RU2787103C1 - Method for obtaining a medicinal substance from amur velvet leaves - Google Patents
Method for obtaining a medicinal substance from amur velvet leaves Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787103C1 RU2787103C1 RU2022122629A RU2022122629A RU2787103C1 RU 2787103 C1 RU2787103 C1 RU 2787103C1 RU 2022122629 A RU2022122629 A RU 2022122629A RU 2022122629 A RU2022122629 A RU 2022122629A RU 2787103 C1 RU2787103 C1 RU 2787103C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aqueous
- flacoside
- obtaining
- amur
- ethyl acetate
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 19
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 26
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 23
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 15
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000972672 Phellodendron Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000005712 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241001093501 Rutaceae Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L na2so4 Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 abstract description 11
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000001929 anti-hepatotoxic Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 abstract description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 abstract description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005039 chemical industry Methods 0.000 abstract 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930003935 flavonoids Natural products 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 3
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- XZTYGFHCIAKPGJ-UHFFFAOYSA-N Meclofenoxate Chemical compound CN(C)CCOC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1 XZTYGFHCIAKPGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 229930003939 flavanonols Natural products 0.000 description 2
- -1 flavonoid glucoside Chemical class 0.000 description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 208000002353 Alcoholic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- BXWVSGUITWLTOD-CABCVRRESA-N Amurensine Chemical compound CN([C@H](C1=C2)CC=3C=C(C(=CC=33)O)OC)C[C@H]3C1=CC1=C2OCO1 BXWVSGUITWLTOD-CABCVRRESA-N 0.000 description 1
- HDQHRTXBXYQUNW-CABCVRRESA-N Amurensine Natural products O(C)c1c(O)cc2[C@H]3c4c(cc5OCOc5c4)C[C@H](N(C)C3)c2c1 HDQHRTXBXYQUNW-CABCVRRESA-N 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N Berberine Chemical compound C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093265 Berberine Drugs 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015281 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004392 Genitalia Anatomy 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 208000006454 Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000005252 Hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 206010019728 Hepatitis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes Zoster Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000009503 Leukemia, Erythroblastic, Acute Diseases 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N N'-amino-N-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- GRDZTDZJQRPNCN-YIANMRPHSA-N Phellamurin Chemical compound O([C@@H]([C@@H](O)C(=O)C=1C(O)=C2)C=3C=CC(O)=CC=3)C=1C(CC=C(C)C)=C2O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GRDZTDZJQRPNCN-YIANMRPHSA-N 0.000 description 1
- 241000972673 Phellodendron amurense Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 206010040490 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002385 Streptomycin Sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloids Natural products 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229930015400 berberine Natural products 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 201000006082 chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 230000001989 choleretic Effects 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 150000002210 flavanonols Chemical class 0.000 description 1
- 235000021285 flavonoid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective Effects 0.000 description 1
- 239000000399 hydroalcoholic extract Substances 0.000 description 1
- UCNNJGDEJXIUCC-UHFFFAOYSA-L hydroxy(oxo)iron;iron Chemical compound [Fe].O[Fe]=O.O[Fe]=O UCNNJGDEJXIUCC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000009673 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 201000005505 measles Diseases 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 239000005445 natural product Substances 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- QUCQEUCGKKTEBI-UHFFFAOYSA-N palmatine Chemical compound COC1=CC=C2C=C(C3=C(C=C(C(=C3)OC)OC)CC3)[N+]3=CC2=C1OC QUCQEUCGKKTEBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent Effects 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способу получения лекарственной субстанции, получаемой из листьев бархата амурского (Phellodendron amurence Rupr) и листьев бархата амурского Лаваля (Phellodendron amurence var. Lavallei (Dode) Spague) семейства Рутовых (Rutaceae) и применяемой в качестве противовирусного и антигепатотоксического лекарственного средства «Флакозид».The invention relates to the pharmaceutical industry, in particular to a method for producing a medicinal substance obtained from Amur velvet leaves (Phellodendron amurence Rupr) and Amur Laval velvet leaves (Phellodendron amurence var. Lavallei (Dode) Spague) of the Rutaceae family and used in as an antiviral and antihepatotoxic drug "Flakozid".
Флакозид разрешен для медицинского применения у взрослых и детей как противовирусное средство при острых вирусных гепатитах А и Б, первичных и рецидивирующих формах простого герпеса экстрагенитальной и генитальной локализации, опоясывающем лишае, ветряной оспе и кори [1-2]. Основным действующим веществом «Флакозида» является флавоноидный глюкозид фелламурин - флаванонол (синоним - феллавин, 8-пренилдигидрокемпферол-7-глюкозид).Flacoside is approved for medical use in adults and children as an antiviral agent for acute viral hepatitis A and B, primary and recurrent forms of herpes simplex of extragenital and genital localization, herpes zoster, chickenpox and measles [1-2]. The main active ingredient of "Flacoside" is the flavonoid glucoside fellamurin - flavanonol (synonymous - fellavin, 8-prenyldihydrokaempferol-7-glucoside).
Особый интерес среди реликтовых растений Дальнего Востока представляет бархат амурский (Phellodendron Amurense). Во всех частях бархата амурского содержатся биологически активные вещества: алкалоиды берберин и пальматин, кумарины, сапонины, флавоноиды, фелламурин и амурензин, феллозид, дигидрофеллозяд, гликозиды, эфирное масло, норикаризид, феллодендрин, магнофлорин, обакунон, обакулактон, фитонциды, водорастворимые витамины. Благодаря содержанию этих биологически активных веществ, плоды бархата амурского способны оказывать желчегонное, антигепатотоксическое, а также гепатопротекторное действие [3].Of particular interest among the relict plants of the Far East is Amur velvet (Phellodendron Amurense). All parts of Amur velvet contain biologically active substances: alkaloids berberine and palmatin, coumarins, saponins, flavonoids, fellamurine and amurensine, felloside, dihydrophelloside, glycosides, essential oil, noricariside, phellodendrin, magnoflorin, obakunone, obakulakton, phytoncides, water-soluble vitamins. Due to the content of these biologically active substances, Amur velvet fruits are able to have a choleretic, antihepatotoxic, and hepatoprotective effect [3].
