RU2781331C1 - Животная модель цинк-зависимого амилоидогенеза при болезни Альцгеймера - Google Patents
Животная модель цинк-зависимого амилоидогенеза при болезни Альцгеймера Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781331C1 RU2781331C1 RU2021134384A RU2021134384A RU2781331C1 RU 2781331 C1 RU2781331 C1 RU 2781331C1 RU 2021134384 A RU2021134384 A RU 2021134384A RU 2021134384 A RU2021134384 A RU 2021134384A RU 2781331 C1 RU2781331 C1 RU 2781331C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nematodes
- alzheimer
- zinc
- disease
- amyloid
- Prior art date
Links
- 239000011701 zinc Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 206010001897 Alzheimer's disease Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 17
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 17
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 230000001419 dependent Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims abstract description 35
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241001167795 Escherichia coli OP50 Species 0.000 claims abstract description 6
- 101700040630 MYO4 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001575 pathological Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 4
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 abstract description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L Zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010066671 Enalaprilat Proteins 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 229960002680 enalaprilat Drugs 0.000 description 14
- LZFZMUMEGBBDTC-QEJZJMRPSA-N Enalaprilat Chemical compound C([C@H](N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LZFZMUMEGBBDTC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 13
- 239000002609 media Substances 0.000 description 7
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 230000002490 cerebral Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 4
- 206010002023 Amyloidosis Diseases 0.000 description 3
- 206010002022 Amyloidosis Diseases 0.000 description 3
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 3
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 2
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N Hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 208000005145 Cerebral Amyloid Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 210000003800 Pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000009632 agar plate Methods 0.000 description 1
- 230000003942 amyloidogenic Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 1
- 230000002431 foraging Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 125000003372 histidine group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000021317 sensory perception Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к патологической физиологии и касается создания животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при патогенезе болезни Альцгеймера. Для этого выращивают трансгенных нематод С. elegans линии CL2120 (dvis 14 [(pCL12) unc-54::beta 1-42 +(pCL26) mtl-2::GFP]), оверэкспрессирующих человеческий 42-членный бета-амилоид (Aβ42), до стадии L4 при 15°С на пластинах NGM с бактериальным газоном Е. coli OP50. Далее помещают нематод в каплю 0,2 мл М9-буфера, содержащего ZnSO4 20 мкМ и isoD7-A42 40 мкМ, и культивируют в течение 4 часов при 25°С при перемешивании. Затем переносят капли с нематодами в чашки Петри с NMGZn, с бактериальным газоном E. coli ОР50 и культивируют в чашке Петри при 25°С. Изобретение обеспечивает создание эффективной животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при патогенезе болезни Альцгеймера.
Description
Изобретение относится к области патологической физиологии, а именно к способу создания животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при болезни Альцгеймера. Данная модель характеризуется тем, что увеличение образования амилоидных агрегатов у трансгенных нематод С. elegans линии CL2120 (dvis14 [(pCL12) unc-54::beta 1-42+(pCL26) mtl-2::GFP]), а также сокращение продолжительности жизни экспериментальных животных, вызывается добавлением в обычную питательную среду следующих двух компонентов: (1) ионов цинка в безвредных для животных концентрациях; (2) синтетического аналога изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого 42-членного бета- амилоида (isoD7-Aβ42).
Уровень техники
Болезнь Альцгеймера (БА) характеризуется церебральным амилоидогенезом -накоплением в тканях мозга внеклеточных полимерных агрегатов (амилоидных бляшек) [Golde, Т.Е., S.T. DeKosky, and D. Galasko, Alzheimer's disease: The right drug, the right time. Science, 2018. 362(6420): p.1250-1251]. Основным белковым компонентом амилоидных бляшек является бета-амилоид (Aβ) (включая его изоформы с различной длиной полипептидной цепи и с многочисленными посттрансляционными модификациями) [Masters, C.L. and D.J. Selkoe, Biochemistry of Amyloid β-Protein and Amyloid Deposits in Alzheimer Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2012. 2(6): p.а006262]. Критическим фактором церебрального амилоидогенеза является появление в биологических жидкостях организма изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида 1-42 (isoD7-Aβ42) [Gnoth, K., et al., Targeting isoaspartate-modified Aβ rescues behavioral deficits in transgenic mice with Alzheimer's disease-like pathology. Alzheimer's Research & Therapy, 2020. 12(1): p.149; Kozin, S.A., et al., Peripherally applied synthetic peptide isoAsp7-Aβ(1-42) triggers cerebral β-amyloidosis. Neurotoxicity Research, 2013. 24(3): p.370-376].
