RU2783776C1 - New peptide and application thereof - Google Patents
New peptide and application thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2783776C1 RU2783776C1 RU2021126249A RU2021126249A RU2783776C1 RU 2783776 C1 RU2783776 C1 RU 2783776C1 RU 2021126249 A RU2021126249 A RU 2021126249A RU 2021126249 A RU2021126249 A RU 2021126249A RU 2783776 C1 RU2783776 C1 RU 2783776C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- insulitis
- expression
- diabetes
- treatment
- Prior art date
Links
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 29
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 claims description 34
- 102100014320 TGFB1 Human genes 0.000 claims description 33
- 108010037805 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 claims description 33
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 33
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 claims description 33
- 229940099456 Transforming Growth Factor Beta 1 Drugs 0.000 claims description 31
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 30
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 claims description 29
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 18
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 17
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 14
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 34
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 27
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 27
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 26
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 26
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 13
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 10
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 9
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 9
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 9
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 9
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 9
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 9
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 9
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 9
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 9
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- -1 paramethoxybenzyl Chemical group 0.000 description 8
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 8
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 7
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 6
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium;hexafluorophosphate Chemical compound F[P-](F)(F)(F)(F)F.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2S)-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 3
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N Diethylpyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 3
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 3
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 3
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 3
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N (2S)-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C)=CC=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- 206010003816 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 102100019461 CD28 Human genes 0.000 description 2
- 101700033362 CD28 Proteins 0.000 description 2
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 2
- 210000004700 Fetal Blood Anatomy 0.000 description 2
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 210000004153 Islets of Langerhans Anatomy 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 2
- 102000006381 STAT1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 201000009596 autoimmune hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000453 cell autonomous Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000392 somatic Effects 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 2
- SWZCTMTWRHEBIN-QFIPXVFZSA-N (2S)-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=C(O)C=C1 SWZCTMTWRHEBIN-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- NIZKGBJVCMRDKO-KWQFWETISA-N (2S)-2-[[2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NIZKGBJVCMRDKO-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVFZOVWCLRSYKC-UHFFFAOYSA-N 1-methylpyrrolidine Chemical compound CN1CCCC1 AVFZOVWCLRSYKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PDOIGRRPKSYVKH-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O.OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O PDOIGRRPKSYVKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QQKAZZAULUMMKR-UHFFFAOYSA-N 2-N-hydroxybenzene-1,2-dicarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)NO QQKAZZAULUMMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022663 Acetate Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241001446639 Allurus Species 0.000 description 1
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N Anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010751 Asperula odorata Nutrition 0.000 description 1
- 244000186140 Asperula odorata Species 0.000 description 1
- 230000036912 Bioavailability Effects 0.000 description 1
- 229940001468 Citrate Drugs 0.000 description 1
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N Diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N HF Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@@]2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N 0.000 description 1
- 229940001447 Lactate Drugs 0.000 description 1
- 206010062049 Lymphocytic infiltration Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N Mesotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide Chemical compound C1=CC2CC1C1C2C(=O)N(O)C1=O ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-hydroxy-Succinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940100662 Nasal Drops Drugs 0.000 description 1
- LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N Nitromethane Chemical compound C[N+]([O-])=O LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N Pentachlorophenol Chemical compound OC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007759 RPMI Media 1640 Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N Trifluoromethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N Trimethylsilyl chloride Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001263 acyl chlorides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001266 acyl halides Chemical class 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005161 aryl oxy carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 230000035514 bioavailability Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N fumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000008079 hexane Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-L maleate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylbenzene Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113083 morpholine Drugs 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-L oxalate Chemical compound [O-]C(=O)C([O-])=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissues Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O phosphonium Chemical compound [PH4+] XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001187 sodium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M toluene-4-sulfonate Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 1
- 239000005051 trimethylchlorosilane Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
[1] Настоящее изобретение относится к новому пептиду и, более конкретно, к новому пептиду и его применению.[1] The present invention relates to a new peptide and, more specifically, to a new peptide and its use.
Уровень техникиState of the art
[2] Лимфоцитарная инфильтрация панкреатического островка называется инсулитом. Инсулит, в конечном счете, разрушает панкреатические β-клетки, которые секретируют инсулин, что приводит к диабету 1 типа (T1D) {Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event". Immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53 и т. д.}. Кроме того, сообщалось о том, что диабет 1 типа можно облегчить путем защиты поджелудочной железы от инсулита {Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. "Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice". Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669 и т. д.}.[2] Lymphocytic infiltration of the pancreatic islet is called insulitis. Insulitis ultimately destroys the pancreatic β-cells that secrete insulin, resulting in type 1 diabetes (T1D) {Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event". immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53 etc.}. In addition, it has been reported that type 1 diabetes can be alleviated by protecting the pancreas from insulitis {Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. "Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice". Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669 etc.}.
[3] Известно, что различные цитокины, такие как IFN-γ (гамма-интерферон), TNF-α (фактор некроза опухолей альфа) и TGF-β1 (трансформирующий ростовой фактор бета 1) участвуют в развитии и супрессии инсулита. Известно, что инсулит вызывается IFN-γ {von Herrath MG, Oldstone MB. "Interferon-γ is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus". J. Exp Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9 и т. д.}, а также известно, что вызывается TNF-α {Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hi deo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. "IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death". J. Immunol April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489 и т. д.}. В то же время сообщалось о том, что повышенная экспрессия TGF-β1 защищает диабетических мышей, не страдающих ожирением (NOD), от инсулита {Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. "TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice" J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6 и т. д.}.[3] Various cytokines such as IFN-γ (interferon gamma), TNF-α (tumor necrosis factor alpha) and TGF-β1 (transforming growth factor beta 1) are known to be involved in the development and suppression of insulitis. It is known that insulitis is caused by IFN-γ {von Herrath MG, Oldstone MB. "Interferon-γ is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus". J. Exp Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9 etc.} and also known to be induced by TNF-α {Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hi deo Yagita, Minho Shong, Myung Shik Lee. "IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death". J. Immunol April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489 etc.}. At the same time, increased expression of TGF-β1 has been reported to protect diabetic non-obese (NOD) mice from insulitis {Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. "TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice" J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6 etc.}.
[4] Следовательно, необходимо разработать материал, который характеризуется эффектом в отношении инсулита.[4] Therefore, it is necessary to develop a material that has an effect on insulitis.
[5] [Перечень ссылок][5] [List of links]
[6] [Непатентная литература][6] [Non-Patent Literature]
[7] (Непатентный документ 1) Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event". Immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53.[7] (Non-Patent Document 1) Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event". immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53.
[8] (Непатентный документ 2) Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. "Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice". Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669.[8] (Non-Patent Document 2) Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. "Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice". Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669.
[9] (Непатентный документ 3) von Herrath MG, Oldstone MB. "Interferon-γ is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus". J. Exp. Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9.[9] (Non-Patent Document 3) von Herrath MG, Oldstone MB. "Interferon-γ is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus". J. Exp. Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9.
[10] (Непатентный документ 4) Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hi deo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. "IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death". J. Immunol. April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489.[10] (Non-Patent Document 4) Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hi deo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. "IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death". J. Immunol. April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489.
[11] (Непатентный документ 5) Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. "TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice" J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6.[11] (Non-Patent Document 5) Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. "TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice" J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Техническая задачаTechnical task
[12] Целью настоящего изобретения является обеспечение нового пептида.[12] The aim of the present invention is to provide a new peptide.
[13] Другой целью настоящего изобретения является обеспечение нового применения пептида по настоящему изобретению.[13] Another object of the present invention is to provide a novel use for the peptide of the present invention.
[14] Цели настоящего изобретения не ограничиваются вышеуказанным, а другие цели, не упомянутые в данном документе, будут более четко понятны специалистам в данной области техники из приведенного ниже описания.[14] The objects of the present invention are not limited to the above, and other objects not mentioned herein will be more clearly understood by those skilled in the art from the description below.
Решение задачиThe solution of the problem
[15] В настоящем изобретении предусмотрен пептид, состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:1 (YGAGAGAGY), или его фармацевтически приемлемая соль.[15] The present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 (YGAGAGAGY), or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[16] В аминокислотной последовательности Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).[16] In the amino acid sequence, Y is tyrosine (Tyr), G is glycine (Gly), and A is alanine (Ala).
[17] Аминокислоты, которые входят в состав пептида, включают L-, D- и DL-формы, все из которых включены в аминокислоты пептида по настоящему изобретению. Также будет понятно, что Y можно интерпретировать как имеющий значение, включающее 4-гидроксифенилаланин, а также тирозин, в качестве аминокислоты.[17] The amino acids that make up the peptide include the L-, D- and DL-forms, all of which are included in the amino acids of the peptide of the present invention. It will also be understood that Y can be interpreted as having a meaning including 4-hydroxyphenylalanine as well as tyrosine as an amino acid.
[18] Пептид включает его варианты, в которых часть структуры пептида в соответствии с настоящим изобретением варьирует из-за спонтанной мутации или искусственной мутации без изменения его основной активности.[18] The peptide includes its variants, in which part of the structure of the peptide in accordance with the present invention varies due to spontaneous mutation or artificial mutation without changing its basic activity.
