RU2782223C2 - Composition for induction of specific immunological tolerance - Google Patents
Composition for induction of specific immunological tolerance Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782223C2 RU2782223C2 RU2017139244A RU2017139244A RU2782223C2 RU 2782223 C2 RU2782223 C2 RU 2782223C2 RU 2017139244 A RU2017139244 A RU 2017139244A RU 2017139244 A RU2017139244 A RU 2017139244A RU 2782223 C2 RU2782223 C2 RU 2782223C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- composition
- peptide
- protein
- cells
- erythrocytes
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title description 2
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 claims abstract description 141
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims description 55
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims description 55
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 claims description 43
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 36
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 claims description 34
- 230000000236 ionophoric Effects 0.000 claims description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 29
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims description 25
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 23
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 15
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 claims description 14
- 206010003816 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 12
- 201000009596 autoimmune hypersensitivity disease Diseases 0.000 claims description 12
- 206010039073 Rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 10
- 230000000770 pro-inflamatory Effects 0.000 claims description 10
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 8
- 210000000612 Antigen-Presenting Cells Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 7
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 claims description 5
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 claims description 5
- 230000002132 lysosomal Effects 0.000 claims description 5
- 102100005117 IGF2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101700070236 IGF2 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001965 increased Effects 0.000 claims description 4
- 229940068935 insulin-like growth factor 2 Drugs 0.000 claims description 4
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 claims description 4
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 4
- 102100006624 F9 Human genes 0.000 claims description 3
- 201000005603 Fabry disease Diseases 0.000 claims description 3
- 102100008255 GAA Human genes 0.000 claims description 3
- 101710010383 GAA Proteins 0.000 claims description 3
- 210000000865 Mononuclear Phagocyte System Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000003916 Arrestin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000328 Arrestin Proteins 0.000 claims description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 2
- 206010011401 Crohn's disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102100009906 F7 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 2
- 229960000301 Factor VIII Drugs 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 206010019315 Heart transplant rejection Diseases 0.000 claims description 2
- 206010021972 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010023439 Kidney transplant rejection Diseases 0.000 claims description 2
- 206010024715 Liver transplant rejection Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002678 Mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028417 Myasthenia gravis Diseases 0.000 claims description 2
- 102000015528 Myelin Basic Protein Human genes 0.000 claims description 2
- 108010025255 Myelin Basic Protein Proteins 0.000 claims description 2
- UNJJBGNPUUVVFQ-ZJUUUORDSA-N Phosphatidylserine Chemical compound CCCC(=O)O[C@H](COC(=O)CC)COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O UNJJBGNPUUVVFQ-ZJUUUORDSA-N 0.000 claims description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 2
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 2
- 102000034433 acetylcholine receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108020000715 acetylcholine receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims description 2
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960004222 factor IX Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012413 factor VII Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 229960002486 laronidase Drugs 0.000 claims description 2
- 201000004681 psoriasis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006704 ulcerative colitis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 claims 4
- 229940019700 Blood coagulation factors Drugs 0.000 claims 1
- 102100008175 MGAM Human genes 0.000 claims 1
- 101700048951 VSPDV Proteins 0.000 claims 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 abstract 2
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 54
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 33
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N Bissulfosuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 31
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 26
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 26
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 229940092253 Ovalbumin Drugs 0.000 description 24
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 24
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 24
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 21
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 19
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 19
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 18
- LAZPBGZRMVRFKY-HNCPQSOCSA-N Levamisole hydrochloride Chemical compound Cl.C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 LAZPBGZRMVRFKY-HNCPQSOCSA-N 0.000 description 17
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 101700064140 FOXP3 Proteins 0.000 description 16
- 102100011855 FOXP3 Human genes 0.000 description 16
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 16
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 229960001031 Glucose Drugs 0.000 description 14
- 101700082799 IL2RA Proteins 0.000 description 14
- 101700015336 ISG20 Proteins 0.000 description 14
- 102100002950 ISG20 Human genes 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 13
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 13
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 12
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 12
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 12
- 101710024753 SERPINB14 Proteins 0.000 description 12
- 229940076144 Interleukin-10 Drugs 0.000 description 11
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 9
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 9
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 9
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 7
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 7
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 7
- 210000003547 Hepatic macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 101710006689 ITGAX Proteins 0.000 description 6
- 102100019437 ITGAX Human genes 0.000 description 6
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 6
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 6
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 5
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 5
- 210000001865 Kupffer Cells Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002440 hepatic Effects 0.000 description 5
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000003614 tolerogenic Effects 0.000 description 5
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M Sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 230000000172 allergic Effects 0.000 description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- SPFMQWBKVUQXJV-QGROCUHESA-N (2S,3R,4S,5S)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;hydrate Chemical compound O.OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O SPFMQWBKVUQXJV-QGROCUHESA-N 0.000 description 2
- PITMOJXAHYPVLG-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxybenzoic acid;N-(4-ethoxyphenyl)acetamide;1,3,7-trimethylpurine-2,6-dione Chemical compound CCOC1=CC=C(NC(C)=O)C=C1.CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O.CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C PITMOJXAHYPVLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HIYAVKIYRIFSCZ-CYEMHPAKSA-N 5-(methylamino)-2-[[(2S,3R,5R,6S,8R,9R)-3,5,9-trimethyl-2-[(2S)-1-oxo-1-(1H-pyrrol-2-yl)propan-2-yl]-1,7-dioxaspiro[5.5]undecan-8-yl]methyl]-1,3-benzoxazole-4-carboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H](C)[C@H]1O[C@@]2([C@@H](C[C@H]1C)C)O[C@@H]([C@@H](CC2)C)CC=1OC2=CC=C(C(=C2N=1)C(O)=O)NC)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-CYEMHPAKSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 2
- 230000037177 Biodistribution Effects 0.000 description 2
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 2
- 206010018651 Graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 2
- 206010061992 Haemophilia Diseases 0.000 description 2
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 2
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 2
- 101710006572 ITGAM Proteins 0.000 description 2
- 102100019441 ITGAM Human genes 0.000 description 2
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 2
- 108090001095 Immunoglobulin G Proteins 0.000 description 2
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N Inosine Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229940054269 Sodium Pyruvate Drugs 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 description 2
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 2
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 2
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- -1 0.09% Substances 0.000 description 1
- SNTGWXAZMZPJPH-UHFFFAOYSA-N 1-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)N1ON1C(=O)CCC1=O SNTGWXAZMZPJPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-N,N-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022705 Aldurazyme Drugs 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 208000003455 Anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 108060007869 BAH1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-Positive T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102100005552 CR1 Human genes 0.000 description 1
- 101700042195 CR1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- SBJKKFFYIZUCET-JLAZNSOCSA-N Dehydro-L-ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(=O)C1=O SBJKKFFYIZUCET-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 206010053430 Erythrophagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102100000368 F8 Human genes 0.000 description 1
- 101700070229 F8 Proteins 0.000 description 1
- 101700074227 F9 Proteins 0.000 description 1
- 102100008634 FGF2 Human genes 0.000 description 1
- 101700082364 FGF2 Proteins 0.000 description 1
- 229940014516 Fabrazyme Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylases Human genes 0.000 description 1
- 108091022086 Glutamate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 208000009429 Hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 229940027941 Immunoglobulin G Drugs 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 229940047122 Interleukins Drugs 0.000 description 1
- 206010024579 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028093 Mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 description 1
- 229940103023 Myozyme Drugs 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 208000008425 Protein Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000000400 T-Lymphocytes, Cytotoxic Anatomy 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 108010049936 agalsidase alfa Proteins 0.000 description 1
- 229960001239 agalsidase alfa Drugs 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000012970 cakes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 201000003542 factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000003571 opsonizing Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000090 phagocyte Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Данное изобретение относится к композиции, которая вызывает, у хозяина, иммунологическую толерантность к пептидным или белковым действующим агентам, в частности, терапевтическим пептидам, полипептидам или белкам, пептидным или белковым аутоантигенам, пептидам, полипептидам или белкам, вызывающим аллергическую реакцию, или трансплантационным пептидным или белковым антигенам. Изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, включая человека.This invention relates to a composition which induces, in the host, immunological tolerance to peptide or protein active agents, in particular therapeutic peptides, polypeptides or proteins, peptide or protein autoantigens, peptides, polypeptides or proteins that cause an allergic reaction, or transplantation peptide or protein antigens. The invention also relates to a method for treating a mammal, including a human.
Известно, что печень содействует вызову иммунной толерантности. Это представлено толеризацией пищевых антигенов в печени и приживляемостью аллотрансплантатов печени. Также была продемонстрирована некоторая антиген-специфическая толерантность к некоторым чужеродным антигенам, попадающим в печень. У E. Breous et al., Hepatology, August 2009, стр. 612-621, описано, что печеночные регулирующие Т-клетки и клетки Купфера являются ключевыми медиаторами толерантности системных Т-клеток к антигенам, поражающим печень мыши. Описано, что в модели связанной с печенью передачи генов, реакции цитотоксических T-лимфоцитов на «не свои» антигены контролируются печеночными регулирующими Т-клетками, которые выделяют иммунодепрессивный цитокиновый интерлейкин IL-10 в ответ на антиген. Кроме того, клетки Купфера являются скорее толерогенными, чем создают иммунную реакцию в этом контексте.It is known that the liver contributes to the induction of immune tolerance. This is represented by tolerization of food antigens in the liver and engraftment of liver allografts. Some antigen-specific tolerance to some foreign antigens entering the liver has also been demonstrated. E. Breous et al., Hepatology, August 2009, pp. 612-621, describe that hepatic regulatory T cells and Kupffer cells are key mediators of systemic T cell tolerance to mouse liver-damaging antigens. In a liver-associated gene transfer model, cytotoxic T-lymphocyte responses to non-self antigens have been described as being controlled by hepatic regulatory T cells that secrete the immunosuppressive cytokine interleukin IL-10 in response to the antigen. In addition, Kupffer cells are tolerogenic rather than creating an immune response in this context.
Толерогенная роль клеток Купфера также описана у C. Ju et al., Chem. Res. Toxicol. 2003, 16:1514-1519. См. также A.H. Lau et al., Gut 2003, 52:1075-1078.The tolerogenic role of Kupffer cells is also described in C. Ju et al., Chem. Res. Toxicol. 2003, 16:1514-1519. See also A.H. Lau et al., Gut 2003, 52:1075-1078.
Целью данного изобретения является получение композиций, которые могут применяться для вызова иммунной толерантности к множеству пептидных или белковых активных агентов. В частности, его целью является получение специфической иммунной толерантности в отношении одного или нескольких пептидных или белковых активных агентов.The aim of this invention is to provide compositions that can be used to induce immune tolerance to a variety of peptide or protein active agents. In particular, its purpose is to obtain specific immune tolerance against one or more peptide or protein active agents.
Объектом данного изобретения, поэтому является композиция, которая вызывает, у хозяина, иммунной толерантности к пептидному или белковому активному агенту, где указанная композиция содержит эритроциты, содержащие указанный активный агент. Этим активным агентом может быть терапевтический пептид, полипептид или белок, пептидный или белковый аутоантиген, пептид, полипептид или белок, вызывающий аллергическую реакцию, или трансплантационный пептидный или белковый антиген, и их смеси.The object of the present invention, therefore, is a composition which induces, in the host, immune tolerance to a peptide or protein active agent, wherein said composition comprises red blood cells containing said active agent. The active agent may be a therapeutic peptide, polypeptide or protein, a peptide or protein self-antigen, an allergic peptide, polypeptide or protein, or a transplantation peptide or protein antigen, and mixtures thereof.
Активный агент может быть природного, синтетического или рекомбинантного происхождения. Термин "содержащая" молекула означает молекулы, которые содержат целевой пептид, полипептид или белок, и другую группу, которая может быть любого происхождения и не вредит действию указанного пептида, полипептида или белка. Например, такая группа включает гаптены.The active agent may be of natural, synthetic or recombinant origin. The term "comprising" a molecule means molecules that contain the target peptide, polypeptide or protein, and another group, which can be of any origin and does not interfere with the action of the specified peptide, polypeptide or protein. For example, such a group includes haptens.
Не претендуя на теорию, считается, что композиция в соответствии с данным изобретением индуцирует антиген(ы)-специфические Т-клетки (Tregs) и образует иммунодепрессивные цитокины или интерлейкины, в частности, IL-10.Without wishing to be bound by theory, it is believed that the composition of the present invention induces antigen(s)-specific T cells (Tregs) and produces immunosuppressive cytokines or interleukins, in particular IL-10.
Биологически и/или биотехнологически полученные пептиды, полипептиды или белки все чаще применяют в качестве терапевтических агентов. Однако было обнаружено, что эти агенты могут вызывать гуморальные и/или клеточные иммунные реакции. Последствия иммунной реакции на такой терапевтический агент варьируется от переходного возникновения антител без какой-либо клинической значимости, до тяжелых, угрожающих жизни состояний. Потенциальные клинические последствия включают тяжелые реакции гиперчувствительности, снижение эффективности и стимулирование аутоиммунности, включая антитела к эндогенной форме пептида, полипептида или белка (European Medicines Agency, Committee for Medicinal products for human use (CHMP), Guidelines on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins, Draft, London, 24 January 2007).Biologically and/or biotechnologically derived peptides, polypeptides or proteins are increasingly used as therapeutic agents. However, it has been found that these agents can induce humoral and/or cellular immune responses. The consequences of an immune response to such a therapeutic agent range from transient antibody development without any clinical significance to severe, life-threatening conditions. Potential clinical consequences include severe hypersensitivity reactions, reduced efficacy, and induction of autoimmunity, including antibodies to the endogenous form of the peptide, polypeptide, or protein (European Medicines Agency, Committee for Medicinal products for human use (CHMP), Guidelines on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins , Draft, London, 24 January 2007).
Терапевтический пептид, полипептид или белок определяется как молекула, содержащая пептид, полипептид или белок, которая эффективна для лечения патологии, особенно патологии вследствие дефицита, которая может быть скорректирована введением этой молекулы.A therapeutic peptide, polypeptide or protein is defined as a molecule containing a peptide, polypeptide or protein that is effective in the treatment of a pathology, especially pathology due to deficiency, which can be corrected by the administration of this molecule.
В одном варианте, терапевтическим пептидом, полипептидом или белком является антитело. Включен любой его фрагмент.In one embodiment, the therapeutic peptide, polypeptide, or protein is an antibody. Any part of it is included.
В другом варианте, терапевтическим пептидом, полипептидом или белком является фактором коагуляции. Включен любой его фрагмент.In another embodiment, the therapeutic peptide, polypeptide, or protein is a coagulation factor. Any part of it is included.
В другом варианте, терапевтическим пептидом, полипептидом или белком является фермент. Включен любой его фрагмент. In another embodiment, the therapeutic peptide, polypeptide, or protein is an enzyme. Any part of it is included.
В другом варианте, терапевтическим пептидом, полипептидом или белком является фактор роста. Включен любой его фрагмент. In another embodiment, the therapeutic peptide, polypeptide, or protein is a growth factor. Any part of it is included.
