RU2782076C2 - Method for production of blood substitute for use in veterinary medicine - Google Patents
Method for production of blood substitute for use in veterinary medicine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782076C2 RU2782076C2 RU2018136935A RU2018136935A RU2782076C2 RU 2782076 C2 RU2782076 C2 RU 2782076C2 RU 2018136935 A RU2018136935 A RU 2018136935A RU 2018136935 A RU2018136935 A RU 2018136935A RU 2782076 C2 RU2782076 C2 RU 2782076C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hemoglobin
- purification
- carried out
- kda
- solution
- Prior art date
Links
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 14
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102000008015 Hemeproteins Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108010089792 Hemeproteins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical class O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000002949 hemolytic Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- YOQDYZUWIQVZSF-UHFFFAOYSA-N sodium borohydride Substances [BH4-].[Na+] YOQDYZUWIQVZSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ODGROJYWQXFQOZ-UHFFFAOYSA-N sodium;boron(1-) Chemical compound [B-].[Na+] ODGROJYWQXFQOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000002572 peristaltic Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001698 pyrogenic Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 2
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010069173 Product contamination Diseases 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Vitamin C Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 108010002255 deoxyhemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 238000005137 deposition process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 108010050918 polyhemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к гематологии, и относится к способу получения кровезаменителя на основе полимеризованного гемоглобина с функцией переноса кислорода. Способ включает получение дезоксигенированного гемоглобина, его полимеризацию и очистку. Изобретение может быть использовано для производства кровезамещающих растворов, сопоставимых по эффективности газового транспорта (по переносу кислорода) с эритроцитами крови животных.The invention relates to veterinary medicine, in particular to hematology, and relates to a method for producing a blood substitute based on polymerized hemoglobin with an oxygen transfer function. The method includes obtaining deoxygenated hemoglobin, its polymerization and purification. The invention can be used for the production of blood-substituting solutions comparable in efficiency of gas transport (oxygen transfer) with animal blood erythrocytes.
Известен способ получения кровезаменителя-переносчика кислорода «Геленпол» /RU 2132687, А61К 35/18, опубл. 1999, RU 2162707, A61K 38/42, опубл.2001/. Для его приготовления в качестве сырья предложено использовать эритроцитарную массу человеческой крови со сроком хранения не более 36 суток, а это может негативно сказаться на запасах клинической крови. В технологии получения препарата «Геленпол» отсутствует этап удаления низкомолекулярного гемоглобина (несшитого тетрамера), что может негативно сказаться на качестве лечения больных.A known method of obtaining a blood substitute-oxygen carrier "Gelenpol" /RU 2132687, A61K 35/18, publ. 1999, RU 2162707, A61K 38/42, publ. 2001/. For its preparation, it is proposed to use as a raw material the erythrocyte mass of human blood with a shelf life of no more than 36 days, and this may adversely affect the supply of clinical blood. There is no stage of removal of low molecular weight hemoglobin (non-crosslinked tetramer) in the technology for obtaining the drug "Gelenpol", which can adversely affect the quality of treatment for patients.
Известен способ получения кровезаменителя - «бесклеточного заменителя эритроцитов» /RU 2203087, 2003, А61К 38/42/, в соответствии с которым удаляют лейкоциты и тромбоциты из крови, отмывают и лизируют эритроциты, переводят гемоглобин эритроцитов в СО-форму, удаляют примеси стромы с помощью фильтрации и тепловой обработки. Затем получают дезоксиформу гемоглобина, которую пиридоксилируют и полимеризуют. Проводят дальнейшую очистку, концентрирование и дезоксигенацию. A known method of obtaining a blood substitute - "cell-free substitute for erythrocytes" /RU 2203087, 2003, A61K 38/42/, according to which leukocytes and platelets are removed from the blood, washed and lysed erythrocytes, converts erythrocyte hemoglobin into CO-form, removes stromal impurities from by filtration and heat treatment. The deoxyform of hemoglobin is then obtained, which is pyridoxylated and polymerized. Further purification, concentration and deoxygenation are carried out.
