, which were inserted into the pET15b1 plasmid at the corresponding restriction sites by the restriction ligase method to obtain intermediate plasmids pET15b-N1, pET15b-P1, and pET15b-L1. The structure of the obtained plasmids was confirmed by sequencing.
Этап 3. С целью оптимизации синтеза белков N, Р и L во вспомогательных плазмидах был проведен сайт-направленный мутагенез плазмид pET15b-N1, pET15b-Р1 и pET15b-L1 с использованием набора реактивов QC Lightning Multi (Agilent Technologies, Cat. 210516-5, USA). В результате мутагенеза были сделаны следующие изменения:
- в плазмиде pET15b-Р1 была произведена синонимичная замена С → А в 129-й позиции гена Р, при этом кодон TCG (сер) альтернативной рамки считывания (ген С) заменился на стоп-кодон TAG, что обеспечивает синтез только одного белкового продукта гена Р - полноразмерного Р белка [Leyrer, 1998] [31];- in the plasmid pET15b-P1, a synonymous substitution C → A was made in the 129th position of the P gene, while the TCG codon (ser) of the alternative reading frame (gene C) was replaced with the TAG stop codon, which ensures the synthesis of only one protein product of the gene P - full-length P protein [Leyrer, 1998] [31];
- так как перед встройкой каждого гена в плазмидах pET15b-N1, pET15b-Р1, pET15b-L1 находится сайт рестрикции Nco I (CCATGG), содержащий ATG-кодон, необходимо было внести в него замену для того, чтобы трансляция не могла начинаться с альтернативного старт-кодона. Последовательность CCATGG была заменена сайт-направленным мутагенезом на CCTAGG (сайт рестриктазы Avr II).- since before the insertion of each gene in plasmids pET15b-N1, pET15b-P1, pET15b-L1 there is a restriction site Nco I (CCATGG) containing an ATG codon, it was necessary to make a replacement in it so that translation could not start with an alternative start codon. The CCATGG sequence was replaced by site-directed mutagenesis with CCTAGG (Avr II restriction enzyme site).
Олигонуклеотиды, использованные для коррекции структуры плазмид методом сайт-направленного мутагенеза, представлены в таблице 3 ниже:The oligonucleotides used to correct the plasmid structure by site-directed mutagenesis are presented in Table 3 below:
Плазмиды после сайт-направленного мутагенеза (целевые) назвали соответственно pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L (Фиг. 1-3).Plasmids after site-directed mutagenesis (target) were named respectively pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L (Fig. 1-3).
Анализ экспрессии встроенных генов, проведенный на примере плазмиды pET15b-Р (Фиг. 4), показал высокий уровень продукции вспомогательных белков в культуре трансформированных клеток 293-Т7, конститутивно продуцирующих РНК-полимеразу фага Т7 (культура клеток 293-Т7 любезно предоставлена Кулемзиным С.В., ИМКБ СО РАН). Как следует из Фиг. 4, в лизатах клеток 293-Т7, трансфицированных плазмидой pET15b-Р, выявляется полноразмерный Р-белок вируса Сендай в виде мажорной полосы с молекулярной массой 79 кДа.An analysis of the expression of the inserted genes, carried out on the example of the plasmid pET15b-P (Fig. 4), showed a high level of production of auxiliary proteins in the culture of transformed 293-T7 cells constitutively producing phage T7 RNA polymerase (the 293-T7 cell culture was kindly provided by Kulemzin S. V., IMKB SB RAS). As follows from FIG. 4, in the lysates of 293-T7 cells transfected with the pET15b-P plasmid, the full-length Sendai virus P-protein is detected in the form of a major band with a molecular weight of 79 kDa.
Пример 2. Получение плазмид pSen2-MCS(N) и pSen2-MCS(M), содержащих полногеномные копии вирусной ДНК (Фиг. 5-8).Example 2. Obtaining plasmids pSen2-MCS(N) and pSen2-MCS(M) containing whole genome copies of viral DNA (Fig. 5-8).
Сборку копии ДНК геномной РНК вируса Сендай штамма Москва осуществляли в плазмиде pUC 19 в 6 этапов.The DNA copy of the genomic RNA of the Sendai virus strain Moscow was assembled in the plasmid pUC 19 in 6 steps.
Этап 1. В плазмиду pUC19 по сайтам NarI/BstI-SbfI встраивали синтетически полученный фрагмент ДНК (ООО «Биосинтез», г. Новосибирск), содержащий промотор РНК-полимеразы фага Т7 [Beaty, 2017] [1], фрагмент рибозима-молот [Beaty, 2017] [1], полилинкер, фрагмент ДНК-копии 3'-НТО генома вируса Сендай (позиции 15345-15384, GenBank Acc. КР717417), геномный рибозим вируса гепатита D [Perrotta, 1991] [34], терминатор РНК-полимеразы фага Т7 (позиции 260-213, база данных SnapGene snapgene.com) [29].
Структура синтетического фрагмента ДНК:Structure of a synthetic DNA fragment:
В результате получили плазмиду pUC19-Fr0 (Фиг. 5).As a result, plasmid pUC19-Fr0 was obtained (Fig. 5).
