RU2783284C1 - Способ определения остаточных количеств авиламицина в биологических тканях животного происхождения - Google Patents
Способ определения остаточных количеств авиламицина в биологических тканях животного происхождения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2783284C1 RU2783284C1 RU2021135078A RU2021135078A RU2783284C1 RU 2783284 C1 RU2783284 C1 RU 2783284C1 RU 2021135078 A RU2021135078 A RU 2021135078A RU 2021135078 A RU2021135078 A RU 2021135078A RU 2783284 C1 RU2783284 C1 RU 2783284C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ethyl acetate
- avilamycin
- acetone
- acid
- extraction
- Prior art date
Links
- XIRGHRXBGGPPKY-OTPQUNEMSA-N [(2R,3S,4R,6S)-6-[(2'R,3'S,3aR,4R,4'R,6S,7aR)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-2-[(2R,3S,4S,5S,6S)-6-[(2R,3aS,3'aR,6'R,7R,7'S,7aR,7'aR)-7'-acetyl-7'-hydroxy-6'-methyl-7-(2-methylpropanoyloxy)spiro[4,6,7,7a-tetrahydro-3aH-[1,3]dioxolo[4,5-c]pyran-2,4'-6,7a-dihydro-3aH- Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)C[C@@H](O[C@@H]1C)O[C@H]1[C@H](O)CC2(O[C@]3(C)C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]3O2)O[C@H]2[C@@H](OC)[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]2O)O[C@H]2[C@H](O)[C@H](OC)[C@H](OC3[C@@H]([C@@H]4O[C@]5(O[C@H]4CO3)[C@@H]3OCO[C@H]3[C@@](O)([C@@H](C)O5)C(C)=O)OC(=O)C(C)C)O[C@@H]2COC)O[C@@H]1C)C(=O)C1=C(C)C(Cl)=C(O)C(Cl)=C1OC XIRGHRXBGGPPKY-OTPQUNEMSA-N 0.000 title claims abstract description 34
- 239000004190 Avilamycin Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 229960005185 avilamycin Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 235000019379 avilamycin Nutrition 0.000 title claims abstract description 28
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 114
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000008079 hexane Substances 0.000 claims abstract description 16
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 13
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 6
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 abstract description 10
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 abstract 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- XIRGHRXBGGPPKY-FCNCREMHSA-N avilamycin A Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)C[C@@H](O[C@@H]1C)O[C@H]1[C@H](O)CC2(O[C@]3(C)C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]3O2)O[C@H]2[C@@H](OC)[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]2O)O[C@H]2[C@H](O)[C@H](OC)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H]4O[C@]5(O[C@H]4CO3)[C@@H]3OCO[C@H]3[C@@](O)([C@@H](C)O5)C(C)=O)OC(=O)C(C)C)O[C@@H]2COC)O[C@@H]1C)C(=O)C1=C(C)C(Cl)=C(O)C(Cl)=C1OC XIRGHRXBGGPPKY-FCNCREMHSA-N 0.000 description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920002397 Thermoplastic olefin Polymers 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 231100000703 Maximum Residue Limit Toxicity 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа определения остаточного содержания авиламицина в биологических тканях животного происхождения. Способ включает извлечение дихлороизоэверниновой кислоты из тканей ацетоном, концентрирование полученного экстракта досуха с последующим гидролизом остатка едким натром, очистку гидролизата этилацетатом и его закисление ортофосфорной кислотой, последующую дополнительную очистку полученного раствора и перевод определяемого соединения в слой этилацетата для дальнейшего концентрирования и перерастворения перед анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). При этом при экстракции соблюдается соотношение ацетон : навеска образца, равное 5 см3 ацетона на 2 г навески образца, очистку гидролизата перед закислением проводят однократно с использованием 3-5 см3 этилацетата, а подкисленный гидролизат дополнительно очищают 3-4 см3 гексана с дальнейшим удалением органического слоя и добавлением этилацетата, перемешиванием на шейкере и центрифугированием. Затем слой этилацетата упаривают в токе азота досуха, перерастворяют в 1 см3 0,5% муравьиной кислоты и проводят анализ методом ВЭЖХ-МС/МС. Способ позволяет на 30% увеличить аналитический отклик сигнала детектора по метаболиту авиламицина, что позволяет уверенно работать со сложными видами образцов в результате снижения влияния шумов базовой линии; существенно уменьшить расход ацетона при экстракции; упростить процедуру жидкостно-жидкостной экстракции этилацетатом; избежать процедуры твердофазной очистки (ТФО). 4 табл., 6 ил.
