RU2782600C1 - Способ увеличения пролиферативного потенциала трехмерных опухолевых клеточных культур - Google Patents
Способ увеличения пролиферативного потенциала трехмерных опухолевых клеточных культур Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782600C1 RU2782600C1 RU2021135637A RU2021135637A RU2782600C1 RU 2782600 C1 RU2782600 C1 RU 2782600C1 RU 2021135637 A RU2021135637 A RU 2021135637A RU 2021135637 A RU2021135637 A RU 2021135637A RU 2782600 C1 RU2782600 C1 RU 2782600C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- spheroids
- tumor
- mscs
- cell
- Prior art date
Links
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000002062 proliferating Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 210000004271 bone marrow stromal cells Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 20
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 claims abstract description 14
- 210000000577 Adipose Tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 208000009956 Adenocarcinoma Diseases 0.000 claims abstract 2
- 210000004293 Mammary Glands, Human Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 10
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 media Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- VLEUZFDZJKSGMX-ONEGZZNKSA-N Pterostilbene Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)=C1 VLEUZFDZJKSGMX-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 6
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 6
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 101710026246 POU5F1 Proteins 0.000 description 5
- 102100019163 POU5F1 Human genes 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 101700006931 SOX2 Proteins 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 3
- 102100019683 BAX Human genes 0.000 description 3
- 101700010813 BAX Proteins 0.000 description 3
- 102100013894 BCL2 Human genes 0.000 description 3
- 108060000885 BCL2 Proteins 0.000 description 3
- 102100008428 CCL2 Human genes 0.000 description 3
- 101700006000 CCL2 Proteins 0.000 description 3
- 102100008433 CCL27 Human genes 0.000 description 3
- 101700020729 CCL27 Proteins 0.000 description 3
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- 210000001808 Exosomes Anatomy 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 description 3
- -1 Nanog Proteins 0.000 description 3
- 101710043203 P23p89 Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 101700079116 QSOX1 Proteins 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 3
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N (3β)-Cholest-5-en-3-ol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 229920002483 18S ribosomal RNA Polymers 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 102100019487 CCL11 Human genes 0.000 description 2
- 101700074178 CCL11 Proteins 0.000 description 2
- 102100019485 CCL13 Human genes 0.000 description 2
- 101700034979 CCL13 Proteins 0.000 description 2
- 102100019494 CCL17 Human genes 0.000 description 2
- 101700084100 CCL17 Proteins 0.000 description 2
- 102100019492 CCL19 Human genes 0.000 description 2
- 101700049349 CCL19 Proteins 0.000 description 2
- 102100012032 CCL20 Human genes 0.000 description 2
- 101700018681 CCL20 Proteins 0.000 description 2
- 102100012031 CCL21 Human genes 0.000 description 2
- 101700067194 CCL22 Proteins 0.000 description 2
- 102100012036 CCL23 Human genes 0.000 description 2
- 101700065817 CCL23 Proteins 0.000 description 2
- 102100012030 CCL24 Human genes 0.000 description 2
- 102100012029 CCL25 Human genes 0.000 description 2
- 101700026902 CCL25 Proteins 0.000 description 2
- 102100008431 CCL26 Human genes 0.000 description 2
- 102100016450 CCL7 Human genes 0.000 description 2
- 101700044004 CCL7 Proteins 0.000 description 2
- 102100016451 CCL8 Human genes 0.000 description 2
- 101700045693 CCL8 Proteins 0.000 description 2
- 102100004728 CDH1 Human genes 0.000 description 2
- 101700016900 CDH1 Proteins 0.000 description 2
- 102100009637 CXCL11 Human genes 0.000 description 2
- 101710032182 CXCL11 Proteins 0.000 description 2
- 102100009639 CXCL13 Human genes 0.000 description 2
- 101710032192 CXCL13 Proteins 0.000 description 2
- 102100006229 CXCL16 Human genes 0.000 description 2
- 101710032184 CXCL16 Proteins 0.000 description 2
- 102100009664 CXCL2 Human genes 0.000 description 2
- 101700075102 CXCL2 Proteins 0.000 description 2
- 102100009682 CXCL5 Human genes 0.000 description 2
- 101700012002 CXCL5 Proteins 0.000 description 2
- 102100009685 CXCL6 Human genes 0.000 description 2
- 101700033050 CXCL6 Proteins 0.000 description 2
- 102100009686 CXCL9 Human genes 0.000 description 2
- 101700052645 CXCL9 Proteins 0.000 description 2
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 2
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 102000008789 N-cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010063834 Oversensing Diseases 0.000 description 2
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 2
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000009251 multiple myeloma Diseases 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 101710040918 shg Proteins 0.000 description 2
- 229940034586 silk sericin Drugs 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 2
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 2
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 2
- 230000001228 trophic Effects 0.000 description 2
- 239000010833 unregulated medical waste Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710043079 ADAM11 Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N Aminocaproic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N Bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 Breast Anatomy 0.000 description 1
- 208000000409 Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100012026 CCL1 Human genes 0.000 description 1
- 101700009741 CCL1 Proteins 0.000 description 1
- 102100019496 CCL15 Human genes 0.000 description 1
- 101700034300 CCL15 Proteins 0.000 description 1
- 101700070431 CCL21 Proteins 0.000 description 1
- 101700067246 CCL24 Proteins 0.000 description 1
- 101700040437 CCL26 Proteins 0.000 description 1