Этапы 2-4. Получение плазмид pUC19-Fr1, pUC19-Fr2 и pUC19-Fr3. Для сборки полногеномной последовательности геном вируса Сендай штамм Москва был разбит in silico на 3 стыкующихся фрагмента в направлении 5'→3': Fr1 - позиции 1-5128 п. н., GenBank Асс. КР717417; Fr2 - позиции 5129-9432 п. н., GenBank Асс. КР717417; Fr3 - позиции 9425-15384 п. н., GenBank Асс. КР717417. Позиции фрагментов были выбраны так, чтобы они не содержали сайтов рестрикции, используемых при их клонировании в плазмиду pUC19-Fr0, что позволяет собрать их воедино в этой плазмиде. Рассчитанные фрагменты получали методом ОТ-ПЦР с использованием в качестве матрицы РНК вируса Сендай штамма Москва и следующих пар праймеров: для фрагмента 1 (клонирование по сайтам рестриктаз XbaI - XmaI)Stages 2-4. Obtaining plasmids pUC19-Fr1, pUC19-Fr2 and pUC19-Fr3. To assemble the whole genome sequence, the genome of the Sendai virus strain Moscow was divided in silico into 3 joined fragments in the 5'→3' direction: Fr1 - positions 1-5128 bp, GenBank Ass. КР717417; Fr2 - positions 5129-9432 b.p., GenBank Ass. КР717417; Fr3 - positions 9425-15384 b.p., GenBank Ass. KR717417. The positions of the fragments were chosen so that they did not contain the restriction sites used when they were cloned into the plasmid pUC19-Fr0, which allows them to be assembled in this plasmid. The calculated fragments were obtained by RT-PCR using the RNA template of the Sendai virus strain Moscow and the following pairs of primers: for fragment 1 (cloning at XbaI - XmaI restriction sites)
В состав прямого праймера Fr1, кроме сайта рестриктазы XbaI, введена последовательность рибозима-молота и 5'-НТО генома вируса Сендай штамм Москва.In addition to the XbaI restriction enzyme site, the forward primer Fr1 contains the sequence of the hammerhead ribozyme and the 5'-UTR of the genome of the Sendai virus strain Moscow.
для фрагмента 2 (клонирование по сайтам рестриктаз SpeI - SphI)for fragment 2 (cloning at SpeI - SphI restriction sites)
для фрагмента 3 (клонирование по сайтам рестриктаз XmaI-SbfI)for fragment 3 (cloning at XmaI-SbfI restriction sites)
В плазмиду pUC19-Fr0 рестриктазно-лигазным методом встраивали три фрагмента генома вируса Сендай, полученных после ОТ-ПЦР, соответственно по сайтам рестрикции XbaI-XmaI, XbaI/Spel-SphI, XmaI-SbfI и получили три плазмиды: pUC19-Fr1, pUC19-Fr2, pUC19-Fr3 (Фиг. 5). Структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием.Three fragments of the Sendai virus genome obtained after RT-PCR were inserted into the plasmid pUC19-Fr0 by the restriction ligation method, respectively, at the restriction sites XbaI-XmaI, XbaI/Spel-SphI, XmaI-SbfI and three plasmids were obtained: pUC19-Fr1, pUC19- Fr2, pUC19-Fr3 (Fig. 5). The structure of the obtained plasmids was confirmed by sequencing.
Этапы 5-6. Сборка плазмиды pSen2. На 5 этапе в плазмиду pUC19-Fr1 по сайтам XmaI-SwaI переносили фрагмент XmaI-StuI из плазмиды pUC19-Fr3, в результате чего получили плазмиду pUC19-Fr13 (Фиг. 5). На этапе 6 в плазмиду pUC19-Fr13 по сайтам SmaI-PspXI переносили фрагмент ScaI-PspXI из плазмиды pUC19-Fr3 с получением плазмиды pSen2. Структуру генома вируса Сендай штамма Москва в плазмиде pSen2 подтверждали секвенированием.Stages 5-6. Assembly of plasmid pSen2. At
Для конструирования рекомбинантных вариантов вируса Сендай штамм Москва, несущих в своем геноме встройку чужеродных генов (трансгенов), необходимо получить плазмиду, аналогичную pSen2, но имеющую в местах встройки полилинкер из уникальных сайтов рестрикции (multiple cloning site - MCS). В качестве мест для встройки полилинкера использовали две области: перед геном N (3'-НТО) и перед геном М (межгенный промежуток Р-М). После полилинкера (MCS) в районы встройки должны быть также введены сигнальные последовательности терминации и реинициации транскрипции РНК-полимеразы вируса Сендай, чтобы обеспечить жизнеспособность рекомбинантного варианта вируса. Расчетные схемы плазмид pSen2-MCS(N) и pSen2-MCS(M) для конструирования рекомбинантных вариантов вируса Сендай штамма Москва, представлены на Фиг. 6. Поскольку оба района для встройки трансгенов расположены в плазмиде pUC19-Fr1 (Фиг. 5), все генно-инженерные процедуры по получению плазмид pSen2-MCS(N) и pSen2-MCS(M) удобнее проводить именно с плазмидой pUC19-Fr1 (7913 п. н.), чем с существенно большей по размеру pSen2 (18118 п. н.).To construct recombinant variants of the Sendai virus, strain Moscow, carrying an insertion of foreign genes (transgenes) in their genome, it is necessary to obtain a plasmid similar to pSen2, but having a polylinker from unique restriction sites (multiple cloning site, MCS) in the insertion sites. Two regions were used as sites for insertion of the polylinker: upstream of the N gene (3'-UTR) and upstream of the M gene (intergenic P-M gap). After the polylinker (MCS), the termination and transcriptional reinitiation signal sequences for the Sendai virus RNA polymerase must also be introduced into the insertion regions to ensure the viability of the recombinant variant of the virus. The calculation schemes of plasmids pSen2-MCS(N) and pSen2-MCS(M) for constructing recombinant variants of the Sendai virus of the Moscow strain are shown in Fig. 6. Since both regions for the insertion of transgenes are located in the pUC19-Fr1 plasmid (Fig. 5), it is more convenient to carry out all genetic engineering procedures for obtaining pSen2-MCS(N) and pSen2-MCS(M) plasmids with the pUC19-Fr1 plasmid ( 7913 bp) than with a significantly larger pSen2 (18118 bp).
