RU2783882C2 - Method for assessment of toxin-forming capability of aflatoxigenic strain - Google Patents
Method for assessment of toxin-forming capability of aflatoxigenic strain Download PDFInfo
- Publication number
- RU2783882C2 RU2783882C2 RU2021105539A RU2021105539A RU2783882C2 RU 2783882 C2 RU2783882 C2 RU 2783882C2 RU 2021105539 A RU2021105539 A RU 2021105539A RU 2021105539 A RU2021105539 A RU 2021105539A RU 2783882 C2 RU2783882 C2 RU 2783882C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aflatoxin
- toxin
- gene
- strain
- aspergillus flavus
- Prior art date
Links
- 230000002845 aflatoxigenic Effects 0.000 title claims abstract description 13
- HCUOEKSZWPGJIM-YBRHCDHNSA-N (E,2E)-2-hydroxyimino-6-methoxy-4-methyl-5-nitrohex-3-enamide Chemical compound COCC([N+]([O-])=O)\C(C)=C\C(=N/O)\C(N)=O HCUOEKSZWPGJIM-YBRHCDHNSA-N 0.000 claims abstract description 150
- 101700014648 aflD Proteins 0.000 claims abstract description 149
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 claims abstract description 145
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 claims abstract description 86
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 74
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000001551 toxigenic Effects 0.000 claims abstract description 24
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 claims abstract description 24
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 62
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 60
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 claims description 56
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 55
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 claims description 31
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 31
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 23
- 239000002609 media Substances 0.000 claims description 19
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 claims description 19
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 claims description 15
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 10
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 claims description 9
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 claims description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 claims description 9
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 9
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 claims description 8
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 claims description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 240000001016 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 6
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 230000036647 reaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming Effects 0.000 claims description 2
- 101710027621 CYP55A2 Proteins 0.000 claims 1
- 101700000225 NR4A3 Proteins 0.000 claims 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B1 Chemical compound C=1([C@@H]2C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 14
- 239000002115 aflatoxin B1 Substances 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 6
- 239000002097 aflatoxin B2 Substances 0.000 description 5
- WWSYXEZEXMQWHT-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B2 Chemical compound C=1([C@@H]2CCO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O WWSYXEZEXMQWHT-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LINOMUASTDIRTM-LZTLOYDTSA-N Vomitoxin Chemical compound C([C@]12[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1C=C(C([C@@H](O)[C@@]13CO)=O)C)C)O2 LINOMUASTDIRTM-LZTLOYDTSA-N 0.000 description 3
- MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N Zearalenone Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCCC(=O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 3
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 3
- 230000001351 cycling Effects 0.000 description 3
- 229930002954 deoxynivalenol Natural products 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XWIYFDMXXLINPU-WNWIJWBNSA-N Aflatoxin G1 Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1[C@@H]1C=CO[C@@H]1O2 XWIYFDMXXLINPU-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 2
- WPCVRWVBBXIRMA-WNWIJWBNSA-N Aflatoxin G2 Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1[C@@H]1CCO[C@@H]1O2 WPCVRWVBBXIRMA-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 2
- 239000002098 aflatoxin G1 Substances 0.000 description 2
- 239000002100 aflatoxin G2 Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000036159 relative stability Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1H-2-benzofuran-1-yl)-1H-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710024786 AFB1 Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 240000005781 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241000228230 Aspergillus parasiticus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101700066917 GRH1 Proteins 0.000 description 1
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 1
- 241000758791 Juglandaceae Species 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000229231 Phage E Species 0.000 description 1
- 240000006711 Pistacia vera Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N Potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003008 fumonisin Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 235000020233 pistachio Nutrition 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области биологии и, в частности, относится к способу оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма.The present invention relates to the field of biology and, in particular, relates to a method for assessing the toxin-forming ability of an aflatoxigenic strain.
Описание предшествующего уровня техникиDescription of the prior art
Афлатоксин представляет собой наиболее токсичный микотоксин, обнаруженный к настоящему времени. Если в качестве примера взять афлатоксин В1, то его токсичность в 10 раз превышает таковую для цианида калия и в 68 раз превышает таковую для мышьяка. Афлатоксин классифицируется Международной онкологической организацией как канцероген класса I. Афлатоксин может легко загрязнить зерновые продукты и маслопродукты, такие как арахис, кукурузу, рис и т.д., а также многие растительные продукты, такие как грецкие орехи, фисташки и сырье для китайской медицины. Наблюдалось много случаев отравления людей и скота афлатоксином в Китае и других странах. Согласно последнему отчету Международного агентства по изучению рака (IARC), только в развивающихся странах приблизительно 500 миллионов человек подвергаются риску воздействия афлатоксина. Китай является регионом с высоким уровнем загрязнения афлатоксином. Результаты учета, проводимого Министерством сельского хозяйства в течение многих лет, показывают, что заражение афлатоксином основных сельскохозяйственных продуктов в Китае постепенно увеличивается, а содержание токсинов на сильно загрязненных территориях превышает предельное содержание в сотни раз. Хотя высокотоксичные микотоксигенные штаммы составляют менее 20%, они стали серьезной скрытой опасностью, угрожающей качеству и безопасности продукции растениеводства.Aflatoxin is the most toxic mycotoxin discovered to date. Taking aflatoxin B1 as an example, its toxicity is 10 times that of potassium cyanide and 68 times that of arsenic. Aflatoxin is classified by the International Cancer Organization as a Class I carcinogen. Aflatoxin can easily contaminate grains and oil products such as peanuts, corn, rice, etc., as well as many plant foods such as walnuts, pistachios, and Chinese medicine raw materials. There have been many cases of human and livestock poisoning with aflatoxin in China and other countries. According to the latest report from the International Agency for Research on Cancer (IARC), approximately 500 million people in developing countries alone are at risk of exposure to aflatoxin. China is a region with high levels of aflatoxin pollution. The results of counts conducted by the Ministry of Agriculture for many years show that aflatoxin contamination of main agricultural products in China is gradually increasing, and the toxin content in heavily contaminated areas exceeds the limit by hundreds of times. Although highly toxic mycotoxigenic strains account for less than 20%, they have become a serious latent threat to the quality and safety of crop production.
Афлатоксин в основном вырабатывается такими грибами, как Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus. Исследования показали, что способность различных штаммов Aspergillus flavus вырабатывать афлатоксин, то есть их токсинообразующая способность, может различаться в сотни раз. Штаммы, обладающие токсинообразующей способностью, являются основным источником высокого загрязнения. Однако до сих пор отсутствует эффективный способ успешного выявления штаммов, обладающих токсинообразующей способностью, с применением специфичности. В настоящее время существуют, главным образом, два способа оценки токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus: один заключается в оценке токсинообразующей способности штаммов путем измерения выхода афлатоксина, вырабатываемого штаммами после некоторого периода времени культивирования штамма. Во-первых, способ этого типа занимает много времени, поскольку штаммы необходимо выделить, а затем культивировать, и затем проводить оценку путем измерения содержания афлатоксина. А во-вторых, на биосинтез афлатоксина влияет множество сложных факторов. Кроме того, выход афлатоксина сильно варьируется от одной партии к другой партии одних и тех же штаммов, и результат токсинообразующей способности не подходит для использования при описании характеристик выхода, присущих штамму, что влияет на точность и надежность результатов этого способа в отношении выявления и оценки. Способ другого типа представляет собой оценку токсинообразующей способности штаммов путем измерения транскрипционной активности генов, связанных с токсинообразующей способностью. Существует литература, посвященная выявлению гена Nor-1 для оценки токсинообразующей способности. Однако недостатком способа этого типа является то, что в естественном состоянии имеют место дефекты в генах токсигенности, отличных от гена Nor-1, что приводит к тому, что даже в случае выявления экспрессии гена Nor-1 афлатоксин не образуется в силу его свойств, а это ведет к ложным результатам таких способов.Aflatoxin is mainly produced by fungi such as Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Studies have shown that the ability of different strains of Aspergillus flavus to produce aflatoxin, that is, their toxin-producing ability, can vary hundreds of times. Strains with toxin-producing ability are the main source of high pollution. However, there is still no effective way to successfully identify strains with toxin-producing ability using specificity. Currently, there are mainly two ways to evaluate the toxin-producing ability of Aspergillus flavus strains: one is to evaluate the toxin-producing ability of the strains by measuring the yield of aflatoxin produced by the strains after a certain period of time culturing the strain. Firstly, this type of method is time consuming because the strains must be isolated and then cultured and then assessed by measuring the content of aflatoxin. Secondly, aflatoxin biosynthesis is influenced by many complex factors. In addition, the yield of aflatoxin varies greatly from one batch to another batch of the same strains, and the result of toxin-forming capacity is not suitable for use in describing the yield characteristics inherent in the strain, which affects the accuracy and reliability of the results of this method in terms of detection and evaluation. Another type of method is to evaluate the toxin-producing ability of strains by measuring the transcriptional activity of genes associated with toxin-producing ability. There is literature on the identification of the Nor-1 gene to assess toxin-forming capacity. However, the disadvantage of this type of method is that in the natural state there are defects in toxigenicity genes other than the Nor-1 gene, which leads to the fact that even if the expression of the Nor-1 gene is detected, aflatoxin is not formed due to its properties, and this leads to false results of such methods.
Вкратце, объективная и точная оценка токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма представляют собой нерешенную проблему для практикующих специалистов во всем мире.In short, an objective and accurate assessment of the toxin-forming capacity of an aflatoxigenic strain is an unresolved problem for practitioners worldwide.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Ввиду недостатков предшествующего уровня техники настоящее изобретение направлено на предоставление способа оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма.In view of the shortcomings of the prior art, the present invention is directed to providing a method for evaluating the toxin-producing ability of an aflatoxigenic strain.
Для достижения цели настоящего изобретения техническое решение, принятое согласно настоящему изобретению, представляет собой следующее.To achieve the object of the present invention, the technical solution adopted according to the present invention is as follows.
Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма включает следующие стадии, предусматривающие измерение выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1 штаммов Aspergillus flavus для получения отношения выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1, оценку токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма в зависимости от отношения выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1.The method for assessing the toxin-forming ability of an aflatoxigenic strain includes the following steps, which include measuring the output of aflatoxin and the transcriptional activity of the Nor-1 gene of Aspergillus flavus strains to obtain the ratio of the output of aflatoxin to the transcriptional activity of the Nor-1 gene, assessing the toxin-forming ability of the aflatoxin strain depending on the ratio of the output of aflatoxin to transcriptional activity of the Nor-1 gene.
Согласно изложенному выше решению способ измерения выхода афлатоксина включает следующие стадии: культивирование штамма Aspergillus flavus, сбор спор Aspergillus flavus для культивирования со встряхиванием, после культивирования фильтрацию с получением фильтрата и измерение концентрации афлатоксина в фильтрате.According to the above solution, the method for measuring aflatoxin yield includes the following steps: culturing the Aspergillus flavus strain, collecting Aspergillus flavus spores for shaking culture, after culturing filtration to obtain a filtrate, and measuring the concentration of aflatoxin in the filtrate.
Согласно изложенному выше решению среда, используемая для культивирования штамма Aspergillus flavus, представляет собой среду CDA, а условия культивирования являются следующими: культивирование при 28°C и влажности 90% в течение 10 дней.According to the above decision, the medium used for culturing the Aspergillus flavus strain is CDA medium, and the culturing conditions are as follows: culturing at 28°C and 90% humidity for 10 days.
Среда, используемая для встряхиваемой культуры спор Aspergillus flavus, представляет собой жидкую среду с картофельной декстрозой, а условия культивирования являются следующими: культивирование со встряхиванием при 28°C и 200 об/мин в течение 96 часов.The medium used for the shake culture of Aspergillus flavus spores is potato dextrose liquid medium, and the culture conditions are as follows: shake culture at 28° C. and 200 rpm for 96 hours.