Термин «фрагмент» включает любой фрагмент пептида, полипептида или белка, который является эффективным для лечения связанной патологии вместо полной молекулы.The term "fragment" includes any fragment of a peptide, polypeptide or protein that is effective for the treatment of an associated pathology instead of a complete molecule.
Гликозилированные формы также включены в эти определения. В одном варианте, активным агентом является лизосомальный фермент. Лизосомальным ферментом является такой, который применяют для лечения или корректировки лизосомной болезни накопления через заместительную терапию ферментами (ЗТФ), включая болезнь Помпе (генерализованный гликогеноз II типа), Болезнь Фабри и расстройства мукополисахаридоза МПС I. В качестве примеров можно назвать:Glycosylated forms are also included in these definitions. In one embodiment, the active agent is a lysosomal enzyme. A lysosomal enzyme is one that is used to treat or correct lysosomal storage disease through enzyme replacement therapy (ETF), including Pompe disease (generalized glycogenosis type II), Fabry disease, and MPS I mucopolysaccharidosis disorders. Examples include:
- фермент альфаглюкозидазы, например, Myozyme® для лечения болезни Помпе;- an alpha-glucosidase enzyme, such as Myozyme® for the treatment of Pompe disease;
- ларонидазу, например, Aldurazyme® для лечения МПС I;- laronidase, for example, Aldurazyme® for the treatment of MPS I;
- альфагалактозидазу A или агальзидазу альфа, например, Fabrazyme® и Replagal® для лечения болезни Фабри.- alphagalactosidase A or agalsidase alfa, such as Fabrazyme® and Replagal® for the treatment of Fabry's disease.
В другом варианте, активным агентом является фактор коагуляции, применяемый при лечении гемофилии. Фактором коагуляции может быть Фактор Factor VIII, в частности, для лечения гемофилии A. Фактором коагуляции может быть Фактор IX, в частности, для лечения гемофилии B. Фактором коагуляции может быть Фактор VII для лечения обоих типов гемофилии.In another embodiment, the active agent is a coagulation factor used in the treatment of hemophilia. The coagulation factor may be Factor VIII, in particular for the treatment of hemophilia A. The coagulation factor may be Factor IX, in particular for the treatment of hemophilia B. The coagulation factor may be Factor VII for the treatment of both types of hemophilia.
Пептидный или белковый аутоантиген определяют как антиген, который является обычной составляющей ткани и у пациента является целью причиняющей вред гуморальной или медиированной клетками иммунной реакции, как в случае аутоиммунной болезни.A peptide or protein self-antigen is defined as an antigen that is a normal tissue constituent and is the target of a deleterious humoral or cell-mediated immune response in a patient, as in the case of an autoimmune disease.
В одном варианте, активный агент действует против ревматоидного артрита (РА).In one embodiment, the active agent acts against rheumatoid arthritis (RA).
В другом варианте, активный агент действует против рассеянного склероза (РС). Например, активным агентом является миелиновый основной белок.In another embodiment, the active agent acts against multiple sclerosis (MS). For example, the active agent is myelin basic protein.
В другом варианте, активный агент действует против юношеского диабета, такого как диабет 1 типа и ЛАДВ (латентный аутоиммунный диабет взрослых). В качестве примеров могут быть указаны антиген бета-клетки, в частности, декарбоксилаза глутаминовой кислоты (ДГК), про-инсулин и инсулиноподобный фактор роста-2 (ИФР2), и их смеси.In another embodiment, the active agent acts against juvenile diabetes, such as type 1 diabetes and LADD (latent adult autoimmune diabetes). Examples which may be mentioned are beta cell antigen, in particular glutamic acid decarboxylase (DHA), pro-insulin and insulin-like growth factor-2 (IGF2), and mixtures thereof.
В другом варианте, активный агент действует против увеита. Может быть указан сетчаточный S антиген.In another embodiment, the active agent acts against uveitis. The retinal S antigen may be indicated.
В другом варианте, активный агент действует против воспалительного заболевания толстого кишечника (ВЗТК), такого как болезнь Крона и язвенный колит.In another embodiment, the active agent acts against inflammatory bowel disease (IDD) such as Crohn's disease and ulcerative colitis.
В другом варианте активный агент действует против системной красной волчанки.In another embodiment, the active agent acts against systemic lupus erythematosus.
В другом варианте, активный агент действует против псориаза.In another embodiment, the active agent acts against psoriasis.
В другом варианте, активный агент действует против приобретенной миастении гравис. В качестве примера можно указать рецептор ацетилхолина.In another embodiment, the active agent acts against acquired myasthenia gravis. An example is the acetylcholine receptor.
Пептид, полипептид или белок, вызывающий аллергическую реакцию определяется как пептид, полипептид или белок, который отвечает за аллергическую реакцию у хозяина, где реакция может включать анафилактический шок.An allergic peptide, polypeptide, or protein is defined as a peptide, polypeptide, or protein that is responsible for an allergic reaction in a host, where the reaction may include anaphylactic shock.
В одном варианте, таким пептидом, полипептидом или белком, вызывающим аллергическую реакцию, является терапевтический активный пептид, полипептид или белок, указанный выше, где данное изобретение позволяет избежать некоторых или всех аллергических реакций против них и нейтрализовать их.In one embodiment, such an allergic peptide, polypeptide, or protein is a therapeutically active peptide, polypeptide, or protein as defined above, wherein the invention avoids and neutralizes some or all of the allergic reactions against them.
В другом варианте, пептид, полипептид или белок, вызывающий аллергическую реакцию, имеет пищевое происхождение или может быть любой другой белковой или пептидной молекулой, которая может попадать в кровоток и создавать аллергическую реакцию, например, после перорального проглатывания.In another embodiment, the peptide, polypeptide, or protein causing the allergic reaction is of food origin, or may be any other protein or peptide molecule that can enter the bloodstream and cause an allergic reaction, for example, after oral ingestion.
Трансплантационный пептидный или белковый антиген определяется как антиген, который представлен трансплантированной тканью и вовлечен в отторжение трансплантата пациентом, например, болезнь «трансплантат против хозяина» (ТПХ).A transplantation peptide or protein antigen is defined as an antigen that is presented by transplanted tissue and is involved in transplant rejection by a patient, such as graft-versus-host disease (GVHD).
В одном варианте, трансплантационный антиген вовлечен в отторжение трансплантата почек.In one embodiment, the transplantation antigen is involved in kidney transplant rejection.
В одном варианте, трансплантационный антиген вовлечен в отторжение трансплантата сердца.In one embodiment, the transplantation antigen is involved in heart transplant rejection.
В одном варианте, трансплантационный антиген вовлечен в отторжение трансплантата печени.In one embodiment, the transplantation antigen is involved in liver transplant rejection.
Термин "хозяин" относится, предпочтительно, к человеку, но также к животным, в частности домашним животным (особенно собакам и кошкам) и животным для спорта (особенно лошадям).The term "host" preferably refers to a human, but also to animals, in particular pets (especially dogs and cats) and sport animals (especially horses).
В соответствии с данным изобретением, эритроциты содержат, т.е. инкапсулируют, активный агент (АА), что означает, что АА находится практически внутри эритроцитов.In accordance with the present invention, erythrocytes contain, i. encapsulate, the active agent (AA), which means that AA is located practically inside the red blood cells.
В одном варианте, композиция направлена на антигенпрезентирующие клетки (АПК) ретикулоэндотелиальной системы. Согласно характеристике, эритроциты создают, выбирают или модифицируют таким образом, чтобы нацелить их на антигенпрезентирующие клетки (АПК) ретикулоэндотелиальной системы.In one embodiment, the composition is directed to antigen presenting cells (APCs) of the reticuloendothelial system. By characterization, erythrocytes are designed, selected, or modified to target antigen-presenting cells (APCs) of the reticuloendothelial system.
В предпочтительном варианте, композиция нацелена на печень и, особенно, клетки Купфера. Согласно характеристике, эритроциты создают, выбирают или модифицируют таким образом, чтобы нацелить их на печень. Доставка АА в печень стимулирует толерантность печени к АА, особенно АА-специфическую толерантность. Толерогенные АПК печени вовлечены в стимулирование такой толерантности. Эти клетки включают, в основном, клетки Купфера (КК), не зрелые печеночные дендритные клетки и синусоидальные эндотелиальные клетки печени.In a preferred embodiment, the composition targets the liver and especially Kupffer cells. According to the characterization, erythrocytes are created, selected or modified in such a way as to target them to the liver. Delivery of AA to the liver stimulates liver tolerance to AA, especially AA-specific tolerance. Hepatic tolerogenic APCs are involved in promoting such tolerance. These cells include mainly Kupffer cells (KK), immature hepatic dendritic cells, and sinusoidal hepatic endothelial cells.
В предпочтительном варианте, композицию применяют для подавления провоспалительной реакции АПК. Согласно характеристике, эритроциты предпочтительно создают или модифицируют таким образом, чтобы подавлять провоспалительную реакцию АПК.In a preferred embodiment, the composition is used to suppress the pro-inflammatory response of APC. According to the characterization, erythrocytes are preferably created or modified in such a way as to suppress the pro-inflammatory response of APC.
В предпочтительном варианте, композиции в соответствии с данным изобретением содержат эритроциты, которые содержат АА и нацелены на печень.In a preferred embodiment, the compositions in accordance with this invention contain erythrocytes that contain AA and are targeted to the liver.
Композиция способствует фагоцитозу таких эритроцитов АПК печени, особенно, КК.The composition promotes phagocytosis of such erythrocytes by APC of the liver, especially CC.
Согласно первому варианту, эритроциты содержат АА и имеют форму иммунного комплекса с иммуноглобулином, который распознает эпитоп на поверхности таких эритроцитов, так, чтобы способствовать фагоцитозу указанных эритроцитов АПК печени, особенно КК.According to the first variant, the erythrocytes contain AA and are in the form of an immune complex with an immunoglobulin that recognizes an epitope on the surface of such erythrocytes, so as to promote phagocytosis of said erythrocytes by liver APC, especially CK.
Композиция также способствует фагоцитозу макрофагами.The composition also promotes phagocytosis by macrophages.
Предпочтительно, иммуноглобулином является иммуноглобулин G.Preferably, the immunoglobulin is immunoglobulin G.
Антителом, которое может применяться для получения адекватной опсонизации, являются анти-Резусные антитела, анти-гликофорин A антитела и анти-РК1 (РК1 - рецептор комплемента 1 типа) антитела. Предпочтительны анти-Резусные антитела.Antibody that can be used to obtain adequate opsonization are anti-Rhesus antibodies, anti-glycophorin A antibodies and anti-PK1 (PK1 - complement receptor type 1) antibodies. Anti-Rhesus antibodies are preferred.
Согласно другому варианту, доставка в печень и/или ингибирование провоспалительной реакции производится подходящей химической обработкой с применением агентов, которые модифицируют поверхность эритроцитов, и, в частности, мостиковых или поперечно сшивающих агентов, таких как бис(сульфосукцинимидил) суберат (BS3 или BS3), глутаровый альдегид или нейраминидаза.In another embodiment, delivery to the liver and/or inhibition of the pro-inflammatory response is effected by suitable chemical treatment using agents that modify the surface of red blood cells, and in particular bridging or cross-linking agents such as bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3 or BS 3 ) , glutaraldehyde or neuraminidase.
Согласно другому варианту, доставка в печень и/или ингибирование провоспалительной реакции производится с применением ионофора. Под ионофором понимают, как хорошо известно специалисту в данной области техники, жирорастворимую молекулу, которая позволяет переносить ионы через жировой сэндвич клеточной мембраны. Ионофорами могут быть, в частности, жирорастворимые молекулы, синтезированные микроорганизмами для переноса ионов через жировой сэндвич клеточной мембраны. В общем, ионофор способен образовывать комплекс с ионом и служит в качестве носителя иона.According to another variant, delivery to the liver and/or inhibition of the pro-inflammatory response is carried out using an ionophore. By ionophore is meant, as is well known to those skilled in the art, a fat-soluble molecule that allows the transport of ions across the fat sandwich of the cell membrane. Ionophores can be, in particular, fat-soluble molecules synthesized by microorganisms to transport ions through the fat sandwich of the cell membrane. In general, an ionophore is capable of complexing with an ion and serving as an ion carrier.
В одном варианте, ионофор образует комплекс с двухвалентным катионом, таким как кальций. В соответствии с данным изобретением, ионофор может применяться с кальцием, что вызывает увеличение внутриклеточной концентрации кальция и экспозиции фосфатидилсерина, что приводит к раннему старению эритроцитов.In one embodiment, the ionophore forms a complex with a divalent cation such as calcium. In accordance with the present invention, the ionophore can be applied with calcium, which causes an increase in intracellular calcium concentration and exposure of phosphatidylserine, which leads to early aging of erythrocytes.
В качестве примера применяют ионофор кальция A23187 (кальцимицин). Полагают, что ионофор, такой как A23187, вызывает повышение внутриклеточных концентраций кальция ЭЦТ, что приводит к старению клеток, и что фагоцитоз состаренных эритроцитов подавляет провоспалительную реакцию. Это согласуется с Romero P.J., Romero E.A., Blood Cells Mol. Dis. 25 (1999) 9-19; и Bratosin D. et al., Cell Death Differ. 8 (2001) 1143-1156.As an example, calcium ionophore A23187 (calcimycin) is used. It is believed that an ionophore, such as A23187, causes an increase in intracellular ECT calcium concentrations, which leads to cell aging, and that phagocytosis of aged erythrocytes suppresses the pro-inflammatory response. This is in agreement with Romero P.J., Romero E.A., Blood Cells Mol. Dis. 25 (1999) 9-19; and Bratosin D. et al., Cell Death Differ. 8 (2001) 1143-1156.
В конкретном варианте, по крайней мере, объединяют два способа доставки в клетку, и, например, в результате композиция содержат АА-содержащие эритроциты в виде иммунного комплекса, и химически обработана так чтобы обеспечивать их поглощение в печени, и фагоцитоз АПК, в частности, КК.In a specific embodiment, at least two methods of delivery to the cell are combined, and, for example, as a result, the composition contains AA-containing erythrocytes in the form of an immune complex, and is chemically processed so as to ensure their absorption in the liver, and APC phagocytosis, in particular, QC.
В одном варианте, эритроциты получают от самого пациента.In one embodiment, the erythrocytes are obtained from the patient himself.
В другом варианте, эритроциты получают от донора, совместимого по типу крови.In another embodiment, the red blood cells are obtained from a blood type compatible donor.
Композиция в соответствии с данным изобретением может содержать один или более АА в одних и тех же эритроцитах, или каждый в различных эритроцитах.The composition in accordance with this invention may contain one or more AA in the same erythrocytes, or each in different erythrocytes.