Проведенный in silico анализ структуры генома вируса Сендай штамма Москва в плазмиде pSen2 показал, что в состав полилинкера могут быть введены такие уникальные сайты рестриктаз, как BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII. Встройка полилинкера и сигнальных последовательностей перед геном TV (MCS(N)) и перед геном М (MCS(M)) может быть проведена с использованием рестриктаз PspOMI-BsiWI и MluI-PspOMI в соответствующие районы плазмиды pUC19-Fr1 после их сайт-направленного мутагенеза. Для проведения сайт-направленного мутагенеза были рассчитаны следующие олигонуклеотиды:The in silico analysis of the genome structure of the Sendai virus of the Moscow strain in the pSen2 plasmid showed that such unique restriction enzyme sites as BsiWI, NruI, ClaI, AscI, and BssHII can be introduced into the polylinker. Insertion of the polylinker and signal sequences upstream of the TV gene (MCS(N)) and upstream of the M gene (MCS(M)) can be carried out using the PspOMI-BsiWI and MluI-PspOMI restriction enzymes into the corresponding regions of the pUC19-Fr1 plasmid after their site-directed mutagenesis . The following oligonucleotides were calculated for site-directed mutagenesis:
Сайт-направленный мутагенез проводили, как и в Примере 1, с использованием набора реактивов QC Lightning Multi (Agilent Technologies, Cat. 210516-5, USA). Пошаговая схема сайт-направленного мутагенеза и последующей встройки полилинкера и сигнальных последовательностей перед генами N и М в плазмиде pUC19-Fr1 приведена ниже:Site directed mutagenesis was performed as in Example 1 using the QC Lightning Multi kit (Agilent Technologies, Cat. 210516-5, USA). A step-by-step scheme of site-directed mutagenesis and subsequent insertion of a polylinker and signal sequences upstream of the N and M genes in the pUC19-Fr1 plasmid is shown below:
Получение плазмиды pUC19-Fr1-MCS(N) (модифицированный участок)Preparation of plasmid pUC19-Fr1-MCS(N) (modified region)
Далее по сайтам рестрикции PspOMI и BsiWI был встроен синтетический фрагмент ДНК:Next, a synthetic DNA fragment was inserted at the PspOMI and BsiWI restriction sites:
После встройки этого фрагмента ДНК задействованные сайты рестрикции PspOMI и BsiWI в плазмиде pUC19-Fr1-MCS(N) нивелируются:After the insertion of this DNA fragment, the involved restriction sites PspOMI and BsiWI in the plasmid pUC19-Fr1-MCS(N) are leveled:
Получение плазмиды pUC19-Fr1-MCS(M) (модифицированный участок)Preparation of plasmid pUC19-Fr1-MCS(M) (modified region)
Далее по сайтам рестрикции MluI и PspOMI был встроен синтетический фрагмент ДНК:Next, a synthetic DNA fragment was inserted into the MluI and PspOMI restriction sites:
После встройки этого фрагмента ДНК задействованные сайты рестрикции MluI и PspOMI в плазмиде pUC19-Fr1-MCS(M) нивелируются:After the insertion of this DNA fragment, the MluI and PspOMI restriction sites involved in the pUC19-Fr1-MCS(M) plasmid are leveled:
Плазмида pUC19-Fr1-MCS(N) использовалась для сборки плазмиды pSen2-MCS(N), содержащей полногеномную ДНК копию вируса Сендай штамма Москва, в соответствии с вышеописанными Этапами 5-6 сборки плазмиды pSen2 (вместо плазмиды pUC19-Fr1). Аналогично использовалась плазмида pUC19-Fr1-MCS(M) для сборки геномной плазмиды pSen2-MCS(M). Структуры рекомбинантных плазмидных ДНК pSen2-MCS(N) и pSen2-MCS(M) представлены на Фиг. 7 и 8, соответственно.The pUC19-Fr1-MCS(N) plasmid was used to assemble the pSen2-MCS(N) plasmid containing a genome-wide DNA copy of the Sendai virus strain Moscow, according to steps 5-6 above to assemble the pSen2 plasmid (instead of the pUC19-Fr1 plasmid). Similarly, the plasmid pUC19-Fr1-MCS(M) was used to assemble the genomic plasmid pSen2-MCS(M). The structures of the recombinant plasmid DNA pSen2-MCS(N) and pSen2-MCS(M) are shown in FIG. 7 and 8, respectively.
Пример 3. Конструирование рекомбинантных вариантов вируса Сендай штамм Москва, содержащих встройку модельного трансгена EGFP (Фиг. 9).Example 3. Construction of recombinant variants of the Sendai virus, Moscow strain, containing the insertion of the model EGFP transgene (Fig. 9).