- 101700003485 CSF2 Proteins 0.000 description 1
- 102100006400 CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102100000546 CX3CL1 Human genes 0.000 description 1
- 101710027818 CX3CL1 Proteins 0.000 description 1
- 102100018698 CXCL1 Human genes 0.000 description 1
- 101700072041 CXCL1 Proteins 0.000 description 1
- 102100009641 CXCL10 Human genes 0.000 description 1
- 101710032181 CXCL10 Proteins 0.000 description 1
- 102100014691 CXCL12 Human genes 0.000 description 1
- 101710043128 CXCL12 Proteins 0.000 description 1
- 102100006847 CXCL8 Human genes 0.000 description 1
- 101710026285 CXCL8 Proteins 0.000 description 1
- 210000002583 Cell-Derived Microparticles Anatomy 0.000 description 1
- 102000003805 Chemokine CCL19 Human genes 0.000 description 1
- 108010082161 Chemokine CCL19 Proteins 0.000 description 1
- 108010083702 Chemokine CCL21 Proteins 0.000 description 1
- 108010083647 Chemokine CCL24 Proteins 0.000 description 1
- 108010083698 Chemokine CCL26 Proteins 0.000 description 1
- 108010078239 Chemokine CX3CL1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016950 Chemokine CXCL1 Human genes 0.000 description 1
- 108010014419 Chemokine CXCL1 Proteins 0.000 description 1
- 229940107161 Cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101700070526 DNMT1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101700033006 EGF Proteins 0.000 description 1
- 102100010813 EGF Human genes 0.000 description 1
- 101700025368 ERBB2 Proteins 0.000 description 1
- 102100016662 ERBB2 Human genes 0.000 description 1
- 229940116977 Epidermal Growth Factor Drugs 0.000 description 1
- 241000272186 Falco columbarius Species 0.000 description 1
- 102000012558 Fibroblast growth factor 20 Human genes 0.000 description 1
- 108050002085 Fibroblast growth factor 20 Proteins 0.000 description 1
- 102000013818 Fractalkine Human genes 0.000 description 1
- 101700048391 GCP2 Proteins 0.000 description 1
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N Interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 102100006525 KLF4 Human genes 0.000 description 1
- 101700048573 KLF4 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N MCP 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- 102100014894 MMP2 Human genes 0.000 description 1
- 101700060512 MMP2 Proteins 0.000 description 1
- 102100006844 MMP9 Human genes 0.000 description 1
- 101700067851 MMP9 Proteins 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108009000330 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 Metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- JMUPMJGUKXYCMF-UHFFFAOYSA-N N-[2-[2-[[6-[5-acetamido-6-(5-acetamido-1,2,4-trihydroxy-6-oxohexan-3-yl)oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-4-[3-[3-acetamido-4-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymet Chemical compound OC1C(NC(C)=O)C(OC(C(O)C(C=O)NC(=O)C)C(O)CO)OC(CO)C1OC1C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)NC(C)=O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)NC(C)=O)O1 JMUPMJGUKXYCMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKQLRGMMMAHREN-YJFXYUILSA-N N-stearoylsphingosine-1-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC LKQLRGMMMAHREN-YJFXYUILSA-N 0.000 description 1
- 210000000441 Neoplastic Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002220 Organoids Anatomy 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N PMSF Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 Placenta Anatomy 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101710037934 QRSL1 Proteins 0.000 description 1
- 102100018829 SOX2 Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HELHAJAZNSDZJO-UHFFFAOYSA-L Sodium tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960002167 Sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 102100002607 TIMP1 Human genes 0.000 description 1
- 102100006014 TIMP2 Human genes 0.000 description 1
- 101700019351 TRYM Proteins 0.000 description 1
- 101710037010 TUBGCP2 Proteins 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N Tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 108010031374 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010031372 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 Proteins 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 description 1
- 210000003954 Umbilical Cord Anatomy 0.000 description 1
- 102100015249 VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000027448 caveolin-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000006395 clathrin-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000771 oncological Effects 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 150000008106 phosphatidylserines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- OFPTZWGZSRJCOT-MSPNRCMCSA-M potassium;2-[(1S,2S,3R,4S,5S,6R)-3-(diaminomethylideneamino)-4-[(2R,3R,4R,5S)-3-[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy-2,5,6-trihydroxycyclohexyl]guanidine;(2S,5R,6R)-3,3-d Chemical compound [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O OFPTZWGZSRJCOT-MSPNRCMCSA-M 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001187 sodium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 1
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способу увеличения пролиферативного потенциала трёхмерных опухолевых клеточных культур. Для осуществления указанного способа к культуре клеток аденокарциномы протоков молочной железы человека – сфероидам добавляют индуцированные цитохалазином B мембранные везикулы мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани человека в количестве 10 мкг. Настоящее изобретение позволяет увеличить количество трёхмерных опухолевых клеточных культур in vitro. 6 ил., 1 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, ветеринарии, фармакологии, клеточной биологии, более точно к способам улучшения культивирования опухолевых сфероидов для скрининга веществ с потенциальной противоопухолевой активностью in vitro. Изобретение может быть использовано для повышения количества опухолевых сфероидов и улучшения достоверности результатов доклинических исследований различных препаратов и веществ с противоопухолевой активностью.