Известно использование флакозида в различных комплексах на основе природных соединений растительного происхождения, обладающих противоинфекционным действием в отношении инфекций, передаваемым половым путем [6-9]. Кроме того, флакозид является одним из компонентов для лечения и профилактики заболевания печени, выбранного из группы, включающей гепатиты типов А, Б, С, и E и алкогольный гепатит [10-12]. Фелламурин проявляет противоопухолевую активность на клетках остеосаркомы [13].It is known to use flacoside in various complexes based on natural compounds of plant origin, which have an anti-infective effect against sexually transmitted infections [6-9]. In addition, flacoside is one of the components for the treatment and prevention of liver disease, selected from the group including hepatitis types A, B, C, and E and alcoholic hepatitis [10-12]. Fellamurin exhibits antitumor activity on osteosarcoma cells [13].
Препарат оказывает выраженное иммуностимулирующее действие на гуморальное звено системы иммунитета [14].The drug has a pronounced immunostimulating effect on the humoral link of the immune system [14].
В качестве прототипа выбран способ получения аналога флакозида феллавина путем экстракции листьев бархата амурского спиртом, заключающийся в экстракции растительного сырья 45-55% водным спиртом, в упаривании водно-спиртового извлечения до водного остатка, в последующей экстракции от неполярных соединений хлороформом, в извлечении суммы флавоноидов из водного остатка этилацетатом, в упаривании этилацетатных извлечений, в последующей кристаллизации целевого продукта из смеси этилацетат : вода при соотношении 1:1, с выходом целевого продукта 3% от сухого веса сырья. Недостатком прототипа является длительность экстракции путем настаивания сырья до 30 часов, использование токсического растворителя метанола. Экстракция хлороформом полностью не очищает водный кубовый остаток от смол, которые мешают кристаллизации и влияют на качество продукции [15].As a prototype, a method for obtaining an analogue of flacoside fellavin by extracting Amur velvet leaves with alcohol, which consists in extracting plant materials with 45-55% aqueous alcohol, in evaporating the hydroalcoholic extract to an aqueous residue, in subsequent extraction from non-polar compounds with chloroform, in extracting the amount of flavonoids from the aqueous residue with ethyl acetate, in the evaporation of ethyl acetate extracts, in the subsequent crystallization of the target product from a mixture of ethyl acetate: water at a ratio of 1:1, with the yield of the target product 3% of the dry weight of the raw material. The disadvantage of the prototype is the duration of extraction by infusion of raw materials up to 30 hours, the use of toxic solvent methanol. Extraction with chloroform does not completely purify the aqueous distillation residue from resins that interfere with crystallization and affect product quality [15].
Недостатком прототипа является длительность экстракции путем настаивания сырья до 30 часов, использование токсического растворителя метанола. Экстракция хлороформом полностью не очищает водный кубовый остаток от смол, которые мешают кристаллизации и влияют на качество продукции.The disadvantage of the prototype is the duration of extraction by infusion of raw materials up to 30 hours, the use of toxic solvent methanol. Extraction with chloroform does not completely purify the aqueous distillation residue from resins that interfere with crystallization and affect product quality.
Задачей предлагаемого изобретения является усовершенствование способа получения лекарственной субстанции на основе листьев бархата амурского с содержанием фелламурина в сырье не ниже 1,0% повышение качества и выхода целевого продукта (до 70% от содержания в сырье, с содержанием фелламурина в готовом продукте не ниже 96%) для обеспечения заявленной биологической активности.The objective of the present invention is to improve the method for obtaining a medicinal substance based on Amur velvet leaves with a content of fellamurine in the raw material of at least 1.0%, an increase in the quality and yield of the target product (up to 70% of the content in the raw material, with a fellamurin content in the finished product of at least 96% ) to ensure the declared biological activity.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка усовершенствованного способа получения лекарственной субстанции из листьев бархата амурского, обладающей противовирусной активностью в отношении простого вируса герпеса и гепатита С, благодаря высокому содержанию основного действующего вещества фелламурина не менее 96% (метод ВЭЖХ). Усовершенствование технологии позволяет получить выход флакозида выше, чем в прототипе.The technical result of the invention is the development of an improved method for obtaining a medicinal substance from Amur velvet leaves, which has antiviral activity against herpes simplex virus and hepatitis C, due to the high content of the main active substance fellamurin of at least 96% (HPLC method). Improvement of technology allows you to get the yield of flacoside higher than in the prototype.
