RU2786007C1 - Method for assessing cell malignancy in glioma cultures - Google Patents
Method for assessing cell malignancy in glioma cultures Download PDFInfo
- Publication number
- RU2786007C1 RU2786007C1 RU2022105092A RU2022105092A RU2786007C1 RU 2786007 C1 RU2786007 C1 RU 2786007C1 RU 2022105092 A RU2022105092 A RU 2022105092A RU 2022105092 A RU2022105092 A RU 2022105092A RU 2786007 C1 RU2786007 C1 RU 2786007C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- expression
- malignancy
- gene
- grade
- degree
- Prior art date
Links
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 102100019398 CDK4 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 101700008359 CDK4 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100018829 SOX2 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 101700006931 SOX2 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100008054 TUBB3 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 101710025594 TUBB3 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101710028079 UMAG_05828 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000004329 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000821 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101710036046 NOTCH2 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102100012126 NOTCH2 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 102100019155 MDM2 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 101700032565 MDM2 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 44
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 8
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 abstract description 4
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 19
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 13
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000002518 glial Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 206010002224 Anaplastic astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 208000005017 Glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 102100011594 PSMC4 Human genes 0.000 description 2
- 101710043636 PSMC4 Proteins 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M Sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002083 cellular DNA Polymers 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 201000001169 fibrillary astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 201000011626 grade III astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000003211 malignant Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229940009444 Amphotericin Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 Arteries Anatomy 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N BRL-49594 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010091358 EC 2.4.2.8 Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 EC 2.4.2.8 Human genes 0.000 description 1
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 1
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 1
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 1
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 1
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 1
- 102100004985 GUSB Human genes 0.000 description 1
- 101710023886 GUSB Proteins 0.000 description 1
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000000122 Hyperventilation Diseases 0.000 description 1
- 102100003512 MELK Human genes 0.000 description 1
- 101700050188 MELK Proteins 0.000 description 1
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 1
- 102100011583 MSI1 Human genes 0.000 description 1
- 101700007738 MSI1 Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 210000000869 Occipital Lobe Anatomy 0.000 description 1
- 102100007815 PDGFB Human genes 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010019674 Proto-Oncogene Proteins c-sis Proteins 0.000 description 1
- 230000036191 S Phase Effects 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 Sodium Pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 102100005468 TBP Human genes 0.000 description 1
- 108060008091 TBP Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 230000003727 cerebral blood flow Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 102000017256 epidermal growth factor-activated receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040009258 epidermal growth factor-activated receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000000870 hyperventilation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 201000010133 oligodendroglioma Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к клеточной, молекулярной биологии и может быть использовано при оценке степени злокачественности клеток в культурах глиомы.The invention relates to cellular and molecular biology and can be used in assessing the degree of malignancy of cells in glioma cultures.
Глиальные опухоли головного мозга человека, по данным Всемирной организации здравоохранения, являются наиболее частыми первичными злокачественными опухолями головного мозга. Эти опухоли, согласно классификации Всемирной организации здравоохранения, подразделяют на 4 степени злокачественности (Grade I, Grade II, Grade III и Grade IV), при этом внутри грейда встречаются гистологические разделения типов опухолей. Данная классификация глиальных опухолей важна, поскольку она учитывает скорость прогрессирования опухоли, наличие признаков злокачественности, наиболее частый возраст первичной диагностики опухоли.Glial tumors of the human brain, according to the World Health Organization, are the most common primary malignant brain tumors. These tumors, according to the classification of the World Health Organization, are divided into 4 grades of malignancy (Grade I, Grade II, Grade III and Grade IV), while histological divisions of tumor types occur within the grade. This classification of glial tumors is important because it takes into account the rate of tumor progression, the presence of signs of malignancy, the most common age of primary tumor diagnosis.