[19] Примеры фармацевтически приемлемой соли могут включать гидрохлорид, сульфат, фосфат, ацетат, цитрат, тартрат, сукцинат, лактат, малеат, фумарат, оксалат, метан сульфонат и пара-толуолсульфонат, натриевую соль, калиевую соль, кальциевую соль и т. п.[19] Examples of a pharmaceutically acceptable salt may include hydrochloride, sulfate, phosphate, acetate, citrate, tartrate, succinate, lactate, maleate, fumarate, oxalate, methane sulfonate and p-toluenesulfonate, sodium salt, potassium salt, calcium salt, etc. .
[20] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и предпочтительно его применение для лечения или предупреждения инсулита. При этом под термином «лечение» в полном объеме подразумевают снижение интенсивности или облегчение симптомов, а термин «предупреждение» применяют во всеобъемлющем значении, включая подавление прогрессирования заболевания от бессимптомной стадии до выражения симптомов.[20] In addition, the present invention contemplates the use of a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention, and preferably its use for the treatment or prevention of insulitis. The term "treatment" is used in its entirety to reduce the intensity or alleviation of symptoms, while the term "prevention" is used in a comprehensive sense, including the suppression of the progression of the disease from an asymptomatic stage to the expression of symptoms.
[21] Лечение и предупреждение может быть обусловлено по меньшей мере одним из подавления экспрессии IFN-γ (гамма-интерферона), подавления экспрессии TNF-α (фактора некроза опухоли альфа) и индукции экспрессии TGF-β1 (трансформирующего ростового фактора бета 1).[21] Treatment and prevention may be due to at least one of downregulation of IFN-γ (interferon gamma), downregulation of TNF-α (tumor necrosis factor alpha), and induction of TGF-β1 (transforming growth factor beta 1) expression.
[22] Подавление экспрессии IFN-γ может представлять собой подавление экспрессии мРНК IFN-γ.[22] Suppression of IFN-γ expression may be suppression of IFN-γ mRNA expression.
[23] Подавление экспрессии TNF-α может представлять собой подавление экспрессии мРНК TNF-α.[23] Suppression of TNF-α expression may be suppression of TNF-α mRNA expression.
[24] Индукция экспрессии TGF-β1 может представлять собой индукцию экспрессии мРНК TGF-β1.[24] The induction of TGF-β1 expression may be the induction of TGF-β1 mRNA expression.
[25] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и предпочтительно его применение для лечения или предупреждения диабета 1 типа (T1D).[25] In addition, the present invention contemplates the use of a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention, and preferably its use in the treatment or prevention of type 1 diabetes (T1D).
[26] Диабет 1 типа может быть вызван инсулитом.[26] Type 1 diabetes can be caused by insulitis.
[27] Лечение или предупреждение может быть обусловлено по меньшей мере одним из подавления развития инсулита и уменьшения его развития.[27] Treatment or prevention may be due to at least one of the suppression of the development of insulitis and reduce its development.
[28] Лечение или предупреждение может быть обусловлено снижением уровня глюкозы в крови.[28] Treatment or prevention may be due to a decrease in blood glucose levels.
[29] Снижение уровня глюкозы в крови может быть обусловлено по меньшей мере одним из числа подавления развития инсулита и уменьшения его развития.[29] The decrease in blood glucose levels may be due to at least one of suppressing the development of insulitis and reducing its development.
[30] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена композиция для лечения или предупреждения инсулита, содержащая пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена композиция для лечения или предупреждения диабета 1 типа, содержащая пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением. Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию.[30] In addition, the present invention provides a composition for the treatment or prevention of insulitis containing a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof in accordance with the present invention. In addition, the present invention provides a composition for the treatment or prevention of type 1 diabetes containing a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof in accordance with the present invention. The composition may be a pharmaceutical composition.
[31] Композиция может содержать в качестве действующего вещества пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением.[31] The composition may contain as active substance a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof in accordance with the present invention.
[32] Композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемую добавку и может состоять из пептида или фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемой добавки.[32] The composition further comprises a pharmaceutically acceptable additive and may consist of a peptide or pharmaceutically acceptable salt according to the present invention and a pharmaceutically acceptable additive.
[33] Пептид по настоящему изобретению можно получать с помощью способов, которые обычно применяют в области химии пептидов. Например, пептид можно получать со ссылкой на литературу, широко известную из уровня техники, или с помощью способа, такого как жидкофазный синтез или твердофазный синтез.[33] The peptide of the present invention can be obtained using methods that are commonly used in the field of peptide chemistry. For example, a peptide can be prepared with reference to the literature widely known in the art, or by a method such as liquid phase synthesis or solid phase synthesis.
[34] Примеры способов образования пептидной связи могут включать ацилазидный способ, ацилгалогенидный способ, ацилимидазольный способ, карбодиимидный способ, способ с применением фосфония, ангидридный способ, смешанный ангидридный способ, окислительно-восстановительный способ и применение K-реагента Вудворда.[34] Examples of methods for forming a peptide bond may include an acylazide method, an acyl halide method, an acylimidazole method, a carbodiimide method, a phosphonium method, an anhydride method, a mixed anhydride method, a redox method, and the use of Woodward's K reagent.
[35] Перед проведением реакции конденсации карбоксильную группу, аминогруппу или т. п., которые не участвуют в реакции, можно защитить, и карбоксильную группу, которая участвует в реакции конденсации, можно активировать с помощью способов, известных из уровня техники.[35] Before carrying out the condensation reaction, a carboxyl group, an amino group or the like that does not participate in the reaction can be protected, and a carboxyl group that participates in the condensation reaction can be activated by methods known in the art.
[36] Примеры функциональных групп для защиты карбоксильной группы могут включать группы, образующие сложный эфир, например, метил, трет-бутил, арил, пентафторфенил, бензил, параметоксибензил и метоксиэтоксиметил.[36] Examples of functional groups for protecting the carboxyl group may include ester-forming groups such as methyl, tert-butyl, aryl, pentafluorophenyl, benzyl, paramethoxybenzyl, and methoxyethoxymethyl.
[37] Примеры функциональных групп для защиты аминогруппы могут включать тритилкарбонил, арилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, трихлорэтилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил и/или 9-флуоренилметилоксикарбонил.[37] Examples of functional groups for protecting the amino group may include tritylcarbonyl, aryloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, trichloroethyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, and/or 9-fluorenylmethyloxycarbonyl.
[38] Примеры активных форм карбоксильной группы могут включать смешанный ангидрид, азид, ацилхлорид и активный сложный эфир [сложный эфир со спиртом (например, пентахлорфенол, 2,4-динитрофенол, цианометиловый спирт, п-нитрофенол, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимид, N-гидроксисукцинимид, N-гидроксифталамид или 1-гидроксибензотриазол)].[38] Examples of active forms of the carboxyl group may include mixed anhydride, azide, acyl chloride, and active ester [ester with alcohol (e.g., pentachlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, p-nitrophenol, N-hydroxy-5-norbornene -2,3-dicarboximide, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalamide or 1-hydroxybenzotriazole)].
[39] Растворители, применяемые в реакции конденсации для образования пептидной связи, включают бензол, толуол, гексан, ацетон, нитрометан, циклогексан, эфир, хлороформ, дихлорметан, этилацетат, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин, диоксан, тетрагидрофуран, воду, метанол и этанол, которые можно применять отдельно или в комбинации.[39] The solvents used in the condensation reaction to form a peptide bond include benzene, toluene, hexane, acetone, nitromethane, cyclohexane, ether, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, N,N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, water , methanol and ethanol, which can be used alone or in combination.
[40] Температура реакции может колебаться в диапазоне от приблизительно -70°C до 100°C, который обычно применяют в реакции, и предпочтительно колеблется в диапазоне от -30°C до 30°C.[40] The reaction temperature may range from about -70°C to 100°C, which is usually used in the reaction, and preferably ranges from -30°C to 30°C.
[41] Реакцию снятия защиты для удаления защитной группы пептида можно осуществлять с применением кислотного соединения, основного соединения или переходного металла, способного удалять защитную группу не воздействуя на пептидную связь, в зависимости от вида защитной группы.[41] The deprotection reaction to remove the protecting group of the peptide can be carried out using an acidic compound, a basic compound, or a transition metal capable of removing the protecting group without affecting the peptide bond, depending on the kind of the protecting group.
[42] Реакцию снятия защиты можно выполнять посредством кислотной обработки с применением, например, хлороводорода, бромоводорода, фторводорода, уксусной кислоты, метансульфоновой кислоты, трифторметансульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты, триметилхлорсилана или их смесей.[42] The deprotection reaction can be carried out by acid treatment using, for example, hydrogen chloride, hydrogen bromide, hydrogen fluoride, acetic acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, trimethylchlorosilane, or mixtures thereof.