В качестве экспериментальных моделей церебрального амилоидогенеза при болезни Альцгеймера используются трансгенные животные, в которых амилоидные бляшки образуются за счет перепроизводства человеческого бета-амилоида в различных тканях, включая нейрон-содержащие. В патенте РФ №2 532 525 публ. 20.06.2014 представлено применение трансгенных мышей линии В6С3-Tg (APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/ J, которым внутривенно вводят препарат isoD7-Aβ42, что приводит к резкому ускорению образования амилоидных бляшек. Этот способ обеспечивает возможность произвольного изменения скорости развития патологических процессов у подопытных животных в зависимости от целей конкретного исследования за счет варьирования числа инъекций и/или количества синтетического пептида в одной инъекционной дозе. Однако, как для модели, описанной в патенте РФ №2 532 525, так и для всех других известных к настоящему времени животных моделей, невозможно оценить влияние бинарной комбинации isoD7-Aβ42 и ионов цинка на развитие амилоидоза. Между тем ионы цинка являются ключевым фактором при патогенезе болезни Альцгеймера [Куликова, А.А., А.А. Макаров, and С.А. Козин, Роль ионов цинка и структурного полиморфизма β-амилоида в инициации болезни Альцгеймера. Молекулярная биология, 2015. 49(2): р. 249-263; Friedlich, A.L., et al., Neuronal Zinc Exchange with the Blood Vessel Wall Promotes Cerebral Amyloid Angiopathy in an Animal Model of Alzheimer's Disease. The Journal of Neuroscience, 2004. 24(13): p. 3453-3459]. Более того, ранее было продемонстрировано в экспериментах in vitro, что бинарные комплексы [isoD7-Aβ42 / Цинк] являются потенциальными инициирующими агентами цинк-зависимой олигомеризации эндогенных молекул бета-амилоида при развитии болезни Альцгеймера [Istrate, A.N., et al., Interplay of histidine residues of the Alzheimer's disease Аβ peptide governs its Zn-induced oligomerization. Scientific Reports, 2016. 6: p.21734]. Однако, до настоящего времени не существовало ни одной животной модели, в которой можно было бы наблюдать роль цинк-связанных комплексов с участием изоформ бета-амилоида в амилоидогенезе.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей изобретения является создание животной модели амилоидогенеза, в которой было бы возможным вызывать ускорение появления амилоидных агрегатов под воздействием экзогенных цинк-связанных комплексов с участием изоформ бета-амилоида, и использовать такую модель для тестирования эффективности потенциальных терапевтических агентов, направленных на подавление амилоидогенных свойств таких комплексов.
Настоящее изобретение состоит в использовании цинк-связанных комплексов isoD7-Aβ42 в качестве экзогенных молекулярных агентов, инициирующих резкое ускорение агрегации эндогенных молекул бета-амилоида человека (Аβ) в тканях животных, оверэкспрессирующих человеческий 42-членный бета-амилоид(Aβ42). Трансгенные нематоды, которые оверэкспрессируют человеческий Аβ, представляют собой популярную животную модель в исследованиях церебрального амилоидогенеза при БА [Alexander, A.G., V. Marfil, and С. Li, Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet, 2014. 5: p. 279; Chen, X., et al., Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central journal, 2015. 9: p. 65-65; Dostal, V. and CD. Link, Assaying β-amyloid toxicity using a transgenic C. elegans model. J Vis Exp, 2010 (44); Ewald, C.Y. and C. Li, Understanding the molecular basis of Alzheimer's disease using a Caenorhabditis elegans model system. Brain structure & function, 2010. 214(2-3): p. 263-283]. У таких нематод по мере старения происходит появление фибриллярных амилоидных бляшек в различных тканях организма, а также наблюдаются многообразные функциональные отклонения, однако, средняя продолжительность жизни животных не изменяется. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что введение isoD7-Aβ42 в организм трансгенных нематод не вызывает никаких эффектов на уровень амилоидоза у этих животных, однако, бинарная смесь isoD7-Аβ42 и ионов цинка при попадании внутрь нематод резко увеличивает амилоидную нагрузку в тканях животных и приводит к значительному сокращению продолжительности жизни нематод.
