RU2782056C2 - Labeled nucleotides and their use - Google Patents
Labeled nucleotides and their use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782056C2 RU2782056C2 RU2019139633A RU2019139633A RU2782056C2 RU 2782056 C2 RU2782056 C2 RU 2782056C2 RU 2019139633 A RU2019139633 A RU 2019139633A RU 2019139633 A RU2019139633 A RU 2019139633A RU 2782056 C2 RU2782056 C2 RU 2782056C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleotide
- redox
- label
- charge
- labeled
- Prior art date
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 323
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 323
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 71
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 230000002829 reduced Effects 0.000 claims abstract description 19
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims abstract description 17
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- -1 4-ferrocenylbenzyl alcohol Chemical compound 0.000 claims abstract description 11
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 9
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N Ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000005092 Ruthenium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- MPMSMUBQXQALQI-UHFFFAOYSA-N Cobalt phthalocyanine Chemical compound [Co+2].C12=CC=CC=C2C(N=C2[N-]C(C3=CC=CC=C32)=N2)=NC1=NC([C]1C=CC=CC1=1)=NC=1N=C1[C]3C=CC=CC3=C2[N-]1 MPMSMUBQXQALQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- UZVMVUUAAXJDIL-UHFFFAOYSA-N [Zn].N1C(C=C2C3=CC=CC=C3C(C=C3C4=CC=CC=C4C(=C4)N3)=N2)=C(C=CC=C2)C2=C1C=C1C2=CC=CC=C2C4=N1 Chemical compound [Zn].N1C(C=C2C3=CC=CC=C3C(C=C3C4=CC=CC=C4C(=C4)N3)=N2)=C(C=CC=C2)C2=C1C=C1C2=CC=CC=C2C4=N1 UZVMVUUAAXJDIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- VTJUKNSKBAOEHE-UHFFFAOYSA-N Calixarene Chemical compound COC(=O)COC1=C(CC=2C(=C(CC=3C(=C(C4)C=C(C=3)C(C)(C)C)OCC(=O)OC)C=C(C=2)C(C)(C)C)OCC(=O)OC)C=C(C(C)(C)C)C=C1CC1=C(OCC(=O)OC)C4=CC(C(C)(C)C)=C1 VTJUKNSKBAOEHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 claims abstract description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 41
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 claims description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 19
- 210000003041 Ligaments Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 claims description 12
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement Effects 0.000 claims description 8
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 8
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 claims description 8
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 claims description 8
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 claims description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 3
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N dCyd Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N DEOXYTHYMIDINE Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims 2
- HKOAFLAGUQUJQG-UHFFFAOYSA-N 2-pyrimidin-2-ylpyrimidine Chemical compound N1=CC=CN=C1C1=NC=CC=N1 HKOAFLAGUQUJQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000717 retained Effects 0.000 abstract 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N Inosine Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N 0.000 description 6
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 6
- 229920002287 Amplicon Polymers 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 4
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 4
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052803 cobalt Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J dATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 4
- 239000002109 single walled nanotube Substances 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 4
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 289-95-2 Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002074 nanoribbon Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003559 rna-seq method Methods 0.000 description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N Deoxyribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Trimethylglycine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 2
- AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N indium;oxotin Chemical compound [In].[Sn]=O AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 1
- 241000269328 Amphibia Species 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N Deoxyadenosine monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100002070 FOS Human genes 0.000 description 1
- 108060001038 FOS Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 240000007842 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000288105 Grus Species 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBTKNAXYKSUFRK-UHFFFAOYSA-N Heliogen blue Chemical compound [Cu].[N-]1C2=C(C=CC=C3)C3=C1N=C([N-]1)C3=CC=CC=C3C1=NC([N-]1)=C(C=CC=C3)C3=C1N=C([N-]1)C3=CC=CC=C3C1=N2 RBTKNAXYKSUFRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102100012486 JUN Human genes 0.000 description 1
- 108060001040 JUN Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910015800 MoS Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 229940013390 Mycoplasma pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- RUFLMLWJRZAWLJ-UHFFFAOYSA-N Nickel silicide Chemical compound [Ni]=[Si]=[Ni] RUFLMLWJRZAWLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000233872 Pneumocystis carinii Species 0.000 description 1
- 229920001609 Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 229910004221 SiNW Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241001441722 Takifugu rubripes Species 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 1
- 240000008529 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229940035893 Uracil Drugs 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- YVTHLONGBIQYBO-UHFFFAOYSA-N [O--].[Zn++].[In+3] Chemical compound [O--].[Zn++].[In+3] YVTHLONGBIQYBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H [oxido-[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl]oxyphosphoryl] phosphate Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- QTPILKSJIOLICA-UHFFFAOYSA-G [oxido-[oxido-[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl]oxyphosphoryl]oxyphosphoryl] phosphate Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O QTPILKSJIOLICA-UHFFFAOYSA-G 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminum Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000008984 brauner Senf Nutrition 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000007772 electrode material Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 239000002048 multi walled nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021334 nickel silicide Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000025475 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008124 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 150000002902 organometallic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000767 polyaniline Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000023 polynucleotide Chemical group 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Chemical group 0.000 description 1
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 description 1
- 229920000123 polythiophene Polymers 0.000 description 1
- 230000003334 potential Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002441 reversible Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 239000002965 rope Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229910021428 silicene Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021332 silicide Inorganic materials 0.000 description 1
- FVBUAEGBCNSCDD-UHFFFAOYSA-N silicide(4-) Chemical compound [Si-4] FVBUAEGBCNSCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 230000005641 tunneling Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021307 wheat Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS
Данная заявка заявляет приоритет по первоначальной заявке США №62/710465, поданной 16 февраля 2018 года, содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.This application claims priority over original US application No. 62/710465, filed February 16, 2018, the contents of which are incorporated herein in their entirety by reference.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИPRIOR ART
Разные протоколы в биологическом или химическом исследовании включают проведение большого количества контролируемых реакций на локальных поверхностях подложек или в пределах предварительно определенных реакционных камер. За указанными реакциями можно затем наблюдать или их выявлять, и последующий анализ может помочь идентифицировать или обнаружить свойства химических веществ, участвующих в реакции. В некоторых примерах в контролируемых реакциях генерируются флуоресценция, и, таким образом, для выявления можно использовать оптическую систему. В других примерах контролируемые реакции изменяют заряд, проводимость или какое-нибудь другое электрическое свойство, и, таким образом, для выявления можно использовать электронную систему.Various protocols in biological or chemical research involve conducting a large number of controlled reactions on local substrate surfaces or within predefined reaction chambers. These reactions can then be observed or detected, and subsequent analysis can help identify or reveal the properties of the chemicals involved in the reaction. In some examples, fluorescence is generated in controlled reactions and thus an optical system can be used for detection. In other examples, controlled reactions change charge, conductivity, or some other electrical property, and thus an electronic system can be used for detection.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Первый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой меченый нуклеотид. Номера 1-6 относятся к данному первому аспекту.The first aspect disclosed in this document is a labeled nucleotide. Numbers 1-6 refer to this first aspect.
1. В одном примере меченый нуклеотид содержит нуклеотид; связывающую группу, присоединенную к фосфатной группе данного нуклеотида; редокс-активную зарядную метку, присоединенную к связывающей группе, причем редокс-активная зарядная метка подлежит окислению или восстановлению посредством токопроводящего канала при удерживании вблизи чувствительной зоны токопроводящего канала.1. In one example, the labeled nucleotide contains a nucleotide; a linking group attached to the phosphate group of the given nucleotide; a redox-active charge label attached to the linking group, wherein the redox-active charge label is subject to oxidation or reduction by the conductive channel when held near the sensitive area of the conductive channel.
2. В примере (1) меченого нуклеотида редокс-активная зарядная метка включает координированный атом металла, который подлежит вступлению в окислительно-восстановительную реакцию.2. In the labeled nucleotide example (1), the redox-active charge label includes a coordinated metal atom to be redox-reacted.
3. В примере (1) или (2) меченого нуклеотида связывающая группа содержит специфичную область, присоединенную к редокс-активной зарядной метке.3. In example (1) or (2) labeled nucleotide, the linking group contains a specific region attached to a redox-active charging label.
4. В примере (3) специфичная область предполагает взаимодействие с акцепторной областью на связке, связанной с токопроводящим каналом, и специфичная область включает аффинную метку.4. In example (3), the specific region involves interaction with an acceptor region on the ligament associated with the conductive channel, and the specific region includes an affinity label.
5. В примере (4) специфичная область предполагает гибридизацию с акцепторной областью на связке, связанной с токопроводящим каналом, и аффинная метка включает нуклеотидную последовательность, включающую от примерно одного нуклеотида до примерно десяти нуклеотидов, или последовательность пептидо-нуклеиновой кислоты, включающую от примерно одной пептидо-нуклеиновой кислоты до примерно десяти пептидо-нуклеиновых кислот.5. In example (4), the specific region involves hybridization with an acceptor region on the ligament associated with the conductive channel, and the affinity tag includes a nucleotide sequence comprising from about one nucleotide to about ten nucleotides, or a peptido nucleic acid sequence comprising from about one peptido nucleic acid to about ten peptido nucleic acids.
В любом из примеров (1)-(5) меченого нуклеотида редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии; и редокс-активная зарядная метка включает от примерно 1 до примерно 100 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии.In any of examples (1)-(5) of the labeled nucleotide, the redox active charge label comprises 10 charges or less in the unoxidized or unreduced state; and the redox active charge label includes from about 1 to about 100 charges in the oxidized or reduced state.
Следует понимать, что любые признаки меченого нуклеотида, раскрытые в данном документе, включая примеры (1)-(6), можно объединять вместе любым желаемым образом и/или в любой желаемой конфигурации.It should be understood that any features of a labeled nucleotide disclosed herein, including examples (1)-(6), can be combined together in any desired manner and/or in any desired configuration.
Второй аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой способ. Номера 7-18 относятся к данному второму аспекту.The second aspect disclosed in this document is a method. Numbers 7-18 refer to this second aspect.
7. В примере способ включает введение нуклеиновой кислоты - матрицы в токопроводящий канал, имеющий связанную с ним полимеразу; введение меченых нуклеотидов в токопроводящий канал, по меньшей мере одного из меченых нуклеотидов, включающего нуклеотид и нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку, присоединенную к нему, посредством чего один из меченых нуклеотидов ассоциирует с полимеразой; при ассоциации одного из меченых нуклеотидов, инициацию окислительно-восстановительной реакции нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки с токопроводящим каналом с изменением состояния заряда нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки; и под действием окислительно-восстановительной реакции, выявление ответа токопроводящего канала.7. In an example, the method includes introducing a nucleic acid template into a conductive channel having a polymerase associated therewith; introducing labeled nucleotides into a conductive channel of at least one of the labeled nucleotides, comprising a nucleotide and a nucleotide-specific redox-active charge label attached thereto, whereby one of the labeled nucleotides associates with the polymerase; when one of the labeled nucleotides is associated, initiating a redox reaction of the nucleotide-specific redox-active charging label with a conductive channel with a change in the state of charge of the nucleotide-specific redox-active charging label; and under the action of a redox reaction, revealing the response of the conductive channel.