[43] При осуществлении реакции снятия защиты посредством кислотной обработки, ее можно стимулировать путем добавления вспомогательного вещества, такого как анизол, фенол или тиоанизол.[43] When carrying out the deprotection reaction by acid treatment, it can be stimulated by adding an auxiliary substance such as anisole, phenol or thioanisole.
[44] В качестве альтернативы, реакцию снятия защиты можно выполнять посредством основной обработки с применением, например, аммиака, диэтиламина, гидразина, морфолина, N-метилпирролидина, пиперидина, карбоната натрия или их смесей.[44] Alternatively, the deprotection reaction can be performed by basic treatment using, for example, ammonia, diethylamine, hydrazine, morpholine, N-methylpyrrolidine, piperidine, sodium carbonate, or mixtures thereof.
[45] В качестве альтернативы, реакцию снятия защиты можно выполнять посредством обработки переходным металлом с применением, например, цинка, ртути, палладия/водорода и т. д.[45] Alternatively, the deprotection reaction can be performed by transition metal treatment using, for example, zinc, mercury, palladium/hydrogen, etc.
[46] После завершения реакции пептид можно очищать с применением традиционного способа очистки пептида, такого как экстрагирование, разделение слоев, осаждение твердых частиц, рекристаллизация или колоночная хроматография.[46] After completion of the reaction, the peptide can be purified using a conventional peptide purification method such as extraction, layer separation, solid particle precipitation, recrystallization, or column chromatography.
[47] Кроме того, пептид в соответствии с настоящим изобретением можно превратить в его вариант или его фармацевтически приемлемую соль с применением традиционного способа.[47] In addition, the peptide of the present invention can be converted into a variant thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof using a conventional method.
[48] Пептид в соответствии с настоящим изобретением можно синтезировать с применением автоматического синтезатора пептидов или можно получить с помощью манипуляции с генами. Например, слитый ген, кодирующий слитый белок, содержащий партнера по слиянию и пептид в соответствии с настоящим изобретением, изготавливают с помощью манипуляции с генами, а затем применяют для трансформации микроорганизма-хозяина и слитый белок экспрессируется в микроорганизме-хозяине, после чего пептид в соответствии с настоящим изобретением расщепляется или отделяется от слитого белка с применением протеолитического фермента или соединения, с получением таким образом требуемого пептида.[48] The peptide according to the present invention can be synthesized using an automatic peptide synthesizer or can be obtained by gene manipulation. For example, a fusion gene encoding a fusion protein containing a fusion partner and a peptide according to the present invention is made by gene manipulation, and then used to transform a host microorganism, and the fusion protein is expressed in the host microorganism, after which the peptide according to with the present invention is cleaved or separated from the fusion protein using a proteolytic enzyme or compound, thereby obtaining the desired peptide.
[49] Пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением вводят парентерально в количестве от 24,3 мг/день до 4860 мг/день и предпочтительно от 48,6 мг/день до 2430 мг/день. При пероральном введении его количество превышает в от 5 до 10 раз количество при парентеральном введении. Введение можно проводить один раз в день или несколько раз в день и его количество может зависеть от взрослого (с весом 60 кг), но может варьировать в зависимости от веса, состояния тела и т. п. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением можно в основном вводить посредством парентеральных путей, например, внутривенной инъекции, подкожной инъекции, интраспинального введения, трансдермального введения, трансназального введения или ректального введения. В некоторых случаях возможно пероральное введение.[49] The peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is parenterally administered in an amount of 24.3 mg/day to 4860 mg/day, and preferably 48.6 mg/day to 2430 mg/day. When administered orally, its amount exceeds from 5 to 10 times the amount when administered parenterally. The administration may be once a day or several times a day and the amount may depend on the adult (60 kg) but may vary depending on weight, body condition, etc. The peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention can generally be administered via parenteral routes, for example, intravenous injection, subcutaneous injection, intraspinal administration, transdermal administration, transnasal administration or rectal administration. In some cases, oral administration is possible.
[50] Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, или композиция в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены вместе с фармацевтически приемлемой добавкой в форме инъекции, суппозитория, порошка, назальных капель, гранулы, таблетки или трансдермального пластыря.[50] The peptide or a pharmaceutically acceptable salt or composition thereof according to the present invention may be formulated with a pharmaceutically acceptable supplement in the form of an injection, suppository, powder, nasal drops, granule, tablet or transdermal patch.
[51] Фармацевтически приемлемую добавку можно применять в зависимости от различных факторов, хорошо известных специалистам в данной области техники, включая, например, определенный биоактивный материал, его концентрацию, стабильность и предполагаемую биодоступность; нарушения и заболевания, подлежащие лечению, или состояния, ассоциированные с ними; индивидуумы, подлежащие лечению, их возраст, размер и общее состояние здоровья; и пути введения композиции, например, назальный, пероральный, глазной, местный, трансдермальный и внутримышечный пути, однако, настоящее изобретение не ограничивается ими. Фармацевтически приемлемая добавка, которую применяют для введения биоактивного материала, в дополнение к пероральному пути введения, может включать водный раствор, включающий D5W (5% глюкозы в воде), декстрозу и физиологическую соль в количестве, находящемся в пределах 5% от ее объема. В случае местной инъекции, вводимой внутрь пораженных тканей, для усиления терапевтических эффектов и увеличения их продолжительности могут применяться любые инъецируемые гидрогели. Также фармацевтически приемлемая добавка может содержать дополнительные компоненты для улучшения стабильности эффективных компонентов, такие как консерванты и антиоксиданты. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, или композиция в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены с помощью подходящих способов в смежной области и предпочтительно составлены как подходящие для каждого заболевания или компонента по ссылке на широко известную литературу, относящуюся к способам составления в области техники.[51] A pharmaceutically acceptable additive may be used depending on various factors well known to those skilled in the art, including, for example, the particular bioactive material, its concentration, stability, and intended bioavailability; disorders and diseases to be treated, or conditions associated with them; individuals to be treated, their age, size and general health; and routes of administration of the composition, for example, nasal, oral, ocular, topical, transdermal and intramuscular routes, however, the present invention is not limited to them. A pharmaceutically acceptable additive that is used to administer the bioactive material, in addition to the oral route of administration, may include an aqueous solution containing D5W (5% glucose in water), dextrose and physiological salt in an amount within 5% of its volume. In the case of local injection administered into the affected tissues, any injectable hydrogels can be used to enhance therapeutic effects and increase their duration. Also, the pharmaceutically acceptable additive may contain additional components to improve the stability of the effective components, such as preservatives and antioxidants. The peptide or pharmaceutically acceptable salt thereof or composition according to the present invention can be formulated using suitable methods in the related art and is preferably formulated as appropriate for each disease or component by reference to the well-known literature relating to formulation methods in the art.
[52] Пептид по настоящему изобретению может храниться в солевом растворе или может лиофилизироваться в ампуле после добавления маннита или сорбита и его можно вводить после растворения в солевом растворе.[52] The peptide of the present invention may be stored in saline or may be lyophilized in an ampoule after addition of mannitol or sorbitol, and may be administered after being dissolved in saline.
[53] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения или предупреждения инсулита, в том числе введения пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением млекопитающему, в том числе человеку, нуждающемуся во введении. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения или предупреждения диабета 1 типа, в том числе введения пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением млекопитающему, в том числе человеку, нуждающемуся во введении. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения инсулита. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения диабета 1 типа. Введенные пептид или его фармацевтически приемлемая соль могут представлять собой пептид или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве.[53] In addition, the present invention provides a method for treating or preventing insulitis, including administering a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention to a mammal, including a human, in need of administration. In addition, the present invention provides a method for treating or preventing type 1 diabetes, including administering a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention to a mammal, including a human, in need of administration. In addition, the present invention contemplates the use of a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of insulitis. In addition, the present invention contemplates the use of a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of type 1 diabetes. The peptide or pharmaceutically acceptable salt thereof administered may be the peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof in an effective amount.
[54] Если не указано иное, вещества, описанные в связи с пептидом или его фармацевтически приемлемой солью, а также применение, композиция и способ в соответствии с настоящим изобретением, применяются в равной степени друг к другу в том же объеме, если они не противоречат друг другу.[54] Unless otherwise indicated, substances described in connection with a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as well as the use, composition and method in accordance with the present invention, apply equally to each other in the same scope, unless they contradict each other.
Полезные эффекты изобретенияUseful effects of the invention
[55] В соответствии с настоящим изобретением инсулит можно эффективно лечить или предупреждать. Более того, в соответствии с настоящим изобретением диабет 1 типа можно эффективно лечить или предупреждать.[55] According to the present invention, insulitis can be effectively treated or prevented. Moreover, according to the present invention, type 1 diabetes can be effectively treated or prevented.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
[56] На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления или снижения развития инсулита.[56] FIG. 1 is a graph showing the results of an analysis of the effect of the peptide of Example 1 in suppressing or reducing the development of insulitis.
[57] На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови.[57] FIG. 2 is a graph showing the results of an analysis of the effect of the peptide of Example 1 on lowering blood glucose levels.
