RU2782890C2 - Method for assessment of safety of chemical products for human health - Google Patents
Method for assessment of safety of chemical products for human health Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782890C2 RU2782890C2 RU2017144058A RU2017144058A RU2782890C2 RU 2782890 C2 RU2782890 C2 RU 2782890C2 RU 2017144058 A RU2017144058 A RU 2017144058A RU 2017144058 A RU2017144058 A RU 2017144058A RU 2782890 C2 RU2782890 C2 RU 2782890C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteins
- chemical
- human
- list
- cells
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 98
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 62
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 230000000622 irritating Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000002510 Keratinocytes Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102000015279 Basigin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010064528 Basigin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000004927 Skin cells Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 230000000254 damaging Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 abstract description 3
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 20
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 14
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000002609 media Substances 0.000 description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000003522 irritant Effects 0.000 description 6
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 6
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 6
- 231100000400 irritating Toxicity 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 102100017472 ACSL3 Human genes 0.000 description 4
- 101700081863 ACSL3 Proteins 0.000 description 4
- 210000002615 Epidermis Anatomy 0.000 description 4
- 101710015228 FAA3 Proteins 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 229960000583 Acetic Acid Drugs 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 3
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 3
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 231100000108 skin corrosion Toxicity 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- AKFOHAJXLDHIEH-SNVBAGLBSA-N (3R)-3-(cyclobutanecarbonyloxy)-4-(trimethylazaniumyl)butanoate Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@@H](CC([O-])=O)OC(=O)C1CCC1 AKFOHAJXLDHIEH-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 2
- 231100000635 Draize test Toxicity 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 231100000078 corrosive Toxicity 0.000 description 2
- 231100001010 corrosive Toxicity 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 2
- 238000005312 nonlinear dynamic Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N Bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N Neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000472 OECD 431 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Toxicity 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100008350 PRSS1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000831 aspiration hazard Toxicity 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000058 in vitro skin irritation / corrosion testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic Effects 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005319 nano flow HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing Effects 0.000 description 1
- 231100000330 serious eye damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 108060007849 sprT Proteins 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, сфере исследований и испытаний безопасности химической продукции для здоровья человека, в частности, к лабораторной технике, и может быть использовано для выявления у тестируемой химической продукции способности вызывать повреждение (раздражение) кожных покровов.The invention relates to medicine, the field of research and testing of the safety of chemical products for human health, in particular, to laboratory equipment, and can be used to identify the ability of the tested chemical products to cause damage (irritation) of the skin.
Отдельные виды продукции обоснованно считаются потенциально опасными для здоровья человека. К ним относятся химические вещества, лекарственные препараты и косметические средства. В России и в мире законодательно закреплено, что оборот таких продуктов (ввоз в страну или производство) может быть разрешен только после предварительных лабораторных испытаний, устанавливающих степень их опасности (безопасности) для здоровья человека. Такие испытания проводятся в сертифицированных лабораториях по специально установленным методикам.Certain types of products are reasonably considered potentially hazardous to human health. These include chemicals, drugs and cosmetics. In Russia and in the world, it is legally fixed that the circulation of such products (import into the country or production) can be allowed only after preliminary laboratory tests that establish the degree of their danger (safety) to human health. Such tests are carried out in certified laboratories according to specially established methods.
В настоящее время все используемые на территории РФ химические вещества должны проходить процедуру токсикологических исследований, соответствовать ряду санитарно-гигиенических требований и требованиям безопасности. Процесс установления таких требований регулируется государственным стандартом (ГОСТ) 32419-2013 «Классификация опасности химической продукции. Общие требования». Согласно этому документу, в отношении химической продукции в обязательном порядке должна быть оценена ее потенциальная опасность для здоровья человека. При этом должны быть оценены следующие виды возможного повреждающего действия химической продукции на организм человека:Currently, all chemicals used on the territory of the Russian Federation must undergo the procedure of toxicological studies, comply with a number of sanitary and hygienic requirements and safety requirements. The process of establishing such requirements is regulated by the state standard (GOST) 32419-2013 “Hazard classification of chemical products. General requirements". According to this document, in relation to chemical products, its potential hazard to human health must be assessed without fail. In this case, the following types of possible damaging effects of chemical products on the human body should be assessed:
- острая токсичность при общем воздействии на организм;- acute toxicity with a general effect on the body;
- способность вызывать раздражение или разъедание (коррозию) кожи;- the ability to cause irritation or corrosion (corrosion) of the skin;
- способность вызывать серьезные повреждения/раздражение глаз;- potential to cause serious eye damage/irritation;
- сенсибилизирующее действие;- sensitizing effect;
- мутагенность;- mutagenicity;
- канцерогенность;- carcinogenicity;
- негативное влияние на репродуктивную функцию;- negative impact on reproductive function;
- избирательная токсичность в отношении органов-мишеней при однократном и продолжительном воздействии;- selective toxicity to target organs with single and prolonged exposure;
- опасность при аспирации.- Aspiration hazard.
Настоящее изобретение касается испытаний безопасности химической продукции в части раздражающего/коррозивного действия на кожу. При этом под коррозией кожи (разъеданием кожи) подразумевается крайнее проявление раздражающего действия.The present invention relates to testing the safety of chemical products in terms of irritant/corrosive effects on the skin. In this context, skin corrosion (skin corrosion) refers to an extreme manifestation of an irritant effect.
Известен способ оценки наличия раздражающего/коррозивного действия тестируемой химической продукции в лабораторных тестах с использованием лабораторных животных (тест Драйза) [1]. Метод заключается в поверхностном нанесении исследуемого химического вещества на кожу кроликов и последующей визуальной оценке необратимых или обратимых изменений кожи животного в баллах.There is a method for assessing the presence of irritating/corrosive effects of the tested chemical products in laboratory tests using laboratory animals (Draize test) [1]. The method consists in the surface application of the test chemical on the skin of rabbits and the subsequent visual assessment of irreversible or reversible changes in the skin of the animal in points.