Недостатком известного способа является его многостадийность, высокая стоимость и низкая производительность. Указанные недостатки связаны с тем, что для защиты гемоглобина от окисления используют окись углерода, для удаления которой необходима оксигенация раствора гемоглобина с последующей дезоксигенацией, что значительно (на 16 часов) удлиняет технологический процесс. Удаление негемовых белков в прототипе осуществляют путем нагрева раствора гемоглобина до 60°С, что также приводит к увеличению длительности технологического процесса на 10 часов. Кроме того, проведение модификации гемоглобина, а также тепловая обработка и гемолиз в атмосфере окиси углерода могут привести к денатурации гемоглобина, что снижает надежность технологии.The disadvantage of the known method is its multi-stage, high cost and low productivity. These disadvantages are due to the fact that carbon monoxide is used to protect hemoglobin from oxidation, for the removal of which it is necessary to oxygenate the hemoglobin solution followed by deoxygenation, which significantly (by 16 hours) lengthens the technological process. The removal of non-heme proteins in the prototype is carried out by heating the hemoglobin solution to 60°C, which also leads to an increase in the duration of the process by 10 hours. In addition, carrying out the modification of hemoglobin, as well as heat treatment and hemolysis in an atmosphere of carbon monoxide, can lead to denaturation of hemoglobin, which reduces the reliability of the technology.
Известен способ получения кровезаменителя /Патент RU2341286, 2007, А61К 38/42/, включающий получение дезоксигенированного гемоглобина, его полимеризацию и очистку. При этом получение дезоксигенированного гемоглобина включает гемолиз добавлением воды к эритроцитарной массе, отделение стромы, осаждение негемовых белков и их удаление из полученного раствора гемоглобина. A known method of obtaining a blood substitute /Patent RU2341286, 2007, A61K 38/42/, including obtaining deoxygenated hemoglobin, its polymerization and purification. At the same time, obtaining deoxygenated hemoglobin includes hemolysis by adding water to the erythrocyte mass, separation of the stroma, precipitation of non-heme proteins and their removal from the resulting hemoglobin solution.
Полимеризация включает обработку полученного дезоксигенированного гемоглобина модифицированным глутаровым альдегидом и восстановление боргидридом натрия, а чистка включает диафильтрацию. Для получения дезоксигенированного гемоглобина используют свободную от лейкоцитов эритроцитарную массу; осаждение негемовых белков ведут путем добавления к раствору гемоглобина концентрированного раствора хлорида натрия. После удаления негемовых белков осуществляют концентрирование раствора гемоглобина ультрафильтрацией. Очистку диафильтацией ведут на отсекающих мембранах с получением готового продукта в диапазоне по молекулярной массе не более 450 кДа и не менее 100 кДа.Polymerization includes treatment of the resulting deoxygenated hemoglobin with modified glutaraldehyde and reduction with sodium borohydride, and purification includes diafiltration. To obtain deoxygenated hemoglobin, a erythrocyte mass free of leukocytes is used; the precipitation of non-heme proteins is carried out by adding a concentrated solution of sodium chloride to the hemoglobin solution. After removal of non-heme proteins, the hemoglobin solution is concentrated by ultrafiltration. Purification by diafiltration is carried out on cut-off membranes to obtain a finished product in the molecular weight range of not more than 450 kDa and not less than 100 kDa.
Недостатком известного способа является его сложность, высокая степень затрат ресурсов и времени на проведение технологического процесса. Указанный недостаток связан с тем, что при получении дезоксигенированного гемоглобина используют стадию концентрирования гемоглобина ультрафильтрацией, что удлиняет технологический процесс и приводит к удорожанию продукта. Для процесса полимеризации дезоксигенированного гемоглобина используют модифицированный глутаровый альдегид, что также удлиняет технологический процесс.The disadvantage of this method is its complexity, high resource and time costs for the process. This drawback is due to the fact that when obtaining deoxygenated hemoglobin, the stage of hemoglobin concentration by ultrafiltration is used, which lengthens the technological process and leads to an increase in the cost of the product. For the process of polymerization of deoxygenated hemoglobin, modified glutaraldehyde is used, which also lengthens the technological process.