Культуры клеток глиомы применяют для того, чтобы проводить фундаментальные исследования опухолевых процессов, в персонализированной медицине для подбора схем лечения, учитывающих индивидуальные особенности пациента, а также в фармакологии для оценки эффективности действия лекарственных средств на опухоль. При этом часто отмечается подавление культуры глиомы в целом, но степень злокачественности культуры не снижается. При отмене препаратов может происходить вытеснение пула предшествующих клеток более злокачественными клонами, поэтому важное значение имеет определение степени злокачественности клеток в культуре.Glioma cell cultures are used to conduct fundamental studies of tumor processes, in personalized medicine to select treatment regimens that take into account the individual characteristics of the patient, and also in pharmacology to evaluate the effectiveness of drugs on the tumor. In this case, suppression of the glioma culture as a whole is often noted, but the degree of malignancy of the culture does not decrease. With the abolition of drugs, the pool of previous cells may be replaced by more malignant clones; therefore, it is important to determine the degree of malignancy of cells in culture.
Известен способ определения степени злокачественности глиомы, основанный на морфологическом исследовании образца (1). При этом оценивались плоидность и содержание клеточной ДНК опухоли, процент фракции S-фазы с использованием образцов, фиксированных формалином, а затем залитых в парафин. Недостатками данного метода являются изначальная неоднородность материала и отсутствие корреляции со степенью злокачественности опухоли.A known method for determining the degree of malignancy of glioma, based on the morphological study of the sample (1). At the same time, the ploidy and content of the cellular DNA of the tumor, the percentage of the S-phase fraction were evaluated using samples fixed with formalin and then embedded in paraffin. The disadvantages of this method are the initial heterogeneity of the material and the lack of correlation with the degree of malignancy of the tumor.
Известен способ, основанный на проведении интраоперационной высокочастотной допплерографии до и после гипервентиляции (2), при котором измеряют среднюю линейную скорость мозгового кровотока в артериях, васкуляризирующих следующие области: опухоль, переходную зону и окружающее неизмененное мозговое вещество. Однако данный метод обладает недостаточной точностью и не может быть использован при определении степени злокачественности клеток в культурах.A known method is based on conducting intraoperative high-frequency Doppler before and after hyperventilation (2), which measures the average linear velocity of cerebral blood flow in the arteries that vascularize the following areas: the tumor, the transition zone and the surrounding unchanged medulla. However, this method has insufficient accuracy and cannot be used to determine the degree of malignancy of cells in cultures.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ, основанный на измерении экспрессии маркерных генов (3). Именно его мы и выбрали в качестве прототипа. В указанном способе дифференциация глиом основана на анализе экспрессии генов и микро-РНК с выделением общей РНК из тканевых проб глиом и перифокальной зоны и последующими обратной транскрипцией, затем амплификацией в режиме реального времени RT-PCR. Особенностью данного способа является использование высокоспецифичных праймеров для генетических локусов EGFR, MSI1, PSMC4, ТВР, RPLO, микро-РНК hsa-miR-92-1-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p и высокоспецифичных референсных генов PSMC4, ТВР, RPLO и референсных высокоспецифичных микро-РНК hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p с дальнейшим анализом значения коэффициента относительной экспрессии Е. При этом различные диапазоны значений коэффициента относительной экспрессии Е позволяют дифференцировать опухоли разных степеней злокачественности: различать глиомы Grade II от глиом высокой степени злокачественности Grade III и IV. Однако способ недостаточно точен, поскольку не позволяет дифференцировать глиомы высоких грейдов Grade III и IV. К сложности способа можно отнести необходимость анализировать не только ткань опухоли, но и перифокальную зону. Последнее требование делает трудновыполнимым использование прототипа для оценки степени злокачественности клеток культуры глиомы.Closest to the claimed method is a method based on measuring the expression of marker genes (3). That is what we chose as a prototype. In this method, the differentiation of gliomas is based on the analysis of gene expression and miRNA with the isolation of total RNA from tissue samples of gliomas and the perifocal zone and subsequent reverse transcription, then real-time RT-PCR amplification. A feature of this method is the use of highly specific primers for the genetic loci EGFR, MSI1, PSMC4, TBP, RPLO, microRNA hsa-miR-92-1-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p and highly specific reference genes PSMC4, TBP, RPLO and reference highly specific miRNAs hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p with further analysis of the value of the relative expression coefficient E. Grades: Distinguish Grade II gliomas from Grade III and IV high-grade gliomas. However, the method is not accurate enough, since it does not allow differentiating gliomas of high grades Grade III and IV. The complexity of the method includes the need to analyze not only the tumor tissue, but also the perifocal zone. The latter requirement makes it difficult to use the prototype to assess the degree of malignancy of glioma culture cells.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является повышение точности способа и его упрощение. Это осуществляется подбором панели маркерных генов и использованием прогностической модели на основе линейной регрессии.The problem to be solved by the present invention is to improve the accuracy of the method and simplify it. This is done by selecting a panel of marker genes and using a predictive model based on linear regression.