8. В примере (7) способа инициирование окислительно-восстановительной реакции включает прикладывание зарядного напряжения к токопроводящему каналу, и выявление ответа токопроводящего канала включает прикладывание напряжения считывания к токопроводящему каналу.8. In method example (7), initiating a redox reaction includes applying a charging voltage to a conductive path, and detecting a response of the conductive path includes applying a sense voltage to the conductive path.
9. Пример способа (7) или (8) дополнительно включает ассоциирование ответа токопроводящего канала с нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой ассоциированного одного из меченых нуклеотидов; и на основе нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки, идентификацию нуклеотида ассоциированного меченого нуклеотида.9. An example of method (7) or (8) further comprises associating a conductive channel response with a nucleotide-specific redox active charge label of the associated one of the labeled nucleotides; and based on the nucleotide-specific redox active charge label, identifying the nucleotide of the associated labeled nucleotide.
10. Пример (9) может также дополнительно включать отщепление нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки от ассоциированного одного из меченых нуклеотидов, посредством чего нуклеотид ассоциированного меченого нуклеотида включается в растущую нить, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице.10. Example (9) may also further include cleavage of a nucleotide-specific redox active charge tag from an associated one of the labeled nucleotides, whereby the nucleotide of the associated labeled nucleotide is incorporated into a growing strand complementary to the nucleic acid template.
11. В примере (10) ассоциирование одного из меченых нуклеотидов, инициирование окислительно-восстановительной реакции, выявление, ассоциирование и идентификация вместе представляют собой цикл секвенирования; и способ дополнительно включает выполнение следующего цикла секвенирования, позволяя следующему одному из меченых нуклеотидов ассоциировать с полимеразой; при ассоциации следующего одного из меченых нуклеотидов, инициирование другой окислительно-восстановительной реакции другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки и токопроводящего канала с изменением состояния заряда другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки; под действием другой окислительно-восстановительной реакции, выявление другого ответа токопроводящего канала; ассоциирование другого ответа токопроводящего канала с другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой; и на основе другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки, идентификацию нуклеотида следующего одного из меченых нуклеотидов.11. In example (10), association of one of the labeled nucleotides, initiation of a redox reaction, detection, association, and identification together constitute a sequencing cycle; and the method further includes performing the next round of sequencing, allowing the next one of the labeled nucleotides to associate with the polymerase; upon association of the next one of the labeled nucleotides, initiating another redox reaction of the other nucleotide-specific redox-active charging label and the conductive channel to change the state of charge of the other nucleotide-specific redox-active charging label; under the influence of a different redox reaction, revealing a different response of the conductive channel; associating another conductive channel response with another nucleotide-specific redox-active charge label; and based on the other nucleotide-specific redox active charge label, identifying the nucleotide of the next one of the labeled nucleotides.
12. Пример (11) может также дополнительно включать отщепление другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки следующего одного из меченых нуклеотидов, посредством чего нуклеотид следующего одного из меченых нуклеотидов включается в растущую нить, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице; и повторение цикла секвенирования.12. Example (11) may also further include cleavage of another nucleotide-specific redox-active charge label of the next one of the labeled nucleotides, whereby the nucleotide of the next one of the labeled nucleotides is included in a growing strand complementary to the nucleic acid template; and repeating the sequencing run.
13. В любом из примеров (7)-(12) способа редокс-активная зарядная метка включает координированный атом металла, который подлежит вступлению в окислительно-восстановительную реакцию.13. In any of the examples (7)-(12) of the method, the redox-active charge label includes a coordinated metal atom to be entered into a redox reaction.
14. В любом из примеров (7)-(13) способа редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии; и редокс-активная зарядная метка включает от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов в измененном состоянии заряда.14. In any of the examples (7)-(13) of the method, the redox active charge label includes 10 charges or less in a non-oxidized or non-reduced state; and a redox active charge tag includes from about 1 charge to about 100 charges in an altered state of charge.
15. В любом из примеров (7)-(14) способа меченые нуклеотиды включают первый меченый нуклеотид, включающий дезоксиаденозинфосфат в качестве нуклеотида и первую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; второй меченый нуклеотид, включающий дезоксигуанозинфосфат в качестве нуклеотида и вторую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; третий меченый нуклеотид, включающий дезоксицитидинфосфат в качестве нуклеотида и третью нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; и четвертый меченый нуклеотид, включающий дезокситимидинфосфат в качестве нуклеотида и четвертую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; и первая, вторая, третья и четвертая нуклеотид-специфичные редокс-активные зарядные метки отличаются друг от друга.15. In any of the method examples (7)-(14), the labeled nucleotides include a first labeled nucleotide comprising deoxyadenosine phosphate as a nucleotide and a first nucleotide-specific redox active charge label; a second labeled nucleotide comprising deoxyguanosine phosphate as a nucleotide and a second nucleotide-specific redox active charge label; a third labeled nucleotide comprising deoxycytidine phosphate as a nucleotide and a third nucleotide-specific redox active charge label; and a fourth labeled nucleotide comprising deoxythymidine phosphate as a nucleotide and a fourth nucleotide-specific redox active charge label; and the first, second, third and fourth nucleotide-specific redox active charge marks are different from each other.
16. В примере (15) две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток являются положительно заряженными в измененном состоянии заряда, и где другие две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток являются отрицательно заряженными в измененном состоянии заряда.16. In example (15), two of the first, second, third and fourth nucleotide-specific redox active charge labels are positively charged in the changed state of charge, and where the other two of the first, second, third and fourth nucleotide-specific redox active charge tags are negatively charged in an altered state of charge.
17. В любом из примеров (7)-(16) способа меченые нуклеотиды находятся в буфере с низким содержанием соли.17. In any of the method examples (7)-(16), the labeled nucleotides are in a low salt buffer.
18. В любом из примеров (7)-(17) способа токопроводящий канал представляет собой канал полевого транзистора.18. In any of the examples (7) to (17) of the method, the conductive channel is a FET channel.
Следует понимать, что любые признаки способа, включая примеры (7)-(17), можно объединять вместе любым желаемым образом. Кроме того, следует понимать, что любое сочетание признаков данного способа и/или меченого нуклеотида можно использовать вместе и/или объединять с любым из примеров, раскрытых в данном документе.It should be understood that any features of the method, including examples (7)-(17), can be combined together in any desired manner. In addition, it should be understood that any combination of features of this method and/or labeled nucleotide can be used together and/or combined with any of the examples disclosed herein.
Третий аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой набор. Номера 19-22 относятся к данному третьему аспекту.The third aspect disclosed in this document is a set. Numbers 19-22 refer to this third aspect.
19. В примере набор содержит проточную ячейку, включающую токопроводящий канал, имеющий связку, присоединенную к нему, и полимеразу, присоединенную к данному токопроводящему каналу посредством связки; нуклеиновую кислоту - матрицу, подлежащую введению в проточную ячейку; реагенты, подлежащие введению в проточную ячейку, причем реагенты включают меченые нуклеотиды, по меньшей мере один из меченых нуклеотидов, включающий: нуклеотид; связывающую группу, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида; и редокс-активную зарядную метку, присоединенную к связывающей группе, причем редокс-активная зарядная метка подлежит окислению или восстановлению посредством токопроводящего канала при удерживании вблизи чувствительной зоны токопроводящего канала; и детектор для выявления ответа от токопроводящего канала, когда окислительно-восстановительная реакция протекает между редокс-активной зарядной меткой и токопроводящим каналом.19. In an example, the kit contains a flow cell comprising a conductive channel having a ligament attached to it, and a polymerase attached to this conductive channel through a ligament; a nucleic acid matrix to be introduced into the flow cell; reagents to be introduced into the flow cell, and the reagents include labeled nucleotides, at least one of the labeled nucleotides, including: a nucleotide; a linking group attached to the phosphate group of the nucleotide; and a redox active charge label attached to the linking group, wherein the redox active charge label is subject to oxidation or reduction by the conductive channel while being held near a sensitive area of the conductive channel; and a detector for detecting a response from the conductive path when a redox reaction occurs between the redox active charging mark and the conductive path.
20. В примере (19) набора редокс-активная зарядная метка выбрана из группы, состоящей из ферроцена, цинк-тетрабензопорфирина, фталоцианина кобальта, трис-(2,2'-бипиримидин)рутения, 4-ферроценилбензилового спирта, 5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинка (II) и редокс-активного каликсарена.20. In the example (19) of the kit, the redox active charge label is selected from the group consisting of ferrocene, zinc tetrabenzoporphyrin, cobalt phthalocyanine, tris-(2,2'-bipyrimidine)ruthenium, 4-ferrocenylbenzyl alcohol, 5-(4- hydroxymethylphenyl)-10,15,20-trimesitylporphynatozinc (II) and redox-active calixarene.
21. В любом из примеров (19) или (20) набора редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии; и редокс-активная зарядная метка включает от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии.21. In any one of examples (19) or (20) of the set, the redox active charge label includes 10 charges or less in the non-oxidized or non-reduced state; and the redox active charge label includes from about 1 charge to about 100 charges in the oxidized or reduced state.
22. В любом из примеров (19)-(21) набора токопроводящий канал представляет собой канал полевого транзистора.22. In any of the examples (19)-(21) of the set, the conductive channel is a FET channel.
Следует понимать, что любые признаки данного набора, включая примеры (19)-(22), можно объединять вместе любым желательным образом. Кроме того, следует понимать, что любое сочетание признаков данного набора и/или способа и/или меченого нуклеотида можно использовать совместно и/или объединять с любым из примеров, раскрытых в данном документе.It should be understood that any features of this set, including examples (19)-(22), can be combined together in any desired manner. In addition, it should be understood that any combination of features of this kit and/or method and/or labeled nucleotide can be used in conjunction with and/or combined with any of the examples disclosed herein.
Кроме того, следует понимать, что любые признаки любого из меченых нуклеотидов и/или любого из способов и/или любого из наборов можно объединять вместе любым желательным образом, и/или можно объединять с любым из примеров, раскрытых в данном документе.In addition, it should be understood that any features of any of the labeled nucleotides and/or any of the methods and/or any of the kits can be combined together in any desired manner, and/or can be combined with any of the examples disclosed herein.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
Признаки примеров настоящего раскрытия станут очевидными посредством ссылки на следующее подробное описание и графические материалы, в которых номера позиций соответствуют похожим, хотя возможно не идентичным, компонентам. Для краткости, номера позиций и признаки, имеющие ранее описанную функцию, могут быть или могут не быть описаны в связи с другими графическими материалами, в которых они встречаются.Features of the examples of the present disclosure will become apparent by reference to the following detailed description and drawings, in which reference numbers correspond to similar, although possibly not identical, components. For brevity, reference numbers and features having a previously described function may or may not be described in connection with other drawings in which they occur.