Далее в целях исключения неоднозначного понимания текста заявителем приведены использованные в заявочном материале термины и их расшифровка.
иМВ - индуцированных цитохалазином В мембранные везикулы
МСК - мезенхимные стромальные (стволовые) клетки
3D клеточные культуры - трехмерные клеточные культуры
МВ - мембранные везикулы
МО - микроокружение опухоли
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ЭМП - эпителиально-мезенхимный переход
ПП - пролиферативный потенциал (увеличение количества сфероидов)
Число новых случаев злокачественных новообразований продолжает расти с каждым годом. В 2019 году в Российской Федерации было выявлено более 640 тыс. случаев злокачественных новообразований, что на 2,5% выше по сравнению с показателями 2018 года [Каприн, А.Д., с соавт., Состояние онкологической помощи населению России в 2019 году. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2020. - 236 с. ISBN 978-5-85502-255-1]. На дату подачи настоящей заявки тестирование противоопухолевых препаратов проводят с использованием монослойных опухолевых клеток.
Данная модель имеет определенные недостатки. Например, в монослойных клеточных культурах отсутствуют пространственные градиенты кислорода, факторы роста и метаболиты, а также зональность, которая включает наличие некротических, гипоксических, покоящихся и пролиферирующих клеток, характерных для естественной опухоли [Ham et al., Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med, 2016. 241(9): p. 939-954.]. Кроме того, после длительного культивирования опухолевых клеточных линий исключается генетическая гетерогенность исходной опухоли [Zhou et al., Microfluidic device for primary tumor spheroid isolation. Exp Hematol Oncol, 2017. 6 (22): p. 1-7].
Основными наиболее приближенными моделями к естественной опухоли на дату подачи настоящей заявки являются трехмерные (3D) клеточные культуры (в частности, опухолевые сфероиды). Они обладают рядом важных свойств, сближающих их с нативной тканью [Jeppesen et al., Short-term spheroid culture of primary colorectal cancer cells as an in vitro model for personalizing cancer medicine. Plos One, 2017. 12(9): p. 1-19].
Сфероиды, полученные из опухолевой ткани пациента, могут позволить осуществить подбор наиболее эффективного препарата и его необходимую дозу. Например, в [Jeppesen et al., Short-term spheroid culture of primary colorectal cancer cells as an in vitro model for personalizing cancer medicine. Plos One, 2017. 12(9): p. 1-19] описан скрининг химиочувствительности с использованием сфероидов первичных клеток колоректальной аденокарциномы пяти пациентов и получены индивидуальные профили ответа опухоли на терапию. Сфероиды сохраняли различия между пациентами в чувствительности к лекарствам и их комбинациям, наиболее часто используемым для лечения колоректального рака.
В работе [Halfter et al., Testing chemotherapy efficacy in HER2 negative breast cancer using patient-derived spheroids. J Transl Med, 2016. 14(1): p. 1-14] приведено сравнение действия терапевтических препаратов на сфероидах, полученных из ткани и клеточной линии опухоли молочной железы, которое показало различие между данными группами.
Сфероиды могут быть получены из большинства типов опухолей, что предоставляет возможности для создания биобанков с соответствующими материалами пациентов, которые могут быть использованы для проведения скрининга лекарств и облегчения разработки терапевтических средств [Gilazieva et al., Promising Applications of Tumor Spheroids and Organoids for Personalized Medicine. Cancers, 2020. 12(10): p. 2-19].
Однако существуют ограничения, которые не позволяют полноценно использовать опухолевые сфероиды в персонализированной медицине. Одно из таких ограничений обусловлено недостаточным количеством клеточного материала. Первичные культуры клеток, которые в последующем будут использоваться для формирования опухолевых сфероидов, обладают ограниченным пролиферативным потенциалом. Для усиления пролиферации клеток и использования их в дальнейших исследованиях необходимы специальные добавки. В качестве данных добавок могут быть использованы факторы роста, цитокины, гормоны, которые добавляются в культуральную среду для пролиферации и активации клеток.
В качестве новой культуральной добавки, улучшающей выход опухолевых сфероидов, может использоваться заявленное техническое решение, которое основывается на идее того, что индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы (иМВ), выделенные из мезенхимных стромальных (стволовых) клеток (МСК), будут доставлять опухолевым клеткам ростовые факторы, тем самым увеличивая пролиферацию опухолевых сфероидов. Заявленное техническое решение позволит увеличить выход опухолевых сфероидов, что может значительно повысить эффективность индивидуального подбора противоопухолевых препаратов и внедрить методы персонализированной медицины в онкологию.
Внеклеточные мембранные везикулы - это сферические микро- и наноструктуры, отделяющиеся от поверхности клетки и участвующие в межклеточной коммуникации путем переноса заключенных внутри них биологически активных молекул и факторов роста в другие клетки и ткани. Внеклеточные везикулы опосредуют взаимодействия между клетками микроокружения опухоли и индуцируют фенотипические модификации в клетках-реципиентах, тем самым выступая ключевыми медиаторами в поддержании и распространении злокачественного новообразования [Whiteside, T.L. Exosome and mesenchymal stem cell cross-talk in the tumor microenvironment. Seminars in Immunology, 2018. 35(C): p. 69-79].