Недостатками данного метода является необходимость использования значительного количества лабораторных животных, создание необходимых условий для их содержания, причинение страданий лабораторным животным, а также неточность результата, определяемая особенностями видоспецифического ответа кожи животных и человека на однотипное воздействие, а также индивидуальными особенностями реакции на воздействие различных организмов одного и того же вида.The disadvantages of this method are the need to use a significant number of laboratory animals, the creation of the necessary conditions for their maintenance, causing suffering to laboratory animals, as well as the inaccuracy of the result, determined by the characteristics of the species-specific response of the skin of animals and humans to the same type of exposure, as well as individual characteristics of the reaction to the impact of various organisms of the same and the same kind.
Важно отметить, что метод Драйза не направлен на анализ системного ответа организма на тестируемое воздействие, а учитывает лишь локальный местный ответ конкретного органа - кожи. Поэтому, с развитием клеточной биологии, стал актуальным вопрос о возможности испытаний влияния ряда продуктов на кожу человека в тестах in vitro. В результате, на смену теста Драйза пришли альтернативные методические подходы для оценки безопасности химических веществ в отношении кожных покровов, не предполагающие использование лабораторных животных.It is important to note that the Draize method is not aimed at analyzing the systemic response of the body to the test exposure, but takes into account only the local local response of a specific organ - the skin. Therefore, with the development of cell biology, the question of the possibility of testing the effect of a number of products on human skin in in vitro tests has become relevant. As a result, the Draize test has been replaced by alternative methodological approaches for assessing the safety of chemicals in relation to the skin, which do not involve the use of laboratory animals.
Известен способ оценки общей токсичности химических веществ с использованием в качестве объекта исследований кератиноцитов человека клеточной линии НаСаТ. Клетки данной линии представляют собой нераковые иммортализованные кератиноциты человека, обладающие многими морфологическими и функциональными особенностями нормальных кератиноцитов человека. В отличие от первичных культур кератиноцитов, полученных от различных доноров и отличающихся высокой вариабельностью характеристик, клетки линии НаСаТ способны неограниченно делиться, что определяет возможность получения стандартизованного объекта исследований и целесообразность их использования в качестве клеточной модели кожи in vitro [2]. Объектом исследования являются клетки контрольных клеточных культур и испытуемые клетки - после воздействия исследуемого вещества в известной концентрации.A known method for assessing the overall toxicity of chemicals using as an object of study of human keratinocytes of the NaCaT cell line. The cells of this line are non-cancerous immortalized human keratinocytes, which have many morphological and functional features of normal human keratinocytes. Unlike primary cultures of keratinocytes obtained from different donors and characterized by a high variability of characteristics, HaCaT cells are able to divide indefinitely, which determines the possibility of obtaining a standardized research object and the expediency of their use as an in vitro skin cell model [2]. The object of the study are cells of control cell cultures and test cells - after exposure to the test substance in a known concentration.
Клетки иммортализованной клеточной линии НаСаТ высаживают в 75 см2 флаконы (например, Corning, США) в 15 мл питательной среды, рекомендованной для культивирования кератиноцитов (например, ДМЕМ/F12, содержащей 10% ФБС и Glutamax (Gibco, США)). Культивирование проводят в CO2-инкубаторе (при температуре 37±1°С, влажности 90±10%, содержании 5.0±1.0% CO2). После достижения 60-70% конфлюэнтности, культуральную среду отбирают, а клетки подвергают воздействию предварительно подготовленного раствора испытуемого вещества в питательной среде в различных концентрациях. К контрольным образцам добавляют свежую питательную среду. Время воздействия веществ на клетки может быть разным, но чаще составляет 48 часов. Затем жизнеспособность клеток оценивают методом МТТ или по поглощению нейтрального красного и определяют значение IC50 (концентрация испытуемого вещества, вызывающая 50%-ное снижение жизнеспособности клеток) [2].Cells of the immortalized HaCaT cell line are planted in 75 cm 2 flasks (eg, Corning, USA) in 15 ml of a nutrient medium recommended for culturing keratinocytes (eg, DMEM/F12 containing 10% PBS and Glutamax (Gibco, USA)). Cultivation is carried out in CO 2 -incubator (at a temperature of 37±1°C, humidity 90±10%, content of 5.0±1.0% CO 2 ). After reaching 60-70% confluence, the culture medium is withdrawn and the cells are exposed to a pre-prepared solution of the test substance in the nutrient medium at various concentrations. Fresh nutrient medium is added to the control samples. The time of exposure of substances to cells can be different, but more often it is 48 hours. Cell viability is then assessed by MTT or neutral red uptake and the IC50 value (concentration of the test substance causing a 50% reduction in cell viability) is determined [2].
Недостатком данного способа является то, что он позволяет охарактеризовать общетоксическое действие химического вещества, но не его способность вызывать раздражение/повреждение кожных покровов.The disadvantage of this method is that it allows you to characterize the general toxic effect of a chemical, but not its ability to cause irritation/damage to the skin.
Ближайшим аналогом к заявленному способу оценки безопасности химической продукции является способ, описанный в методических инструкциях Организации Экономического сотрудничества и развития [3] и нормативных документах РФ [4]. Способ основан на применении в качестве объекта исследований клеточных моделей реконструированного эпителия человека. Таких как продукт EpiSkin™, EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE и epiCS® или аналогов. Они представляют собой коммерчески доступные в странах Европы и США клеточные модели кожи человека, выращенные по специальным протоколам из нормальных кератиноцитов человека на мембранных вставках для культуральных планшетов типа transwell, имеющие стандартизованное (постоянное) строение и хорошо выраженный роговой слой. Клеточные модели имеют многослойное строение: сразу над мембраной располагаются несколько слоев ядросодержащих клеток, на поверхности которых имеется не менее 5 слоев роговых чешуек. Способ основан на регистрации способности тестируемого вещества разрушать роговой слой клеточной модели, что приводит к снижению жизнеспособности нижерасположенных ядросодержащих клеток, которая, в свою очередь, оценивается количественными методами, например, методом МТТ [4].The closest analogue to the claimed method for assessing the safety of chemical products is the method described in the methodological instructions of the Organization for Economic Cooperation and Development [3] and regulatory documents of the Russian Federation [4]. The method is based on the use of cellular models of reconstructed human epithelium as an object of research. Such as EpiSkin™, EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE and epiCS® or equivalents. They are commercially available in Europe and the USA cell models of human skin, grown according to special protocols from normal human keratinocytes on membrane inserts for culture plates of the transwell type, having a standardized (constant) structure and a well-defined stratum corneum. Cellular models have a multilayer structure: immediately above the membrane there are several layers of nucleated cells, on the surface of which there are at least 5 layers of horny scales. The method is based on recording the ability of the test substance to destroy the stratum corneum of the cell model, which leads to a decrease in the viability of the underlying nucleated cells, which, in turn, is assessed by quantitative methods, for example, by the MTT method [4].