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:The defining differences of the proposed method, compared with the prototype, are:
- анализируются только опухолевые клетки, без использования дополнительных зон, что делает способ проще;- only tumor cells are analyzed, without the use of additional zones, which makes the method easier;
- заявляемый способ дает возможность надежно различать культуры II, III и IV грейдов злокачественности, что делает его более точным.- the claimed method makes it possible to reliably distinguish cultures II, III and IV grades of malignancy, which makes it more accurate.
Предлагаемый способ решения данной задачи заключается в следующем. Из культуры клеток глиомы выделяют тотальную РНК, проводят реакцию обратной транскрипции для синтеза первой цепи к-ДНК. Определяют уровень экспрессии следующих генов: NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2. Проводят расчет степени злокачественности клеток в культуре по формуле:The proposed method for solving this problem is as follows. From the culture of glioma cells, total RNA is isolated, a reverse transcription reaction is carried out to synthesize the first strand of c-DNA. The expression level of the following genes is determined: NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2. Calculate the degree of malignancy of cells in culture according to the formula:
y=1,842+0,118×Х1-0,2×Х2+0,091×Х3+0,012×Х4+0,072×Х5-0,12×Х6+0,051×Х7+0,047×Х8,y=1.842+0.118×X 1 -0.2×X 2 +0.091×X 3 +0.012×X 4 +0.072×X 5 -0.12×X 6 +0.051×X 7 +0.047×X 8 ,
гдеwhere
X1 - экспрессия гена NOTCH2;X 1 - expression of the NOTCH2 gene;
Х2 - экспрессия гена TUBB3;X 2 - expression of the TUBB3 gene;
Х3 - экспрессия гена GDNF; X 3 - expression of the GDNF gene;
Х4 - экспрессия гена SOX2; X 4 - expression of the SOX2 gene;
Х5 - экспрессия гена CDK4; X 5 - expression of the CDK4 gene;
Х6 - экспрессия гена PDGFA1; X 6 - expression of the PDGFA1 gene;
Х7 - экспрессия гена NANOG; X 7 - NANOG gene expression;
Х8 - экспрессия гена MDM2;X 8 - expression of the MDM2 gene;
при значениях y меньше 2,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade II, при значениях y больше 2,5, но меньше 3,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade III, при значении y больше 3,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade IV.with values of y less than 2.5, the degree of malignancy of the culture corresponds to Grade II, with values of y greater than 2.5, but less than 3.5, the degree of malignancy of the culture corresponds to Grade III, with a value of y greater than 3.5, the degree of malignancy of the culture corresponds to Grade IV.
Для проверки адекватности выбора маркерных генов и для выведения формулы расчета злокачественности клеток мы провели исследование на 27 культурах глиом.To test the adequacy of the choice of marker genes and to derive a formula for calculating cell malignancy, we conducted a study on 27 glioma cultures.