Согласно изложенному выше решению применяют способ иммуноаффинной очистки в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией для измерения концентрации афлатоксина в фильтрате после культивирования со встряхиванием спор Aspergillus flavus.According to the above solution, an immunoaffinity purification method in combination with high performance liquid chromatography is used to measure the concentration of aflatoxin in the filtrate after shaking culture of Aspergillus flavus spores.
Согласно изложенному выше решению способ измерения транскрипционной активности гена Nor-1 включает следующие стадии: культивирование штамма Aspergillus flavus, сбор спор Aspergillus flavus для культивирования со встряхиванием, после завершения культивирования фильтрацию гифов Aspergillus flavus и получение высушенных микроорганизмов в результате сушки, а затем используют способ измерения транскрипционной активности гена Nor-1 для измерения транскрипционной активности гена Nor-1 в высушенных микроорганизмах.According to the above solution, the method for measuring the transcriptional activity of the Nor-1 gene includes the following steps: culturing the Aspergillus flavus strain, collecting Aspergillus flavus spores for shaking culture, filtering Aspergillus flavus hyphae after culturing is completed, and obtaining dried microorganisms by drying, and then using the measurement method transcriptional activity of the Nor-1 gene to measure the transcriptional activity of the Nor-1 gene in dried microorganisms.
Согласно изложенному выше решению показатели выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1 также можно получить посредством способа одновременного выявления на основе RT-PCR. Конкретные стадии включают в себя следующее.According to the above solution, the aflatoxin yield and transcriptional activity of the Nor-1 gene can also be obtained by the RT-PCR-based simultaneous detection method. Specific steps include the following.
(1) Построение S-образной кривой для количественного определения афлатоксина: на стадии иммунной реакции, если количество нанесенного в качестве покрытия моноклонального антитела к афлатоксину является постоянным, используют препараты стандарта афлатоксина для конкуренции с фагом с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину за связывание с моноклональным антителом к афлатоксину. После завершения иммунной реакции фаг с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину, связанным с моноклональным антителом к афлатоксину, элюируют. Препараты стандарта афлатоксина соответствуют разному количеству элюированного фага. Из содержащегося в элюате фага высвобождаются молекулы ДНК во время нагревания в ходе ПЦР, и при этом высвободившиеся молекулы ДНК используют в качестве мишеней для амплификации в реакции RT-PCR. Каждый элюат подвергают реакции амплификации в RT-PCR с использованием набора, и после завершения реакции амплификации получают разные значения Ct. Логарифм концентрации афлатоксина используют в качестве абсциссы, а значение Ct используют в качестве ординаты, и для получения S-образной кривой для количественного определения афлатоксина выполняют регрессионный анализ.(1) S-curve for aflatoxin quantitation: At the stage of immune reaction, if the amount of coated anti-aflatoxin monoclonal antibody is constant, use aflatoxin standard preparations to compete with phage with surface-exposed anti-idiotypic anti-aflatoxin nanoantibody for binding to monoclonal antibody to aflatoxin. After the completion of the immune response, the phage with the anti-idiotypic anti-aflatoxin nanoantibody surfaced and bound to the anti-aflatoxin monoclonal antibody is eluted. Aflatoxin standard preparations correspond to different amounts of eluted phage. DNA molecules are released from the phage contained in the eluate during heating during PCR, and the released DNA molecules are used as targets for amplification in the RT-PCR reaction. Each eluate is subjected to an RT-PCR amplification reaction using a kit, and after completion of the amplification reaction, different Ct values are obtained. The logarithm of the aflatoxin concentration is used as the abscissa and the Ct value is used as the ordinate, and a regression analysis is performed to obtain an S-shaped curve for aflatoxin quantification.
(2) Построение кривой RT-PCR для транскрипционной активности гена Nor-1: серийно разводят образцы с известным числом копий фрагмента ДНК гена Nor-1 Tq-nor1 с получением разного числа копий, а затем используют набор для проведения реакции RT-PCR-амплификации для каждого числа копий Tq-nor1 отдельно. После реакции амплификации получают разные значения Ct. Логарифм числа копий Tq-nor1 используют в качестве абсциссы, а значение Ct используют в качестве ординаты для выполнения регрессионного анализа с получением при этом кривой для количественного определения транскрипции гена Nor-1.(2) Construction of RT-PCR curve for transcriptional activity of Nor-1 gene: Serially dilute samples with known copy number of the Nor-1 DNA fragment Tq-nor1 to obtain different copy numbers, and then use the kit to carry out the RT-PCR amplification reaction for each number of Tq-nor1 copies separately. After the amplification reaction, different Ct values are obtained. The logarithm of the Tq-nor1 copy number is used as the abscissa and the Ct value is used as the ordinate to perform a regression analysis to obtain a curve to quantify the transcription of the Nor-1 gene.
(3) Осуществление культивирования штамма Aspergillus flavus с получением спор Aspergillus flavus, сбор спор Aspergillus flavus для культивирования со встряхиванием. После завершения культивирования фильтруют раствор для культивирования штамма от мицелия грибов Aspergillus flavus. После разбавления раствора для культивирования штамма в некотором соотношении используют его для замены препаратов стандарта афлатоксина в иммунной реакции, проводимой на стадии (1), для осуществления реакции, основанной на иммунной конкуренции. После конкурентной реакции фаг с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину, связанным с моноклональным антителом к афлатоксину, элюируют, и молекулы ДНК, высвобождаемые содержащимися в элюате фагами, используют в качестве матрицы амплификации для количественного определения афлатоксина в реакции одновременной RT-PCR-амплификации. Кроме того, после высушивания мицелия грибов Aspergillus flavus общую РНК выделяют и подвергают обратной транскрипции с получением cDNA, и cDNA разбавляют в некотором соотношении и используют в качестве матрицы для амплификации гена Nor-1 в реакции одновременной RT-PCR-амплификации.(3) Carrying out cultivation of the Aspergillus flavus strain to obtain Aspergillus flavus spores, collecting Aspergillus flavus spores for culture with shaking. After completion of cultivation, the solution for cultivating the strain from the mycelium of the fungi Aspergillus flavus is filtered. After diluting the strain culture solution in a certain ratio, it is used to replace the aflatoxin standard preparations in the immune reaction carried out in step (1) to carry out the reaction based on immune competition. After a competitive reaction, the surface-surfaced anti-idiotypic aflatoxin nanoantibody bound to an aflatoxin monoclonal antibody is eluted, and the DNA molecules released by the phages contained in the eluate are used as an amplification template to quantify aflatoxin in a simultaneous RT-PCR amplification reaction. In addition, after drying the mycelium of Aspergillus flavus, total RNA is isolated and reverse transcribed to obtain cDNA, and cDNA is diluted in a certain ratio and used as a template for amplifying the Nor-1 gene in a simultaneous RT-PCR amplification reaction.
(4) Бактериофаг V2-5 и cDNA используют в качестве матриц для проведения реакции одновременной RT-PCR-амплификации. После реакции амплификации получают два значения Ct, и эти два значения Ct соответственно сопоставляют с S-образной кривой для количественного определения афлатоксина и кривой для количественного определения транскрипции гена Nor-1, при этом выполняют преобразование для получения показателей концентрации афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1 с определением отношения выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1.(4) V2-5 bacteriophage and cDNA are used as templates for carrying out the simultaneous RT-PCR amplification reaction. After the amplification reaction, two Ct values are obtained, and these two Ct values are respectively compared with an S-curve for the quantification of aflatoxin and a curve for the quantification of transcription of the Nor-1 gene, and transformation is performed to obtain the aflatoxin concentration and the transcriptional activity of the Nor- gene. 1 with the determination of the ratio of the output of aflatoxin to the transcriptional activity of the Nor-1 gene.
Согласно изложенному выше решению фаг с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину представляет собой фаг VHH 2-5, а моноклональное антитело к афлатоксину представляет собой моноклональное антитело к афлатоксину 1С11.According to the above solution, the phage with the anti-idiotypic aflatoxin nanoantibody surfaced is the VHH 2-5 phage, and the anti-aflatoxin monoclonal antibody is the anti-aflatoxin monoclonal antibody 1C11.
Согласно изложенному выше решению в реакционной системе, предусматривающей реакцию одновременной RT-PCR-амплификации, конечная концентрация прямых и обратных праймеров Ph-F, Ph-R, Tq-nor1-F и Tq-nor1-R составляет от 300 нМ до 400 нМ; флуоресцентный зонд: конечная концентрация Ph-зонда и Tq-зонда составляет от 200 нМ до 400 нМ; конечная доза ДНК-полимеразы: от 0,5 Ед до 1,0 Ед; конечная концентрация MgCl2: от 1 мМ до 2 мМ; конечная концентрация dNTP: от 200 мкМ до 400 мкМ.According to the solution above, in the reaction system involving the simultaneous RT-PCR amplification reaction, the final concentration of forward and reverse primers Ph-F, Ph-R, Tq-nor1-F and Tq-nor1-R is from 300 nM to 400 nM; fluorescent probe: final concentration of Ph probe and Tq probe is 200 nM to 400 nM; final dose of DNA polymerase: 0.5 U to 1.0 U; final concentration of MgCl 2 : 1 mM to 2 mM; final dNTP concentration: 200 μM to 400 μM.
Согласно изложенному выше решению нуклеотидная последовательность прямого праймера Ph-F представлена под SEQ ID N0:1; нуклеотидная последовательность обратного праймера Ph-R представлена под SEQ ID NO: 2; нуклеотидная последовательность Ph-зонда, представляющего собой флуоресцентный зонд, представлена под SEQ ID NO: 3; нуклеотидная последовательность прямого праймера Tq-nor1-F представлена под SEQ ID NO: 4; нуклеотидная последовательность обратного праймера Tq-nor1-R представлена под SEQ ID NO: 5; нуклеотидная последовательность Tq-зонда, представляющего собой флуоресцентный зонд, представлена под SEQ ID NO: 6.According to the above decision, the nucleotide sequence of the Ph-F forward primer is shown under SEQ ID N0:1; the nucleotide sequence of the Ph-R reverse primer is shown under SEQ ID NO: 2; the nucleotide sequence of the Ph probe, which is a fluorescent probe, is shown under SEQ ID NO: 3; the nucleotide sequence of the forward primer Tq-nor1-F is shown under SEQ ID NO: 4; the nucleotide sequence of the reverse primer Tq-nor1-R is shown under SEQ ID NO: 5; the nucleotide sequence of the Tq probe, which is a fluorescent probe, is shown under SEQ ID NO: 6.
Согласно изложенному выше решению реакционная система, предусматривающая реакцию одновременной RT-PCR-амплификации, включает 5 мкл мастер-микса Universal Probe для qPCR, 0,1 мкл Ph-F, 0,1 мкл Ph-R, 0,1 мкл Ph-зонда, 2 мкл фаговой матрицы, 0,1 мкл Tq-nor1-F, 0,1 мкл Tq-nor1-R, 0,1 мкл Tq-зонда, 1 мкл матрицы гена Nor-1, 0,2 мкл ДНК-полимеразы, 0,8 мкл MgCl2, 0,2 мкл dNTP, при этом добавляют Н2О для доведения до 10 мкл.According to the solution above, the reaction system for the simultaneous RT-PCR amplification reaction includes 5 µl of Universal Probe qPCR master mix, 0.1 µl of Ph-F, 0.1 µl of Ph-R, 0.1 µl of Ph-probe , 2 µl phage template, 0.1 µl Tq-nor1-F, 0.1 µl Tq-nor1-R, 0.1 µl Tq probe, 1 µl Nor-1 gene template, 0.2 µl DNA polymerase, 0.8 µl MgCl 2 , 0.2 µl dNTP while adding H 2 O to make up to 10 µl.
Согласно изложенному выше решению условия реакции одновременной RT-PCR-амплификации являются следующими: 95°C, 5 мин; 95°C, 10 с, 60°C, 30 с, 40 циклов.According to the above solution, the reaction conditions of the simultaneous RT-PCR amplification are as follows: 95° C., 5 min; 95°C, 10 s, 60°C, 30 s, 40 cycles.