Фиг. 1 представляет собой схематичное изображение примера меченого нуклеотида;Fig. 1 is a schematic representation of an example of a labeled nucleotide;
Фиг.2 представляет собой схематичное и частично перспективное изображение примера системы, раскрытой в данном документе;Fig. 2 is a schematic and partly perspective view of an example of the system disclosed herein;
Фиг. 3 представляет собой схематичное изображение полимераз, присоединенных к токопроводящему каналу сенсора заряда, и ассоциированных с мечеными нуклеотидами, которые можно различить на основе заряда.Fig. 3 is a schematic representation of polymerases attached to a conductive channel of a charge sensor and associated with labeled nucleotides that can be distinguished based on charge.
Фиг. 4 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую пример способа, раскрытого в данном документе;Fig. 4 is a flowchart illustrating an example of the method disclosed herein;
Фиг. 5А представляет собой схематичное изображение примера меченого нуклеотида, используемого в способе секвенирования; иFig. 5A is a schematic representation of an example of a labeled nucleotide used in a sequencing method; and
Фиг. 5В представляет собой схематичное изображение примера взаимодействия связки и специфичной области примера меченого нуклеотида, раскрытого в данном документе.Fig. 5B is a schematic representation of an example of the interaction of a ligament and a specific region of an example of a labeled nucleotide disclosed herein.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION
В данном документе раскрыты меченые нуклеотиды, которые можно использовать для выявления одиночных молекул в способах секвенирования нуклеиновых кислот. Сенсор, используемый при выявлении одиночных молекул, может иметь один токопроводящий канал с одной полимеразой, присоединенной к нему. Это позволяет выявлять одно событие включения (то есть включение основания в растущую нить посредством полимеразы) за один раз на каждом отдельном сенсоре. Меченые нуклеотиды обеспечивают уникальный способ выявления, который можно использовать для секвенирования нуклеиновой кислоты и для выявления нуклеиновых кислот и в общем других аналитов.This document discloses labeled nucleotides that can be used to detect single molecules in nucleic acid sequencing methods. A sensor used in single molecule detection may have a single conductive channel with a single polymerase attached to it. This allows detection of one inclusion event (i.e. incorporation of the base into the growing strand by the polymerase) at a time on each individual sensor. Tagged nucleotides provide a unique detection method that can be used for nucleic acid sequencing and for the detection of nucleic acids and other analytes in general.
Пример меченого нуклеотида 10 схематично изображен на Фиг. 1. Как показано, меченый нуклеотид 10 включает нуклеотид 12, связывающую группу 14 или 14', присоединенную к фосфатной группе 16 нуклеотида 12, и редокс-активную зарядную метку 18, присоединенную к связывающей группе 14 или 14', причем редокс-активная зарядная метка 18 подлежит окислению или восстановлению посредством токопроводящего канала (номер позиции 32, Фиг. 2) при удерживании вблизи чувствительной зоны (номер позиции 31, Фиг. 3) токопроводящего канала 32. Меченый нуклеотид 10 можно считать неприродным или синтетическим нуклеотидом, поскольку он структурно или химически отличается от природного нуклеотида.An example of labeled
Нуклеотид 12 меченого нуклеотида 10 может представлять собой природный нуклеотид. Природные нуклеотиды включают азотсодержащее гетероциклическое основание 20, сахар 22 и одну или более фосфатных групп 16. Примеры природных нуклеотидов включают, например, рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. В рибонуклеотиде сахар 22 представляет собой рибозу, и в дезоксирибонуклеотидах сахар 22 представляет собой дезоксирибозу, то есть сахар, лишенный гидроксильной группы, которая присутствует в положении 2' в рибозе. В примере нуклеотид 12 находится в полифосфатной форме, поскольку он включает несколько фосфатных групп 16 (например, трифосфат (то есть гамма фосфат), тетрафосфат, пентафосфат, гексафосфат и т.д.). Гетероциклическое основание 20 (то есть, нуклеооснование) может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G), и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидина или N-9 пурина. Аналог нуклеиновой кислоты может иметь любой фосфатный остов, сахар или измененное нуклеооснование. Примеры аналогов нуклеиновой кислоты включают, например, универсальные основания или аналоги фосфат-сахарного основа, такие как пептидо-нуклеиновые кислоты (PNA-от англ. peptide nucleic acid).
Меченый нуклеотид 10 также включает связывающую группу 14 или 14'. В некоторых примерах связывающая группа (показанная как 14 на Фиг. 1) не включает специфичную область 24. В других примерах связывающая группа (показанная как 14' на Фиг. 1) не включает специфичную область 24. Как схематично изображено на Фиг. 1, когда специфичная область 24 является частью связывающей группы 14', область 24 может быть расположена на конце, который химически связан с редокс-активной зарядной меткой 18. Специфичная область 24 будет описана дополнительно ниже в данном документе.Labeled
Связывающая группа 14 или 14' меченого нуклеотида 10 может представлять собой любую молекулу с длинной цепью, которая может химически связываться на одном конце с фосфатной группой 16 нуклеотида 12, и которая может химически связываться на другом конце с редокс-активной зарядной меткой 18. Связывающая группа 14 или 14' может быть также выбрана таким образом, чтобы она не взаимодействовала с полимеразой 26, используемой в системе 30 (см. Фиг. 2), раскрытой в данном документе. Связывающая группа 14 или 14' выбрана таким образом, чтобы они была достаточно длинной для того, чтобы позволить редокс-активной зарядной метке 18 расположиться в пределах чувствительной зоны 31 (Фиг. 3) токопроводящего канала 32 (Фиг. 2). В качестве примеров связывающая группа 14 или 14' может включать алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) цепь, амидную группу, фосфатную группу, гетероцикл, такой как триазол, нуклеотиды или их комбинации. Примеры алкильной цепи могут включать по меньшей мере 6 атомов углерода и примеры поли(этиленгликолевой) цепи могут включать по меньшей мере 3 этиленгликолевых звена.The linking
Следующий пример иллюстрирует пример меченого нуклеотида 10, где связывающая группа 14, 14' содержит алкильную цепь, амидную группу, поли(этиленгликолевую) цепь и триазол:The following example illustrates an example of a labeled
Следующий пример иллюстрирует другой пример меченого нуклеотида 10, где связывающая группа 14, 14' содержит алкильные цепи, амидную группу, поли(этиленгликолевые) цепи, триазол и фосфатную группу:The following example illustrates another example of a labeled
Следующий пример иллюстрирует еще один пример меченого нуклеотида 10, где связывающая группа 14, 14' содержит алкильные цепи, амидные группы, поли(этиленгликолевые) цепи, триазол и фосфатную группу:The following example illustrates another example of labeled
Следующий пример иллюстрирует еще один пример меченого нуклеотида 10, где связывающая группа 14, 14' содержит алкильные цепи, амидную группу, поли(этиленгликолевые) цепи, триазол, фосфатную группу и полинуклеотидную цепь:The following example illustrates another example of a labeled
В то время, как было описано несколько примеров связывающих групп 14, 14', следует понимать, что могут быть использованы другие связывающие группы 14, 14'.While several examples of linking
Как показано на Фиг. 1 и в предыдущих примерах, некоторые из меченых нуклеотидов 10 могут также включать специфичную область 24 в составе связывающей группы 14'. Специфичная область 24 может взаимодействовать с акцепторной областью на связке 28 (Фиг. 2), которая связана с токопроводящим каналом 32. Специфичная область 24 может включать аффинную метку, которая может временно присоединяться к акцепторной области связки 28. Аффинность связывания аффинной метки может быть достаточно сильной, чтобы связывать специфичную область 24 с акцепторной областью на связке 28, когда меченый нуклеотид 10 удерживается полимеразой 26, но может также быть достаточно слабой, чтобы освобождать специфичную область 24 от акцепторной области после события включения (например, когда полимераза 26 естественным образом расщепляет связь между альфа-фосфатом и связывающей группой 14, 14' или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом). Иными словами, скорости ассоциации и диссоциации специфичной области 24 (например, аффинной метки) с или от акцепторной области могут быть выбраны для улучшения суммарной чувствительности в отношении одиночных молекул. Скорость ассоциации при взаимодействии аффинная метка/акцепторная область может быть высокой, например, благодаря эффективно высокой концентрации специфичной области 24, и таким образом аффинной метки, перед включением нуклеотида. Данная высокая скорость ассоциации увеличивает период времени, за который аффинная метка связывается с акцепторной областью. После расщепления скорость диссоциации взаимодействия также может быть выбрана такой, чтобы быть достаточно высокой для того, чтобы комплекс (между аффинной меткой и акцепторной областью) диссоциировал достаточно быстро для того, чтобы существовала низкая вероятность связанного состояния (между аффинной меткой ранее включенного нуклеотида и акцепторной областью), когда следующий меченый нуклеотид 10 поступает к активному сайту полимеразы 26.As shown in FIG. 1 and in previous examples, some of the labeled
В конкретном примере специфичная область 24 предполагает гибридизацию с акцепторной областью на связке 28, и таким образом аффинная метка может включать нуклеотидную последовательность или последовательность пептидо-нуклеиновой кислоты, которая способна временно присоединяться к акцепторной области на связке 28 (Фиг. 2). В одном примере аффинная метка включает нуклеотидную последовательность, включающую от примерно одного нуклеотида до примерно десяти нуклеотидов или от примерно одной пептидо-нуклеиновой кислоты до примерно десяти пептидо-нуклеиновых кислот. В других примерах аффинная метка включает вплоть до шести нуклеотидов или пептидо-нуклеиновых кислот. В еще одном примере (как показано и описано дополнительно на Фиг. 5В), специфичная область 24 может дополнительно включать инозин(ы), фланкирующий(ие) обе стороны нуклеотидной последовательности. В еще одних примерах аффинная метка может представлять собой группировку, не являющуюся нуклеиновой кислотой, как например пептиды, которые обладают аффинностью друг к другу или к гидрофобным полимерам. Конкретный пример белка включает суперспираль, которая представляет собой структурный мотив в белках, в котором от 2 до 7 альфа-спиралей скручены вместе подобно нитям веревки. Иными словами, суперспирали построены двумя или более альфа-спиралями, которые обматывают друг друга с образованием суперспирали. Примеры суперспиралей включают онкобелки, подобно c-Fos и c-jun.In a specific example,
Редокс-активная зарядная метка 18 может представлять собой любую зарядную метку, которая может увеличивать свой заряд при окислении (потеря электрона) или восстановлении (получение электрона) посредством токопроводящего канала 32, например, при удерживании вблизи чувствительной зоны 31 токопроводящего канала 32. Зарядная метка 18 может быть нейтральной по суммарному заряду (нулевой заряд) или близкой к данному состоянию (10 зарядов или меньше), перед тем, как произойдет окислительно-восстановительная реакция. Иными словами, в неокисленном или невосстановленном состоянии редокс-активная зарядная метка 18 несет 10 зарядов или меньше. Заряды, которые несет редокс-активная зарядная метка 18, не включают какого-либо заряда фосфата 16 или связывающей группы 14, 14' меченого нуклеотида 10. После протекания окислительно-восстановительной реакции общий суммарный заряд редокс-активной зарядной метки 18 меняется (то есть она несет больше положительных зарядов или больше отрицательных зарядов). В одном примере редокс-активная зарядная метка 18 включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии, и редокс-активная зарядная метка 18 включает от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии. Следует понимать, что число зарядов редокс-активной зарядной метки 18 в неокисленном или невосстановленном состоянии меньше, чем число зарядов редокс-активной зарядной метки 18 в окисленном или восстановленном состоянии. В другом примере редокс-активная зарядная метка 18 включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии, и редокс-активная зарядная метка 18 включает от примерно 20 зарядов до примерно 50 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии.The redox-
Редокс-активная зарядная метка 18 может включать любой координированный (то есть закрепленный на месте) атом металла, который может вступать в окислительно-восстановительную реакцию. Примеры атомов металла включают железо, кобальт, рутений, цинк, медь, литий, серебро и т.д. В качестве некоторых конкретных примеров редокс-активная зарядная метка 18 выбрана из группы, состоящей из ферроцена, цинк-тетрабензопорфирина, фталоцианина кобальта, трис-(2,2'-бипиримидин)рутения, 4-ферроценилбензилового спирта, 5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинка (II) и редокс-активного каликсарена.The redox
Ферроцен может представлять собой любое металлоорганическое соединение, которое включает формулу Fe(C5H5)2. Конкретным примером является ферроценсодержащий дендример:Ferrocene can be any organometallic compound that includes the formula Fe(C 5 H 5 ) 2 . A specific example is a ferrocene-containing dendrimer:
в котором Fe2+ может становиться Fe3+ при окислении, вводя, таким образом, положительный заряд в каждом «Fe».in which Fe 2 + can become Fe 3 + when oxidized, thus introducing a positive charge in each "Fe".