Культуры глиом получали из тканей глиальных опухолей головного мозга человека. Материал биоптатов тканей глиомы был получен при операциях по резекции опухолей. Культуры разбили на три группы по степени злокачественности. Критерием отнесения к той или иной группе служило заключение морфологического исследования опухоли. К группе злокачественности Grade II относили культуры от пациентов с диагнозом диффузная астроцитома, группу Grade III составляли культуры от пациентов с диагнозами анапластическая астроцитома и олигодендроглиома Grade III. Группа Grade IV - это культуры, полученные из глиобластомы.Glioma cultures were obtained from tissues of human brain glial tumors. The material of biopsy specimens of glioma tissues was obtained during tumor resection operations. Cultures were divided into three groups according to the degree of malignancy. The criterion for assignment to one or another group was the conclusion of the morphological study of the tumor. Grade II malignancy group included cultures from patients diagnosed with diffuse astrocytoma, Grade III group consisted of cultures from patients diagnosed with anaplastic astrocytoma and Grade III oligodendroglioma. Grade IV group are cultures derived from glioblastoma.
Из клеток выделяли общую РНК, проводили обратную транскрипцию и определяли нормализованную экспрессию 26-ти генов.Total RNA was isolated from the cells, reverse transcription was performed, and the normalized expression of 26 genes was determined.
Затем мы проанализировали полученные данные с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics 26.0. Для отбора опорных генов для нашей модели мы нашли гены, у которых при подсчете коэффициента Джонкхира-Терпстры с поправкой на точный критерий Монте-Карло (при доверительном интервале 95% (CI 95) и количестве выборок 10000) с учетом поправки Бонферрони для 3 выборок была получена односторонняя значимость р<0,017. Такими генами оказались TUBB3, MELK, NESTIN, PDGFB, SOX2. Затем мы провели поиск мультиколлинеаров к этим генам, рассчитав парную корреляцию по методу Спирмена. Данные мультиколлинеары были исключены из нашего набора анализируемых генов для повышения точности модели и уменьшения итогового количества генов, необходимых для дифференциации образца культуры клеток. Затем оставшиеся гены мы исследовали на лучшее соответствие типа используемой регрессионной модели с помощью метода подгонки кривых, в результате большинство отобранных генов лучше соответствовало модели на основе линейной регрессии. Модель линейной регрессии мы составляли на основе метода прямого шагового подбора модели с использованием информационного критерия включения\исключения AICC. На данном этапе наивысшую точность модели равную 40,1% (информационный критерий равен - 22,861) дали гены TUBB3, SOX2, CDK4. Для повышения точности нашей модели мы проанализировали распределение результатов экспрессии всех отобранных генов, а затем на основе полученных данных для генов NOTCH2, GDNF, CDK4, NANOG провели ранжирование. После этого у набора генов NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2 прогностическая точность возросла до 86% (информационный критерий равен - 49,951), при этом точность разделения степеней злокачественности также увеличилась и проиллюстрирована фигурой 1.We then analyzed the obtained data using IBM SPSS Statistics 26.0 software. To select reference genes for our model, we found genes in which, when calculating the Jonkheer-Terpstra coefficient adjusted for the exact Monte Carlo test (with a confidence interval of 95% (CI 95) and the number of samples 10,000), taking into account the Bonferroni correction for 3 samples, was a one-sided significance of p<0.017 was obtained. These genes turned out to be TUBB3, MELK, NESTIN, PDGFB, SOX2. We then searched for multicollinears for these genes by calculating the pairwise correlation using the Spearman method. These multicollinears were excluded from our set of analyzed genes to improve the accuracy of the model and reduce the total number of genes needed to differentiate the cell culture sample. We then examined the remaining genes for better fit to the type of regression model used by curve fitting, resulting in the majority of the selected genes better fitting the model based on linear regression. We compiled a linear regression model based on the method of direct stepwise selection of the model using the information inclusion / exclusion criterion AICC. At this stage, the highest accuracy of the model equal to 40.1% (the information criterion is equal to - 22.861) was given by the genes TUBB3, SOX2, CDK4. To improve the accuracy of our model, we analyzed the distribution of expression results for all selected genes, and then, based on the obtained data for the NOTCH2, GDNF, CDK4, and NANOG genes, we ranked them. After that, for the NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2 gene set, the prognostic accuracy increased to 86% (information criterion is - 49.951), while the accuracy of separating the grades of malignancy also increased and is illustrated in Figure 1.