Преимуществом данного изобретения по сравнению с существующими в настоящее время конституциональными (трансгенными), индуцируемыми и смешанными животными моделями болезни Альцгеймера является возможность контролировать роль цинк-зависимых комплексов в инициировании патологической агрегации эндогенных молекул человеческого бета-амилоида, которые конституционально оверэкспрессируются в организме трансгенных модельных животных. Дополнительным преимуществом данного изобретения является возможность тестировать в животной модели терапевтический потенциал прототипов анти-амилоидных средств лечения болезни Альцгеймера, направленных на подавления цинк-зависимой агрегации бета-амилоида.
Технический результат, достигаемый при использовании настоящего изобретения, заключается в создании животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при болезни Альцгеймера. В рамках настоящего изобретения впервые в мире показано, что комплексы ионов цинка и изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида 1-42 вызывают резкое ускорение образование амилоидных агрегатов у трансгенных нематод С. elegans линии CL2120 (dvisl4 [(pCL12) unc-54::beta 1-42+(pCL26) mtl-2::GFP] и приводят к значительному сокращению продолжительности жизни животных. Патогенные эффекты таких комплексов полностью нейтрализуются эналаприлатом, образующим, как было показано ранее, тройной комплекс [isoD7-Aβ42 / Цинк / Эналаприлат] [Козин, С.А., et al., Эналаприлат ингибирует цинк-зависимую олигомеризацию металл-связывающего домена изоформ бета-амилоида и защищает клетки нейробластомы человека от их токсического действия. Молекулярная биология, 2018. 52(4): р. 683-691].
Осуществление изобретения
В экспериментах использовались трансгенные нематоды С. elegans CL2120 (dvisl4 [(pCL12) unc-54:: beta 1-42+(pCL26) mtl-2:: GFP]) и С. elegans CL2122 (dvisl5 [(pPD30.38) unc-54 (вектор)+(pCL26) mtl-2::GFP], которые были получены из Центра генетики Caenorhaditis. С червями обращались согласно стандартным методам [Brenner, S., The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics, 1974. 77(1): p.71-94]. Бактерии Е. coli OP50 выращивали в течение ночи в бульоне Лурия-Бертани. На следующий день на чашки с NGM или NGMZn (NGMZn содержит 20 мкм ZnSO4) разливали по 50 мкл бактериальной массы.. Засеянные планшеты инкубировали при 30°С в течение ~ 16 часов, а затем в течение 1-2 часов при 15 или 25°С перед переносом червей.
Для введения в организм нематод пептидов бета-амилоида (Аβ42, isoD7-Aβ42) и Эналаприлата проводили следующие операции: нематоды очищали от нежелательной микрофлоры методом щелочного гипохлорита [Jorgensen, Е.М. and S.E. Mango, The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet, 2002. 3(5): p.356-69], выращивали до стадии L4 при 15°С на пластинах NGM с бактериальным газоном. Затем примерно 140 животных помещали в каплю 0,2 мл М9-буфера+/- ZnSO4 (20 мкМ)+/- isoD7-Aβ42 (40 мкМ)+/- Эналаприлат (4 мМ) и культивировали в течение 4 часов при 25°С при перемешивании. Далее все содержимое переносили в чашки Петри с NGM или NGMZn с ОР50 и помещали в термостатируемый инкубатор при 25°С. На следующий день червей переносили на аналогичные среды с бактериальным субстратом и определяли продолжительность жизни при 25°С.