Механизм слияния везикулы с клеткой и передача различных молекул происходит через рецепторное взаимодействие и может осуществляться через клатрин-опосредованный и кавеолин-зависимый эндоцитоз, благодаря лиганд/рецепторным взаимодействиям [Colombo et al., Extracellular Vesicles Enhance Multiple Myeloma Metastatic Dissemination. International Journal of Molecular Sciences, 2019. 20(13): p. 1-15].
МСК представляют собой мультипотентные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток. МСК могут быть получены из разных тканей, например, из костного мозга, жировой ткани, плаценты или пуповины. МСК являются основным компонентом микроокружения опухоли и играют ключевую роль в ее развитии. В микроокружении опухоли MCК участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса, эпителиально-мезенхимном переходе, способствуют метастазированию, а также ингибируют противоопухолевые иммунные ответы [Ridge et al., Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Molecular Cancer, 2017. 16(1): p. 1-10].
Везикулы МСК содержат и переносят белки, связанные с ростом опухоли и ремоделированием внеклеточного матрикса (эндогенный или тканевые ингибиторы металлопротеиназ TIMP-1 и TIMP-2, матриксные металлопротеиназы MMP-9 и MMP-2), с ангиогенезом (сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF и тромбоцитарный фактор роста PDGF), пролиферацией (трансформирующий фактор роста TGF-β, фактор роста фибробластов FGF), а также цитокины (интерлейкины IL-6, IL-8 и IL-1β), РНК и микроРНК [Lindoso et al., Extracellular vesicles as regulators of tumor fate: crosstalk among cancer stem cells, tumor cells and mesenchymal stem cells. Stem cell investigation, 2017. 4: p. 1-14]. Показано, что полученные из MCК везикулы, несущие факторы роста и IL-6, способствуют пролиферации клеток множественной миеломы in vitro и in vivo [Roccaro et al., BM mesenchymal stromal cell-derived exosomes facilitate multiple myeloma progression. Journal of Clinical Investigation, 2013. 123(8): p.1542]. Содержимое везикул может активировать транскрипционные факторы, которые играют роль в регуляции роста опухолевых стволовых клеток. К ним относятся такие факторы, как Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Myc [Yang et al., Targeting cancer stem cell pathways for cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2020. 5(1): p. 1-35]. Таким образом происходит повышение уровня стволовости опухолевых клеток, которая играет роль в самообновлении стволовых клеток и генерации дифференцированного потомства. Это свойство позволяет поддерживать популяцию клеток и баланс между покоем, пролиферацией и регенерацией.
Предполагается, что изменение условий культивирования путем добавления иМВ в опухолевые сфероиды позволит увеличить их выход. Предлагаемый способ обеспечивает доставку трофических факторов роста и других биологических молекул, содержащихся в иМВ МСК, которые будут поддерживать рост и пролиферацию опухолевых сфероидов.
Заявителем был проведен анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области улучшения качества культивирования культур клеток, в результате выявлены следующие аналоги.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту US20070020760 «Добавка к среде и среда для культивирования клеток животных» (с англ. Medium supplement and animal cell culture medium). Сущностью данного изобретения является добавочная среда, в которой содержится серицин или производное серицина для использования при культивировании клеток животных.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту EP3719115 «Состав и способ культивирования, размножения, сохранения и/или предварительной обработки клеток» (с англ. Composition and method for the cultivation, expansion, preservation and/or pre-treatment of cells). Сущность способа заключается в том, что композиция, представляющая собой среду, добавку к среде и/или раствор, содержит птеростильбен, использующийся как композиция для культивирования, размножения, сохранения и/или предварительной обработки клеток.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU №2711920 «Добавка для культивирования эпителиальных клеток». Сущностью является добавка для ускорения пролиферации клеточных культур в условиях in vitro, на основе хитозана, отличающаяся тем, что она представляет собой хитозан в солевой форме, полученной при взаимодействии хитозана с органической кислотой, выбранной из аскорбиновой, или аспарагиновой, или аминокапроновой, или гликолевой кислоты при мольном соотношении хитозан: кислота 0,4:1,6.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU №2663794 «Добавление железа для улучшения культивирования клеток». Сущностью изобретения является способ повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток в среде для культивирования клеток, с помощью железа, в частности, высокой концентрации железа.
Недостатками всех вышеописанных аналогов является то, что все они включают в себя добавление определенных веществ к клеткам, что может сопровождаться нежелательными эффектами. Подбор концентрации и изучение влияния химических веществ на разные типы клеток должен производиться в индивидуальном порядке. Например, использование железа в высоких концентрациях для некоторых клеточных линий, предположительно, может отрицательно воздействовать на молекулярные процессы, происходящие в клетке.