Методики инкапсулирования активных ингредиентов в эритроциты известны, и основная методика лизис-лигирования, которая является предпочтительной, описана в патентах EP-A-101341 и EP-A-679101, в которых может проконсультироваться специалист в данной области техники. Согласно этой методике, первичное отделение элемента диализа (например, диализная трубка или диализный картридж) непрерывно заполняют суспензией эритроцитов, а вторичное отделение содержит водный раствор, который является гипотоническим по отношению к суспензии эритроцитов, для лизирования эритроцитов; затем, в лигирующем отделении, лигирование эритроцитов индуцируется в присутствии АА повышением осмотического и/или онкотического давления, и затем суспензию эритроцитов, содержащую АА, собирают.Techniques for encapsulating active ingredients in erythrocytes are known, and the preferred lysis ligation technique is described in EP-A-101341 and EP-A-679101, which may be consulted by one skilled in the art. According to this technique, the primary compartment of the dialysis element (eg, dialysis tube or dialysis cartridge) is continuously filled with a suspension of erythrocytes, and the secondary compartment contains an aqueous solution that is hypotonic with respect to the suspension of erythrocytes to lyse the erythrocytes; then, in the ligation department, the ligation of erythrocytes is induced in the presence of AA by increasing the osmotic and/or oncotic pressure, and then the erythrocyte suspension containing AA is collected.
Среди описанных по настоящее время вариантов, предпочтение отдается способу, описанному в WO2006/016247, что позволяет эффективно, воспроизводимо, безопасно и стабильно инкапсулировать АА. Этот способ включает стадии:Among the options currently described, preference is given to the method described in WO2006/016247, which allows efficient, reproducible, safe and stable encapsulation of AA. This method includes the steps:
1 - суспензия лепешки эритроцитов в изотоническом растворе при уровне гематокрита больше или равном 65%, охлаждение от +1 до +8°C,1 - suspension of erythrocyte pellets in isotonic solution at a hematocrit level greater than or equal to 65%, cooling from +1 to +8°C,
2 - измерение осмотической резистентности с применением образца эритроцитов из указанной лепешки эритроцитов,2 - measurement of osmotic resistance using a erythrocyte sample from said erythrocyte cake,
стадии 1 и 2 могут проводиться в любом порядке (включая параллельный),stages 1 and 2 can be carried out in any order (including parallel),
3 - лизис и процесс интернационализации АА внутри одной камеры при температуре, постоянно поддерживаемой на уровне от +1 до +8°C, включающий пропускание суспензии эритроцитов при уровне гематокрита более или равном 65%, и гипотонический лизисный раствор охлаждают до +1-8°C, через диализный картридж; и параметры лизиса корректируют согласно измеренной ранее осмотической резистентности; и3 - lysis and the process of internationalization of AA inside one chamber at a temperature constantly maintained at a level of +1 to +8°C, including the passage of a suspension of erythrocytes at a hematocrit level of more than or equal to 65%, and the hypotonic lysis solution is cooled to +1-8°C C, via dialysis cartridge; and the lysis parameters are adjusted according to previously measured osmotic resistance; and
4 - процесс лигирования проводят во второй камере, внутри которой температура составляет от +30 до +40°C, и в присутствии гипертонического раствора.4 - the ligation process is carried out in the second chamber, inside which the temperature is from +30 to +40°C, and in the presence of hypertonic solution.
Под "интернализацией" подразумевают проникновение АА внутрь эритроцитов.By "internalization" is meant the penetration of AA into the erythrocytes.
В частности, для диализа, лепешку эритроцитов суспендируют в изотоническом растворе при высоком уровне гематокрита, больше или равном 65%, и, предпочтительно, больше или равном 70%, и эту суспензию охлаждают до температуры от около +1 до +8°C, предпочтительно, от +2 до 6°C, обычно в области +4°C. Согласно конкретному варианту, уровень гематокрита составляет от 65% до 80%, предпочтительно от 70% до 80%.In particular, for dialysis, the RBC pellet is suspended in isotonic saline at a high hematocrit level greater than or equal to 65%, and preferably greater than or equal to 70%, and this suspension is cooled to a temperature of about +1 to +8°C, preferably , from +2 to 6°C, usually around +4°C. In a particular embodiment, the hematocrit level is between 65% and 80%, preferably between 70% and 80%.
Осмотическую резистентность предпочтительно измеряют в эритроцитах непосредственно перед стадией лизиса. Эритроциты или содержащая их суспензия предпочтительно имеет температуру, близкую или идентичную той, которая выбрана для лизиса. Согласно другой предпочтительной характеристике данного изобретения, измерение осмотической резистентности применяют быстро, т.е. процесс лизиса проводят сразу же после отбора образца. Предпочтительно, период времени между отбором образца и началом лизиса меньше или равен 30 минут, более предпочтительно, меньше или равен 25, и даже меньше или равен 20 минутам.Osmotic resistance is preferably measured in erythrocytes immediately prior to the lysis step. The erythrocytes or suspension containing them preferably has a temperature close to or identical to that selected for lysis. According to another preferred feature of the present invention, the measurement of osmotic resistance is applied rapidly, i.e. the lysis process is carried out immediately after sampling. Preferably, the time period between sampling and the start of lysis is less than or equal to 30 minutes, more preferably less than or equal to 25, and even less than or equal to 20 minutes.
Подробную методику, по которой проводят лизис, в котором измеряют и принимают во внимание осмотическую резистентность, специалист в данной области техники может посмотреть в WO2006/016247.A detailed procedure by which lysis is carried out, in which osmotic resistance is measured and taken into account, can be consulted by a person skilled in the art in WO2006/016247.
Согласно другой характеристике данного изобретения, композиция в соответствии с данным изобретением содержит, на завершающей стадии, суспензию эритроцитов с уровнем гематокрита от около 40% до около 70%, предпочтительно, от около 45% до около 55%, более предпочтительно, около 50%. Предпочтительно ее упаковывают в объеме от около 1 до около 250 мл. Упаковкой предпочтительно является пакет для крови, шприц и подобные, подходящие для переливания или введения крови. Количество инкапсулированного АА, соответствующее медицинскому предписанию, предпочтительно полностью содержатся в пакете для крови, шприце и подобном.According to another feature of the present invention, the composition of the present invention comprises, in the final step, a suspension of red blood cells with a hematocrit level of from about 40% to about 70%, preferably from about 45% to about 55%, more preferably about 50%. Preferably, it is packaged in a volume of from about 1 to about 250 ml. The package is preferably a blood bag, a syringe and the like suitable for transfusion or administration of blood. The medically prescribed amount of encapsulated AA is preferably contained entirely in a blood bag, syringe, and the like.
Объектом данного изобретения является также способ вызывания у хозяина иммунной толерантности к пептидному или белковому активному агенту, где указанная композиция содержит эритроциты, содержащие активный агент, выбранный из группы, включающей терапевтический пептид, полипептид или белок, пептидный или белковый аутоантиген, пептид, полипептид или белок, вызывающие аллергическую реакцию, и трансплантационный пептидный или белковый антиген. Этот способ включает введение хозяину эффективного количества композиции в соответствии с данным изобретением, в частности, внутривенно, инъекцией или вливанием, предпочтительно, вливанием.The subject of this invention is also a method for inducing immune tolerance in a host to a peptide or protein active agent, wherein said composition comprises erythrocytes containing an active agent selected from the group consisting of a therapeutic peptide, polypeptide or protein, peptide or protein autoantigen, peptide, polypeptide or protein. that cause an allergic reaction, and transplantation peptide or protein antigen. This method comprises administering to the host an effective amount of a composition according to the invention, in particular intravenously, by injection or infusion, preferably by infusion.
Согласно одной характеристике изобретения, вводят от около 1 до около 250 мл, предпочтительно, от около 10 до около 250 мл, обычно от около 10 до около 200 мл суспензии эритроцитов. Суспензия имеет подходящий уровень гематокрита, обычно от около 40% до около 70%, предпочтительно, от около 45% до около 55%, наиболее предпочтительно, около 50%. Эритроциты могут оказывать свое собственное толерогенное действие по отношению к активному агенту, который присутствует в то же время (инкапсулированному активному агенту). Высокие количества эритроцитов могут благоприятствовать толерогенному действию. С другой стороны, доставка в печень, как указано выше, позволяет применять низкие дозы эритроцитов. Таким образом, специалист в данной области техники может выбрать оптимальное количество активного агента и эритроцитов, применяемых у пациента, и может принимать во внимание, обработаны или нет эритроциты так, чтобы попадать в печень.In one aspect of the invention, about 1 to about 250 ml, preferably about 10 to about 250 ml, typically about 10 to about 200 ml, of the red blood cell suspension is administered. The suspension has a suitable hematocrit level, typically about 40% to about 70%, preferably about 45% to about 55%, most preferably about 50%. The erythrocytes can exert their own tolerogenic effect towards the active agent that is present at the same time (the encapsulated active agent). High erythrocyte counts may favor tolerogenic effects. On the other hand, delivery to the liver, as mentioned above, allows the use of low doses of erythrocytes. Thus, one skilled in the art can select the optimal amount of active agent and red blood cells to be administered to a patient, and can take into account whether or not the red blood cells are processed so as to enter the liver.
Объектом данного изобретения также является применение композиции в соответствии с данным изобретением для вызова иммунной толерантности, специфической к активному агенту или активным агентам, которые присутствуют во введенных эритроцитах.The subject of the present invention is also the use of the composition according to the present invention to induce immune tolerance specific to the active agent or active agents which are present in the administered erythrocytes.
Другим объектом изобретения является композиция в соответствии с данным изобретением для применения в качестве лекарственного средства для вызова иммунной толерантности, специфической к активному агенту или активным агентам, которые присутствуют во введенных эритроцитах.Another aspect of the invention is a composition according to the invention for use as a medicament for inducing immune tolerance specific to the active agent or active agents that are present in the administered erythrocytes.
Далее данное изобретение более подробно описано в вариантах, представленных в виде не ограничивающих примеров, которые ссылаются на представленные чертежи:Hereinafter, this invention is described in more detail in the variants presented in the form of non-limiting examples, which refer to the presented drawings:
На фигуре 1 представлен график, представляющий процент Т-клеток CD4, экспрессирующих FOXP3.Figure 1 is a graph representing the percentage of CD4 T cells expressing FOXP3.
На фигуре 2 представлен график, представляющий процент регулирующих Т-клеток CD4+ CD25+, производящих IL-10.The figure 2 presents a graph representing the percentage of regulatory T cells CD4 + CD25 + producing IL-10.
На фигуре 3 представлен график, представляющий процент Т-клеток CD4, экспрессирующих FOXP3 в селезенке.Figure 3 is a graph representing the percentage of CD4 T cells expressing FOXP3 in the spleen.
На фигуре 4 представлен график, представляющий процент Т-клеток CD4, экспрессирующих FOXP3 в печени.Figure 4 is a graph representing the percentage of CD4 T cells expressing FOXP3 in the liver.
На фигуре 5 представлен график, представляющий процент ЯА-специфических Т-клеток CD8.Figure 5 is a graph representing the percentage of JA-specific CD8 T cells.
Пример 1: Инкапсулирование FITC-декстрана в эритроциты мышиExample 1: Encapsulation of FITC-dextran in mouse erythrocytes
FITC-декстран фторохром (70 кДа) инкапсулируют в эритроциты, полученные от мыши (мыши OF1) с применением гипотонического диализа на колонке. Кровь центрифугируют и затем промывают 3 раза ФРФБ. Гематокрит доводят до 70% в присутствии FITC-декстрана, добавленного до конечной концентрации 8 мг/мл до диализа. Эритроциты диализируют со скоростью 2 мл/мин вплотную к лизисному буферу, имеющему низкую осмолярность (противоток при 15 мл/мин). Лизированные эритроциты, выходящие из колонки, повторно уплотняют с применением раствора с высокой осмолярностью и инкубируют в течение 30 мин при 37°C. После нескольких промывок ФРФБ, содержащим глюкозу, клетки доводят до гематокрита 50%.FITC-dextran fluorochrome (70 kDa) was encapsulated in erythrocytes obtained from a mouse (OF1 mouse) using hypotonic dialysis on a column. The blood is centrifuged and then washed 3 times with PRPB. The hematocrit is adjusted to 70% in the presence of FITC-dextran added to a final concentration of 8 mg/ml prior to dialysis. The erythrocytes are dialyzed at a rate of 2 ml/min against a low osmolarity lysis buffer (countercurrent at 15 ml/min). Lysed erythrocytes emerging from the column are reconsolidated using a high osmolarity solution and incubated for 30 minutes at 37°C. After several washes with FBS containing glucose, the cells were brought to a hematocrit of 50%.
Пример 2. Химическая обработка бис(сульфосукцинимидил) субератом (BS3) 1 мМ эритроцитов, содержащих FITC-декстранExample 2 Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) chemical treatment with 1 mM FITC-dextran containing erythrocytes
Суспензию эритроцитов с инкапсулированным FITC-декстраном несколько раз промывают перед доведением до 1,7×106 клеток/мкл ФРФБ и смешивают с одним объемом буферного раствора 2 мМ BS3 (раствор BS3 содержит 0,09% глюкозы и фосфатный буфер, pH 7,4), так, чтобы получить конечную концентрацию BS3 1 мМ. Клетки инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию гасят добавлением одного объема 20 мМ Tris-HCl, 140 мМ NaCl. После инкубирования при комнатной температуре в течение 5 минут, смесь центрифугируют при 800 g в течение 5 мин 4°C. Затем клетки дважды промывают ФРФБ, содержащим глюкозу (центрифугирование при 800 g) и один раз SAG-BSA 6% (центрифугирование при 1000 g) в течение 10 мин, перед доведением до гематокрита 50% для составления конечного продукта.The FITC-dextran-encapsulated erythrocyte suspension is washed several times before adjusting to 1.7×10 6 cells/µl of PBS and mixed with one volume of 2 mM BS3 buffer solution (BS3 solution contains 0.09% glucose and phosphate buffer, pH 7.4 ), so as to obtain a final BS3 concentration of 1 mM. Cells are incubated for 30 minutes at room temperature. The reaction is quenched by adding one volume of 20 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl. After incubation at room temperature for 5 minutes, the mixture is centrifuged at 800 g for 5 min at 4°C. The cells are then washed twice with BBS containing glucose (centrifugation at 800 g) and once with SAG-BSA 6% (centrifugation at 1000 g) for 10 min before adjusting to a hematocrit of 50% to formulate the final product.