Технический результат достигается при использовании разработанного способа получения лекарственной субстанции на основе листьев бархата амурского (Phellodendron amurence Rupr) и листьев бархата амурского Лаваля (Phellodendron amurence var.Lavallei (Dode) Spague) семейства Рутовых (Rutaceae), включающий трехкратную экстракцию высушенного и измельченного сырья водным этиловым спиртом при соотношении сырье : экстрагент равном 1:10 в концентрации 40-60% при температуре 20-60 °С в течение двух часов, подачу на каждую последующую экстракцию свежего экстрагента в количестве равном слитому извлечению, упаривание полученных экстрактов последовательно по мере поступления до объема 1/20, объединение водных кубовых концентратов и их обработку четыре раза смесью 1,2-дихлорэтаном с этиловым спиртом в соотношении 1:1:1, упаривание остатков органического растворителя, подщелачивание водных кубовых остатков 10-12% водным раствором гидрата окиси натрия до рН 7-7,68, четырехкратную обработку водных щелочных растворов этилацетатом в соотношении 1:0,5, объединение этилацетатных экстрактов, промывку водой, сушку над сернокислым натрием и упаривание, получение технического продукта флакозида кристаллизацией из смеси водного раствора 1,2-этилацетат охлаждением, с последующей фильтрацией и промывкой охлажденным 1,2-этилацетатом, сушку технического продукта, перекристаллизацию из водного этилового спирта и получение готового флакозида.The technical result is achieved using the developed method for obtaining a medicinal substance based on Amur velvet leaves (Phellodendron amurence Rupr) and Amur Laval velvet leaves (Phellodendron amurence var. Lavallei (Dode) Spague) of the Rutaceae family, including three-fold extraction of dried and crushed raw materials with water ethyl alcohol at a ratio of raw material: extractant equal to 1:10 at a concentration of 40-60% at a temperature of 20-60 ° C for two hours, supplying fresh extractant for each subsequent extraction in an amount equal to the drained extraction, evaporating the obtained extracts sequentially as they arrive until volume 1/20, combining aqueous distillation concentrates and processing them four times with a mixture of 1,2-dichloroethane with ethyl alcohol in a ratio of 1:1:1, evaporation of organic solvent residues, alkalization of aqueous distillation residues with a 10-12% aqueous solution of sodium hydroxide to pH 7-7.68, fourfold treatment with aqueous alkalis solutions with ethyl acetate in a ratio of 1:0.5, combining ethyl acetate extracts, washing with water, drying over sodium sulfate and evaporation, obtaining a technical product of flacoside by crystallization from a mixture of an aqueous solution of 1,2-ethyl acetate by cooling, followed by filtration and washing with chilled 1,2 -ethyl acetate, drying the technical product, recrystallization from aqueous ethyl alcohol and obtaining the finished flacoside.
Предложенное техническое решение иллюстрируется следующими примерами 1 и 2 получения лекарственного средства «Флакозид».The proposed technical solution is illustrated by the following examples 1 and 2 of obtaining the drug "Flacoside".
Пример 1.Example 1
Исходным сырьем являются листья бархата амурского, заготовленные в июле месяце (согласно фармакопейной статье). Высушенное измельченное сырье, проходящее сквозь сито 0,5-5 мм, с влажностью сырья W=9,5% в количестве 0,201 кг и содержанием фелламурина в сырье 3,7% помещают в плоскодонную колбу вместимостью 3,0 л.The initial raw material is Amur velvet leaves harvested in the month of July (according to the pharmacopoeial article). Dried crushed raw materials passing through a sieve of 0.5-5 mm, with a moisture content of the raw materials W=9.5% in the amount of 0.201 kg and a content of fellamurine in the raw materials of 3.7%, are placed in a flat-bottomed flask with a capacity of 3.0 liters.
Экстракцию проводят 40% водным спиртом этиловым в соотношении сырье-экстрагент (1:10) при комнатной температуре или при нагревании (45°С) в течение 2-х часов при постоянном перемешивании. Экстракцию проводят трехкратно. На каждую последующую экстракцию подают свежий экстрагент, равный объему слитого извлечения.The extraction is carried out with 40% aqueous ethyl alcohol in the ratio of raw material-extractant (1:10) at room temperature or under heating (45°C) for 2 hours with constant stirring. Extraction is carried out three times. For each subsequent extraction, a fresh extractant is supplied, equal to the volume of the drained extract.
Водно-спиртовые извлечения фильтруют на воронке Бюхнера в колбу Бунзена в вакууме. В качестве фильтрующего материала используют серо-шинельное сукно. Получают от первой экстракции 1,7 л водно-спиртового извлечения, от второй экстракции 1,8 л водно-спиртового извлечения, от третьей экстракции получают 1,5 л водно-спиртового извлечения.Water-alcohol extracts are filtered on a Buechner funnel into a Bunsen flask under vacuum. A gray overcoat cloth is used as a filtering material. From the first extraction 1.7 l of a water-alcohol extract are obtained, from the second extraction 1.8 l of a water-alcohol extract, from the third extraction 1.5 l of a water-alcohol extract are obtained.
Полученные водно-спиртовые извлечения упаривают до 1/20 от первоначального объема, последовательно по мере поступления. Водно-кубовые концентраты объединяют и получают водно-кубовый остаток в количестве 0,250 л с плотностью p=1,05 г/см3. К водному кубовому остатку в количестве 0,250 л приливают 0,250 л спирта этилового 96,4% и 0,250 дихлорэтана, реакционную смесь помещают в делительную воронку вместимостью 2,0 л, затем перемешивают и отделяют нижний слой в количестве 0,250 л (1,2-дихлорэтановый экстракт). Обработку дихлорэтаном проводят 4 раза по 0,250 л. Получают 1,2-дихлорэтановый экстракт в количестве 1,0 л, который два раза промывают дистиллированной водой по 100 мл.The resulting water-alcohol extracts are evaporated to 1/20 of the original volume, sequentially as they arrive. Water-vat concentrates are combined and a water-vat residue is obtained in the amount of 0.250 l with a density of p=1.05 g/cm 3 . 0.250 l of ethyl alcohol 96.4% and 0.250 dichloroethane are added to the water distillation residue in the amount of 0.250 l, the reaction mixture is placed in a separating funnel with a capacity of 2.0 l, then stirred and the lower layer is separated in the amount of 0.250 l (1,2-dichloroethane extract ). Treatment with dichloroethane is carried out 4 times in 0.250 l. 1,2-dichloroethane extract is obtained in the amount of 1.0 l, which is washed twice with distilled water, 100 ml each.