Согласно изложенному выше решению диапазон концентраций афлатоксина на S-образной кривой для количественного определения афлатоксина составляет от 33,33 нг/мл до 1,69 пг/мл, и нижний предел выявления (LOD) афлатоксина составляет 0,018 нг/мл. На кривой для количественного определения транскрипции гена Nor-1 число копий гена Nor-1 находится в диапазоне от 102 до 108.According to the solution above, the aflatoxin concentration range on the S-curve for aflatoxin quantitation is 33.33 ng/mL to 1.69 pg/mL, and the lower limit of detection (LOD) of aflatoxin is 0.018 ng/mL. On the curve for quantifying the transcription of the Nor-1 gene, the copy number of the Nor-1 gene ranges from 10 2 to 10 8 .
Согласно изложенному выше решению токсинообразующую способность афлатоксигенного штамма обозначают как Y, и отношение выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1 (AFT/Nor-1) обозначают как X. Формула для оценки токсинообразующей способности Aspergillus flavus представляет собой Y=10,14Х - 16,20. Для высокотоксигенного штамма токсинообразующая способность составляет >150 нг/мл; умеренная токсинообразующая способность: 50< токсинообразующая способность <150 нг/мл; низкая токсинообразующая способность соответствует токсинообразующей способности <50 нг/мл; отсутствие выработки токсина: 0. Указанные выше значения подставляют в формулу для расчета диапазона оценки токсинообразующей способности, причем AFT/Nor-1 > 16,4 указывает на высокотоксигенный штамм; 6,5 < AFT/Nor-1 < 16,4 указывает на умеренно токсигенный штамм; 0<AFT/Nor-1 < 6,5 указывает на низкотоксигенный штамм; AFT/Nor-1=0 указывает на нетоксигенный штамм.According to the above solution, the toxin-producing ability of the aflatoxigenic strain is denoted as Y, and the ratio of aflatoxin yield to the transcriptional activity of the Nor-1 gene (AFT/Nor-1) is denoted as X. The formula for evaluating the toxin-producing ability of Aspergillus flavus is ,twenty. For a highly toxigenic strain, the toxin-forming capacity is >150 ng/mL; moderate toxin-forming capacity: 50< toxin-forming capacity <150 ng/ml; low toxin-forming capacity corresponds to toxin-forming capacity <50 ng/ml; no toxin production: 0. The above values are substituted into the formula to calculate the range of toxin-producing ability, with AFT/Nor-1 > 16.4 indicating a highly toxigenic strain; 6.5 < AFT/Nor-1 < 16.4 indicates a moderately toxigenic strain; 0<AFT/Nor-1 < 6.5 indicates a low toxigenic strain; AFT/Nor-1=0 indicates a non-toxigenic strain.
Полезный эффект настоящего изобретения заключается в следующем.The advantageous effect of the present invention is as follows.
(1) В исследовании согласно настоящему изобретению было доказано, что отношение выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1 характеризуется высокой относительной стабильностью. Путем построения модели оценки токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus можно получить уравнение регрессии для отношения токсинообразующей способности Aspergillus flavus и выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1 (AFT/Nor-1). Путем определения отношения AFT/Nor-1 можно быстро и точно осуществлять оценку токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus, что имеет большое значение для раннего предупреждения, предотвращения и контроля загрязнения афлатоксином.(1) In the study according to the present invention, it was proved that the ratio of aflatoxin yield to the transcriptional activity of the Nor-1 gene is characterized by high relative stability. By constructing a model for assessing the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus strains, a regression equation can be obtained for the ratio of the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus and aflatoxin yield to the transcriptional activity of the Nor-1 (AFT/Nor-1) gene. By determining the AFT/Nor-1 ratio, it is possible to quickly and accurately assess the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus strains, which is of great importance for the early warning, prevention and control of aflatoxin contamination.
(2) В настоящем изобретении предусматривается способ одновременного обнаружения на основе RT-PCR для одновременного выявления токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus и транскрипционной активности гена Nor-1. Существует четкая линейная взаимосвязь между токсинообразующей способностью штаммов Aspergillus flavus и транскрипционной активностью гена Nor-1, полученными при помощи способа одновременного выявления на основе RT-PCR согласно настоящему изобретению, при этом количественное определение афлатоксина проводили с помощью ВЭЖХ, а также проводили количественное определение транскрипционной активности гена Nor-1 при помощи Nanodrop. Следовательно, результат, полученный для отношения AFT/Nor-1 (токсинообразующая способность штамма Aspergillus flavus/транскрипционная активность гена Nor-1), полученного с использованием способа одновременного выявления на основе RT-PCR, является надежным и точным и может использоваться в качестве показателя идентификации для оценки токсинообразующей способности штамма Aspergillus flavus.(2) The present invention provides an RT-PCR-based simultaneous detection method for simultaneously detecting the toxin-producing ability of Aspergillus flavus strains and the transcriptional activity of the Nor-1 gene. There is a clear linear relationship between the toxin-producing ability of Aspergillus flavus strains and the transcriptional activity of the Nor-1 gene obtained using the simultaneous detection method based on RT-PCR according to the present invention, while the quantitative determination of aflatoxin was carried out using HPLC, and the quantitative determination of transcriptional activity was also carried out Nor-1 gene using Nanodrop. Therefore, the result obtained for the AFT/Nor-1 ratio (Aspergillus flavus strain toxin-producing ability/Nor-1 gene transcriptional activity) obtained using the RT-PCR-based simultaneous detection method is reliable and accurate and can be used as an identification indicator to assess the toxin-forming ability of the Aspergillus flavus strain.
(3) В способе одновременного выявления на основе RT-PCR токсинообразующей способности штамма Aspergillus flavus и транскрипционной активности гена Nor-1, описанном в данном документе, необходимое количество реагентов меньше и стоимость ниже, и, следовательно, можно достичь высокой производительности выявления. Способ одновременного выявления на основе RT-PCR обеспечивает упрощение режима анализа, оптимизацию процедуры и структуры эксперимента, а также обеспечивает платформу для выявления и теоретическую основу для одновременного анализа афлатоксина и других низкомолекулярных соединений, связанных с путем его синтеза.(3) In the method for simultaneous detection based on RT-PCR of the toxin-forming ability of the Aspergillus flavus strain and the transcriptional activity of the Nor-1 gene described herein, the required amount of reagents is smaller and the cost is lower, and therefore high detection performance can be achieved. The RT-PCR-based simultaneous detection method provides a simplification of the analysis mode, optimization of the procedure and experimental design, and provides a detection platform and a theoretical basis for the simultaneous analysis of aflatoxin and other small molecular weight compounds associated with its synthesis pathway.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
На ФИГ. 1 показана оптимизация концентрации ДНК-полимеразы, dNTP и MgCl2 в одновременной реакции RT-PCR.FIG. 1 shows the optimization of the concentration of DNA polymerase, dNTP and MgCl 2 in a simultaneous RT-PCR reaction.
На ФИГ. 2 показана оценка эффективности одновременной RT-PCR-амплификации.FIG. 2 shows an evaluation of the efficiency of simultaneous RT-PCR amplification.
ФИГ. 3 представляет собой стандартную кривую количественного анализа для количественного определения афлатоксина В1 и транскрипции гена Nor-1 посредством способа на основе одновременной RT-PCR.FIG. 3 is a standard quantitation curve for the quantitation of aflatoxin B1 and transcription of the Nor-1 gene by the simultaneous RT-PCR method.
На ФИГ. 4 показана перекрестная реактивность при количественном определении в одновременной RT-PCR для афлатоксина B1, В2, G1, G2, ZEN, DON, FBI.FIG. 4 shows cross-reactivity in simultaneous RT-PCR quantitation for aflatoxin B1, B2, G1, G2, ZEN, DON, FBI.
На ФИГ. 5 показано сравнение результатов количественного определения посредством одновременной RT-PCR, ВЭЖХ и Nanodrop.FIG. 5 shows a comparison of the results of quantification by simultaneous RT-PCR, HPLC and Nanodrop.
На ФИГ. 6 показана корреляционная взаимосвязь (А) между выходом афлатоксина и величиной экспрессии гена Nor-1, а также корреляционная взаимосвязь (В) между выходом афлатоксина и отношением AFT/Nor-1.FIG. 6 shows the correlation (A) between aflatoxin yield and Nor-1 gene expression, and the correlation (B) between aflatoxin yield and AFT/Nor-1 ratio.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDESCRIPTION OF EMBODIMENTS
Для того чтобы сделать настоящее изобретение более доступным для понимания, содержание настоящего изобретения будет дополнительно разъяснено ниже в связи с вариантами осуществления, но при этом содержание настоящего изобретения не ограничено следующими вариантами осуществления.In order to make the present invention more understandable, the content of the present invention will be further explained below in connection with the embodiments, but the content of the present invention is not limited to the following embodiments.
Вариант осуществления 1
1. В настоящем исследовании доказано, что отношение выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1 характеризуется высокой относительной стабильностью.1. In this study, it was proved that the ratio of aflatoxin yield to the transcriptional activity of the Nor-1 gene is characterized by high relative stability.
Взвешивают 1 г NaNO3, 1 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4⋅7H2O, 0,5 г KCl, 0,01 г FeSO4, 30 г глюкозы и 20 г порошкообразного агара. Разбавляют их деионизированной водой до общего объема 1000 мл и стерилизуют их высокотемпературным паром при 121°C в течение 30 мин для получения среды CDA. Штамм Aspergillus flavus культивируют на твердой среде CDA при 28°C и влажности 90% в течение 10 дней, а затем культуральный планшет промывают 20% Tween-20 для получения раствора со спорами Aspergillus flavus. Используют способ подсчета при помощи гемоцитометра, раствор спор Aspergillus flavus равномерно встряхивают с помощью вихревого встряхивателя и споры Aspergillus flavus в растворе подсчитывают под микроскопом.Weigh out 1 g NaNO 3 , 1 g K 2 HPO 4 , 0.5 g MgSO 4 .7H 2 O, 0.5 g KCl, 0.01 g FeSO 4 , 30 g glucose and 20 g powdered agar. Dilute them with deionized water to a total volume of 1000 ml and sterilize them with high temperature steam at 121°C for 30 min to obtain a CDA medium. The Aspergillus flavus strain was cultured on CDA solid medium at 28°C and 90% humidity for 10 days, and then the culture plate was washed with 20% Tween-20 to obtain a solution with Aspergillus flavus spores. The hemocytometer counting method is used, the Aspergillus flavus spore solution is uniformly shaken with a vortex shaker, and the Aspergillus flavus spores in the solution are counted under a microscope.
В колбу Эрленмейера объемом 50 мл помещают 15 мл жидкой среды с картофельной декстрозой, автоклавируют жидкую среду с картофельной декстрозой при 121°C в течение 30 минут. После этого на основании результатов подсчета добавляют раствор со спорами Aspergillus flavus до тех пор, пока конечная концентрация не составит 1×105 спор на мл, и культивируют со встряхиванием при 28°C и 200 об/мин в течение 96 ч. Культуральный бульон фильтруют с помощью двухслойной фильтровальной бумаги с получением фильтрата (сохраняют для последующего использования) и мицелия грибов Aspergillus flavus. Для получения мицелия грибов Aspergillus flavus отжимают лишнюю воду фильтровальной бумагой и высушивают в сушильной камере при 65°C в течение 12 часов для получения высушенных микроорганизмов. После охлаждения до комнатной температуры хранят при -70°C для последующего использования. Фильтрат, полученный при фильтровании, хранят при 4°C для последующего использования.In a 50 ml Erlenmeyer flask, 15 ml of liquid medium with potato dextrose are placed, the liquid medium with potato dextrose is autoclaved at 121° C. for 30 minutes. Thereafter, based on the results of counting, the Aspergillus flavus spore solution is added until the final concentration is 1×10 5 spores per ml, and cultured with shaking at 28°C and 200 rpm for 96 hours. The culture broth is filtered using two-layer filter paper to obtain the filtrate (retained for later use) and the mycelium of the fungi Aspergillus flavus. To obtain Aspergillus flavus mycelium, excess water is squeezed out with filter paper and dried in a drying chamber at 65°C for 12 hours to obtain dried microorganisms. After cooling to room temperature, store at -70°C for later use. The filtrate obtained by filtration is stored at 4°C for later use.