Цинк-тетрабензопорфирин имеет структуру:Zinc tetrabenzoporphyrin has the structure:
в которой R=C2H5, С6Н13 или С12Н25. Zn1+ может становиться Zn2+ при окислении, вводя, таким образом, положительный заряд.in which R=C 2 H 5 , C 6 H 13 or C 12 H 25 . Zn 1+ can become Zn 2+ upon oxidation, thus introducing a positive charge.
Примеры фталоцианина кобальта включают: 
и 
оба из которых представляют собой суммарно нейтральные молекулы в растворе. При окислении Со2+ становится Со3+, вводя, таким образом, положительный заряд в каждом «Со» (например, один положительный заряд для первой структуры и пять положительных зарядов для второй структуры). Известны другие кобальт-содержащие соединения со степенями окисления, находящимися в интервале от -3 до +5, и они могут быть использованы в качестве отрицательно заряжаемых редокс-активных зарядных меток 18 или положительно заряжаемых редокс-активных зарядных меток 18.both of which are summarily neutral molecules in solution. When oxidized, Co 2+ becomes Co 3+ , thus introducing a positive charge in each "Co" (eg, one positive charge for the first structure and five positive charges for the second structure). Other cobalt-containing compounds with oxidation states ranging from -3 to +5 are known and can be used as negatively charged redox active charge tags 18 or positively charged redox active charge tags 18.
Трис-(2,2'-бипиримидин)рутений имеет структуру:Tris-(2,2'-bipyrimidine)ruthenium has the structure:
в которой Ru2+ может становиться Ru3+ при окислении, вводя, таким образом, положительный заряд.in which Ru 2 + can become Ru 3 + when oxidized, thus introducing a positive charge.
4-ферроценилбензиловый спирт имеет структуру:4-ferrocenylbenzyl alcohol has the structure:
в которой Fe2+ может становиться Fe3+ при окислении, вводя, таким образом, положительный заряд.in which Fe 2 + can become Fe 3 + when oxidized, thus introducing a positive charge.
5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинк (II) имеет структуру:5-(4-hydroxymethylphenyl)-10,15,20-trimesitylporphynato-zinc (II) has the structure:
в которой Zn2+ может становиться Zn1+ при восстановлении, вводя, таким образом, отрицательный заряд.in which Zn 2 + can become Zn 1 + when reduced, thus introducing a negative charge.
Некоторые примеры редокс-активных каликсаренов включают:Some examples of redox active calixarenes include:
Каждая из ранее описанных окислительно-восстановительных реакций обратима, и таким образом соединения могут быть использованы в своем более окисленном состоянии и могут быть восстановлены в чувствительной зоне 31 токопроводящего канала, или могут быть использованы в своем менее окисленном состоянии и могут быть окислены в чувствительной зоне 31 токопроводящего канала.Each of the previously described redox reactions is reversible and thus the compounds can be used in their more oxidized state and can be reduced in the
Как упомянуто выше, редокс-активная зарядная метка 18, раскрытая в данном документе, может быть нейтральной или почти нейтральной в растворе, и не несет большего заряда до тех пор, пока не вступит в окислительно-восстановительную реакцию. В связи с этим, нуклеотиды 10 в растворе не считаются высоко зарядными молекулами, и агломерация среди противоположно заряженных меченых нуклеотидов 10 (содержащих противоположно заряженные почти нейтральные редокс-активные зарядные метки 18) менее вероятно произойдет.As mentioned above, the redox
Меченые нуклеотиды 10 можно использовать в наборе и/или в системе 30 (пример которой показан на Фиг. 2). Набор или система 30 может включать токопроводящий канал 32. Токопроводящий канал 32 может быть в пределах или частью сосуда, такого как лунка, трубка, канал, кювета, чашка Петри, бутыль или тому подобное. Другим примером подходящего сосуда является проточная ячейка 34. Может быть использована любая конфигурация проточной ячейки, подходящая для реализаций, описанных в данном документе. Некоторые примеры проточных ячеек представляют собой проточные ячейки, которые имеются в продаже от Ilumina, Inc. (San Diego, CA). Проточные ячейки 34 удобны для доставки основного объема реагентов к ряду токопроводящих каналов 32 с индивидуальной адресацией во время присоединения компонентов реакции (например, нуклеиновых кислот - матриц, меченых нуклеотидов 10 и т.д.) к соответствующему токопроводящему каналу 32 или во время последующих реакций, проводимых с компонентами реакции на соответствующих токопроводящих каналах 32. Циклические процессы, такие как реакции секвенирования нуклеиновых кислот, особенно хорошо подходят для проточных ячеек 34. Другим особенно полезным сосудом является лунка в многолуночном планшете или планшете для микротитрования.Labeled
В примере, показанном на Фиг. 2, проточная ячейка 34 включает токопроводящий канал 32. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «токопроводящий канал» предназначен для обозначения части устройства выявления, которое преобразует возмущения на своей поверхности или в окружающем его электрическом поле в электрический сигнал. Например, токопроводящий канал 32 может преобразовывать прибытие или отправление компонента реакции (например, меченого нуклеотида 10) в электрический сигнал. В примерах, раскрытых в данном документе, токопроводящий канал 32 может также преобразовывать взаимодействия двух компонентов реакции (нуклеиновой кислоты - матрицы и нуклеотида 20 меченого нуклеотида 10) в выявляемый сигнал в результате его взаимодействия с редокс-активной зарядной меткой 18 меченого нуклеотида 10.In the example shown in FIG. 2, the
Токопроводящий канал 32 может представлять собой канал сенсора заряда 35. Сенсор заряда 35 может включать исток и электроды стока S, D и канал 32, соединяющий электроды S, D. Канал 32 может иметь подходящую геометрию, такую как, например, трубка, проволока, пластина и т.д.The
Электроды S, D могут представлять собой любой подходящий проводниковый материал. Примеры подходящих материалов истока и электродов стока включают кобальт, силицид кобальта, никель, силицид никеля, алюминий, вольфрам, медь, титан, молибден, оксид индия-олова (ITO - от англ. Indium tin oxide), оксид индия-цинка, золото, платину, углерод и т.д.The electrodes S, D may be any suitable conductor material. Examples of suitable source and drain electrode materials include cobalt, cobalt silicide, nickel, nickel silicide, aluminum, tungsten, copper, titanium, molybdenum, indium tin oxide (ITO), indium zinc oxide, gold, platinum, carbon, etc.