Трансген EGFP получали методом ПНР с использованием в качестве матрицы плазмиды pEGFP-N1 [33] и олигонуклеотидных праймеров:The EGFP transgene was obtained by the NDP method using the pEGFP-N1 plasmid as a template [33] and oligonucleotide primers:
Встройку трансгена EGFP проводили рестриктазно-лигазным методом в полилинкер плазмид pSen2-MCS(N) и pSen2-MCS(M) по сайтам рестриктаз BsiWI и BssHII. В результате были получены геномные плазмиды pSen2-EGFP(N) и pSen2-EGFP(M).The EGFP transgene was inserted by the restriction ligation method into the polylinker of the pSen2-MCS(N) and pSen2-MCS(M) plasmids at the BsiWI and BssHII restriction sites. As a result, genomic plasmids pSen2-EGFP(N) and pSen2-EGFP(M) were obtained.
Для оживления рекомбинантных вариантов вируса Сендай штамм Москва использовали культуру клеток 293-Т7, продуцирующую РНК-полимеразу фага Т7 (можно использовать любую культуру клеток эукариот, рекомбинантную или трансформированную, которая продуцирует РНК-полимеразу фага Т7). 80%-ный монослой клеток 293-Т7, выращенный в 6-ти луночном планшете, инфицировали вирусом MVA-T7 с множественностью 10 инфекционных единиц/клетка и через час трансфицировали смесью плазмидных ДНК (по 5 мкг каждой) с реагентом Lipofectamine™ LTX Plus (Invitrogen, Cat. 15338).To revive the recombinant variants of the Sendai virus strain Moscow, a 293-T7 cell culture producing T7 phage RNA polymerase was used (any eukaryotic cell culture, recombinant or transformed, that produces T7 phage RNA polymerase can be used). An 80% monolayer of 293-T7 cells grown in a 6-well plate was infected with MVA-T7 virus at a multiplicity of 10 infectious units/cell and transfected an hour later with a mixture of plasmid DNA (5 μg each) with the Lipofectamine™ LTX Plus reagent ( Invitrogen, Cat. 15338).
Использовали два типа смеси:Two types of mixture were used:
1) геномная плазмида pSen2-EGFP(N) + три вспомогательных плазмиды pET15b-N, pET15b-P и pET15b-L;1) genomic plasmid pSen2-EGFP(N) + three auxiliary plasmids pET15b-N, pET15b-P and pET15b-L;
2) геномная плазмида pSen2-EGFP(M) + три вспомогательных плазмиды pET15b-N, pET15b-P и pET15b-L;2) genomic plasmid pSen2-EGFP(M) + three auxiliary plasmids pET15b-N, pET15b-P and pET15b-L;
Для контроля оживления немодифицированного вируса Сендай использовали смесь плазмид pSen2, pET15b-N, pET15b-P и pET15b-L (Фиг. 9А). Для контроля EGFP флюоресценции использовали плазмиду pEGFP-N1 [33]. В плазмиде pEGFP-N1 ген EGFP экспрессируется под контролем CMV промотора независимо от наличия в клетках РНК-полимеразы фага Т7 и индуцирует интенсивную флюоресценцию трансформированных клеток (Фиг. 9Б).A mixture of pSen2, pET15b-N, pET15b-P, and pET15b-L plasmids was used to control resuscitation of the unmodified Sendai virus (FIG. 9A). The pEGFP-N1 plasmid was used to control EGFP fluorescence [33]. In the pEGFP-N1 plasmid, the EGFP gene is expressed under the control of the CMV promoter, regardless of the presence of T7 phage RNA polymerase in the cells and induces intense fluorescence of the transformed cells (Fig. 9B).
Через 48 часов инкубации (37°С, 5% СО2) трансфицированные клетки анализировали на микроскопе «Axiovert» 40 CFL ZEISS с использованием светофильтров для зеленой люминесценции. Как следует из Фиг. 9А, в клетках, трансфицированных смесью плазмид pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L и pSen2, наблюдается характерный для вируса Сендай цитопатический эффект (округлившиеся клетки, синцитии) в световом поле, но отсутствует флюоресценция. Наличие цитопатического эффекта свидетельствует об оживлении вируса Сендай штамма Москва с геномной плазмиды pSen2. На Фиг. 9 В представлены интактные нетрансфицированные клетки 293-Т7 (отрицательный контроль). Как следует из сравнения Фиг. 9Г и Фиг. 9Д, сконструированный нами набор рекомбинантных плазмидных ДНК обеспечивает создание рекомбинантных вариантов вируса Сендай штамма Москва, при этом уровень экспрессии трансгена рекомбинантом Sen2-EGFP(N) выше (более интенсивная флюоресценция), чем рекомбинантом Sen2-EGFP(M), что соответствует высказанным нами ранее предположениям о зависимости уровня экспрессии трансгена от близости к 3'-концу генома.After 48 hours of incubation (37° C., 5% CO 2 ), the transfected cells were analyzed on an Axiovert 40 CFL ZEISS microscope using green luminescence filters. As follows from FIG. 9A, in cells transfected with a mixture of plasmids pET15b-N, pET15b-P, pET15b-L and pSen2, a cytopathic effect characteristic of the Sendai virus (rounded cells, syncytia) is observed in the light field, but there is no fluorescence. The presence of a cytopathic effect indicates the revival of the Sendai virus of the Moscow strain from the pSen2 genomic plasmid. On FIG. 9B shows intact non-transfected 293-T7 cells (negative control). As follows from the comparison of Fig. 9D and FIG. 9E, the set of recombinant plasmid DNA we designed ensures the creation of recombinant variants of the Sendai virus of the Moscow strain, while the level of transgene expression by the Sen2-EGFP(N) recombinant is higher (more intense fluorescence) than by the Sen2-EGFP(M) recombinant, which corresponds to what we said earlier. assumptions about the dependence of the level of transgene expression on proximity to the 3'-end of the genome.
Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получать рекомбинантные варианты вируса Сендай штамма Москва со встройкой и экспрессией трансгенов в 3'-нетранслируемой области генома перед геном N и в межгенном промежутке Р-М перед геном М. В качестве трансгенов могут быть использованы противоопухолевые белки или протективно-значимые антигены патогенных агентов, с целью разработки на их основе противоопухолевых лекарственных средств и векторных вакцин против инфекционных заболеваний.Thus, the claimed technical solution makes it possible to obtain recombinant variants of the Sendai virus of the Moscow strain with the insertion and expression of transgenes in the 3'-untranslated region of the genome before the N gene and in the P-M intergenic gap before the M gene. Antitumor proteins or protective agents can be used as transgenes. - significant antigens of pathogenic agents, in order to develop anticancer drugs and vector vaccines against infectious diseases on their basis.
Источники научно-технической и патентной информацииSources of scientific, technical and patent information
1. Beaty S.M. et al. Efficient and robust Paramyxoviridae reverse genetics systems // mSphere. - 2017. - Vol.2. - No. 2. - e00376-16. Doi: 10.1128/mSphere.00376-16.1. Beaty S.M. et al. Efficient and robust Paramyxoviridae reverse genetic systems // mSphere. - 2017. - Vol.2. - No. 2.-e00376-16. Doi: 10.1128/mSphere.00376-16.
2. Zainutdinov S.S. et al. Complete genome sequence of Sendai virus oncolytic strain Moscow. // Genome Announcements. - 2016. - Vol.4. - No. 4. - e00818-16. Doi: 10.1128/genomeA.00818-16.2. Zainutdinov S.S. et al. Complete genome sequence of Sendai virus oncolytic strain Moscow. // Genome Announcements. - 2016. - Vol.4. - No. 4.-e00818-16. Doi: 10.1128/genomeA.00818-16.
3. Matveeva O.V. et al. Mechanisms of oncolysis by paramyxovirus Sendai. // Acta Naturae. - 2015. - Vol.7. - No. 2. - P. 6-16. PMID: 26085940.3. Matveeva O.V. et al. Mechanisms of oncolysis by paramyxovirus Sendai. // Acta Naturae. - 2015. - Vol.7. - No. 2. - P. 6-16. PMID: 26085940.
4. Russell C.J., Hurwitz J.L. Sendai virus-vectored vaccines that express envelope glycoproteins of respiratory viruses. // Viruses. - 2021. - Vol.13. No. 6: 1023. Doi: 10.3390/V13061023.4. Russell C.J., Hurwitz J.L. Sendai virus-vectored vaccines that express envelope glycoproteins of respiratory viruses. // Viruses. - 2021. - Vol.13. no. 6:1023. Doi: 10.3390/V13061023.
5. Adderson E. et al. Safety and immunogenicity of an intranasal Sendai virus-based human parainfluenza virus type 1 vaccine in 3- to 6-year-old children. // Clinical and Vaccine Immunology. - 2015. - V. 22. - No. 3. Doi: 10.1128/CVI.00618-145. Adderson E. et al. Safety and immunogenicity of an intranasal Sendai virus-based human
6. Huang F.S. et al. Safety and immunogenicity of an intranasal Sendai virus-based vaccine for human parainfluenza virus type I and respiratory syncytial virus (SeVRSV) in adults. // Hum. Vaccin. Immunother. - 2021. - Vol.17. - No. 2. - P. 554-559. Doi: 10.1080/21645515.2020.1779517.6. Huang F.S. et al. Safety and immunogenicity of an intranasal Sendai virus-based vaccine for human parainfluenza virus type I and respiratory syncytial virus (SeVRSV) in adults. // Hum. Vaccin. Immunother. - 2021. - Vol.17. - No. 2. - P. 554-559. Doi: 10.1080/21645515.2020.1779517.
7. Nyombaire J. et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of an intranasally administered replication-competent Sendai virus-vectored HIV type 1 Gag vaccine: induction of potent T-cell or antibody responses in prime-boost regimens. // J. Infect. Dis. - 2017. - Vol.215. - No. 1. - P 95-104. Doi: 10.1093/infdis/iiw500.7. Nyombaire J. et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of an intranasally administered replication-competent Sendai virus-vectored
8. Russell C.J. et al. A Sendai virus recombinant vaccine expressing a gene for truncated human metapneumovirus (hMPV) fusion protein protects cotton rats from hMPV challenge. // Virology. - 2017. - Vol.509. - P. 60-66. Doi: 10.1016/i.virol.2017.05.021.8 Russell C.J. et al. A Sendai virus recombinant vaccine expressing a gene for truncated human metapneumovirus (hMPV) fusion protein protects cotton rats from hMPV challenge. // Virology. - 2017. - Vol.509. - P. 60-66. Doi: 10.1016/i.virol.2017.05.021.