Кроме того, еще одним недостатком использования дополнительных химических веществ может являться их влияние на биологическую активность опухолевых клеток, при моделировании 3D моделей опухоли и использовании их в скрининговых системах. Моделирование противоопухолевых ответов на исследуемое вещество с потенциальной противоопухолевой активностью, было изучено на примере птеростильбена, который сам по себе обладает противоопухолевой активностью [Obrador et al., Pterostilbene in Cancer Therapy. Antioxidants (Basel), 2021. 10(3): p. 1-17]. Хитозан используется для создания каркасов для культивирования клеток в качестве усилителя абсорбции, что также может сказываться на действие противоопухолевых препаратов [Babu and Ramesh, Multifaceted Applications of Chitosan in Cancer Drug Delivery and Therapy. Mar Drugs, 2017. 15(4): p. 1-19].
Также недостатками вышеперечисленных веществ может быть их стоимость, например, серицин-протеин шелка, сотканный из коконов тутового шелкопряда (Bombyx mori), может быть труднодоступным и дорогим, поэтому его использование при культивировании клеток в крупных масштабах, может носить ограниченный характер [Kaewkorn et al., Effects of silk sericin on the proliferation and apoptosis of colon cancer cells. Biol Res, 2012. 45(1): p. 45-50].
Техническим результатом заявленного технического решения является разработка способа, направленного на увеличение количества трехмерных опухолевых клеточных культур in vitro путем добавления индуцированных цитохалазином В мембранных везикул.
Сущностью заявленного решения является способ увеличения пролиферативного потенциала трехмерных опухолевых клеточных культур, заключающийся в том, что к культуре опухолевых клеток - сфероидов, индуцированных цитохалазином В, добавляют мембранные везикулы мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека. Способ по п.1, отличающийся тем, что мембранные везикулы мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека добавляют к культуре опухолевых клеток - сфероидов, полученных из коммерческих перевиваемых опухолевых клеточных линий. Способ по п.1, отличающийся тем, что мембранные везикулы мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека добавляют к культуре опухолевых клеток - сфероидов, полученных из первичных клеток биоптатов опухоли.
Заявленное техническое решение поясняется Фиг. 1 - Фиг.6.
На Фиг. 1 показаны иМВ МСК различного размера, выделенные с использованием цитохалазина B. Данные получены с помощью сканирующей электронной микроскопии (шкала 1 мкм, увеличение 10.00к х.).
На Фиг. 2 приведена Таблица, в которой показаны результаты мультиплексного анализа лизата иМВ МСК. Значения указаны в пкг на 1 мл.
На Фиг. 3 показаны сфероиды, культивированные в суспензии из опухолевых клеток аденокарциномы протоков молочной железы человека (MCF7). Фазово-контрастная микроскопия (шкала: 200 μm). А-Контрольная группа - сфероиды MCF7 без добавления иМВ МСК. Б-Опытная группа - сфероиды с добавлением иМВ МСК в концентрации 10 мкг.
На Фиг. 4 представлен график, показывающий количество сфероидов из клеток MCF7 после добавления иМВ МСК в концентрации 10 мкг. По оси X указан размер, образовавшихся сфероидов. По оси Y указано количество образовавшихся сфероидов. В качестве контроля использовались сфероиды без добавления иМВ МСК.
На Фиг.5 представлены графики, показывающие уровень экспрессии мРНК генов апоптоза: BAX, BCL-2, Caspase 3. Количество мРНК нормализовано по 18S-РНК. * - p <0.05.
На Фиг.6 представлены графики, показывающие уровень экспрессии мРНК генов стволовости и эпителиально-мезенхимного перехода: Ncad, Ecad, Sox2, Oct4. Количество мРНК нормализовано по 18S-РНК. * - p <0.05.
Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.
Поставленная цель и заявленный технический результат достигается путем добавления мембранных везикул к опухолевым клеткам при формировании сфероидов, что приводит к временному перепрограммированию клеток, устраняя тем самым ограничения в пролиферации клеток. Сливаясь с клетками-реципиентами, мембранные везикулы способны доставлять трофические факторы роста и нуклеиновые кислоты, которые поддерживают рост и пролиферацию опухолевых сфероидов.
Заявленное изобретение осуществляется в 3 этапа в нижеприведенной последовательности, а именно:
1 этап: Получение иМВ МСК человека с помощью цитохалазина В и оценка полученных иМВ (измерение концентрации, мультиплексный анализ, сканирующая электронная микроскопия);
2 этап: Получение опухолевых сфероидов и культивирование с иМВ МСК;
3 этап: Анализ эффективности влияния иМВ МСК на опухолевые сфероиды при стандартных условиях культивирования (ПЦР-РВ, количественный подсчет сфероидов).
Далее заявителем приведено подробное описание этапов осуществления заявленного технического решения.
1 этап: Получение иМВ МСК человека с помощью цитохалазина В.
Индуцированные микровезикулы из МСК жировой ткани человека получают путем обработки клеток раствором цитохалазина B и активному перемешиванию на вортексе 60 секунд. Мембранные везикулы отделяют от клеточного дебриса и ядер последовательным центрифугированием при 700 об/мин, 1400 об/мин и 12000 об/мин и фильтрованием (фильтр на 1 мкм).
Для определения морфологии и размера иМВ, выделенных из МСК, используют сканирующую электронную микроскопию. Пробоподготовка иМВ к сканирующей электронной микроскопии осуществляется по следующему протоколу.