Токопроводящий канал 32 может включать любой проводниковый или полупроводниковый материал, который может окислять или восстанавливать редокс-активную зарядную метку 18. Материал может включать органический материал, неорганический материал или оба материала. Некоторые примеры подходящих материалов канала включают кремний, углерод (например, стеклоуглерод, графен и т.п.), полимеры, такие как проводящие полимеры (например, полипиррол, полианилин, политиофен, поли(3,4-этилендиокситиофен) с примесью поли(4-стиролсульфоната) (PEDOT-PSS) и т.д.), металлы и т.д.The
В некоторых примерах токопроводящий канал 26 может также представлять собой наноструктуру, которая имеет по меньшей мере один линейный размер по наношкале (находясь в интервале от 1 нм до меньше чем 1 мкм). В одном примере данный линейный размер относится к наибольшему линейному размеру. В качестве примеров, токопроводящий канал 26 может представлять собой полупроводящую наноструктуру, графеновую наноструктуру, металлическую наноструктуру и наноструктуру на основе проводящего полимера. Наноструктура может представлять собой многостенную или одностенную нанотрубку, нанопроволоку, наноленту и т.дIn some examples,
Примером сенсора заряда 35 является полевой транзистор (FET - от англ. field effect transistor), такой как FET на основе углеродной нанотрубки (CNT - от англ. carbon nanotube), FET на основе одностенной углеродной нанотрубки (SWNT - от англ. single-walled carbon nanotube), FET на основе кремниевой нанопроволоки (SiNW - от англ. silicon nanowire), FET на основе полимерной нанопроволоки, FET на основе графеновой наноленты (и родственные FET - наноленты, изготовленные из двухмерных материалов, таких как MoS2, силицен, и т.д.), туннельный FET (TFET - от англ. tunnel FET) и устройства с большой допороговой крутизной.An example of a
Примером сенсора заряда 35, показанного на Фиг. 2, является наноструктура FET, включающая исток S, электрод стока D и токопроводящий канал 32 между истоком S и электродом стока D. Токопроводящий канал 32 может представлять собой углеродную нанотрубку, одностенную углеродную нанотрубку, кремниевую нанопроволоку, полимерную нанопроволоку и т.д. Токопроводящий канал 32 функционирует как вывод затвора и, таким образом, также показан как «G» на Фиг. 2. В примерах, раскрытых в данном документе, вывод затвора G/токопроводящий канал 32 может служить в качестве окислительно-восстановительного электрода (отдающего или принимающего электроны) в отношении редокс-активной зарядной метки 18 меченого нуклеотида 10. Более конкретно, вывод затвора G/токопроводящий канал 32 можно использовать для переноса электронов к или от редокс-активной зарядной метки 18. Перенос электронов может происходить посредством туннелирования через оксидный слой затвора (не показан) на по меньшей мере части поверхности вывода затвора G/токопроводящего канала 32. В некоторых примерах для модуляции эффективности передачи тока можно использовать толщину оксидного слоя затвора, такую, чтобы минимальное количество времени контакта проходило перед тем, как редокс-активная зарядная метка 18 станет достаточно активированной. Время контакта может относиться ко времени, на протяжении которого редокс-активная зарядная метка 18 удерживается в достаточной близости от вывода затвора G/токопроводящего канала 32 для того, чтобы перенос электронов происходил с высокой долей вероятности. Данный период времени будет зависеть от многих факторов, включая тип редокс-активной зарядной метки 18, толщину оксидного слоя затвора и расстояние от вывода затвора G/токопроводящего канала 32 до зарядной метки 18. Это можно использовать для обеспечения того, чтобы сенсор заряда 35 достаточно устанавливал различие между диффундирующими мечеными нуклеотидами 10, которые временно контактируют с выводом затвора G/токопроводящим каналом 32, но которые фактически не ассоциированы с полимеразой 26, присоединенной к выводу затвора G/токопроводящему каналу 32. Ожидают, что нуклеотиды 10, которые ассоциированы с активным сайтом полимеразы 26, остаются в ассоциированном состоянии на протяжении периода времени, который значительно продолжительнее, чем период времени, за который происходит временное взаимодействие. Например, меченый нуклеотид 10 может оставаться ассоциированным с активным сайтом полимеразы (например, полимеразы 26) на протяжении от сотен микросекунд до сотен миллисекунд. Временное взаимодействие будет происходить в сроки для диффузии, которые на порядки величины быстрее.An example of
В данном примере полимераза 26 иммобилизована на выводе затвора G/токопроводящем канале 32 сенсора заряда 32 посредством связки 28. Связку 28 используют в качестве якоря для полимеразы 26. Связка 28 может демонстрировать способность к транспорту электронов. Примеры подходящих связок 28 включают цепи нуклеиновых кислот (например, имеющие от 5 до 25 нуклеотидов), пептиды, одиночные углеродные цепи, непроводящие олигомеры или полимеры или олигомеры или полимеры с низкой проводимостью и т.д.In this example,
В некоторых примерах связка 28 удерживает полимеразу 26 на расстоянии по меньшей мере 10 нм от вывода затвора G/токопроводящего канала 32 сенсора заряда 35. Это может быть желательным, например, когда не желательно обнаруживать заряды полимеразы 26 и/или отрицательные заряды нуклеиновой кислоты - матрицы 36, удерживаемой полимеразой 26. Однако, если желательно обнаружить заряды полимеразы 26 и/или нуклеиновой кислоты - матрицы 36, тогда связка 28 может удерживать полимеразу 26 на расстоянии меньше чем примерно 10 нм, меньше чем примерно 9 нм, меньше чем примерно 8 нм, меньше чем примерно 7 нм, меньше чем примерно 6 нм, меньше чем примерно 5 нм, меньше чем примерно 4 нм, меньше чем примерно 3 нм, меньше чем примерно 2 нм или примерно 1 нм от вывода затвора G сенсора заряда 32.In some instances,
Применение сенсора заряда на основе FET 35 может обеспечивать следующее: (1) чувствительность в отношении одиночной молекулы может достигаться посредством как следует сконструированного FET, и (2) можно способствовать высокой степени параллелизации (так называемая «способность к мультиплексированию»), поскольку выявляемое изменение в заряде локализовано вблизи вывода затвора G/токопроводящего канала 32, избегая, таким образом, перекрестных помех между соседними сайтами FET с индивидуальной адресацией (например, в ряду). Кроме того, кремниевую наноструктуру FET можно изготовлять с использованием способов, которые совместимы со средствами производства полупроводников.The use of a charge sensor based on
Примеры набора и/или системы 30 могут также включать нуклеиновую кислоту - матрицу 36, которая подлежит введению в проточную ячейку 34, и реагенты (не показаны на Фиг. 2), которые подлежат введению в проточную ячейку 34.Examples of kit and/or
Нуклеиновая кислота - матрица 36 может представлять собой любой образец, который подлежит секвенированию, и может состоять из ДНК, РНК или их аналогов. Источник нуклеиновых кислот - матриц (или мишеней) 36 может представлять собой геномную ДНК, матричную РНК или другие нуклеиновые кислоты из нативных источников. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты - матрицы 36, которые происходят из таких источников, могут быть амплифицированы перед применением в способе или системе 30 в данном документе. Можно использовать любую из множества известных методик амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA - от англ. rolling circle amplification), амплификацию с множественным замещением (MDA- от англ. multiple displacement amplification) или амплификацию со случайными праймерами (RPA - от англ. random primer amplification), но, не ограничиваясь ими. Следует понимать, что амплификация нуклеиновых кислот - мишеней 26 перед применением в способе или системе 30, изложенной в данном документе, является необязательной. В связи с этим, нуклеиновые кислоты - матрицы 36 не будут амплифицированы перед применением в некоторых примерах. Нуклеиновые кислоты - матрицы/мишени могут возможно происходить из синтетических библиотек. Синтетические нуклеиновые кислоты могут иметь композиции нативной ДНК или РНК или могут представлять собой их аналоги.
Биологические образцы, из которых могут происходить нуклеиновые кислоты - матрицы 36, включают, например, биологические образцы из млекопитающего, такого как грызун, мышь, крыса, кролик, морская свинка, копытное животное, лошадь, овца, свинья, коза, корова, кошка, собака, примат, человекообразный примат или примат, отличный от человека; растения, такого как Arabidopsis thaliana, кукуруза, сорго, овес, пшеница, рис, канола или соя; водоросли, такой как Chlamydomonas reinhardtii; круглого червя, такого как Caenorhabditis elegans; насекомого, такого как Drosophila melanogaster, комар, плодовая мушка, медоносная пчела или паук; рыбы, такой как данио-рерио; рептилии; амфибии, такой как лягушка или Xenopus laevis; dictyostelium discoideum; грибов, таких как Pneumocystis carinii, Takifugu rubripes, дрожжи, Saccharamoyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe; или Plasmodium falciparum. Нуклеиновые кислоты - матрицы 36 могут также происходить из прокариот, таких как бактерия, Escherichia coli, staphylococci или mycoplasma pneumoniae; архей; вируса, такого как вирус Гепатита С, вирус Эбола или вирус иммунодефицита человека; или вироида. Нуклеиновые кислоты - матрицы 36 могут происходить из гомогенной культуры или популяции указанных выше организмов или в качестве альтернативы из коллекции нескольких разных организмов, например, в сообществе или экосистеме.Biological samples from which the
Кроме того, нуклеиновые кислоты - матрицы/мишени 36 могут не происходить из природных источников, а скорее могут быть синтезированы с использованием известных методик. Например, зонды для анализа экспрессии генов или зонды генотипирования могут быть синтезированы и использованы в примерах, изложенных в данном документе.In addition, the template/target
В некоторых примерах, нуклеиновые кислоты - матрицы/мишени 36 могут быть получены в виде фрагментов одной или более чем одной более длинной нуклеиновой кислоты. Фрагментацию можно проводить, используя любую из множества методик, известных в данной области, включая, например, распыление, обработку ультразвуком, химическое расщепление, ферментативное расщепление или физическую фрагментацию.In some examples, template/target
Фрагментация может также получаться в результате применения конкретной методики амплификации, посредством которой получают ампликоны в результате создания копий только части более длинной нуклеиновой кислоты. Например, посредством ПЦР-амплификации получаются фрагменты, имеющие размер, определенный длиной нуклеотидной последовательности на исходной матрице, которая находится между положениями, где во время амплификации гибридизуются фланкирущие праймеры.Fragmentation may also result from the use of a specific amplification technique whereby amplicons are obtained by making copies of only a portion of a longer nucleic acid. For example, by PCR amplification, fragments are obtained having a size determined by the length of the nucleotide sequence on the original template, which is located between the positions where flanking primers hybridize during amplification.
Популяция нуклеиновых кислот - матриц/мишеней 36 или их ампликонов может иметь среднюю длину нити, которая желательна или подходит для конкретного применения способов, наборов или системы 30, изложенных в данном документе. Например, средняя длина нити может составлять меньше чем примерно 100000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или 50 нуклеотидов. В качестве альтернативы или дополнительно средняя длина нити может быть больше чем примерно 10 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов или 100000 нуклеотидов. Средняя длина нити для популяции нуклеиновых кислот - мишеней или их ампликонов может находиться в интервале от максимального до минимального значения, установленного выше.The population of nucleic acid templates/
В некоторых случаях популяция нуклеиновых кислот - матриц/мишеней 36 может быть получена в условиях или иначе сконфигурирована таким образом, чтобы иметь максимальную длину для своих членов. Например, максимальная длина для членов может составлять меньше чем примерно 100000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или 50 нуклеотидов. В качестве альтернативы или дополнительно популяция нуклеиновых кислот в качестве матрицы 36 или их ампликонов может быть получена в условиях или иначе сконфигурирована таким образом, чтобы иметь минимальную длину для своих членов. Например, минимальная длина для членов может составлять больше чем примерно 10 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов или 100000 нуклеотидов. Максимальная и минимальная длина нити для нуклеиновых кислот - матриц 36 в популяции может находиться в интервале от максимального до минимального значения, изложенного выше.In some instances, the population of nucleic acid templates/
Как показано на Фиг. 2, нуклеиновая кислота - матрица 36 (например, нить одноцепочечной ДНК), подлежащая секвенированию, связана с полимеразой 26 после введения в жидкость вместе с или отдельно от реагентов, таких как ранее описанные меченые нуклеотиды 10 (не показано на Фиг. 2).As shown in FIG. 2, a nucleic acid template 36 (e.g., a single-stranded DNA strand) to be sequenced is bound to polymerase 26 after incorporation into the liquid, along with or separately from reagents such as previously described labeled nucleotides 10 (not shown in FIG. 2).