9. Зайчук T.A. и др. Проблемы создания вакцин против бетакоронавирусов: антителозависимое усиление инфекции и вирус Сендай как возможный вакцинный вектор // Молекулярная биология. - 2020. - Т. 54. - №6. - С.922-938. https://doi.Org/l0.31857/S0026898420060154.9. Zaichuk T.A. Problems of creating vaccines against betacoronaviruses: antibody-dependent enhancement of infection and the Sendai virus as a possible vaccine vector // Molecular Biology. - 2020. - T. 54. - No. 6. - S.922-938. https://doi.org/l0.31857/S0026898420060154.
10. Matveeva O.V. et al. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficiency. // Mol. Ther. Oncolytics. - 2015. - Vol.2: 15011. doi: 10.1038/mto.2015.11.10. Matveeva O.V. et al. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficiency. // Mol. Ther. Oncolytics. - 2015. - Vol.2: 15011. doi: 10.1038/mto.2015.11.
11. Zimmermann M. et al. Attenuated and protease-profile modified Sendai virus vectors as a new tool for virotherapy of solid tumors. // Plos One. - 2014. - Vol.9. -No. 3. e90508. Doi: 10.137l/iournal.pone.0090508.11. Zimmermann M. et al. Attenuated and protease-profile modified Sendai virus vectors as a new tool for virotherapy of solid tumors. // Plos One. - 2014. - Vol.9. -No. 3. e90508. Doi: 10.137l/iournal.pone.0090508.
12. Kinoh H. et al. Generation of a recombinant Sendai virus that is selectively activated and lyses human tumor cells expressing matrix metalloproteinases.// Gene Ther.-2004. - Vol.11.-P. 1137-1145. Doi:: 10.1038/si.gt.3302272..12. Kinoh H. et al. Generation of a recombinant Sendai virus that is selectively activated and lyses human tumor cells expressing matrix metalloproteinases.// Gene Ther.-2004. - Vol.11.-P. 1137-1145. Doi:: 10.1038/si.gt.3302272..
13. Iwadate Y. et al. Recombinant Sendai virus vector induces complete remission of established brain tumors through efficient interleukin-2 gene transfer in vaccinated rats. // Clin. Cancer. Res. - 2005. - Vol.11. - No. 10. - P. 3821-3827. Doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-1485.13. Iwadate Y. et al. Recombinant Sendai virus vector induces complete remission of established brain tumors through efficient interleukin-2 gene transfer in vaccinated rats. // clinic. cancer. Res. - 2005. - Vol.11. - No. 10. - P. 3821-3827. Doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-1485.
14. Kinoh H. and Inoue M. New cancer therapy using genetically-engineered oncolytic Sendai virus vector. // Front. Biosci. - 2008. - Vol.13. - P. 2327-2334. Doi: 10.2741/2847.14. Kinoh H. and Inoue M. New cancer therapy using genetically-engineered oncolytic Sendai virus vector. // front. biosci. - 2008. - Vol.13. - P. 2327-2334. Doi: 10.2741/2847.
15. Tatsuta K. et al. Complete elimination of established neuroblastoma by synergistic action of gamma-irradiation and DCs treated with rSeV expressing interferon-beta gene. // Gene Ther. - 2009. - Vol.16. - P. 240-251. Doi: 10.1038/gt.2008.16115. Tatsuta K. et al. Complete elimination of established neuroblastoma by synergistic action of gamma-irradiation and DCs treated with rSeV expressing interferon-beta gene. // Gene Ther. - 2009. - Vol.16. - P. 240-251. Doi: 10.1038/gt.2008.161
16. Yonemitsu Y. et al. Immunostimulatory virotherapy using recombinant Sendai virus as a new cancer therapeutic regimen. // Front Biosci. - 2008. - Vol.13. - P. 1892-1898. Doi: 10.2741/2809.16 Yonemitsu Y. et al. Immunostimulatory virotherapy using recombinant Sendai virus as a new cancer therapeutic regimen. // Front Biosci. - 2008. - Vol.13. - P. 1892-1898. Doi: 10.2741/2809.
17. Tanaka Y. et al. Oncolytic Sendai virus-induced tumor-specific immunoresponses suppress "simulated metastasis" of squamous cell carcinoma in an immunocompetent mouse model". // Head & Neck. - 2019. - Vol.41. - No. 6. - P. 1676-1686. Doi:10.1002/hed.25642.17. Tanaka Y. et al. Oncolytic Sendai virus-induced tumor-specific immunoresponses suppress "simulated metastasis" of squamous cell carcinoma in an immunocompetent mouse model". // Head & Neck. - 2019. - Vol.41. - No. 6. - P. 1676-1686 Doi:10.1002/hed.25642.
18. Kurooka M. and Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells. // Cancer Res. -2007. Vol.67. No. 1. - P. 227-236. Doi: 10.1158/0008-5472.CAN-06-1615.18. Kurooka M. and Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells. // Cancer Res. -2007. Vol.67. no. 1. - P. 227-236. Doi: 10.1158/0008-5472.CAN-06-1615.