Визуализацию и количественный анализ амилоидных отложений у нематод проводили следующим образом: нематод выращивали на среде NGM или NGMZn со штаммом Е. coli ОР50 при 25°С и обрабатывали пептидами (Аβ42, isoD7-Аβ42) и/или Эналаприлатом, как описано выше. На стадии А1 животных окрашивали 1 мМ Х-34 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в 10 мМ Трис рН 8,0 в течение двух часов. Для обесцвечивания их впоследствии культивировали в течение 16 часов на NGM (ионы цинка отсутствуют) или NGMZn (присутствуют ионы цинка) с бактериальным газоном при той же температуре. Окрашенных отдельных червей помещали на предметные стекла в агаре и анестезировали путем инкубации в 0,1% азида натрия. Амилоидные агрегаты в нематодах визуализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems GmbH, Вецлар, Германия) с использованием лазера 405 нм для возбуждения и полосового эмиссионного фильтра 430-570 с иммерсионным объективом 63х. Для визуализации использовалось стандартное программное обеспечение Las X (Leica Microsystems GmbH, Вецлар, Германия) с плагином для конфокальной визуализации. Полученные изображения были обработаны с помощью программного обеспечения Las X для получения максимальных проекций. Вычитание фона и определение порогового значения были выполнены WCIF ImageJ с идентичными параметрами для всех изображений. Общая площадь бляшек, средняя интенсивность флуоресценции и количество бляшек были определены для каждого червя в анатомической области от переднего конца до задней луковицы животного.
Анализ продолжительности жизни нематод осуществляли по нижеприведенной методике. Продолжительность жизни контролировали при 25°С, как описано ранее [Apfeld, J. and С. Kenyon, Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature, 1999. 402(6763): p. 804-9; 15, Dillin, А., D.K. Crawford, and C. Kenyon, Timing requirements for insulin/IGF-1 signaling in C. elegans. Science, 2002. 298(5594): p.830-4]. Все эксперименты повторялись не менее трех раз, и в каждом эксперименте использовалось ≈130 червей. Во всех случаях черви стадии L4 использовали при t=0 для анализа продолжительности жизни, при этом червей переносили через день на новые чашки с агаром. Черви считались мертвыми, когда они прекращали откачку крови из глотки и не реагировали на протыкание платиновой проволокой. Сбежавшие животные или животные с внутренним вылуплением не включались в расчет продолжительности жизни. Данные были проанализированы, и кривые выживаемости сигмовидной кривой Больцмана были построены с использованием пакета программного обеспечения для статистического анализа SciDAVis. Средняя продолжительность жизни сравнивалась в Microsoft Excel с использованием t-критерия Стьюдента с применением одностороннего распределения и двухвыборочной равной дисперсии [Gusarov, I., et al., Bacterial nitric oxide extends the lifespan of C. elegans. Cell, 2013. 152(4): p. 818-30]. Все графики продолжительности жизни представляют собой совокупность результатов всех независимых экспериментов. Определялось среднее процентное изменение ± стандартное отклонение продолжительности жизни после обработки относительно необработанного контроля.
Повышение амилоидной нагрузки у С.elegans, инкубированных со смесью isoD7-Aβ42 / Zn2+, предотвращается при добавлении Эналаприлата. Для выяснения эффектов экзогенного Аβ42, isoD7-Aβ42 и Zn2+ был использован трансгенный штамм С.elegans CL2120, характеризующийся сверхэкспрессией пептида Аβ42 человека. Визуализацию амилоидных агрегатов проводили с помощью специфического окрашивания амилоида у живых червей с использованием красителя Х-34. В соответствии с ранее опубликованными данными [Fay, D.S., et al., In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants. J Neurochem, 1998. 71(4): p. 1616-25], наблюдали зависящее от возраста накопление агрегатов Аβ42 в мышечной ткани нематод CL2120 в отличие от контрольного штамма С. elegans CL2122. У червей, подвергшихся воздействию смеси isoD7-Аβ42 / Zn2+, площадь, покрытая бляшками, увеличилась на 50%. С другой стороны, в группе, обработанной isoD7-Aβ42 и Zn2+ в присутствии Эналаприлата, ни количество бляшек, ни площадь бляшек не отличались от значений в необработанной группе.