Известен способ получения кровезаменителя /Патент RU2361608, А61К 38/42, опубл. 2008/, включающий получение дезоксигенированного гемоглобина, его полимеризацию, очистку и сушку. Для процесса полимеризации не требуется модификации глутарового альдегида, следовательно, процесс сокращается на один этап, при этом исключается использование модификатора глутарового альдегида, глутаминовой кислоты. Диафильтацию проводят в стеклянных реакторах, вместо полимерных одноразовых контейнеров, как указано в способе по патенту /RU 2203087/, на отсекающих мембранах дважды (двухстадийная диафильтрация): по молекулярной массе 300 кДа, а затем 100 кДа. При этом получают готовый целевой продукт с молекулярной массой в диапазоне 192-320 кДа. Данный способ получения кровезаменителя выбран за прототип. A known method of obtaining a blood substitute /Patent RU2361608, A61K 38/42, publ. 2008/, including obtaining deoxygenated hemoglobin, its polymerization, purification and drying. The polymerization process does not require modification of glutaraldehyde, therefore, the process is reduced by one step, while eliminating the use of glutaraldehyde modifier, glutamic acid. Diafiltration is carried out in glass reactors, instead of polymer disposable containers, as indicated in the method according to the patent /RU 2203087/, on cut-off membranes twice (two-stage diafiltration): by molecular weight of 300 kDa, and then 100 kDa. In this case, a finished target product with a molecular weight in the range of 192-320 kDa is obtained. This method of obtaining a blood substitute is chosen as a prototype.
Недостатком прототипа является высокая степень затрат ресурсов и времени на проведение технологического процесса. Указанный недостаток связан с тем, что при двухстадийной диафильтрации очистку полимеризованного гемоглобина проводят дважды на отсекающих мембранах 300 кДа и 100 кДа, что удлиняет технологический процесс до 40 часов, а также требует использования значительных объемов воды для инъекций, используемой для приготовления промывного буфера (до 320 л).The disadvantage of the prototype is the high cost of resources and time to conduct the process. This drawback is due to the fact that in two-stage diafiltration, polymerized hemoglobin is purified twice on cut-off membranes of 300 kDa and 100 kDa, which lengthens the process up to 40 hours, and also requires the use of significant volumes of water for injection used to prepare wash buffer (up to 320 l).
Таким образом, техническая проблема, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в упрощении технологии получения кровезаменителя и получении безопасного конечного продукта.Thus, the technical problem to be solved by the claimed invention is to simplify the technology for obtaining a blood substitute and obtain a safe end product.
Технический результат заключается в сокращении времени фильтрации полимеризованного гемоглобина в 4 раза, снижении объема промывочного раствора до 4-х раз, снижении пирогенности готового продукта.The technical result consists in reducing the filtration time of polymerized hemoglobin by 4 times, reducing the volume of the washing solution up to 4 times, and reducing the pyrogenicity of the finished product.
Для решения обозначенной технической проблемы и достижения заявленного технического результата предлагается способ получения кровезаменителя, включающий получение дезоксигенированного гемоглобина, его полимеризацию, очистку и сушку. Причем получение дезоксигенированного гемоглобина включает сепарацию, гемолиз, отделение стромы, осаждение негемовых белков и их удаление из полученного раствора гемоглобина, его фильтрацию. Полимеризация включает обработку полученного дезоксигенированного гемоглобина немодифицированным глутаровым альдегидом, завершение реакции полимеризации проводят путем внесения боргидрида натрия; очистка включает диафильтрацию. To solve the indicated technical problem and achieve the claimed technical result, a method for producing a blood substitute is proposed, including obtaining deoxygenated hemoglobin, its polymerization, purification and drying. Moreover, obtaining deoxygenated hemoglobin includes separation, hemolysis, separation of the stroma, precipitation of non-heme proteins and their removal from the resulting hemoglobin solution, its filtration. Polymerization includes treatment of the resulting deoxygenated hemoglobin with unmodified glutaraldehyde, completion of the polymerization reaction is carried out by introducing sodium borohydride; purification includes diafiltration.
Отличительной особенностью заявленного способа является то, что для получения дезоксигенированного гемоглобина выделяют свободную от лейкоцитов эритроцитарную массу посредством плазмафереза, осаждение негемовых белков проводят путем добавления к раствору гемоглобина сухого хлорида натрия до конечной концентрации 0,6 мас.%, этап диафильтрации для очистки полимеризованного гемоглобина осуществляют в одну стадию на отсекающих мембранах по молекулярной массе 100 кДа, получают готовый продукт со следующим молекулярным составом гемоглобина:A distinctive feature of the claimed method is that in order to obtain deoxygenated hemoglobin, an erythrocyte mass free of leukocytes is isolated by plasmapheresis, the precipitation of non-heme proteins is carried out by adding dry sodium chloride to the hemoglobin solution to a final concentration of 0.6 wt.%, the diafiltration step for purifying polymerized hemoglobin is carried out in one stage on cut-off membranes with a molecular weight of 100 kDa, a finished product with the following molecular composition of hemoglobin is obtained:
- полимеризованный гемоглобин с молекулярной массой более 64 кДа - от 75% до 95%; - polymerized hemoglobin with a molecular weight of more than 64 kDa - from 75% to 95%;
- модифицированный гемоглобин с молекулярной массой 64 кДа - от 25% до 5%.- modified hemoglobin with a molecular weight of 64 kDa - from 25% to 5%.