Пример 3. Химическая обработка бис(сульфосукцинимидил) субератом (BS3) 5 мМ эритроцитов, содержащих FITC-декстранExample 3 Chemical treatment with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) of 5 mM FITC-dextran containing erythrocytes
Суспензию эритроцитов с инкапсулированным FITC-декстраном несколько раз промывают перед доведением до 1,7×106 клеток/мкл ФРФБ и смешивают с одним объемом буферного раствора 10 мМ BS3 (раствор BS3 содержит 0,09% глюкозы и фосфатный буфер, pH 7,4), так, чтобы получить конечную концентрацию BS3 5 мМ. Клетки инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию гасят добавлением одного объема 20 мМ Tris-HCl, 140 мМ NaCl. После инкубирования при комнатной температуре в течение 5 минут, смесь центрифугируют при 800 g в течение 5 мин 4°C. Затем клетки дважды промывают ФРФБ, содержащим глюкозу (центрифугирование при 800 g) и один раз SAG-BSA 6% (центрифугирование при 1000 g) в течение 10 мин, перед доведением до гематокрита 50% для составления конечного продукта.The FITC-dextran-encapsulated erythrocyte suspension is washed several times before adjusting to 1.7 x 10 6 cells/µl of PBS and mixed with one volume of 10 mM BS3 buffer solution (BS3 solution contains 0.09% glucose and phosphate buffer, pH 7.4 ), so as to obtain a final concentration of BS3 of 5 mM. Cells are incubated for 30 minutes at room temperature. The reaction is quenched by adding one volume of 20 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl. After incubation at room temperature for 5 minutes, the mixture is centrifuged at 800 g for 5 min at 4°C. The cells are then washed twice with BBS containing glucose (centrifugation at 800 g) and once with SAG-BSA 6% (centrifugation at 1000 g) for 10 min before adjusting to a hematocrit of 50% to formulate the final product.
Пример 4. Обработка эритроцитов, содержащих FITC-декстран, A23187 ионофоромExample 4 Treatment of FITC-dextran containing erythrocytes with A23187 ionophore
Суспензию эритроцитов, содержащих FITC-декстран, один раз промывают буфером A, содержащим Hepes 10 мМ, NaCl 140 мМ, АБС 0,1%, CaCl2 2,5 мМ, и затем суспензию разводят до 1,106 клеток/микролитр с применением буфера A. Ионофор, концентрированный в ДМСО, разводят буфером A и затем добавляют к суспензии клеток для получения финальной концентрации 0,15, 0,2 или 0,3 мкМ. Клетки инкубируют в течение 30 мин при 37°C. Смесь центрифугируют при 800 g в течение 6 мин, 4°C. Затем клетки промывают 2 раза ФРФБ, содержащим глюкозу (центрифугирование при 800 g) и один раз SAG-BSA 6% (центрифугирование при 1000 g), и получают конечные продукты.The FITC-dextran-containing erythrocyte suspension was washed once with buffer A containing Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, ABS 0.1%, CaCl 2 2.5 mM, and then the suspension was diluted to 1.10 6 cells/microliter using buffer A. The ionophore concentrated in DMSO is diluted with buffer A and then added to the cell suspension to obtain a final concentration of 0.15, 0.2, or 0.3 μM. Cells are incubated for 30 min at 37°C. The mixture is centrifuged at 800 g for 6 min, 4°C. The cells are then washed 2 times with BBS containing glucose (centrifugation at 800 g) and once with SAG-BSA 6% (centrifugation at 1000 g) to give the final products.
Пример 5. Биораспределение FITC-декстрана после инъекции эритроцитов мышамExample 5 Biodistribution of FITC-Dextran after RBC Injection in Mice
Получают 5 партий эритроцитов мыши OF1, содержащих FITC-декстран, как описано в примере 1, и обрабатывают или не обрабатывают BS3 или ионофором (согласно примерам 2-4) следующим образом:5 batches of OF1 mouse erythrocytes containing FITC-dextran are prepared as described in Example 1 and treated or not treated with BS3 or ionophore (according to Examples 2-4) as follows:
Партия 1: без обработкиBatch 1: untreated
Партия 2: BS3 1 мМLot 2: BS3 1 mM
Партия 3: BS3 5 мМLot 3: BS3 5 mM
Партия 4: ионофор 0,2 мкМBatch 4: ionophore 0.2 µM
Партия 5: ионофор 0,3 мкМBatch 5: ionophore 0.3 µM
Каждую партию вводят ВВ при J1 мышам OF1. Мышей умерщвляют через 1 ч 30 мин после инъекции и выделяют кровь, селезенку, печень и костный мозг: аликвоты 50 мкл крови, и для селезенки, печени и костного мозга, аликвоты 50 мкл после измельчения и гомогенизации цельных клеток каждого органа. Аликвоты замораживают т в течение, по крайней мере, 20 минут при -20°C, затем оттаивают медленно при комнатной температуре. Аликвоты, взятые у контрольных мышей, применяют для приготовления стандартного спектра концентраций FITC-декстрана: аликвоты затем лизируют 125 мкл различных концентраций FITC-декстрана для получения стандартного спектра концентраций.BB was administered at J1 to OF1 mice in each batch. Mice are sacrificed 1
Анализируемые аликвоты образца лизируют с применением 125 мкл дистиллированной воды. Затем к аликвотам добавляют 175 мкл TCA 12%. Эту смесь затем центрифугируют при 15000 g, 10 мин, 4°C. Берут 200 мкл надосадочной кислоты и 500 мкл триэтаноламина 0,4 M добавляют до флуорометрического измерения (возбуждение при 494 нм, эмиссия при 521 нм). Концентрация FITC-декстрана в каждом образце может быть определена с применением стандартного спектра концентраций, и затем может быть определена доля FITC-декстрана, присутствующего в соответствующем органе.Analyzed sample aliquots are lysed using 125 µl of distilled water. Then 175 μl TCA 12% is added to the aliquots. This mixture is then centrifuged at 15,000 g, 10 min, 4°C. Take 200 μl of supernatant and 500 μl of triethanolamine 0.4 M are added before the fluorometric measurement (excitation at 494 nm, emission at 521 nm). The concentration of FITC-dextran in each sample can be determined using a standard concentration spectrum, and then the proportion of FITC-dextran present in the respective organ can be determined.
Биораспределение FITC-декстрана через 1 ч 30 мин после инъекции эритроцитов мышам OF1:Biodistribution of FITC-dextran 1
Обработка 1 мМ BS3 вызывает попадание эритроцитов в печень и селезенку, в то время как обработка ионофором вызывает попадание эритроцита только в печень. Повышение дозы ионоформа улучшает целевое попадание.Treatment with 1 mM BS3 causes erythrocytes to enter the liver and spleen, while ionophore treatment causes erythrocytes to enter only the liver. Increasing the dose of ionoform improves the target hit.
Пример 6. Измерение фагоцитоза в содержащих FITC-декстран эритроцитах мышейExample 6 Measurement of phagocytosis in FITC-dextran-containing mouse erythrocytes
Получают 5 партий эритроцитов мышей OF1, содержащих FITC-декстран, полученных как в Примере 1 и обработанных или не обработанных BS3 или ионофором (в соответствии с примерами 2-4):Receive 5 batches of OF1 mouse erythrocytes containing FITC-dextran, obtained as in Example 1 and treated or not treated with BS3 or ionophore (according to examples 2-4):
Партия 1: без обработкиBatch 1: untreated
Партия 2: BS3 1 мМLot 2: BS3 1 mM
Партия 3. BS3 5 мМLot 3. BS3 5 mM
Партия 4: ионофор 0,2 мкМBatch 4: ionophore 0.2 µM
Партия 5 ионофор 0,3 мкМ.Lot 5 ionophore 0.3 μM.
Каждую партию вводят ВВ при J1 мышам OF1. Мышей умерщвляют через 1 час 30 мин после инъекции и восстанавливают печень. Флуоресценцию вводят в макрофаги печени, экспрессирующие F4/80 маркер, клетки печени, экспрессирующие маркер CD11b, и дендритные клетки печени, экспрессирующие маркер CD11c, измеряют с применением проточной цитометрии.BB was administered at J1 to OF1 mice in each batch. Mice are sacrificed 1
Процент клеток печени, в которых в которых фагоцитированы эритроциты, содержащие FITC-декстран, через 1 час 30 мин после введения мышам:Percentage of liver cells in which FITC-dextran-containing erythrocytes are phagocytosed 1
Обработка BS3 и ионофором вызывает эритрофагоцитоз макрофагами (F4/80 и CD11b) и дендритными клетками. Для обработки BS3 процент клеток, которые обработаны фагоцитом, зависит от дозы BS3, применяемой для обработки.Treatment with BS3 and ionophore induces erythrophagocytosis by macrophages (F4/80 and CD11b) and dendritic cells. For BS3 treatment, the percentage of cells that are phagocyte-treated depends on the dose of BS3 used for treatment.
Пример 7. Способ инкапсулирования яичного альбумина в эритроциты мышей и человекаExample 7 Method for encapsulating ovalbumin in mouse and human erythrocytes
Вариант 1:Option 1:
Яичный альбумин (белок 45 кДа, альбумин куриного яйца) инкапсулируют в эритроциты мыши (мыши OF1 или мыши C57BL/6) способом гипотонического диализа в диализной трубке. Суспензию эритроцитов промывают несколько раз перед доведением гематокрита до 70% для диализа. Диализ проводят в диализной трубке в лизисном буфере низкой осмолярности в течение от около 1 часа или 30 минут, если диализ происходит после тепловой обработки. Эритроциты повторно уплотняют с применением раствора высокой осмолярности в течение 30 минут. После нескольких промывок конечный продукт помещают в буфер, Sag-маннит, и гематокрит доводят до 50%.Egg albumin (45 kDa protein, hen's egg albumin) is encapsulated in mouse erythrocytes (OF1 mice or C57BL/6 mice) by a hypotonic dialysis method in a dialysis tube. The erythrocyte suspension is washed several times before adjusting the hematocrit to 70% for dialysis. The dialysis is carried out in a dialysis tube in a low osmolarity lysis buffer for about 1 hour or 30 minutes if the dialysis occurs after heat treatment. The erythrocytes are reconsolidated using a high osmolarity solution for 30 minutes. After several washes, the final product is placed in buffer, Sag-mannitol, and the hematocrit is adjusted to 50%.
Вариант 2:Option 2:
Яичный альбумин инкапсулируют в мышиные эритроциты способом гипотонического диализа в диализной колонке. Суспензию эритроцитов промывают несколько раз до доведения гематокрита до 70% для диализа. Диализ проводят в диализной колонке в лизисном буфере низкой осмолярности в течение около 10 мин. После того, как они выйдут из колонки, эритроциты повторно уплотняют с применением раствора высокой осмолярности в течение 30 минут при 37°C. После нескольких промывок конечный продукт помещают в NaCl глюкозный буфер, содержащий глюкозу, SAG-маннит или декомплементарную плазму, и гематокрит доводят до 50%.Egg albumin is encapsulated in mouse erythrocytes by hypotonic dialysis in a dialysis column. The erythrocyte suspension is washed several times until the hematocrit is adjusted to 70% for dialysis. Dialysis is carried out on a dialysis column in a low osmolarity lysis buffer for about 10 minutes. After they exit the column, the erythrocytes are reconsolidated using a high osmolarity solution for 30 minutes at 37°C. After several washes, the final product is placed in NaCl glucose buffer containing glucose, SAG-mannitol or decomplementary plasma, and the hematocrit is adjusted to 50%.
Пример 8: Способ инкапсулирования яичного альбумина в эритроциты мышейExample 8 Method for Encapsulating Egg Albumin in Mouse Red Blood Cells
Яичный альбумин (Worthington Biochemicai Corporation, Lakewood, NJ) инкапсулируют в эритроциты мышей гипотоническим диализом. Суспензии эритроцитов получают из крови мышей C57BL/6, собранной на литиевый гепарин. Коротко, эритроциты тир раза промывают физиологическим раствором и гематокрит (Hct) крови доводят до 70% перед диализом. В суспензию эритроцитов добавляют ЯА в конечной концентрации 5 или 0,5 мг/мл. Диализ проводят (скорость потока клеток 2 мл/мин) через клеточный лизисный буфер (осмолярность 50 мОсмол/кг), циркулирующий противотоком (15 мл/мин) в 80 половолоконном диализаторе (Gambro, Lyon, France). Эритроциты повторно уплотняют "в текущем режиме" добавлением (конечный объем 10%) гипертонического раствора (1900 мОсмол/кг), содержащего 0,4 г/л аденина (Sigma-Aldrich, Saint-Louts, MI), 15,6 г/л инозина (Sigma-Aldrich), 6,4 г/л пирувата натрия (Sigma-Aldrich), 4,9 г/л дегидрата фосфата мононатрия (Sigma-Aldrich), 10,9 г/л додекагидрата фосфата динатрия (Sigma-Aldrich), 11,5 г/л моногидрата глюкозы (Sigma-Aldrich) и 50 г/л NaCl (Sigma-Aldrich). Эритроциты инкубируют в течение 30 мин при 37°C гипертоническим раствором. После нескольких промывок 0,9% NaCl 0,2% глюкозой (Bioluz, Saint-Jean-de-Luz, France), продукт промывают один раз буфером A, содержащим Hepes 10 мМ, NaCl 140 мМ, АБС 0,1%, CaCl2 2,5 мМ, разбавленным буфером A до 1,106 клеток/мкл, и обрабатывают 0,15 мкМ кальциевым ионофором A23187 (Sigma) в течение 30 мин при 37°C как описано в примере 15. После 3 промывок 0,9% NaCl 0,2% глюкозой конечный продукт повторно суспендируют и его гематокрит доводят до 50% декомплементированной плазмой мышей C57BL/6 mouse plasma (конечный объем 15%). Полученный таким образом продукт хранят при 2-8°C.Egg albumin (Worthington Biochemicai Corporation, Lakewood, NJ) was encapsulated in mouse erythrocytes by hypotonic dialysis. Erythrocyte suspensions are prepared from blood collected from C57BL/6 mice on lithium heparin. Briefly, erythrocytes are tir fold washed with saline and the hematocrit (Hct) of the blood is adjusted to 70% before dialysis. NA is added to the erythrocyte suspension at a final concentration of 5 or 0.5 mg/ml. Dialysis is carried out (cell flow rate 2 ml/min) through cell lysis buffer (osmolarity 50 mOsmol/kg) circulating countercurrent (15 ml/min) in an 80 hollow fiber dialyzer (Gambro, Lyon, France). The erythrocytes are reconsolidated "on the fly" by the addition (
Пример 9: Способ инкапсулирования яичного альбумина в эритроциты мышейExample 9: Method for encapsulating ovalbumin in mouse erythrocytes
Яичный альбумин (Worthington Biochemicai Corporation, Lakewood, NJ) инкапсулируют в эритроциты мышей гипотоническим диализом. Суспензии эритроцитов получают из крови мышей C57BL/6, собранной на литиевый гепарин. Коротко, эритроциты три раза промывают физиологическим раствором и гематокрит (Hct) крови доводят до 70% перед диализом. К суспензии эритроцитов добавляют ЯА в конечной концентрации 5 или 0,5 мг/мл. Диализ проводят (скорость потока клеток 2 мл/мин) через клеточный лизисный буфер (осмолярность 50 мОсмол/кг), циркулирующий противотоком (15 мл/мин) в диализной трубке. После диализа эритроциты повторно уплотняют добавлением (конечный объем 10%) гипертонического раствора (1900 мОсмол/кг), содержащего 0,4 г/л аденина (Sigma-Aldrich, Saint-Louts, MI), 15,6 г/л инозина (Sigma-Aldrich), 6,4 г/л пирувата натрия (Sigma-Aldrich), 4,9 г/л дегидрата фосфата мононатрия (Sigma-Aldrich), 10,9 г/л додекагидрата фосфата динатрия (Sigma-Aldrich), 11,5 г/л моногидрата глюкозы (Sigma-Aldrich) и 50 г/л NaCl (Sigma-Aldrich). Эритроциты инкубируют в течение 30 мин при 37°C гипертоническим раствором и затем химически обрабатывают BS3 как описано в примере 14.Egg albumin (Worthington Biochemicai Corporation, Lakewood, NJ) was encapsulated in mouse erythrocytes by hypotonic dialysis. Erythrocyte suspensions are prepared from blood collected from C57BL/6 mice on lithium heparin. Briefly, the erythrocytes are washed three times with saline and the hematocrit (Hct) of the blood is adjusted to 70% before dialysis. RA is added to the erythrocyte suspension at a final concentration of 5 or 0.5 mg/ml. Dialysis is carried out (cell flow rate 2 ml/min) through a cell lysis buffer (osmolarity 50 mOsmol/kg) circulating countercurrent (15 ml/min) in a dialysis tube. After dialysis, the erythrocytes are reconsolidated with the addition (
После нескольких промывок 0,9% NaCl 0,2% глюкозой (Bioluz, Saint-Jean-de-Luz, France), конечный продукт повторно суспендируют и его гематокрит доводят до 50% декомплементированной плазмой мышей C57BL/6 mouse plasma (конечный объем 15%). Полученный таким образом продукт хранят при 2-8°C.After several washes with 0.9% NaCl 0.2% glucose (Bioluz, Saint-Jean-de-Luz, France), the final product was resuspended and its hematocrit adjusted to 50% with decomplemented C57BL/6 mouse plasma (
Пример 10. Обработка антителами эритроцитов, содержащих яичный альбуминExample 10 Antibody Treatment of Egg Albumin Containing Erythrocytes
Суспензию эритроцитов, в которые инкапсулирован яичный альбумин, промывают несколько раз перед доведением 109 клеток/мл для in vivo теста и 108 клеток/мл для in vitro теста. Ее инкубируют с анти-TER119 антителом (10 мкг/мл для in vitro теста и 23 мкг/мл или 5 мкг/мл для in vivo теста) в течение 30 минут при 4°C. После нескольких промывок конечный продукт помещают в буфер с инъецируемым количеством, и гематокрит доводят до 50%.The suspension of erythrocytes encapsulated in ovalbumin is washed several times before being adjusted to 10 9 cells/ml for the in vivo test and 10 8 cells/ml for the in vitro test. It is incubated with anti-TER119 antibody (10 μg/ml for in vitro test and 23 μg/ml or 5 μg/ml for in vivo test) for 30 minutes at 4°C. After several washes, the final product is placed in injection buffer and the hematocrit is adjusted to 50%.