Способ осуществляется следующим образом:The method is carried out as follows:
Тестируемое вещество равномерно наносят на поверхность клеточной модели кожи человека (КМКЧ), смочив исследуемое вещество дистиллированной водой для того чтобы обеспечить его хороший контакт с роговым слоем. На две клеточные модели тестируемое вещество воздействует в течение 3 минут, на две другие клеточные модели - в течение часа. После окончании воздействия тестируемое вещество тщательно смывают с поверхности клеточных моделей нейтральным раствором, например, 0,9% раствором NaCl.The test substance is evenly applied to the surface of the human skin cell model (HCM), wetting the test substance with distilled water to ensure good contact with the stratum corneum. Two cell models are exposed to the test substance for 3 minutes, and two other cell models for an hour. After the end of exposure, the test substance is thoroughly washed off the surface of the cell models with a neutral solution, for example, 0.9% NaCl solution.
Затем методом МТТ оценивают жизнеспособность клеток в составе клеточных моделей. Исследуемое химическое вещество признается раздражающим для кожи, если:Then, using the MTT method, the viability of cells in the composition of cell models is assessed. A test chemical is considered a skin irritant if:
- жизнеспособность клеток КМКЧ после 3 минут воздействия составляет менее 50% или- cell viability of KMCCh after 3 minutes of exposure is less than 50%, or
- жизнеспособность клеток КМКЧ после 3 минут воздействия больше или равна 50%, но жизнеспособность клеток КМКЧ после 1 часа воздействия составляет менее 15%.- cell viability of KMCCh after 3 minutes of exposure is greater than or equal to 50%, but cell viability of KMCCh after 1 hour of exposure is less than 15%.
Исследуемое вещество признается не раздражающим для кожи если:A test substance is considered non-irritating to the skin if:
- жизнеспособность клеток КМКЧ после 3 минут воздействия больше или равна 50% и жизнеспособность клеток КМКЧ после 1 часа воздействия больше или равна 15%.- cell viability of KMCCh after 3 minutes of exposure is greater than or equal to 50% and cell viability of KMCCh after 1 hour of exposure is greater than or equal to 15%.
Недостатком данного метода является необходимость использования в качестве объекта испытаний дорогостоящей высокотехнологической биоинженерной конструкции - клеточной модели эпидермиса человека. Кроме того, о наличии негативного воздействия тестируемого химического вещества на эпидермис человека можно судить только на основании гибели клеток в эксперименте, что не позволяет прогнозировать потенциальную опасность для здоровья человека химических соединений в субтоксических концентрациях.The disadvantage of this method is the need to use as an object of testing an expensive high-tech bioengineering structure - a cellular model of the human epidermis. In addition, the presence of a negative effect of the test chemical on the human epidermis can only be judged on the basis of cell death in the experiment, which does not allow predicting the potential hazard to human health of chemical compounds in subtoxic concentrations.
Проблемой, на решение которой направлено изобретение, является прогнозирования наличия (отсутствия) у тестируемой химической продукции способности вызывать повреждение /раздражение) кожных покровов человека.The problem to be solved by the invention is to predict the presence (absence) of the tested chemical products of the ability to cause damage / irritation) of human skin.
Технический результат - повышение точности за счет использования экспериментально установленных контрольных параметров, характеризующих изменение протеома кератиноцитов человека при воздействии химической продукции, способной вызывать раздражение/повреждение кожных покровов.EFFECT: increased accuracy due to the use of experimentally established control parameters characterizing the change in the proteome of human keratinocytes when exposed to chemical products that can cause irritation/damage to the skin.
В результате собственных исследований установлен перечень белков, которые стабильно появляются в кератиноцитах человека клеточной линии НаСаТ при воздействии различных химических веществ, обладающих способностью вызывать раздражение кожных покровов человека. Все эти белки отсутствуют в неповрежденных (интактных) клетках. Появление этих белков в клетках линии НаСаТ при воздействии тестируемого химического вещества служит основанием для заключения о наличии у него способности вызывать раздражение/повреждение кожных покровов.As a result of our own research, a list of proteins has been established that stably appear in human keratinocytes of the HaCaT cell line when exposed to various chemicals that have the ability to irritate human skin. All these proteins are absent in intact (intact) cells. The appearance of these proteins in the cells of the HaCaT line under the influence of the test chemical serves as the basis for concluding that it has the ability to cause irritation/damage to the skin.
Новизна данного технического решения заключается в использовании специфических протеомных маркеров, характерных для повреждения кератиноцитов человека химическими веществами, способными вызывать раздражение/повреждение кожных покровов. Неочевидность предложенного технического решения вытекает из недостаточности современных представлений об изменениях протеома клеток, повергающихся токсическому воздействию химических веществ.The novelty of this technical solution lies in the use of specific proteomic markers characteristic of damage to human keratinocytes by chemicals that can cause irritation/damage to the skin. The non-obviousness of the proposed technical solution stems from the insufficiency of modern ideas about changes in the proteome of cells exposed to the toxic effects of chemicals.
Способ осуществляют следующим образом. Объектом исследования являются нормальные кератиноциты человека иммортализованной клеточной линии НаСаТ. Используются клетки интактных (контрольных) клеточных культур и испытуемые клетки - после воздействия исследуемого вещества в известной концентрации.The method is carried out as follows. The object of the study is normal human keratinocytes of the immortalized HaCaT cell line. Cells of intact (control) cell cultures and test cells after exposure to the test substance at a known concentration are used.