Нуклеиновая кислота - матрица 36 и/или реагенты (например, меченые нуклеотиды 10) могут находиться в жидкости и быть введены в проточную ячейку 34. Жидкость может включать буфер с низким содержанием соли. В качестве примеров, буфер с низким содержанием соли может включать от больше чем 0 мМ до примерно 50 мМ соли. В качестве одного примера, буфер с низким содержанием соли может включать вплоть до 5 мМ Mg2+ в трис-буфере (рН 8,0). Применение буфера с низким содержанием соли может быть желательным таким образом, чтобы на чувствительную зону 31 (то есть, Дебаевскую длину) не оказывалось вредного действия, то есть, чтобы она не была слишком длинной, таким образом, чтобы исключить возможность обнаружения зарядных меток 18. Жидкость может также включать катализаторы, такие как ферменты, которые облегчают реакцию, другие добавки и растворители (например, вода, диметилсульфоксид (ДМСО), бетаин, формамид и т.д.).
В некоторых примерах несколько разных меченых нуклеотидов 10 можно использовать вместе в жидкости, которую вводят в сенсор заряда 35. В данных примерах следует понимать, что связывающая группа 14, 14' может быть либо идентична для всех типов меченых нуклеотидов, либо может быть разной. Свойства связывающей группы 14, 14', такие как длина и жесткость, могут быть изменены таким образом, чтобы влиять на скорость окислительно-восстановительной реакции. Такие свойства могут быть отрегулированы индивидуально для меченого нуклеотида 10 и его ассоциированной редокс-активной зарядной метки 18. Свойства специфичной области 24 связывающей группы 14' можно также менять для влияния на скорость окислительно-восстановительной реакции. Связывающую группу 14, 14' можно изменять для увеличения или уменьшения количества времени, на протяжении которого редокс-активная зарядная метка 18 находится вблизи токопроводящего канала 32. Такие изменения можно использовать для влияния на скорость переноса электронов. Таким образом, временные взаимодействия между зарядной меткой 18 и токопроводящим каналом 32 в результате диффузии меченых нуклеотидов 10 могут быть сделаны с меньшей вероятностью переноса электронов. В качестве альтернативы, удерживание редокс-активной зарядной метки 18 на протяжении более длительного периода в непосредственной близости от токопроводящего канала 32 может приводить к более высокой вероятности переноса электронов.In some examples, several different labeled
В одном примере четыре разных меченых нуклеотида 10 используют в жидкости, которую вводят в сенсор заряда 35, причем каждый включает отличающийся нуклеотид 12 (в частности отличающееся основание 20) и отличающуюся нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку 18. Пример этого показан на Фиг. 3. В данном примере меченые нуклеотиды 10 включают: первый меченый нуклеотид 10А, включающий дезоксиаденозинполифосфат в качестве нуклеотида и первую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку (показано с четырьмя положительными зарядами на Фиг. 3); второй меченый нуклеотид 10G, включающий дезоксигуанозинполифосфат в качестве нуклеотида и вторую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку (показано с четырьмя отрицательными зарядами на Фиг. 3); третий меченый нуклеотид 10С, включающий дезоксицитидинполифосфат в качестве нуклеотида и третью нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку (показано с двумя отрицательными зарядами на Фиг. 3); и четвертый меченый нуклеотид 10Т, включающий дезокситимидинфосфат в качестве нуклеотида и четвертую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку (показано с одним положительным зарядом на Фиг. 3). В данном примере первая, вторая, третья и четвертая нуклеотид-специфичные редокс-активные зарядные метки отличаются друг от друга.In one example, four different labeled
В примере, показанном на Фиг. 3, две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток положительно заряжены (например, dATP и dTTP) в измененном состоянии заряда (то есть, после протекания окислительно-восстановительной реакции), и другие две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток (например, dGTP и dCTP) отрицательно заряжены в измененном состоянии заряда (то есть, после протекания окислительно-восстановительной реакции).In the example shown in FIG. 3, two of the first, second, third, and fourth nucleotide-specific redox active charge labels are positively charged (e.g., dATP and dTTP) in an altered state of charge (i.e., after a redox reaction has occurred), and the other two from the first, the second, third, and fourth nucleotide-specific redox-active charging labels (eg, dGTP and dCTP) are negatively charged in an altered state of charge (ie, after a redox reaction has occurred).
В примере, показанном на Фиг. 3, даже в том случае, если заряды на двух из нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток являются одинаковыми (положительными или отрицательными), метки 18 можно еще использовать для того, чтобы установить различие между разными типами нуклеотидов, поскольку заряды имеют разную силу (например, после редокс-активации). Согласно примеру конфигурации, показанному на Фиг. 3, предложено установление различия между четырьмя состояниями на основе единственного положения гибридизации со связкой и четырех разных редокс-активных зарядных меток 18. Конкретнее, как dGTP, так и dCTP содержат отрицательно заряженные редокс-активные зарядные метки 18, которые отличают их от dATP и dTTP; и dGTP можно отличить от dCTP, благодаря заряду, который различимо выше, чем заряд на dCTP. Аналогично, dATP и dTTP можно отличить друг от друга, благодаря более высокому положительному заряду на группировке dATP, по сравнению с группировкой dTTP.In the example shown in FIG. 3, even if the charges on two of the nucleotide-specific redox-active charge marks are the same (positive or negative), marks 18 can still be used to distinguish between different types of nucleotides, since the charges have different strengths ( e.g. after redox activation). According to the configuration example shown in FIG. 3, it is proposed to differentiate between four states based on a single bond hybridization position and four different redox active charge marks 18. More specifically, both dGTP and dCTP contain negatively charged redox active charge marks 18 that distinguish them from dATP and dTTP ; and dGTP can be distinguished from dCTP by a charge that is distinctly higher than the charge on dCTP. Similarly, dATP and dTTP can be distinguished from each other due to the higher positive charge on the dATP moiety compared to the dTTP moiety.
В некоторых примерах может быть невозможным иметь редокс-активные зарядные метки 18 как положительной, так и отрицательной величины, функционирующие в одной и той же жидкости, поскольку напряжение, требуемое для того, чтобы зарядить отрицательно зарядную метку, может разряжать положительно зарядную метку, и наоборот. В связи с этим, в других примерах может быть желательным использовать примеры меченых нуклеотидов 10, раскрытые в данном документе, которые включают редокс-активные зарядные метки 18 одной полярности, и использовать другие меченые нуклеотиды, которые включают постоянно зарядные (то есть, не редокс) метки. Примеры постоянно заряженных меток включают отрицательно заряженные метки, такие как, например, фосфатная группа, DMT и/или FMOC (от англ. 9-fluorenylmethoxycarbonyl - 9-флуоренилметоксикарбонил); или положительно заряженные метки, такие как первичный амин. В качестве примера, можно использовать от одного до трех разных меченых нуклеотидов 10 (включая редокс-активные зарядные метки 18), и остальная часть меченых нуклеотидов будет включать постоянно зарядные метки и не редокс-активные зарядные метки 18. Это особенно полезно в случае, когда используют условия восстановления или окисления (но не и те и другие). Следует понимать, что в данных примерах не должно происходить агломерации, поскольку отсутствует относительно высокая концентрация больших группировок обоих типов заряда в растворе в одно и то же время.In some instances, it may not be possible to have redox active charge marks 18 of both positive and negative magnitude operating in the same fluid, since the voltage required to charge a negative charge mark may discharge a positive charge mark, and vice versa. . In this regard, in other examples, it may be desirable to use the examples of labeled
На Фиг. 3 также проиллюстрирована чувствительная зона 31 (заштрихованная область вокруг вывода затвора G/токопроводящего канала 32). Сенсоры заряда 35 могут функционировать в биологически релевантных солевых условиях, например, в интервале от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ. Дебаевская длина таких солевых растворов может находиться в интервале от примерно 0,3 нМ до примерно 10 нМ, что может ограничивать чувствительную зону 31 до нескольких нм снаружи от поверхности вывода затвора G и часто может уменьшать уровни сигнала с ограничением возможности выявления.On FIG. 3 also illustrates the sensing area 31 (shaded area around the gate terminal G/conductive path 32). The
В то время как несколько связанных полимераз 28 показаны на токопроводящем канале 32 на Фиг. 3, следует понимать, что в конкретном сенсоре заряда 35 одна полимераза 28 связана с одним токопроводящим каналом 32. Вследствие этого, в примере, показанном на Фиг. 3, проиллюстрирована полимераза 28 во время событий включения четырех разных нуклеотидов, и эффект, оказываемый на разные редокс-активные зарядные метки 18 во время соответствующих событий включения.While several linked
Обращаясь теперь к Фиг. 4, изображен пример способа. Способ 100 включает следующее: введение нуклеиновой кислоты - матрицы 36 в токопроводящий канал 32, имеющий связанную с ним полимеразу 26 (номер позиции 102); введение меченых нуклеотидов 10 в токопроводящий канал 32, причем по меньшей мере один из меченых нуклеотидов 10 включает нуклеотид 12 и нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку 18, присоединенную к нему, посредством чего один из меченых нуклеотидов 10 ассоциирует с полимеразой 26 (номер позиции 104); при ассоциации одного из меченых нуклеотидов 10, инициация окислительно-восстановительной реакции между нуклеотид-специфичной редокс-активной меткой 18 и токопроводящим каналом 32 с изменением состояния заряда нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18 (номер позиции 106); и под действием окислительно-восстановительной реакции, выявление ответа сенсора заряда 32 (номер позиции 108). На Фиг. 5А и 5Б также будут ссылаться на протяжении обсуждения способа 100.Turning now to FIG. 4 shows an example of the method. The
Как показано на Фиг. 5А, нуклеиновая кислота - матрица 36, вводимая в сенсор заряда 32, может закрепляться на месте посредством полимеразы 26, которая связана с сенсором заряда 32. Нуклеиновая кислота - матрица 36, показанная на Фиг. 5А, может представлять собой нить ДНК - матрицу.As shown in FIG. 5A,
Также как показано на Фиг. 5А, меченый нуклеотид 10 может включать основание 20, которое комплементарно целевой нуклеиновой кислоте нуклеиновой кислоты - матрицы 36. Меченый нуклеотид 10 будет закреплен на месте, частично, посредством полимеразы 26, которая также связана с нуклеиновой кислотой - матрицей 36. Если имеется, специфичная область 24 связывающей группы 14' меченого нуклеотида 10 может взаимодействовать со связкой 28.Also as shown in FIG. 5A, labeled