Пример 11. Измерение фагоцитоза содержащих яичный альбумин эритроцитов дендритными клетками Example 11 Measurement of Phagocytosis of Egg Albumin Containing Erythrocytes by Dendritic Cells in vitroin vitro
Действие обработки антителами на эффективность фагоцитоза эритроцитов, полученных в примере 9, дендритными клетками, измеряют in vitro. Эритроциты метят флуоресцентной меткой, СЭКФ (сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоросцеина), в течение 20 мин при 4°C. СЭКФ представляет собой не флуоресцентный краситель, который распространяется через мембрану клетки. Попадая внутрь клетки, молекула становится флуоресцентной после ее расщепления внутриклеточными эстеразами.The effect of antibody treatment on the efficiency of phagocytosis of erythrocytes obtained in Example 9 by dendritic cells was measured in vitro . The erythrocytes are labeled with a fluorescent label, SECF (Carboxyfluoroscein Succinimidyl Ether), for 20 minutes at 4°C. SECF is a non-fluorescent dye that diffuses across the cell membrane. Once inside the cell, the molecule becomes fluorescent after it is cleaved by intracellular esterases.
Дендритные клетки выделяют из селезенки мышей C57BI/6 с применением магнитных шариков. Эти шарики переносят антитела, которые распознают маркер CD11c, тем самым позволяя выделять фракцию CD11c дендритных клеток.Dendritic cells were isolated from the spleen of C57BI/6 mice using magnetic beads. These beads carry antibodies that recognize the CD11c marker, thereby allowing the isolation of the CD11c fraction of dendritic cells.
Меченные или не меченные СЭКФ эритроциты затем инкубируют с дендритными клетками (10×106 клеток/мл) в соотношении 20:1 в конечном объеме 200 мкл/ячейку в круглодонных 96-луночных культуральных планшетах в течение 4 часов при 37°C и 5% CO2. После культивирования в течение 4 часов, эритроциты, не поглощенные дендритными клетками, лизируют с NH4Cl и проводят несколько промывок. Затем измеряют захват СЭКФ флуорохрома дендритными клетками с применением проточной цитометрии (R. Segura et al., J. Immunol, January 2006, 176(1): 441-50).SECF-labeled or unlabeled erythrocytes are then incubated with dendritic cells (10×10 6 cells/ml) at a ratio of 20:1 in a final volume of 200 μl/well in round-bottom 96-well culture plates for 4 hours at 37°C and 5% CO2 . After culturing for 4 hours, erythrocytes not taken up by dendritic cells are lysed with NH 4 Cl and several washes are carried out. The uptake of fluorochrome SECF by dendritic cells is then measured using flow cytometry (R. Segura et al., J. Immunol, January 2006, 176(1): 441-50).
Тестируют три популяции эритроцитов:Three populations of erythrocytes are tested:
(A) эритроциты с загруженным яичным альбумином и не меченные СЭКФ флуорохромом.(A) RBCs loaded with ovalbumin and not labeled with fluorochrome SECF.
(B) эритроциты с загруженным яичным альбумином и меченные СЭКФ флуорохромом.(B) erythrocytes loaded with ovalbumin and labeled with fluorochrome SECF.
(C) эритроциты с загруженным яичным альбумином, обработанные анти-TER119 антителом и меченные СЭКФ.(C) Egg albumin loaded erythrocytes treated with anti-TER119 antibody and labeled with SECF.
Результатыresults
Процент дендритных клеток, имеющих фагоцитозированные флуоресцентные эритроцитыTable 3
Percentage of dendritic cells having phagocytosed fluorescent red blood cells
Мышиные эритроциты, загруженные яичным альбумином и обработанные анти-TER119 антителом, были более эффективно фагоцитозированы дендритными клетками, выделенными из селезенки, по сравнению с не обработанными эритроцитами in vitro, через 4 часа совместного культивирования. 36% дендритных клеток фагоцитозировали эритроциты, имеющие антитела, по сравнению с только 27% при отсутствии антител.Mouse erythrocytes loaded with ovalbumin and treated with anti-TER119 antibody were more efficiently phagocytosed by spleen-derived dendritic cells compared to untreated erythrocytes in vitro after 4 hours of co-culture. 36% of the dendritic cells phagocytosed erythrocytes with antibodies compared to only 27% in the absence of antibodies.
Пример 12. Измерение фагоцитоза эритроцитов, содержащих яичный альбумин, макрофагами и дендритными клетками селезенки и печени Example 12 Measurement of phagocytosis of ovalbumin-containing erythrocytes by macrophages and dendritic cells of the spleen and liver in vivoin vivo у мышей in mice
Это исследование представляет собой аллогенное исследование, так как эритроциты OF1 мышей, содержащие яичный альбумин, впрыскивают не генетически родственным мышам C57BI/6.This study is an allogeneic study, as OF1 mouse erythrocytes containing ovalbumin are injected into non-genetically related C57BI/6 mice.
Получают три партии 74×107 эритроцитов мышей OF1, загруженных яичным альбумином (пример 9), обработанных анти-TER119 антителом (как описано в примере 10) или не обработанных. Эти партии делят следующим образом:Three batches of 74×10 7 OF1 mouse erythrocytes loaded with ovalbumin (Example 9), treated with anti-TER119 antibody (as described in Example 10) or untreated were prepared. These parties are divided as follows:
Партия 1: нет обработки антителомLot 1: no antibody treatment
Партия 2: обработка анти-TER119 антителом.Lot 2: treatment with anti-TER119 antibody.
Каждую партию метят СЭКФ и вводят внутривенно мышам C57BI/6. Через три часа после инъекции берут кровь, селезенку и печень мышей. Процент флуоресцентных эритроцитов, циркулирующих в крови мышей, измеряют проточной цитометрией. Флуоресценцию, введенную в макрофаг селезенки, экспрессирующий F4/80 маркер, в макрофаг печени, экспрессирующий F4/80 маркер, и в дендритные клетки селезенки, экспрессирующие CD11c маркер, измеряют проточной цитометрией.Each batch is labeled with SECF and administered intravenously to C57BI/6 mice. Three hours after the injection, blood, spleen and liver of mice are taken. The percentage of fluorescent red blood cells circulating in the blood of mice is measured by flow cytometry. Fluorescence introduced into a spleen macrophage expressing the F4/80 marker, into a liver macrophage expressing the F4/80 marker, and into spleen dendritic cells expressing the CD11c marker is measured by flow cytometry.
Результатыresults
Процент макрофагов или дендритных клеток из селезенки, имеющих фагоцитозированные флуоресцентные эритроциты через 3 часа после инъекции мышиTable 4
Percentage of macrophages or dendritic cells from the spleen having phagocytosed fluorescent erythrocytes 3 hours after mouse injection
Через 3 часа после инъекции, мышиные эритроциты, загруженные яичным альбумином и обработанные анти-TER119 антителом, практически не присутствуют в крови мышей (1%), в то время как в крови мышей все еще присутствуют не обработанные, загруженные яичным альбумином эритроциты (4,6%).3 hours after injection, murine erythrocytes loaded with ovalbumin and treated with anti-TER119 antibody are practically absent in the blood of mice (1%), while untreated, ovalbumin-loaded erythrocytes are still present in the blood of mice (4, 6%).
Эритроциты, которые были обработаны анти-TER119 антителом, фагоцитозированы F4/80 макрофагами и CD11c дендритными клетками селезенки.RBCs that have been treated with anti-TER119 antibody are phagocytosed by F4/80 macrophages and spleen CD11c dendritic cells.
Эритроциты, обработанные анти-TER119 антителом, более эффективно фагоцитозированы F4/80 макрофагами селезенки, по сравнению с не обработанными эритроцитами. 81% макрофагов селезенки фагоцитозировали обработанные антителом эритроциты, и только 28% в необработанной партии (Таблица 4).RBCs treated with anti-TER119 antibody are more efficiently phagocytosed by F4/80 spleen macrophages than untreated RBCs. 81% of spleen macrophages phagocytosed antibody-treated erythrocytes, and only 28% in the untreated batch (Table 4).
Обработанные антителом эритроциты также более эффективно фагоцитозировались CD11c дендритными клетками из селезенки, по сравнению с не обработанными эритроцитами. Соответственно, 22% дендритных клеток фагоцитозировали обработанные антителом эритроциты, по сравнению с только 5% необработанных эритроцитов (Таблица 4).Antibody-treated erythrocytes were also more efficiently phagocytosed by CD11c dendritic cells from the spleen compared to untreated erythrocytes. Accordingly, 22% of dendritic cells phagocytosed antibody-treated erythrocytes, compared to only 5% of untreated erythrocytes (Table 4).
Процент макрофагов печени, имеющих фагоцитозированные флуоресцентные эритроциты через 3 часа после инъекции мышиTable 5
Percentage of liver macrophages having phagocytosed fluorescent erythrocytes 3 hours after mouse injection
Эритроциты, обработанные анти-TER119 антителом, фагоцитозированы F4/80 макрофагами печени.RBCs treated with anti-TER119 antibody are phagocytosed by F4/80 liver macrophages.
Эритроциты, обработанные анти-TER119 антителом, более эффективно фагоцитозированы F4/80 макрофагами печени по сравнению с не обработанными эритроцитами. 50% макрофагов печени фагоцитозируют обработанные антителом эритроциты, по сравнению с только 24% в необработанной партии (таблица 5).RBCs treated with anti-TER119 antibody are more efficiently phagocytosed by F4/80 liver macrophages compared to untreated RBCs. 50% of liver macrophages phagocytose antibody-treated erythrocytes, compared to only 24% in the untreated batch (Table 5).
В итоге, связывание антитела с эритроцитами позволяет эффективную доставку эритроцитов в селезенку и печень, и значительно повышает процент дендритных клеток и макрофагов, способных к фагоцитозированию таких эритроцитов.In summary, antibody binding to erythrocytes allows efficient delivery of erythrocytes to the spleen and liver, and significantly increases the percentage of dendritic cells and macrophages capable of phagocytosing such erythrocytes.
Пример 13. Измерение процентной доли регулирующих Т-клеток и производство ими противовоспалительного интерлейкина-10 (IL-10) после одной инъекции поли(I:C) и обработанных антителами или не обработанных, содержащих яичный альбумин, эритроцитов у мышейExample 13 Measurement of the Percentage of Regulatory T Cells and Their Production of Anti-inflammatory Interleukin-10 (IL-10) after a Single Injection of Poly(I:C) and Antibody-Treated or Untreated Egg Albumin-Containing RBCs in Mice
Целью этого исследования является измерение процентной доли регулирующих Т-клеток у мышей C57BI/6 после инъекции Поли(I:C) и обработанных антителами (анти-TER119) или не обработанных, содержащих яичный альбумин, эритроцитов.The aim of this study is to measure the percentage of regulatory T cells in C57BI/6 mice following injection of Poly(I:C) and antibody-treated (anti-TER119) or non-treated ovalbumin containing erythrocytes.
Две партии 30×107 обработанных антителом или не обработанных, содержащих яичный альбумин, эритроцитов от мышей OF1 получают по методике примера 8. В этом исследовании эквивалентное количество уловленного яичного альбумина вводят свободно, и отрицательным контролем является консервирующий раствор эритроцитов (глюкозированный NaCl, содержащий 33% декомплементированной плазмы мышей). Количество свободного или уловленного ЯА, впрыскиваемого мышам, составляет 2 мкг. Количество свободного Поли(I:C), впрыскиваемого мышам, составляет 25 мкг.Two batches of 30 x 10 7 antibody-treated or untreated ovalbumin-containing erythrocytes from OF1 mice were prepared as described in Example 8. % decomplemented mouse plasma). The amount of free or trapped NA injected into mice is 2 µg. The amount of free Poly(I:C) injected into mice is 25 µg.