Для измерения концентрации афлатоксина в фильтрате (хранящемся для последующего использования, как описано выше) после культивирования со встряхиванием спор Aspergillus flavus применяют стандартный способ иммуноаффинной очистки в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией, а затем для измерения транскрипционной активности гена Nor-1 в высушенных микроорганизмах, хранящихся для последующего использования, применяют обычный способ измерения транскрипционной активности гена Nor-1.To measure the concentration of aflatoxin in the filtrate (stored for later use as described above) after shaking culture of Aspergillus flavus spores, a standard immunoaffinity purification method in combination with high performance liquid chromatography is used, and then to measure the transcriptional activity of the Nor-1 gene in dried microorganisms stored for later use, the conventional method for measuring the transcriptional activity of the Nor-1 gene is used.
С применением той же процедуры, что описана выше, семь штаммов Aspergillus flavus культивируют в разные периоды времени до и после тестирования двух партий. Результаты измерения показаны в таблице 1.Using the same procedure as described above, seven strains of Aspergillus flavus were cultured at different times before and after two batches were tested. The measurement results are shown in Table 1.
Согласно результатам измерений в таблице 1 наблюдается большая разница между концентрацией афлатоксина в двух партиях, и поэтому выход афлатоксина сам по себе не может служить для оценки токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus. В некоторых случаях, когда относительная величина транскрипции гена Nor-1 для штаммов Aspergillus flavus является высокой, токсинообразующая способность оказывается неожиданно низкой. Кроме того, нетоксигенные штаммы также могут транскрибировать ген Nor-1, и, следовательно, одна только величина транскрипции гена Nor-1 не может служить для оценки токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus. В таблице 1 в связи с отношением, полученным путем деления концентрации афлатоксина на относительную величину транскрипции гена Nor-1, то есть значением [AFT]/[nor-1] в таблице 1, обнаруживается строгая закономерность. Являются сопоставимыми не только порядки величин токсинообразующей способности 7 штаммов, полученных из двух партий культуры, но также значение [AFT]/[nor-1] для каждого штамма является относительно стабильным и, таким образом, позволяет оценить токсинообразующую способность штаммов Aspergillus flavus.According to the measurement results in Table 1, there is a large difference between the concentration of aflatoxin in the two batches, and therefore the yield of aflatoxin alone cannot be used to evaluate the toxin-forming ability of Aspergillus flavus strains. In some cases, when the relative amount of transcription of the Nor-1 gene for strains of Aspergillus flavus is high, the toxin-forming capacity is unexpectedly low. In addition, non-toxigenic strains can also transcribe the Nor-1 gene, and therefore the Nor-1 gene transcription value alone cannot be used to assess the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus strains. In Table 1, in connection with the ratio obtained by dividing the concentration of aflatoxin by the relative amount of transcription of the Nor-1 gene, that is, the value of [AFT]/[nor-1] in Table 1, a strong pattern is found. Not only are the orders of magnitude of the toxin-forming capacity of the 7 strains obtained from the two culture lots comparable, but also the [AFT]/[nor-1] value for each strain is relatively stable and thus allows an assessment of the toxin-forming capacity of the Aspergillus flavus strains.
Из данных в таблице 1 следует, что если для оценки токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus применяют отношение концентрации афлатоксина к относительной величине транскрипции гена Nor-1, точность и надежность такого подхода значительно лучше, чем у подхода с использованием только концентрации афлатоксина или подхода с использованием только относительной величины транскрипции гена Nor-1.It follows from the data in Table 1 that if the ratio of aflatoxin concentration to the relative amount of transcription of the Nor-1 gene is used to assess the toxin-producing ability of Aspergillus flavus strains, the accuracy and reliability of this approach is significantly better than the approach using only the concentration of aflatoxin or the approach using only relative value of transcription of the Nor-1 gene.
Вариант осуществления 2. Разработка способа одновременного выявления на основе RT-PCR для получения показателей выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1Embodiment 2: Development of a RT-PCR-Based Simultaneous Detection Method for Measuring Aflatoxin Yield and Nor-1 Gene Transcriptional Activity
Используют известное антиидиотипическое наноантитело к афлатоксину, представленное на поверхности фага VHH 2-5, и фрагмент ДНК гена Nor-1, Tq-nor1, для разработки способа одновременного выявления на основе RT-PCR выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1. Приведенный выше результат выявления используется в качестве научной основы для определения и оценки токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus, обеспечивая аргументацию способа быстрого определения и оценки токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus. Конкретные стадии являются следующими.A well-known anti-idiotypic nanoantibody to aflatoxin, presented on the surface of the VHH 2-5 phage, and a DNA fragment of the Nor-1 gene, Tq-nor1, are used to develop a method for the simultaneous detection of aflatoxin release and transcriptional activity of the Nor-1 gene based on RT-PCR. The above detection result is used as a scientific basis for determining and evaluating the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus strains, providing a rationale for a rapid method for determining and evaluating the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus strains. The specific steps are as follows.
Представленное на поверхности фага VHH 2-5 антиидиотипическое наноантитело к афлатоксину разработано Центром контроля качества Института исследований масличных культур Китайской академии сельскохозяйственных наук и опубликовано в журнале «Yanru Wang; Peiwu Li; Zuzana Majkova; Candace RS Bever; Нее Too Kim; Qi Zhang; Julie E. Dechant; Shirley J. Gee; Bruce D. Hammock; Isolation of Alpaca Anti-Idiotypic Heavy-Chain Single-Domain Antibody for the Aflatoxin Immunoassay; Analytical Chemistry, 2013, 8298-8303». Фаг, используемый в этом примере, предварительно хранят в Е. coli ER2738 в лаборатории и получают путем амплификации. Способ амплификации является следующим.The anti-idiotype nanoantibody to aflatoxin presented on the surface of the VHH 2-5 phage was developed by the Quality Control Center of the Oilseed Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences and published in the journal “Yanru Wang; Peiwu Li; Zuzana Majkova; Candace RS Bever; Nee Too Kim; Qi Zhang; Julie E. Dechant; Shirley J. Gee; Bruce D. Hammock; Isolation of Alpaca Anti-Idiotypic Heavy-Chain Single-Domain Antibody for the Aflatoxin Immunoassay; Analytical Chemistry, 2013, 8298-8303". The phage used in this example is pre-stored in E. coli ER2738 in the laboratory and obtained by amplification. The amplification method is as follows.
Отбирают случайным образом одну колонию из планшета с отдельными колониями ER2738, содержащими фаг VHH 2-5 с наноантителами, вносят ее в жидкую среду, содержащую 1 мл SB-ампициллина, и инкубируют в течение ночи при 225 об/мин во встряхивателе с постоянной температурой при 37°C. Добавляют вышеуказанный образованный в течение ночи культуральный бульон к 100 мл жидкой среды с SB-ампициллином при 225 об/мин и 37°C и культивируют его до OD600=0,5-0,6. Добавляют 1,5 мл фага-помощника М13К07 (титр 1×1011 - 1×1012 БОЕ/мл) в раствор культивируемых бактерий и оставляют при 37°C в течение 30 мин. Добавляют канамицин с конечной концентрацией 70 мкг/мл в бульон при 37°C и 225 об/мин и встряхивают культуру в течение ночи. Полученный в течение ночи культуральный бульон центрифугируют при 4°C и 10000 об/мин в течение 15 минут, отбирают супернатант и переносят его в чистую пробирку для центрифугирования. Добавляют 1/4 объема PEG/NaCl и оставляют выдерживаться на льду в течение 2 часов. Центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 минут при 4°C, повторно суспендируют в 2 мл 0,5% BSA/PBS, а затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отбирают, отфильтровывают его с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и смешивают его с равным объемом стерильного глицерина, отбирают аликвоту и измеряют титр. Способ измерения титра является следующим.One colony is randomly selected from a plate with single colonies of ER2738 containing VHH 2-5 phage with nanoantibodies, introduced into a liquid medium containing 1 ml of SB-ampicillin, and incubated overnight at 225 rpm in a shaker with a constant temperature at 37°C. Add the above-formed overnight culture broth to 100 ml of liquid medium with SB-ampicillin at 225 rpm and 37°C and cultivate it to OD 600 =0.5-0.6. Add 1.5 ml of helper phage M13K07 (
Случайным образом отбирают одну колонию из планшета с отдельными колониями ER2738, инокулируют ее в жидкую среду LB, содержащую 0,04 мг/мл тетрациклина, культивируют в течение ночи во встряхивателе с постоянной температурой при 37°C и 225 об/мин. Отбирают 20 мкл вышеупомянутого бульона, который культивировали в течение ночи, и добавляют его к 2 мл среды SB. Его инкубируют при 225 об/мин и 37°C до OD600≈1. Для постепенного разбавления фага, титр которого необходимо проверить, используют жидкую среду LB. Отбирают 10 мкл каждого разведения и добавляют его к 100 мкл бульона ER2738 с OD600≈1 и оставляют его без изменения при 37°C в течение 20 минут. Осуществляют инфицирование фагом Е. coli; распределяют бульон с инфицированной Е. coli на чашке с LB-ампициллином, помещают ее вертикально в инкубатор с постоянной температурой 37°C на 30 минут, а затем переворачивают культуру на ночь. Отбирают приблизительно 100 отдельных колоний для подсчета на чашке и рассчитывают титр фага по следующей формуле:One colony was randomly selected from the ER2738 single colony plate, inoculated into liquid LB medium containing 0.04 mg/ml tetracycline, cultured overnight in a constant temperature shaker at 37° C. and 225 rpm. Take 20 μl of the above broth, which was cultivated overnight, and add it to 2 ml of SB medium. It is incubated at 225 rpm and 37°C until OD 600 ≈1. To gradually dilute the phage whose titer is to be checked, liquid LB medium is used. Take 10 µl of each dilution and add it to 100 µl of ER2738 broth with OD 600 ≈1 and leave it unchanged at 37°C for 20 minutes. Carry out infection with phage E. coli; distribute the infected E. coli broth on the LB-ampicillin dish, place it vertically in a 37° C. constant temperature incubator for 30 minutes, and then invert the culture overnight. Approximately 100 individual colonies are selected for plate counting and the phage titer is calculated using the following formula:
Способ получения фрагмента ДНК гена Nor-1, Tq-nor1. В колбу Эрленмейера объемом 50 мл помещают 15 мл жидкой среды с картофельной декстрозой, автоклавируют ее при 121°C в течение 30 минут и добавляют раствор со спорами штамма N73 Aspergillus flavus до конечной концентрации 1×105 мл-1. После культивирования со встряхиванием при 28°C, 200 об/мин в течение 96 часов используют двухслойную фильтровальную бумагу для выжимания раствора для культивирования из мицелия грибов, высушивают его при 65°C в течение 12 часов, быстро замораживают жидким азотом и измельчают в порошок. Точно отвешивают 200 мг порошка гифов, используют набор для выделения ДНК (DNeasy Plant Mini Kit) для выделения геномной ДНК штамма N73 в соответствии с прилагаемыми к набору инструкциями. Используют следующие праймеры (последовательность Nor1-F представлена под SEQIDNO:7; последовательность Nor1-R представлена под SEQIDNO:8) для амплификации продукта фрагмента гена Nor-1 размером 400 п.о. и используют набор для выделения из геля E.Z.N.A.T.M (OMEGA) для очистки фрагмента ДНК размером 400 п.о. в соответствии с инструкциями для получения Tq-nor1.Method for obtaining a DNA fragment of the Nor-1 gene, Tq-nor1. 15 ml of liquid medium with potato dextrose is placed in a 50 ml Erlenmeyer flask, autoclaved at 121°C for 30 minutes, and a solution with Aspergillus flavus strain N73 spores is added to a final concentration of 1×10 5 ml -1 . After shaking culture at 28°C, 200 rpm for 96 hours, use a two-layer filter paper to squeeze the culture solution out of the fungal mycelium, dry it at 65°C for 12 hours, quickly freeze with liquid nitrogen, and pulverize. Accurately weigh 200 mg of hyphae powder, use a DNA extraction kit (DNeasy Plant Mini Kit) to isolate the genomic DNA of strain N73 according to the instructions supplied with the kit. The following primers (Nor1-F sequence shown under SEQIDNO:7; Nor1-R sequence shown under SEQIDNO:8) were used to amplify the 400 bp Nor-1 gene fragment product. and use the EZNA™ Gel Isolation Kit (OMEGA) to purify the 400 bp DNA fragment. according to the instructions for obtaining Tq-nor1.