Клетки высаживают в 75 см2 флаконы (например, Corning, США) в достаточном объеме питательной среды (чаще - 15 мл), рекомендованной для культивирования кератиноцитов (например, ДМЕМ/F12, содержащей 10% ФБС и Glutamax (Gibco, США)). Культивирование проводят в СО2-инкубаторе (при температуре 37±1°С, влажности 90±10%, содержании 5.0±1.0% СО2). После достижения 60-70% конфлюэнтности, культуральную среду отбирают, а клетки подвергают воздействию предварительно подготовленного раствора испытуемого вещества в питательной среде с известной концентрацией. К контрольным образцам добавляют свежую питательную среду. Время воздействия веществ на клетки составляет 48 часов.Cells are planted in 75 cm 2 flasks (eg, Corning, USA) in a sufficient volume of nutrient medium (usually 15 ml) recommended for cultivating keratinocytes (eg, DMEM/F12 containing 10% FBS and Glutamax (Gibco, USA)). Cultivation is carried out in CO 2 -incubator (at a temperature of 37±1°C, humidity 90±10%, content of 5.0±1.0% CO 2 ). After reaching 60-70% confluence, the culture medium is withdrawn and the cells are exposed to a pre-prepared solution of the test substance in nutrient medium at a known concentration. Fresh nutrient medium is added to the control samples. The time of exposure of substances to the cells is 48 hours.
После завершения эксперимента готовят лизаты клеток контрольных и испытуемых культур любым известным способом, позволяющим обеспечить сохранность белков в клеточных лизатах. Например, при помощи ультразвука. Определение содержания белков в клетках контрольных и испытуемых культур проводится любым из известных способов, доступных исходя из уровня развития техники, позволяющих выполнить измерение данного параметра с достаточной чувствительностью (например, масс-спектрометрия, хроматография, электрофорез, ИФА-анализ и др.), при условии, что при получении экспериментальных данных используется один метод. Допускается также использование методов, позволяющих зафиксировать не сами белки, а факт экспрессии в клетках РНК, кодирующих эти белки, например, исследование методом по-лимеразной цепной реакции. Количество измерений для каждой контрольной и испытуемой клеточной культуры должно быть достаточным для получения статистически корректного результата, что достигается использованием технических повторов (не менее трех для каждого эксперимента).After the completion of the experiment, cell lysates of the control and test cultures are prepared by any known method that ensures the preservation of proteins in cell lysates. For example, using ultrasound. Determination of protein content in the cells of control and test cultures is carried out by any of the known methods available based on the state of the art, allowing to measure this parameter with sufficient sensitivity (for example, mass spectrometry, chromatography, electrophoresis, ELISA analysis, etc.), when provided that one method is used when obtaining experimental data. It is also allowed to use methods that make it possible to fix not the proteins themselves, but the fact of expression in cells of RNA encoding these proteins, for example, a study by the polymerase chain reaction method. The number of measurements for each control and test cell culture should be sufficient to obtain a statistically correct result, which is achieved by using technical repetitions (at least three for each experiment).
О наличии раздражающего действия испытуемого вещества судят на основании выявления в лизатах испытуемых клеток трех белков:The presence of an irritating effect of the test substance is judged on the basis of the detection of three proteins in the lysates of the test cells:
- СоА-лигаза длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN),- CoA ligase of long-chain fatty acid 3 (ACSL3_HUMAN),
- фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN),- eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 (IF4G1_HUMAN),
- базигин (BASI_HUMAN).- basicin (BASI_HUMAN).
При обнаружении в исследуемых образцах клеток испытуемых культур всех трех вышеперечисленных белков испытуемое вещество признается веществом, обладающим раздражающим действием на кожу. Если в клетках после воздействия тестируемого химического вещества не выявляются белки из перечня, делается заключение об отсутствии у данного химического вещества способности вызывать раздражение/повреждение кожи человека. При обнаружении одного или двух белков из перечня проводится дополнительный эксперимент - концентрация исследуемого вещества увеличивается в два раза. Если при этом в исследуемых образцах клеток испытуемых культур обнаруживается три белка из определенного перечня, испытуемое вещество признается обладающим раздражающим действием на кожу. В случае повторного обнаружения одного или двух белков из перечня проводится второй дополнительный эксперимент - концентрация исследуемого вещества увеличивается в пять раз по сравнению с исходной. Если при этом в исследуемых образцах обнаруживается три белка из определенного перечня, испытуемое вещество в исходной концентрации признается веществом, обладающим раздражающим действием на кожу. В противном случае испытуемое вещество признается не обладающим раздражающим действием на кожу.If all three of the above proteins are found in the test cell samples of the test cultures, the test substance is recognized as a substance that has an irritating effect on the skin. If no proteins from the list are detected in the cells after exposure to the tested chemical, it is concluded that this chemical does not have the ability to cause irritation/damage to human skin. If one or two proteins from the list are detected, an additional experiment is carried out - the concentration of the test substance is doubled. If at the same time three proteins from a certain list are found in the studied cell samples of the tested cultures, the test substance is recognized as having an irritating effect on the skin. In the case of repeated detection of one or two proteins from the list, a second additional experiment is carried out - the concentration of the test substance is increased five times compared to the initial one. If at the same time three proteins from a certain list are found in the test samples, the test substance in the initial concentration is recognized as a substance that has an irritant effect on the skin. Otherwise, the test substance is considered to be non-irritating to the skin.
Примеры конкретного выполненияSpecific Implementation Examples
Пример 1. Оценка наличия раздражающего действия на кожу человека у раствора Тритона Х-100 (Sigma) в концентрации 25 мкг/мл по способу - прототипу и заявленному способу.Example 1. Evaluation of the presence of an irritating effect on human skin in a solution of Triton X-100 (Sigma) at a concentration of 25 μg/ml according to the prototype method and the claimed method.
Тритон Х-100 - поверхностно-активное вещество (ПАВ), относящееся к группе неионных ПАВ. Его способность раздражать кожу хорошо известна, в связи с чем целью эксперимента было сравнение информативности способа-прототипа и заявляемого способа при прогнозировании этой способности у Тритона Х-100 в эксперименте.Triton X-100 is a surface-active substance (surfactant) belonging to the group of non-ionic surfactants. Its ability to irritate the skin is well known, and therefore the purpose of the experiment was to compare the information content of the prototype method and the proposed method in predicting this ability in Triton X-100 in the experiment.