Осадок иМВ растворяют в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и переносят и лунки 24х луночного культурального планшета, предварительно, положив на дно лунок культуральные стекла. Далее центрифугируют планшет при 3000 об/мин в течение 25 минут для осаждения иМВ МСК на культуральные стекла. Фиксация везикул происходит при комнатной температуре в течение 15 минут, с добавлением 10% формалина. Далее образец иМВ МСК дегидрируют в возрастающих концентрациях этилового спирта. Культуральные стекла высушивают и производят напыление проводящего слоя золото/палладий в вакуумной напылительной установке Quorum T150ES (Quorum Technologies, UK). После процедуры напыления пробы помещаются в автоэмиссионный сканирующий электронный микроскоп Merlin (Carl Zeiss, Германия) и проводят анализ.
Метод определения концентрации везикул происходит по белку и заключается в добавлении лизирующего раствора (50мМ Tris-HCl pH 7.4, 1% NP 40, 0,5% дезоксихалата натрия, 0,1% ДСН, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА) и ингибитор протеаз - PMSF (фенилметилсульфонилфторид) к осадку иМВ МСК до конечной концентрации 1мМ. Далее перемешивают везикулы в лизирующем растворе и инкубируют на льду 20 минут. Для измерения концентрации тотального белка, используют коммерческий набор Pierce™ BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific, США). Для приготовления рабочего раствора, смешивают Реагент А (раствор, содержащий бицинхониновую кислоту, карбонат натрия, тартрат натрия, бикарбонат натрия в 0,1н NaOH pH 11,25) и Реагент Б (4% CuSO4 x 5H2O) в соотношении 50:1. Смешивание образца и рабочего раствора происходит в соотношении 25 к 200 мкл. Смесь инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Уровень абсорбции измеряется при длине волны 562 нм.
Концентрации белка в исследуемых образцах определяется с помощью построения калибровочной кривой на основании разведения белка бычьего сывороточного альбумина с известной концентрацией белка.
Для определения цитокинового профиля лизатов, полученных из иМВ, используют мультиплексный анализ цитокинов/хемокинов и факторов роста. Используется набор Bio-Plex Pro Human Chemokine 40-plex Panel (Cat. #171AK99MR2, Bio-Rad), который позволяет одновременно детектировать 40 аналитов: 6Ckine/CCL21, BCA-1/CXCL13, CTACK/CCL27, ENA-78/CXCL5, Eotaxin/CCL11, Eotaxin-2/CCL24, Eotaxin-3/CCL26, Fractalkine/CX3CL1, GCP-2/CXCL6, GMCSF, Gro-alpha/CXCL1, Gro-beta/CXCL2, I-309/CCL1, IFN-gamma, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8/CXCL8, IL-10, IL-16, IP10/CXCL10, I-TAC/CXCL11, MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, MDC/CCL22, MIF, MIG/CXCL9, MIP1alpha/CCL3, MIP-1delta/CCL15, MIP-3alpha/CCL20, MIP-3beta/CCL19, MPIF-1/CCL23, SCYB16/CXCL16, SDF1alpha+beta/CXCL12, TARC/CCL17, TECK/CCL25, TNF-alpha.
2 этап: Получение опухолевых сфероидов.
Для создания сфероидов используются клетки MCF7, полученные из Американской коллекции типовых клеточных культур (ATCC HTB-22). Данные клетки из расчета 1000 клеток на лунку культивируют на 24х луночном планшете предварительно покрытым 1% агарозой. Сфероиды культивируются в питательной среде, например DMEM/F12 (производства фирмы ПанЭко, Россия), L-глутамин (ПанЭко, Россия) смесь антибиотиков пенициллин-стрептомицин (производства фирмы Биолот, Россия), добавка B27 (Sigma, США), фактор роста фибробластов 20 нг/мл (Sigma, США), эпидермальный фактор роста 20 нг/мл (Sigma, США) при температуре 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Добавление иМВ МСК происходит после 4-х часов культивирования клеток в планшете. В исследовании используется концентрации 10 мкг иМВ МСК на 500 мкл среды. Клетки с иМВ МСК культивируются 96 часов, после чего проводится оценка влияния иМВ МСК на формирование сфероидов.
3 этап: Анализ эффективности влияния иМВ МСК на опухолевые сфероиды.
Влияние иМВ МСК на экспрессию генов опухолевых сфероидов оценивается с помощью полимеразной цепной реакции реального времени (ПЦР-РВ) на приборе CFX 96 Real-Time System (Bio-Rad, США) c использованием программного обеспечения BioRad CFX Manager и GraphPad Prism 7 (GraphPad Software). В образцах опухолевых сфероидов после культивирования их с иМВ МСК исследуется экспрессия генов, участвующих в индукции апоптоза (BAX, BCL-2, Caspase 3), придании клеткам свойств стволовости (Sox2, Oct4) и ЭМП (E-cadherin, N-cadherin).
ПЦР-РВ проводят по методике, включающей праймеры и геноспецифический ДНК-зонд (FAM). Реакционная смесь для ПЦР-РВ включает: ДНК-матрица, 2.5Х реакционная смесь, прямой и обратный праймеры и проба. Амплификацию проводят при режиме: 95 °С - 3 мин, 39 циклов; 95 °C - 10 сек, 44 цикла; 55 °C - 30 сек, 44 цикла. Количество мРНК нормализуют по гену 18S.