[58] На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α.[58] FIG. 3 is a graph showing the results of analysis of the effect of the peptide of Example 1 on the suppression of IFN-γ expression and TNF-α expression.
[59] На фиг. 4 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении индукции экспрессии TGF-β1.[59] FIG. 4 is a graph showing the results of an analysis of the effect of the peptide of Example 1 on the induction of TGF-β1 expression.
[60] На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептидов из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α.[60] FIG. 5 is a graph showing the analysis results of the effect of the peptides of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 on suppression of IFN-γ expression and TNF-α expression.
[61] на фиг. 6 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептидов из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2, в отношении индукции экспрессии TGF-β1.[61] in FIG. 6 is a graph showing the results of analysis of the effect of the peptides of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 on the induction of TGF-β1 expression.
Вариант изобретенияVariant of the invention
[62] Лучшее понимание настоящего изобретения осуществляется с помощью следующих примеров, сравнительных примеров и примеров получения, в которых примеры и примеры получения изложены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения.[62] A better understanding of the present invention is provided by the following Examples, Comparative Examples and Production Examples, in which the Production Examples and Examples are set forth solely to illustrate the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention.
[63] Реагенты, применяемые в следующих примерах и т. п., являются коммерчески доступными и высококачественными продуктами, приобретенными у Sigma-Aldrich, если не указано иное.[63] The reagents used in the following examples and the like are commercially available and high quality products purchased from Sigma-Aldrich unless otherwise noted.
[64] <Пример 1> Получение пептида[64] <Example 1> Peptide preparation
[65] Пептид, показанный в таблице 1 ниже, получали с применением твердофазного способа синтеза пептида. В частности, пептид синтезировали с применением твердофазного способа с применением химических свойств Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонила).[65] The peptide shown in Table 1 below was obtained using a solid phase peptide synthesis method. In particular, the peptide was synthesized using a solid phase method using the chemical properties of Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl).
[66] Более конкретно, 0,55 ммоль/г твердой смолы (смолы Wang; Sigma-Aldrich), 5 мл диметилформамида (DMF), 1,1 ммоль Fmoc-Tyr(tBu)-OH и 0,55 ммоль О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилуроний-гексафторофосфата (HBTU) помещали в хорошо высушенный реактор и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, таким образом, синтезируя Fmoc-Tyr(tBu)-смолу, после чего синтезированную смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. В промытую смолу добавляли 8 мл 20% раствора пиперидина (растворенного в диметилформамиде) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин., таким образом синтезируя Fmoc (защитная группа флуоренилметилоксикарбонил)-незащищенную Tyr(tBu)-смолу. Синтезированную Tyr(tBu)-смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида.[66] More specifically, 0.55 mmol/g solid resin (Wang resins; Sigma-Aldrich), 5 ml dimethylformamide (DMF), 1.1 mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH, and 0.55 mmol O-benzotriazole -N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorophosphate (HBTU) was placed in a well-dried reactor and stirred at room temperature for 2 hours, thus synthesizing Fmoc-Tyr(tBu)-resin, after which the synthesized resin was filtered and then washed with dimethylformamide. 8 ml of 20% piperidine solution (dissolved in dimethylformamide) was added to the washed resin and stirred at room temperature for 30 minutes, thus synthesizing Fmoc (fluorenylmethyloxycarbonyl protecting group)-unprotected Tyr(tBu)-resin. The synthesized Tyr(tBu) resin was filtered and then washed with dimethylformamide.
[67] В промытую Tyr(tBu)-смолу добавляли к 5 мл диметилформамида, 1,1 ммоль Fmoc-Gly-OH и 0,55 ммоль О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилуроний-гексафторофосфата (HBTU) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч., таким образом синтезируя Fmoc-Gly-Tyr(tBu)-смолу, после чего синтезированную смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. В промытую смолу добавляли 8 мл 20% раствора пиперидина (растворенного в диметилформамиде) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин., таким образом синтезируя Fmoc-незащищенную Gly-Tyr(tBu)-смолу. Синтезированную Gly-Tyr(tBu)-смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. С помощью этих процедур пептидная связь образовывалась между глицином и тирозином.[67] The washed Tyr(tBu) resin was added to 5 ml dimethylformamide, 1.1 mmol Fmoc-Gly-OH and 0.55 mmol O-benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU ) and stirred at room temperature for 2 hours, thereby synthesizing an Fmoc-Gly-Tyr(tBu) resin, after which the synthesized resin was filtered and then washed with dimethylformamide. To the washed resin was added 8 ml of a 20% piperidine solution (dissolved in dimethylformamide) and stirred at room temperature for 30 minutes, thus synthesizing an Fmoc-unprotected Gly-Tyr(tBu) resin. The synthesized Gly-Tyr(tBu) resin was filtered and then washed with dimethylformamide. Using these procedures, a peptide bond was formed between glycine and tyrosine.
[68] После этого Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH и Fmoc-Tyr(tBu)-OH последовательно применяли и повторяли такие же процедуры, как и для образования пептидной связи между глицином и тирозином, тем самым получая соединение пептид-смола, содержащее аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1 ниже.[68] After that, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH and Fmoc-Tyr(tBu)-OH in succession the same procedures were used and repeated as for the formation of a peptide bond between glycine and tyrosine, thereby obtaining a peptide-resin compound containing the amino acid sequence shown in Table 1 below.
[69] После этого в соединение добавляли 10 мл смешанного раствора трифторуксусной кислоты и воды в соотношении 95:5 (об./об.), перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. и затем фильтровали, после чего в полученный фильтрат добавляли диэтиловый эфир, чтобы таким образом кристаллизировать твердое вещество. Полученное таким образом твердое вещество фильтровали, промывали диэтиловым эфиром и затем сушили, таким образом синтезируя неочищенное соединение пептида, содержащее аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1 ниже.[69] Thereafter, 10 ml of a 95:5 (v/v) mixed solution of trifluoroacetic acid and water was added to the compound, stirred at room temperature for 3 hours, and then filtered, after which diethyl ether was added to the resulting filtrate to thus crystallize the solid. The solid thus obtained was filtered, washed with diethyl ether, and then dried, thereby synthesizing a crude peptide compound containing the amino acid sequence shown in Table 1 below.
[70] Неочищенное соединение пептида очищали посредством обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) с применением колонки Shimadzu 5 мм Shim-pack ODS C18 (20 х 250 мм) и лиофилизировали, таким образом получая пептид из примера 1 в форме белого твердого вещества.[70] The crude peptide compound was purified by reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) using a Shimadzu 5 mm Shim-pack ODS C18 column (20 x 250 mm) and lyophilized, thus obtaining the peptide of Example 1 as a white solid substances.
[71] Очищенный пептид идентифицировали с помощью аналитической RP-HPLC с применением колонки Shimpak 5 мкм ODS C18 (4,6 x 250 мм) и молекулярный вес пептида измеряли с применением масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) (Axima CFR, Kratos Analytical, Манчестер, Великобритания).[71] The purified peptide was identified by analytical RP-HPLC using a Shimpak 5 µm ODS C18 column (4.6 x 250 mm) and the molecular weight of the peptide was measured using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry ( Axima CFR, Kratos Analytical, Manchester, UK).
[72] [Таблица 1][72] [Table 1]
[73] В таблице 1 Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).[73] In Table 1, Y is tyrosine (Tyr), G is glycine (Gly), and A is alanine (Ala).
[74] <Пример 2> Оценка эффектов пептида[74] <Example 2> Evaluation of the effects of the peptide
[75] 2-1. Оценка эффекта подавления или уменьшения развития инсулита[75] 2-1. Evaluation of the effect of suppressing or reducing the development of insulitis
[76] Эффект пептида из примера 1 в отношении подавления или уменьшения развития инсулита был экспериментально подтвержден.[76] The effect of the peptide of example 1 in suppressing or reducing the development of insulitis was experimentally confirmed.
[77] Экспериментальные животные представляли собой самок NOD/ShiLtJ (Jackson Lab) в возрасте 8 недель. Мыши NOD (диабетические, не страдающие ожирением) представляют собой животные модели инсулита и диабета 1 типа. Известно, что у этих животных диабет 1 типа возникает в среднем в возрасте 18 недель и 90% случаев возникает к возрасту 30 недель. Всех животных содержали в условиях барьера SPF. Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Osong Medical Innovation Foundation Laboratory Animal Center (Kbio-IACUC-2018-066). Период акклиматизации составлял 1 неделю и цикл дня и ночи составлял 12 ч. (08:00 свет выключен - 20:00 свет включен). Температура составляла 20±2°C и относительная влажность составляла от 60% до 80%. Поскольку распространение диабета можно подавлять с помощью кишечных микроорганизмов, воду, pH которой регулируется до 2,8-3,2 с применением HCl, подавали экспериментальным животным.[77] Experimental animals were female NOD/ShiLtJ (Jackson Lab) at the age of 8 weeks. Mice NOD (diabetic, non-obese) are animal models of insulitis and type 1 diabetes. Type 1 diabetes is known to occur in these animals at an average of 18 weeks of age and 90% of cases occur by 30 weeks of age. All animals were kept under SPF barrier conditions. This study was approved by the Institutional Animal Welfare and Use Committee of the Osong Medical Innovation Foundation Laboratory Animal Center (Kbio-IACUC-2018-066). The acclimatization period was 1 week and the day/night cycle was 12 hours (08:00 light off - 20:00 light on). The temperature was 20±2° C. and the relative humidity was 60% to 80%. Since the spread of diabetes can be suppressed by intestinal microorganisms, water, the pH of which is adjusted to 2.8-3.2 using HCl, was fed to the experimental animals.