1. Разработка способа одновременного выявления на основе RT-PCR для выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-11. Development of a method for simultaneous detection based on RT-PCR for aflatoxin release and transcriptional activity of the Nor-1 gene
1. Разработка последовательностей праймеров и зондов для одновременного выявления на основе RT-PCR выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-11. Development of primer and probe sequences for simultaneous detection of aflatoxin release and transcriptional activity of the Nor-1 gene based on RT-PCR
Фрагмент ДНК Tq-nor1 фрагмента ДНК и ген Nor-1, высвобождаемый фагом VHH 2-5 с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину, выбирают в качестве матрицы для одновременной амплификации на основе RT-PCR. Определяют отношение выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1 с помощью результатов одновременной амплификации на основе RT-PCR.The Tq-nor1 DNA fragment of the DNA fragment and the Nor-1 gene released by the VHH 2-5 phage with an anti-idiotypic aflatoxin nanoantibody present on the surface are chosen as a template for simultaneous amplification based on RT-PCR. The ratio of the yield of aflatoxin to the transcriptional activity of the Nor-1 gene is determined using the results of simultaneous amplification based on RT-PCR.
Исходя из последовательности, кодирующей наноантитело, и последовательности гена Nor-1 фага VHH 2-5 с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом, получают последовательность прямого и обратного праймеров (Ph-F, Ph-R) для афлатоксина и зонда (Ph-зонда), а также последовательность прямого и обратного праймеров (Tq-nor1-F, Tq-nor1-R) для Tq-nor-1 и зонда (Tq-зонда). Затем для анализа праймеров используют программное обеспечение Oligo7.0 для выполнения проверки в соответствии с принципами и руководствами для разработки праймеров и зондов для дуплексной реакции RT-PCR.Based on the sequence encoding the nanoantibody and the sequence of the Nor-1 gene of the VHH 2-5 phage with the anti-idiotypic nanoantibody presented on the surface, a sequence of forward and reverse primers (Ph-F, Ph-R) for aflatoxin and a probe (Ph-probe) is obtained, as well as the sequence of forward and reverse primers (Tq-nor1-F, Tq-nor1-R) for Tq-nor-1 and probe (Tq-probe). The primer analysis then uses the Oligo7.0 software to perform validation according to the principles and guidelines for developing primers and probes for RT-PCR duplex reaction.
Принцип проверки праймеров и зонда. Значение ТМ для всех праймеров должно быть установлено на один и тот же или аналогичный уровень, а значение ТМ для всех зондов должно быть как можно более схожим и превышать значение ТМ для праймера приблизительно на 5-10°C. Поскольку реакция является одновременной реакцией в одной и той же системе, необходимо убедиться, что все праймеры и зонды не будут образовывать димеры. Выполняют поиск с помощью BLAST с целью удостовериться, что праймеры и зонды специфичны для предполагаемой мишени.The principle of testing primers and probe. The TM value for all primers should be set to the same or similar level, and the TM value for all probes should be as similar as possible and exceed the TM value for the primer by approximately 5-10°C. Since the reaction is a simultaneous reaction in the same system, it must be ensured that all primers and probes will not form dimers. A BLAST search is performed to ensure that the primers and probes are specific to the intended target.
Было установлено, что следующие последовательности праймеров и зондов соответствуют указанным выше принципам и требованиям, как подытожено в таблице 2.The following primer and probe sequences were found to comply with the above principles and requirements, as summarized in Table 2.
2. Параметры реакции способа одновременного выявления на основе RT-PCR для определения выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-12. Reaction Parameters of RT-PCR Based Simultaneous Detection Method for Determining Aflatoxin Yield and Nor-1 Gene Transcriptional Activity
Параметры реакции одновременной RT-PCR отличаются от параметров реакции RT-PCR, в которой проводят амплификацию одного гена, поскольку необходимо тщательно учитывать взаимодействие между реакционными системами. Во-первых, с помощью RT-PCR амплифицируют два одноцепочечных специфичных фрагмента ДНК: фрагмент фага с антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину и фрагмент ДНК гена Nor-1. Компоненты для реакции смешивают непосредственно, без добавления других компонентов, а затем проводят двойную реакцию RT-PCR, результат которой показан как изображение А на ФИГ. 1. Из фигуры следует, что амплификация молекул ДНК фага VHH 2-5 в значительной степени подавляется. В дуплексной реакции RT-PCR эффективность амплификации и целевая последовательность различных амплифицированных продуктов могут быть разными. Амплификация образцов с низкой эффективностью амплификации или с низким содержанием последовательностей-мишеней может подавляться высокоамплифицируемым образцом или целевой последовательностью с более высоким содержанием.The reaction parameters of a simultaneous RT-PCR reaction differ from those of an RT-PCR reaction in which single gene amplification is performed because interactions between reaction systems must be carefully considered. First, two single-stranded specific DNA fragments are amplified using RT-PCR: a phage fragment with an anti-idiotypic nanoantibody to aflatoxin and a DNA fragment of the Nor-1 gene. The reaction components are mixed directly without adding other components, and then a double RT-PCR reaction is carried out, the result of which is shown as image A in FIG. 1. It follows from the figure that the amplification of the DNA molecules of the VHH 2-5 phage is largely suppressed. In a duplex RT-PCR reaction, the amplification efficiency and target sequence of different amplified products may be different. Amplification of samples with low amplification efficiency or with a low content of target sequences can be suppressed by a highly amplifiable sample or a target sequence with a higher content.
По этой причине в настоящем изобретении оптимизируют условия реакции RT-PCR для способа одновременного выявления выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1. В настоящем изобретении оптимизированы значения концентрации ДНК-пол им ер азы, MgCl2 и dNTP. Результат, показанный как изображение В на ФИГ. 1, демонстрирует, что если концентрация фага VHH 2-5 составляет 106 БОЕ/мл, пороговое значение циклов Ct уменьшается после добавления dNTP и MgCl2, и кривая амплификации появляется при более низком значении количества циклов. Таким образом, показано, что амплификация молекул ДНК фага VHH 2-5 улучшается. На изображении С на ФИГ. 1 показано, что когда количество ДНК-полимеразы повышают с 0,25 Ед до 1,0 Ед, эффективность амплификации фага также в значительной степени улучшается. Следовательно, исходя из принципа, что чем раньше достигается пороговое значение циклов Ct, тем ближе кривая амплификации к S-образной форме в экспоненциальной фазе, при этом предпочтительный диапазон доз ДНК-полимеразы, MgCl2 и dNTP согласно настоящему изобретению составляет:For this reason, the present invention optimizes RT-PCR reaction conditions for a method for simultaneously detecting aflatoxin release and Nor-1 gene transcriptional activity. In the present invention, concentrations of DNA polymerase, MgCl 2 and dNTP are optimized. The result shown as image B in FIG. 1 demonstrates that if the concentration of VHH 2-5 phage is 10 6 pfu/ml, the Ct cycling threshold decreases after addition of dNTP and MgCl 2 and the amplification curve appears at a lower cycling value. Thus, it is shown that the amplification of the DNA molecules of the VHH 2-5 phage is improved. In image C in FIG. 1 shows that when the amount of DNA polymerase is increased from 0.25 U to 1.0 U, the phage amplification efficiency is also greatly improved. Therefore, based on the principle that the earlier the Ct cycling threshold is reached, the closer the amplification curve is to an S-shape in the exponential phase, with the preferred dose range of DNA polymerase, MgCl 2 and dNTP according to the present invention being:
ДНК-полимераза: от 0,5 Ед до 1,0 Ед; MgCl2: от 1 мМ до 2 мМ; dNTP: от 200 мкМ до 400 мкМ.DNA polymerase: 0.5 U to 1.0 U; MgCl 2 : 1 mM to 2 mM; dNTP: 200 µM to 400 µM.
Согласно приведенным выше результатам исследования, настоящее изобретение обеспечивает окончательные оптимизированные параметры реакции амплификации, как показано в таблице 3.According to the above test results, the present invention provides the final optimized amplification reaction parameters as shown in Table 3.
3. Эффективность амплификации согласно способу одновременного выявления на основе RT-PCR для выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-13. Amplification efficiency according to RT-PCR-based simultaneous detection method for aflatoxin release and Nor-1 gene transcriptional activity
Результаты одновременной амплификации на основе RT-PCR последовательно разведенного фага и последовательно разведенного Nor-1 показаны на кривой одновременной амплификации на основе RT-PCR (RFU, относительная единица флуоресценции), как показано на изображении А на ФИГ. 2. Изображение В на ФИГ. 2 представляет собой стандартную кривую эффективности амплификации, полученную из кривой амплификации. Угол наклона стандартной кривой эффективности амплификации фага VHH 2-5 составляет -3,37. Расчеты производили с использованием формулы для расчета эффективности амплификации 
2. Построение стандартной кривой для количественного анализа и оценка способа на основе одновременной RT-PCR2. Plotting Standard Curve for Quantification and Method Evaluation Based on Simultaneous RT-PCR
1. S-образная стандартная кривая для количественного определения афлатоксина1. S-shaped standard curve for the quantitative determination of aflatoxin
1.1. Иммунная реакция1.1. immune response
(1) Нанесение в качестве покрытия. Использовали PBS для разбавления коммерчески доступного моноклонального антитела к афлатоксину 1С11 (секретируется штаммом 1С11 клеток гибридомы с номером депонирования ССТСС №: С201013, номер заявки на патент CN201010245095.5, для которого доступны соответствующие отчеты) до 1,0 мкг/мл. Использовали микропипетку для добавления его в 96-луночный микропланшет по 100 мкл на лунку, инкубировали его в течение ночи при 4°C (-12 ч), промывали планшет 3 раза с помощью PBST; блокировали его: блокировали каждую лунку блокирующим раствором, 300 мкл на лунку, инкубировали при 37°C в течение 45 минут, промывали планшет 3 раза с помощью PBST.(1) Application as a coating. PBS was used to dilute a commercially available monoclonal antibody to aflatoxin 1C11 (secreted by hybridoma cell strain 1C11 with deposit number CCCCC no: C201013, patent application number CN201010245095.5, for which relevant reports are available) to 1.0 μg/ml. Used a micropipette to add it to a 96-well microplate at 100 μl per well, incubated it overnight at 4°C (-12 h), washed the
(2) Блокировка. Блокировали блокирующим раствором, 300 мкл на лунку, инкубировали при 37°C в течение 45 минут, 3 раза промывали планшет с помощью PBST.(2) Blocking. Blocked with blocking solution, 300 μl per well, incubated at 37°C for 45 minutes, washed
(3) Конкуренция. Разбавляли препарат стандарта афлатоксина В1 100% чистым метанолом до концентрации 200 нг/мл, затем разбавляли стандартный раствор афлатоксина В1 3-кратным градиентом 10% (об./об.) смеси метанол/PBS так, чтобы диапазон концентраций составлял от 33,33 нг/мл до 1,69 пг/мл. Затем смешивали фаг VHH 2-5 с известной концентрацией (1,0×1010 КОЕ/мл) с 50 мкл афлатоксина В1 с серийной концентрацией, добавляли 100 мкл смеси в 96-луночный микротитровальный планшет. После инкубации при 37°C в течение 1 часа промывали планшет с помощью PBST 10 раз.(3) Competition. Dilute the aflatoxin B1 standard preparation with 100% pure methanol to a concentration of 200 ng/ml, then dilute the aflatoxin B1 standard solution with a 3-fold gradient of 10% (v/v) methanol/PBS so that the concentration range is from 33.33 ng /ml to 1.69 pg/ml. Then mixed phage VHH 2-5 with a known concentration (1.0×10 10 CFU/ml) with 50 μl of aflatoxin B1 with a serial concentration, added 100 μl of the mixture to a 96-well microtiter plate. After incubation at 37°C for 1 hour, the plate was washed with
(4) Элюирование. Вводили 90 мкл элюата фага в каждую лунку, оставляли его на теплой бане при 37°C на 15 минут, аккуратно захватывали микропипеткой и переносили элюат, содержащий фагмиду.(4) Elution. Introduced 90 μl of the phage eluate into each well, left it in a warm bath at 37°C for 15 minutes, carefully captured with a micropipette and transferred the eluate containing phagemid.
