RU2781831C2 - Phycobiliprotein purification - Google Patents
Phycobiliprotein purification Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781831C2 RU2781831C2 RU2019132193A RU2019132193A RU2781831C2 RU 2781831 C2 RU2781831 C2 RU 2781831C2 RU 2019132193 A RU2019132193 A RU 2019132193A RU 2019132193 A RU2019132193 A RU 2019132193A RU 2781831 C2 RU2781831 C2 RU 2781831C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acidic
- resistant
- apc
- phycocyanin
- acid
- Prior art date
Links
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 17
- 108060006184 phycobiliprotein family Proteins 0.000 title description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 69
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 claims abstract description 42
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000206585 Cyanidium Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241001646653 Galdieria Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000190108 Cyanidioschyzon Species 0.000 claims abstract description 3
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 claims description 60
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 claims description 38
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 38
- 241000883968 Galdieria sulphuraria Species 0.000 claims description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- 241000190106 Cyanidioschyzon merolae Species 0.000 claims description 6
- 241000206584 Cyanidium caldarium Species 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 28
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 13
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 13
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 12
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 6
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 6
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 6
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019749 Dry matter Nutrition 0.000 description 5
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N Tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 5
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 5
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 description 5
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 description 4
- 229940093915 Gynecological Organic acids Drugs 0.000 description 4
- 229940082787 Spirulina Drugs 0.000 description 4
- 229940033123 Tannic Acid Drugs 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 4
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- DOUMFZQKYFQNTF-WUTVXBCWSA-N (R)-rosmarinic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)O)OC(=O)\C=C\C=1C=C(O)C(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C(O)=C1 DOUMFZQKYFQNTF-WUTVXBCWSA-N 0.000 description 2
- PITMOJXAHYPVLG-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxybenzoic acid;N-(4-ethoxyphenyl)acetamide;1,3,7-trimethylpurine-2,6-dione Chemical compound CCOC1=CC=C(NC(C)=O)C=C1.CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O.CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C PITMOJXAHYPVLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940011019 Arthrospira platensis Drugs 0.000 description 2
- 229920001757 Castalin Polymers 0.000 description 2
- PPUHUWSVCUJGTD-UHFFFAOYSA-N Castalin Chemical compound OC1C(CO)OC(=O)C2=CC(O)=C(O)C(O)=C2C2=C(O)C(O)=C(O)C(C3=C(O)C(O)=C4O)=C2C(=O)OC1C1C(O)C4=C3C(=O)O1 PPUHUWSVCUJGTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PPUHUWSVCUJGTD-UTSKMKSGSA-N Castalin Natural products O=C1O[C@H]2[C@H](O)c3c(O)c(O)c(O)c(-c4c(O)c(O)c(O)c5-c6c(O)c(O)c(O)cc6C(=O)O[C@@H](CO)[C@@H](O)[C@H]2OC(=O)c45)c13 PPUHUWSVCUJGTD-UTSKMKSGSA-N 0.000 description 2
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 235000012970 cakes Nutrition 0.000 description 2
- -1 casuariticin Chemical compound 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 2
- 235000021056 liquid food Nutrition 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000021055 solid food Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 2
- 241000620196 Arthrospira maxima Species 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 229920001865 Castalagin Polymers 0.000 description 1
- UDYKDZHZAKSYCO-JLQXGYSZSA-N Castalagin Chemical compound C([C@H]1OC(=O)C2=CC(O)=C(O)C(O)=C2C=2C(O)=C(O)C(O)=C(C=2C(=O)O2)C3=C(O)C(O)=C4O)OC(=O)C5=CC(O)=C(O)C(O)=C5C5=C(O)C(O)=C(O)C=C5C(=O)O[C@H]1[C@H]2[C@@H]1[C@H](O)C4=C3C(=O)O1 UDYKDZHZAKSYCO-JLQXGYSZSA-N 0.000 description 1
- UDYKDZHZAKSYCO-UOYZIOMNSA-N Castalagin Natural products C([C@H]1OC(=O)C2=CC(O)=C(O)C(O)=C2C=2C(O)=C(O)C(O)=C(C=2C(=O)O2)C3=C(O)C(O)=C4O)OC(=O)C5=CC(O)=C(O)C(O)=C5C5=C(O)C(O)=C(O)C=C5C(=O)O[C@H]1[C@H]2[C@H]1[C@@H](O)C4=C3C(=O)O1 UDYKDZHZAKSYCO-UOYZIOMNSA-N 0.000 description 1
- CHBITXAMNKHJCR-JNUHSSLSSA-N Casuariin Chemical compound O1C(=O)C2=CC(O)=C(O)C(O)=C2C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2C(=O)OC[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]1OC(=O)C2=CC(O)=C(O)C(O)=C2C2=C(O)C(O)=C(O)C3=C2C(=O)O[C@H]1[C@@H]3O CHBITXAMNKHJCR-JNUHSSLSSA-N 0.000 description 1
- CHBITXAMNKHJCR-WWPZCJLISA-N Casuariin Natural products O=C1O[C@@H]2[C@@H]([C@@H]3[C@@H](O)COC(=O)c4c(c(O)c(O)c(O)c4)-c4c(O)c(O)c(O)cc4C(=O)O3)OC(=O)c3c(c(O)c(O)c(O)c3)-c3c(O)c(O)c(O)c([C@@H]2O)c13 CHBITXAMNKHJCR-WWPZCJLISA-N 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002707 Digallic acid Polymers 0.000 description 1
- JCGHAEBIBSEQAD-UUUCSUBKSA-N Eugeniin Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)[C@@H]3OC(=O)C4=CC(O)=C(O)C(O)=C4C4=C(O)C(O)=C(O)C=C4C(=O)OC[C@H]3O2)OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)=C1 JCGHAEBIBSEQAD-UUUCSUBKSA-N 0.000 description 1
- 241000778174 Galdieria maxima Species 0.000 description 1
- 241001646655 Galdieria partita Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920001958 Grandinin Polymers 0.000 description 1
- GCEXRPOQEVIITL-XJDSPLDHSA-N Grandinin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)C(CO)OC1(O)[C@@H]1C(C(O)=C(O)C(O)=C2C3=C(O)C(O)=C4O)=C2C(=O)OC1C1C2OC(=O)C5=CC(O)=C(O)C(O)=C5C5=C(O)C(O)=C(O)C=C5C(=O)OCC2OC(=O)C2=CC(O)=C(O)C(O)=C2C4=C3C(=O)O1 GCEXRPOQEVIITL-XJDSPLDHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N Mesotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 229920000864 Punicalin Polymers 0.000 description 1
- SSIRGMIVWUBXFB-FVAJSQOJSA-N Punicalin Chemical compound C([C@H]1O[C@@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1OC(=O)C=1C=C2C(=C(O)C=1O)O)O)O)OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1C1=C(O)C(O)=C(OC3=O)C4=C1C(=O)OC1=C4C3=C2C(O)=C1O SSIRGMIVWUBXFB-FVAJSQOJSA-N 0.000 description 1
- GXGFDWGVOITBNW-WWOWTDEASA-N Punicalin Natural products O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1[C@@H](O)COC(=O)c2c(c(O)c(O)c(O)c2)-c2c(O)c(O)c3OC(=O)c4c(c(O)c(O)c5OC(=O)c2c3-c45)-c2c(O)c(O)c(O)cc2C(=O)O1 GXGFDWGVOITBNW-WWOWTDEASA-N 0.000 description 1
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001285 Quercetin Drugs 0.000 description 1
- 229920002358 Roburin A Polymers 0.000 description 1
- 241000710168 Shallot latent virus Species 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001453296 Synechococcus elongatus Species 0.000 description 1
- 229920001990 Tellimagrandin II Polymers 0.000 description 1
- JCGHAEBIBSEQAD-ANGOHYEVSA-N Tellimagrandin II Natural products O=C(O[C@@H]1[C@@H](OC(=O)c2cc(O)c(O)c(O)c2)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H]1OC(=O)c1cc(O)c(O)c(O)c1)OC(=O)c1c(c(O)c(O)c(O)c1)-c1c(O)c(O)c(O)cc1C(=O)OC2)c1cc(O)c(O)c(O)c1 JCGHAEBIBSEQAD-ANGOHYEVSA-N 0.000 description 1
- 229920000599 Terflavin B Polymers 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Vitamin C Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002535 acidifier Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 230000035425 carbon utilization Effects 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophylls Natural products 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- COVFEVWNJUOYRL-UHFFFAOYSA-N digallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)=C1 COVFEVWNJUOYRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 235000021271 drinking Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229920001968 ellagitannin Polymers 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004634 feeding behavior Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000000576 food coloring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000102 heterotrophic Effects 0.000 description 1
- 238000007603 infrared drying Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 description 1
- 235000011929 mousse Nutrition 0.000 description 1
- 239000000978 natural dye Substances 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N nitric acid Chemical class O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic Effects 0.000 description 1
- 229920002496 poly(ether sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 229930002344 quercetin Natural products 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000011496 sports drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003444 succinic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 229960001367 tartaric acid Drugs 0.000 description 1
- UKIPVDAOZKIZJT-RPMOVZCCSA-N terflavin B Chemical compound C([C@H]1OC([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1OC(=O)C=1C(=C(O)C(O)=C(O)C=1)C=1C=2C(=O)OC=3C(O)=C(O)C=C4C(=O)OC(C=2C4=3)=C(O)C=1O)O)O)OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 UKIPVDAOZKIZJT-RPMOVZCCSA-N 0.000 description 1
- 235000019529 tetraterpenoid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION
Данное изобретение относится к новому способу очистки фикобилипротеинов, в частности, фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, к полученным фикобилипротеинам и к их применению.This invention relates to a new method for the purification of phycobiliproteins, in particular phycobiliproteins resistant to acidic pH values, to the obtained phycobiliproteins and to their use.
ПРЕДЫДУЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Очистка фикобилипротеинов из Galdieria sulphuraria, в частности, фикоцианина С (С-РС), гораздо более сложна, чем из Arthrospira platensis (Spirulina) или других цианобактерий. Это отчасти обусловлено составом клеточной стенки Galdieria sulphuraria, для разрушения которой требуется механическое воздействие (Sorensen et al., 2013). Механический лизис приводит к образованию мицелл, которые только частично удаляются ультрацентрифугированием. Присутствие хлорофилла и растворенных каротиноидов в этих мицеллах способствует увеличению показателей абсорбции при 280 нм (специфичное в отношении белков поглощение в UV (ультрафиолетовой) области), что может объяснять низкую степень чистоты в первичных экстрактах С-РС по сравнению с таковыми из Spirulina (Sorensen et al., 2013). Таким образом, степень чистоты первичного экстракта можно увеличить посредством удаления мицелл и растворимых белков, отличных от фикобилипротеинов.Purification of phycobiliproteins from Galdieria sulphuraria, in particular phycocyanin C (C-PC), is much more difficult than from Arthrospira platensis (Spirulina) or other cyanobacteria. This is partly due to the composition of the cell wall of Galdieria sulphuraria, which requires mechanical action to destroy (Sorensen et al., 2013). Mechanical lysis leads to the formation of micelles, which are only partially removed by ultracentrifugation. The presence of chlorophyll and dissolved carotenoids in these micelles contributes to an increase in absorption values at 280 nm (protein-specific absorption in the UV (ultraviolet) region), which may explain the low purity in the primary extracts of C-PC compared to those from Spirulina (Sorensen et al. al., 2013). Thus, the purity of the primary extract can be increased by removing micelles and soluble proteins other than phycobiliproteins.
Очистка фикобилипротеинов, экстрагированных из Cyanidioschyzon merolae, Cyanidium caldarium, Galdieria sulphuraria и Spirulina путем осаждения сульфатом аммония уже описана в литературе (WO 2016/099261; Eisele et al., 2000; Kao et al. Moon et al., 1975; 2015; Cruz de 
Осуществление других описанных способов очистки, позволяющих достигать степень чистоты, таких как хроматографические способы, является очень дорогостоящим.The implementation of other described methods of purification, allowing to achieve a degree of purity, such as chromatographic methods, is very expensive.
В этой связи, изобретение относится к способу очистки фикобилипротеинов, полученных путем культивирования в биореакторе микроорганизмов, продуцирующих фикобилипротеины, который легко осуществить и который подходит с экономической точки зрения для осуществления в промышленном масштабе.In this regard, the invention relates to a method for purifying phycobiliproteins obtained by culturing phycobiliprotein-producing microorganisms in a bioreactor, which is easy to carry out and economically suitable for industrial scale.
Кроме того, фикобилипротеины, в частности, фикоцианины, представляют собой смесь фикоцианина С и аллофикоцианина. Известные способы очистки не позволяют разделить их промышленно-контролируемым образом. Очистка посредством осаждения сульфатом аммония приводит к неконтролируемому осаждению обоих белков, поэтому получение пигмента со стабильными свойствами может быть затруднительно. Данный способ осаждения также приводит к существенному снижению выхода экстракта (Cruz de
Таким образом, изобретение также относится к получению очищенных фикобилипротеинов, в частности, очищенного фикоцианина, содержащего по существу фикоцианин С или по существу аллофикоцианин, в частности, фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, с контролируемым составом фикоцианинов, где устойчивость к кислым значениям рН не требует добавления стабилизирующих агентов, таких как аскорбиновая кислота (WO 2005/065697) или полифенолы (WO 2015/090697).Thus, the invention also relates to the production of purified phycobiliproteins, in particular purified phycocyanin containing essentially phycocyanin C or essentially allophycocyanin, in particular phycobiliproteins resistant to acidic pH values, with a controlled composition of phycocyanins, where resistance to acidic pH values is not requires the addition of stabilizing agents such as ascorbic acid (WO 2005/065697) or polyphenols (WO 2015/090697).
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Таким образом, изобретение относится к способу очистки фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, из первичного экстракта фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, отличающемуся тем, что он включает стадииThus, the invention relates to a process for purifying acid pH tolerant phycobiliproteins from a primary extract of acid pH tolerant phycobiliproteins, characterized in that it comprises the steps
а) доведения рН первичного экстракта фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, до рН ниже 6, чтобы осадить органические вещества, отличные от фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН,a) adjusting the pH of the primary extract of the acid pH tolerant phycobiliproteins to a pH below 6 to precipitate organic substances other than the acid pH tolerant phycobiliproteins,
б) сбора надосадочной жидкости, содержащей фикобилипротеины, устойчивые к кислым значениям рН, иb) collecting a supernatant containing phycobiliproteins resistant to acidic pH values, and
в) выделения фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, из надосадочной жидкости.c) isolation of acid-resistant phycobiliproteins from the supernatant.
Изобретение также относится к фикобилипротеинам, устойчивым к кислым значениям рН, полученным указанным способом, и, в частности, к фикоцианинам, устойчивым к кислым значениям рН, содержащим смесь фикоцианина С и аллофикоцианина, более конкретно, где молярное соотношение фикоцианина С и аллофикоцианина составляет по меньшей мере 2.The invention also relates to phycobiliproteins resistant to acidic pH values obtained by said method, and in particular to phycocyanins resistant to acidic pH values containing a mixture of phycocyanin C and allophycocyanin, more specifically, where the molar ratio of phycocyanin C and allophycocyanin is at least measure 2.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
Фиг. 1. Увеличение индекса чистоты первичного экстракта из лизата свежих клеток в зависимости от рН.Fig. 1. Increase in the purity index of the primary extract from fresh cell lysate depending on pH.
Фиг. 2. Определение концентрации С-РС и АРС (аллофикоцианин) в различных первичных экстрактах, полученных путем центрифугирования лизата свежих клеток, при различных значениях рН. Концентрации АРС (мг/мл) показаны серым, а концентрации С-РС (мг/мл) показаны черным.Fig. 2. Determination of the concentration of C-PC and APC (allophycocyanin) in various primary extracts obtained by centrifugation of fresh cell lysate at various pH values. APC concentrations (mg/ml) are shown in gray and C-PC concentrations (mg/ml) are shown in black.
Фиг. 3. Определение концентрации С-РС и АРС в осадках, полученных путем центрифугирования лизата свежих клеток, при различных значениях рН. Концентрации АРС (мг/г DM (сухого вещества)) показаны серым, а концентрации С-РС (мг/г DM) показаны черным.Fig. 3. Determination of the concentration of C-PC and APC in sediments obtained by centrifugation of fresh cell lysate at various pH values. APC concentrations (mg/g DM (dry matter)) are shown in gray and C-PC concentrations (mg/g DM) are shown in black.
Фиг. 4. Увеличение индекса чистоты первичного экстракта из лизата лиофилизированных и регидратированных клеток в зависимости от рН.Fig. 4. Increase in the purity index of the primary extract from the lyophilized and rehydrated cell lysate depending on pH.
Фиг. 5. Определение концентрации С-РС и АРС в различных первичных экстрактах, полученных путем центрифугирования лизата лиофилизированных и регидратированных клеток, при различных значениях рН. Концентрации АРС (мг/мл) показаны серым, а концентрации С-РС (мг/мл) показаны черным.Fig. 5. Determination of the concentration of C-PC and APC in various primary extracts obtained by centrifugation of lyophilized and rehydrated cell lysate at various pH values. APC concentrations (mg/ml) are shown in gray and C-PC concentrations (mg/ml) are shown in black.
Фиг. 6. Очистка и концентрирование С-РС посредством тангенциальной фильтрации. Первичный экстракт, предварительно очищенный путем осаждения при кислых значениях рН, фильтровали с применением половолоконной системы.Fig. 6. Purification and concentration of C-PC by tangential filtration. The primary extract, previously purified by precipitation at acidic pH values, was filtered using a hollow fiber system.
Фиг. 7. Увеличение концентрации С-РС в ретентате в ходе фильтрации с применением половолоконных фильтров.Fig. 7. Increasing the concentration of C-PC in the retentate during filtration using hollow fiber filters.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Таким образом, изобретение относится к способу очистки фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, из первичного экстракта фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН.The invention thus relates to a process for purifying acid pH tolerant phycobiliproteins from an acid pH tolerant phycobiliprotein primary extract.
