RU2783357C1 - Способ микроклонального размножения гречихи in vitro - Google Patents
Способ микроклонального размножения гречихи in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2783357C1 RU2783357C1 RU2022122451A RU2022122451A RU2783357C1 RU 2783357 C1 RU2783357 C1 RU 2783357C1 RU 2022122451 A RU2022122451 A RU 2022122451A RU 2022122451 A RU2022122451 A RU 2022122451A RU 2783357 C1 RU2783357 C1 RU 2783357C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- buckwheat
- microclones
- vitro
- micropropagation
- nutrient medium
- Prior art date
Links
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 241000219051 Fagopyrum Species 0.000 title claims abstract 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims abstract description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 4
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 claims abstract description 3
- 229940080805 Fagopyrum esculentum extract Drugs 0.000 claims 1
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 abstract description 36
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N Kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 3
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 3
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-Naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GCUVWBFOTMJVLI-UHFFFAOYSA-N 2-(3-methylbut-3-enyl)-7H-purin-6-amine Chemical compound CC(=C)CCC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 GCUVWBFOTMJVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000002079 Fagopyrum cymosum Species 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 229960001669 Kinetin Drugs 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 241000931365 Ampelodesmos mauritanicus Species 0.000 description 1
- 241000579895 Chlorostilbon Species 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 235000010852 Fagopyrum cymosum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008962 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229910052876 emerald Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010976 emerald Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920003245 polyoctenamer Polymers 0.000 description 1
- 230000001340 slower Effects 0.000 description 1
- 230000035943 smell Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro включает культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара. Отличительной особенностью способа является то, что в состав питательной среды дополнительно вводят диалкоголизированный экстракт Fag-opyrum esculentum в количестве 1-5 мл/л. Предлагаемое изобретение позволит уменьшить сроки получения нормально развитых микроклонов и снизить себестоимость получаемых регенерантов. 3 табл.
Description
Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, для микроклонального размножения гречихи in vitro.
Известны способы микроклонального размножения гречихи, при которых для повышения эффективности регенерации и коэффициента размножения микроклоны культивируют на средах, содержащих различные цитокинины (стимуляторы роста): 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2-изопентениладенин (2ip), мета-тополин (ТОР), кинетин (KIN) и др. (Dobránszki J. (2009). Role of cytokinins and explant type in shoot multiplication of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) in vitro. Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. 3 (1), 66-70; Klocová L., Gubišová M. (2008). Evaluation of different approaches to buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) micropropagation. Czech Journal of Plant Breeding 44, 66-72; Romchatngoen S., Kachonpadungkitti Y., Hisajima S. (1998). Micropropagation of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) plant in vitro. Journal of the Society of High Technology in Agriculture 10, 231-236; Neškovic V., Vinterhalter В., Miljuš-Djuki J., Ghalawenji N. (1990). Micropropagation of recessive determinate genotypes of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) as an alternate approach to uniform seed production. Plant Breeding. 105, 337-340).
Недостатками этих способов являются невысокие темпы роста и развития эксплантов и коэффициента размножения, низкое качество получаемых микроклонов (появление розеток, отсутствие корней), дороговизна применяемых стимуляторов роста.
Известны способы микроклонального размножения гречихи, при которых для повышения эффективности регенерации и усиления ризогенеза в питательные среды для микроклонального размножения вносят ауксины (стимуляторы роста): β-индолилмасляную кислоту (ИМК), α-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) (Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э. и др. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи. Физиология растений (1989), 36 (1), 187-194; Румянцева Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты. Дис. … канд. биол. наук. Казань, 1990. 217 с.; Takahata Y. Plant regeneration from cultured immature inflorescence of Common Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) and Perennial Buckwheat (F. cymosum Meisn.). Japan J. Breed. (1988), 38 (4), 409-413).
Недостатками этих способов являются дороговизна применяемых препаратов для стимуляции роста, а также низкие темпы роста и развития регенерантов и невысокий коэффициент размножения, что ведет к удлинению технологического процесса получения полноценных микроклонов.
Известен способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов (патент RU 2229219, МПК А01Н 4/00, C12N 5/00, А01Н 1/04, 2002 г.), при котором культивируют каллусную ткань, проводят индукцию органогенеза и получают растения-регенеранты.
Однако данный способ не экономичен, поскольку получение каллусной ткани требует дополнительных затрат средств, реактивов и времени.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ микроклонального размножения гречихи, при котором используется питательная среда с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (далее - МС) (Murashige, Т., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tussue cultures. Physiol. Plant. (1962), 15, 473-497. DOI 10.1098/rstb.2000.0713), дополненная рекомендуемым соотношением компонентов согласно исследованиям Н.И. Румянцевой и др. (Румянцева Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты. Дис. … канд. биол. наук. Казань, 1990. 217 с.; Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э. и др. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи. Физиология растений (1989), 36 (1), 187-194) и использованная в работе Е.Н. Барсуковой (Барсукова Е.Н. Использование метода культуры ткани в селекции гречихи. Дисс. … канд. с.-х. наук, Благовещенск, 2000. 160 с.).