[78] Конец хвоста экспериментальных животных, полученных выше, кололи один раз в неделю, и в капле крови из укола измеряли уровни глюкозы в крови с применением глюкометра (Roche, Accu-CHEK Performa). Когда измеренные уровни глюкозы в крови составляли 250 мг/дл или более и уровни глюкозы в крови, повторно измеренные на третий день после этого, составляли также 250 мг/дл или более, считалось, что диабет 1 типа возник и проводили эксперимент.[78] The end of the tail of the experimental animals obtained above was pricked once a week, and blood glucose levels were measured in a drop of blood from the prick using a glucometer (Roche, Accu-CHEK Performa). When the measured blood glucose levels were 250 mg/dl or more and the blood glucose levels measured again on the third day thereafter were also 250 mg/dl or more, type 1 diabetes was considered to have occurred and an experiment was performed.
[79] Два экспериментальных животных с диабетом 1 типа были выбраны в качестве группы обработки из примера 1 и им подкожно (SC) вводили 100 мкл пептида из примера 1 (5 мг/кг). Введение проводили каждое утро и вечер в течение 14 дней и уровни глюкозы в крови измеряли с применением глюкометра. Введение прекращали, когда уровень глюкозы в крови снижался до 250 мг/дл или менее. Кроме того, два экспериментальных животных с диабетом 1 типа были выбраны в качестве группы отрицательного контроля, и их обрабатывали таким же образом, как и группу обработки из примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) вводили вместо пептида из примера 1. На 14-ый день одно экспериментальное животное, измеренные уровни глюкозы в крови которого составляли менее чем 250 мг/дл, было выбрано в качестве нормальной группы и его применяли для сравнения показателей инсулита экспериментальных животных с диабетом 1 типа и экспериментальных животных без диабета 1 типа.[79] Two experimental animals with type 1 diabetes were selected as the treatment group from example 1 and were injected subcutaneously (SC) with 100 μl of the peptide from example 1 (5 mg/kg). Administration was carried out every morning and evening for 14 days, and blood glucose levels were measured using a glucometer. The administration was stopped when the blood glucose level dropped to 250 mg/dL or less. In addition, two experimental animals with type 1 diabetes were selected as a negative control group, and they were treated in the same way as the treatment group from example 1, except that PBS (phosphate buffered saline, Welgene) was administered instead of the peptide from Example 1. On day 14, one experimental animal whose measured blood glucose levels were less than 250 mg/dL was selected as the normal group and used to compare the insulitis scores of experimental animals with type 1 diabetes and experimental animals without type 1 diabetes.
[80] После измерений уровней глюкозы в крови на 14-ый день поджелудочную железу удаляли у экспериментальных животных и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (10% NBF, Sigma, HT5011) для изготовления парафинового блока. Фиксированную ткань поджелудочной железы нарезали, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и исследовали с применением оптического микроскопа для подтверждения развития инсулита. Инсулит был поделен на 4 стадии в зависимости от его степени: стадия 0, при которой инсулит не наблюдается, стадия 1, при которой инсулит наблюдается вокруг панкреатических островков, стадия 2, при которой инсулит составляет 75%, и стадия 3, при которой инсулит составляет 75% или более. Для группы обработки примера 1 измеряли количество островков у двух животных, отдельные островки классифицировали в зависимости от стадии инсулита, таким образом определяя показатель инсулита, и количество островков, соответствующих каждой стадии инсулита, среди общего количества островков представляли в процентах. Для группы отрицательного контроля и нормальной группы показатели инсулита определяли как и для группы обработки примера 1, после чего количество островков, соответствующих стадии инсулита, среди общего количества островков представляли в процентах. Результаты показаны на фиг. 1.[80] After measuring blood glucose levels on
[81] На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления или снижения развития инсулита. На фиг. 1 ось х представляет собой каждую группу, а ось у представляет собой показатель инсулита {инсулит (% островков)}. На фиг. 1 показатель 0 означает стадию 0, показатель 1 означает стадию 1, показатель 2 означает стадию 2 и показатель 3 означает стадию 3.[81] FIG. 1 is a graph showing the results of an analysis of the effect of the peptide of Example 1 in suppressing or reducing the development of insulitis. In FIG. 1, the x-axis represents each group and the y-axis represents the insulitis score {insulitis (% of islets)}. In FIG. 1
[82] Как показано на фиг. 1, в группе обработки примера 1 процент в стадии 3, которая представляет собой самую тяжелую стадию, был снижен и проценты в стадиях 0-2, при которых может секретироваться инсулин, были повышены по сравнению с группой отрицательного контроля. В частности, в группе обработки примера 1 процент в стадии 0, при которой не возникает инсулит, был примерно удвоен по сравнению с группой отрицательного контроля. На основании приведенных выше результатов можно обнаружить, что пептид из примера 1 являлся эффективным в лечении инсулита путем подавления развития инсулита и облегчения проявлений инсулита. Кроме того, процент в стадии 0 был выше в группе обработки примера 1, чем у нормальной группы. Следовательно, пептид из примера 1 способен подавлять развитие инсулита, что указывает на то, что пептид из примера 1 являлся эффективным как в лечении, так и в предупреждении инсулита.[82] As shown in FIG. 1, in the Example 1 treatment group, the percentage in stage 3, which is the most severe stage, was reduced and the percentages in stages 0-2 at which insulin can be secreted were increased compared to the negative control group. In particular, in the example treatment group, 1 percent in
[83] В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид по настоящему изобретению характеризуется терапевтическим и/или профилактическим эффектом в отношении инсулита.[83] Ultimately, it can be concluded that the peptide of the present invention has a therapeutic and/or prophylactic effect on insulitis.
[84] 2-2. Оценка эффекта снижения уровней глюкозы в крови[84] 2-2. Assessing the effect of lowering blood glucose levels
[85] Для оценки эффекта пептида из примера 1 в отношении диабета 1 типа (T1D) эффект пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови у экспериментальных животных с диабетом 1 типа был экспериментально подтвержден.[85] To evaluate the effect of the peptide of Example 1 on type 1 diabetes (T1D), the effect of the peptide of Example 1 on lowering blood glucose levels in experimental animals with type 1 diabetes was experimentally confirmed.
[86] В частности, уровни глюкозы в крови группы обработки примера 1 и группы отрицательного контроля среди экспериментальных животных примера 2-1 анализировали и, таким образом, оценивали эффект пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови. Результаты показаны на фиг. 2.[86] In particular, the blood glucose levels of the treatment group of Example 1 and the negative control group among the experimental animals of Example 2-1 were analyzed, and thus the effect of the peptide of Example 1 on lowering blood glucose levels was evaluated. The results are shown in FIG. 2.
[87] На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови. В данном случае ось х представляет собой время после обработки (d), а ось y представляет собой уровни глюкозы в крови (мг/дл).[87] FIG. 2 is a graph showing the results of an analysis of the effect of the peptide of Example 1 on lowering blood glucose levels. In this case, the x-axis represents time after treatment (d) and the y-axis represents blood glucose levels (mg/dL).
[88] Как показано на фиг. 2, уровни глюкозы в крови двух животных в группе обработки примера 1 (примера 1-1 и пример 1-2) снижались в значительной степени и затем оставались в диапазоне нормальных значений, но уровни глюкозы в крови двух животных в группе отрицательного контроля (группа отрицательного контроля 1 и группа отрицательного контроля 2) непрерывно повышались.[88] As shown in FIG. 2, the blood glucose levels of the two animals in the treatment group of Example 1 (Example 1-1 and Example 1-2) decreased significantly and then remained in the normal range, but the blood glucose levels of the two animals in the negative control group (Negative control 1 and negative control group 2) continuously increased.
[89] На основании приведенных выше результатов можно подтвердить, что пептид по настоящему изобретению являлся эффективным в отношении снижения уровней глюкозы в крови. Поскольку пептид по настоящему изобретению являлся эффективным в отношении снижения уровней глюкозы в крови мышей с диабетом 1 типа и в отношении поддержания нормальных уровней глюкозы в крови, пептид по настоящему изобретению, как представляется, способен лечить или предупреждать диабет 1 типа путем снижения уровней глюкозы в крови. Кроме того, как подтверждено выше, поскольку пептид по настоящему изобретению способен подавлять и уменьшать развитие инсулита, он может проявлять терапевтический и/или профилактический эффект в отношении диабета 1 типа путем его действия и, можно считать, характеризуется эффектом снижения уровней глюкозы в крови.[89] Based on the above results, it can be confirmed that the peptide of the present invention was effective in lowering blood glucose levels. Because the peptide of the present invention was effective in lowering blood glucose levels in type 1 diabetic mice and in maintaining normal blood glucose levels, the peptide of the present invention appears to be able to treat or prevent type 1 diabetes by lowering blood glucose levels. . In addition, as confirmed above, since the peptide of the present invention is able to suppress and reduce the development of insulitis, it can have a therapeutic and/or prophylactic effect on type 1 diabetes through its action, and can be considered to have a blood glucose lowering effect.