(5) Нейтрализация. Смешивали 90 мкл извлеченного раствора с 10 мкл нейтрализующего раствора для нейтрализации смеси, причем объем добавляемого нейтрализующего раствора регулировали в соответствии с фактическим значением рН элюента и нейтрализующего раствора с целью обеспечения нейтрализации смеси.(5) Neutralization. 90 μl of the extracted solution was mixed with 10 μl of neutralizing solution to neutralize the mixture, and the volume of added neutralizing solution was adjusted according to the actual pH of the eluent and neutralizing solution to ensure that the mixture was neutralized.
1.2. Построение стандартной кривой. На стадии иммунной реакции при условии, что количество нанесенного в качестве покрытия моноклонального антитела к афлатоксину 1С11 является фиксированным, афлатоксин будет конкурировать с фагом VHH 2-5 за связывание с 1С11. Чем выше концентрация афлатоксина, тем меньше вероятность связывания фага с 1С11 и меньше величина связывания. После завершения иммунной реакции фаг, связанный с 1С11, элюировали. Количество фагов в элюате зависело от концентрации афлатоксина. Фагмида в элюате высвобождала молекулы ДНК во время процесса нагревания в реакции ПЦР. Высвободившиеся молекулы ДНК использовали в качестве мишени для амплификации в реакции RT-PCR. После реакции амплификации программное обеспечение системы количественного анализа флуоресценции предоставило значения Ct для амплификации фагов с разным количеством в разных элюатах, соответствующие разным количествам афлатоксина. Значения Ct, полученные при серийном разбавлении афлатоксина в концентрациях от 33,33 нг/мл до 1,69 пг/мл до логарифма концентрации афлатоксина, подвергали четырехпараметрической логистической регрессии с использованием программного обеспечения Origin Pro 8.0, и результат использовали для построения S-образной стандартной кривой для количественного определения афлатоксина, как показано на изображении А на ФИГ. 3.1.2. Construction of a standard curve. In the immune reaction step, provided that the amount of anti-aflatoxin 1C11 monoclonal antibody coated is fixed, aflatoxin will compete with the VHH 2-5 phage for binding to 1C11. The higher the concentration of aflatoxin, the lower the probability of phage binding to IC11 and the smaller the amount of binding. After completion of the immune response, the 1C11-bound phage was eluted. The number of phages in the eluate depended on the concentration of aflatoxin. The phagemid in the eluate released DNA molecules during the heating process in the PCR reaction. The released DNA molecules were used as a target for amplification in the RT-PCR reaction. After the amplification reaction, the software of the fluorescence quantification system provided Ct values for the amplification of phages with different amounts in different eluates, corresponding to different amounts of aflatoxin. Ct values obtained from serial dilutions of aflatoxin at concentrations from 33.33 ng/mL to 1.69 pg/mL to the logarithm of aflatoxin concentration were subjected to a four-parameter logistic regression using Origin Pro 8.0 software and the result was used to construct an S-shaped standard curve for the quantitative determination of aflatoxin, as shown in image A in FIG. 3.
2. Построение стандартной кривой для количественного определения транскрипции гена Nor-12. Construction of a standard curve for quantitative determination of transcription of the Nor-1 gene
Использовали штамм Aspergillus flavus. В этом примере использовали депонированный в исследовательском центре штамм Aspergillus flavus N73, который является высокотоксигенным штаммом и использовался для получения Tq-nor1 в данном исследовании. Для других штаммов Aspergillus flavus можно использовать описанный выше «способ получения фрагмента ДНК Tq-nor1 гена Nor-1» для амплификации фрагмента ДНК Tq-nor1 размером 400 п.о. Оба они могут быть использованы в качестве представляющих интерес штаммов для построения стандартной кривой для количественного определения транскрипции гена Nor-1. После использования спектрофотометра (NanoDrop 2000, Thermo Scientific, США) для определения концентрации Tq-nor1 рассчитывали число копий Tq-nor1. Tq-nor1 серийно разводили (от 102 до 108 копий) в виде образца с известным количеством, а затем осуществляли RT-PCR-амплификацию. Для выполнения регрессионного анализа использовали программное обеспечение Origin Pro 8.0, в котором значение логарифма числа копий серийного разведения стандартного образца Tq-nor1 является абсциссой, а значение Ct является ординатой. На изображении В на ФИГ. 3 показана стандартная кривая для количественного определения транскрипции гена Nor-1.A strain of Aspergillus flavus was used. In this example, Aspergillus flavus N73 deposited at the research center was used, which is a highly toxigenic strain and was used to generate Tq-nor1 in this study. For other strains of Aspergillus flavus, the above "method for obtaining a Tq-nor1 DNA fragment of the Nor-1 gene" can be used to amplify a 400 bp Tq-nor1 DNA fragment. Both can be used as strains of interest to construct a standard curve for quantifying transcription of the Nor-1 gene. After using a spectrophotometer (
Стандартная кривая для количественного определения афлатоксина показана на изображении А на ФИГ. 3. На фигуре представлено, что предел выявления LOD (выраженный при помощи IC10) для количественного определения афлатоксина В1 посредством одновременной RT-PCR составляет 0,018 нг/мл. Следовательно, разработанное количественное определение афлатоксина В1 посредством RT-PCR характеризуется высокой чувствительностью. Кроме того, на изображении В на ФИГ. 3 показано, что с помощью одновременной RT-PCR можно количественно определять число копий гена Nor-1 в диапазоне от 102 до 108, что полностью доказывает, что разработанная одновременная RT-PCR имеет заметные преимущества при низкоуровневом абсолютном количественном определении гена Nor-1.A standard curve for the quantitative determination of aflatoxin is shown in image A in FIG. 3. The figure shows that the LOD detection limit (expressed as IC 10 ) for the quantitative determination of aflatoxin B1 by simultaneous RT-PCR is 0.018 ng/ml. Therefore, the developed quantitative determination of aflatoxin B1 by RT-PCR is characterized by high sensitivity. In addition, in the image B in FIG. Figure 3 shows that simultaneous RT-PCR can quantify the copy number of the Nor-1 gene in the range of 10 2 to 10 8 , which fully proves that the developed simultaneous RT-PCR has noticeable advantages in low-level absolute quantification of the Nor-1 gene. .
3. Измерение перекрестной реактивности афлатоксина при одновременном выявлении на основе RT-PCR3. Measurement of aflatoxin cross-reactivity with simultaneous detection based on RT-PCR
Препараты стандарта афлатоксина В2, G1, G2, зеараленона (ZEN), дезоксиниваленола (DON), фумонизина (FBI) разводили в серии концентраций. После их конкуренции с фагом VHH 2-5 в конкурентной иммунной реакции фаг, связанный с моноклональным антителом 1С11 на дне микропланшета, элюировали для проведения одновременной амплификации на основе RT-PCR с Tq-nor1. Значение Ct, полученное при амплификации, соответствует логарифмическому значению различных концентраций токсина, которое использовали для построения стандартной кривой. Вычисляли значение IC50 и рассчитывали перекрестную реактивность в соответствии с формулой расчета перекрестной реактивности % CR=(IC50 AFB1/IC50 апалита)×100. Как показано на ФИГ. 4, показатели перекрестной реактивности для афлатоксина В1, В2, G1 и G2 составляли 100%, 101%, 34% и 12% соответственно. Из этого следует, что при помощи данного способа можно измерять общее количество афлатоксина. В частности, показатели перекрестной реактивности афлатоксина G1 и G2 составляли 34% и 12% соответственно, но это не влияет на применение способа при определении токсинообразующей способности Aspergillus flavus, поскольку штаммы Aspergillus flavus вырабатывают только афлатоксин группы В. Перекрестная реактивность афлатоксина В2 составляет 101%. Разработанный способ на основе RT-PCR для количественного определения афлатоксина В2 имеет более высокую чувствительность, что в некоторых условиях повышает надежность разработанного способа на основе RT-PCR для определения токсинообразующей способности Aspergillus flavus по той причине, что штаммы Aspergillus flavus могут вырабатывать как афлатоксин В1, так и афлатоксин В2. Следовательно, при использовании разработанного способа на основе RT-PCR для определения токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus получают оценку общего выхода В1 и В2.Aflatoxin B2, G1, G2 standard preparations, zearalenone (ZEN), deoxynivalenol (DON), fumonisin (FBI) were diluted in a series of concentrations. After competing with the VHH 2-5 phage in a competitive immune response, the phage bound to the 1C11 monoclonal antibody at the bottom of the microplate was eluted for simultaneous amplification based on Tq-nor1 RT-PCR. The Ct value obtained from the amplification corresponds to the logarithmic value of various toxin concentrations, which was used to construct the standard curve. The IC 50 value was calculated and the cross reactivity was calculated according to the formula for calculating the cross reactivity % CR=(IC 50 AFB1 /IC 50 apalite )×100. As shown in FIG. 4, the cross-reactivity rates for aflatoxin B1, B2, G1 and G2 were 100%, 101%, 34% and 12%, respectively. It follows that the total amount of aflatoxin can be measured using this method. In particular, the cross-reactivity rates of aflatoxin G1 and G2 were 34% and 12%, respectively, but this does not affect the application of the method in determining the toxin-producing ability of Aspergillus flavus, since Aspergillus flavus strains produce only group B aflatoxin. The cross-reactivity of aflatoxin B2 is 101%. The developed method based on RT-PCR for the quantitative determination of aflatoxin B2 has a higher sensitivity, which in some conditions increases the reliability of the developed method based on RT-PCR for determining the toxin-forming ability of Aspergillus flavus due to the fact that strains of Aspergillus flavus can produce both aflatoxin B1, and aflatoxin B2. Therefore, when using the developed method based on RT-PCR to determine the toxin-forming ability of Aspergillus flavus strains, an estimate of the total yield of B1 and B2 is obtained.
4. Проверка выявления добавки с помощью одновременной RT-PCR4. Verification of Additive Detection by Simultaneous RT-PCR
Препарат стандарта афлатоксина В1 и фрагмент ДНК Tq-nor-1 гена Nor-1 одновременно добавляли к 2 мл чистой среды PDB. Встряхивали их и хорошо перемешивали, а после равномерного перемешивания помещали смешанный раствор при 4°C без доступа света в течение 4 дней. Через 4 дня смесь разбавляли в 20 раз, и содержание афлатоксина В1 и Tq-nor-1 в смеси одновременно определяли с помощью RT-PCR. Получали 3 повторности для внутригруппового эксперимента группу в один день и 3 повторности для межгруппового эксперимента в разные дни. Результаты выявления добавки показаны в таблице 4.The aflatoxin B1 standard preparation and the Tq-nor-1 DNA fragment of the Nor-1 gene were simultaneously added to 2 ml of pure PDB medium. They were shaken and mixed well, and after stirring evenly, the mixed solution was placed at 4°C without access to light for 4 days. After 4 days, the mixture was diluted 20 times, and the content of aflatoxin B1 and Tq-nor-1 in the mixture was simultaneously determined using RT-PCR. Received 3 replications for the intragroup experiment group on the same day and 3 replications for the intergroup experiment on different days. The results of additive detection are shown in Table 4.