Промывную воду от дихлорэтана присоединяют к очищенному водному кубовому остатку и упаривают в вакууме до 0,450 л водного кубового остатка. 1,2-дихлорэтановый экстракт выводят из технологического процесса. Очищенный водный кубовый остаток подщелачивают 10-12% водным раствором гидрата окиси натрия до рН 7-7,68. Щелочной раствор обрабатывают этилацетатом, насыщенным водой в соотношении как (1:0,5) четыре раза. Полученные этилацетатные экстракты объединяют и промывают один раз 100 мл дистиллированной водой, затем экстракт высушивают над сернокислым натрием и упаривают в вакууме.Wash water from dichloroethane is added to the purified aqueous VAT residue and evaporated in vacuum to 0.450 l of aqueous VAT residue. 1,2-dichloroethane extract is withdrawn from the process. The purified aqueous VAT residue is alkalized with a 10-12% aqueous solution of sodium hydroxide to pH 7-7.68. The alkaline solution is treated with ethyl acetate saturated with water in a ratio of (1:0.5) four times. The obtained ethyl acetate extracts are combined and washed once with 100 ml of distilled water, then the extract is dried over sodium sulfate and evaporated in vacuum.
Получают 10,27 г суммы фенольных соединений, которую растворяют в 70 мл этилацетата на водяной бане при температуре 65°С, затем раствор переносят в коническую колбу вместимостью 300 мл туда же добавляют 70 мл горячей воды дистиллированной (65-70°С) и несколько кристалликов фелламурина. По мере остывания раствора начинается кристаллизация, затем раствор ставят в холодильник. Образовавшийся кристаллический осадок фильтруют в вакууме переносят в химический стакан, к осадку приливают холодный этилацетат (50 мл), перемешивают и фильтруют в вакууме, а затем сушат и получают технического флакозида 6,16 г. 10.27 g of the total phenolic compounds are obtained, which is dissolved in 70 ml of ethyl acetate in a water bath at a temperature of 65 ° C, then the solution is transferred into a conical flask with a capacity of 300 ml, 70 ml of hot distilled water (65-70 ° C) and several fellamurine crystals. As the solution cools, crystallization begins, then the solution is placed in the refrigerator. The resulting crystalline precipitate is filtered under vacuum, transferred to a beaker, cold ethyl acetate (50 ml) is added to the precipitate, stirred and filtered under vacuum, and then dried to give a technical flacoside of 6.16 g.
Затем проводят перекристаллизацию технического продукта. 6,16 г флакозида помещают в круглодонную колбу и приливают в 40 мл 96,3% спирта этилового и растворяют на водяной бане при температуре 70°С, туда же в колбу добавляют 40 мл горячей (70°С) воды дистиллированной и вращают колбу на водяной бане до полного растворения, затем реакционную смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр самотеком в плоскодонную колбу вместимостью 200 мл, круглодонную колбу ополаскивают 20 мл горячего 50% водного этанола и присоединяют к фильтрату, добавляют несколько кристалликов фелламурина, охлаждают при комнатной температуре, помещают в холодильник и через 3-4 часа получают кристаллический продукт, который отфильтровывают в вакууме, переносят в химический стакан, к осадку приливают охлажденный 50% водный спирт этиловый в количестве 70 мл, тщательно перемешивают и фильтруют в вакууме.Then the technical product is recrystallized. 6.16 g of flacoside are placed in a round-bottom flask and poured into 40 ml of 96.3% ethyl alcohol and dissolved in a water bath at a temperature of 70 ° C, 40 ml of hot (70 ° C) distilled water are added to the same flask and the flask is rotated for water bath until completely dissolved, then the reaction mixture is filtered through a pleated paper filter by gravity into a 200 ml flat-bottomed flask, the round-bottomed flask is rinsed with 20 ml of hot 50% aqueous ethanol and added to the filtrate, a few crystals of fellamurine are added, cooled at room temperature, placed in a refrigerator and after 3-4 hours a crystalline product is obtained, which is filtered off in a vacuum, transferred to a beaker, cooled 50% aqueous ethyl alcohol in an amount of 70 ml is added to the precipitate, thoroughly mixed and filtered in a vacuum.
Полученный влажный готовый продукт сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 70°С в течение 4 часов. Получают 4,94 г готового продукта «флакозида» с содержанием основного вещества 96,72%. Выход готового продукта от начала процесса 70,5%.The resulting wet finished product is dried in a vacuum oven at a temperature of 70°C for 4 hours. 4.94 g of the finished product "flacoside" with the content of the main substance of 96.72% is obtained. The yield of the finished product from the beginning of the process is 70.5%.
Идентификацию полученной субстанции "Флакозид" проводили методом ЯМР.Identification of the resulting substance "Flacoside" was carried out by NMR.
В 1Н ЯМР-спектре раствора флакозида в ДМСО присутствуют следующие сигналы: два трехпротонных сигнала при 1,49 и 1,56 м.д. (по три протонные единицы каждый), относятся к изопренильному остатку при С-8, синглет при 6,29 м.д. при С-6, два дублета при 6,78 м.д. и 7,31 м.д. (по две протонные единицы каждый) (протоны 3', 5', и 2', 6' соответственно) относятся к ароматическим протонам кольца В, Фенольные гидроксильные группы при С-4' и С-5 (сигналы в виде синглетов) 9,54 м.д. и 11,81 м.д. соответственно. Сигнал при С-5 со значением 11,81 м.д. относится к фенольной гидроксильной группе, значение которой относится к флаванонолам.The 1 H NMR spectrum of a solution of flacoside in DMSO contains the following signals: two three-proton signals at 1.49 and 1.56 ppm. (three proton units each), refer to the isoprenyl residue at C-8, singlet at 6.29 ppm. at C-6, two doublets at 6.78 ppm and 7.31 ppm (two proton units each) (protons 3', 5', and 2', 6' respectively) refer to the aromatic protons of ring B, Phenolic hydroxyl groups at C-4' and C-5 (signals as singlets) 9, 54 ppm and 11.81 ppm respectively. Signal at C-5 with a value of 11.81 ppm. refers to the phenolic hydroxyl group, the meaning of which refers to flavanonols.