Description
Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для контроля содержания остаточных количеств авиламицина в продукции животноводства. Сущность способа заключается в извлечении аналита из объекта исследования ацетоном с последующим концентрированием экстракта и применением щелочного гидролиза едким натром, при нагревании. Очистку полученного деривата осуществляют экстракцией этилацетатом с удалением органической составляющей, нейтрализацией остатка ортофосфорной кислотой, с последующим обезжириванием гексаном и удалением органического слоя. Финальную экстракцию проводят этилацетатом с последующим концентрированием досуха и перерастворением в необходимом количестве деионизованной воды, подкисленной муравьиной кислотой. Использование данного способа позволяет с высокой точностью определить содержание остаточного количества авиламицина в мышечной ткани животного происхождения.
Авиламицин является антибиотиком семейства ортомицинов, представители которого, ингибируют рост грамположительных бактерий. Авиламицин по своей химической природе представляет смесь олигосахаридов, которые продуцируются Streptomyces viridochromogenes. На сегодняшний момент известно, что авиламицин имеет один главный изомер (авиламицин А его доля ≥60%) и еще 15 второстепенных (авиламицин А', В, С, D1, D2, Е, F, G, Н, I, J, К, L, М и N) [1].
Молекула авиламицина содержит в себе часть полкетид-дихлор-изо-иверниновой кислоты, связанную с полисахаридной цепочкой.
Несмотря на то, что авиламицин является относительно безопасным лекарственным соединением многие страны устанавливают максимально допустимые уровни (МДУ) на содержание маркерного соединения, по которому оценивается остаточное содержание авиламицина. В Европейском Союзе [2] и Российской Федерации [3] МДУ на маркер авиламицина - дихлоризоэверниновую кислоту составляет 50 мкг/кг для мяса свиней, кроликов и домашней птицы. В Российской Федерации зарегистрирован лекарственный препарат для ветеринарного применения Максус G100 (Maxus G100), содержащий в качестве действующего вещества авиламицин (организация-разработчик: Elanco Animal Health Incorporated, USA; номер регистрационного удостоверения: 840-3-6,16-3548 №ПВИ-3-1.5/01690).
Обращение на рынке препаратов содержащих авиламицин предопределяет необходимость разработки аналитической методики для целей контроля его остаточного содержания.
Описаны способы определения авиламицина А и авиламицина В как целевых аналитов. Так, были опубликованы статьи в которых авиламицин А определяли с помощью жидкостной хроматографии [4, 5]. Однако применяемый метод не является достаточно селективным и имеет высокий предел количественного определения. Предел количественного определения, в данном случае, составляет мг/кг (выше установленных МДУ) [5].
Примечательной была статья в которой в одном методе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детекцией определяли авиламицин А и авиламицин В [6]. Следует заметить, что по виду, представленных авторами статьи хроматограмм, содержание авиламицина В заметно меньше его основного изомера (что согласуется с литературными данными), но кроме этого хроматографический пик авиламицина В имеет очень низкий аналитический отклик интенсивности, что в перспективе, закрывает возможность применения указанного метода для целей количественного анализа в области низких концентраций. Кроме того, метод ВЭЖХ, является недостаточно селективным: в случае обнаружения остаточных количеств авиламицина в образце, необходимо проводить подтверждение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС), основываясь на данных по наличию фрагментов молекулярного иона аналита.