Компоненты, которые входят в состав питательной среды в данном способе микроклонального размножения, представлены в табл. 1.
Однако представленный способ имеет некоторые недостатки. Растения, культивируемые таким способом, могут отставать в росте, корнеобразование замедляется, что в совокупности снижает коэффициент размножения и возможность оптимальной приживаемости микроклонов, а также увеличивает длительность технологического процесса.
Введение в среду регуляторов роста в виде кинетинов или ауксинов увеличивает эффективность регенерации, но при этом повышается стоимость питательной среды, что приводит к возрастанию себестоимости получаемых растений-регенерантов. К тому же, для приготовления среды используют гидролизат казеина, что также ведет к дополнительным затратам.
Целью изобретения является уменьшение сроков получения нормально развитых микроклонов и снижение себестоимости получаемых регенерантов.
Указанная цель достигается тем, что в предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro, включающий культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара, согласно изобретения в состав питательной среды дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт Fagopyrum esculentum в количестве 1-5 мл/л.
По сравнению с прототипом, признаками изобретательского уровня предлагаемого способа микроклонального размножения гречихи in vitro является:
1. «… в состав среды дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт Fagopyrum esculentum…», что позволяет:
- сократить срок получения нормально развитых регенерантов, увеличить морфологические показатели культивируемых in vitro растений и повысить коэффициент их размножения;
- усилить ризогенез, что значительно повысит способность микроклонов лучше приживаться и быстрее адаптироваться к новым питательным субстратам;
- не добавлять в питательную среду гидролизат казеина, что снижает себестоимость получаемых микроклонов;
- использовать дешевое, доступное растительное сырье F. esculentum, произрастающего повсеместно и дающего большую вегетативную массу, что уменьшает стоимость питательной среды и, соответственно, себестоимость получаемых микроклонов.
2. «… в количестве 1-5 мл/л среды», что позволяет:
- рационально и экономно использовать экстракт F. esculentum и избежать перерасхода препарата.
Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решений, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.
Техническим результатом изобретения является использование в качестве стимулятора роста микроклонов деалкоголизированного экстракта F. esculentum в количестве 1-5 мл/л среды, полученного из дешевого, доступного сырья при одновременном снижении расхода препарата.
Предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro иллюстрируется приведенным ниже примером ее осуществления. Жидкий концентрированный экстракт гречихи посевной получают следующим образом. Листья растений высушивают воздушно-теневым методом до уровня влажности 12%, измельчают на мельнице марки ЛЗМ для размола сухих проб до фракции 1 мм, экстракция производится С2Н5ОН 70% (EtOH 70%) с использованием емкости с кипящей водой (t около 100°С), проводят вакуум-фильтрацию и переносят полученные извлечения в мерные колбы (100 мл). В результате получают экстракт темно-зеленого цвета с коричневатым оттенком и травяным ароматом. Готовый препарат хранят в герметически закрывающейся емкости из темного стекла в холодильнике. Перед обработкой необходимое количество экстракта деалкоголизируют выпариванием до исчезновения запаха спирта и доводят дистиллированной водой до начального объема.
Пример. В качестве объектов исследований использовали регенераты гречихи посевной двух сортов - Изумруд (индетерминантного типа) селекции ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, и Дикуль (детер-минантного типа) селекции ВНИИ зернобобовых культур, введенных в культуру in vitro. Асептические одноузловые черенки длиной 15-20 мм с пазушной почкой пассировали на питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скуга, содержащую 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара и деалкоголизированные экстракты F. esculentum из расчета 1 мл, 5 мл и 10 мл по вариантам опыта (табл. 2). Контрольный вариант - прототип - способ культивирования микроклонов на питательной среде без добавления экстракта. Повторность опыта - трехкратная. Изолированные in vitro объекты культивировались в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещенности 4 тыс. лк, температуре 22-25°С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Продолжительность пассажа составила 21 сутки.
Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводились по общепринятым методикам. Результаты приведены в табл. 3.
Согласно проведенным исследованиям, при использовании экстракта достигается значительный положительный эффект, заключающийся в уменьшении срока получения нормально развитых регенерантов (до 21 суток) и увеличении морфологических показателей, культивируемых in vitro растений, в том числе количества междоузлий и соответственно, коэффициента размножения микрорастений. Так, по сравнению с прототипом (контролем), высота регенерантов по вариантам возросла в 1,2-6,0 раза, количество междоузлий и листьев - в 1,2-1,8 раза, длина листовой пластинки - в 1,2-2,3 раза. Коэффициент размножения превзошел контрольные показатели в два и более раза.
В вариантах с использованием экстракта ризогенез многократно усилился, что значительно повышает способность микроклонов лучше приживаться и быстрее адаптироваться к новым питательным субстратам. Следует отметить, что увеличение концентрации экстракта в питательной среде до 10 мл/л не ведет к усилению эффективности экстракта.