Первичный экстракт фикобилипротеинов обычно получают из клеток микроорганизмов, выращиваемых промышленным способом в биореакторах большой емкости, предпочтительно таким образом, чтобы получить ферментационный бульон с высокой плотностью микроорганизмов, продуцирующих фикобилипротеины (высокую плотность обычно определяют как более 50 г сухого вещества (DM) на литр ферментационного бульона, предпочтительно более 100 г/л). Указанные способы культивирования известны специалистам в области техники и могут осуществляться при автотрофии, гетеротрофии или миксотрофии, в частности, как описано в заявках WO 2017/050917, WO 2017/050918 и PCT/EP2016/079325, поданной 30 ноября 2016. Фикобилипротеины, продуцированные культивируемыми микроорганизмами, должны высвобождаться после лизиса клеток. Действительно, клетки микроорганизмов содержат большие количества фикобилипротеинов (Moon et al., 2015, Sorensen et al., 2013, Eriksen 2008). Следовательно, осуществление способа по изобретению требует прежде всего получения водного экстракта из ферментационного бульона.The primary extract of phycobiliproteins is usually obtained from cells of microorganisms grown commercially in large capacity bioreactors, preferably in such a way as to obtain a fermentation broth with a high density of microorganisms producing phycobiliproteins (high density is usually defined as more than 50 g of dry matter (DM) per liter of fermentation broth , preferably more than 100 g/l). These cultivation methods are known to those skilled in the art and can be carried out in autotrophy, heterotrophy or mixotrophy, in particular as described in WO 2017/050917, WO 2017/050918 and PCT/EP2016/079325, filed November 30, 2016. Phycobiliproteins produced by cultivated microorganisms should be released after cell lysis. Indeed, microbial cells contain large amounts of phycobiliproteins (Moon et al., 2015, Sorensen et al., 2013, Eriksen 2008). Therefore, the implementation of the method according to the invention requires first of all obtaining an aqueous extract from the fermentation broth.
Водный экстракт можно получать непосредственно из ферментационного бульона после его сбора из реактора в конце ферментации, возможно с добавлением соответствующего количества воды.An aqueous extract can be obtained directly from the fermentation broth after it has been collected from the reactor at the end of the fermentation, optionally with the addition of an appropriate amount of water.
Его можно получать из свежих клеток, отделенных от ферментационного бульона любым способом разделения, хорошо известным специалистам в области техники. Его также можно получать из клеток, которые были лиофилизированы или высушены для хранения.It can be obtained from fresh cells separated from the fermentation broth by any separation method well known to those skilled in the art. It can also be obtained from cells that have been lyophilized or dried for storage.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения, водный экстракт получают из свежих клеток, отделенных от ферментационного бульона после культивирования.According to a preferred embodiment of the invention, the aqueous extract is obtained from fresh cells separated from the fermentation broth after cultivation.
Лизис клеток можно осуществлять любым способом, известным специалисту в области техники. Его можно осуществлять, когда клетки суспендированы в воде, ферментационном бульоне или восстановленной суспензии.Cell lysis can be carried out by any method known to the person skilled in the art. It can be carried out when the cells are suspended in water, fermentation broth or reconstituted suspension.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения, лизис клеток осуществляют на клетках, отделенных от ферментационного бульона, перед их ресуспендированием.According to a preferred embodiment of the invention, cell lysis is carried out on cells separated from the fermentation broth before they are resuspended.
Предпочтительно, водный экстракт получают из суспензии, содержащей лизированные клетки, отделяя твердые вещества, любым способом разделения, известным специалистам в области техники, для отделения твердых остатков клеточного лизиса, в частности, путем фильтрования.Preferably, the aqueous extract is obtained from the suspension containing the lysed cells, separating the solids by any separation method known to those skilled in the art to separate the solid residues of cell lysis, in particular by filtration.
Это приводит к получению водного экстракта, обозначаемого «первичным экстрактом фикобилипротеинов» или «первичным экстрактом», который содержит, помимо желаемых фикобилипротеинов, в частности, устойчивых к кислым значениям рН фикобилипротеинов, другие органические вещества, такие как мицеллы и другие водорастворимые белки.This results in an aqueous extract, referred to as "primary phycobiliprotein extract" or "primary extract", which contains, in addition to the desired phycobiliproteins, in particular acid pH-resistant phycobiliproteins, other organic substances such as micelles and other water-soluble proteins.
Первичный экстракт фикобилипротеинов может быть получен из свежих лизированных клеток (непосредственно в ферментационном бульоне или после отделения от ферментационного бульона) или из лиофилизированных или высушенных клеток, где лизис клеток происходит до или после лиофилизации или высушивания.The primary extract of phycobiliproteins can be obtained from fresh lysed cells (directly in the fermentation broth or after separation from the fermentation broth) or from lyophilized or dried cells, where cell lysis occurs before or after lyophilization or drying.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения, первичный экстракт получают из свежих клеток.According to a preferred embodiment of the invention, the primary extract is obtained from fresh cells.
Способ очистки по изобретению заключается в отделении фикобилипротеинов, в частности, устойчивых к кислым значениям рН фикобилипротеинов, от других органических веществ, таких как мицеллы и другие водорастворимые белки.The purification method according to the invention consists in separating phycobiliproteins, in particular acid pH-resistant phycobiliproteins, from other organic substances such as micelles and other water-soluble proteins.
Микроорганизмы, культивируемые для получения фикобилипротеинов, хорошо известны специалистам в области техники, в частности, выбраны из группы Cyanophyceae, как, например, Arthrospira platensis (Spirulina), Spirulina maxima, Synechococcus elongatus, или группы Cyanidiophyceae, как, например, Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldiarium, Cyanidioschyzon merolae.Microorganisms cultivated for the production of phycobiliproteins are well known to those skilled in the art, in particular selected from the Cyanophyceae group, such as Arthrospira platensis (Spirulina), Spirulina maxima, Synechococcus elongatus, or the Cyanidiophyceae group, such as Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldiarium, Cyanidioschyzon merolae.
Предпочтительно, фикобилипротеины представляют собой устойчивые к кислым значениям рН фикоцианины. Устойчивые к кислым значениям рН фикобилипротеины или устойчивые к кислым значениям рН фикоцианины определяют как фикобилипротеины, которые устойчивы к осаждению при кислых значениях рН. Согласно изобретению, кислые значения рН означают рН ниже 7, предпочтительно 6 или менее. Предпочтительно, устойчивые к кислым значениям рН фикобилипротеины не осаждаются в водном растворе при значениях рН ниже 6. Их также можно описать как устойчивые или стабильные при кислых значениях рН.Preferably, the phycobiliproteins are acid pH resistant phycocyanins. Acid pH resistant phycobiliproteins or acid pH resistant phycocyanins are defined as phycobiliproteins that are resistant to precipitation at acidic pH values. According to the invention, acidic pH values mean a pH below 7, preferably 6 or less. Preferably, acid pH-stable phycobiliproteins do not precipitate in aqueous solution at pH values below 6. They can also be described as acid-pH stable or stable.
Конечно, очищенные фикобилипротеины по изобретению будут более или менее стабильны в зависимости от рассматриваемых значений рН. Некоторые будут стабильны при значениях рН около 6, другие будут стабильны при значениях рН существенно ниже 6. Следовательно, устойчивые к кислым значениям рН фикобилипротеины также определяют как смесь фикобилипротеинов, большинство которых не осаждается при рН ниже 7, предпочтительно, ниже 6 или менее.Of course, the purified phycobiliproteins of the invention will be more or less stable depending on the pH values considered. Some will be stable at pH values around 6, others will be stable at pH values well below 6. Therefore, acid-resistant phycobiliproteins are also defined as a mixture of phycobiliproteins, most of which do not precipitate below pH 7, preferably below 6 or less.
Предпочтительно, изобретение относится к фикобилипротеинам, стабильным при рН менее 5, предпочтительно менее или равном 4, более предпочтительно в диапазоне от 4 до 2, еще более предпочтительно менее или равном 3,5.Preferably, the invention relates to phycobiliproteins stable at a pH less than 5, preferably less than or equal to 4, more preferably in the range of 4 to 2, even more preferably less than or equal to 3.5.
Такие устойчивые к кислым значениям рН фикоцианины известны специалистам в области техники, в частности, описаны в заявке WO 2016/099261 или заявке WO 2017/050918. В частности, это фикоцианины, продуцируемые штаммами микроводорослей родов Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria, в частности, выбранных из видов Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita, Galdieria sulphuraria, в частности, штаммами Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium и Cyanidioschyzon merolae.Such acid pH-resistant phycocyanins are known to those skilled in the art, in particular described in WO 2016/099261 or WO 2017/050918. In particular, these are phycocyanins produced by strains of microalgae of the genera Cyanidioschyzon, Cyanidium or Galdieria, in particular, selected from the species Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium daedalum, Galdieria maxima, , Galdieria partita, Galdieria sulphuraria, in particular, strains of Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium and Cyanidioschyzon merolae.
Указанные фикоцианины представляют собой смесь фикоцианина С (С-РС) и аллофикоцианина (АРС).These phycocyanins are a mixture of phycocyanin C (C-PC) and allophycocyanin (APC).