Начиная с 2010 года возрастает число публикаций определения авиламицина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Наши соотечественники, в рамках разаработанного ими многокомпонентного подхода к определению остаточного количества соединений, различных по химической природе (492 соединения), опубликовали статью, содержащую в том числе и количественное определение авиламицина [7]. В которой главным недостактом, являлась недоступность определения суммарного количества всех изомеров авиламицина, т.е количественная оценка акцентировалась только на авиламицине А.
Из-за высокой скорости метаболизма авиламицина, акценты были смещены в сторону определения его метаболитов. Это открывало возможности решения проблемы суммарного определения всех изомеров авиламицина т.к. определился главный метаболит авиламицина -дихлоризоэверниновая кислота [8].
По содержанию дихлороизоэверниновой кислоты в объекте исследования можно рассчитать содержание авиламицина. Расчет массовой доли, если требуется, проводится через коэффициент эквивалентности (фактор эквивалентности), который является отношением молярной массы авиламицина к молярной массе дихлороизоэверниновой кислоты (Мав/Мд) и равен 5, 6.
Наиболее близким по назначению, является способ определения авиламицина как дихлороизоэверниновой кислоты в свинине, жире и печени [1] - прототип. Экстракцию дихлороизоэверниновой кислоты производят из 10 г навески тканей 50 см3 ацетона в процессе гомогенизации, с дальнейшим центрифугированием и повторением экстракции новой порцией ацетона (25 см3), с дальнейшим объединением экстрактов в один, и его разбавлением до 100 см3 ацетоном, в колбе. Аликвоту - 10 см3, полученного экстракта, концентрируют досуха в стеклянном флаконе, к остатку приливают 4 см3 1М гидрооксида натрия, перемешивают и помещают для дериватизации в сушильный шкаф на 2 часа при 70°С. Полученный гидролизат переносят в новый флакон, ополаскивают 10 см3 деионизованной воды и 10 см3 этилацетата, последовательно, старый флакон, и объединяют растворы с гидролизатом. Перемешивают флакон с объединенным раствором и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут. Слой этилацетата отбрасывают и вводят в остаток гидролизата 2 см3 ортофосфорной кислоты и 15 см3 этилацетата. Перемешивают флакон и разделяют фракции центрифугированием, при 3000 об/мин в течение 5 минут. Органический слой отбирают в новый флакон и повторяют экстракцию новой порцией этилацетата. Объединенный объем (30 см3) этилацетата концентрируют досуха в токе азота и перерастворяют на ультразвуковой бане в 2 см3 смеси этилацетат/гексан/муравьиная кислота (в соотношении 100/900/1). полученный раствор подвергают твердофазной очистке на колонке с силикагелем, который предварительно промывают 10 см3 смеси этилацетат/гексан/муравьиная кислота (в соотношении 100/900/1). После нанесения гидролизата на колонку, ее промывают 8 см3 смеси этилацетат/гексан/муравьиная кислота (в соотношении 100/900/1). Целевые компоненты смывают с колонки 15 см3 раствора этилацетат/гексан/муравьиная кислота (в соотношении 300/700/1). Раствор экстракта собирают в новый флакон и концентрируют в токе азота досуха, с последующим перерастворением в 1 см3 метанола и анализом методом ВЭЖХ-МС/МС.
1. Недостаток способа-прототипа состоит в том, что в процессе подготовки объекта испытания применяется избыточное количество ацетона, относящегося к прекурсорам, оборот которых в РФ ограничен и в отношении которых допускается исключение некоторых мер контроля.
2. Недостатком способа-прототипа, является применение времязатратного протокола жидкостно-жидкостной экстракции на стадиях, предшествующих твердофазной очистке (далее ТФО) на силикагеле.