Для изучения влияния иМВ МСК на изменения количества опухолевых сфероидов в суспензии проводят их подсчет на 4 сутки культивирования с помощью инвертированного микроскопа AxyObserver.Z1 (Carl Zeiss, Германия). Для подсчета сфероидов, их собирают и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант удаляют, а к осадку добавляли 100 мкл ФСБ. После аккуратного перемешивания, сфероиды переносят в 96ти луночный планшет и проводят подсчет.
Результаты, описанные на Этапах 1 - 3, приведены на Фиг. 1 - Фиг.6.
Из данных, приведенных на Фиг. 1, видно, что метод выделения иМВ МСК позволяет получать стабильную по размерам фракцию, состоящую из округлых клеточных компонентов, окруженных мембранной. Кроме того, полученная фракция не содержит клеточных остатков.
Из данных, приведенных в Таблице на Фиг.2, видно наличие выраженных цитокинов и хемокинов в иМВ МСК. Наибольшая концентрация была отмечена для следующих цитокинов: MCP-1, TARC, IFNg, IL-2, IL4, CTACK, MDC, MIP-1b, MIP-3a, MIP-3b.
Из данных, приведенных на Фиг. 3 и Фиг. 4, видно, что культивирование клеток MCF7 с иМВ МСК приводит к увеличению количества опухолевых сфероидов при добавлении иМВ МСК. По графику видно, что при 10 мкг иМВ МСК происходит наибольшее увеличение количества сфероидов размером от 50 до 100 мкм. Кроме того, на дату подачи настоящей заявки влияние иМВ МСК на опухолевые сфероиды находится на стадии дальнейших испытаний, однако уже на данной стадии исследований возможно констатировать факт того, что иМВ МСК влияют на пролиферативный потенциал опухолевых клеток и изменяют количественный показатель сфероидов in vitro.
Из данных, приведенных на Фиг. 5, видно, что при культивировании сфероидов MCF7 в суспензии можно говорить о снижении экспрессии таких апоптозных генов, как BAX и BCL-2 при культивировании сфероидов с 10 мкг иМВ МСК. Было выявлено, что экспрессия каспазы 3 значительно снижена при добавлении 10 мкг иМВ МСК по сравнению с контролем.
Из данных, приведенных на Фиг. 6, видно, что при культивировании сфероидов с иМВ МСК отсутствует значительное расхождение между экспрессией генов Е-кадгерин и N-кадгерин, что может свидетельствовать об отсутствие ЭМП. Кроме того, отсутствует достоверное отличие в экспрессии гена стволовости SOX2 между группами, тогда как экспрессия гена стволовости OCT4 значительно возрастает при добавлении 10 мкг иМВ МСК.
Таким образом, графические материалы, иллюстрирующие примеры конкретного выполнения заявленного технического решения, доказывают возможность достижения заявленных технических результатов, а именно:
- добавление цитохалазина B, последовательное центрифугирование и фильтрация способствуют выделению иМВ МСК, обладающих округлой формой без включения клеточных остатков.
- мультиплексный анализ показывает наличие в иМВ МСК цитокинов/хемокинов и факторов роста.
- добавление иМВ МСК к опухолевым клеткам увеличивает количество образующихся сфероидов в суспензионной культуре, что, предположительно, доказывает, роль иМВ МСК в пролиферации опухолевых клеток.
- иМВ МСК не влияют на жизнеспособность опухолевых клеток в концентрации 10 мкг.
- иМВ МСК не влияют на процесс эпителиально-мезенхимного перехода (ЭМП), но, предположительно, запускают экспрессию гена OCT4, который является транскрипционным фактором, играющим роль в регуляции роста опухолевых стволовых клеток.
Таким образом, из вышеизложенного можно сделать общий вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно - разработан способ увеличения количества трехмерных опухолевых клеточных культур in vitro путем добавления индуцированных цитохалазином В мембранных везикул.
Заявленное техническое решение изобретение удовлетворяет условию патентоспособности «новизна», так как впервые для повышения количества опухолевых сфероидов будут использоваться индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы, выделенные из МСК жировой ткани человека.
Заявленное техническое решение изобретение удовлетворяет условию патентоспособности «изобретательский уровень», так как конкурентным преимуществом использования иМВ МСК по сравнению с описанными по тексту аналогами являются их особенности. иМВ МСК способны переносить различные факторы роста. Кроме того, мембрана иМВ МСК включает в себя такие компоненты как холестерин, сфингомиелин, гликосфинголипиды и фосфатидилсерины. Эти компоненты поддерживают стабильность этих структур, защищая содержимое везикул от деградации [Choi et al., Proteomics of extracellular vesicles: Exosomes and ectosomes. Mass Spectrom Rev, 2015. 34(4): p. 474-490]. Таким образом, иМВ МСК являются стабильными, устойчивыми структурами, которые имеют естественный барьер, предотвращающий их разрушение, что способствует доставке биологически активных молекул в реципиентные клетки.
Кроме того, мембрана иМВ МСК также включает в себя рецепторные белки, которые будут способствовать слиянию иМВ МСК и клеток [Mulcahy et al., Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles, 2014. 3: p. 1-14]. Таким образом, преимуществом использования иМВ МСК является возможность их естественного слияния с клетками, без необходимости дополнительного стимулирования слияния, например, электропарация (создание пор в мембране под действием электрического поля), при использовании которой происходит повреждение клеток.