[90] В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид по настоящему изобретению осуществляет лечение и/или предупреждение диабета 1 типа.[90] Ultimately, it can be concluded that the peptide of the present invention provides treatment and/or prevention of type 1 diabetes.
[91] 2-3. Оценка эффекта подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1.[91] 2-3. Evaluation of the effect of suppression of IFN-γ expression and TNF-α expression and induction of TGF-β1 expression.
[92] Оценивали эффект пептида из примера 1 в отношении цитокина {IFN-γ (гамма-интерферона), TNF-α (фактора некроза опухоли альфа) и TGF-β1 (трансформирующего ростового фактора бета 1)}, ассоциированных с инсулитом. Известно, что инсулит вызван экспрессией IFN-γ и TNF-α, и известно, что повышенная экспрессия TGF-β1 защищает поджелудочную железу от инсулита. Таким образом, путем определения того, подавляет ли пептид из примера 1 экспрессию IFN-γ и TNF-α и индуцирует ли экспрессию TGF-β1, оценивали его эффект в отношении инсулита.[92] The effect of the peptide of Example 1 on the cytokine {IFN-γ (interferon gamma), TNF-α (tumor necrosis factor alpha) and TGF-β1 (transforming growth factor beta 1)} associated with insulitis was evaluated. It is known that insulitis is caused by the expression of IFN-γ and TNF-α, and it is known that increased expression of TGF-β1 protects the pancreas from insulitis. Thus, by determining whether the peptide of Example 1 suppresses the expression of IFN-γ and TNF-α and induces the expression of TGF-β1, its effect on insulitis was evaluated.
[93] Конец хвоста экспериментальных животных, полученных как в примере 2-1, кололи один раз в неделю, и в капле крови из укола измеряли уровни глюкозы в крови с применением глюкометра (Roche, Accu-CHEK Performa). Было подтверждено, что уровни глюкозы в крови являлись «высокими» (600 мг/дл или более), мыши подвергались цервикальной дислокации и из них извлекали селезенку. Клеточное сито (BD, 352350) помещали в пробирку объемом 50 мл, и ткань извлеченной селезенки пропускали через клеточное сито с применением наконечника шприца, после чего в пробирку, содержащую клеточное сито, добавляли HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса) таким образом, что клетки промывали водой с последующим центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта. Клетки суспендировали в 1 мл HBSS с добавлением 10 мл 1x лизирующего буфера RBC (Ebioscience, 00-4333-57), смешивали при легком перемешивании, оставляли во льду в течение 5 мин и затем центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта. К полученным клеткам снова добавляли 10 мл лизирующего буфера RBC, оставляли во льду в течение 5 мин, дополнительно центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта и затем промывали два раза с помощью 10 мл HBSS. После окончательного центрифугирования (1000 об/мин, 5 мин) клетки суспендировали в 1 мл HBSS, 50 мкл клеток разбавляли раствором трипанового синего 1:1 и количество клеток подсчитывали с применением гемоцитометра. Извлеченные спленоциты помещали в количестве 1x107 клеток на лунку в 6-луночный планшет в 2 мл среды RPMI-1640 (Welgene, LM011-01), содержащей 10% FBS (эмбриональную бычью сыворотку, Corning, 35-015-CV), и добавляли к ней 2 нг/мл антител к CD28 мыши (Ebioscience, 16-0281-82) для индукции активности Т-клеток. Одновременно клетки обрабатывали 100 ммоль пептида из примера 1 в 5% CO2 инкубаторе при 37°C в течение 3 ч. для оценки изменений экспрессии IFN-γ и TNF-α и в течение 72 ч. для оценки изменений экспрессии TGF-β1.[93] The end of the tail of the experimental animals obtained as in Example 2-1 was pricked once a week, and blood glucose levels were measured in a drop of blood from the prick using a glucometer (Roche, Accu-CHEK Performa). Blood glucose levels were confirmed to be "high" (600 mg/dl or more), mice underwent cervical dislocation and the spleen was removed from them. The cell sieve (BD, 352350) was placed in a 50 ml tube, and the tissue of the extracted spleen was passed through the cell sieve using a syringe tip, after which HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) was added to the tube containing the cell sieve so that the cells were washed water followed by centrifugation (1000 rpm, 5 min) to remove the supernatant. Cells were suspended in 1 ml HBSS supplemented with 10 ml 1x RBC lysis buffer (Ebioscience, 00-4333-57), mixed with gentle agitation, left on ice for 5 min and then centrifuged (1000 rpm, 5 min) to remove supernatant. 10 ml RBC lysis buffer was again added to the resulting cells, left on ice for 5 min, centrifuged further (1000 rpm, 5 min) to remove the supernatant, and then washed twice with 10 ml HBSS. After final centrifugation (1000 rpm, 5 min), cells were suspended in 1 ml HBSS, 50 μl of cells were diluted with trypan blue solution 1:1, and the number of cells was counted using a hemocytometer. The extracted splenocytes were plated at 1x10 7 cells per well in a 6-well plate in 2 ml of RPMI-1640 medium (Welgene, LM011-01) containing 10% FBS (fetal bovine serum, Corning, 35-015-CV) and added to it 2 ng/ml of antibodies to mouse CD28 (Ebioscience, 16-0281-82) to induce T-cell activity. Simultaneously, cells were treated with 100 mmol of the peptide from Example 1 in a 5% CO 2 incubator at 37° C. for 3 hours to assess changes in IFN-γ and TNF-α expression and for 72 hours to assess changes in TGF-β1 expression.
[94] После этого клетки центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин.) для удаления супернатанта, лизировали посредством пипетирования 5 мл TRIzol (Invitrogen, 15596-018) и оставляли при комнатной температуре в течение 5 мин. К клеткам добавляли 100 мкл хлороформа, смешивали при энергичном перемешивании и затем оставляли при комнатной температуре в течение 2 мин. После этого проводили центрифугирование (12000 об/мин, 15 мин.) и только супернатант осторожно переносили на новую е-пробирку объемом 1,5 мл с добавлением 300 мкл изопропанола, смешивали при легком перемешивании и затем оставляли при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем проводили центрифугирование (12000 об/мин, 15 мин.) для удаления супернатанта с промыванием в 500 мкл 70% этанола, разбавленного в обработанной DEPC (диэтилпирокарбонатом) воде (раствор LPS, CBW004), и центрифугирование (12000 об/мин, 10 мин.) для удаления супернатанта, после чего оставшийся этанол выпаривали в непокрытом состоянии. РНК элюировали путем добавления 30 мкл обработанной DEPC воды и количественно определяли.[94] After that, the cells were centrifuged (1000 rpm, 5 min.) to remove the supernatant, lysed by pipetting 5 ml of TRIzol (Invitrogen, 15596-018) and left at room temperature for 5 min. 100 µl of chloroform was added to the cells, mixed with vigorous stirring, and then left at room temperature for 2 minutes. After that, centrifugation (12000 rpm, 15 min.) was carried out and only the supernatant was carefully transferred to a new 1.5 ml e-tube with the addition of 300 μl of isopropanol, mixed with gentle agitation, and then left at room temperature for 10 min. Then, centrifugation (12000 rpm, 15 min.) was performed to remove the supernatant with washing in 500 μl of 70% ethanol diluted in DEPC (diethyl pyrocarbonate) treated water (LPS solution, CBW004) and centrifugation (12000 rpm, 10 min. .) to remove the supernatant, after which the remaining ethanol was evaporated uncoated. RNA was eluted by adding 30 μl of DEPC-treated water and quantified.