Штаммы нематод, сверхэкспрессирующие Aβ42 и контрольные (CL2120 и CL2122, соответственно), имеют сходную продолжительность жизни [Minniti, A.N., et al., Intracellular amyloid formation in muscle cells of Abeta-transgenic Caenorhabditis elegans: determinants and physiological role in copper detoxification. Molecular neurodegeneration, 2009. 4: p.2-2]. Добавление в культуральную среду isoD7-Aβ42 не повлияло на среднюю продолжительность жизни нематод. В присутствии ионов цинка (среда NGMZn) добавление Aβ42 также не влияло на среднюю продолжительность жизни нематод CL2120 и CL2122.
При выращивании контрольных нематод (С.elegans CL2122) как на NGM (в отсутствии ионов цинка), так и на NGMZn (в присутствии ионов цинка) добавление пептида isoD7-Aβ42 не вызывало каких-либо изменений в продолжительности жизни животных. Обработка пептидом isoD7-Aβ42 нематод, сверхэкспрессирующих Аβ42, выращенных на NGM, также не привела к изменению их продолжительности жизни. Однако, одновременное присутствие ионов цинка и пептида isoD7-Aβ42 в культуральной среде привело к снижению средней продолжительности жизни нематод С.elegans CL2120 с 9,00 дней до 7,62 дней (снижение на 15,32%).
В группе контрольных животных (С. elegans CL2122) добавление Эналаприлата не приводило к изменениям продолжительности жизни ни на NGM, ни на NGMZn. У нематод С. elegans CL2120 на NGM Эналаприлат также не влиял на среднюю продолжительность жизни. В то же время присутствие Эналаприлата в среде NGMZn в концентрациях 0,4 мМ и 4 мМ полностью устраняет эффект индуцированного isoD7-Аβ42 сокращения продолжительности жизни нематод.
Таким образом, используя окрашивание, мы обнаружили, что амилоидная нагрузка у нематод С. elegans CL2120, культивируемых на среде с ионами цинка и isoD7-Aβ, на 50% выше, чем у контрольных нематод. Однако, добавление Эналаприлата к бинарной смеси Zn2 +и isoD7-Aβ приводит к значительному снижению развития конституциональных бляшек. Авторами настоящего изобретения впервые продемонстрировано, что одновременное присутствие ионов цинка и isoD7-Aβ в рационе трансгенных нематод С. elegans CL2120 приводит к резкому увеличению амилоидоза и значительному сокращению средней продолжительности жизни животных. В то же время, добавление Эналаприлата в питательную среду полностью нейтрализует негативное влияние комбинации ионов цинка и isoD7-Aβ на продолжительность жизни этих нематод (С.elegans CL2120). Полученные результаты впервые показали на животной модели болезни Альцгеймера, что комплексы isoD7-Aβ с Zn2 +действуют как триггер патологической агрегации нативных молекул Aβ и приводят к резкому ускорению амилоидогенеза и падению продолжитльности жизни. Используя Эналаприлат, было обнаружено, что молекулярные агенты, блокирующие способность isoD7-Aβ участвовать в цинк-зависимой олигомеризации, могут действовать как потенциальные антиамилоидные терапевтические агенты, которые останавливают развитие патогенеза AD.