Степень выявления добавки афлатоксина В1 составляла от 88,37% до 103,10%, и степень выявления добавки фрагмента ДНК Tq-nor-1 гена Nor-1 составляла от 86,18% до 98,17%. Этот результат демонстрирует, что разработанная одновременная RT-PCR имеет надежную повторяемость и воспроизводимость результатов при выявлении и анализе реальных образцов.The detection rate of addition of aflatoxin B1 ranged from 88.37% to 103.10%, and the detection rate of addition of the Tq-nor-1 DNA fragment of the Nor-1 gene ranged from 86.18% to 98.17%. This result demonstrates that the developed simultaneous RT-PCR has reliable repeatability and reproducibility in the detection and analysis of real samples.
5. Применение способа на основе одновременной RT-PCR для количественной оценки уровня экспрессии гена Nor-1 и токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus5. Application of the method based on simultaneous RT-PCR to quantify the expression level of the Nor-1 gene and the toxin-producing ability of Aspergillus flavus strains
В этом исследовании отбирали 17 штаммов Aspergillus flavus с разной токсинообразующей способностью. Помещали 15 мл жидкой среды с картофельной декстрозой в колбу Эрленмейера объемом 50 мл, автоклавировали ее при 121°C в течение 30 минут и добавляли раствор со спорами Aspergillus flavus до конечной концентрации 1×105 мл-1. После культивирования со встряхиванием культуры при 28°C и 200 об/мин в течение 96 часов фильтровали культуральный бульон с помощью двухслойной фильтровальной бумаги для получения культурального бульона штамма и мицелия грибов Aspergillus flavus. С помощью фильтровальной бумаги отжимали лишнюю воду из мицелия грибов Aspergillus flavus и высушивали его в течение 12 часов при 65°C в сушильной камере, охлаждали до комнатной температуры, измельчали в порошок с жидким азотом и точно отвешивали по 0,20 мг измельченного гриба на образец. При проведении выделения общей РНК следовали инструкциям к набору (RNeasy Plant Mini Kit) для выделения РНК. Затем использовали набор для обратной транскрипции QuantiTect для синтеза cDNA. Раствор cDNA разводили в 100-1000 раз и использовали вместо Tq-nor1 в системе одновременной амплификации на основе RT-PCR и использовали в качестве одной из матриц амплификации при выполнении одновременной амплификации на основе RT-PCR для измерения транскрипционной активности гена Nor-1. После того, как культуральную среду штамма разбавляли в 10 раз с помощью 10% (вес/об.) BSA/PBS, ее использовали вместо препарата стандарта афлатоксина, используемого в иммунной реакции, для участия в реакции иммунной конкуренции. После конкурентной реакции фагмиду в элюате использовали в качестве другой матрицы в системе одновременной амплификации на основе RT-PCR и выполняли одновременную амплификацию на основе RT-PCR для измерения токсинообразующей способности штаммов. Для количественной оценки выработки токсина и уровня экспрессии гена Nor-1 для 17 штаммов Aspergillus flavus использовали способ на основе одновременной RT-PCR, и результаты показаны в таблице 5.In this study, 17 strains of Aspergillus flavus with different toxin-forming abilities were selected. Placed 15 ml of liquid medium with potato dextrose in a 50 ml Erlenmeyer flask, autoclaved it at 121°C for 30 minutes and added a solution with Aspergillus flavus spores to a final concentration of 1×10 5 ml -1 . After shaking culture at 28° C. and 200 rpm for 96 hours, the culture broth was filtered with a two-layer filter paper to obtain a culture broth of Aspergillus flavus strain and mycelium. With the help of filter paper, excess water was squeezed out from the mycelium of Aspergillus flavus fungi and dried for 12 hours at 65°C in a drying chamber, cooled to room temperature, powdered with liquid nitrogen, and 0.20 mg of crushed fungus per sample was accurately weighed. . When performing total RNA isolation, the instructions for the kit (RNeasy Plant Mini Kit) for RNA isolation were followed. The QuantiTect reverse transcription kit was then used for cDNA synthesis. The cDNA solution was diluted 100-1000 times and used in place of Tq-nor1 in the RT-PCR-based simultaneous amplification system and used as one of the amplification templates when performing RT-PCR-based simultaneous amplification to measure the transcriptional activity of the Nor-1 gene. After the culture medium of the strain was diluted 10-fold with 10% (w/v) BSA/PBS, it was used instead of the aflatoxin standard preparation used in the immune response to participate in the immune competition response. After the competitive reaction, the phagemid in the eluate was used as another template in the RT-PCR-based simultaneous amplification system, and RT-PCR-based simultaneous amplification was performed to measure the toxin-forming capacity of the strains. Simultaneous RT-PCR method was used to quantify toxin production and Nor-1 gene expression level for 17 strains of Aspergillus flavus, and the results are shown in Table 5.
Для проверки точности результатов со ссылкой на способ национального стандарта GB5009.22-2016 применяли способ ВЭЖХ для определения количества токсина, вырабатываемого штаммами Aspergillus flavus. В то же время экспрессию гена Nor-1 конкретного штамма количественно определяли с помощью спектрофотометра (Nanodrop). Количественные результаты представлены в таблице 5. Полученный результат сравнивали с результатом, полученным в способе на основе одновременной RT-PCR, и результат сравнения показан на изображении А на ФИГ. 5 и изображении В на ФИГ. 5. На изображении А на ФИГ. 5 показан результат сравнения RT-PCR и ВЭЖХ в отношении количественного определения афлатоксина. Полученное уравнение линейной регрессии имеет вид Y=0,947X - 3,84, и анализ линейной регрессии дает хорошую корреляцию (R2=0,999). На изображении В на ФИГ. 5 показан результат сравнения RT-PCR и Nanodrop в отношении количественного определения транскрипции гена Nor-1. Уравнение линейной регрессии, полученное этим способом, имеет вид Y=1,05Х-1,18, а коэффициент корреляции R2=0,989. Результаты сравнения различных способов выявления демонстрируют, что количественные результаты разработанной одновременной RT-PCR надежны и могут использоваться для одновременного анализа токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus и транскрипционной активности гена Nor-1.To check the accuracy of the results, with reference to the national standard GB5009.22-2016 method, the HPLC method was used to determine the amount of toxin produced by strains of Aspergillus flavus. At the same time, the expression of the Nor-1 gene of a particular strain was quantified using a spectrophotometer (Nanodrop). The quantitative results are shown in Table 5. The result obtained was compared with the result obtained in the method based on simultaneous RT-PCR, and the result of the comparison is shown in image A in FIG. 5 and picture B in FIG. 5. In image A in FIG. 5 shows the result of comparing RT-PCR and HPLC for aflatoxin quantitation. The resulting linear regression equation is Y=0.947X-3.84 and the linear regression analysis gives a good correlation (R 2 =0.999). In image B in FIG. 5 shows the result of comparing RT-PCR and Nanodrop with respect to quantification of the transcription of the Nor-1 gene. The linear regression equation obtained by this method has the form Y=1.05X-1.18, and the correlation coefficient R 2 =0.989. The results of comparison of different detection methods demonstrate that the quantitative results of the developed simultaneous RT-PCR are reliable and can be used for the simultaneous analysis of the toxin-producing ability of Aspergillus flavus strains and the transcriptional activity of the Nor-1 gene.
Вариант осуществления 3
1. Применение транскрипционной активности Nor-1 и AFT/Nor-1 (отношение токсинообразующей способности к транскрипционной активности Nor-1) для оценки токсинообразующей способности Aspergillus flavus соответственно1. Application of the transcriptional activity of Nor-1 and AFT/Nor-1 (ratio of toxin-forming capacity to transcriptional activity of Nor-1) to assess the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus, respectively
Путем сравнения и анализа результатов было обнаружено, что если токсинообразующую способность Aspergillus flavus оценивают исключительно по транскрипционной активности Nor-1, результаты определения являются ненадежными. Например, логарифмические значения числа копий экспрессии гена Nor-1 в штаммах Aspergillus flavus Pel24-2 и Рс34-1 составляют 7,85±0,52 и 6,75±0,58 соответственно. Уровни экспрессии гена Nor-1 этих двух штаммов эквивалентны. Однако выработка афлатоксина штаммом Pel24-2 составляет 66,5±4,93 нг/мл, а выработка афлатоксина штаммом Рс34-1 составляет всего 19,69±2,27 нг/мл. Кроме того, штаммы CY1, CY2, Pg28-1 и Рс321-1-3 не вырабатывают афлатоксин. При этом уровни экспрессии гена Nor-1 штаммами Pg28-1 и Рс321-1-3 даже выше, чем у некоторых штаммов, вырабатывающих афлатоксин.By comparing and analyzing the results, it was found that if the toxin-producing ability of Aspergillus flavus is evaluated solely by the transcriptional activity of Nor-1, the results of the determination are unreliable. For example, the logarithmic values of the copy number of the Nor-1 gene expression in Aspergillus flavus Pel24-2 and Pc34-1 strains are 7.85±0.52 and 6.75±0.58, respectively. The expression levels of the Nor-1 gene of these two strains are equivalent. However, the production of aflatoxin by strain Pel24-2 is 66.5 ± 4.93 ng/ml, and the production of aflatoxin by strain Pc34-1 is only 19.69 ± 2.27 ng/ml. In addition, strains CY1, CY2, Pg28-1 and Pc321-1-3 do not produce aflatoxin. At the same time, the expression levels of the Nor-1 gene in Pg28-1 and Pc321-1-3 strains are even higher than in some strains that produce aflatoxin.
Однако более надежно оценивать токсинообразующую способность Aspergillus flavus с использованием отношения выработки афлатоксина к уровню экспрессии гена Nor-1. Для того чтобы дополнительно изучить корреляционную взаимосвязь между токсинообразующей способностью штаммов Aspergillus flavus, уровнем экспрессии гена nor-1, а также AFT/Nor-1, токсинообразующую способность штаммов принимают за ординату, а логарифм величины экспрессии гена Nor-1 и отношение AFT/Nor-1 используют в качестве абсциссы для построения графика. Корреляционная взаимосвязь между токсинообразующей способностью штаммов Aspergillus flavus и величиной экспрессии гена Nor-1 показана на изображении А на ФИГ. 6. Уравнение линейной регрессии имеет вид: у=36,37 х-196,21, а коэффициент корреляции, полученный с помощью анализа линейной регрессии, составляет R2=0,693. При этом корреляционная взаимосвязь между токсинообразующей способностью Aspergillus flavus и отношением AFT/Nor-1 показана на изображении В на ФИГ. 6. Уравнение линейной регрессии имеет вид: у=10,14 х - 16,20, а коэффициент корреляции, полученный с помощью анализа линейной регрессии, составляет R2=0,979. Имеет место очень хорошая корреляция между токсинообразующей способностью штаммов Aspergillus flavus и отношением AFT/Nor-1.However, it is more reliable to assess the toxin-producing ability of Aspergillus flavus using the ratio of aflatoxin production to the level of Nor-1 gene expression. In order to further study the correlation between the toxin-forming ability of Aspergillus flavus strains, the level of nor-1 gene expression, and AFT/Nor-1, the toxin-forming ability of strains is taken as the ordinate, and the logarithm of the value of Nor-1 gene expression and the AFT/Nor- 1 is used as the abscissa for plotting. The correlation relationship between the toxin-forming ability of Aspergillus flavus strains and the amount of Nor-1 gene expression is shown in image A in FIG. 6. The linear regression equation is: y=36.37 x-196.21, and the correlation coefficient obtained from the linear regression analysis is R 2 =0.693. Meanwhile, the correlation between the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus and the AFT/Nor-1 ratio is shown in Figure B of FIG. 6. The linear regression equation is: y=10.14 x - 16.20, and the correlation coefficient obtained using the linear regression analysis is R 2 =0.979. There is a very good correlation between the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus strains and the AFT/Nor-1 ratio.