Фелламурин - (2R,3R)-3,5-дигидрокси-2-(4-гидроксифенил)-8-(3-метилбут-2-енил)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-2-ил]окси-2,3-дигидрохромен-4-он. Молярная масса 518,515 г/моль. Брутто формула С26Н30О11 Fellamurin - (2R,3R)-3,5-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-8-(3-methylbut-2-enyl)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3 ,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3-dihydrochromen-4-one. Molar mass 518.515 g/mol. Gross formula C 26 H 30 O 11
Количественное определение фелламурина в готовом продукте проводили методом ВЭЖХ, в качестве внутреннего стандарта использовали рабочий стандартный образец фелламурина.Quantitative determination of fellamurin in the finished product was carried out by HPLC, a working standard sample of fellamurin was used as an internal standard.
Полученная субстанция флакозид представляет собой мелкокристаллический порошок от белого цвета или белого с бежеватым оттенком, содержащий в качестве доминирующего компонента фелламурин. «Флакозид» используют для приготовления таблеток.The resulting substance flacoside is a finely crystalline powder of white or white with a beige tint, containing fellamurine as the dominant component. "Flakozid" is used for the preparation of tablets.
Пример 2.Example 2
Исходным сырьем являются листья бархата амурского, заготовленные в июле месяце (согласно фармакопейной статье). Высушенное измельченное сырье, проходящее сквозь сито 0,5-5 мм, с влажностью сырья W=9,5% в количестве 0,607 кг и содержанием фелламурина в сырье 3,7% помещают в плоскодонную колбу вместимостью 10,0 л.The initial raw material is Amur velvet leaves harvested in the month of July (according to the pharmacopoeial article). Dried crushed raw materials passing through a sieve of 0.5-5 mm, with a raw material moisture content of W=9.5% in the amount of 0.607 kg and a fellamurine content in the raw material of 3.7%, are placed in a flat-bottomed flask with a capacity of 10.0 liters.
Экстракцию проводят 50% водным спиртом этиловым в соотношении сырье-экстрагент (1:10) при комнатной температуре или при нагревании (45°С) в течение 2-х часов при постоянном перемешивании. Экстракцию проводят трехкратно. На каждую последующую экстракцию подают свежий экстрагент, равный объему слитого извлечения. Водно-спиртовые извлечения фильтруют на воронке Бюхнера в колбу Бунзена в вакууме. В качестве фильтрующего материала используют серо-шинельное сукно. Получают от первой экстракции 4,860 л водно-спиртового извлечения, от второй экстракции 4,7 л водно-спиртового извлечения, от третьей экстракции получают 4,8 л водно-спиртового извлечения.The extraction is carried out with 50% aqueous ethyl alcohol in the ratio of raw material-extractant (1:10) at room temperature or under heating (45°C) for 2 hours with constant stirring. Extraction is carried out three times. For each subsequent extraction, a fresh extractant is supplied, equal to the volume of the drained extract. Water-alcohol extracts are filtered on a Buechner funnel into a Bunsen flask under vacuum. A gray overcoat cloth is used as a filtering material. From the first extraction, 4.860 liters of an aqueous-alcoholic extract are obtained, from the second extraction, 4.7 liters of an aqueous-alcoholic extract, from the third extraction, 4.8 liters of an aqueous-alcoholic extract are obtained.
Полученные водно-спиртовые извлечения упаривают до 1/20 от первоначального объема, последовательно по мере поступления. Водно-кубовые концентраты объединяют и получают водно-кубовый остаток в количестве 0,720 л с плотностью p=1,05 г/см3. К водному кубовому остатку в количестве 0,720 л приливают 0,720 л спирта этилового 96,4% и 0,720 1,2-дихлорэтана, реакционную смесь помещают в тубус вместимостью 5,0 л, затем перемешивают и отделяют нижний слой в количестве 0,720 л (1,2-дихлорэтановый экстракт). Обработку 1,2-дихлорэтаном проводят 4 раза по 0,720 л. Получают 1,2-дихлорэтановый экстракт в количестве 2,880 л, который два раза промывают дистиллированной водой по 288 мл.The resulting water-alcohol extracts are evaporated to 1/20 of the original volume, sequentially as they arrive. Water-vat concentrates are combined and a water-vat residue is obtained in the amount of 0.720 l with a density of p=1.05 g/cm 3 . 0.720 l of ethyl alcohol 96.4% and 0.720 1,2-dichloroethane are added to the water distillation residue in the amount of 0.720 l, the reaction mixture is placed in a tube with a capacity of 5.0 l, then mixed and the lower layer is separated in the amount of 0.720 l (1.2 dichloroethane extract). Treatment with 1,2-dichloroethane is carried out 4 times with 0.720 l. A 1,2-dichloroethane extract is obtained in an amount of 2.880 l, which is washed twice with 288 ml of distilled water.
Промывную воду от дихлорэтана присоединяют к очищенному водному кубовому остатку и упаривают в вакууме до 1,296 л водного кубового остатка. 1,2-дихлорэтановый экстракт выводят из технологического процесса. Очищенный водный кубовый остаток подщелачивают 10-12% водным раствором гидрата окиси натрия до рН 7-7,68, получают щелочной раствор с рН=7,61, который обрабатывают этилацетатом, насыщенным водой в соотношении как (1:0,5) четыре раза.Wash water from dichloroethane is added to the purified aqueous VAT residue and evaporated in vacuum to 1.296 l of aqueous VAT residue. 1,2-dichloroethane extract is withdrawn from the process. The purified aqueous VAT residue is alkalized with a 10-12% aqueous solution of sodium hydroxide to pH 7-7.68, an alkaline solution is obtained with pH = 7.61, which is treated with ethyl acetate saturated with water in a ratio of (1:0.5) four times .