Предпочтительно, апопротеин С-РС содержит белок SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 2 или их вариант. В частности, апопротеин α-субъединицы С-РС содержит белок с SEQ ID NO 1, а апопротеин β-субъединицы С-РС содержит белок с SEQ ID NO 2 или их варианты.Preferably, the C-PC apoprotein contains the protein of SEQ ID NO 1 or
SEQ ID 1: MKTPITEAIA AADNQGRFLS NTELQAVNGR YQRAAASLEA ARSLTSNAQR LINGAAQAVY SKFPYTSQMP GPQYASSAVG KAKCARDIGY YLRMVTYCLV VGGTGPMDEY LIAGLEEINR TFDLSPSWYV EALNYVKSNH GLSGQAANEA NTYIDYAINA LSSEQ ID 1: MKTPITEAIA AADNQGRFLS NTELQAVNGR YQRAAASLEA ARSLTSNAQR LINGAAQAVY SKFPYTSQMP GPQYASSAVG KAKCARDIGY YLRMVTYCLV VGGTGPMDEY LIAGLEEINR TFDLPSSWYV EALNYVKSNH GLSGQAANEA NTYIDYAINA LS
SEQ ID 2: MLDAFAKVVA QADARGEFLS NTQLDALSKM VSEGNKRLDV VNRITSNASA IVTNAARALF SEQPQLIQPG GNAYTNRRMA ACLRDMEIIL RYVSYAIIAG DSSVLDDRCL NGLRETYQAL GVPGASVAVG VEKMKDSAIA IANDPSGITT GDCSALMAEV GTYFDRAATA VQSEQ ID 2: MLDAFAKVVA QADARGEFLS NTQLDALSKM VSEGNKRLDV VNRITSNASA IVTNAARALF SEQPQLIQPG GNAYTNRRMA ACLRDMEIIL RYVSYAIIAG DSSVLDDRCL NGLRETYQAL GVPGASVAVG VEKMKDSAIA IANDPSGITT GDCSALMAEV GTYFDRAATA VQ
Также, предпочтительно, α-субъединица указанного АРС содержит SEQ ID NO 3 или ее варианты, а апопротеин β-субъединицы указанного АРС содержит SEQ ID NO 4 или ее варианты.Also preferably, the α-subunit of said APC contains SEQ ID NO 3 or variants thereof, and the apoprotein of the β-subunit of said APC contains
SEQ ID 3: MSLISQIINT ADEELRYPNG GELSTLIYFF NTANTRINII NKLKEREKDI IQNASKKLFQ LHPEYVSSGG NASGPKQRAL CLRDYGWYLR LVTYGILAGD ITPIEKIGII GVKDMYNSLG VPIIGMYDAI KCLKEASINI FELSEEKDLI IPYFDYLSNA ILSSEQ ID 3: MSLISQIINT ADEELRYPNG GELSTLIYFF NTANTRINII NKLKEREKDI IQNASKKLFQ LHPEYVSSGG NASGPKQRAL CLRDYGWYLR LVTYGILAGD ITPIEKIGII GVKDMYNSLG VPIIGMYDAI KCLKEASINI FELSEEKDLI IPYFDYLSNA ILS
SEQ ID 4: MSIVTKSIVN ADAEARYLSP GELDRIKSFV LSGQRRLRIA QILTDNRERI VKQAGQQLFQ QRPDIVSPGG NAYGEEMTAT CLRDLDYYLR LVTYGVVAGD ISPIEEIGLE DFMQDAITAV INTADVQGKY LDNSSIEKLK GYFQTGELRV RAAATIAANA AGIIKDAVAK SLLYSDITRP GGNMYTTRRY AACIRDLDYY LRYATYSMLA GDPSILDERV LNGLKETYNS LGVPIGATIQ SIQAMKEVTS SLVSEQ ID 4: MSIVTKSIVN ADAEARYLSP GELDRIKSFV LSGQRRLRIA QILTDNRERI VKQAGQQLFQ QRPDIVSPGG NAYGEEMTAT CLRDLDYYLR LVTYGVVAGD ISPIEEIGLE DFMQDAITAV INTADVQGKY LDNSSIEKLK GYFQTGELRV RAAATIAANA AGIIKDAVAK SLLYSDITRP GGNMYTTRRY AACIRDLDYY LRYATYSMLA GDPSILDERV LNGLKETYNS LGVPIGATIQ SIQAMKEVTS SLV
Апопротеины С-РС и АРС из одинакового источника фикоцианинов обычно имеют различные изоэлектрические точки. За счет снижения рН можно по меньшей мере частично отделять С-РС от АРС.Apoproteins C-PC and APC from the same source of phycocyanins usually have different isoelectric points. By lowering the pH, C-PC can be at least partially separated from APC.
Авторы изобретения обнаружили, что чем больше понижали рН первичного экстракта, тем более чистый С-РС получали.The inventors found that the more the pH of the primary extract was lowered, the more pure C-PC was obtained.
Предпочтительно, когда фикобилипротеин представляет собой устойчивый к кислым значениям рН фикоцианин, снижение рН ниже изоэлектрической точки АРС приводит к получению фикоцианина, содержащего смесь С-РС/АРС с молярным соотношением по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15.Preferably, when the phycobiliprotein is an acid pH-stable phycocyanin, lowering the pH below the APC isoelectric point results in a phycocyanin containing a mixture of C-PC/APC with a molar ratio of at least 5, preferably at least 10, more preferably at least fifteen.
Предпочтительно, рН первичного экстракта на стадии (а) доводят до рН ниже 5. Таким образом, можно получить устойчивый к кислым значениям рН фикоцианин, содержащий менее 5 мол. % АРС, предпочтительно менее 1%, более предпочтительно менее 0,1% АРС, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме АРС и С-РС.Preferably, the pH of the primary extract in step (a) is adjusted to a pH below 5. In this way, acid-resistant phycocyanin containing less than 5 mol. % APC, preferably less than 1%, more preferably less than 0.1% APC, where the percentages are expressed in relation to the total amount of APC and C-PC.
На стадии (а) доведение рН осуществляют путем добавления сильной или слабой неорганической или органической кислоты в твердой форме или в форме раствора, количество добавляемой кислоты определяется рН первичного экстракта, подлежащего обработке, и значением рН, которое стремится получить специалист в области техники. Среди неорганических кислот, хорошо известных специалистам в области техники, следует отдельно упомянуть соляную кислоту и фосфорную кислоту. Среди органических кислот, хорошо известных специалистам в области техники, следует отдельно упомянуть уксусную кислоту, лимонную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, предпочтительно лимонную кислоту. Следует также упомянуть кислые полифенолы, такие как розмариновая кислота, дубильная кислота, дигалловая кислота, дубодубильная кислота, галлодубильная кислота, кислые таннины, такие как кверцетин, эллагитаннины, касталагин, касталин, казуаритицин, грандинин, пуникалигин, пуникалин, робурин А, теллимаграндин II, терфлавин В, вескалигин, пендункулагин, казуариин, кастлин, вескалин, предпочтительно дубильную кислоту. Предпочтительно, используемые кислоты представляют собой кислоты, разрешенные для применения в пищевых продуктах, в частности, фосфорную кислоту, лимонную кислоту или дубильную кислоту.In step (a), the pH adjustment is carried out by adding a strong or weak inorganic or organic acid in solid form or in solution form, the amount of added acid being determined by the pH of the primary extract to be treated and the pH value that the person skilled in the art seeks to achieve. Among the inorganic acids well known to those skilled in the art, mention should be made separately of hydrochloric acid and phosphoric acid. Among the organic acids well known to those skilled in the art, mention should be made of acetic acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, preferably citric acid. Mention should also be made of acidic polyphenols such as rosmarinic acid, tannic acid, digallic acid, tannic acid, gallotannic acid, acidic tannins such as quercetin, ellagitannins, castalagin, castalin, casuariticin, grandinin, punicaligin, punicalin, roburin A, tellimagrandin II, terflavin B, vescaligin, penduculagin, casuariin, castlin, vescalin, preferably tannic acid. Preferably, the acids used are food approved acids, in particular phosphoric acid, citric acid or tannic acid.
Для стадии (б) сбора надосадочной жидкости, содержащей устойчивые к кислым значениям рН фикобилипротеины, можно использовать любой известный специалистам в области техники способ разделения, в частности, тангенциальную фильтрацию на керамических мембранах или органических мембранах, таких как полиэфирсульфоновые половолоконные. Можно выбрать порог отсечения этих фильтров для отделения молекул, имеющих большую или меньшую молекулярную массу по сравнению с целевыми фикобилипротеинами.For step (b) collecting the supernatant containing acid pH-stable phycobiliproteins, any separation method known to those skilled in the art can be used, in particular tangential filtration on ceramic membranes or organic membranes such as polyethersulfone hollow fiber. You can choose the cut-off threshold of these filters to separate molecules having a higher or lower molecular weight compared to the target phycobiliproteins.
Согласно конкретному воплощению изобретения, разделение на стадии (б) осуществляют посредством тангенциальной фильтрации. На данной стадии концентрируют и удаляют некоторые белки, отличные от фикобилипротеинов, таким образом увеличивая степень чистоты конечного продукта.According to a specific embodiment of the invention, the separation in step (b) is carried out by tangential filtration. This step concentrates and removes some proteins other than phycobiliproteins, thus increasing the purity of the final product.
Стадию в) высушивания/дегидратации устойчивых к кислым значениям рН фикобилипротеинов из надосадочной жидкости осуществляют любым способом удаления растворителя, в данном случае воды, например, путем выпаривания при атмосферном давлении или под вакуумом. Отдельно следует упомянуть распыление, лиофилизацию, цеодратацию, сушку инфракрасным излучением или сушку по технологии «окна преломления».Step c) of drying/dehydrating the acid-resistant phycobiliproteins from the supernatant is carried out by any method of removing the solvent, in this case water, for example by evaporation at atmospheric pressure or under vacuum. Separate mention should be made of spraying, lyophilization, zeodration, infrared drying or refraction window drying.
В случае выпаривания путем нагревания специалисту в области техники следует позаботиться о том, чтобы не применять чрезмерно высоких температур, которые могут привести к денатурации фикобилипротеинов.In the case of evaporation by heating, one of ordinary skill in the art should take care not to apply excessively high temperatures which could lead to denaturation of the phycobiliproteins.