На фиг. 1 представлены предсказанные значения степеней злокачественности культур глиом из выборок грейдов II, III и IV.In FIG. 1 shows the predicted values of the grades of malignancy of glioma cultures from the samples of grades II, III, and IV.
Итоговая формула:Final formula:
y=1,842+0,118×Х1-0,2×Х2+0,091×Х3+0,012×Х4+0,072×Х5-0,12×Х6+0,051×Х7+0,047×Х8,y=1.842+0.118×X 1 -0.2×X 2 +0.091×X 3 +0.012×X 4 +0.072×X 5 -0.12×X 6 +0.051×X 7 +0.047×X 8 ,
гдеwhere
X1 - экспрессия гена NOTCH2;X 1 - expression of the NOTCH2 gene;
Х2 - экспрессия гена TUBB3;X 2 - expression of the TUBB3 gene;
Х3 - экспрессия гена GDNF;X 3 - expression of the GDNF gene;
Х4 - экспрессия гена SOX2;X 4 - expression of the SOX2 gene;
Х5 - экспрессия гена CDK4;X 5 - expression of the CDK4 gene;
Х6 - экспрессия гена PDGFA1;X 6 - expression of the PDGFA1 gene;
Х7 - экспрессия гена NANOG;X 7 - NANOG gene expression;
Х8 - экспрессия гена MDM2.X 8 - MDM2 gene expression.
На основе предсказанных значений степени злокачественности для образцов из наших выборок мы рассчитали, что при значениях y меньше 2,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade II, при значениях y больше 2,5, но меньше 3,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade III, при значении y больше 3,5 степень злокачественности культуры соответствует Grade IV.Based on the predicted values of the degree of malignancy for samples from our samples, we calculated that with values of y less than 2.5, the degree of malignancy of the culture corresponds to Grade II, with values of y greater than 2.5, but less than 3.5, the degree of malignancy of the culture corresponds to Grade III, with a value of y greater than 3.5, the degree of malignancy of the culture corresponds to Grade IV.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.The invention is illustrated by the following examples of specific execution of the method.
Пример 1Example 1
Больная К., была прооперирована по поводу опухоли лобной области головного мозга. Из биоптата ткани получена перевиваемая культура клеток. Для этого образец опухоли помещали в чашку Петри с холодным раствором Хенкса, очищали ткань от кровеносных сосудов, оболочек и т.п. Измельчали образец при помощи скальпеля и стеклянной пипеткой переносили в 15 мл пробирку. После осаждения всех фрагментов убирали раствор Хенкса и добавляли 0,25% раствор трипсина. После повторного осаждения ткани отбирали трипсин и добавляли свежий, после чего помещали на подогреваемый до 37°С шейкер до размягчения ткани. Для остановки реакции трипсина в пробирку добавляли культуральную среду в соотношении 1:1, после чего вновь ждали осаждения образца и отбирали жидкость, не захватывая осадок. Диссоциацию ткани проводили в растворе Хенкса, добавляя его в пробирку и ресуспендируя ткань стеклянной пипеткой. После осаждения оставшихся крупных фрагментов взвесь образовавшихся клеток переносили в чистую пробирку. К оставшейся ткани вновь добавляли раствор Хенкса. Взвесь клеток процеживали в 50 мл пробирку для лучшего очищения от оставшихся крупных фрагментов, а затем пипеткой переносили в чистую 15 мл пробирку и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Отбирали жидкость, добавляли культуральную среду и рассевали на флаконы для дальнейшей культивации. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12 с пируватом натрия с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% раствора HEPES для поддержания рН, 1% GlutaMAX и 1% раствора пенициллина/стрептомицина/амфотерицина в CO2-инкубаторе при температуре 37оС и 5% содержании CO2. Из культуры выделяли общую РНК реактивом «Tri Reagent», MRC, США, по прилагаемому протоколу. Синтез первой цепи кДНК осуществляли набором реактивов «MMLV RT kit», Евроген, Россия, по прилагаемому протоколу. Объем пробы составлял 20 мкл, в реакционную смесь добавляли 2-5 мкг РНК и 2 мкл олиго(dT) 16 праймера. Длительность инкубации 40 минут при 41°. Полученный образец кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР в реальном времени. Проводили реакцию ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 Touch (BioRad, CIIIA). Для проведения реакции использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green I R-402» (Синтол, Россия). Температурно-временные характеристики реакции: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин; 40 циклов (денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация при 60°С - 30 сек). Определяли экспрессию генов: NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2. Нормализованную экспрессию рассчитывали по трем референсным генам: GUSB, HPRT, GAPDH, используя программное обеспечение прибора. Нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров приведены в Таблице 1.Patient K. was operated on for a tumor of the frontal region of the brain. A transplantable cell culture was obtained from the tissue biopsy. To do this, a tumor sample was placed in a Petri dish with a cold Hanks solution, and the tissue was cleaned from blood vessels, membranes, etc. The sample was crushed with a scalpel and transferred to a 15 ml tube with a glass pipette. After sedimentation of all fragments, Hank's solution was removed and 0.25% trypsin solution was added. After re-sedimentation of the tissue, trypsin was taken and fresh was added, after which they were placed on a shaker heated to 37°C until the tissue softened. To stop the reaction of trypsin, a culture medium was added to the test tube at a ratio of 1:1, after which the sample was again expected to settle and the liquid was taken without capturing the precipitate. Tissue dissociation was carried out in Hank's solution by adding it to the test tube and resuspending the tissue with a glass pipette. After sedimentation of the remaining large fragments, the suspension of the resulting cells was transferred into a clean test tube. Hank's solution was again added to the remaining tissue. The cell suspension was filtered into a 50 ml tube for better purification from the remaining large fragments, and then transferred to a clean 15 ml tube with a pipette and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. The liquid was taken, the culture medium was added, and seeded into flasks for further cultivation. Cells were cultured in DMEM/F12 growth medium with sodium pyruvate supplemented with 10% fetal calf serum, 1% HEPES solution to maintain pH, 1% GlutaMAX, and 1% penicillin/streptomycin/amphotericin solution in a CO2 incubator at 37°C and 5% CO2. Total RNA was isolated from the culture with the Tri Reagent, MRC, USA, according to the attached protocol. Synthesis of the first strand of cDNA was carried out using the MMLV RT kit, Evrogen, Russia, according to the attached protocol. The sample volume was 20 µl, 2–5 µg of RNA and 2 µl of oligo(dT) 16 primer were added to the reaction mixture. The duration of incubation is 40 minutes at 41°. The resulting cDNA sample was used as a template for quantitative real-time PCR. A real-time PCR reaction was performed on a CFX96 Touch cycler (BioRad, CIIIA). The reaction was carried out using the "Reagent kit for real-time PCR in the presence of SYBR Green I R-402" (Sintol, Russia). Temperature-time characteristics of the reaction: preheating at 95°C - 5 min; 40 cycles (denaturation at 95°C - 10 sec, annealing and elongation at 60°C - 30 sec). Gene expression was determined: NOTCH2, TUBB3, GDNF, SOX2, CDK4, PDGFA1, NANOG, MDM2. Normalized expression was calculated for three reference genes: GUSB, HPRT, GAPDH using the instrument software. The nucleotide sequences of the forward and reverse primers are shown in Table 1.