Полученные этилацетатные экстракты объединяют и промывают один раз 300 мл дистиллированной водой, затем экстракт высушивают над сернокислым натрием и упаривают в вакууме. Получают 36,8 г суммы фенольных соединений, которую растворяют в 330 мл этилацетата на водяной бане при температуре 65°С, затем раствор переносят в коническую колбу вместимостью 1,0 л туда же добавляют 330 мл воды дистиллированной (65-70°С) и несколько кристалликов фелламурина.The obtained ethyl acetate extracts are combined and washed once with 300 ml of distilled water, then the extract is dried over sodium sulfate and evaporated in vacuum. 36.8 g of the total phenolic compounds are obtained, which is dissolved in 330 ml of ethyl acetate in a water bath at a temperature of 65 ° C, then the solution is transferred into a conical flask with a capacity of 1.0 l, 330 ml of distilled water (65-70 ° C) are added there and a few crystals of fellamurine.
По мере остывания раствора начинается кристаллизация, затем колбу с раствором помещают в холодильник. Образовавшийся кристаллический осадок фильтруют в вакууме, переносят в химический стакан, к осадку приливают холодный этилацетат (150 мл), перемешивают и фильтруют в вакууме, а затем сушат и получают технического флакозида 22,91 г. Затем проводят перекристаллизацию технического продукта. 22,91 г флакозида помещают в круглодонную колбу, приливают 120 мл 96,3% спирта этилового и растворяют на водяной бане при температуре 70°С, туда же в колбу добавляют 120 мл горячей (70°С) воды дистиллированной и вращают колбу на водяной бане до полного растворения, затем реакционную смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр самотеком в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, круглодонную колбу ополаскивают 50 мл горячего 50% водного этанола и присоединяют к фильтрату, добавляют несколько кристалликов фелламурина, охлаждают при комнатной температуре, помещают в холодильник и через 3-4 часа получают кристаллический продукт, который отфильтровывают в вакууме, переносят в химический стакан, к осадку приливают охлажденный 50% водный спирт этиловый в количестве 150 мл, тщательно перемешивают и фильтруют в вакууме.As the solution cools, crystallization begins, then the flask with the solution is placed in a refrigerator. The resulting crystalline precipitate is filtered under vacuum, transferred to a beaker, cold ethyl acetate (150 ml) is added to the precipitate, stirred and filtered under vacuum, and then dried to obtain a technical flacoside of 22.91 g. Then the technical product is recrystallized. 22.91 g of flacoside are placed in a round-bottom flask, 120 ml of 96.3% ethyl alcohol are added and dissolved in a water bath at a temperature of 70 ° C, 120 ml of hot (70 ° C) distilled water are added to the same flask and the flask is rotated in water bath until completely dissolved, then the reaction mixture is filtered through a folded paper filter by gravity into a 500 ml flat-bottom flask, the round-bottom flask is rinsed with 50 ml of hot 50% aqueous ethanol and added to the filtrate, a few crystals of fellamurin are added, cooled at room temperature, placed in a refrigerator and after 3-4 hours, a crystalline product is obtained, which is filtered off in a vacuum, transferred to a beaker, chilled 50% aqueous ethyl alcohol in an amount of 150 ml is added to the precipitate, thoroughly mixed and filtered in a vacuum.
Полученный влажный готовый продукт сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 70°С в течение 4 часов. Получают 14,23 г готового продукта «флакозида» с содержанием основного вещества 97,38%. Выход готового продукта от начала процесса 70,0%.The resulting wet finished product is dried in a vacuum oven at a temperature of 70°C for 4 hours. Receive 14.23 g of the finished product "flacoside" with the content of the main substance of 97.38%. The yield of the finished product from the beginning of the process is 70.0%.
Полученная субстанция флакозид представляет собой мелкокристаллический порошок от белого цвета или белого с бежеватым оттенком, содержащий в качестве доминирующего компонента фелламурин. «Флакозид» используют для приготовления таблеток.The resulting substance flacoside is a finely crystalline powder of white or white with a beige tint, containing fellamurine as the dominant component. "Flakozid" is used for the preparation of tablets.
Пример 3. Определение цитотоксической активности флакозида.Example 3. Determination of the cytotoxic activity of the flacoside.
Цитотоксическую активность флакозида оценивали на культурах опухолевых клеток K562 (эритролейкемия человека) получена из биоколлекции ФГБНУ ВИЛАР (https://pm.cytogen.ru), чувствительных к цитостатикам и нормальных клеток. В качестве нормальных клеток использовали быстроделящиеся фибробласты кожи крыс. Цитотоксическую активность флакозида определяли спектрофотометрическим методом МТТ. Данная клеточная культура является стандартным объектом оценки цитотоксического действия противоопухолевых соединений (Федеральное руководство по доклиническому испытанию лекарственных средств, 2014). Культивирование клеток осуществлялось в стерильных условиях с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). Клетки инкубировали при 37 С в условиях 5% СО2. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с глутаминомThe cytotoxic activity of flacoside was evaluated on cultures of tumor cells K562 (human erythroleukemia) obtained from the biocollection of the Federal State Budget Scientific Institution VILAR (https://pm.cytogen.ru), sensitive to cytostatics and normal cells. Rapidly dividing rat skin fibroblasts were used as normal cells. The cytotoxic activity of flacoside was determined by the MTT spectrophotometric method. This cell culture is a standard object for assessing the cytotoxic effect of anticancer compounds (Federal Guidelines for Preclinical Drug Trials, 2014). Cell cultivation was carried out under sterile conditions using a laminar box LB-V (Russia). Cells were incubated at 37° C. under 5% CO 2 conditions. Cells were cultivated using a standard DMEM medium with glutamine
(Dulbecco'sModifiedEaglemedium, ПанЭко, Россия) с добавлением 10% термоинактивированной эмбриональной телячей сыворотки (Sigma, США), антибиотиков гентамицина сульфата и стрептомицина сульфата (ООО «БиоХимФарм», Россия).(Dulbecco's Modified Eaglemedium, PanEco, Russia) with the addition of 10% heat-inactivated fetal calf serum (Sigma, USA), antibiotics gentamicin sulfate and streptomycin sulfate (LLC BioKhimPharm, Russia).
Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ. Клетки выращивали в 25 см флаконах, после достижения монослоя проводили трипсинизацию и вносили по 200 мкл клеточной суспензии 10 тыс клеток на 1 мл в лунки плоскодонного планшета «COSTAR» и добавляли исследуемое вещество - флакозид на 24 ч. После инкубации в культуральную среду на 3 ч вносили 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ) до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Общий объем лунки составлял 200 мкл, по 2 тыс клеток на лунку. Затем жидкость из лунок удаляли пипетированием и вносили по 150 мкл диметилсульфоксида на 30 мин. МТТ восстанавливается за счет действия дегидрогеназ живых клеток до водонерастворимых кристаллов формазана. Оптическую плотность образцов регистрировали при длине волны 530 нм на планшетном анализаторе иммуноферментных реакций "УНИПЛАН" АИФР-01 (Россия). Оптическую плотность контрольных образцов (без тестируемого препарата) принимали за 100% выживаемость клеток, равную единице. Представлены данные трех экспериментов (n=4).Cell viability was determined by the MTT method. The cells were grown in 25 cm flasks, after reaching the monolayer, trypsinization was performed and 200 μl of a cell suspension of 10 thousand cells per 1 ml was added to the wells of a COSTAR flat-bottom plate and the test substance, flacoside, was added for 24 hours. After incubation, the culture medium was added for 3 hours 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) was added to a final concentration of 0.5 mg/ml. The total well volume was 200 µl, 2000 cells per well. Then the liquid was removed from the wells by pipetting and 150 μl of dimethyl sulfoxide were added for 30 min. MTT is reduced by the action of dehydrogenases of living cells to water-insoluble formazan crystals. The optical density of the samples was recorded at a wavelength of 530 nm on a plate analyzer of enzyme immunoassay reactions "UNIPLAN" AIFR-01 (Russia). The optical density of the control samples (without the test drug) was taken as 100% cell survival equal to one. The data of three experiments (n=4) are presented.
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью программы GraphPadPrism 6. Достоверность отличий (Р) оценивали по критерию Стьюдента-Фишера (см. табл. 1).Statistical processing of the obtained experimental data was carried out using the GraphPadPrism 6 program. The significance of differences (P) was assessed by the Student-Fisher test (see Table 1).
Показано, что флакозид оказывает дозозависимое цитотоксическое действие на опухолевые клетки K562. Максимальный цитотоксический эффект проявлялся в концентрации 100 мкМ - 64% ингибирование жизнеспособности опухолевых клеток.Flacoside has been shown to have a dose-dependent cytotoxic effect on K562 tumor cells. The maximum cytotoxic effect was manifested at a concentration of 100 μM - 64% inhibition of the viability of tumor cells.
Литература:Literature:
1. Государственный реестр лекарственных средств-Том 1. - М. - 2004. - С. 80,441.1. State Register of Medicines - Volume 1. - M. - 2004. - S. 80.441.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Часть II. - М.: «Медицина». - 1993. - С. 401.2. Mashkovsky M.D. Medicines. Part II. - M.: "Medicine". - 1993. - S. 401.
3. Шретер А.И. Целебные растения Дальнего Востока и их применение /А.И. Шретер - Владивосток: Дальневосточное книжное изд-во ИПК «Дальпресс», 2000. - 144 с.3. Shreter A.I. Medicinal plants of the Far East and their application / A.I. Shreter - Vladivostok: Far Eastern book publishing house IPK "Dalpress", 2000. - 144 p.
4. Фатеева Т.В., Дерябин П.Г., Бортникова В.В., Крепкова Л.В., Мизина П.Г. Активность флакозида при вирусном гепатите С в экспериментах invitroll Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2019. - Т. 167. - №4. С. 463-466.4. Fateeva T.V., Deryabin P.G., Bortnikova V.V., Krepkova L.V., Mizina P.G. Flacoside activity in viral hepatitis C in invitroll experiments Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2019. - T. 167. - No. 4. pp. 463-466.
5. Карабаева В.В., Крепкова Л.В., Бабенко А.Н., Бортникова В.В., Фатеева Т.В., Мизина П.Г., Михеева Н.С., Карабаева О.Н. Ретроспективный анализ экспериментального и клинического изучения флакозида при вирусных гепатитах // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021. Т. 10. №4. С. 169-176.5. Karabaeva V.V., Krepkova L.V., Babenko A.N., Bortnikova V.V., Fateeva T.V., Mizina P.G., Mikheeva N.S., Karabaeva O.N. Retrospective analysis of the experimental and clinical study of flacoside in viral hepatitis // Development and registration of medicines. 2021. Vol. 10. No. 4. pp. 169-176.
6. Патент РФ №2401121.6. RF patent No. 2401121.
7. Патент РФ №2200569.7. RF patent No. 2200569.
8. Патент РФ №2200571.8. RF patent No. 2200571.
9. Патент РФ №2200570.9. RF patent No. 2200570.
10. Бортникова В.В., Карабаева В.В., Крепкова Л.В., Мизина П.Г., Бабенко А.Н., Михеева Н.С., Карабаева О.Н. Ретроспективный анализ клинического изучения лекарственного препарата «Флакозид» в терапии заболеваний гепатобилиарной системы. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(3):100-104. https HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104": // HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104" doi HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104". HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104"org HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104"/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-10410. Bortnikova V.V., Karabaeva V.V., Krepkova L.V., Mizina P.G., Babenko A.N., Mikheeva N.S., Karabaeva O.N. Retrospective analysis of the clinical study of the drug "Flacoside" in the treatment of diseases of the hepatobiliary system. Development and registration of medicines. 2021;10(3):100-104. https HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104": // HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10- 3-100-104" doi HYPERLINK" https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104". HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104"org HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100 -104"/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104
11. Патент РФ №2391989.11. RF patent No. 2391989.