После сбора надосадочной жидкости на стадии (б) возможно повторное использование фикобилипротеинов, содержащихся в преципитате. Для этого остаточные фикобилипротеины растворяют в водном растворе с кислым значением рН, составляющими приблизительно 6 или менее, при которых примеси остаются нерастворимыми, тогда как фикобилипротеины являются растворимыми.After collecting the supernatant in step (b), it is possible to reuse the phycobiliproteins contained in the precipitate. To do this, the residual phycobiliproteins are dissolved in an aqueous solution with an acidic pH of about 6 or less, at which impurities remain insoluble, while the phycobiliproteins are soluble.
Эти остаточные фикобилипротеины затем отделяют от примесей и выделяют, повторяя стадии (б) и (в) способа. Это итеративный процесс, который можно повторять столько раз, сколько потребуется. Когда условия, используемые в способе по изобретению, позволяют предпочтительно очищать С-РС, остаточные фикобилипротеины представляют собой смесь С-РС/АРС, обогащенную АРС.These residual phycobiliproteins are then separated from impurities and isolated by repeating steps (b) and (c) of the method. This is an iterative process that can be repeated as many times as needed. When the conditions used in the process of the invention allow C-PC to be preferentially purified, the residual phycobiliproteins are a mixture of C-PC/APC enriched in APC.
При повторном использовании преципитата получают фикобилипротеины, содержащие смесь С-РС/АРС в молярном соотношении менее 5, в частности менее 4, предпочтительно в диапазоне от 3 до 0,1.When the precipitate is reused, phycobiliproteins are obtained containing a mixture of C-PC/APC in a molar ratio of less than 5, in particular less than 4, preferably in the range from 3 to 0.1.
Повторяя стадии (а)-(в) описанного выше способа, возможно посредством итеративного процесса извлекать из преципитата С-РС, который можно добавлять к ранее полученным фракциям для их обогащения, а также обогащать остаточную смесь фикобилипротеинов АРС, получая соотношение АРС/С-РС по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15.By repeating steps (a)-(c) of the method described above, it is possible, by an iterative process, to recover from the C-PC precipitate, which can be added to the previously obtained fractions to enrich them, and also to enrich the residual mixture of APC phycobiliproteins, obtaining the ratio of APC / C-PC at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15.
Таким образом, можно получить смесь АРС, содержащую менее 5 мол. % СРС, предпочтительно менее 1%, более предпочтительно менее 0,1% СРС, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме АРС и С-РС.Thus, it is possible to obtain a mixture of APC containing less than 5 mol. % CPC, preferably less than 1%, more preferably less than 0.1% CPC, where the percentages are expressed in relation to the total amount of APC and CPC.
Указанные АРС, выделенные из преципитата, могут быть затем очищены методиками препаративной хроматографии, хорошо известными специалистам в области техники, для получения аллофикоцианинов, которые можно применять, например, в области медицинской визуализации, благодаря их флуоресцентным свойствам.Said APCs isolated from the precipitate can then be purified by preparative chromatography techniques well known to those skilled in the art to obtain allophycocyanins which can be used, for example, in the field of medical imaging due to their fluorescent properties.
Изобретение также относится к устойчивым к кислым значениям рН фикобилипротеинам, в частности, фикоцианинам, которые получают указанным способом очистки.The invention also relates to acid pH-resistant phycobiliproteins, in particular phycocyanins, which are obtained by said purification process.
Изобретение также относится к очищенным устойчивым к кислым значениям рН фикоцианинам, содержащим смесь С-РС/АРС с молярным соотношением по меньшей мере 2.The invention also relates to purified acid pH resistant phycocyanins containing a mixture of C-PC/APC with a molar ratio of at least 2.
В частности, изобретение относится к устойчивому к кислым значениям рН фикоцианину, содержащему по меньше 95 мол. % С-РС и менее 5 мол. % АРС, предпочтительно по меньшей мере 99 мол. % С-РС и менее 1 мол. % АРС, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме АРС и С-РС.In particular, the invention relates to acid-resistant phycocyanin containing less than 95 mol. % C-RS and less than 5 mol. % APC, preferably at least 99 mol. % C-RS and less than 1 mol. % APC, where the percentages are expressed in relation to the total amount of APC and C-PC.
Указанные С-РС известны специалистам в области техники и, в частности, охарактеризованы выше, в частности, те из них, у которых α-субъединица С-РС содержит белок с SEQ ID NO 1, а апопротеин β-субъединицы С-РС содержит белок с SEQ ID NO 2 или их варианты.These C-PCs are known to those skilled in the art and are specifically described above, in particular those in which the α-subunit of C-PC contains the protein of SEQ ID NO 1 and the apoprotein of the β-subunit of C-PC contains the protein with
Предпочтительно, варианты по изобретению имеют идентичность последовательности по меньшей мере 83% для α-субъединиц С-РС и по меньшей мере 82% для β-субъединиц С-РС.Preferably, variants of the invention have at least 83% sequence identity for C-PC α-subunits and at least 82% for C-PC β-subunits.
Предпочтительно, варианты по изобретению имеют идентичность по меньшей мере 90% для субъединиц β (SEQ ID NO 1) и β (SEQ ID NO 2).Preferably, the variants of the invention have at least 90% identity for subunits β (SEQ ID NO 1) and β (SEQ ID NO 2).
Изобретение также относится к очищенному фикоцианину, обогащенному АРС, который можно получить способом по изобретению.The invention also relates to purified APC-enriched phycocyanin, which can be obtained by the process of the invention.
В частности, изобретение относится к очищенному фикоцианину, который содержит смесь, обогащенную АРС, где молярное соотношение С-РС/АРС составляет менее 5, в частности, 4, предпочтительно в диапазоне от 3 до 0,1.In particular, the invention relates to purified phycocyanin which contains an APC-enriched mixture wherein the C-PC/APC molar ratio is less than 5, in particular 4, preferably in the range of 3 to 0.1.
Согласно конкретному воплощению изобретения, смесь, обогащенная АРС, имеет соотношение АРС/С-РС по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15.According to a specific embodiment of the invention, the mixture enriched in APC has an APC/C-PC ratio of at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15.
Согласно более конкретному воплощению изобретения, фикоцианин по существу состоит из АРС, при этом по меньшей мере 95 мол. % составляет АРС и менее 5 мол. % составляет С-РС, предпочтительно по меньшей мере 99 мол. % АРС и менее 1 мол. % С-РС, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме АРС и С-РС.According to a more specific embodiment of the invention, phycocyanin essentially consists of APC, with at least 95 mol. % is APC and less than 5 mol. % is C-PC, preferably at least 99 mol. % APC and less than 1 mol. % C-PC, where the percentages are expressed in relation to the total amount of APC and C-PC.
Указанные АРС известны специалистам в области техники и, в частности, охарактеризованы выше, в частности, те из них, у которых α-субъединица указанного АРС содержит SEQ ID NO 3 или ее варианты, а апопротеин β-субъединицы указанного АРС содержит SEQ ID NO 4 или ее варианты.Said APCs are known to those skilled in the art and are specifically described above, in particular those in which the α-subunit of said APC contains SEQ ID NO 3 or variants thereof and the apoprotein of the β-subunit of said APC contains
Предпочтительно, варианты по изобретению имеют идентичность последовательности по меньшей мере 83% для α-субъединиц АРС и по меньшей мере 82% для β-субъединиц АРС.Preferably, variants of the invention have at least 83% sequence identity for APC α-subunits and at least 82% for APC β-subunits.
Специалисту в области техники известно, как определять идентичность белковых последовательностей с применением существующих способов, в частности, программы BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).One skilled in the art will know how to determine protein sequence identity using existing methods, in particular the BLASTP program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Аналогичным образом, специалисту в области техники известно, как идентифицировать варианты указанных последовательностей и верифицировать, что они сохраняют такие же структурные свойства, простым исследованием стабильности при кислых значениях рН, например, проводя такое исследование, как описанное в Примере 3 заявки WO 2017/050918.Similarly, one skilled in the art would know how to identify variants of said sequences and verify that they retain the same structural properties by a simple stability study at acidic pH values, for example by conducting such a study as described in Example 3 of WO 2017/050918.
Специалистам в области техники известно, что полипептид может быть модифицирован путем замены, вставки и/или делеции по меньшей мере одной аминокислоты без существенной модификации его функции.Those skilled in the art will recognize that a polypeptide can be modified by substitution, insertion and/or deletion of at least one amino acid without substantially modifying its function.
Например, замена аминокислоты в заданном положении на другую химически эквивалентную аминокислоту представляет собой известный пример вариации последовательности, которая не влияет существенным образом на свойства белка.For example, substitution of an amino acid at a given position for another chemically equivalent amino acid is a well-known example of sequence variation that does not significantly affect the properties of the protein.
Такие «консервативные» замены можно охарактеризовать как замены внутри следующих групп аминокислот:Such "conservative" substitutions can be characterized as substitutions within the following groups of amino acids:
- Ala, Ser, Thr, Pro, Gly- Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
- Asp, Asn, Glu, Gln- Asp, Asn, Glu, Gln
- His, Arg, Lys- His, Arg, Lys
- Met, Leu, Ile, Val, Cys и- Met, Leu, Ile, Val, Cys and
- Phe, Tyr, Trp.- Phe, Tyr, Trp.
Таким образом, варианты апопротеинов фикоцианинов и/или аллофикоцианинов по изобретению могут содержать от 1 до 30 аминокислот, отличных по числу по сравнению с соответствующей так называемой референсной последовательностью, в частности, в отношении α и/или β-субъединиц фикоцианина, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и имеет проценты гомологии/идентичности, указанные выше.Thus, the phycocyanin and/or allophycocyanin apoprotein variants of the invention may contain from 1 to 30 amino acids different in number from the corresponding so-called reference sequence, in particular with respect to the α and/or β subunits of phycocyanin, provided that the resulting variant retains the properties of the reference protein and has the homology/identity percentages indicated above.