3. Недостатком способа-прототипа, является применение стадии ТФО, являющейся времязатратной и требующей наличия специфического сорбента «Inertsep SI» производства GL Sciences (Tokyo, Japan).
Настоящее изобретение направлено на устранение недостатков прототипа, а именно на снижение количества применяемого ацетона при экстракции, на упрощение протокола стадии жидкостно-жидкостной экстракции, на устранение стадии ТФО при сохранении качества получаемых в ходе исследований данных (не более 3-4%).
Патентуемый способ определения остаточных количеств авиламицина в биологических тканях животного происхождения и кормах включает: извлечение анализируемого соединения из образца ацетоном; концентрирование полученного экстракта досуха; гидролиз остатка гидрооксидом натрия с последующей очисткой этилацетататом; восстановление рН ортофосфорной кислотой и обезжиривание гексаном; перевод определяемого соединения в слой этилацетата и его финальное концентрирование досуха, с последующим перерастворением в деионизованной воде с муравьиной кислотой и анализ методом ВЭЖХ-мс/мс.
Способ отличается от прототипа следующими признаками. В качестве экстрагента применяют ацетон, в его соотношении с навеской образца 5:2. Жидкостно-жидкостную экстракцию дериватов проводят однократно, с помощью введения 3-5 см3 этилацетата после стадии гидролиза. Взамен ТФО проводят жидкостно-жидкостную экстракцию мешающих примесей, с помощью 3-4 см3 гексана и его последующим удалением, и конечным концентрированием очищенного деривата в 1 см3 0,5% муравьиной кислоты.
Технический результат изобретения - снижение количества применяемого ацетона и повышение относительной интенсивности сигнала средства измерения за счет упрощения этапа жидкостно-жидкостной экстракции перед стадией ТФО, и замены стадии ТФО на жидкостно-жидкостную экстракцию гексаном.
Патентуемый способ позволяет значительно, на 30%, увеличить аналитический отклик сигнала детектора по метаболиту авиламицина, что позволяет уверенно работать со сложными видами образцов в результате снижения влияния шумов базовой линии; существенно уменьшить расход прекурсора - ацетона; упростить процедуру жидкостно-жидкостной экстракции этилацетатом; избежать процедуры ТФО.
Рекомендуемые режимы выполнения Способа подобраны в результате экспериментов, проведенных заявителем: исследована зависимость изменения полноты извлечения определяемого соединения от количества экстрагента, зависимости относительной интенсивности сигнала на детекторе масс-спектрометра от изменений в выполнении стадии жидкостно-жидкостной экстракции и применения гексана, взамен ТФО.
Перед проведением экспериментов, в гомогенаты мышечной ткани вводили эквивалентное количество дихлороизоэверниновой кислоты. Процедура подготовки образцов к анализу соответствовала прототипу с вариацией количества экстрагента. За эталон принимали образец, прошедший процедуру пробоподготовки согласно прототипу с введением в него определяемого компонента непосредственно перед анализом.
Было установлено, что в результате применения соотношения 5:2 (ацетон, см3/ навеска, г) на стадии экстракции, извлечение определяемого компонента происходит в полной мере, на уровне 97,8% от введенного значения, при сравнении с эталонным значением. Зависимость степени извлечения от соотношения навески и экстрагента отображена графически на фиг. 1 и в табл.1.
Согласно полученным данным можно заключить, что оптимально минимальным объемом ацетона, необходимом для извлечения дихлороизоэверниновой кислоты с минимальными потерями из 2 г навески мышечной ткани, является - 5 см3. Что соответствует опыту №3 (Табл. 1).
Было установлено, что при использовании измененного протокола применения этилацетата на стадиях, предшествующих ТФО, потери дихлороизоэверниновой кислоты несущественны, и составляют менее 3%. Зависимость потерь определяемого компонента от изменения протокола применения этилацетата отображена графически в табл. 2 и на фиг. 2 а, 2 б.