Пример меченого нуклеотида 10, ассоциированного со связкой 28, показан на 5В. В данном примере связывающая группа 14' меченого нуклеотида 10 включает специфичную область 24 (например, А', В', С), которая обладает аффинностью в отношении части (например, А, В, С) связки 28. В данном конкретном примере специфичная область 24 (например, А', В', С) включает нуклеотиды или пептидо-нуклеиновые кислоты, которые комплементарны нуклеотидам или пептидо-нуклеиновым кислотам данной части (например, А, В, С) связки 28. В другом примере, специфичная область 24 и акцепторная область связки 28 может представлять собой группировки, не являющиеся нуклеиновыми кислотами, которые обладают аффинностью друг к другу. В еще одном примере специфичная область 24 может представлять собой группировку, не являющуюся нуклеиновой кислотой, которая обладает аффинностью в отношении гидрофобного полимера (один пример связки 28). Специфичное связывание данных областей может быть получено в результате стандартного спаривания оснований по Уотсону-Крику. Специфичная область 24, в данном примере, может также включать инозины (I), фланкирующие А', В', С нуклеотидную последовательность. Инозины представляют собой универсальные основания, и, таким образом, могут спариваться со всеми четырьмя нативными нуклеотидами ДНК. В связи с этим, дополнительные связывающие взаимодействия могут быть результатом взаимодействий универсальных оснований (например, инозина I) с нативными нуклеотидами на связке 28. Таким образом, когда меченый нуклеотид 10 связывается с полимеразой 26 во время включения, происходит синергическое связывание между специфичной областью 24 меченого нуклеотида 10 и связкой 28, что значительно увеличивает стабильность взаимодействия меченого нуклеотида 10 и связки 28.An example of labeled
Когда связывающая группа14 меченого нуклеотида 10 не включает специфичную область 24, следует понимать, что меченый нуклеотид 10 будет закреплен на месте в результате взаимодействия с полимеразой 26. Длина связывающей группы 14 может способствовать удерживанию редокс-активной зарядной метки 18 в пределах чувствительной зоны 31 вывода затвора G/токопроводящего канала 32.When the linking
Взаимодействие меченого нуклеотида 10 и полимеразы 26 или меченого нуклеотида 10 и полимеразы 26 и связки 28 вызывает попадание редокс-активной зарядной метки 18 в чувствительную зону 31 токопроводящего канала 32. Взаимодействие(я) также помогает(ют) в удержании редокс-активной зарядной метки 18 в чувствительной зоне 31 на протяжении периода времени, достаточного для эффективного и полного переноса заряда. Период времени может составлять вплоть до десятков миллисекунд. Данное относительно длительное взаимодействие отличается от других меченых нуклеотидов 10, находящихся в растворе, которые могут диффундировать и на протяжении непродолжительного времени соприкасаться с токопроводящим каналом 32. Непродолжительное взаимодействие не является достаточно длительным для того, чтобы происходил достаточный перенос заряда, и таким образом в данных примерах редокс-активная зарядная метка 18 не является заряженной, и ответа не выявляют посредством сенсора заряда 32.The interaction of labeled
В примере, показанном на Фиг. 5А, редокс-активная зарядная метка 18 на основе фталоцианина меди меченого нуклеотида поступает в поле (например, чувствительную зону 31), которое находится в пределах от примерно 1 нм до примерно 2 нм от токопроводящего канала 32. Поскольку меченый нуклеотид 10 закреплен на месте, редокс-активная зарядная метка 18 способна стать заряженной посредством вывода затвора G/токопроводящего канала 32.In the example shown in FIG. 5A, a redox-active copper
Для инициации окислительно-восстановительной реакции между выводом затвора G/токопроводящим каналом 32 (например, кремниевой нанопроволокой, углеродной нанотрубкой и т.д.) и редокс-активной зарядной меткой 18, напряжение, прикладываемое к выводу затвора G/токопроводящему каналу 32, можно доводить до напряжения оксидирования или напряжения восстановления редокс-активной зарядной метки 18. При окислении, редокс-активная зарядная метка 18 теряет электроны, и, таким образом, вывод затвора G/токопроводящий канал 32 создает суммарные положительные заряды на редокс-активной зарядной метке 18. При восстановлении, редокс-активная зарядная метка 18 получает электроны, и, таким образом, вывод затвора G/токопроводящий канал 32 привносит суммарные отрицательные заряды в редокс-активную зарядную метку 18. В результате окислительно-восстановительной реакции состояние заряда редокс-активной зарядной метки 18 меняется. Данное измененное сильно заряженное состояние (например, по сравнению с состоянием редокс-активной зарядной метки 18 перед зарядкой, которое является неокисленным или невосстановленным состоянием) вносит помехи в поле вокруг токопроводящего канала 32 и формирует выявляемый сигнал.In order to initiate a redox reaction between the G gate terminal/conductive path 32 (e.g., silicon nanowire, carbon nanotube, etc.) and the redox
Напряжение, прикладываемое к токопроводящему каналу 32 во время окислительно-восстановительной реакции и во время выявления, может зависеть от используемой редокс-активной зарядной метки 18. Например, зарядное напряжение может отличаться от напряжения считывания, и, таким образом, токопроводящий канал 32 может циклично меняться от зарядного(ых) напряжения(ий) до напряжения(ий) считывания. В одном примере инициирование окислительно-восстановительной реакции включает прикладывание зарядного напряжения к токопроводящему каналу 32, и выявление ответа токопроводящего канала 32 включает прикладывание напряжения считывания к токопроводящему каналу 32.The voltage applied to
Ответ токопроводящего канала 32 после окислительно-восстановительной реакции является показателем измененного состояния заряда редокс-активной зарядной метки 18. Ответ токопроводящего канала 32 после окислительно-восстановительной реакции может также указывать на основание 20 меченого нуклеотида 10, поскольку редокс-активная зарядная метка 18 является нуклеотид-специфичной (то есть специфичная метка 18 выбрана для конкретного основания 20). В связи с этим, способ 100 может также включать ассоциирование ответа токопроводящего канала 32 с нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой 18 ассоциированного одного из меченых нуклеотидов 10 (то есть меченого нуклеотида 10, ассоциировал с полимеразой 26), и, на основе нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18, идентификацию нуклеотида (например, основания 20) ассоциированного меченого нуклеотида 10 (то есть, меченого нуклеотида 10, который ассоциировал с полимеразой 26).The response of
Основание 20 ассоциированного меченого нуклеотида 10 будет включено в растущую нить 38, которая подвергается гибридизации с нуклеиновой кислотой - матрицей 36. В свою очередь, при этом будет естественно рваться связь между фосфатной группой 16 меченого нуклеотида 10 и только что включенного нуклеотидного основания 20. Например, после включения нуклеотидного основания 20 в растущую нить 38 связь между альфа-фосфатом и связывающей группой 16 или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом естественно расщепляется. В результате, оставшееся количество меченого нуклеотида 10 (например, компоненты 14 или 14' и 18) может диссоциировать от нуклеотидного основания 20 и диффундировать в сторону от токопроводящего канала 32, возвращая, таким образом, поле вокруг токопроводящего канала 32 в состояние, в котором оно было до ассоциации меченого нуклеотида 10 с полимеразой 26. Появление и исчезновение сигнала, когда в поле вокруг токопроводящего канала 32 вносятся помехи, и оно возвращается в невозбужденное состояние, соответственно, может коррелировать с включением нуклеотидного основания 20 в растущую нить 38 нуклеиновой кислоты - матрицы 36. В связи с этим, примеры способа 100 также включают отщепление (например, на уровне фосфатной группы 16) нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18 и связывающей группы 14, 14' от ассоциированного одного из меченых нуклеотидов 10, вследствие чего нуклеотидное основание 20 ассоциированного меченого нуклеотида 10 включается в растущую нить 38, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице 36. Отщепление может включать ожидание того, чтобы происходило естественное отщепление. Поскольку сигнал возвращается к исходному состоянию между последовательными включениями оснований меченого нуклеотида 20, возможно выявление гомополимерных сегментов в растущей нити 38 вдоль нити матрицы 36.The
Некоторые примеры, раскрытые в данном документе, используют синергическое связывание меченого нуклеотида 10 с полимеразой 26, отдельно или в комбинации со связкой 28, для приведения и удерживания редокс-активной зарядной метки 18 вблизи чувствительной зоны 31 токопроводящего канала 32. Стабильность комплекса, образованного связкой 28 и специфичной областью 24, может быть относительно низкой, такой что комплекс (образованный специфичной областью 24 и связкой 28) не образуется в случае меченых нуклеотидов 10, которые также не связаны с полимеразой 26 (то есть меченые нуклеотиды 10, которые свободны в растворе, по существу не связываются со связкой 28). Иными словами, скорость диссоциации комплекса может быть достаточной высокой, чтобы время жизни было коротким. Однако, когда образуется стабильная ассоциация между меченым нуклеотидом 10 и полимеразой 26, локальная концентрация связывающей группы 14, 14' повышается вокруг связки 28, таким образом, приводя к высокой скорости ассоциации специфичной области 24 со связкой 28. Таким образом, общая продолжительность ассоциации значительно увеличена в ассоциированном с полимеразой состоянии меченого нуклеотида 10, по сравнению с неассоциированным состоянием свободноплавающих меченых нуклеотидов 10. Синергическое действие аффинностей меченого нуклеотида 10 в отношении полимеразы 30, отдельно или в комбинации со связкой 28, делает возможной существенную общую аффинность связывания. После естественного отщепления посредством полимеразы 26 после включения нуклеотидного основания 20, синергическое действие теряется, и зарядная метка 18 также будет диссоциировать от токопроводящего канала 32.Some of the examples disclosed herein use the synergistic binding of labeled
В примере способа 100 ассоциирование одного из меченых нуклеотидов 10 с полимеразой 28, инициирование окислительно-восстановительной реакции, выявление, ассоциирование ответа и идентификация включенного нуклеотидного основания 20 вместе представляют собой цикл секвенирования. Способ 100 может дополнительно включать следующее: проведение другого цикла секвенирования с другим меченым нуклеотидом 10, который ассоциирует с полимеразой 26. Проведение следующего цикла секвенирования может включать обеспечение ассоциации следующего из меченых нуклеотидов 10 с полимеразой 26; при ассоциации следующего из меченых нуклеотидов 10 инициирование другой окислительно-восстановительной реакции между другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой 18 и сенсором заряда 32 с изменением состояния заряда другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18; под действием другой окислительно-восстановительной реакции выявление другого ответа сенсора заряда 32; ассоциирование другого ответа сенсора заряда 32 с другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой; и на основе другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18, идентификацию нуклеотида (основания 20) следующего одного из меченых нуклеотидов 10 (то есть, который проассоциировал с полимеразой 26). Другая нуклеотид-специфичная редокс-активная зарядная метка может быть отщеплена, и нуклеотид (основание 20) следующего одного из меченых нуклеотидов 10 включается в растущую нить 38, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице 36. Цикл секвенирования можно повторять.In the
В примерах, раскрытых в данном документе, также можно использовать форму волны. За формой волны можно следить для определения того, когда она достигнет одного или более пороговых значений напряжения в отношении окислительно-восстановительного потенциала редокс-активных зарядных меток 18, которые имеют разные окислительно-восстановительные потенциалы. В данных примерах изменение в полученном токе через вывод затвора G/токопроводящий канал 32 может быть использовано в качестве информации для идентификации основания 20 меченого нуклеотида 10, включая редокс-активную зарядную метку 18, которая ассоциирована с конкретным пороговым напряжением.In the examples disclosed in this document, you can also use the waveform. The waveform can be monitored to determine when it reaches one or more voltage thresholds in relation to the redox potential of the redox charging tags 18 that have different redox potentials. In these examples, a change in received current through gate G/