Исследование согласно способу-прототипу:Research according to the prototype method:
Объектом исследования служила стандартизованная модель эпидермиса человека «VitroSkin» в формате 24-луночного планшета. Исследование проводили в соответствии с вышепредставленным описанием. Кроме тестируемого вещества, использовали два контрольных вещества: вещество, не вызывающее повреждение кожи (0.9% NaCl, отрицательный контроль) и вещество, обладающее выраженным раздражающим действием на кожу человека (ледяная уксусная кислота, положительный контроль). На клеточные модели тестируемое и контрольные вещества наносили на 3 минуты и на 1 час (каждый эксперимент проводили в двух повторах). После окончания воздействия тестируемое вещество тщательно смывают с поверхности клеточных моделей нейтральным раствором, например, 0,9% раствором NaCl. По завершении времени эксперимента жизнеспособность клеток в составе КМКЧ оценивали методом МТТ. Результаты представлены в таблице 1.The object of the study was a standardized model of the human epidermis "VitroSkin" in the format of a 24-well plate. The study was carried out in accordance with the above description. In addition to the test substance, two control substances were used: a substance that does not cause skin damage (0.9% NaCl, negative control) and a substance that has a pronounced irritant effect on human skin (glacial acetic acid, positive control). Test and control substances were applied to cell models for 3 minutes and 1 hour (each experiment was performed in duplicate). After the end of exposure, the test substance is thoroughly washed off the surface of the cell models with a neutral solution, for example, 0.9% NaCl solution. At the end of the experiment, the viability of cells in the composition of CMCH was assessed by the MTT method. The results are presented in table 1.
Таблица 1. Результаты исследования влияния раствора Тритона Х-100 (Sigma) в концентрации 25 мкг/мл на кожу человека по способу - прототипу. Данные представлены в виде среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего (m).Table 1. The results of a study of the effect of a solution of Triton X-100 (Sigma) at a concentration of 25 μg/ml on human skin according to the prototype method. Data are presented as arithmetic mean (M) ± standard error of the mean (m).
При воздействии отрицательного контрольного вещества жизнеспособность клеток КМКЧ не снижалась ни в одном из сроков наблюдения. Напротив, воздействие ледяной уксусной кислоты (положительный контроль) приводило к резкому снижению жизнеспособности клеток, которая составила 2-3% от исходных значений. Тестируемое вещество - тритон Х-100 в концентрации 25 мкг/мл, через 3 минуты после нанесения на КМКЧ лишь незначительно снизило жизнеспособность клеток (до 87% от исходного уровня. Однако более длительное воздействие (в течение часа) привело к существенному снижению жизнеспособности клеток КМКЧ, что позволило отнести тестируемое вещество к химическим веществам, способным вызвать раздражение кожи человека.Under the influence of a negative control substance, the viability of CMCC cells did not decrease in any of the observation periods. On the contrary, exposure to glacial acetic acid (positive control) led to a sharp decrease in cell viability, which amounted to 2-3% of the original values. The test substance, Triton X-100 at a concentration of 25 µg/ml, 3 minutes after application to CMCC, only slightly reduced cell viability (up to 87% of the initial level. However, longer exposure (within an hour) led to a significant decrease in cell viability of CMCC , which made it possible to classify the test substance as a chemical substance capable of irritating human skin.
Таким образом, исследование по способу-прототипу позволило прийти к заключению о том, что тритон Х-100 способен вызвать раздражение кожи человека.Thus, the study of the prototype method led to the conclusion that Triton X-100 is capable of irritating human skin.
Исследование согласно заявленному способу:Research according to the claimed method:
Клетки иммортализованной клеточной линии НаСаТ высаживали в 96-луночные планшеты (Corning) по 2000 клеток в 200 мкл среды ДМЕМ/F12, содержащей 10% ФБС и Glutamax (Gibco), в лунку. Через 96 часов культивирования среду из лунок отбирали и добавляли по 200 мкл раствора Тритон Х-100 (Sigma) в полной питательной среде в концентрации 25 мкг/мл и инкубировали в течение 48 часов. К контрольным образцам добавляли свежую питательную среду.Cells of the immortalized HaCaT cell line were planted in 96-well plates (Corning) at 2000 cells in 200 μl of DMEM/F12 medium containing 10% PBS and Glutamax (Gibco) per well. After 96 hours of cultivation, the medium was taken from the wells and 200 μl of a solution of Triton X-100 (Sigma) in a complete nutrient medium at a concentration of 25 μg/ml was added and incubated for 48 hours. Fresh nutrient medium was added to the control samples.
Затем снимали клетки с поверхности культуральных флаконов тремя миллилитрами смеси трипсина-ЭДТА (3-5 мин. при 37°С), отмывали фосфатным буфером. Водные суспензии клеток гомогенизировали при помощи ультразвука при 4°С, на ультразвуковой установке BANDELIN sonoplus HD2070 (Германия). Гомогенаты клеток НаСаТ (175 мкг белка в пробе) подвергали триптическому гидролизу. Содержание белка в гомогенатах клеток НаСаТ определяли по методу с бицинхониновой кислотой, с использованием БСА в качестве стандарта [5].Then the cells were removed from the surface of the culture flasks with three milliliters of trypsin-EDTA mixture (3-5 min. at 37°C), washed with phosphate buffer. Aqueous cell suspensions were homogenized using ultrasound at 4°C on a BANDELIN sonoplus HD2070 ultrasonic unit (Germany). Homogenates of HaCaT cells (175 μg of protein per sample) were subjected to tryptic hydrolysis. The protein content in homogenates of HaCaT cells was determined by the method with bicinchoninic acid, using BSA as a standard [5].
Для разделения и идентификации пептидов использовали хроматографическую систему Ultimate 3000 nano-flow HPLC (Dionex, США), совмещенную с масс-спектрометром Orbitrap Exactive (Thermo Scientific) с источником электростатической ионизации Nanospray Flex NG ion source (Thermo Scientific) (по три технических повтора для каждой пробы). При MS/MS-сканировании исключали однозарядные ионы и ионы с неопределенным состоянием заряда [5].Peptides were separated and identified using an Ultimate 3000 nano-flow HPLC chromatographic system (Dionex, USA) combined with an Orbitrap Exactive mass spectrometer (Thermo Scientific) with a Nanospray Flex NG ion source (Thermo Scientific) electrostatic ionization source (three technical repetitions for each sample). In MS/MS scanning, singly charged ions and ions with an undetermined state of charge were excluded [5].