Далее приводятся конкретные примеры реализации заявленного способа получения кровезаменителя. The following are specific examples of the implementation of the claimed method for obtaining a blood substitute.
Пример 1. Способ получения кровезаменителя. Example 1. Method for obtaining a blood substitute.
Стабилизированная, охлажденная до +2-4°С кровь крупного рогатого скота (КРС), в пластиковых емкостях объемом 10 л передается из холодильной камеры через шлюз в производственное помещение. С помощью перистальтического насоса кровь подается в реактор, где проходит этап плазмафереза. Плазмаферез и отмывка эритромассы осуществляются с помощью ультрафильтрации на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм. Для осуществления гемолиза эритроцитов в реактор, содержащий 2 л отмытой эритромассы, с помощью перистальтического насоса подается 6 л воды для инъекций (ВДИ) с температурой +6-8°С из сборной емкости, размещенной в помещении подготовки растворов. Этап гемолиза проходит при перемешивании в течение 40 мин.Stabilized, cooled to +2-4°C, the blood of cattle (cattle), in plastic containers with a volume of 10 liters, is transferred from the refrigeration chamber through the gateway to the production room. With the help of a peristaltic pump, blood is supplied to the reactor, where the plasmapheresis stage takes place. Plasmapheresis and washing of erythromass are carried out using ultrafiltration on membranes with a pore diameter of 0.45 μm. To carry out hemolysis of erythrocytes, 6 liters of water for injection (WFI) with a temperature of +6-8°C are supplied to the reactor containing 2 liters of washed erythromass using a peristaltic pump from a collection tank located in the solution preparation room. The hemolysis step takes place with stirring for 40 minutes.
Этап фильтрации. Полученный гемолизат перекачивают насосом на расположенные последовательно патронные фильтры с размером пор 50; 20; 10; 5 и 1 мкм, и далее в биоконтейнер Флексель для осаждения негемовых белков объемом 10 л. После перекачки насосом всего объема, в емкость подается сухой хлорид натрия до конечной концентрации 0,6 масс.%, в количестве 0,028 кг. Процесс осаждения длится 30 мин. После осаждения негемовых белков раствор гемоглобина перекачивают насосом на патронные фильтры с размером пор 5; 1 и 0,65 мкм, расположенные последовательно, и далее на стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм и затем в реактор для проведения синтеза полигемоглобина. В реактор подается поток стерильного азота (контроль по ротаметру) для перемешивания и дезоксигенации гемоглобина. Filtration stage. The resulting hemolysate is pumped to successively arranged cartridge filters with a pore size of 50; twenty; ten; 5 and 1 µm, and then into the Flexel biocontainer for the precipitation of non-heme proteins with a volume of 10 liters. After pumping the entire volume by the pump, dry sodium chloride is supplied to the tank to a final concentration of 0.6 wt.%, in the amount of 0.028 kg. The deposition process lasts 30 minutes. After the non-heme proteins are precipitated, the hemoglobin solution is pumped onto cartridge filters with a pore size of 5; 1 and 0.65 µm, located in series, and then on a sterilizing filter with a pore size of 0.22 µm and then into a reactor for polyhemoglobin synthesis. A stream of sterile nitrogen is fed into the reactor (rotameter control) for mixing and deoxygenation of hemoglobin.
Дезоксигенацию проводят до достижения концентрации кислорода в равновесной газовой среде 1,0-2,0 об.% (по показанию датчика концентрации кислорода в реакторе).Deoxygenation is carried out until the oxygen concentration in the equilibrium gaseous medium reaches 1.0-2.0 vol.% (according to the oxygen concentration sensor in the reactor).