При проведении экспериментов, варьировали, относительно прототипа, объемы введения в гидролизат деионизованной воды и этилацетата, перед закислением рН среды ортофосфорной кислотой, и после этого. Перед проведением экспериментов, в гомогенаты мышечной ткани вводили эквивалентное количество дихлороизоэверниновой кислоты. Схема эксперимента была следующей:
Гидролизаты, полученные от навесок гомогената мышечной ткани и содержащие эквивалентное количество дихлороизоэверниновой кислоты, переносили в новые флаконы, ополаскивали старые флаконы варьируемым объемом деионизованной воды и варьируемым объемом этилацетата, объединяя эти объемы с гидролизатами в новых флаконах. Перемешивали флаконы с объединенными растворами и центрифугировали. Слои этилацетата отбрасывали, вводили в остаток гидролизатов ортофосфорную кислоту и варьируемый объем этилацетата. Перемешивали флаконы и разделяли фракции центрифугированием. Органический слой отбирали в новые флаконы и повторяли экстракцию новой порцией этилацетата. Объединенные объемы этилацетата концентрировали досуха в токе азота для дальнейшей стадии ТФО.
Согласно полученным данным, можно заключить, что наиболее экономичным протоколом применения этилацетата, необходимым для определения дихлороизоэверниновой кислоты с минимальными потерями, в навеске мышечной ткани, является его однократное применение до стадии закисления раствора, в количестве 3-5 см3. Что соответствует опытам №5-7 (Табл. 2).
Было установлено, что при замене процедуры ТФО на жидкостно-жидкостную экстракцию гексаном, достигается необходимая степень чистоты экстракта, с потерями дихлороизоэверниновой кислоты не более 2%, относительно прототипа. Это так же подтверждается отношением сигнала к шуму, равному 46.1 на уровне предела количественного определения (10 мкг/кг), что позволяет проводить количественный анализ данного соединения. Зависимость полноты определения дихлороизоэверниновой кислоты от изменения протокола применения ТФО отображена графически на фиг. 3 и в табл.3. Отношение сигнала к шуму отражено графически на фиг. 4.
Перед проведением экспериментов, в гомогенаты мышечной ткани вводили эквивалентное количество дихлороизоэверниновой кислоты. При проведении эксперимента, в качестве альтернативного протокола очистки, применялся следующий подход:
В гидролизаты, доведенные до необходимого рН раствором ортофосфорной кислоты, вводили варьируемый объем гексана, перемешивали на шейкере и центрифугировали. Гексан отбрасывали и экстрагировали дихлороизоэверниновую кислоту, добавляя к растворам 3 см3 этилацетата, перемешивая на шейкере и центрифугируя. Слой этилацетата переносили в новую полипропиленовую пробирку и упаривали в токе азота досуха, с последующим перерастворением в 1 см3 0,5% муравьиной кислоты и проводили анализ методом ВЭЖХ-МС/МС.
Согласно полученным данным, можно заключить, что наиболее экономичным протоколом дополнительной очистки, является замена протокола Прототипа на применение гексана в объеме 3-4 см3, что соответствует опытам №3-4 (Табл. 3).
Было установлено, что при использовании новых протоколов экстракции ацетоном, отмывки гидролизата этилацетатом, а так же при замене стадии ТФО на очистку гексаном, с последующим концентрированием в токе азота, значительно повышается аналитический отклик при определении метаболита авиламицина - дихлороизоэверниновой кислоты в мышечных тканях животного происхождения. Сравнение относительной интенсивности сигнала и площади сигнала прототипа с окончательным протоколом способа, при эквивалентной добавке дихлороизоэверниновой кислоты перед процедурой экстракции отражено на фиг. 5. и в табл.4. Градуировочная характеристика с указанным коэффициентом корреляции, построенная по 5 уровням добавок дихлороизоэверниновой кислоты, прошедших процедуру экстракции и очистки в соответствии с патентуемым способом, представлена на фиг. 6.