Масс-спектры в "raw" формате обрабатывали с использованием программного обеспечения Progenesis LC-MS (Nonlinear Dynamics Ltd, Великобритания). Поиск пептидов и белков осуществляли в программе "Mascot", используя следующие параметры поиска: база данных "Swiss-Prot" (SP, версия 2012_11, ".fasta" формат) для вида Homo sapiens; расщепляющий фермент - трипсин; точность совпадения теоретической и экспериментальной массы пептида - ±15 ppm; точность совпадения теоретической и экспериментальной массы фрагментарных ионов - ±0.01 Да; значение зарядового состояния ионов пептида - "2+, 3+ и 4+"; количество возможных пропущенных участков расщепления трипсином - 1; фиксированная модификация - пиридилэтилирование цистеина, окисленный метионин в качестве вариабельной модификации. Поиск проводили по базе данных инвертированных и рандомных последовательностей аминокислот (decoy), процент ложноположительных результатов (false discovery rate, FDR) <1%. Белки с индексом достоверности (Mascot score) <13 считали недостоверными. Выходные данные Mascot в формате "xml" реимпортировали в программу Progenesis LC-MS ("Nonlinear Dynamics Ltd.", Великобритания) [5].Raw mass spectra were processed using Progenesis LC-MS software (Nonlinear Dynamics Ltd, UK). The search for peptides and proteins was carried out in the "Mascot" program using the following search parameters: "Swiss-Prot" database (SP, version 2012_11, ".fasta" format) for the species Homo sapiens; splitting enzyme - trypsin; accuracy of coincidence of the theoretical and experimental mass of the peptide - ±15 ppm; the accuracy of the coincidence of the theoretical and experimental masses of fragmentary ions - ±0.01 Da; the value of the charge state of the peptide ions - "2+, 3+ and 4+"; the number of possible missing sites of cleavage by trypsin - 1; fixed modification - pyridylethylation of cysteine, oxidized methionine as a variable modification. The search was performed on the database of inverted and random amino acid sequences (decoy), the percentage of false positive results (false discovery rate, FDR) <1%. Proteins with a Mascot score <13 were considered unreliable. The Mascot output data in the "xml" format was reimported into the Progenesis LC-MS software (Nonlinear Dynamics Ltd., UK) [5].
В результате в лизатах клеток НаСаТ после воздействия тритона Х-100 в концентрации 25 мкг/мл были обнаружены все три белка из перечня, а именно: СоА-лигаза длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN), фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN), базигин (BASI_HUMAN). На основании чего был сделан вывод о том, что тритон Х-100 способен вызвать раздражение кожи человека.As a result, in lysates of HaCaT cells after exposure to Triton X-100 at a concentration of 25 μg/ml, all three proteins from the list were found, namely: long-chain fatty acid CoA ligase 3 (ACSL3_HUMAN), eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 (IF4G1_HUMAN ), basicin(BASI_HUMAN). On the basis of which it was concluded that Triton X-100 is capable of irritating human skin.
Таким образом, исследования безопасности раствора тритона Х-100 в концентрации 25 мкг/мл в отношении кожных покровов человека по способу-прототипу и заявленному способу были одинаково информативны и позволили прийти к заключению, что данное химическое вещество способно вызывать раздражение/повреждение кожи человека.Thus, studies of the safety of a solution of Triton X-100 at a concentration of 25 μg / ml in relation to human skin according to the prototype method and the claimed method were equally informative and led to the conclusion that this chemical is capable of causing irritation / damage to human skin.
Пример 2. Оценка наличия раздражающего действия на кожу человека раствора тритона Х-100 (Sigma) в концентрации 12,5 мкг/мл по способу - прототипу и заявленному способу.Example 2. Evaluation of the presence of an irritating effect on human skin of a solution of Triton X-100 (Sigma) at a concentration of 12.5 μg/ml according to the prototype method and the claimed method.
Как и в примере 1, целью эксперимента было сравнение информативности способа-прототипа и заявляемого способа при прогнозировании способности тритона X-100 раздражать/повреждать кожу человека.As in example 1, the purpose of the experiment was to compare the information content of the prototype method and the proposed method in predicting the ability of Triton X-100 to irritate/damage human skin.
Исследование согласно способу-прототипу проводили также, как в примере 1, используя меньшую концентрацию раствора Тритон Х-100 (12,5 мкг/мл).The study according to the prototype method was carried out as in example 1, using a lower concentration of a solution of Triton X-100 (12.5 µg/ml).
Результаты исследования приведены в таблице 2.The results of the study are shown in table 2.
Таблица 2. Результаты исследования влияния раствора Тритона Х-100 (Sigma) в концентрации 12,5 мкг/мл на кожу человека по способу - прототипу. Данные представлены в виде среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего (m).Table 2. The results of a study of the effect of a solution of Triton X-100 (Sigma) at a concentration of 12.5 μg/ml on human skin according to the prototype method. Data are presented as arithmetic mean (M) ± standard error of the mean (m).
При воздействии отрицательного контрольного вещества жизнеспособность клеток не снижалась ни в одном из сроков наблюдения. Напротив, воздействие ледяной уксусной кислоты (положительный контроль) приводило к резкому снижению жизнеспособности клеток, которая составила 2-3% от исходных значений. Тестируемое вещество - тритон Х-100 в концентрации 12,5 мкг/мл, через 3 минуты после нанесения на КМКЧ лишь незначительно снизило жизнеспособность клеток (до 93% от исходного уровня. Воздействие тестируемого вещества в течение часа привело к более выраженному снижению жизнеспособности клеток КМКЧ (до 28%), но при этом величина показателя превышала 15%, что не позволило отнести тестируемое вещество к химическим веществам, способным вызвать раздражение кожи человека.When exposed to a negative control substance, cell viability did not decrease in any of the observation periods. On the contrary, exposure to glacial acetic acid (positive control) led to a sharp decrease in cell viability, which amounted to 2-3% of the original values. The test substance, Triton X-100 at a concentration of 12.5 μg/ml, 3 minutes after application to CBCC, only slightly reduced cell viability (up to 93% of the initial level. Exposure to the test substance for an hour led to a more pronounced decrease in cell viability of CBCC (up to 28%), but at the same time, the value of the indicator exceeded 15%, which did not allow the test substance to be classified as a chemical substance that can irritate human skin.