19. Kawano H. et al. A new therapy for highly effective tumor eradication using HVJ-E combined with chemotherapy. // BMC Medicine. - 2007. - Vol.5: 28. Doi: 10.1186/1741-7015-5-2819. Kawano H. et al. A new therapy for highly effective tumor eradication using HVJ-E combined with chemotherapy. // BMC Medicine. - 2007. - Vol.5: 28. Doi: 10.1186/1741-7015-5-28
20. Kawano H. et al. New potential therapy for orthotopic bladder carcinoma by combining HVJ envelope with doxorubicin. Cancer Chemother. Pharmacol. // 2008. - Vol.61. - No. 6. - P. 973-978. Doi: 10.1007/s00280-007-0553-1.20. Kawano H. et al. New potential therapy for orthotopic bladder carcinoma by combining HVJ envelope with doxorubicin. Cancer Chemother. Pharmacol. // 2008. - Vol.61. - No. 6. - P. 973-978. Doi: 10.1007/s00280-007-0553-1.
21. Fujihara A. et al. Intratumoral injection of inactivated Sendai virus particles elicits strong antitumor activity by enhancing local CXCL10 expression and systemic NK cell activation. // Cancer Immunol. Immunother. - 2008. - Vol.57. -No. 1. - P. 73-84. Doi: 10.1007/s00262-007-0351-y.21. Fujihara A. et al. Intratumoral injection of inactivated Sendai virus particles elicits strong antitumor activity by enhancing local CXCL10 expression and systemic NK cell activation. // Cancer Immunol. Immunother. - 2008. - Vol.57. -No. 1. - P. 73-84. Doi: 10.1007/s00262-007-0351-y.
22. Hui G. et al. Induction of apoptosis in hormone-resistant human prostate cancer PC3 cells by inactivated Sendai virus. // Biomed. Environ. Sci. - 2014. - Vol.27. -No. 7. - P. 506-514. Doi: 10.3967/bes2014.082.22. Hui G. et al. Induction of apoptosis in hormone-resistant human prostate cancer PC3 cells by inactivated Sendai virus. // Biomed. Environ. sci. - 2014. - Vol.27. -No. 7. - P. 506-514. Doi: 10.3967/bes2014.082.
23. Kiyohara E. et al. Intratumoral injection of hemagglutinating virus of Japan-envelope vector yielded an antitumor effect for advanced melanoma: a phase I/IIa clinical study. // Cancer Immunology, Immunotherapy. - 2020. - Vol.69. - P. 1131-1140. Doi: 10.1007/s00262-020-02509-8.23 Kiyohara E. et al. Intratumoral injection of hemagglutinating virus of Japan-envelope vector yielded an antitumor effect for advanced melanoma: a phase I/IIa clinical study. // Cancer Immunology, Immunotherapy. - 2020. - Vol.69. - P. 1131-1140. Doi: 10.1007/s00262-020-02509-8.
24. Matveeva O.V. et al. Oncolysis by paramyxoviruses: preclinical and clinical studies. // Mol. Ther. Oncolytics. - 2015. - Vol.2: 150017. Doi: 10.1038/mto.2015.17.24. Matveeva O.V. et al. Oncolysis by paramyxoviruses: preclinical and clinical studies. // Mol. Ther. Oncolytics. - 2015. - Vol.2: 150017. Doi: 10.1038/mto.2015.17.
25. Сенин В. и др. Метод иммунотерапии онкологических заболеваний и фармацевтические композиции на основе вируса Сендай. // РФ патент №2519763. Опубликован 26.06.2014. Бюл. №17.25. Senin V. et al. Cancer immunotherapy method and pharmaceutical compositions based on the Sendai virus. // RF patent No. 2519763. Published on 06/26/2014. Bull. No. 17.
26. Ilyinskaya G.V. et al. Oncolytic Sendai Virus Therapy of Canine Mast Cell Tumors (A Pilot Study).// Front. Vet. Sci. - 2018. - Vol.5: 116. Doi: 10.3389/fvets.2018.00116.26. Ilyinskaya G.V. et al. Oncolytic Sendai Virus Therapy of Canine Mast Cell Tumors (A Pilot Study).// Front. Vet. sci. - 2018. - Vol.5: 116. Doi: 10.3389/fvets.2018.00116.
27. Hurwitz J.L. at al. Modified Sendai virus vaccine and imaging vector. Patent US9637758B2. - 2018.27. Hurwitz, J.L. at al. Modified Sendai virus vaccine and imaging vector. Patent US9637758B2. - 2018.
28. Makowska D.O. et al. Engineering of live chimeric vaccines against human metapneumovirus. // Pathogens. - 2020. - Vol.9. - No. 2:135. Doi: 10.3390/pathogens9020135.28. Makowska D.O. et al. Engineering of live chimeric vaccines against human metapneumovirus. // Pathogens. - 2020. - Vol.9. - No. 2:135. Doi: 10.3390/pathogens9020135.
29. https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=pet_and_duet_vectors_(novagen) &plasmid=pET-15b29. https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=pet_and_duet_vectors_(novagen) &plasmid=pET-15b
30. https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors& plasmid=pUC1930. https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors& plasmid=pUC19
31. Leyrer S. et al. Rapid and efficient recovery of Sendai virus from cDNA: factors influencing recombinant virus rescue. // J. Virol. Methods. - 1998. - Vol.75. - No. 1. - P. 47-58. Doi: 10.1016/s0166-0934(98)00095-0.31. Leyrer S. et al. Rapid and efficient recovery of Sendai virus from cDNA: factors influencing recombinant virus rescue. // J. Virol. methods. - 1998. - Vol.75. - No. 1. - P. 47-58. Doi: 10.1016/s0166-0934(98)00095-0.