Литературные источники:
[1] Shizuka Saito-Shida, Tomoko Hayashi, Satoru Nemoto, Hiroshi Akiyama, "S Determination of total avilamycin residues as dichloroisoeverninic acid in porcine muscle, fat, and liver by LC-MS/MS" Food Chemistry, vol. 249, pp.84-90, 2018.
[2] РЕГЛАМЕНТ КОМИССИИ (EU) №37/2010 от 22 декабря 2009 г. по фармакологически активным веществам и их классификации относительно максимальных пределов остатков в пищевых продуктах животного происхождения.
[3] TP ТС 034/2013 Технический регламент Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции».
[4] Neely, F.L., & Emerson, С.S." Rapid determination of avilamycin in fermentation broths. Journal of Liquid Chromatography" Journal of Liquid Chromatography, vol. 14, pp.2699-2705, 1991.
[5] Scott, C.A., Yordy, D.W., & Coleman, M.R., «Determination of avilamycin inpoultry feeds by liquid chromatography» Journal of AOAC International, т.82, pp.579-585, 1999.
[6] Sunderland, J., Lovering, A.M., Tobin, С.M., MacGowan, A.P., Roe, J.M., & Delsol, A.A., «Determination of avilamycin A and В in pig faeces by solid phase extraction and reverse-phase HPLC assay. International Journal of Antimicrobial Agents, 24» International Journal of Antimicrobial Agents, т.24, pp. 511-514, 2004.
[7] Amelin, V., Korotkov, A., & Andoralov, A., "Identification and determination of 492 contaminants of different classes in food and feed by high-resolution mass spectrometry using the standard addition method.," Journal of AOAC International, vol. 99, pp.1600-1618, 2016.
[8] Clare Ho & Yiu-Tung Wong, «Determination of avilamycin as dichloroisoeverninic acid in poultry and porcine muscles by isotope dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry.,» Anal Bioanal Chem, т.405, pp. 8633-8643, 2013.
Claims (1)
- Способ определения остаточных количеств авиламицина в биологических тканях животного происхождения, включающий извлечение дихлороизоэверниновой кислоты из тканей ацетоном, концентрирование полученного экстракта досуха с последующим гидролизом остатка едким натром, очистку гидролизата этилацетатом и его закисление ортофосфорной кислотой, последующую дополнительную очистку полученного раствора и перевод определяемого соединения в слой этилацетата для дальнейшего концентрирования и перерастворения перед анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС), отличающийся тем, что при экстракции соблюдается соотношение ацетон : навеска образца, равное 5 см3 ацетона на 2 г навески образца, очистку гидролизата перед закислением проводят однократно с использованием 3-5 см3 этилацетата, а подкисленный гидролизат дополнительно очищают 3-4 см3 гексана с дальнейшим удалением органического слоя и добавлением этилацетата, перемешиванием на шейкере и центрифугированием, затем слой этилацетата упаривают в токе азота досуха, перерастворяют в 1 см3 0,5% муравьиной кислоты и проводят анализ методом ВЭЖХ-МС/МС.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2783284C1 true RU2783284C1 (ru) | 2022-11-11 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2269137C1 (ru) * | 2004-05-05 | 2006-01-27 | Владимир Камбулатович Шорманов | Способ определения оксибензола и его монометильных производных в биологическом материале |
| RU2453848C1 (ru) * | 2011-04-05 | 2012-06-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Способ определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в биологическом материале |
| CN109932459A (zh) * | 2019-04-22 | 2019-06-25 | 华中农业大学 | 一种定量检测鸡消化道内阿维拉霉素的方法 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2269137C1 (ru) * | 2004-05-05 | 2006-01-27 | Владимир Камбулатович Шорманов | Способ определения оксибензола и его монометильных производных в биологическом материале |
| RU2453848C1 (ru) * | 2011-04-05 | 2012-06-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Способ определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в биологическом материале |