В результате был сделан вывод о том, что раствор тритона Х-100 не способен вызвать раздражение кожи человека.As a result, it was concluded that Triton X-100 solution is not capable of irritating human skin.
Исследование согласно заявленному способу проводили как указано в примере 1.The study according to the claimed method was carried out as indicated in example 1.
В результате в лизатах клеток НаСаТ после воздействия Тритон Х-100 в концентрации 12,5 мкг/мл были обнаружены все три белка из перечня.As a result, all three proteins from the list were found in lysates of HaCaT cells after exposure to Triton X-100 at a concentration of 12.5 μg/ml.
На основании этого был сделан вывод о том, что тритон Х-100 способен вызвать раздражение кожи человека.Based on this, it was concluded that Triton X-100 is capable of irritating human skin.
Таким образом, исследование безопасности раствора тритон Х-100 по заявленному способу позволило прогнозировать наличие способности вызывать раздражение кожи человека в субтоксической концентрации (12,5 мкг/мл), не приводящей к гибели клеток. В то время как способ-прототип оказался не информативным - не позволил прийти к верному заключению.Thus, the study of the safety of the Triton X-100 solution according to the claimed method made it possible to predict the presence of the ability to cause irritation of human skin at a subtoxic concentration (12.5 μg/ml), which does not lead to cell death. While the prototype method was not informative - did not allow to come to the right conclusion.
Пример 3. Оценка наличия раздражающего действия на кожу человека у раствора ДСН (Sigma) в концентрации 12,5 мкг/мл по заявленному способу.Example 3. Evaluation of the presence of an irritant effect on human skin in a solution of SDS (Sigma) at a concentration of 12.5 μg/ml according to the claimed method.
ДСН - химическое вещество из группы ПАВ анионного типа. Его способность раздражать кожу человека и лабораторных животных, как и в случае с тритоном Х-100, хорошо известна. Однако, это свойство легко регистрируется в испытаниях с использованием токсических и субтоксических концентраций вещества (>50 мкг/мл). С целью оценки чувствительности заявленного способа в данном эксперименте использовалась низкая концентрация ДСН - 12,5 мкг/мл.SDS is a chemical substance from the group of anionic surfactants. Its ability to irritate the skin of humans and laboratory animals, as in the case of Triton X-100, is well known. However, this property is easily recorded in tests using toxic and subtoxic concentrations of the substance (>50 µg/ml). In order to assess the sensitivity of the claimed method in this experiment, a low concentration of SDS was used - 12.5 μg/ml.
Исследование согласно заявленному способу проводили как указано в примере 1.The study according to the claimed method was carried out as indicated in example 1.
В результате в лизатах клеток НаСаТ после воздействия ДСН в концентрации 12,5 мкг/мл были обнаружены два белка из перечня - СоА-лигаза длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN) и фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN). Белок базигин (BASI_HUMAN) обнаружен не был. В соответствии с заявленным способом, концентрацию ДСН увеличили в 2 раза (до 25 мкг/мл) и провели повторное исследование. При этом в исследуемых образцах клеток испытуемых культур обнаружили три белка из определенного перечня. В результате, исследование по заявленному способу позволило прийти к заключению, что ДСН обладает раздражающим действием на кожу.As a result, in lysates of HaCaT cells after exposure to SDS at a concentration of 12.5 μg/ml, two proteins from the list were found - long-chain fatty acid CoA ligase 3 (ACSL3_HUMAN) and eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 (IF4G1_HUMAN). The basigin protein (BASI_HUMAN) was not detected. In accordance with the claimed method, the concentration of SDS was increased by 2 times (up to 25 µg/ml) and re-examined. At the same time, three proteins from a certain list were found in the studied cell samples of the tested cultures. As a result, the study according to the claimed method led to the conclusion that SDS has an irritating effect on the skin.
Пример 4. Оценка наличия раздражающего действия на кожу человека у раствора ДСН (Sigma) в концентрации 4 мкг/мл по заявленному способу.Example 4. Evaluation of the presence of an irritating effect on human skin in a solution of SDS (Sigma) at a concentration of 4 μg/ml according to the claimed method.
В данном эксперименте были проведены испытания ДСН для кожи человека в еще более низкой концентрации (4 мкг/мл).In this experiment, human skin SDS was tested at an even lower concentration (4 µg/ml).
Исследование согласно заявленному способу проводили как указано в примере 1.The study according to the claimed method was carried out as indicated in example 1.
В результате в лизатах клеток НаСаТ после воздействия ДСН в концентрации 4 мкг/мл были обнаружены два белка из перечня - СоА-лигаза длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN) и фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN). Белок базигин (BASI_HUMAN) обнаружен не был. В соответствии с заявленным способом концентрация ДСН была увеличена в 2 раза - до 8 мкг/мл. При этом в исследуемых образцах клеток испытуемых культур обнаружили два белка из определенного перечня: СоА-лигазу длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN) и фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN). Белок базигин (BASI_HUMAN) обнаружен не был. В соответствии с заявленным способом, концентрация ДСН была увеличена в пять раз - до 20 мкг/мл. При этом в исследуемых образцах клеток испытуемых культур обнаружили три белка из определенного перечня. В результате, исследование по заявленному способу позволило прийти к заключению, что ДСН обладает раздражающим действием на кожу.As a result, in lysates of HaCaT cells after exposure to SDS at a concentration of 4 µg/mL, two proteins from the list were found: long-chain fatty acid CoA ligase 3 (ACSL3_HUMAN) and eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 (IF4G1_HUMAN). The basigin protein (BASI_HUMAN) was not detected. In accordance with the claimed method, the concentration of SDS was increased by 2 times - up to 8 μg/ml. At the same time, two proteins from a certain list were found in the studied cell samples of the tested cultures: long-chain fatty acid CoA ligase 3 (ACSL3_HUMAN) and eukaryotic translation initiation factor 4, gamma 1 (IF4G1_HUMAN). The basigin protein (BASI_HUMAN) was not detected. In accordance with the claimed method, the concentration of SDS was increased five times - up to 20 μg/ml. At the same time, three proteins from a certain list were found in the studied cell samples of the tested cultures. As a result, the study according to the claimed method led to the conclusion that SDS has an irritating effect on the skin.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫLIST OF USED LITERATURE
1. Draize J.H. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin an mucous membranes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1944; 82:377-390.1. Draize J.H. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin an mucous membranes. J Pharmacol. Exp. Ther. 1944; 82:377-390.