Более конкретно, согласно изобретению,More specifically, according to the invention,
- варианты апопротеинов α-субъединицы фикоцианинов, которые можно применять в кислотных композициях по изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут содержать от 1 до 27 аминокислот, отличающихся от соответствующей так называемой референсной последовательности, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше;- apoprotein variants of the α-subunit of phycocyanins that can be used in the acidic compositions of the invention, resulting from substitutions, insertions and/or deletions, may contain from 1 to 27 amino acids different from the corresponding so-called reference sequence, provided that the resulting variant retains the properties of the reference protein and the percent identity indicated above;
- варианты апопротеинов β-субъединицы фикоцианинов, которые можно применять в кислотных композициях по изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут содержать от 1 до 30 аминокислот, отличающихся от соответствующей так называемой референсной последовательности, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше;- apoprotein variants of the β-subunit of phycocyanins that can be used in the acidic compositions of the invention, resulting from substitutions, insertions and/or deletions, may contain from 1 to 30 amino acids different from the corresponding so-called reference sequence, provided that the resulting variant retains the properties of the reference protein and the percent identity indicated above;
- варианты апопротеинов α-субъединицы аллофикоцианинов, которые можно применять в кислотных композициях по изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут содержать от 1 до 24 аминокислот, отличающихся от соответствующей так называемой референсной последовательности, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше;- apoprotein variants of the α-subunit of allophycocyanins that can be used in the acidic compositions of the invention, resulting from substitutions, insertions and/or deletions, may contain from 1 to 24 amino acids different from the corresponding so-called reference sequence, provided that the resulting variant retains the properties of the reference protein and the percent identity indicated above;
- варианты апопротеинов β-субъединицы аллофикоцианинов, которые можно применять в кислотных композициях по изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут содержать от 1 до 20 аминокислот, отличающихся от соответствующей так называемой референсной последовательности, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше.- apoprotein variants of the β-subunit of allophycocyanins that can be used in the acidic compositions of the invention, resulting from substitutions, insertions and/or deletions, may contain from 1 to 20 amino acids different from the corresponding so-called reference sequence, provided that the resulting variant retains the properties of the reference protein and the percent identity indicated above.
В частности, согласно изобретению, кокой бы ни была референсная последовательность (α и/или β-субъединицы фикоцианина и/или α и/или β-субъединицы аллофикоцианина), варианты указанных субъединиц могут предпочтительно содержать от 1 до 15 отличающихся аминокислот, предпочтительно от 1 до 10 отличающихся аминокислот, в частности 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6 или 7, или 8, или 9 отличающихся аминокислот по сравнению с соответствующей так называемой референсной последовательностью, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше.In particular, according to the invention, whatever the reference sequence (α and/or β subunits of phycocyanin and/or α and/or β subunits of allophycocyanin), variants of these subunits may preferably contain from 1 to 15 different amino acids, preferably from 1 up to 10 different amino acids, in particular 1 or 2 or 3 or 4 or 5 or 6 or 7 or 8 or 9 different amino acids compared to the corresponding so-called reference sequence, provided that the resulting variant retains the properties reference protein and percent identity as above.
Предпочтительно, изобретение относится к С-РС, где белок субъединицы альфа состоит из белка с SEQ ID 1, а белок субъединицы бета состоит из белка с SEQ ID 2.Preferably, the invention relates to C-PC, where the alpha subunit protein consists of the protein of SEQ ID 1 and the beta subunit protein consists of the protein of
Согласно другому предпочтительному воплощению, изобретение относится к АРС, где белок субъединицы альфа состоит из белка с SEQ ID NO 3, а белок субъединицы бета состоит из белка с SEQ ID NO 4.According to another preferred embodiment, the invention relates to APC, where the alpha subunit protein consists of the protein of SEQ ID NO 3 and the beta subunit protein consists of the protein of
Фикобилипротеины представляют собой естественные красители, в основном применяющиеся для окрашивания пищевых продуктов.Phycobiliproteins are natural dyes mainly used to color foods.
Изобретение также относится к применению устойчивых к кислым значениям рН фикобилипротеинов, полученных способом по изобретению и, в частности, устойчивых к кислым значениям рН фикоцианинов, определенных выше, в качестве красителей в пищевых продуктах.The invention also relates to the use of the acid pH-resistant phycobiliproteins obtained by the process of the invention, and in particular the acid-pH-resistant phycocyanins as defined above, as food colorants.
Изобретение также относится к композиции, в частности, пищевой композиции, содержащей устойчивый к кислым значениям рН фикобилипротеин, полученный способом по изобретению и, в частности, устойчивый к кислым значениям рН фикоцианин, как определено выше.The invention also relates to a composition, in particular a food composition, comprising the acid pH-resistant phycobiliprotein obtained by the method of the invention and in particular the acid-pH-resistant phycocyanin as defined above.
Указанные применения и указанные композиции известны специалистам в области техники.These uses and these compositions are known to those skilled in the art.
Предпочтительно, пищевой продукт или пищевая композиция представляет собой кислотную композицию, как определено в заявке WO 2017/050918.Preferably, the food or food composition is an acidic composition as defined in WO 2017/050918.
Согласно изобретению, кислотная композиция определена как любая композиция, содержащая неорганическую или органическую кислоту и фикоцианин. Такая композиция может быть жидкой, текучей или вязкой, пастообразной или твердой композицией, имеющей кислое значение рН, в которую включен устойчивый к кислым значениям рН фикоцианин.According to the invention, an acid composition is defined as any composition containing an inorganic or organic acid and phycocyanin. Such a composition may be a liquid, flowable or viscous, pasty or solid composition having an acidic pH, in which an acidic pH-stable phycocyanin is incorporated.
У водных жидких композиций рН определяют обычным способом. У неводных жидких композиций или пастообразных или твердых композиций рН определяют после растворения композиции в количестве воды, достаточном для растворения твердых соединений, которые она содержит, включая неорганические или органические кислоты и фикоцианин.For aqueous liquid compositions, the pH is determined in the usual manner. For non-aqueous liquid compositions or pasty or solid compositions, the pH is determined after dissolving the composition in an amount of water sufficient to dissolve the solid compounds it contains, including inorganic or organic acids and phycocyanin.
Предпочтительно, композиция по изобретению представляет собой водную жидкую композицию, возможно в форме геля или пастообразную или твердую композицию, предназначенную для растворения в водном растворе или в твердой или пастообразной композиции, содержащей воду. Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения, кислотная композиция представляет собой пастообразную или твердую композицию, предназначенную для применения и/или хранения во влажной окружающей среде.Preferably, the composition of the invention is an aqueous liquid composition, optionally in the form of a gel or a pasty or solid composition, intended to be dissolved in an aqueous solution or in a solid or pasty composition containing water. According to another preferred embodiment of the invention, the acidic composition is a pasty or solid composition intended for use and/or storage in a humid environment.
Неорганические или органические кислоты, которые можно применять в композициях по изобретению, хорошо известны специалистам в области техники. Среди неорганических кислот отдельно следует упомянуть угольную, фосфорную, соляную, серную, хлорную, сульфоновую и азотную кислоты. Среди органических кислот отдельно следует упомянуть лимонную, молочную, яблочную, винную, янтарную кислоты, предпочтительно лимонную кислоту.The inorganic or organic acids that can be used in the compositions of the invention are well known to those skilled in the art. Among the inorganic acids, mention should be made of carbonic, phosphoric, hydrochloric, sulfuric, perchloric, sulfonic and nitric acids. Among the organic acids, mention should be made of citric, lactic, malic, tartaric, succinic acids, preferably citric acid.
Согласно изобретению, кислотная пищевая композиция означает любую композицию, предназначенную для приема внутрь человеком или животными, которая подпадает под приведенное выше определение. Нутрицевтические кислотные композиции следует считать подпадающими под определение кислотных пищевых композиций в контексте изобретения.According to the invention, an acidic food composition means any composition intended for ingestion by humans or animals that falls within the definition above. Nutraceutical acid compositions are to be considered as falling under the definition of acid food compositions in the context of the invention.
Кислотные пищевые композиции по изобретению хорошо известны специалистам в области техники. Они могут включать носитель, который может включать структурные компоненты, ассоциированные с активными соединениями, идентифицированные в отношении их питательного вклада или свойств, благотворно влияющих на здоровье человека или животного. Кислотная пищевая композиция по изобретению может также включать пищевые добавки, такие как текстурирующие агенты, корригенты, консерванты, все из которых хорошо известны специалистам в области техники. Носитель может включать воду и/или белок, и/или жир, и/или волокна, и/или сахара. Компоненты носителя могут обладать лишь структурными свойствами, но обычно они известны своим питательным вкладом.The acidic food compositions of the invention are well known to those skilled in the art. They may include a carrier, which may include structural components associated with the active compounds, identified in relation to their nutritional contribution or properties beneficial to human or animal health. The acidic food composition of the invention may also include food additives such as texturizing agents, flavoring agents, preservatives, all of which are well known to those skilled in the art. The carrier may include water and/or protein and/or fat and/or fibers and/or sugars. The carrier components may only have structural properties, but are generally known for their nutritional contribution.