Получение полимеризованного гемоглобина (Этап полимеризации). В реактор, содержащий дезоксигемоглобин, переносят 2,5% раствор глутарового альдегида в количестве 0,083 кг в течение 40 мин. Реакцию проводят при перемешивании в течение 1 ч при температуре +6-8°С в токе азота. Для остановки реакции в смесь вносят раствор боргидрида натрия в количестве 0,002 кг. Реакцию проводят в течение 30 мин при перемешивании. Obtaining polymerized hemoglobin (Polymerization stage). A 2.5% solution of glutaraldehyde in the amount of 0.083 kg is transferred to a reactor containing deoxyhemoglobin for 40 minutes. The reaction is carried out with stirring for 1 h at a temperature of +6-8°C in a stream of nitrogen. To stop the reaction, a solution of sodium borohydride is added to the mixture in an amount of 0.002 kg. The reaction is carried out for 30 min with stirring.
Реакционную смесь подвергают очистке методом диафильтрации на отсекающих мембранах для молекул с молекулярной массой 100 кДа и выше. Использование только одного вида мембраны вместо использования двух видов отсекающих мембран с молекулярной массой 300 кДа, а затем 100 кДа, является отличительной особенностью данного способа, по сравнению с указанным в патенте RU2361608 способе. Раствор промывают 80 л ВДИ для частичного удаления модифицированного гемоглобина (внутримолекулярносшитого тетрамера) и низкомолекулярных соединений, менее 64 кДа. Полученный пермеат концентрируют до 2 л и сливают в биоконтейнер объемом 5 л. Промывной раствор направляют на станцию очистки стоков.The reaction mixture is subjected to purification by diafiltration on cut-off membranes for molecules with a molecular weight of 100 kDa and above. The use of only one type of membrane instead of using two types of cut-off membranes with a molecular weight of 300 kDa and then 100 kDa is a distinctive feature of this method compared to the method specified in patent RU2361608. The solution is washed with 80 l of WFI to partially remove the modified hemoglobin (intramolecular cross-linked tetramer) and low molecular weight compounds, less than 64 kDa. The resulting permeate is concentrated to 2 L and poured into a 5 L biocontainer. The washing solution is sent to the wastewater treatment plant.
В биоконтейнер с раствором полимеризованного гемоглобина добавляют 0,231 л 40% стерильного раствора глюкозы путем стерильного соединения коннектором 0,01 л 13,6% стерильного раствора аскорбиновой кислоты, 0,750 л 0,9% стерильного раствора NaCl, перемешивают. Затем приготовленный раствор перистальтическим насосом подают на установку стерилизующей фильтрации с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат поступает в накопительную емкость для подачи на розлив по флаконам с дальнейшей лиофилизацией препарата, для чего используется лиофилизатор, обеспечивающий получение стерильного порошка.0.231 l of 40% sterile glucose solution is added to the biocontainer with a solution of polymerized hemoglobin by means of a sterile connection with a connector 0.01 l of 13.6% sterile ascorbic acid solution, 0.750 l of 0.9% sterile NaCl solution, mixed. Then the prepared solution is fed with a peristaltic pump to a sterilizing filtration unit with a pore size of 0.22 μm. The filtrate enters the storage tank for bottling into vials with further lyophilization of the drug, for which a lyophilizer is used to obtain a sterile powder.
Таблица 1 – Результаты сравнения с прототипом (технологические параметры)Table 1 - Results of comparison with the prototype (technological parameters)
часThe time of the diafiltration process,
hour
Пример 2. Снижение пирогенности готового препарата.Example 2. Reducing the pyrogenicity of the finished product.
Испытание на пирогенность инъекционных растворов и субстанций, из которых они изготавливаются, основано на измерении температуры тела у кроликов до и после инъекции (ОФС 42-0061-07).The test for pyrogenicity of injection solutions and substances from which they are made is based on measuring body temperature in rabbits before and after injection (OFS 42-0061-07).
Испытание лекарственного средства проводили на группе из трех кроликов с исходной температурой 38,5 - 39,5°С. The drug was tested on a group of three rabbits with an initial temperature of 38.5 - 39.5°C.
Перед опытом, с интервалом не менее 30 мин, у каждого кролика дважды измеряют температуру тела. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не должны превышать 0,2°С. В противном случае кролика исключают из испытания. За исходную температуру принимают величину последнего результата измерения.Before the experiment, with an interval of at least 30 minutes, each rabbit's body temperature was measured twice. Differences in temperature readings in the same animal should not exceed 0.2°C. Otherwise, the rabbit is excluded from the test. The value of the last measurement result is taken as the initial temperature.