2. Rusanov A.L., Luzgina N.G., Lisitsa A.V. Sodium Dodecyl Sulfate Cytotoxicity towards HaCaT Keratinocytes: Comparative Analysis of Methods for Evaluation of Cell Viability, Bull Exp Biol Med. 2017; 163(2):284-288.2. Rusanov A.L., Luzgina N.G., Lisitsa A.V. Sodium Dodecyl Sulfate Cytotoxicity towards HaCaT Keratinocytes: Comparative Analysis of Methods for Evaluation of Cell Viability, Bull Exp Biol Med. 2017; 163(2):284-288.
3. OECD, 2013a. OECD Guideline for the Testing of Chemicals (No. 431.): In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (Rhe) Test Method, OECD, Paris.3. OECD, 2013a. OECD Guideline for the Testing of Chemicals (No. 431.): In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (Rhe) Test Method, OECD, Paris.
4. ГОСТ 32634-2014. Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro. Дата введения в действие: 01.06.2015.4. GOST 32634-2014. Test methods for the effects of chemical products on the human body. Skin corrosion/corrosion: in vitro human skin model test. Effective date: 06/01/2015.
5. Rusanov A.L., Petushkova N.A., Poverennaya E.V., Nakhod K.V., Larina O.V., Lisitsa A.V., Luzgina N.G. Proteomic profiling of HaCaT keratinocytes exposed to skin damaging detergents, Biomeditsinskaya khimiya, 2017, 63(5); 405-412.5. Rusanov A.L., Petushkova N.A., Poverennaya E.V., Nakhod K.V., Larina O.V., Lisitsa A.V., Luzgina N.G. Proteomic profiling of HaCaT keratinocytes exposed to skin damaging detergents, Biomeditsinskaya khimiya, 2017, 63(5); 405-412.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144058A RU2782890C2 (en) | 2017-12-15 | Method for assessment of safety of chemical products for human health |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144058A RU2782890C2 (en) | 2017-12-15 | Method for assessment of safety of chemical products for human health |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017144058A RU2017144058A (en) | 2019-06-17 |
| RU2782890C2 true RU2782890C2 (en) | 2022-11-07 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002070729A2 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Stratatech Corporation | Improved skin substitutes and uses thereof |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002070729A2 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Stratatech Corporation | Improved skin substitutes and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ГОСТ 32634-2014. Межгосударственный стандарт. Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro, (утв. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 сентября 2014 г. N 1229-ст). Дата введения в действие: 01.06.2015. S. GIBBS, In vitro Irritation Models and Immune Reactions, Skin Pharmacol Physiol, 2009, 22, рр.103-113. DOI: 10.1159/000178869. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harris et al. | Oxidative stress, thiols, and redox profiles | |
| Prudencio et al. | Superoxide dismutase 1 encoding mutations linked to ALS adopts a spectrum of misfolded states | |
| Vernocchi et al. | Sperm ubiquitination in epididymal feline semen | |
| Jørgensen et al. | Lipid peroxidation-derived 4-hydroxynonenal-modified proteins accumulate in human facial skin fibroblasts during ageing in vitro | |
| Welch et al. | Evaluation of the toxicity of sodium dodecyl sulphate (SDS) in the MucilAir™ human airway model in vitro | |
| Malécot et al. | Proteomic study of the effects of microcystin-LR on organelle and membrane proteins in medaka fish liver | |
| Piyankarage et al. | Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster | |
| Moroz et al. | Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons | |
| Rusanov et al. | Sodium dodecyl sulfate cytotoxicity towards HaCaT keratinocytes: comparative analysis of methods for evaluation of cell viability | |
| Ferreira et al. | Nature and kinetics of redox imbalance triggered by respiratory and skin chemical sensitizers on the human monocytic cell line THP-1 | |
| Kranvogl et al. | Simultaneous determination of phthalates, their metabolites, alkylphenols and bisphenol A using GC-MS in urine of men with fertility problems. | |
| WO2008017303A2 (en) | Biomarkers for inflammation of the liver | |
| JP2011522265A (en) | Protein biomarkers for in vitro testing of developmental and embryonic toxicity of chemicals | |
| Luo et al. | Non‐gradient blue native polyacrylamide gel electrophoresis | |
| Vasilaki et al. | Formation of 3‐nitrotyrosines in carbonic anhydrase III is a sensitive marker of oxidative stress in skeletal muscle | |
| RU2782890C2 (en) | Method for assessment of safety of chemical products for human health | |
| Boccaletto et al. | Proteomics: A valuable approach to elucidate spermatozoa post–testicular maturation in the endangered Acipenseridae family | |
| EP1388007A1 (en) | Method for qualitative and/or quantitative determination of gender, species, race and/or geographical origin of biological materials | |
| Caumette et al. | Monitoring the arsenic and iodine exposure of seaweed-eating North Ronaldsay sheep from the gestational and suckling periods to adulthood by using horns as a dietary archive | |
| JPH10232225A (en) | Method for evaluating sensitization and/or stimulability and/or allergic property of substance | |
| Serrano et al. | In vivo assessment and potential diagnosis of xenobiotics that perturb the thyroid pathway: Proteomic analysis of Xenopus laevis brain tissue following exposure to model T4 inhibitors | |
| JP2020010629A (en) | Methyl mercaptan odor inhibitor evaluation and/or selection method | |
| Rusanov et al. | Changes in the proteome of HaCaT keratinocytes induced by cytotoxic substance Triton X-100 | |
| Dong et al. | Comparative analysis of S-fatty acylation of gel-separated proteins by stable isotope–coded fatty acid transmethylation and mass spectrometry | |
| Zhang et al. | Differential expression of peroxiredoxin 6 in fetal rat testis following in utero exposure to di (nbutyl) phthalate |