Кислотная пищевая композиция по изобретению может быть представлена в готовой для употребления форме или в форме пищевой добавки, которую добавляют в твердый, пастообразный или жидкий препарат для получения пищи, которую можно употреблять внутрь.The acidic food composition of the invention may be presented in a ready-to-eat form or in the form of a dietary supplement that is added to a solid, pasty or liquid preparation to form a food that can be ingested.
Кислоту для пищевых композиций следует предпочтительно выбирать из перечня разрешенных к применению пищевых подкисляющих агентов, в частности, угольной, фосфорной, лимонной, яблочной, винной и молочной кислот, более конкретно, лимонной кислоты.The acid for food compositions should preferably be selected from a list of approved food acidifying agents, in particular carbonic, phosphoric, citric, malic, tartaric and lactic acids, more specifically citric acid.
Что касается кислотных композиций, отличных от пищевых композиций по изобретению, они могут быть в том числе фармацевтическими, ветеринарными или косметическими и могут дополнительно содержать любые добавки и/или активные вещества, известные и применяемые в композициях такого типа.As regards acid compositions other than food compositions according to the invention, they may be pharmaceutical, veterinary or cosmetic, and may additionally contain any additives and/or active substances known and used in compositions of this type.
В твердую, жидкую или пастообразную кислотную композицию по изобретению фикоцианин может быть включен, например, в форме порошка. Указанная кислотная композиция, в частности, указанная кислотная пищевая композиция, может тогда находиться в любой обычной форме, такой как кремы, гели, пены, пасты и так далее. В частности, для твердой пищевой композиции следует отдельно упомянуть кексы или печенья, сухие продукты для приготовления, порошки для разведения, твердые или желеобразные желатиновые композиции, муссы и так далее.In the solid, liquid or pasty acid composition according to the invention, phycocyanin can be included, for example, in the form of a powder. Said acidic composition, in particular said acidic food composition, may then be in any conventional form such as creams, gels, foams, pastes, and so on. In particular, for a solid food composition, special mention should be made of cakes or biscuits, dry preparations, powders for reconstitution, hard or jelly-like gelatin compositions, mousses, and so on.
Согласно изобретению, указанная жидкая кислотная композиция может представлять собой водную композицию, в которой растворен фикоцианин. Она может быть в форме готовой для употребления композиции или в виде жидкого концентрата для разведения, в частности, для приема внутрь или для добавления в твердую пищу для ее приготовления или для употребления, например жидкий концентрат для глазирования или композиция «топпинга», которыми покрывают кекс для придания ему цвета. Среди указанных концентрированных композиций следует упомянуть сиропы, возможно содержащие спирт.According to the invention, said liquid acid composition may be an aqueous composition in which phycocyanin is dissolved. It may be in the form of a ready-to-eat composition or as a liquid concentrate for reconstitution, in particular for ingestion or for addition to solid foods for preparation or consumption, such as a liquid concentrate for icing or a "topping" composition used to top a cake. to give it color. Among these concentrated compositions, syrups, possibly containing alcohol, should be mentioned.
Жидкие кислотные композиции по изобретению могут иметь различную вязкость и могут включать или не включать такие добавки, как агенты, регулирующие вязкость, желирующие вещества и другие структурирующие добавки, известные специалистам в области техники и обычные для изготовления жидких пищевых композиций.The liquid acidic compositions of the invention may have a variety of viscosities and may or may not include additives such as viscosity adjusting agents, gelling agents, and other structurants known to those skilled in the art and customary in the manufacture of liquid food compositions.
Согласно конкретному воплощению изобретения, жидкая пищевая композиция может быть подкисленным напитком, возможно газированным. Сюда входят газированные напитки, соки, спортивные напитки, фитнес-напитки, восстановительные напитки и так далее. Композиции указанных напитков хорошо известны специалистам в области техники и могут включать, в частности, сахара, минеральные соли, пищевые добавки, растворенный газ и так далее. Напиток по изобретению представляет собой обычный кислый напиток, в котором обычно используемый краситель заменен полностью или частично устойчивым к кислым значениям рН фикоцианином по изобретению.According to a specific embodiment of the invention, the liquid food composition may be an acidified beverage, optionally carbonated. This includes sodas, juices, sports drinks, fitness drinks, recovery drinks, and so on. The compositions of these beverages are well known to those skilled in the art and may include, in particular, sugars, mineral salts, nutritional supplements, dissolved gas, and so on. The drink according to the invention is a conventional acidic drink in which the color normally used is replaced in whole or in part by the acid pH-resistant phycocyanin according to the invention.
Согласно изобретению, содержание фикоцианина в композициях по изобретению может соответствовать стандартной практике, принятой в области техники.According to the invention, the content of phycocyanin in the compositions according to the invention may be in accordance with standard practice adopted in the technical field.
Например, когда фикоцианин используют для окрашивания кислотной композиции, содержание фикоцианина в указанной композиции может соответствовать стандартной практике, принятой в области техники в отношении красителей.For example, when phycocyanin is used to color an acidic composition, the content of phycocyanin in said composition may be in accordance with standard practice for dyes in the art.
В жидкой кислотной композиции по изобретению содержание фикоцианина может находиться в диапазоне от 2,5 мг/л до 2500 мг/л, предпочтительно от 25 мг/л до 300 мг/л.In the liquid acid composition according to the invention, the content of phycocyanin can range from 2.5 mg/l to 2500 mg/l, preferably from 25 mg/l to 300 mg/l.
В готовой для употребления жидкой питьевой композиции содержание фикоцианина может обычно находиться в диапазоне от 25 мг/л до 300 мг/л, предпочтительно от 50 мг/л до 100 мг/л.In a ready-to-drink liquid drinking composition, the content of phycocyanin can generally range from 25 mg/l to 300 mg/l, preferably from 50 mg/l to 100 mg/l.
В концентрированной жидкой композиции, которую следует разводить перед применением, такой как сироп, содержание фикоцианина обычно может находиться в диапазоне от 250 мг/л до 2500 мг/л, предпочтительно от 500 мг/л до 1000 мг/л.In a concentrated liquid formulation to be reconstituted prior to use, such as a syrup, the phycocyanin content can generally range from 250 mg/l to 2500 mg/l, preferably from 500 mg/l to 1000 mg/l.
В твердой композиции содержание фикоцианина обычно может находиться в диапазоне от 0,01 мг/г до 10 мг/г, предпочтительно от 0,1 мг/г до 5,0 мг/г, особенно предпочтительно от 0,25 мг/г до 2,5 мг/г.In the solid composition, the content of phycocyanin can generally be in the range of 0.01 mg/g to 10 mg/g, preferably 0.1 mg/g to 5.0 mg/g, particularly preferably 0.25 mg/g to 2 .5 mg/g.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1. Очистка посредством кислотного осаждения на свежих клеткахExample 1 Purification by Acid Precipitation on Fresh Cells
Ферментационный бульон клеток Galdieria sulphuraria, центрифугированный и промытый эквивалентным объемом воды, механически измельчают для высвобождения фикобилипротеинов в водную фазу при рН 6. Измельченный материал подкисляют, поэтапно изменяя рН на 0,5 единиц путем добавления лимонной кислоты. На каждой стадии отбирают образец смеси и затем центрифугируют в течение 10 мин при 11000 g. Собирают надосадочную жидкость, содержащую фикобилипротеины, и определяют индекс чистоты путем определения отношения поглощения при 618 нм к поглощению при 280 нм при помощи спектрофотометра (Amersham Biosciences Ultra Spec 2100 Pro).Fermentation broth of Galdieria sulphuraria cells, centrifuged and washed with an equivalent volume of water, is mechanically crushed to release phycobiliproteins into the aqueous phase at
Очевидно, что чем ниже рН, тем выше индекс чистоты (Фиг. 1). Такое увеличение индекса чистоты отражает уменьшение контаминирующих белков в надосадочной жидкости, тогда как С-РС остается преимущественно в надосадочной жидкости. Благодаря своей устойчивости к кислым значениям рН не происходит существенной потери содержания С-РС в надосадочной жидкости (Фиг. 2). Неожиданно, что аллофикоцианин (АРС) полностью исчезает из надосадочной жидкости при значениях рН ниже 5, оказываясь в осадке вместе с другими осажденными белками и клеточным дебрисом (Фиг. 3). Данный осадок также содержит С-РС и АРС, при этом содержание АРС выше (Фиг. 3).Obviously, the lower the pH, the higher the purity index (Fig. 1). This increase in purity index reflects a decrease in contaminating proteins in the supernatant, while C-PC remains predominantly in the supernatant. Due to its resistance to acidic pH values, there is no significant loss of C-PC content in the supernatant (FIG. 2). Surprisingly, allophycocyanin (APC) completely disappears from the supernatant at pH values below 5, being precipitated along with other precipitated proteins and cell debris (Fig. 3). This sediment also contains C-PC and APC, with a higher APC content (FIG. 3).
Подкисление также приводит к лучшему разделению жидкой и твердой фаз и более компактному осадку клеточного дебриса и белков, который легче отделить от водной фазы.Acidification also results in better separation of the liquid and solid phases and a more compact sediment of cell debris and proteins that can be more easily separated from the aqueous phase.