Раствор испытуемого лекарственного средства вводят внутривенно животным сразу после второго измерения температуры. Измерения температуры после введения испытуемого лекарственного средства проводят с интервалом не более 30 мин на протяжении трех часов. The test drug solution is administered intravenously to the animals immediately after the second temperature measurement. Temperature measurements after the introduction of the test drug are carried out at intervals of not more than 30 minutes for three hours.
Лекарственное средство признают апирогенным, если сумма индивидуальных максимальных повышений температур меньше или равна 1,2°С, а индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превышает 0,5 °С.The drug is recognized as non-pyrogenic if the sum of individual maximum temperature rises is less than or equal to 1.2 ° C, and the individual temperature increase in none of the rabbits does not exceed 0.5 ° C.
Таблица 2 - Результаты сравнения с прототипом (биологические параметры)Table 2 - Results of comparison with the prototype (biological parameters)
+0,6; +1,2; +0,3.
Сумма максимальных повышений температуры у 3 кроликов: +2,1.
Субстанция пирогенна.The test solution in a test dose was administered to each of 3 rabbits. Maximum temperature changes in animals for 3 hours:
+0.6; +1.2; +0.3.
The sum of the maximum temperature rises in 3 rabbits: +2.1.
The substance is pyrogenic.
+0,2; +0,2; +0,5.
Сумма максимальных повышений температуры у 3 кроликов: +0,9.
Субстанция апирогенна.The test solution in a test dose was administered to each of 3 rabbits. Maximum temperature changes in animals for 3 hours:
+0.2; +0.2; +0.5.
Sum of maximum temperature rises in 3 rabbits: +0.9.
The substance is non-pyrogenic.
Пример 3. Определение молекулярного состава гемоглобина в готовом продукте (кровезаменителе).Example 3. Determination of the molecular composition of hemoglobin in the finished product (blood substitute).
Предложенный способ позволяет получать кровезаменитель, основу которого составляет полимеризованный гемоглобин из крови КРС со следующим молекулярным распределением:The proposed method allows to obtain a blood substitute based on polymerized hemoglobin from cattle blood with the following molecular distribution:
- полимеризованный гемоглобин с молекулярной массой свыше 64 кДа - от 75% до 95%;- polymerized hemoglobin with a molecular weight over 64 kDa - from 75% to 95%;
- фракция модифицированного гемоглобина (64 кДа) - от 25% до 5%.- fraction of modified hemoglobin (64 kDa) - from 25% to 5%.
На хроматограммах (фиг. 1, 2, 3) представлены молекулярные параметры препарата. Профилю хроматограмм в интервале времени удерживания от 12 до 18 минуты соответствует фракция полимеризованного гемоглобина с молекулярным весом более 64 кДа. Интервалу времени удерживания от 18 до 22 минуты соответствует профиль модифицированного гемоглобина с молекулярной массой 64 кДа. Молекулярные параметры определяли методом ВЭЖХ с использованием колонки YMC-Pack Diol-200. Содержание фракций в препарате оценивали методом нормализации площадей пиков.On the chromatograms (Fig. 1, 2, 3) presents the molecular parameters of the drug. The profile of chromatograms in the retention time interval from 12 to 18 minutes corresponds to the fraction of polymerized hemoglobin with a molecular weight of more than 64 kDa. The retention time interval from 18 to 22 minutes corresponds to the profile of the modified hemoglobin with a molecular weight of 64 kDa. Molecular parameters were determined by HPLC using a YMC-Pack Diol-200 column. The content of fractions in the preparation was estimated by the method of normalization of peak areas.
На фиг. 1-3 представлены хроматограммы трех опытных партий препарата.In FIG. 1-3 shows chromatograms of three experimental batches of the drug.
Таким образом, указанный метод получения кровезаменителя способствует 4-х кратному снижению времени проведения этапа диафильтрации полимеризованного гемоглобина для удаления низкомолекулярных соединений с молекулярной массой менее 64 кДа и способствует 4-х кратному снижению объема промывного раствора. Кроме того, снижение объема промывного раствора благоприятно сказывается на показателе пирогенности получаемого препарата за счет снижения вероятности загрязнения продукта допускаемым количеством пирогенов в воде (по ФС.2.2.0019.15), а также себестоимости препарата.Thus, this method of obtaining a blood substitute contributes to a 4-fold reduction in the time of the polymerized hemoglobin diafiltration step to remove low molecular weight compounds with a molecular weight of less than 64 kDa and contributes to a 4-fold decrease in the volume of the washing solution. In addition, a decrease in the volume of the wash solution has a positive effect on the pyrogenicity of the resulting drug by reducing the likelihood of product contamination with the allowable amount of pyrogens in water (according to FS.2.2.0019.15), as well as the cost of the drug.