Партия 1: содержащие яичный альбумин эритроциты и Поли(I:C)Batch 1: ovalbumin containing erythrocytes and Poly(I:C)
Партия 2: обработанные антителом, содержащие яичный альбумин, эритроциты и Поли(I:C)Lot 2: Antibody treated containing ovalbumin, erythrocytes and Poly(I:C)
Партии впрыскивают внутривенно мышам C57BI/6 mice (4 мыши в группе). Через семь дней после впрыскивания партии мышей умерщвляют, и их селезенки собирают. Для измерения процента экспрессирующих FOXP3 CD4+ Т-клеток проточной цитометрией (Фигура 1, Таблица 6), используют 2,5×106 клетки селезенки. Коротко, после ЭЦТ лизиса с применением раствора NH4Cl (StemCell Technologies, каталожный номер 7850), клетки селезенки сначала окрашивают PC5-анти-CD4 (Biolegend, номер по каталогу BLE100514) и FITC-анти-CD25 моноклональными антителами (Biolegend, номер по каталогу BLE110569), и затем инкубируют с буферами фиксации и пермеабилизации (Biolegend, номер по каталогу 421303) перед инкубированием с PE-анти-FOXP3 mAb (Biolegend, номер по каталогу 320008) или контролем изотипа.Batches are injected intravenously into C57BI/6 mice (4 mice per group). Seven days after injection, batches of mice are sacrificed and their spleens are harvested. To measure the percentage of FOXP3-expressing CD4 + T cells by flow cytometry (Figure 1, Table 6), 2.5×10 6 spleen cells were used. Briefly, after ECT lysis using NH 4 Cl solution (StemCell Technologies, cat. no. 7850), spleen cells are first stained with PC5-anti-CD4 (Biolegend, cat. no. BLE100514) and FITC-anti-CD25 monoclonal antibodies (Biolegend, cat. no. BLE110569) and then incubated with fixation and permeabilization buffers (Biolegend, cat. no. 421303) before incubation with PE-anti-FOXP3 mAb (Biolegend, cat. no. 320008) or isotype control.
Для измерения процента регулирующих Т-клеток (CD4+ CD25+), производящих IL-10, проточной цитометрией (Фигура 2). Клетки селезенки (5×106 клеток/мл) культивируют 0,1 мкг/мл пептида ЯА323-339 (Genscript, номер по каталогу 41007-1) в течение 4 часов при 37°C в 5% CO2-воздухе на 24-луночных культуральных планшетах. Через час после начала культивирования, Брефелдин A (Ebioscience, номер по каталогу 420601) добавляют для блокирования секреции цитокина. В конце культивирования, клетки сначала окрашивают PC5-анти-CD4 и FITC-анти-CD25 моноклональными антителами и затем инкубируют буфером фиксации (Biolegend, номер по каталогу 420801) и буфером пермеабилизации (Biolegend, номер по каталогу 421002) перед инкубированием с PE-анти-IL-10 mAb (Biolegend, номер по каталогу 505008) или контролем изотипа.To measure the percentage of regulatory T cells (CD4+ CD25+) producing IL-10 by flow cytometry (Figure 2). Spleen cells (5×10 6 cells/ml) are cultured with 0.1 μg/ml peptide YA323-339 (Genscript, catalog number 41007-1) for 4 hours at 37°C in 5% CO 2 -air for 24- well culture plates. One hour after the start of culture, Brefeldin A (Ebioscience, catalog number 420601) is added to block cytokine secretion. At the end of culture, cells are first stained with PC5-anti-CD4 and FITC-anti-CD25 monoclonal antibodies and then incubated with fixation buffer (Biolegend, catalog number 420801) and permeabilization buffer (Biolegend, catalog number 421002) before incubation with PE-anti -IL-10 mAb (Biolegend, catalog number 505008) or isotype control.
Процент регулирующих CD4 Т-клеток, экспрессирующих фактор транскрипции FOXP3, значительно повышается после инъекции Поли(I:C) и обработанных антителом, содержащих яичный альбумин, эритроцитов или свободного ЯА по сравнению с контрольными мышами, которым впрыскивали консервирующий раствор (Фигура 1, Таблица 6, тест Стьюдента, p<0,007 и p<0,05, соответственно).The percentage of CD4 regulatory T cells expressing the transcription factor FOXP3 is significantly increased after injection of Poly(I:C) and antibody-treated ovalbumin-containing erythrocytes or free JA compared to preservative injected control mice (Figure 1, Table 6 , Student's test, p<0.007 and p<0.05, respectively).
Процент CD4 Т-клеток, экспрессирующих FOXP3Table 6
Percentage of CD4 T cells expressing FOXP3
Тем не менее, только регулирующие T-клетки, индуцированные инъекцией обработанных антителом, содержащими ЯА, эритроцитов и Поли(I:C), могут производить противовоспалительный цитокин (IL-10) после повторного стимулирования in vitro с пептидом ЯА (Фигура 2, таблица 7).However, only regulatory T cells induced by injection of antibody-treated RBCs containing JA and Poly(I:C) can produce an anti-inflammatory cytokine (IL-10) after in vitro restimulation with JA peptide (Figure 2, Table 7 ).
Процент регулирующих CD4+ CD25+ Т-клеток, производящих IL-10Table 7
Percentage of CD4+ CD25+ regulatory T cells producing IL-10
В общем, инъекция обработанных антителом, содержащих ЯА, эритроцитов и Поли(I:C) вызывает образование регулирующих Т-клеток, способных вырабатывать IL-10 после повторного стимулирования антигеном.In general, injection of antibody-treated, NA-containing erythrocytes and Poly(I:C) induces the formation of regulatory T cells capable of producing IL-10 upon re-stimulation with antigen.
На Фигуре 1, процент FOXP3+ CD4+ Т-клеток в селезенке определяют проточной цитометрией через 7 дней после внутривенной инъекции мышам C57BL/6 обработанных антителом (черные столбики) или не обработанных (темно-серые столбики), содержащих ЯА, эритроцитов и Поли(I:C) или свободного ЯА и Поли(I:C) (светло-серые столбики) или контрольной среды (белые столбики). Количество свободного или уловленного ЯА, впрыскиваемого мышам, составляло 2 мкг, и количество Поли(I:C) составляло 25 мкг.In Figure 1, the percentage of FOXP3+ CD4+ T cells in the spleen is determined by flow cytometry 7 days after intravenous injection in C57BL/6 mice treated with antibody (black bars) or untreated (dark gray bars), containing RA, erythrocytes and Poly(I: C) or free IA and Poly(I:C) (light gray bars) or control medium (white bars). The amount of free or trapped NA injected into mice was 2 µg and the amount of Poly(I:C) was 25 µg.
На Фигуре 2, образование IL-10 регулирующими CD4+ CD25+ Т-клетками определяют проточной цитометрией после in vitro повторного стимулирования с пептидом ЯА 0,1 мкг/мл клеток селезенки, выделенных у мышей C57BL/6 через 7 дней после внутривенной инъекции обработанных антителом (черные столбики) или не обработанных (темно-серые столбики), содержащих ЯА, эритроцитов и Поли(I:C) или свободного ЯА и Поли(I:C) (светло-серые столбики) или контрольной среды (белые столбики). Количество свободного или уловленного ЯА, впрыскиваемого мышам, составляло 2 мкг, и количество Поли(I:C) составляло 25 мкг.In Figure 2, IL-10 production by CD4 + CD25 + T cells is determined by flow cytometry after in vitro re-stimulation with 0.1 μg/ml YA peptide of spleen cells isolated from C57BL/6 mice 7 days after intravenous injection of antibody-treated ( black bars) or untreated (dark gray bars) containing NA, erythrocytes and Poly(I:C) or free NA and Poly(I:C) (light gray bars) or control medium (white bars). The amount of free or trapped NA injected into mice was 2 µg and the amount of Poly(I:C) was 25 µg.
Пример 14. BS3 обработка эритроцитов, содержащих яичный альбуминExample 14 BS3 Treatment of Egg Albumin Containing Erythrocytes
Суспензию эритроцитов, в которые инкапсулирован ЯА (пример 8) несколько раз промывают перед разведением до 1,7×106 клеток/мкл с применением ФРФБ, и смешивают с одним объемом буферного раствора 2 мМ BS3 (раствор BS3 содержит глюкозу, 0,09%, и фосфатный буфер, pH 7,4), с получением конечной концентрации BS3 1 мМ. Клетки инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию гасят добавлением одного объема 20 мМ Tris-HCl, NaCl 140 мМ. После инкубирования при комнатной температуре в течение 5 минут, смесь центрифугируют при 800 g в течение 5 мин, 4°C. Затем клетки промывают три раза NaCl глюкозой (центрифугирование при 800 g) в течение 10 мин, затем доводят до гематокрита 50% декомплементированной плазмой.The suspension of erythrocytes encapsulated in RA (Example 8) was washed several times before diluted to 1.7×10 6 cells/µl using PBS and mixed with one volume of 2 mM BS3 buffer solution (BS3 solution contains glucose, 0.09% , and phosphate buffer, pH 7.4) to give a final BS3 concentration of 1 mM. Cells are incubated for 30 minutes at room temperature. The reaction is quenched by adding one volume of 20 mM Tris-HCl, NaCl 140 mM. After incubation at room temperature for 5 minutes, the mixture is centrifuged at 800 g for 5 minutes, 4°C. The cells are then washed three times with NaCl glucose (centrifugation at 800 g) for 10 min, then brought to hematocrit with 50% decomplemented plasma.
Пример 15. Обработка ионофором эритроцитов, содержащих яичный альбуминExample 15 Ionophore Treatment of Egg Albumin Containing Erythrocytes
Суспензию эритроцитов, в которые инкапсулирован ЯА (пример 8), промывают один раз буфером A, содержащим Hepes 10 мМ, NaCl 140 мМ, АБС 0,1%, CaCl2 2,5 мМ, и затем суспензию разводят до 1,106 клеток/мкл с применением буфера A. Ионофор, концентрированный в ДМСО, разводят буфером A и затем добавляют в суспензию клеток для получения конечной концентрации 0,15 мкМ. Клетки инкубируют в течение 30 мин при 37°C. Смесь центрифугируют при 800 g в течение 6 мин, 4°C. Затем клетки промывают три раза NaCl глюкозой (центрифугирование при 800 g) в течение 10 мин, затем доводят до гематокрита 50% декомплементированной плазмой.The suspension of erythrocytes encapsulated with AA (Example 8) is washed once with buffer A containing Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, ABS 0.1%, CaCl 2 2.5 mM, and then the suspension is diluted to 1.10 6 cells /μl using buffer A. The ionophore concentrated in DMSO is diluted with buffer A and then added to the cell suspension to obtain a final concentration of 0.15 μm. Cells are incubated for 30 min at 37°C. The mixture is centrifuged at 800 g for 6 min, 4°C. The cells are then washed three times with NaCl glucose (centrifugation at 800 g) for 10 min, then brought to hematocrit with 50% decomplemented plasma.
Пример 16. Измерение процента регулирующих Т-клеток в печени и селезенке после одной инъекции содержащих яичный альбумин эритроцитов у мышей, обработанных для доставки в печени и/или для подавления АПК провоспалительной реакцииExample 16 Measurement of the percentage of regulatory T cells in the liver and spleen after a single injection of ovalbumin-containing erythrocytes in mice treated for liver delivery and/or APC suppression of the pro-inflammatory response
Целью этого исследования является демонстрация того, что применение ЭЦТ, обработанных для доставки в печень или подавления АПК провоспалительной реакции, в качестве системы доставки антигена, вызывает увеличение процента регулирующих Т-клеток у мышей.The aim of this study is to demonstrate that the use of ECTs treated to deliver to the liver or to suppress the pro-inflammatory APC response as an antigen delivery system causes an increase in the percentage of regulatory T cells in mice.
Партии 126×107 обработанных антителом, обработанных BS3 или обработанных ионофором, содержащих яичный альбумин эритроцитов из мышей C57BL/6 получают по методике примера 8. Количество уловленного ЯА, впрыскиваемого мышам, составляет 8 мкг.Batches of 126 x 10 7 antibody-treated, BS3-treated, or ionophore-treated, ovalbumin-containing erythrocytes from C57BL/6 mice were prepared as described in Example 8. The amount of captured NA injected into mice was 8 μg.
Партия 1: Обработанные ионофором, содержащие яичный альбумин эритроцитыBatch 1: Ionophore-treated ovalbumin containing erythrocytes
Партия 2: обработанные BS3, содержащие яичный альбумин эритроцитыBatch 2: BS3-treated ovalbumin containing erythrocytes
Партия 3: обработанные антителом, содержащие яичный альбумин эритроцитыLot 3: antibody-treated, ovalbumin-containing erythrocytes
Партия 4: обработанные антителом, содержащие яичный альбумин эритроциты и Поли(I:С)Lot 4: Antibody-treated ovalbumin-containing erythrocytes and Poly(I:C)
Партии впрыскивают внутривенно мышам C57BI/6 (3 мыши в группе). Через семь дней после инъекции партии мышей умерщвляют, и их селезенки и печень собирают. Для измерения процента экспрессирующих FOXP3 CD4+ Т-клеток прочной цитометрией в селезенке (Фигура 3, Таблица 8) и в печени (Фигура 4, Таблица 8), применяют 1×106 и 2,5×106 клеток печени и клеток селезенки. Коротко, после ЭЦТ лизиса с применением раствора NH4Cl (StemCell Technologies, кат. № 7850), клетки сначала окрашивают PC5-анти-CD4 (Biotegend. кат. № BLE100514) и FITC-анти-CD25 моноклональными антителами (Biolegend, кат. № BLE110569), и затем инкубируют с буферами фиксации и пермеабилизации (Biolegend, кат. № 421303), затем инкубируют PE-анти-FOXP3 mAb (Biolegend, кат. № 320008) или контролем изотипа.Batches are injected intravenously into C57BI/6 mice (3 mice per group). Seven days after injection, a batch of mice are sacrificed and their spleens and livers are harvested. To measure the percentage of FOXP3 expressing CD4 + T cells by solid cytometry in the spleen (Figure 3, Table 8) and liver (Figure 4, Table 8), 1×10 6 and 2.5×10 6 liver and spleen cells are used. Briefly, after ECT lysis using NH 4 Cl solution (StemCell Technologies, cat. no. 7850), cells are first stained with PC5-anti-CD4 (Biotegend. cat. no. BLE100514) and FITC-anti-CD25 monoclonal antibodies (Biolegend, cat. no. BLE110569) and then incubated with fixation and permeabilization buffers (Biolegend, cat. no. 421303), then incubated with PE-anti-FOXP3 mAb (Biolegend, cat. no. 320008) or isotype control.
На Фигуре 3 процент FOXP3+ CD4+ Т-клеток в селезенке определяют проточной цитометрией через 7 дней после внутривенной инъекции мышам C57BL/6 обработанных ионофором (темно-серный столбик), обработанных BS3 (серый столбик) или обработанных антителом (светло-серый столбик) содержащих ЯА эритроцитов, или обработанных антителом, содержащих ЯА эритроцитов и Поли(I:C) (черный столбик) или контрольной среды (белый столбик). Количество уловленного ЯА, впрыскиваемого мышам составляет 8 мкг.In Figure 3, the percentage of FOXP3+ CD4+ T cells in the spleen is determined by flow cytometry 7 days after intravenous injection in C57BL/6 mice treated with ionophore (dark gray bar), treated with BS3 (gray bar) or treated with antibody (light gray bar) containing AA erythrocytes or antibody-treated containing RBC NA and Poly(I:C) (black bar) or control medium (white bar). The amount of captured NA injected into mice is 8 μg.