12. Противовирусные органические соединения: учеб. пособие / Е.Н. Уломский, В.Л. Русинов, О.Н. Чупахин; [науч. ред. В.Н. Чарушин]; М-во образования и науки Рос. Федерации, Урал. федер. ун-т. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2017. - 92 с.12. Antiviral organic compounds: textbook. allowance / E.N. Ulomsky, V.L. Rusinov, O.N. Chupakhin; [scient. ed. V.N. Charushin]; Ministry of Education and Science Ros. Federation, Ural. feder. un-t. - Yekaterinburg: Publishing House Ural, un-ta, 2017. - 92 p.
13. Zhang H., Jiang H., Zhang H., Liu J., Hu X., Chen L. Anti-tumor efficacy of phellamurin in osteosarcoma cells: Involvement of the PI3K/AKT/mTOR pathway // European Journal of Pharmacology. 2019.172477. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172477.13. Zhang H., Jiang H., Zhang H., Liu J., Hu X., Chen L. Anti-tumor efficacy of phellamurin in osteosarcoma cells: Involvement of the PI3K/AKT/mTOR pathway // European Journal of Pharmacology . 2019.172477. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172477.
14. Бортникова В.В., Крепкова Л.В. Экспериментальное токсикологическое изучение противовирусного фитопрепаратаФлакозид // Вестник РУДН, серия Медицина, 2008, №7, С. 96-101.14. Bortnikova V.V., Krepkova L.V. Experimental toxicological study of the antiviral phytopreparation Flacozid // Bulletin of the Peoples' Friendship University of Russia, series Medicine, 2008, No. 7, pp. 96-101.
15. В.И. Глызин. Докторская диссертация, 1974. Получение лекарственных препаратов противовирусной активности из группы природных флавоноидов.15. V.I. Glyzin. Doctoral dissertation, 1974. Obtaining drugs with antiviral activity from the group of natural flavonoids.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787103C1 true RU2787103C1 (en) | 2022-12-28 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CW XIAO et all.Antifungal Efficacy of Phellodendron amurense Ethanol Extract against Trichophyton mentagrophytes in Rabbits // Pak Vet J, 34(2): 219-223. НАУМОВА О.А. Фармакогностическое исследование плодов бархата амурского с целью контроля качества и стандартизации сырья //Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук, 2014;БОРТНИКОВА В.В. и др.Ретроспективный анализ клинического изучения лекарственного препарата "Флакозид" в терапии заболеваний гепатобилиарной системы. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(3):100-104. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shuaibu et al. | Trypanocidal activity of extracts and compounds from the stem bark of Anogeissus leiocarpus and Terminalia avicennoides | |
| CN106928246B (en) | A kind of compound and preparation method thereof and purposes | |
| Shuaibu et al. | The use of microfluorometric method for activity-guided isolation of antiplasmodial compound from plant extracts | |
| US20100286255A1 (en) | Method for extracting secoisolariciresinol and dihydroquercetin from wood | |
| Nyong et al. | Effect of methods of extraction on phytochemical constituents and antibacterial properties of Tetracarpidium conophorum seeds | |
| CN115716790B (en) | Extraction and separation method of amide ester alkaloid in purslane and application of extraction and separation method | |
| KR100524373B1 (en) | A pharmaceutical composition containing the extract of saururus chinensis baill useful as an anticancer agent and a process for the preparation thereof | |
| JP6923861B2 (en) | Dicafe oil spermidine derivative glycoside and its use | |
| Hartenstein et al. | (2R)-2-β-D-glucopyranosyloxy-4-hydroxy-2H-1, 4-benzoxazin-3 (4H)-one from Secale cereale | |
| AU2016245659B2 (en) | Phillygenin glucuronic acid derivative, preparation method and application thereof | |
| RU2787103C1 (en) | Method for obtaining a medicinal substance from amur velvet leaves | |
| CN112300104A (en) | Lignanoid compound in purslane and extraction and separation method and application thereof | |
| CN105037316A (en) | Active ingredient extracted and separated from aspidistra typica baill and application of active ingredient | |
| US7387800B2 (en) | Sesquiterpenoid derivatives having adipocyte differentiation inhibitory effect | |
| CN114948936A (en) | Natural antiviral atomized liquid and preparation method and application thereof | |
| KR20180052589A (en) | Method of Manufacturing Sparassis crispa Extract using Organic Solvent | |
| CN111777588B (en) | Pseudorufop-gracilis phenylpropanoids compound and application thereof | |
| CN108125946A (en) | Application of the dihydromyricetin in terms of kidney medicine is prepared | |
| Oluremi et al. | Anti-measles virus activity of 4-hydroxy-3-methoxy benzaldehyde (Vanillin) isolated from Xylopia aethiopica (Dunal) A. rich | |
| CN108997453B (en) | Diphenyl ethyl ketone glycoside compound and preparation method and application thereof | |
| Priya et al. | Phytochemical Analysis and Antimicrobial Activity of Hibiscus rosa sinensis | |
| US20110033566A1 (en) | Anti-bacterial composition comprising extract from barks of Alnus pendula Matsum | |
| RU2713118C1 (en) | Method for extracting the sum of furocoumarins from cell culture of hemlock patchy (conium maculatum l.) | |
| KR100569086B1 (en) | Acer mono leaf extracts and Phenolic compounds isolated thereof having hepatoprotective activity | |
| CN1961876A (en) | Use of phthalimide derivative in preparation of medicament for resisting angiogenesis |