Claims (6)
- Способ создания животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при развитии болезни Альцгеймера, включающий следующие пять этапов:
- 1) выращивание трансгенных нематод С. elegans линии CL2120 (dvis 14 [(pCL12) unc-54::beta 1-42 +(pCL26) mtl-2::GFP]), оверэкспрессирующих человеческий 42-членный бета-амилоид (Aβ42), до стадии L4 при 15°С на пластинах NGM с бактериальным газоном Е. coli OP50;
- 2) помещение нематод в каплю 0,2 мл М9-буфера, содержащего ZnSO4 20 мкМ и isoD7-A42 40 мкМ;
- 3) культивирование нематод в капле в течение 4 часов при 25°С при перемешивании;
- 4) перенос капли с нематодами в чашки Петри с NMGZn, с бактериальным газоном E. coli ОР50;
- 5) культивирование нематод в чашке Петри при 25°С.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2781331C1 true RU2781331C1 (ru) | 2022-10-11 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2532525C2 (ru) * | 2012-12-10 | 2014-11-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Экзогенно-индуцируемая животная модель болезни альцгеймера |
RU2572721C1 (ru) * | 2014-11-05 | 2016-01-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова" | Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2532525C2 (ru) * | 2012-12-10 | 2014-11-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Экзогенно-индуцируемая животная модель болезни альцгеймера |
RU2572721C1 (ru) * | 2014-11-05 | 2016-01-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова" | Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
КУЛАМИХИН И.С. и др. Геропротекторый эффект димебона и его макроциклических аналогов на модели нематод Caenorhabditis elegans / Труды 62-й Всероссийской научной конференции МФТИ. 18-24 ноября 2019 года. Биологическая и медицинская физика. — М.: МФТИ, 2019, стр. 25-26. СОКОЛОВСКИЙ Н.В. и др. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ СИСТЕМНОГО АМИЛОИДОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ) / Журнал фундаментальной медицины и биологии, 2017, N 3, стр. 21-26. KOZIN S.A. et al., Intravenously Injected Amyloid-b Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral b-Amyloidosis in AbPP/PS1 Transgenic / Frontiers in Neuroscience, 2018, vol. 12, article 518, 8 pages. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gonzalez-Moragas et al. | C. elegans as a tool for in vivo nanoparticle assessment | |
Freeze et al. | Control of basal ganglia output by direct and indirect pathway projection neurons | |
Sharma et al. | Lower vertebrate and invertebrate models of Alzheimer's disease–A review | |
Lin et al. | Environmental enrichment implies GAT-1 as a potential therapeutic target for stroke recovery | |
CN108938667B (zh) | 一种用于药物筛选的阿尔兹海默症模型的构建方法 | |
Abdulateef et al. | The effect of the electric shock on embryonic development and neurophysiological traits in the chick’s embryo | |
Takigami et al. | Spaced taste avoidance conditioning in Lymnaea | |
RU2781331C1 (ru) | Животная модель цинк-зависимого амилоидогенеза при болезни Альцгеймера | |
EA024733B1 (ru) | Биологически активный белково-полипептидный комплекс, стимулирующий регенерацию нервной ткани, и способ его получения | |
Kropp et al. | Allele-specific mitochondrial stress induced by Multiple Mitochondrial Dysfunctions Syndrome 1 pathogenic mutations modeled in Caenorhabditis elegans | |
Rodriguez et al. | Tau modulates visual plasticity in adult and old mice | |
Hansen et al. | Influence of season and environment on adult neurogenesis in the central olfactory pathway of the shore crab, Carcinus maenas | |
Rebolledo et al. | Inclusion body myositis: a view from the Caenorhabditis elegans muscle | |
Peters et al. | The Effects of Snake Venom (Bitis arietans) on Embryonic Development | |
Caliskan et al. | Zebrafish embryo as an emerging model organism in neurodevelopmental toxicity research | |
Hibi et al. | Deciphering cerebellar neural circuitry involved in higher order functions using the zebrafish model | |
de Figueiredo | The effect of excessive glutamate release on neuronal fitness, hyperactivity, and locomotor performance in a Drosophila model of Alzheimer’s | |
Igorevna et al. | Modeling of Tumor Growth in Experiment | |
SU1457871A1 (ru) | Способ определени физиологического состо ни сеголетков и годовиков карповых рыб | |
Lilienthal | Isolating the neural circuitry of prickle-mediated epilepsy | |
Lacagnina et al. | Ventral hippocampal interneurons govern extinction and relapse of contextual associations | |
Hong et al. | Anterior hypothalamic nucleus drives distinct defensive responses through cell-type-specific activity | |
Sheloukhova | Molecular dissection of ancestral glia | |
Keidar | The effects of LIS1 and MeCP2 reduced dosage in the mouse brain | |
Knight et al. | The Effects of Cannabidiol and Serotonin on Anxiety-Like Behavior in Crayfish |