Пример 2. Очистка посредством кислотного осаждения на лиофилизированных и регидратированных клеткахExample 2 Purification by Acid Precipitation on Lyophilized and Rehydrated Cells
Ферментационный бульон клеток Galdieria sulphuraria, центрифугированный и промытый эквивалентным объемом воды, механически измельчают для высвобождения фикобилипротеинов в водную фазу при рН 6. Затем измельченный материал подвергают лиофильной сушке. Лиофилизированный сухой материал суспендируют в объеме воды, эквивалентном исходному объему бульона, и затем подкисляют, поэтапно изменяя рН на 0,5 единиц путем добавления лимонной кислоты. На каждой стадии отбирают образец смеси и затем центрифугируют в течение 10 мин при 11000 g. Собирают надосадочную жидкость, содержащую фикобилипротеины, и определяют индекс чистоты путем определения отношения поглощения при 618 нм к поглощению при 280 нм при помощи спектрофотометра (Amersham Biosciences Ultra Spec 2100 Pro).The fermentation broth of Galdieria sulphuraria cells, centrifuged and washed with an equivalent volume of water, is mechanically ground to release the phycobiliproteins into the aqueous phase at
Как описано выше в Примере 1, можно заметить увеличение индекса чистоты, коррелирующее с уменьшением рН (Фиг. 4). В данном случае подкисление также приводит к лучшему разделению жидкой и твердой фаз и более компактному осадку клеточного дебриса и белков, который легче отделить от водной фазы. Аналогично тому, что наблюдалось в Примере 1, при значениях рН ниже 5 АРС обнаруживается в осадке, а не в водной фазе (Фиг. 5). При значениях рН от 6 до 5 количество АРС в надосадочной жидкости уменьшается по мере снижения рН.As described above in Example 1, an increase in the purity index can be seen, correlating with a decrease in pH (FIG. 4). In this case, acidification also leads to a better separation of the liquid and solid phases and a more compact sediment of cell debris and proteins, which is easier to separate from the aqueous phase. Similar to what was observed in Example 1, at pH values below 5, APC is found in the sediment, and not in the aqueous phase (Fig. 5). At pH values from 6 to 5, the amount of APC in the supernatant decreases as the pH decreases.
Пример 3. Очистка и концентрирование С-РС посредством тангенциальной фильтрацииExample 3 Purification and concentration of C-PC by tangential filtration
Первичный экстракт после кислотного осаждения и центрифугирования фильтруют с применением половолоконного модуля тангенциальной фильтрации. Фильтрование через такую сетку удаляет некоторые из белков, не являющихся С-РС, таким образом, увеличивая индекс чистоты (Фиг. 6). Индекс чистоты, достигаемый при таком способе, приближается к значениям, обычно получаемым при намного более сложных способах, включающих двухфазные экстракции или осаждение сульфатом аммония или даже хроматографические методы (Soresen et al., 2013; Cruz de
ЛитератураLiterature
- Cruz de
- Eisele et al., "Studies on C-phycocyanin from Cyanidium caldarium, a eukaryote at the extremes of habitat" Biochemica et Biophysica Acta 1456 (2000) 1456, 2-3, 99-107.- Eisele et al., "Studies on C-phycocyanin from Cyanidium caldarium, a eukaryote at the extremes of habitat" Biochemica et Biophysica Acta 1456 (2000) 1456, 2-3, 99-107.
- Eriksen NT. "Production of phycocyanin - a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine" Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Aug; 80(1): 1-14.- Eriksen NT. "Production of phycocyanin - a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine" Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Aug; 80(1): 1-14.
- Kao et al., "Physical-chemical properties of C-phycocyanin isolated from an acido-thermophilic eukaryote, Cyanidium caldarium" Biochem. J. (1975) 147, 63-70.- Kao et al., "Physical-chemical properties of C-phycocyanin isolated from an acido-thermophilic eukaryote, Cyanidium caldarium" Biochem. J. (1975) 147, 63-70.
- Myounghoon et al. "Isolation and Characterization of Thermostable Phycocyanin from Galdieria Sulphuraria, "Korean journal of chemical engineering, 31 (2014): 1-6.- Myounghoon et al. "Isolation and Characterization of Thermostable Phycocyanin from Galdieria Sulfuraria," Korean journal of chemical engineering, 31 (2014): 1-6.
- 
- WO 2005/065697, WO 2015/090697, WO 2016/099261, WO 2017/050917, WO 2017/050918 и PCT/EP 2016/079325, поданная 30 ноября 2016.- WO 2005/065697, WO 2015/090697, WO 2016/099261, WO 2017/050917, WO 2017/050918 and PCT/EP 2016/079325 filed November 30, 2016.
Claims (11)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1752674 | 2017-03-30 | ||
| FR1752674A FR3064635B1 (en) | 2017-03-30 | 2017-03-30 | PURIFICATION OF PHYCOBILIPROTEINS |
| PCT/EP2018/058294 WO2018178334A2 (en) | 2017-03-30 | 2018-03-30 | Purification of phycobiliproteins |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019132193A RU2019132193A (en) | 2021-04-30 |
| RU2019132193A3 RU2019132193A3 (en) | 2021-11-26 |
| RU2781831C2 true RU2781831C2 (en) | 2022-10-18 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2320195C1 (en) * | 2006-05-31 | 2008-03-27 | Владимир Кимович Мазо | Method for producing of protein preparation from cyanobacteria |
| CN102731645A (en) * | 2012-07-17 | 2012-10-17 | 福州大学 | Method for preparing edible phycocyanin through extraction from algae |
| WO2016099261A1 (en) * | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Rijksuniversiteit Groningen | Natural blue photopigments, methods for producing them and to uses thereof as colorant. |
| CN106190853A (en) * | 2016-04-18 | 2016-12-07 | 嘉兴泽元生物制品有限责任公司 | A kind of red algae cultural method of high yield phycocyanin |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2320195C1 (en) * | 2006-05-31 | 2008-03-27 | Владимир Кимович Мазо | Method for producing of protein preparation from cyanobacteria |
| CN102731645A (en) * | 2012-07-17 | 2012-10-17 | 福州大学 | Method for preparing edible phycocyanin through extraction from algae |
| WO2016099261A1 (en) * | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Rijksuniversiteit Groningen | Natural blue photopigments, methods for producing them and to uses thereof as colorant. |
| CN106190853A (en) * | 2016-04-18 | 2016-12-07 | 嘉兴泽元生物制品有限责任公司 | A kind of red algae cultural method of high yield phycocyanin |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| /s10811-010-9525-7. EISELE, L. E., et al. Studies on C-phycocyanin from Cyanidium caldarium, a eukaryote at the extremes of habitat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 2000, 1456(2-3), p.99-107. doi:10.1016/s0005-2728(99)00110-3. * |
| /s10811-016-1007-0. * |
| CHAIKLAHAN R. et al. Stability of phycocyanin extracted from Spirulina sp.: Influence of temperature, pH and preservatives. Process Biochemistry, 2012, v.47, p.659-664, doi:10.1016/j.procbio.2012.01.010. RAHMAN D. Y. et al. Thermostable phycocyanin from the red microalga Cyanidioschyzon merolae, a new natural blue food colorant. J. Appl. Phycol., /Published online: 21 November 2016, v.29, p.1233-1239, * |
| SHI-GAN YAN et al. Single-step chromatography for simultaneous purification of C-phycocyanin and allophycocyanin with high purity and recovery from Spirulina (Arthrospira) platensis. J. Appl. Phycol., 2011, v.23, p.1-6, * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7313283B2 (en) | Purification of phycobiliproteins | |
| Ashaolu et al. | Phycocyanin, a super functional ingredient from algae; properties, purification characterization, and applications | |
| RU2739847C2 (en) | Acidic composition containing phycocyanine | |
| US10815281B2 (en) | Method for extracting soluble proteins from microalgal biomass | |
| CN103992384B (en) | A kind of large yellow croaker fish bone collagen peptide and its production and use | |
| Lauceri et al. | A simple method for rapid purification of phycobiliproteins from Arthrospira platensis and Porphyridium cruentum biomass | |
| CN103992387B (en) | A kind of mussel boiling liquid bioactive peptide and its preparation method and application | |
| CN104250285A (en) | Pseudosciaena crocea flesh antioxidative peptide and preparation method and use thereof | |
| CN107151686B (en) | High-solubility cod protein | |
| CN104558115A (en) | Antioxidant polypeptide with Raja porosa meat protein as well as preparation method and application of antioxidant polypeptide | |
| RU2573913C2 (en) | Canola protein product of supernatant | |
| RU2781831C2 (en) | Phycobiliprotein purification | |
| CN110923284B (en) | Walnut nut flavor peptide and preparation method thereof | |
| JP7022453B2 (en) | Phycocyanin purification method | |
| US20240101596A1 (en) | Method for the extraction of phycobiliproteins at high purity degree from cyanobacterial and/or algal biomasses | |
| CN106699842B (en) | Novel anti-inflammatory small molecule polypeptide and application thereof | |
| CN116421708B (en) | Extraction of ovalbumin from pigeon egg white and application of ovalbumin in wound repair | |
| CN106191184A (en) | A kind of preparation of novel Scapharca broughtonii antioxidation active peptides and application thereof | |
| CN111004305B (en) | Agaricus blazei murill small peptide and preparation method and application thereof | |
| CN114403455B (en) | Cod peptide with immunoregulatory activity and application thereof | |
| KR20210018826A (en) | Non-essential wheat proteins and methods of production thereof | |
| CN106619717A (en) | Production method of deproteinized calf blood extractive intermediates | |
| Li et al. | Recovery of Proteins from Sweet Potato Cell Liquid by Acidification via Inoculation-Enhanced Fermentation and Determination of Functional Properties of Protein Products | |
| JP2011087501A (en) | Method for producing tetrapeptide having nail keratin increasing action | |
| CN117924410A (en) | Preparation of antioxidant bird's nest peptide by subcritical water combined with ultrahigh pressure homogenization physical technology |