[95] cDNA синтезировали посредством методики эксперимента для набора для синтеза cDNA (ELPISbio, EBT-1512) с применением 1 мг количественно определенной РНК. Затем в соответствии с методикой для набора для ПЦР (полимеразной цепной реакции) (Solgent, SEF01-M50H) амплифицировали cDNA каждого цитокина (IFN-γ, TNF-α, TGF-β1) и конститутивный ген GAPDH для количественного определения изменений экспрессии цитокинов. Затем продукты ПЦР подвергались электрофорезу на 2% агарозном геле, чтобы таким образом подтвердить связи ДНК, которые затем количественно определяли с применением программы Image J, и количественно определенные значения рассчитывали как процентное отношение к GAPDH. Контрольную группу обрабатывали таким же образом, как и группу обработки примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) применяли вместо пептида из примера 1 и антитела к CD28 мыши, и группу отрицательного контроля обрабатывали таким же образом, как и группу обработки примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) применяли вместо пептида из примера 1. Результаты показаны на фиг. 3 и 4. Последовательности праймера для ПЦР каждого цитокина показаны в таблице 2 ниже.[95] cDNA was synthesized by the cDNA Synthesis Kit Experimental Procedure (ELPISbio, EBT-1512) using 1 mg of quantified RNA. Then, according to the procedure for the PCR (polymerase chain reaction) kit (Solgent, SEF01-M50H), the cDNA of each cytokine (IFN-γ, TNF-α, TGF-β1) and the constitutive GAPDH gene were amplified to quantify changes in cytokine expression. The PCR products were then subjected to 2% agarose gel electrophoresis to thereby confirm the DNA bonds, which were then quantified using the Image J program, and the quantified values were calculated as a percentage of GAPDH. The control group was treated in the same manner as the treatment group of Example 1, except that PBS (phosphate buffered saline, Welgene) was used in place of the peptide from Example 1 and anti-mouse CD28 antibody, and the negative control group was treated in the same manner as and the treatment group of Example 1, except that PBS (phosphate buffered saline, Welgene) was used in place of the peptide from Example 1. The results are shown in FIG. 3 and 4. The PCR primer sequences for each cytokine are shown in Table 2 below.
[96] [Таблица 2][96] [Table 2]
[97] В таблице 2 t представляет собой тимин, а представляет собой аденин, с представляет собой цитозин и g представляет собой гуанин.[97] In Table 2, t is thymine, a is adenine, c is cytosine, and g is guanine.
[98] На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α, и на фиг. 4 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении индукции экспрессии TGF-β1. На фиг. 3 и 4 ось х представляет собой контрольную группу {(-)}, группу отрицательного контроля (антитело к CD28) и группу обработки примера 1 (антитело к CD28 + пример 1), и на фиг. 3 и 4 ось у представляет собой уровень экспрессии мРНК в процентном отношении к GAPDH {цитокины/GAPDH (%)}.[98] FIG. 3 is a graph showing the results of analysis of the effect of the peptide of Example 1 on the suppression of IFN-γ expression and TNF-α expression, and FIG. 4 is a graph showing the results of an analysis of the effect of the peptide of Example 1 on the induction of TGF-β1 expression. In FIG. 3 and 4, the x-axis represents the control group {(-)}, the negative control group (anti-CD28 antibody) and the treatment group of example 1 (anti-CD28 antibody + example 1), and in FIG. The 3rd and 4th y-axes are the level of mRNA expression as a percentage of GAPDH {cytokines/GAPDH (%)}.
[99] Как показано на фиг. 3, на основании результатов оценки уровней экспрессии IFN-γ и TNF-α, которые, как известно, вызывают инсулит, каждый уровень экспрессии был снижен по сравнению с группой отрицательного контроля. Следовательно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 подавлял экспрессию IFN-γ и TNF-α, что указывает на то, что развитие инсулита было подавлено, таким образом эффективно осуществляя лечение и/или предупреждение инсулита.[99] As shown in FIG. 3, based on the results of assessing the expression levels of IFN-γ and TNF-α, which are known to cause insulitis, each expression level was reduced compared to the negative control group. Therefore, it can be confirmed that the peptide of Example 1 suppressed the expression of IFN-γ and TNF-α, indicating that the development of insulitis was suppressed, thus effectively treating and/or preventing insulitis.
[100] Как показано на фиг. 4, на основании результатов оценки уровня экспрессии TGF-β1, который, как известно, поражает защиту поджелудочной железы от инсулита, уровень экспрессии был повышен по сравнению с группой отрицательного контроля. Следовательно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 индуцирует экспрессию TGF-β1, тем самым защищая поджелудочную железу от инсулита, таким образом эффективно лечит и/или предупреждает инсулит.[100] As shown in FIG. 4, based on the results of evaluating the expression level of TGF-β1, which is known to affect the protection of the pancreas against insulitis, the expression level was increased compared with the negative control group. Therefore, it can be confirmed that the peptide of Example 1 induces TGF-β1 expression, thereby protecting the pancreas from insulitis, thus effectively treating and/or preventing insulitis.
[101] Соответственно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 является эффективным в лечении и/или предупреждении инсулита путем подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и/или индукции экспрессии TGF-β1.[101] Accordingly, it can be confirmed that the peptide of Example 1 is effective in treating and/or preventing insulitis by suppressing IFN-γ expression and TNF-α expression and/or inducing TGF-β1 expression.
[102] В заключение, пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением способны проявлять терапевтический и/или профилактический эффект в отношении инсулита путем подавления экспрессии IFN-γ, подавления экспрессии TNF-α и/или индукции экспрессии TGF-β1. В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением способны лечить и/или предупреждать диабет 1 типа.[102] In conclusion, the peptide or pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is capable of exerting a therapeutic and/or prophylactic effect on insulitis by suppressing IFN-γ expression, suppressing TNF-α expression, and/or inducing TGF-β1 expression. Ultimately, it can be concluded that the peptide or pharmaceutically acceptable salt of the present invention is capable of treating and/or preventing type 1 diabetes.
[103] <Сравнительный пример 1 и сравнительный пример 2> Получение пептида[103] <Comparative Example 1 and Comparative Example 2> Preparation of Peptide
[104] Для оценки того, проявляет ли активность часть пептида из примера 1, получали пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности пептида из примера 1. Пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2 представляли собой пептид (GAGAGY), состоящий из 6 аминокислот последовательно от С-конца аминокислотной последовательности (YGAGAGAGY) пептида из примера 1, и пептид (YGAGAG), состоящий из 6 аминокислот последовательно от его N-конца соответственно. Пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2 изготавливали таким же образом, что и пептид из примера 1, на основании аминокислотной последовательности, показанной в таблице 3 ниже.[104] To evaluate whether a portion of the peptide of Example 1 exhibits activity, the peptide of Comparative Example 1 and the peptide of Comparative Example 2 were prepared containing amino acid sequences corresponding to the amino acid sequence portion of the peptide of Example 1. The peptide of Comparative Example 1 and the peptide of Comparative Example 2 were a peptide (GAGAGY) consisting of 6 amino acids consecutively from the C-terminus of the amino acid sequence (YGAGAGAGY) of the peptide of Example 1 and a peptide (YGAGAG) consisting of 6 amino acids sequentially from its N-terminus, respectively. The peptide of Comparative Example 1 and the peptide of Comparative Example 2 were prepared in the same manner as the peptide of Example 1 based on the amino acid sequence shown in Table 3 below.
[105] [Таблица 3][105] [Table 3]
[106] В таблице 3 Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).[106] In Table 3, Y is tyrosine (Tyr), G is glycine (Gly), and A is alanine (Ala).
[107] <Сравнительный пример> Оценка эффектов пептида из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2[107] <Comparative Example> Evaluation of the effects of the peptide of Comparative Example 1 and Comparative Example 2
[108] Для оценки того, являются ли эффективными пептиды из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1, как пептид из примера 1, проводили следующий эксперимент.[108] To evaluate whether the peptides of Comparative Examples 1 and 2 are effective in suppressing IFN-γ expression and TNF-α expression and inducing TGF-β1 expression like the peptide of Example 1, the following experiment was performed.
[109] Настоящий эксперимент проводили таким же образом, что и в примере 2-3, за исключением того, что пептид из сравнительного примера 1 или пептид из сравнительного примера 2 применяли вместо пептида из примера 1. Результаты показаны на фиг. 5 и 6.[109] The present experiment was carried out in the same manner as in Example 2-3, except that the peptide from Comparative Example 1 or the peptide from Comparative Example 2 was used instead of the peptide from Example 1. The results are shown in FIG. 5 and 6.
[110] На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффектов пептидов из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α, и на фиг. 6 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффектов пептидов из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении индукции экспрессии TGF-β1. На фиг. 5 и 6 ось х представляет собой контрольную группу {(-)}, группу отрицательного контроля (антитело к CD28) и группу обработки сравнительного примера 1 (антитело к CD28 + сравнительный пример 1) и группу обработки сравнительного примера 2 (антитело к CD28 + сравнительный пример 2) и на фиг. 5 и 6 ось у представляет собой уровень экспрессии мРНК в процентном отношении {цитокины/GAPDH (%)} к GAPDH.[110] FIG. 5 is a graph showing the results of analysis of the effects of the peptides of Comparative Examples 1 and 2 on the suppression of IFN-γ expression and TNF-α expression, and FIG. 6 is a graph showing the results of analysis of the effects of the peptides of Comparative Examples 1 and 2 on the induction of TGF-β1 expression. In FIG. 5 and 6, the x-axis represents the control group {(-)}, the negative control group (anti-CD28 antibody) and the treatment group of Comparative Example 1 (anti-CD28 antibody + Comparative Example 1) and the treatment group of Comparative Example 2 (anti-CD28 antibody + Comparative Example 1). example 2) and in Fig. The 5th and 6th y-axes are the level of mRNA expression as a percentage of {cytokines/GAPDH (%)} to GAPDH.