В примерах, раскрытых в данном документе, число электронов, переносимых к или от редокс-активной зарядной метки 18, можно также отслеживать. Переносимое число электронов можно использовать для идентификации основания нуклеотида 20, ассоциированного с полимеразой 26, и что полимераза 26 включается в растущую нить 38.In the examples disclosed herein, the number of electrons transferred to or from the redox active charging
Меченые нуклеотиды 10 и систему 10, раскрытую в данном документе, можно использовать для любого из множества применений. Как описано в ссылке на Фиг. 4, 5А и 5В, конкретным полезным применением является секвенирование нуклеиновой кислоты, такое как секвенирование одиночных молекул методом синтеза (SBS - от англ. sequencing-by-synthesis). В SBS одиночных молекул удлинение праймера нуклеиновой кислоты вдоль нуклеиновой кислоты - матрицы 36 (например, целевая нуклеиновая кислота или ее ампликон) отслеживают для определения последовательности нуклеотидов в матрице 36. Лежащий в основе химический процесс может представлять собой полимеризацию (например, катализируемую ферментом полимеразой 26, как описано в данном документе). В конкретном примере SBS одиночных молекул на основе полимеразы нуклеотиды (например, основания 20) добавляют к праймеру (удлиняя, таким образом, праймер и образуя растущую нить 38) в матрице зависимым образом таким образом, чтобы можно было использовать выявление порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру, для определения последовательности матрицы. Множество разных матриц 36 в разных токопроводящих каналах 32 целого ряда можно подвергать анализу на основе методики SBS одиночных молекул в условиях, где события, происходящие в случае разных матриц 36, можно различить посредством индивидуальных детекторов, которые функционально связаны с каждым из токопроводящих каналов 32. Каждый токопроводящий канал 32 (и его исток и электроды стока S, D) может быть размещен в углублении или лунке проточной ячейки, что помогает физически отделять один канал 32 от соседнего канала 32 в ряду.The labeled
Другие подходящие применения для меченых нуклеотидов 10, набора и системы 30, раскрытых в данном документе, включают секвенирование методом лигирования и секвенирование методом гибридизации. Другим полезным применением для меченых нуклеотидов 10 и системы 30, раскрытых в данном документе, является анализ экспрессии генов. Экспрессию генов можно выявлять или количественно определять, используя методики секвенирования РНК, такие как методики, называемые цифровым секвенированием РНК. Методики секвенирования РНК можно осуществлять, используя методы секвенирования, известные в данной области, такие как методы, изложенные выше, за исключением того, что флуоресцентное выявление оптически меченых нуклеотидов можно заменить способами выявления на основе заряда, изложенными в данном документе.Other suitable uses for labeled
Экспрессию генов можно также выявлять или количественно определять с использованием методик гибридизации, проводимых посредством прямой гибридизации с чипом, или с использованием мультиплексного анализа, продукты которого выявляют на чипе. Данные способы можно легко адаптировать посредством замены оптических меток и флуоресцентного выявления методиками выявления на основе заряда и редокс-активными зарядными метками 18, изложенными в данном документе.Gene expression can also be detected or quantified using hybridization techniques carried out by direct hybridization to an array, or using multiplex analysis whose products are detected on an array. These methods can be readily adapted by replacing optical labels and fluorescent detection with charge-based detection techniques and redox active charge labels 18 set forth herein.
Следует понимать, что все комбинации приведенных выше понятий и дополнительных понятий, обсуждаемых более подробно ниже (в том случае, если такие понятия не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленного предмета изобретения, появляющиеся в конце данного раскрытия, рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в данном документе. Также следует понимать, что терминология, в явном виде используемая в данном документе, которая также может появляться в любом раскрытии, включенном посредством ссылки, должна предоставлять значение, наиболее соответствующее конкретным понятиям, раскрытым в данном документе.It should be understood that all combinations of the above concepts and additional concepts discussed in more detail below (in the event that such concepts are not mutually contradictory) are considered as part of the subject matter disclosed in this document. In particular, all combinations of claimed subject matter appearing at the end of this disclosure are considered part of the subject matter disclosed herein. It should also be understood that the terminology explicitly used in this document, which may also appear in any disclosure incorporated by reference, should provide the meaning that is most appropriate for the specific concepts disclosed in this document.
Ссылка на протяжении всего описания изобретения на «один пример», «другой пример», «пример» и т.п., означает, что конкретный элемент (например, признак, структура и/или характеристика), описанный в связи с данным примером, включен в по меньшей мере один пример, описанный в данном документе, и может быть представлен или может не быть представлен в других примерах. Кроме того, следует понимать, что описанные элементы для любого примера можно объединять любым подходящим образом в разных примерах, если контекстом явным образом не продиктовано иное.Reference throughout the description of the invention to "one example", "another example", "example", etc., means that a particular element (for example, a feature, structure and/or characteristic) described in connection with this example, included in at least one example described herein and may or may not be present in other examples. In addition, it should be understood that the described elements for any example can be combined in any suitable way in different examples, unless the context clearly dictates otherwise.
Термины «по существу» и «примерно», используемые на протяжении данного раскрытия, включая формулу изобретения, используют для описания и объяснения небольших отклонений, как например, вследствие разброса при обработке. Например, они могут относиться к меньше чем или равным плюс/минус 5%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 2%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 1%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,5%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,2%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,1%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,05%.The terms "substantially" and "about" as used throughout this disclosure, including the claims, are used to describe and explain small variations, such as due to processing scatter. For example, they may refer to less than or equal to plus/minus 5%, such as less than or equal to plus/minus 2%, such as less than or equal to plus/minus 1%, such as less than or equal to plus /minus 0.5%, such as less than or equal to plus/minus 0.2%, such as less than or equal to plus/minus 0.1%, such as less than or equal to plus/minus 0.05 %.
Кроме того, следует понимать, что диапазоны, предложенные в данном документе, включают установленный диапазон или любое значение или поддиапазон в пределах установленного диапазона, как если бы такое значение или поддиапазон были в явном виде перечислены. Например, следует понимать, что диапазон, представленный от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов, включает не только в явном виде перечисленные пределы от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов, но также включает отдельные значения, такие как, например, 5 зарядов, 50 зарядов, 75 зарядов и т.д., и поддиапазоны, как например, от примерно 15 зарядов до примерно 85 зарядов, и т.д.In addition, it should be understood that the ranges proposed herein include the specified range or any value or subrange within the specified range, as if such a value or subrange were explicitly listed. For example, it should be understood that the range represented from about 1 charge to about 100 charges includes not only the explicitly listed ranges of about 1 charge to about 100 charges, but also includes individual values such as, for example, 5 charges, 50 charges, 75 charges, etc., and subranges such as from about 15 charges to about 85 charges, etc.
В то время как несколько примеров было подробно описано, следует понимать, что раскрытые примеры можно модифицировать. Таким образом, приведенное выше описание нужно считать неограничивающим.While several examples have been described in detail, it should be understood that the disclosed examples may be modified. Thus, the above description is to be considered non-limiting.
Claims (62)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862710465P | 2018-02-16 | 2018-02-16 | |
| US62/710,465 | 2018-02-16 | ||
| PCT/US2019/017830 WO2019160937A1 (en) | 2018-02-16 | 2019-02-13 | Labeled nucleotides and uses thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019139633A RU2019139633A (en) | 2021-06-07 |
| RU2019139633A3 RU2019139633A3 (en) | 2021-06-07 |
| RU2782056C2 true RU2782056C2 (en) | 2022-10-21 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2637310C1 (en) * | 2016-06-08 | 2017-12-04 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Fluorescently-labeled deoxyuridine triphosphates |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2637310C1 (en) * | 2016-06-08 | 2017-12-04 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Fluorescently-labeled deoxyuridine triphosphates |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| В.Г.Беликов "Фармацевтическая химия", учебное пособие, 2007, Москва, "МЕДпресс-информ", стр.27-29. Химическая Энциклопедия под ред. И.Л. Кнунянца, М., из-во Большая Российская Энциклопедия, 1992, т. 3, стр. 302, нуклеотиды, стр. 106-109, "молекула". Рекомендации по межгосударственной стандартизации РМГ 29-2013 ГСИ. Метрология. Основные термины и определения, Москва, Стандартинформ, 2014, стр. 18, п.6.14, https://files.stroyinf.ru/Data2/1/4293772/4293772305.pdf. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tosar et al. | Electrochemical DNA hybridization sensors applied to real and complex biological samples | |
| US5824477A (en) | Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid | |
| US6365400B1 (en) | Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid | |
| US11332786B2 (en) | Sensor and sensing system | |
| US8715932B2 (en) | Nucleic acid sequencing | |
| US10203297B2 (en) | Device and method for detecting redox reactions in solution | |
| Pedrero et al. | Electrochemical genosensors based on PCR strategies for microorganisms detection and quantification | |
| GB2247889A (en) | DNA denaturation by an electric potential | |
| AU2019222685B2 (en) | Labeled nucleotides and uses thereof | |
| Wan et al. | Multiplexed electrochemical DNA sensor for single-nucleotide polymorphism typing by using oligonucleotide-incorporated nonfouling surfaces | |
| RU2782056C2 (en) | Labeled nucleotides and their use | |
| US20140228247A1 (en) | Sequence-specific analysis of nucleic acids | |
| Palchetti et al. | Electrochemical hybridization-based biosensor in environmental monitoring | |
| Kara et al. | Electrochemical Genoassay Design for Allele‐Specific Detection of Toll‐Like Receptor‐2 Gene Polymorphism | |
| Bowater et al. | Sensitive electrochemical assays of DNA structure | |
| NZ760030A (en) | Sensor And Sensing System | |
| BOWATER et al. | Electronic science Sensitive electrochemical assays of DNA structure | |
| Krüger | 2) Patent Application Publication o Pub. No.: US 2014/0228247 A1 |