Claims (3)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018136935A RU2782076C2 (en) | 2018-10-19 | Method for production of blood substitute for use in veterinary medicine | |
| PCT/RU2019/050191 WO2020080978A2 (en) | 2018-10-19 | 2019-10-21 | Method for producing a blood substitute for use in veterinary medicine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018136935A RU2782076C2 (en) | 2018-10-19 | Method for production of blood substitute for use in veterinary medicine |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018136935A RU2018136935A (en) | 2020-04-20 |
| RU2018136935A3 RU2018136935A3 (en) | 2022-04-25 |
| RU2782076C2 true RU2782076C2 (en) | 2022-10-21 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4826811A (en) * | 1986-06-20 | 1989-05-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| RU2341286C1 (en) * | 2007-07-25 | 2008-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Method of blood substitute production and related installation for method implementation |
| RU2361608C1 (en) * | 2008-03-18 | 2009-07-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственная Компания "Медбиофарм" | Blood substitute with function of oxygen transfer, pharmaceutical composition (versions) |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4826811A (en) * | 1986-06-20 | 1989-05-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| RU2341286C1 (en) * | 2007-07-25 | 2008-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Method of blood substitute production and related installation for method implementation |
| RU2361608C1 (en) * | 2008-03-18 | 2009-07-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственная Компания "Медбиофарм" | Blood substitute with function of oxygen transfer, pharmaceutical composition (versions) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK174286B1 (en) | Pasteurizable, lyophilizable, conformationally stabilized hemoglobin product, process for preparing an aqueous solution of a tetrameric, conformationally stabilized hemoglobin product, ..... | |
| FI86141B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV PERITONEAL DIALYSLOESNING. | |
| Cohen et al. | Effect of immunoglobulin light chains from hemodialysis and continuous ambulatory peritoneal dialysis patients on polymorphonuclear leukocyte functions. | |
| RU2475252C1 (en) | Method for preparing high-temperature stable pharmaceutical composition containing oxygen carrier and using it | |
| CN111499736B (en) | Preparation method of intravenous injection COVID-19 human immunoglobulin | |
| KR20140031915A (en) | Method for removing unmodified hemoglobin from cross-linked hemoglobin solutions including polymeric hemoglobin with high temperature short time heat treatment apparatus | |
| CN102731683A (en) | Method of separating natural low molecular heparin from heparin waste liquor | |
| JP2004535368A (en) | Production of hemoglobin-based oxygen carriers | |
| RU2782076C2 (en) | Method for production of blood substitute for use in veterinary medicine | |
| AP1028A (en) | Method and apparatus for preparing an acellular red blood cell substitute. | |
| WO2020080978A2 (en) | Method for producing a blood substitute for use in veterinary medicine | |
| WO1991009615A1 (en) | Polyhemoglobin stabilized by purine derivatives and glutathione | |
| RU2341286C1 (en) | Method of blood substitute production and related installation for method implementation | |
| US2460550A (en) | Modified globin and method for its preparation | |
| JP2000500736A (en) | Preparation of pharmaceutical grade hemoglobin by heat treatment in partially oxygenated form | |
| CN102603891B (en) | Method for preparing tetanus human immune globulin by double virus inactivation | |
| RU2799637C1 (en) | Method of producing biologically active peptide-amino acid preparation based on human blood plasma | |
| CN110872345A (en) | Preparation method of high-purity immunoglobulin G | |
| CN105505867B (en) | For separating the composition and its separating liquid of lymphocyte | |
| RU2745443C1 (en) | Method for obtaining agent with antihypoxic, regenerative activity | |
| RU2125888C1 (en) | Method of preparing monomeric albumin | |
| RU2264826C1 (en) | Method for obtaining antithymocytic globulin for intravenous injection | |
| CN1238380C (en) | Process for preparing high-purity pyretogenless substrateless hematoglobin for red blood cell substitute | |
| CN107303385A (en) | A kind of preparation method of Cerebrolysin Vial solution | |
| KR100562762B1 (en) | Method and apparatus for manufacturing acellular erythrocyte replacement |