На Фигуре 4, процент FOXP3+ CD4+ Т-клеток в печени определяют проточной цитометрией через 7 дней после внутривенной инъекции мышам C57BL/6 обработанных ионофором (темно-серный столбик), обработанных BS3 (серый столбик) или обработанных антителом (светло-серый столбик) содержащих ЯА эритроцитов, или обработанных антителом, содержащих ЯА эритроцитов и Поли(I:C) (черный столбик) или контрольной среды (белый столбик). Количество уловленного ЯА, впрыскиваемого мышам составляет 8 мкг.In Figure 4, the percentage of FOXP3+ CD4+ T cells in the liver is determined by flow cytometry 7 days after intravenous injection in C57BL/6 mice treated with ionophore (dark gray bar), treated with BS3 (gray bar) or treated with antibody (light gray bar) containing RA of erythrocytes, or antibody-treated, containing RA of erythrocytes and Poly(I:C) (black bar) or control medium (white bar). The amount of captured NA injected into mice is 8 μg.
Для измерения процента ЯА-специфических CD8 Т-клеток проточной цитометрией (Фигура 5, Таблица 9), клетки селезенки окрашивают PC7-анти-CD8 (Biolegend, кат. № BLE100722), FITC-анти-CD3 (Biolegend, кат. № BL E100203) и PC5-анти-C062L моноклональными антителами (Biolegend, кат. № BLE104410) и PE-ЯА-тетрамером (Beckman Coulter, кат. № T20076).To measure the percentage of JA-specific CD8 T cells by flow cytometry (Figure 5, Table 9), spleen cells are stained with PC7-anti-CD8 (Biolegend, cat. no. BLE100722), FITC-anti-CD3 (Biolegend, cat. no. BL E100203 ) and PC5-anti-C062L monoclonal antibodies (Biolegend, cat. no. BLE104410) and PE-RA tetramer (Beckman Coulter, cat. no. T20076).
На Фигуре 5, процент ЯА-специфических CD8+ Т-клеток в селезенке определяют проточной цитометрией через 7 дней после внутривенной инъекции мышам C57BL/6 обработанных ионофором (темно-серный столбик), обработанных BS3 (серый столбик) или обработанных антителом (светло-серый столбик) содержащих ЯА эритроцитов, или обработанных антителом, содержащих ЯА эритроцитов и Поли(I:C) (черный столбик) или контрольной среды (белый столбик). Количество уловленного ЯА, впрыскиваемого мышам составляет 8 мкг.In Figure 5, the percentage of JA-specific CD8+ T cells in the spleen is determined by flow cytometry 7 days after intravenous injection in C57BL/6 mice treated with ionophore (dark gray bar), treated with BS3 (gray bar) or treated with antibody (light gray bar). ) RBCs containing NA or treated with antibody containing RBCs NA and Poly(I:C) (black bar) or control medium (white bar). The amount of captured NA injected into mice is 8 μg.
Для измерения процента регулирующих Т-клеток (CD4+ CD25+), производящих IL-10, проточной цитометрией (Таблица 10), клетки селезенки (5×106 клеток/мл) культивируют с 0,1 мкг/мл ЯА323-339 пептидом (Genecript, кат. № 41007-1) или без пептида в течение 4 часов при 37°C в 5% CO2-воздухе в 24-луночных культуральных планшетах. Через один час после начала культивирования, Брефелдин A (Ebiosctence, кат. № 420601) добавляют для блокирования секреции цитокина. В конце культивирования клетки сначала окрашивают PC5-анти-CD4 и FITC-анти-CD25 моноклональными антителами и затем инкубируют буфером фиксации (Biolegend, кат. № 420801) и буфером пермеабилизации (Biolegend, кат. № 421002), затем инкубируют PE-анти-IL-10 mAb (Biolegend, кат. № 505008) или контролем изотипа.To measure the percentage of regulatory T cells (CD4+ CD25+) producing IL-10 by flow cytometry (Table 10), spleen cells (5×10 6 cells/ml) were cultured with 0.1 μg/ml RAA323-339 peptide (Genecript, 41007-1) or without peptide for 4 hours at 37°C in 5% CO2-air in 24-well culture plates. One hour after the start of culture, Brefeldin A (Ebiosctence, cat. no. 420601) is added to block cytokine secretion. At the end of culture, cells are first stained with PC5-anti-CD4 and FITC-anti-CD25 monoclonal antibodies and then incubated with fixation buffer (Biolegend, cat. no. 420801) and permeabilization buffer (Biolegend, cat. no. 421002), then incubated with PE-anti- IL-10 mAb (Biolegend cat. no. 505008) or isotype control.
Обработка ионофором является единственной обработкой, которая вызывает значительное увеличение регулирующих CD4 Т-клеток, экспрессирующих FOXP3 и в селезенке, и в печени (Таблица 8 и Фигуры 3 и 4, p<0,05). Обработка антителом вызывает значительное увеличение регулирующих CD4 Т-клеток, экспрессирующих FOXP3, только в селезенке (Таблица 8, Фигура 3, p<0,05).Ionophore treatment is the only treatment that causes a significant increase in CD4 regulatory T cells expressing FOXP3 in both the spleen and liver (Table 8 and Figures 3 and 4, p<0.05). Antibody treatment causes a significant increase in regulatory CD4 T cells expressing FOXP3, only in the spleen (Table 8, Figure 3, p<0.05).
Процент регулирующих FOXP3 CD4+ Т-клеток в селезенке и печениTable 8
Percentage of FOXP3-regulating CD4 + T cells in spleen and liver
(± стандартное отклонение)% CD4 T cells expressing FOXP3 in the liver
(± standard deviation)
Только совместная инъекция Ab-обработанных, содержащих ЯА ЭЦТ и Поли(I:C) вызывает повышение процента ЯА-специфических CD8 Т-клеток (Таблица 9, Фигура 5).Only co-injection of Ab-treated JA-containing ECT and Poly(I:C) causes an increase in the percentage of JA-specific CD8 T cells (Table 9, Figure 5).
Процент регулирующих ЯА-специфических CD8+ Т-клеток в селезенкеTable 9
Percentage of regulating JA-specific CD8 + T cells in the spleen
(± стандартное отклонение)% JA-specific CD8 T cells
(± standard deviation)
Только совместная инъекция Ab-обработанных, содержащих ЯА ЭЦТ и Поли(I:С) вызывает увеличение процента CD4+ CD25+ T-клеток, производящих IL-10, в селезенке, и это производство не является специфическим к ЯА.Only co-injection of Ab-treated JA-containing ECT and Poly(I:C) causes an increase in the percentage of CD4 + CD25 + T cells producing IL-10 in the spleen, and this production is not specific to JA.
Пример 17. Измерение толерантности к ЯА после трех инъекций содержащих яичный альбумин эритроцитов у мышей, обработанных для доставки в печень и подавления АПК провоспалительной реакцииExample 17 Measuring JA Tolerance After Three Injections of Egg Albumin Containing Erythrocytes in Mice Treated for Liver Delivery and APC Suppression of the Proinflammatory Response
Целью этого исследования является демонстрация того, что инъекции содержащих ЯА ЭЦТ, обработанных для доставки в печень и подавления АПК провоспалительной реакции, ингибируют реакции ЯА T и B клеток, вызванные ЯА и Поли(I:С).The aim of this study is to demonstrate that injections of JA-containing ECT, treated to deliver to the liver and suppress the pro-inflammatory APC response, inhibit the JA and B cell responses induced by JA and Poly(I:C).
До обработки образцы крови (200 мкл) у мышей C57BL/6 собирают ретроорбитальной пункцией на трубке сепаратора сыворотка/гель (Becton Dickinson, Microtainer TM SST, ref 365951) с получением пре-иммунной сыворотки. Затем мышам внутривенно вводят три раза в дни -7, -3 и -1 контрольную среду, свободный ЯА или партию обработанных ионофором, содержащих яичный альбумин, эритроцитов, полученных из крови мышей C57BL/6 и согласно методике примера 8 (3-4 мыши в группе). Количество свободного и уловленного ЯА, впрыскиваемого мышам, составляет 120 и 90 мкг, соответственно, на 0 и 21 дни мышам вводят ЯА и Поли(I:С) (100 мкг и 50 мкг/мышь, соответственно). Некоторые мыши получают только контрольную среду. Через шесть дней после последней инъекции образцы крови мышей (200 мкл) собирают с получением пост-иммунной сыворотки, и суспензию СЭКФ-меченных C57BL/6 спленоцитов, представляющих или нет ЯА257-264 пептид в соотношении 1:1 впрыскивают мышам для оценки способности цитотоксических CD8 Т-клеток для лизирования клеток SIINFEKL. Через 16 часов после инъекции клеток ЯА257-264 мышей умерщвляют, и их селезенки собирают.Prior to treatment, blood samples (200 μl) from C57BL/6 mice were collected by retroorbital puncture on a serum/gel separator tube (Becton Dickinson, Microtainer™ SST, ref 365951) to obtain pre-immune serum. Mice are then intravenously injected three times on days -7, -3, and -1 with control medium, free NA, or a batch of ionophore-treated, ovalbumin-containing erythrocytes obtained from the blood of C57BL/6 mice and according to the procedure of example 8 (3-4 mice in group). The amount of free and entrapped NA injected into mice is 120 and 90 µg, respectively, on days 0 and 21 mice are injected with NA and Poly(I:C) (100 µg and 50 µg/mouse, respectively). Some mice receive only control medium. Six days after the last injection, blood samples from mice (200 μl) were collected to obtain post-immune serum, and a suspension of SECF-labeled C57BL/6 splenocytes, whether or not presenting the RA257-264 peptide in a 1:1 ratio, was injected into mice to assess the ability of cytotoxic CD8 T cells for lysing SIINFEKL cells. 16 hours after the injection of YA257-264 cells, mice are sacrificed and their spleens are harvested.
Для измерения процента активированных и ЯА-специфических CD8 Т-клеток проточной цитометрией (Таблица 11), клетки селезенки окрашивают PC7-анти-CD8 (Biolegend, кат. № BLE100722), FITC-анти-CD3 (Biolegend, кат. № BLE100203) и PC5-анти-CD62L моноклональными антителами (Biolegend, кат. № BLE104410) и PE-ЯА-тетрамером (Beckman Coulter, кат. № T20076).To measure the percentage of activated and JA-specific CD8 T cells by flow cytometry (Table 11), spleen cells were stained with PC7-anti-CD8 (Biolegend, cat. no. BLE100722), FITC-anti-CD3 (Biolegend, cat. no. BLE100203), and PC5-anti-CD62L monoclonal antibodies (Biolegend, cat. no. BLE104410) and PE-RA tetramer (Beckman Coulter, cat. no. T20076).
Для измерения процента ЯА-специфического in vivo лизиса (Таблица 12), процент СЭКФ низких и СЭКФ высоких клеток измеряют проточной цитометрией и определяют по следующей формуле:To measure the percentage of JA-specific in vivo lysis (Table 12), the percentage of low cell SEFR and high cell SEFR was measured by flow cytometry and determined by the following formula:
% = [1-(доля обработанных мышей/доля не обработанных мышей)]×100, где доля = процент СЭКФ высоких/процент СЭКФ низких% = [1-(proportion of treated mice/proportion of non-treated mice)]×100 where proportion = percent SEFR high/percent SEFR low
Для измерения анти-ЯА IgG1 и IgG2a титров в сыворотке (Таблица 13), различные разведения пре- и пост-иммунной сыворотки (от 1/50 до 1/36450) инкубируют в 96-луночных планшетах MaxiSorp (Nunc, кат. № 442404), предварительно покрытых ЯА (Serlabo, кат. № WQ-LS003054, 5 мкг/мл). Присутствие анти-ЯА IgG1 и IgG2a обнаруживают инкубированием пероксидазы хрена (HRP), конъюгированной с анти-мышиным IgG1 (Thermo Scientific, кат. № cat PA1-86031, разведение 1/4000) или анти-мышиным IgG2a (Thermo Scientific, кат. № PA1-86039, разведение 1/4000) с последующим инкубированием с тетраметилбензидиновым (ТМБ) субстратом (Biolegend, кат. № 421101). Реакцию останавливают раствором 2N H2SO4 и измеряют оптическую плотность при 450 нм и 630 нм с применением планшетного ридера (Biotek, кат. № ELx808). Данные, полученные при 630 нм, вычитают из данных, полученных при 450 нм, и титр антитела определяют как разведение, для которого оптическая плотность более чем в 3 раза больше О.П., полученной для пре-иммунной сыворотки, разведенной 1/50.To measure anti-YA IgG1 and IgG2a serum titers (Table 13), various dilutions of pre- and post-immune serum (from 1/50 to 1/36450) are incubated in MaxiSorp 96-well plates (Nunc, cat. no. 442404) pre-coated with AA (Serlabo, cat. no. WQ-LS003054, 5 µg/ml). The presence of anti-YA IgG1 and IgG2a is detected by incubating horseradish peroxidase (HRP) conjugated with anti-mouse IgG1 (Thermo Scientific, cat. no. cat PA1-86031, dilution 1/4000) or anti-mouse IgG2a (Thermo Scientific, cat. no. PA1-86039, 1/4000 dilution) followed by incubation with tetramethylbenzidine (TMB) substrate (Biolegend cat. no. 421101). The reaction is stopped with a solution of 2N H 2 SO 4 and the optical density is measured at 450 nm and 630 nm using a plate reader (Biotek, cat. no. ELx808). The data obtained at 630 nm is subtracted from the data obtained at 450 nm, and the antibody titer is defined as the dilution for which the optical density is more than 3 times the O.P. obtained for pre-immune serum diluted 1/50.
Инъекции обработанных ионофором, содержащих ЯА ЭЦТ способны значительно снижать пролиферацию и активацию ЯА-специфических CD8 Т-клеток, индуцированных ЯА и Поли(I:С) по сравнению с инъекциями ЯА (Таблица 11; p<0,05).Injections of ionophore-treated JA-containing ECTs are able to significantly reduce the proliferation and activation of JA-specific CD8 T cells induced by JA and Poly(I:C) compared with JA injections (Table 11; p<0.05).
Процент активированных и ЯА-специфических CD8+ Т-клеток в селезенкеTable 11
Percentage of activated and JA-specific CD8 + T cells in the spleen
Инъекции обработанных ионофором, содержащих ЯА ЭЦТ способны значительно снижать ЯА-специфический клеточный лизис, вызванный ЯА и Поли(I:C) (Таблица 12; p<0,01).Injections of ionophore-treated, JA-containing ECTs are able to significantly reduce JA-specific cell lysis caused by JA and Poly(I:C) (Table 12; p<0.01).
Процент ЯА-специфического in vivo лизисаTable 12
Percentage of JA-specific in vivo lysis
Мыши, предварительно обработанные обработанными ионофором, содержащими ЯА ЭЦТ имеют очень низкие и/или не имеют титры анти-ЯА IgG1 и IgG2a антител по сравнению с мышами, предварительно обработанными ЯА (Таблица 13).Mice pretreated with ionophore-containing ECT JA have very low and/or no anti-JA IgG1 and IgG2a antibody titers compared to mice pretreated with JA (Table 13).