Таким образом, способ микроклонального размножения гречихи in vitro, предусматривающего культивирование микроклонов на питательной среде с добавлением деалкоголизированного водного раствора EtOH 70% экстракта F. esculentum в диапазоне концентраций 1-5 мл/л среды, позволяет значительно стимулировать рост пробирочных растений гречихи, быстрее размножать посадочный материал и увеличивать коэффициент их размножения, а также способствует значительному улучшению корневой системы микрорастений, что, соответственно, увеличивает степень приживаемости микроклонов на новых питательных субстратах, в результате чего существенно увеличивается эффективность микроклонального размножения. При этом использование дешевого, доступного сырья для приготовления экстракта снижает себестоимость получаемых микроклонов.
Claims (1)
- Способ микроклонального размножения гречихи in vitro, включающий культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара, отличающийся тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят диалкоголизированный экстракт Fagopyrum esculentum в количестве 1-5 мл/л.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2783357C1 true RU2783357C1 (ru) | 2022-11-11 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2143825C1 (ru) * | 1997-10-21 | 2000-01-10 | Хотимченко Юрий Степанович | Сироп |
| RU2229219C2 (ru) * | 2002-04-04 | 2004-05-27 | Государственное научное учреждение Приморский научно-исследовательский институт сельского хозяйства | Способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2143825C1 (ru) * | 1997-10-21 | 2000-01-10 | Хотимченко Юрий Степанович | Сироп |
| RU2229219C2 (ru) * | 2002-04-04 | 2004-05-27 | Государственное научное учреждение Приморский научно-исследовательский институт сельского хозяйства | Способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| /rstb.2000.0713. * |
| РУМЯНЦЕВА Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты, автореферат диссертации, Казань, 1990, весь документ. БАРСУКОВА Е.Н., Использование метода культуры ткани в селекции гречихи, автореферат диссертации, Благовещенск, 2000, весь документ. MURASHIGE, Т., et al., A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tussue cultures. Physiol. Plant. (1962), 15, 473-497. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tokuhara et al. | Highly-efficient somatic embryogenesis from cell suspension cultures of Phalaenopsis orchids by adjusting carbohydrate sources | |
| Choffe et al. | In vitro regeneration of Echinacea purpurea L.: direct somatic embryogenesis and indirect shoot organogenesis in petiole culture | |
| Nasircilar et al. | In vitro propagation of endemic and endangered Muscari mirum from different explant types | |
| Moura et al. | Histological study of somatic embryogenesis induction on zygotic embryos of macaw palm (Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex Martius) | |
| Batukayev et al. | In vitro reproduction and ex vitro adaptation of complex resistant grape varieties | |
| Vinoth et al. | Optimization of somatic embryogenesis protocol in Lycopersicon esculentum L. using plant growth regulators and seaweed extracts | |
| Mauri et al. | Effect of abscisic acid and stratification on somatic embryo maturation and germination of holm oak (Quercus ilex L.) | |
| Bartos et al. | Histology of somatic embryogenesis in Coffea arabica L. | |
| RU2783357C1 (ru) | Способ микроклонального размножения гречихи in vitro | |
| RU2619052C1 (ru) | Способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro | |
| RU2619177C1 (ru) | Способ повышения эффективности культивирования in vitro Березы повислой, Лимонника китайского, Рододендрона и Сирени | |
| Mishutkina et al. | Sugar beet (Beta vulgaris L.) morphogenesis in vitro: effects of phytohormone type and concentration in the culture medium, type of explants, and plant genotype on shoot regeneration frequency | |
| Poeaim et al. | Optimization for callus induction and plant regeneration from mature seeds of Thai rice variety: Nam Roo (Oryza sativa L.) | |
| RU2789883C1 (ru) | Питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной | |
| Mitrofanova et al. | Some special features of the conservation of valuable, essential oil rose cultivars: in vitro deposition and cryopreservation | |
| Mitrofanova et al. | Realization of Ficus carica L. morphogenic capacity via organogenesis and somatic embryogenesis in vitro | |
| Gill et al. | Tissue culture studies in mothbean—Factors influencing plant regneration from seedling explants of different cultivars | |
| Subotić et al. | Histological analysis of somatic embryogenesis and adventitious shoot formation from root explants of Centaurium erythreae Gillib | |
| RU2264706C2 (ru) | Способ оптимизации клонального микроразмножения винограда in vitro | |
| Puad et al. | Effects of Carbon Sources, Plant Growth Regulators and Inoculum Size on Citrus suhuiensis Cell Suspension Culture Growth | |
| Ibrahim et al. | Influence of biotic elicitor Aspergillus niger on salicylic acid products in callus cultures of Calendula officinalis L. plant | |
| Silva et al. | In vitro culture of zygotic embryos and seeds of Caesalpinia ferrea Martius | |
| RU2788851C1 (ru) | Способ микроклонального размножения картофеля в культуре in vitro | |
| Abou Dahab et al. | Effect of some sterilization treatments and growth regulators on Ruscus hypoglossum L | |
| Borovaya et al. | Using plant extracts for the micropropagation of buckwheat. |