32. Matsumoto Y. et al. The control of paramyxovirus genome hexamer length and mRNA editing. // RNA. - 2018. - Vol.24. - P. 461-467. Doi: 10.1261/rna.065243.11732. Matsumoto Y. et al. The control of paramyxovirus genome hexamer length and mRNA editing. //RNA. - 2018. - Vol.24. - P. 461-467. Doi: 10.1261/rna.065243.117
33. https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=fluorescent_protein_genes_and_plasmids&plasmid=pEGFP-N133. https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=fluorescent_protein_genes_and_plasmids&plasmid=pEGFP-N1
34. Perrotta A.T. and Been M.D. A pseudoknot-like structure required for efficient self-cleavage of hepatitis delta virus RNA. // Nature. - 1991. - Vol.350. - No. 6317. - P. 434-436. Doi: 10.1038/350434a0.34. Perrotta A.T. and Been M.D. A pseudoknot-like structure required for efficient self-cleavage of hepatitis delta virus RNA. // Nature. - 1991. - Vol.350. - No. 6317. - P. 434-436. Doi: 10.1038/350434a0.
Claims (10)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787724C1 true RU2787724C1 (en) | 2023-01-12 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8741650B2 (en) * | 2004-01-22 | 2014-06-03 | Dnavec Research Inc. | Methods for producing minus-strand RNA viral vectors using hybrid promoter comprising cytomegalovirus enhancer and chicken β-actin promoter |
| RU2662916C1 (en) * | 2017-06-05 | 2018-07-31 | Общество с ограниченной ответственностью "Альтернативные Инновационные Технологии" | Method of treating metastatic cancer using sendai virus |
| RU2742993C2 (en) * | 2015-05-15 | 2021-02-12 | Куревак Аг | Prime-boost modes involving introduction of at least one mrna structure |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8741650B2 (en) * | 2004-01-22 | 2014-06-03 | Dnavec Research Inc. | Methods for producing minus-strand RNA viral vectors using hybrid promoter comprising cytomegalovirus enhancer and chicken β-actin promoter |
| RU2742993C2 (en) * | 2015-05-15 | 2021-02-12 | Куревак Аг | Prime-boost modes involving introduction of at least one mrna structure |
| RU2662916C1 (en) * | 2017-06-05 | 2018-07-31 | Общество с ограниченной ответственностью "Альтернативные Инновационные Технологии" | Method of treating metastatic cancer using sendai virus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ge et al. | Newcastle disease virus-vectored rabies vaccine is safe, highly immunogenic, and provides long-lasting protection in dogs and cats | |
| Zhao et al. | Newcastle disease virus (NDV) recombinants expressing infectious laryngotracheitis virus (ILTV) glycoproteins gB and gD protect chickens against ILTV and NDV challenges | |
| Pfaller et al. | Reverse genetics of Mononegavirales: How they work, new vaccines, and new cancer therapeutics | |
| Kumar et al. | Evaluation of the Newcastle disease virus F and HN proteins in protective immunity by using a recombinant avian paramyxovirus type 3 vector in chickens | |
| Shinya et al. | Characterization of a neuraminidase-deficient influenza a virus as a potential gene delivery vector and a live vaccine | |
| KR100992235B1 (en) | Recombinant newcastle disease virus rna expression systems and virus | |
| JP5679620B2 (en) | Replication-deficient RNA-virus as a vaccine | |
| Bitzer et al. | Sendai virus vectors as an emerging negative‐strand RNA viral vector system | |
| WO2000053786A1 (en) | Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses | |
| US20210205436A1 (en) | Recombinant mopeia virus and vaccine platform | |
| JP2009529861A (en) | Recombinant Newcastle disease virus expressing avian influenza virus H5 hemagglutinin | |
| Engel-Herbert et al. | Characterization of a recombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein | |
| Li et al. | A recombinant canine distemper virus expressing a modified rabies virus glycoprotein induces immune responses in mice | |
| Gao et al. | Expression of transgenes from Newcastle disease virus with a segmented genome | |
| EP4176049A1 (en) | Recombinant enteroviruses and uses thereof | |
| JP2005518209A (en) | Recombinant minus-strand viral RNA expression system and vaccine | |
| RU2787724C1 (en) | Set of recombinant plasmid dna for obtaining recombinant viruses sendai strain moscow (options) | |
| Wang et al. | Attenuate Newcastle disease virus by codon modification of the glycoproteins and phosphoprotein genes | |
| JP2022523157A (en) | Chimeric RSV and hMPV F proteins, immunogenic compositions, and methods of use | |
| JPWO2010113647A1 (en) | Vector using Borna disease virus and use thereof | |
| CN106063932A (en) | Use Sendai virus as the anti-mycobacterium tuberculosis vaccine of carrier | |
| US20110027308A1 (en) | Compositions and methods for preventing influenza infection in canines, felines and equines | |
| WO2021229270A1 (en) | Recombinant vaccine against covid-19 in a viral vector | |
| US20210275662A1 (en) | Method for rescuing and producing a virus in avian cells | |
| Masoud et al. | Engineered Newcastle disease virus expressing the haemagglutinin protein of H9N2 confers protection against challenge infections in chickens |