Титр анти-ЯА IgG1 и IgG2 антител в сывороткеTable 13
Serum anti-YA IgG1 and IgG2 antibody titer
Пример 18. Измерение иммунной толерантности к ЯА после инъекций различных количеств содержащих яичный альбумин эритроцитов у мышейExample 18 Measurement of Immune Tolerance to JA After Injections of Different Amounts of Egg Albumin-Containing Erythrocytes in Mice
Эксперимент проводят как описано в примере 17, за исключением того, что 2 различных партии обработанных ионофором, содержащих яичный альбумин эритроцитов получают с 2 различными концентрациями ЯА, с получением одной партии, партии 1, с 53250±6800 ЯА молекулами на ЭЦТ, как в примере 17, и другой партии, партии 2, с 8250±840 молекулами на ЭЦТ.The experiment was carried out as described in Example 17, except that 2 different batches of ionophore-treated, ovalbumin-containing erythrocytes were prepared with 2 different concentrations of RBCs, resulting in one batch, Batch 1, with 53250 ± 6800 RCA molecules per ECT, as in example 17, and another batch, batch 2, with 8250 ± 840 molecules per ECT.
C57BI/8 мышам вводят внутривенно, трижды, в дни -7, -3 и -1 110 мкл или 30 мкл партии 1. 110 мкл партии 2, 110 мкл свободного ЯА или 110 мкл консервирующего раствора. Количество ЯА и ЭЦТ, впрыснутых мышам, представлены в Таблице 14. На день 0 и день 21, мышам вводят ЯА и Поли(I:C) (100 мкг и 50 мкг/мышь, соответственно). Через шесть дней после инъекции мышей умерщвляют, селезенки собирают и количество IgG1, IgG2b и IgG2c измеряют в сыворотке как описано в Примере 17 с применением ПХ, конъюгированной с анти-мышиным IgG2b (Southern Biotech, 1090-05) и анти-мышиным IgG2c (Southern Biotech, 1079-05). Для измерения производства ИФНγ, клетки селезенки (5×106 клеток/мл) сначала культивируют с 0,1 мкг/мл ЯА323-339 пептида (Genscript, кат. № 41007-1) или без пептида в течение 48 часов при 37°C в 5% CO2-воздухе в 24-луночных культуральных планшетах. Затем ИФНγ измеряют в надосадочной жидкости проточной цитометрией с применением Cytometric Bead Array (BO Bioscience, 558296 и 558266). Для измерения процента цитотоксичного T-лимфоцитного антигена 4 (ЦТЛА-4), экспрессирующего CD4+ CD25+ Т-клетки проточной цитометрией, клетки селезенки сначала окрашивают PC5-анти-CD4 (Biolegend, кат. № BLE100514) и FITC-анти-CD25 моноклональными антителами (Biolegend, кат. № BLE110569), и затем фиксируют ФРФБ 1% параформальдегидом (Sigma Aldrich, F1635-25 мл) и пермеабилизуют сапонином 0,3% (Sigma Aldrich, 84510), затем инкубируют PE-анти-ЦТЛА-4 mAb (BO Pharminghen, кат. № 553720) или контролем изотипа.C57BI/8 mice are injected intravenously, thrice, on days -7, -3 and -1 with 110 µl or 30 µl of lot 1. 110 µl of lot 2, 110 µl of free AA or 110 µl of preservative solution. The amounts of NA and ECT injected into mice are shown in Table 14. On day 0 and day 21, mice were treated with NA and Poly(I:C) (100 μg and 50 μg/mouse, respectively). Six days after injection, mice are sacrificed, spleens are harvested and serum IgG1, IgG2b and IgG2c are measured as described in Example 17 using HRP conjugated with anti-mouse IgG2b (Southern Biotech, 1090-05) and anti-mouse IgG2c (Southern Biotech, 1090-05). Biotech, 1079-05). To measure IFNγ production, spleen cells (5×10 6 cells/mL) are first cultured with 0.1 µg/mL of RAA323-339 peptide (Genscript, cat. no. 41007-1) or without peptide for 48 hours at 37°C in 5% CO 2 -air in 24-well culture plates. IFNγ is then measured in the supernatant by flow cytometry using a Cytometric Bead Array (BO Bioscience, 558296 and 558266). To measure the percentage of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) expressing CD4+ CD25+ T cells by flow cytometry, spleen cells are first stained with PC5-anti-CD4 (Biolegend, cat. no. BLE100514) and FITC-anti-CD25 monoclonal antibodies ( Biolegend, Cat # BLE110569) and then fixed with FGFB 1% paraformaldehyde (Sigma Aldrich, F1635-25 mL) and permeabilized with 0.3% saponin (Sigma Aldrich, 84510), then incubated with PE-anti-CTLA-4 mAb (BO Pharminghen cat. no. 553720) or isotype control.
Количества ЯА и ЭЦТ, впрыскиваемые мышам при каждой инъекцииTable 14
Amounts of NA and ECT injected into mice with each injection
(30 мкл/мышь)Lot 1 low dose
(30 µl/mouse)
Мыши, предварительно обработанные Партией 1 высокой дозой, высоким количеством ЯА и ЭЦТ, имели значительно меньшее количество титров анти-ЯА IgG1, IgG2b и IgG2c антител, чем мыши, предварительно обработанные ЯА (Таблица 15, IgG1: p<0,002, IgG2b и IgG2c: p≤0,05). Более того, мыши, обработанные Партией 2, тем же количеством ЭЦТ, но более низкой дозой ЯА (8-11 мкг/мышь), также имели значительно меньше титров анти-ЯА IgG1 и IgG2c антител, чем мыши, обработанные ЯА (Таблица 15, IgG1: p<0,006, и IgG2c: p≤0,05). Однако мыши, обработанные Партией 1 низкой дозой, небольшим количеством ЯА и ЭЦТ, имели значительное количество титров антител. Таким образом, количество ЯА и ЭЦТ, впрыснутое мышам, играет ключевую роль в индуцировании иммунной толерантности.Mice pretreated with Lot 1 high dose, high amounts of JA and ECT had significantly lower anti-JA IgG1, IgG2b, and IgG2c antibody titers than mice pretreated with JA (Table 15, IgG1: p<0.002, IgG2b and IgG2c: p≤0.05). Moreover, mice treated with Lot 2, the same amount of ECT but lower dose of JA (8-11 µg/mouse), also had significantly lower anti-JA IgG1 and IgG2c antibody titers than mice treated with JA (Table 15, IgG1: p<0.006, and IgG2c: p≤0.05). However, mice treated with Lot 1 low dose, small amounts of NA and ECT had significant antibody titers. Thus, the amount of NA and ECT injected into mice plays a key role in inducing immune tolerance.
Титры анти-ЯА IgG1, IgG2b и IgG2c антител в сывороткеTable 15
Serum anti-YA IgG1, IgG2b, and IgG2c antibody titers
Обработка ЯА и Поли(I:С) вызывает увеличение производства ИФНγ в ответ на стимулирование ЯА. Это увеличение наблюдают у мышей, предварительно обработанных свободным ЯА, но не у мышей, предварительно обработанных обработанными ионофором, содержащими ЯА ЭЦТ Таблица 16, (p<0,005).Treatment with JA and Poly(I:C) causes an increase in IFNγ production in response to stimulation with JA. This increase is observed in mice pre-treated with free JA, but not in mice pre-treated with ionophore containing JA ECT Table 16, (p<0.005).
Производство ИФНγ спленоцитами, стимулированными ЯА классно 2-ограниченного пептида (среднее ± стандартное отклонение)Table 16
Production of IFNγ by splenocytes stimulated with NA of a famously 2-restricted peptide (mean ± standard deviation)
+2х ЯА и Поли(I:С)3x batch 1 high dose
+2x YA and Poly(I:C)
+2х ЯА и Поли(I:С)3x batch 1 low dose
+2x YA and Poly(I:C)
+2х ЯА и Поли(I:С)3x batch 2
+2x YA and Poly(I:C)
+2х ЯА и Поли(I:С)3x YA
+2x YA and Poly(I:C)
Так как ЦТЛА-4 является белком, который играет важную регулирующую роль в иммунной системе через передачу ингибирующего сигнала на Т-клетку, его экспрессию измеряют на CD4 CD25 регулирующих Т-клетках проточной цитометрией. Мыши, предварительно обработанные Партией 1 высокой дозой и Партией 2 имеют значительно более высокий процент экспрессии ЦТЛА-4 в CD4 CD25 регулирующих Т-клетках, по сравнению с мышами, предварительно обработанными ЯА и мышами, которые получали только ЯА+Поли(I:C) (Таблица 17, Партия 1: p≤0,03 и p≤0,02, соответственно, и Партия 2: p≤0,05). Более того, мыши, предварительно обработанные Партией 1 высокой дозой, имели значительно более высокую среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) экспрессии ЦТЛА-4 в CD4 CD25 регулирующих Т-клетках (Таблица 17, p≤0,03). Наконец, мыши, предварительно обработанные Партией 1 низкой дозой имели значительно более высокий процент экспрессии ЦТЛА-4 в CD4 CD25 регулирующих Т-клетках, по сравнению с мышами, получавшими только ЯА+Поли(I:C) (Таблица 17, p≤0,04).Since CTLA-4 is a protein that plays an important regulatory role in the immune system through the transmission of an inhibitory signal to the T cell, its expression is measured on CD4 CD25 regulatory T cells by flow cytometry. Mice pretreated with High Dose Lot 1 and Lot 2 have a significantly higher percentage of CTLA-4 expression in CD4 CD25 regulatory T cells compared to JA pretreated mice and mice that received JA+Poly(I:C) alone. (Table 17, Lot 1: p≤0.03 and p≤0.02, respectively, and Lot 2: p≤0.05). Moreover, mice pretreated with high dose Lot 1 had a significantly higher mean fluorescence intensity (MFI) of CTLA-4 expression in CD4 CD25 regulatory T cells (Table 17, p≤0.03). Finally, mice pretreated with low dose Lot 1 had a significantly higher percentage of CTLA-4 expression in CD4 CD25 regulatory T cells compared to mice treated with JA+Poly(I:C) alone (Table 17, p≤0, 04).
Процент и средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) ЦТЛА-4 в CD4 CD25 регулирующих Т-клетках (среднее ± стандартное отклонение)Table 17
Percentage and Mean Fluorescence Intensity (MFI) of CTLA-4 in CD4 CD25 regulatory T cells (mean ± standard deviation)
+2х ЯА и Поли(I:С)3x batch 1 high dose
+2x YA and Poly(I:C)
+2х ЯА и Поли(I:С)3x batch 1 low dose
+2x YA and Poly(I:C)
+2х ЯА и Поли(I:С)3x batch 2
+2x YA and Poly(I:C)
+2х ЯА и Поли(I:С)3x YA
+2x YA and Poly(I:C)
В заключение, обработка обработанными ионофором, содержащими антиген ЭЦТ позволяет предотвращать или снижать реакцию антиген-специфических T и B клеток в модели профилактики. Не только количество антигена, но и количество ЭЦТ, вводимое мышам, играет ключевую роль в этой терапии.In conclusion, treatment with antigen-containing ionophore-treated ECTs can prevent or reduce the response of antigen-specific T and B cells in a prophylaxis model. Not only the amount of antigen, but also the amount of ECT administered to mice plays a key role in this therapy.
Claims (34)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US25525009P | 2009-10-27 | 2009-10-27 | |
| US61/255,250 | 2009-10-27 | ||
| US32551110P | 2010-04-19 | 2010-04-19 | |
| US61/325,511 | 2010-04-19 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012121865/15A Division RU2012121865A (en) | 2009-10-27 | 2010-10-27 | COMPOSITION FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNOLOGICAL TOLERANCE |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017139244A RU2017139244A (en) | 2019-02-12 |
| RU2017139244A3 RU2017139244A3 (en) | 2021-02-26 |
| RU2782223C2 true RU2782223C2 (en) | 2022-10-24 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996013517A1 (en) * | 1994-10-27 | 1996-05-09 | Akzo Nobel N.V. | Novel peptides derived from autoantigen for use in immunotherapy of autoimmune diseases |
| WO2009019317A1 (en) * | 2007-08-08 | 2009-02-12 | Erytech Pharma | Composition and therapeutic anti-tumour vaccine |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996013517A1 (en) * | 1994-10-27 | 1996-05-09 | Akzo Nobel N.V. | Novel peptides derived from autoantigen for use in immunotherapy of autoimmune diseases |
| WO2009019317A1 (en) * | 2007-08-08 | 2009-02-12 | Erytech Pharma | Composition and therapeutic anti-tumour vaccine |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PRPVATOROV VM, IVANOVA GA The role of erythrocytes in the system of controlled transport of agents //Klinicheskaia Meditsina, 01 Jan 2009, 87(9):4-8. * |
| ВОРОБЬЕВ А.А. и др. Микробиология. Москва, "Медицина", 2003, стр.158-159. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210268082A1 (en) | METHOD OF INDUCING IMMUNE TOLERANCE BY ADMINISTERING ACTIVE PRINCIPLE-LOADING RBC's | |
| Cremel et al. | Red blood cells as innovative antigen carrier to induce specific immune tolerance | |
| US20220211826A1 (en) | Compositions and methods for inducing immune tolerance | |
| Banz et al. | In situ targeting of dendritic cells by antigen-loaded red blood cells: A novel approach to cancer immunotherapy | |
| JP2010505883A (en) | Compositions and methods for modulating immune responses | |
| Cremel et al. | Innovative approach in Pompe disease therapy: Induction of immune tolerance by antigen-encapsulated red blood cells | |
| TWI228419B (en) | Neospora vaccine | |
| JP2024038062A (en) | Method of obtaining regulatory T cells derived from thymus tissue and use of said cells as cellular immunotherapy in immune system disorders | |
| RU2782223C2 (en) | Composition for induction of specific immunological tolerance | |
| Gilchuk et al. | Eliciting epitope-specific cd8+ t cell response by immunization with microbial protein antigens formulated with α-galactosylceramide: theory, practice, and protocols | |
| US7262167B2 (en) | Drug, in particular for modulating the immunological response for the control of viruses, tumors, bacteria and parasites | |
| RU2597976C2 (en) | Method for producing regulatory dendritic cells | |
| US20040033232A1 (en) | Methods and compositions for in vivo clearance of pathogens | |
| Sambamurthy | Pharmaceutical biotechnology | |
| US20180015101A1 (en) | Compositions and methods for antigen-specific tolerance | |
| US20220213222A1 (en) | Prevention and treatment of type-1 diabetes using agonists of the (na++k+)-atpase | |
| Chalamcherla | PRINCIPLES OF IMMUNOLOGY | |
| Zhang et al. | Red blood cells in biology and translational medicine: natural vehicle inspires new biomedical applications | |
| Zepeda | Glycoconjugate-Based Vaccines for Chagas Disease | |
| Catapano et al. | CD1d-iNKT Cell Axis in Dyslipidemia | |
| Wilson et al. | Natural Killer T Cells as Targets for Therapeutic Intervention in Autoimmune Diseases |