Заявленное техническое решение изобретение удовлетворяет условию патентоспособности «промышленная применимость», так как иМВ отличаются от естественных везикул только методом получения. Поскольку клетки выделяют естественные везикулы в ограниченном количестве, применение специальных веществ (цитохалазин B) будет способствовать увеличению выхода иМВ. Характеристики же иМВ, включая размер, иммунофенотип, молекулярный состав и, главное, способность переносить необходимые молекулярные компоненты, не отличаются от естественных везикул [Gomzikova et al., Evaluation of Cytochalasin B-Induced Membrane Vesicles Fusion Specificity with Target Cells. Biomed Res Int, 2018. p. 1-6]. Кроме того, иМВ подлежат лиофилизации и хранению. Таким образом, препарат иМВ отвечает критерию «промышленная применимость», предъявляемого к изобретениям.
Claims (1)
- Способ увеличения пролиферативного потенциала трёхмерных опухолевых клеточных культур, заключающийся в том, что к культуре клеток аденокарциномы протоков молочной железы человека – сфероидам добавляют индуцированные цитохалазином B мембранные везикулы мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани человека в количестве 10 мкг.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2782600C1 true RU2782600C1 (ru) | 2022-10-31 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2711920C1 (ru) * | 2019-05-27 | 2020-01-24 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" | Добавка для культивирования эпителиальных клеток |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2711920C1 (ru) * | 2019-05-27 | 2020-01-24 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" | Добавка для культивирования эпителиальных клеток |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HWANG J. et al., Cytochalasin B induces apoptosis through the mitochondrial apoptotic pathway in HeLa human cervical carcinoma cells, Oncology reports, 2013, Vol. 30, Issue 4, pp. 1929-1935, https://doi.org/10.3892/or.2013.2617. Chulpanova D.S. et al., Cytochalasin B-Induced Membrane Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells Overexpressing IL2 Are Able to Stimulate CD8 + T-Killers to Kill Human Triple Negative Breast Cancer Cells, Biology (Basel), 2021 Feb., 10, 10(2), 141, doi: 10.3390/biology10020141. ГОМЗИКОВА М.О. и др. Исследование свойств мембранных везикул, полученных с помощью цитохалазина В из клеток человека НЕК293, Гены & клетки, 2015, Том X, No. 3, с. 27-32. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Miserocchi et al. | Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies | |
An et al. | Exosomes from adipose-derived stem cells (ADSCs) overexpressing miR-21 promote vascularization of endothelial cells | |
Medina et al. | Myeloid angiogenic cells act as alternative M2 macrophages and modulate angiogenesis through interleukin-8 | |
Rani et al. | Prostate cancer: the role of inflammation and chemokines | |
Larsen et al. | Collagen density modulates the immunosuppressive functions of macrophages | |
Salo et al. | A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies | |
Seike et al. | Interaction between lung cancer cells and astrocytes via specific inflammatory cytokines in the microenvironment of brain metastasis | |
Bi et al. | Tumor-on-a-chip platform to interrogate the role of macrophages in tumor progression | |
Balkwill | Cancer and the chemokine network | |
Chung et al. | Human brain metastatic stroma attracts breast cancer cells via chemokines CXCL16 and CXCL12 | |
Guo et al. | CXCL12-CXCR4 axis promotes proliferation, migration, invasion, and metastasis of ovarian cancer | |
Xu et al. | Enrichment of cancer stem cell-like cells by culture in alginate gel beads | |
US20210102170A1 (en) | Tissue-engineered three-dimensional model for tumor analysis | |
Rabe et al. | Tumor extracellular vesicles regulate macrophage-driven metastasis through CCL5 | |
He et al. | Honeycomb-like hydrogel microspheres for 3D bulk construction of tumor models | |
Chang et al. | Mesenchymal stem cells over-expressing cxcl12 enhance the radioresistance of the small intestine | |
Li et al. | Knockdown of IL-8 provoked premature senescence of placenta-derived mesenchymal stem cells | |
Sioud et al. | NOD2/CARD15 on bone marrow CD34+ hematopoietic cells mediates induction of cytokines and cell differentiation | |
Humbert et al. | Apoptotic mesenchymal stromal cells support osteoclastogenesis while inhibiting multinucleated giant cells formation in vitro | |
Sadovska et al. | Effects of urinary extracellular vesicles from prostate cancer patients on the transcriptomes of cancer-associated and normal fibroblasts | |
RU2782600C1 (ru) | Способ увеличения пролиферативного потенциала трехмерных опухолевых клеточных культур | |
Liu et al. | Screening differentially expressed proteins from co-cultured hematopoietic cells and bone marrow-derived stromal cells by quantitative proteomics (SILAC) method | |
Donnenberg et al. | A maladaptive pleural environment suppresses preexisting anti-tumor activity of pleural infiltrating T cells | |
Bandow et al. | CC chemokine ligand 20 (CCL20) positively regulates collagen type I production in 3D skin equivalent tissues | |
Wang et al. | Modification of chemokine receptor expression to enhance levels of trafficking receptors on autologous cytokine-induced killer cells derived from patients with colorectal cancer |