По формуле рассчитали степень злокачественности:According to the formula, the degree of malignancy was calculated:
y=1,842+0,118×Х1-0,2×Х2+0,091×Х3+0,012×Х4+0,072×Х5-0,12×Х6+0,051×Х7+0,047×Х8,y=1.842+0.118×X 1 -0.2×X 2 +0.091×X 3 +0.012×X 4 +0.072×X 5 -0.12×X 6 +0.051×X 7 +0.047×X 8 ,
гдеwhere
X1 - экспрессия гена NOTCH2;X 1 - expression of the NOTCH2 gene;
Х2 - экспрессия гена TUBB3; X 2 - expression of the TUBB3 gene;
Х3 - экспрессия гена GDNF; X 3 - expression of the GDNF gene;
Х4 - экспрессия гена SOX2; X 4 - expression of the SOX2 gene;
Х5 - экспрессия гена CDK4;X 5 - expression of the CDK4 gene;
Х6 - экспрессия гена PDGFA1; X 6 - expression of the PDGFA1 gene;
Х7 - экспрессия гена NANOG; X 7 - NANOG gene expression;
Х8 - экспрессия гена MDM2;X 8 - expression of the MDM2 gene;
y=1,9. Это значение соответствует степени злокачественности Grade II. Заключение по морфологическому исследованию: диффузная астроцитома WHO grade II.y=1.9. This value corresponds to the degree of malignancy Grade II. Conclusion on the morphological study: diffuse astrocytoma WHO grade II.
Пример 2Example 2
Больной Д. поступил в стационар с диагнозом «Внутримозговая опухоль височно-островковой доли справа». Был прооперирован. Из биоптата опухолевой ткани получена культура клеток. Определяли уровни экспрессии генов и рассчитали по формуле значение злокачественности y. Оно оказалось равным 2,9. Это значение соответствует степени злокачественности Grade III. Заключение по морфологическому исследованию: анапластическая астроцитома. WHO grade III.Patient D. was admitted to the hospital with a diagnosis of intracerebral tumor of the temporal-insular lobe on the right. Was operated on. A cell culture was obtained from a biopsy of the tumor tissue. The levels of gene expression were determined and the value of malignancy y was calculated using the formula. It turned out to be 2.9. This value corresponds to the degree of malignancy Grade III. Conclusion on the morphological study: anaplastic astrocytoma. WHO grade III.
Пример 3Example 3
Больной Н. проведена операция «Микрохирургическое удаление опухоли левой затылочной доли». Из биоптата удаленной ткани выделена культура клеток. В культуре заявленным способом проведена оценка злокачественности клеток. Расчет дал значение y=4,04. Это значение соответствует степени злокачественности Grade IV. Заключение по морфологическому исследованию: Глиобластома, WHO Grade IVPatient N. underwent the operation "Microsurgical removal of the tumor of the left occipital lobe". A cell culture was isolated from the biopsy of the removed tissue. In culture, the claimed method assessed the malignancy of the cells. The calculation gave a value of y=4.04. This value corresponds to the degree of malignancy Grade IV. Conclusion on morphological examination: Glioblastoma, WHO Grade IV
Таким образом из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ решает задачу оценки степени злокачественности культур клеток глиомы. Способ позволяет достоверно различать степени злокачественности Grade II, Grade III и Grade IV.Thus, from the above examples it can be seen that the proposed method solves the problem of assessing the degree of malignancy of glioma cell cultures. The method allows to reliably distinguish the grade II, Grade III and Grade IV malignancy.
Список использованной литературыList of used literature
1. El-Rayes В.F. et al. Cellular DNA content parameters as prognostic indicators in human astrocytomas //Journal of neuro-oncology. - 2005. - T. 71. - №. 2. - C. 85-89.1. El-Rayes B.F. et al. Cellular DNA content parameters as prognostic indicators in human astrocytomas //Journal of neuro-oncology. - 2005. - T. 71. - No. 2. - C. 85-89.
2. Способ диагностики степени злокачественности глиом. Патент РФ 2423920.2. Method for diagnosing the degree of malignancy of gliomas. RF patent 2423920.
3. Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК. Патент РФ 2709651.3. A method for the differential diagnosis of gliomas based on the analysis of gene expression and micro-RNA. RF patent 2709651.