| CN109932459A (zh) * | 2019-04-22 | 2019-06-25 | 华中农业大学 | 一种定量检测鸡消化道内阿维拉霉素的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHIZUKA SAITO-SHIDA ET AL. Determination of total avilamycin residues as dichloroisoeverninic acid in porcine muscle, fat, and liver by LC-MS/MS. Food Chemistry, 2018, vol.249, pp.84-90. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Capriotti et al. | Analytical strategies based on chromatography–mass spectrometry for the determination of estrogen-mimicking compounds in food | |
| Arroyo-Manzanares et al. | High-resolution mass spectrometry for the determination of mycotoxins in biological samples. A review | |
| Bekaert et al. | A validated ultra-high performance liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry analysis for the simultaneous quantification of the three known boar taint compounds | |
| Nardelli et al. | Multi-residue method for the determination of organochlorine pesticides in fish feed based on a cleanup approach followed by gas chromatography–triple quadrupole tandem mass spectrometry | |
| Herrero et al. | Feasibility of ultra-high performance liquid and gas chromatography coupled to mass spectrometry for accurate determination of primary and secondary phthalate metabolites in urine samples | |
| Kulikovskii et al. | Determination of nitrofuran metabolites in muscular tissue by high-performance liquid chromatography with mass spectrometric detection | |
| WO2022121942A1 (zh) | 一种蛋黄中斑蝥黄的提取及净化方法、测定鸡蛋黄中斑蝥黄的固相萃取-高效液相色谱法 | |
| Junza et al. | Identification of metabolites and thermal transformation products of quinolones in raw cow’s milk by liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry | |
| CN111239267B (zh) | 一种基于gc-ms检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法 | |
| Xu et al. | Mass spectrometry-based fecal metabolome analysis | |
| Mendonça et al. | Sensitive and selective quantification of free and total malondialdehyde in plasma using UHPLC-HRMS [S] | |
| Yang et al. | Determination of trichothecenes A (T-2 toxin, HT-2 toxin, and diacetoxyscirpenol) in the tissues of broilers using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry | |
| Verheyden et al. | Development and validation of a method for simultaneous analysis of the boar taint compounds indole, skatole and androstenone in pig fat using liquid chromatography–multiple mass spectrometry | |
| Pastor-Belda et al. | Dual stir bar sorptive extraction coupled to thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry for the determination of endocrine disruptors in human tissues | |
| Duarte et al. | Novel IAC-LC–ESI-MS2 analytical set-up for ochratoxin A determination in pork | |
| Zheng et al. | Development and validation of a solid‐phase extraction method coupled with LC–MS/MS for the simultaneous determination of 16 antibiotic residues in duck meat | |
| Wauters et al. | Development of a quantitative method for the simultaneous analysis of the boar taint compounds androstenone, skatole and indole in porcine serum and plasma by means of ultra-high performance liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry | |
| Wang et al. | Determination of virginiamycin M1 residue in tissues of swine and chicken by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry | |
| Wang et al. | Determination of intramuscular phospholipid classes and molecular species in Gaoyou duck | |
| Feddern et al. | Ractopamine analysis in pig kidney, liver and lungs: A validation of the method scope extension using QuEChERS as a sample preparation step | |
| Verplanken et al. | Development and validation of a UHPLC-HR-Orbitrap-MS method for the simultaneous determination of androstenone, skatole and indole in porcine meat and meat products | |
| RU2783284C1 (ru) | Способ определения остаточных количеств авиламицина в биологических тканях животного происхождения | |
| Stolker et al. | Determination of acetyl gestagenic steroids in kidney fat by automated supercritical fluid extraction and liquid chromatography ion-trap mass spectrometry | |
| Stroher et al. | Comparative analysis and validation methodologies of GC and HPLC for analysis of cholesterol in meat products | |
| Hidalgo et al. | Determination of α-keto acids in pork meat and Iberian ham via tandem mass spectrometry |