[111] Как показано на фиг. 5, на основании результатов оценки уровней экспрессии IFN-γ и TNF-α, которые, как известно, вызывают инсулит, уровень их экспрессии в каждой из группы обработки сравнительного примера 1 и группы обработки сравнительного примера 2 не изменялся значительно по сравнению с группой отрицательного контроля, и вместо этого было обнаружено, что в группе обработки сравнительного примера 2 повышался уровень экспрессии TNF-α. Кроме того, как представлено на фиг. 6, на основании результатов оценки уровней экспрессии TGF-β1, которые, как известно, поражают защиту поджелудочной железы от инсулита, уровень его экспрессии в каждой из группы обработки сравнительного примера 1 и группы обработки сравнительного примера 2 не изменялся значительно по сравнению с группой отрицательного контроля. Из этих результатов можно увидеть, что пептиды из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2 не проявляли эффектов в отношении подавления экспрессии IFN-γ, подавления экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1, в отличие от пептида из примера 1.[111] As shown in FIG. 5, based on the results of evaluating the expression levels of IFN-γ and TNF-α known to cause insulitis, their expression level in each of the Comparative Example 1 treatment group and Comparative Example 2 treatment group did not change significantly compared to the negative control group. , and instead, it was found that in the treatment group of Comparative Example 2, the expression level of TNF-α increased. In addition, as shown in FIG. 6, based on the results of evaluating the expression levels of TGF-β1, which is known to affect the protection of the pancreas against insulitis, its expression level in each of the treatment group of comparative example 1 and the treatment group of comparative example 2 did not change significantly compared with the negative control group. . From these results, it can be seen that the peptides of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 had no effects on suppressing IFN-γ expression, suppressing TNF-α expression, and inducing TGF-β1 expression, unlike the peptide of Example 1.
[112] На основании приведенных выше результатов можно сделать вывод, что целый пептид из примера 1, а не его часть, является эффективным в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1 и характеризуется эффектом в отношении инсулита и диабета 1 типа.[112] Based on the above results, it can be concluded that the whole peptide of Example 1, rather than a portion thereof, is effective in suppressing IFN-γ expression and TNF-α expression and inducing TGF-β1 expression, and has an effect on insulitis and type 1 diabetes.
[113] <Пример получения 1> Получение инъекционного раствора[113] <Production Example 1> Preparation of injection solution
[114] Для получения 1 мл раствора 10 мг пептида, полученного таким же образом, что и в примере 1, растворяли в PBS. Этот раствор загружали в ампулу для инъекции для получения инъекционного раствора.[114] To obtain 1 ml of a solution, 10 mg of the peptide obtained in the same manner as in example 1 was dissolved in PBS. This solution was loaded into an injection vial to prepare an injection solution.
Промышленная применимостьIndustrial Applicability
[115] Настоящее изобретение является эффективным в лечении или предупреждения инсулита. Кроме того, настоящее изобретение является эффективным в лечении или предупреждения диабета 1 типа. Следовательно, настоящее изобретение является промышленно применимым.[115] The present invention is effective in the treatment or prevention of insulitis. In addition, the present invention is effective in the treatment or prevention of type 1 diabetes. Therefore, the present invention is industrially applicable.
--->--->
<110> Инсол Байосайенсиз, инк.<110> Insol Biosciences, Inc.
<120> НОВЫЙ ПЕПТИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ<120> NEW PEPTIDE AND ITS APPLICATIONS
<130> GP19010PCT<130> GP19010PCT
<160> 11<160> 11
<170> KoPatentIn 3.0<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1<210> 1
<211> 9<211> 9
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> пептид<223> peptide
<400> 1<400> 1
Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly TyrTyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr
1 5 fifteen
<210> 2<210> 2
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> прямой праймер для IFN-гамма<223> forward primer for IFN-gamma
<400> 2<400> 2
actggcaaaa ggatggtgac 20
<210> 3<210> 3
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> обратный праймер IFN-гамма<223> IFN-gamma reverse primer
<400> 3<400> 3
tgagctcatt gaatgcttgg 20
<210> 4<210> 4
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> прямой праймер для TNF-альфа<223> forward primer for TNF-alpha
<400> 4<400> 4
agcccccagt ctgtatcctt 20
<210> 5<210> 5
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> обратный праймер для TNF-альфа<223> reverse primer for TNF-alpha
<400> 5<400> 5
ctccctttgc agaactcagg 20
<210> 6<210> 6
<211> 17<211> 17
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> прямой праймер для TGF-бета1<223> forward primer for TGF-beta1
<400> 6<400> 6
gcttcagctc cacagag 17gcttcagctc cacagag 17
<210> 7<210> 7
<211> 17<211> 17
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> обратный праймер для TGF-бета1<223> reverse primer for TGF-beta1
<400> 7<400> 7
ggttgtagag ggcaagg 17ggttgtagag ggcaagg 17
<210> 8<210> 8
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> прямой праймер для GAPDH<223> forward primer for GAPDH
<400> 8<400> 8
tcatgaccac agtccatgcc 20
<210> 9<210> 9
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> обратный праймер для GAPDH<223> reverse primer for GAPDH
<400> 9<400> 9
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 10<210> 10
<211> 6<211> 6
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> пептид<223> peptide
<400> 10<400> 10
Gly Ala Gly Ala Gly TyrGly Ala Gly Ala Gly Tyr
1 5 fifteen
<210> 11<210> 11
<211> 6<211> 6
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> пептид<223> peptide
<400> 11<400> 11
Tyr Gly Ala Gly Ala GlyTyr Gly Ala Gly Ala Gly
1 5 fifteen
<---<---
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2019-0028654 | 2019-03-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2783776C1 true RU2783776C1 (en) | 2022-11-17 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104059131A (en) * | 2014-07-04 | 2014-09-24 | 丝科普乐（北京）生物科技有限公司 | Anti-silk fibroin polyclonal antibody and preparation method thereof |
| RU2015143655A (en) * | 2013-03-15 | 2017-04-26 | Шэньчжэнь Хайтайд Байофармасьютикал, Лтд. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING THE NEOGENESIS PEPTIDES OF THE ISLANDS AND THEIR ANALOGUES |
| WO2018147624A1 (en) * | 2017-02-09 | 2018-08-16 | 강원대학교산학협력단 | Insulin a-chain derived peptide fragment and pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or diabetic wounds, containing same |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2015143655A (en) * | 2013-03-15 | 2017-04-26 | Шэньчжэнь Хайтайд Байофармасьютикал, Лтд. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING THE NEOGENESIS PEPTIDES OF THE ISLANDS AND THEIR ANALOGUES |
| CN104059131A (en) * | 2014-07-04 | 2014-09-24 | 丝科普乐（北京）生物科技有限公司 | Anti-silk fibroin polyclonal antibody and preparation method thereof |
| WO2018147624A1 (en) * | 2017-02-09 | 2018-08-16 | 강원대학교산학협력단 | Insulin a-chain derived peptide fragment and pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or diabetic wounds, containing same |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2633865T3 (en) | USE OF INTERLEUKIN-22 IN THE TREATMENT OF VIRAL HEPATITIS | |
| CN108883166B (en) | Conjugate vaccine targeting in vivo proteins which are the main cause of disease | |
| EP3431507A1 (en) | Fusion protein comprising nerve growth factor and preparation method and use thereof | |
| US20210253662A1 (en) | Long-Acting Recombinant GLP1-Fc-CD47 Protein and Preparation and Use Thereof | |
| KR102394681B1 (en) | Pharmaceutical composition for preventing or treating nonalcoholic fatty liver disease comprising a polypeptide | |
| CN113508126B (en) | Novel peptides and uses thereof | |
| WO2013037267A1 (en) | Variant of liraglutide and conjugate thereof | |
| AU2018247928B2 (en) | C4BP-based compounds for treating immunological diseases | |
| RU2783776C1 (en) | New peptide and application thereof | |
| CN107987144B (en) | Centipede polypeptide SLP _ SstX as well as encoding gene and application thereof | |
| AU2016297311B2 (en) | Novel peptide and use thereof | |
| EP4180452A1 (en) | Fusion protein including glucagon-like peptide-1 and interleukin-1 receptor antagonist and use thereof | |
| US8227404B2 (en) | Method of preventing acute or sub-acute hepatic failure in a subject by administering a soluble human tumor necrosis factor alpha fusion protein | |
| CN113501862A (en) | Polypeptide and application thereof in preparation of immunoregulation medicament | |
| JP2007209214A (en) | Insulin secretion-inducing agent, insulin secretion-inducing composition and method for producing the composition and virus vector for gene therapy | |
| KR20110018646A (en) | NOVEL GENES ENCODING β-DEFENSIN OF OLIVE FLOUNDER AND USES THEREOF | |
| WO2015021924A1 (en) | Low molecular polypeptide for preventing and treating inflammation and use thereof | |
| WO2011068853A2 (en) | TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASE | |
| KR101019246B1 (en) | A pharmaceutical composition comprising a retro-inverso isomer peptide |