Claims (12)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2786007C1 true RU2786007C1 (en) | 2022-12-15 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2508542C1 (en) * | 2012-07-16 | 2014-02-27 | Полина Михайловна Шварцбурд | Rapid method for determining risk of cell malignancy |
| RU2709651C1 (en) * | 2018-11-29 | 2019-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for differential diagnosis of gliomas based on analysis of gene expression and micro-rna |
| RU2717944C1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-03-27 | Валентин Григорьевич Никитаев | Method for assessing degree of malignancy of prostatic adenocarcinoma |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2508542C1 (en) * | 2012-07-16 | 2014-02-27 | Полина Михайловна Шварцбурд | Rapid method for determining risk of cell malignancy |
| RU2709651C1 (en) * | 2018-11-29 | 2019-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for differential diagnosis of gliomas based on analysis of gene expression and micro-rna |
| RU2717944C1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-03-27 | Валентин Григорьевич Никитаев | Method for assessing degree of malignancy of prostatic adenocarcinoma |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Garrido P. et al. Multidisciplinary consensus on optimising the detection of NTRK gene alterations in tumours //Clinical and Translational Oncology. - 2021. - Т. 23. - No. 8. - С. 1529-1541. Xu D. et al. Development and clinical validation of a novel 9-gene prognostic model based on multi-omics in pancreatic adenocarcinoma //Pharmacological Research. - 2021. - Т. 164. - С. 105370. Alquicira-Hernandez J. et al. scPred: accurate supervised method for cell-type classification from single-cell RNA-seq data //Genome biology. - 2019. - Т. 20. - No. 1. - С. 1-17. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2904658A1 (en) | Method for identifying the quantitative cellular composition in a biological sample | |
| CN110564852A (en) | MiRNAs expression map model related to human multiple myeloma, construction method and application | |
| CN109504784B (en) | MiRNA molecular marker for predicting early embryo quality in human assisted reproduction technology and application thereof | |
| CN106555004B (en) | The lncRNA markers of cerebral arterial thrombosis | |
| CN109022573B (en) | Breast cancer PIK3CA hot spot mutation detection probe primer sequence combination and kit | |
| CN109055555A (en) | A kind of lung cancer transfer diagnosis marker and its kit and application in early days | |
| CN109694852B (en) | Human glioma primary cell and in-vitro isolation culture method and application thereof | |
| RU2012121874A (en) | DIAGNOSTIC METHODS FOR DETERMINING THE FORECAST OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER | |
| RU2786007C1 (en) | Method for assessing cell malignancy in glioma cultures | |
| CN111118170B (en) | Application of chi-miR-450-5p as goat follicle maturation miRNA marker | |
| CN106244675B (en) | Kit for adult AML risk stratification and clinical prognosis evaluation and application of CPNE3 | |
| CN101988062A (en) | cervical cancer detection markers and detection method, kit and biochip thereof | |
| CN103958698A (en) | Method for quantifying renal markers by assaying urine | |
| CN108165627B (en) | Molecular marker for diagnosing and treating pelvic cavity prolapse | |
| CN101365800B (en) | Composition and method for determination of CK19 expression | |
| RU2780236C1 (en) | Method for estimating the degree of cell anaplasia in the glioma culture | |
| CN105132547B (en) | The application of STAC2 genes and its encoding proteins in pelvic prolapse is suppressed | |
| CN107345244A (en) | Detect method, primer and the kit of leukaemia TEL AML1 fusions | |
| CN107574241B (en) | Method for detecting depression family gene SKA1-3 | |
| CN108315428A (en) | A kind of the primer combination of probe object and its detection method of detection PIK3CA genes E545K | |
| CN105821131B (en) | Osteosarcoma miRNA marker | |
| CN111575385B (en) | Application of SB290157 in ovarian epithelial cancer diseases | |
| CN110551817A (en) | Kit for detecting human WT1 fusion gene and use method thereof | |
| RU2743223C1 (en) | Method of differential diagnosis of glial brain tumors | |
| CN107385027B (en) | Gene chip for screening mRNA (messenger ribonucleic acid) related to liver aging and preparation method and application thereof |