В свете вышеизложенного в настоящем изобретении предусмотрено, что уравнение для определения токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus имеет вид: у=10,14 х - 16,20, где X представляет AFT/Nor-1, а Y представляет токсинообразующую способность. Для высокотоксигенных штаммов токсинообразующая способность составляет >150 нг/мл; умеренная токсинообразующая способность: 50 <токсинообразующая способность <150 нг/мл; низкая токсинообразующая способность: токсинообразующая способность <50 нг/мл; отсутствие выработки токсина: 0; затем рассчитывают диапазон определения токсинообразующей способности в соответствии с уравнением регрессии.In light of the foregoing, the present invention provides that the equation for determining the toxin generating capacity of Aspergillus flavus strains is: y=10.14 x - 16.20 where X is AFT/Nor-1 and Y is toxin generating capacity. For highly toxigenic strains, the toxin-forming capacity is >150 ng/mL; moderate toxin-forming capacity: 50 < toxin-forming capacity <150 ng/ml; low toxin-forming capacity: toxin-forming capacity <50 ng/ml; no toxin production: 0; then calculate the range of determination of toxin-forming capacity in accordance with the regression equation.
Высокотоксигенные штаммы: AFT/Nor-1 > 16,4;Highly toxigenic strains: AFT/Nor-1 > 16.4;
умеренно токсигенные штаммы: 6,5<AFT/Nor-1<16,4;moderately toxigenic strains: 6.5<AFT/Nor-1<16.4;
низкотоксигенные штаммы: 0<AFT/Nor-1<6,5;low toxigenic strains: 0<AFT/Nor-1<6.5;
нетоксигенные штаммы: AFT/Nor-1=0.non-toxigenic strains: AFT/Nor-1=0.
Проверка стабильности AFT/Nor-1 (отношение токсинообразующей способности к транскрипционной активности Nor-1) в связи с результатом определения токсинообразующей способностиStability test of AFT/Nor-1 (ratio of toxin-forming capacity to transcriptional activity of Nor-1) in connection with the result of determination of toxin-forming capacity
2. Проверка стабильности AFT/Nor-1 (отношение токсинообразующей способности к транскрипционной активности Nor-1) в связи с результатом определения токсинообразующей способности2. Stability test of AFT/Nor-1 (ratio of toxin-producing ability to transcriptional activity of Nor-1) in connection with the result of determination of toxin-producing ability
Для дополнительной проверки стабильности отношения AFT/Nor-1 при определении результатов токсинообразующей способности, проводят внутригрупповые и межгрупповые экспериментальные анализы соответственно для пяти штаммов Aspergillus flavus с точки зрения токсинообразующей способности в отношении афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1. Во внутригрупповом эксперименте получают по 5 повторностей одновременно в один и тот же день, и среднее значение для 5 повторностей используют в качестве токсинообразующей способности и транскрипционной активности гена Nor-1 для конкретной партии штаммов. Для межгруппового эксперимента определяют три разные даты, каждую дату определяют как партию и всего получают 3 партии. Результаты показаны в таблице 6.To further test the stability of the AFT/Nor-1 ratio in determining toxin-forming capacity results, intragroup and between-group experimental analyzes were performed respectively for five strains of Aspergillus flavus in terms of toxin-forming capacity against aflatoxin and transcriptional activity of the Nor-1 gene. In an intragroup experiment, 5 replications are generated simultaneously on the same day, and the average of the 5 replications is used as the toxin-forming capacity and transcriptional activity of the Nor-1 gene for a particular batch of strains. For the intergroup experiment, three different dates are defined, each date is defined as a batch, and a total of 3 batches are received. The results are shown in Table 6.
Величина афлатоксинообразующей способности и транскрипционной активности гена Nor-1 в таблице представляют собой среднее значение для внутригрупповых экспериментов с 5 повторностями.The value of aflatoxin-forming capacity and transcriptional activity of the Nor-1 gene in the table represent the average value for within-group experiments with 5 replicates.
Исходя из таблицы можно легко обнаружить, что существует большая разница между выходом афлатоксина, вырабатываемым разными партиями культур, и транскрипционной активностью гена Nor-1. При рассмотрении штамма 233-1 в качестве примера, показатели выхода афлатоксина, определенные для трех партий, составляют 10,07, 19,69 и 25,32 нг/мл соответственно, и коэффициент вариации между различными партиями составляет 42,00%. Кроме того, для показателей выхода афлатоксина, вырабатываемого штаммами IT-2, Pg56-1-2, N200 и 233-1, все внутригрупповые коэффициенты вариации между различными партиями превышают 17,00%. Из этого следует, что оценка токсинообразующей способности штаммов только на основании полученного показателя выхода афлатоксина ненадежна. По аналогии, исходя из межгрупповых показателей транскрипционной активности гена Nor-1 для разных партий, можно обнаружить, что имеют место большие различия в транскрипционной активности гена Nor-1, что соответственно доказывает, что определение и оценка токсинообразующей способности штаммов исключительно по транскрипционной активности гена Nor-1 являются ненадежными. Однако межгрупповые коэффициенты вариации для отношения AFT/Nor-1 составляют менее 13%, что обеспечивает лучшую стабильность.Based on the table, it can be easily seen that there is a large difference between the yield of aflatoxin produced by different batches of cultures and the transcriptional activity of the Nor-1 gene. Using strain 233-1 as an example, the aflatoxin yields determined for three lots are 10.07, 19.69, and 25.32 ng/mL, respectively, and the coefficient of variation between different lots is 42.00%. In addition, for the yield rates of aflatoxin produced by strains IT-2, Pg56-1-2, N200 and 233-1, all intra-group variation coefficients between different batches exceed 17.00%. It follows from this that the assessment of the toxin-forming ability of strains only on the basis of the obtained indicator of the release of aflatoxin is unreliable. By analogy, based on the intergroup indicators of the transcriptional activity of the Nor-1 gene for different batches, it can be found that there are large differences in the transcriptional activity of the Nor-1 gene, which accordingly proves that the determination and evaluation of the toxin-forming ability of strains solely on the transcriptional activity of the Nor gene -1 are unreliable. However, the intergroup coefficients of variation for the AFT/Nor-1 ratio are less than 13%, which provides better stability.
Таким образом, способ определения и оценки токсинообразующей способности токсигенных штаммов, продуцирующих афлатоксин, предусмотренный в настоящем изобретении, то есть определение отношения AFT/Nor-1, является более точным и надежным способом определения и оценки токсинообразующей способности штаммов Aspergillus flavus.Thus, the method for determining and evaluating the toxin-forming capacity of toxigenic aflatoxin-producing strains provided in the present invention, that is, determining the AFT/Nor-1 ratio, is a more accurate and reliable method for determining and evaluating the toxin-forming capacity of Aspergillus flavus strains.
Очевидно, что вышеупомянутые варианты осуществления являются просто примерами, изложенными для более ясного описания, и не предназначены для ограничения реализации настоящего изобретения. Для специалистов в данной области техники другие изменения или изменения в различных формах могут быть внесены на основе приведенного выше описания. Перечисление в данном документе всех способов реализации нецелесообразно и не представляется возможным. Следовательно, очевидные изменения или модификации настоящего изобретения все еще находятся в пределах объема правовой охраны настоящего изобретения.Obviously, the above embodiments are merely examples set forth for a clearer description and are not intended to limit the implementation of the present invention. For those skilled in the art, other changes or changes in various forms may be made based on the above description. Listing in this document all methods of implementation is impractical and not possible. Therefore, obvious changes or modifications of the present invention are still within the scope of the present invention.
Claims (14)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811491692.9 | 2018-12-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021105539A RU2021105539A (en) | 2022-09-05 |
| RU2783882C2 true RU2783882C2 (en) | 2022-11-21 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1556391A (en) * | 2003-12-30 | 2004-12-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | Peanut aspergillus flavus anti aflatoxin production preperty identification method |
| RU2534732C1 (en) * | 2013-07-26 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Method for quantitative determination of aflatoxin b1 by differential voltammetry |
| CN108593832A (en) * | 2018-05-14 | 2018-09-28 | 广东省农业科学院农产品公共监测中心 | LC-MS-MS methods that are a kind of while measuring six kinds of mycotoxins in corn |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1556391A (en) * | 2003-12-30 | 2004-12-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | Peanut aspergillus flavus anti aflatoxin production preperty identification method |
| RU2534732C1 (en) * | 2013-07-26 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Method for quantitative determination of aflatoxin b1 by differential voltammetry |
| CN108593832A (en) * | 2018-05-14 | 2018-09-28 | 广东省农业科学院农产品公共监测中心 | LC-MS-MS methods that are a kind of while measuring six kinds of mycotoxins in corn |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Abdel-Hadi, A., Carter, D., and Magan, N. Temporal monitoring of the nor-1 (aflD) gene of Aspergillus flavus in relation to aflatoxin B1 production during storage of peanuts under different environmental conditions. J. Appl. Microbiol. 2010, 109, 1914-1922. Mohammad I. Kalil et al. Aflatoxin production and genes assay in Aspergillusflavus isolated from spices. International Journal of Enhanced Research in Science, Technology & Engineering ISSN: 2319-7463, Vol. 6 Issue 9, September-2017, р. 60-67. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7122022B2 (en) | Methods for identifying and assessing toxicity of aflatoxin-producing strains | |
| Hameed et al. | Conventional and emerging detection techniques for pathogenic bacteria in food science: A review | |
| Lievens et al. | Quantitative assessment of phytopathogenic fungi in various substrates using a DNA macroarray | |
| CA2596059A1 (en) | Method of quantitatively analysing microorganism targeting rrna | |
| Bonadonna et al. | Innovative analytical methods for monitoring microbiological and virological water quality | |
| WO2020151532A1 (en) | Model for predicting treatment responsiveness based on intestinal microorganism information | |
| Grudlewska-Buda et al. | Comparison of the intensity of biofilm formation by Listeria monocytogenes using classical culture-based method and digital droplet PCR | |
| Milner et al. | Quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) and fluorescent in situ hybridization (FISH) detection of soilborne pathogen Sclerotium rolfsii | |
| CN109468367B (en) | RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) kit for synchronously detecting yield of aflatoxin and Nor-1 gene transcription amount and detection method thereof | |
| CN114891902A (en) | Primer-probe combination for rapidly detecting five virulent pathogenic bacteria based on liquid drop digital PCR and application method thereof | |
| Zhu et al. | Gene expression in the tuberculous granuloma: analysis by laser capture microdissection and real‐time PCR | |
| Bhuyan et al. | Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units | |
| Daniëls et al. | Real-time PCR as a promising tool to monitor growth of Venturia spp. in scab-susceptible and-resistant apple leaves | |
| Keswani et al. | Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust | |
| RU2783882C2 (en) | Method for assessment of toxin-forming capability of aflatoxigenic strain | |
| Harries et al. | Soil properties related to suppression of Rhizoctonia solani on tobacco fields from northwest Argentina | |
| Veir et al. | Molecular diagnostic assays for infectious diseases in cats | |
| Schnippenkoetter et al. | Comparison of non-subjective relative fungal biomass measurements to quantify the Leptosphaeria maculans—Brassica napus interaction | |
| Ponzoni et al. | A multiplex, bead-based array for profiling plant-derived components in complex food matrixes | |
| CN106414775A (en) | Compositions and methods for metagenome biomarker detection | |
| WO2021039777A1 (en) | Method for examining rheumatoid arthritis | |
| Immanuel et al. | Discrimination between viable and dead Xanthomonas fragariae in strawberry using viability PCR | |
| CN110257544B (en) | Ergota germ fluorescent quantitative PCR detection reagent, detection kit and application | |
| EP1524319A1 (en) | Method of classifying chemical agents and identifying cellular targets thereof | |
| Jayalakshmi et al. | Detection and Diagnosis of Important Soil-Borne Pathogens |