RU2781180C1 - Method for detecting intestinal dysbiosis in birds in vitro - Google Patents
Method for detecting intestinal dysbiosis in birds in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781180C1 RU2781180C1 RU2021118520A RU2021118520A RU2781180C1 RU 2781180 C1 RU2781180 C1 RU 2781180C1 RU 2021118520 A RU2021118520 A RU 2021118520A RU 2021118520 A RU2021118520 A RU 2021118520A RU 2781180 C1 RU2781180 C1 RU 2781180C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- birds
- dysbiosis
- samples
- intestinal
- present
- Prior art date
Links
- 241000271566 Aves Species 0.000 title claims abstract description 47
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 238000001121 post-column derivatisation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 19
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 17
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 description 15
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 12
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000010807 litter Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 6
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 5
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 5
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 4
- 210000003736 Gastrointestinal Contents Anatomy 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 3
- 210000004534 Cecum Anatomy 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 206010039447 Salmonellosis Diseases 0.000 description 3
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 3
- 230000000378 dietary Effects 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- LINZYZMEBMKKIT-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) N-quinolin-6-ylcarbamate Chemical compound C=1C=C2N=CC=CC2=CC=1NC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LINZYZMEBMKKIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 2
- 208000003495 Coccidiosis Diseases 0.000 description 2
- 206010064389 Dysbacteriosis Diseases 0.000 description 2
- 206010023076 Isosporiasis Diseases 0.000 description 2
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N Phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N Phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002550 fecal Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic Effects 0.000 description 2
- 230000002956 necrotizing Effects 0.000 description 2
- 229940054441 o-Phthalaldehyde Drugs 0.000 description 2
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 2
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 1
- SAYSBGLNNKOABV-UHFFFAOYSA-N 5-(dimethylamino)-2-[5-(dimethylamino)naphthalen-1-yl]sulfonylnaphthalene-1-sulfonyl chloride Chemical compound CN(C)C1=CC=CC2=C(S(Cl)(=O)=O)C(S(=O)(=O)C3=C4C=CC=C(C4=CC=C3)N(C)C)=CC=C21 SAYSBGLNNKOABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000037640 Animal pathogens Species 0.000 description 1
- QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 206010061043 Clostridial infection Diseases 0.000 description 1
- 229940038704 Clostridium perfringens Drugs 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 210000003746 Feathers Anatomy 0.000 description 1
- 241000692870 Inachis io Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010021972 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infection Diseases 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 229940055023 Pseudomonas aeruginosa Drugs 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000287530 Psittaciformes Species 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 229940098232 Yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 1
- 230000001420 bacteriolysis Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000001434 dietary modification Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 239000000321 herbal drug Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 238000002705 metabolomic Methods 0.000 description 1
- 230000001431 metabolomic Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- -1 oral tube Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Настоящее изобретение относится к способу обнаружения дисбиоза кишечника у птиц in vitro, где способ предусматривает определение присутствия и/или уровня изолейцил-аргинина (C12H25O3N5) или его изомеров в материале образца птиц, при этом присутствие и/или повышенный уровень изолейцил-аргинина (C12H25O3N5) по сравнению с непораженным контролем свидетельствует о дисбиозе кишечника у птиц. The present invention relates to a method for detecting intestinal dysbiosis in birds in vitro , where the method involves determining the presence and/or level of isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 ) or its isomers in the sample material of birds, while the presence and/or increased the level of isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 ) compared to unaffected controls is indicative of gut dysbiosis in birds.
Уровень техники изобретенияState of the art invention
Здоровое состояние кишечника является крайне важным для здоровья и продуктивности сельскохозяйственных птиц.A healthy gut is essential to the health and productivity of poultry.
Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) птиц содержит сложную микробную экосистему, содержащую триллионы микроорганизмов. Эти микроорганизмы распределены по различным нишам, выполняя различные функции, в том числе ферментацию продуктов. Разнообразие микроорганизмов в ЖКТ зависит от участка пищеварения, состояния здоровья и возраста птиц. В нормальных условиях активность, вызывающая заболевания (дисбиоз), и активность, обеспечивающая защиту от заболеваний (пробиоз), являются идеально сбалансированными. Однако даже незначительное нарушение нормальной микробиоты кишечника может приводить к дисбалансу взаимоотношений хозяин-микроорганизм. Это состояние, при котором дисбаланс оказывает неблагоприятное воздействие на хозяина, известно как дисбиоз (дисбактериоз).The gastrointestinal tract (GI) of birds contains a complex microbial ecosystem containing trillions of microorganisms. These microorganisms are distributed into various niches, performing various functions, including the fermentation of products. The variety of microorganisms in the gastrointestinal tract depends on the site of digestion, the state of health and age of the birds. Under normal conditions, disease-causing activity (dysbiosis) and disease-protective activity (probiosis) are perfectly balanced. However, even a slight disruption of the normal gut microbiota can lead to an imbalance in the host-microorganism relationship. This condition, in which the imbalance has an adverse effect on the host, is known as dysbiosis (dysbacteriosis).
Дисбиоз является вредным для хозяина, приводя к воспалению и повреждению слизистой оболочки, что предрасполагает их к патологическим состояниям, таким как инфекция, вызванная Clostridium perfringens, или воспалительное заболевание кишечника. Dysbiosis is detrimental to the host, leading to inflammation and mucosal damage, which predisposes them to pathological conditions such as Clostridium perfringens infection or inflammatory bowel disease.
Ducatelle et al. в работе “Biomarkers for monitoring intestinal health in poultry: present status and future perspectives”, VETERINARY RESEARCH, vol. 49, № 1, 8 мая 2018 г. представляют обзор биомаркеров, связанных со здоровым состоянием кишечника, которые являются общеизвестными в данной области техники, такие как D-лактат в крови и печени и бутират в содержимом слепой кишки/фекалиях. Ducatelle et al. in “Biomarkers for monitoring intestinal health in poultry: present status and future perspectives”, VETERINARY RESEARCH, vol. 49, No. 1, May 8, 2018 provide an overview of biomarkers associated with gut health that are well known in the art, such as D-lactate in blood and liver and butyrate in caecal/faecal contents.
Clostridium perfringens представляет собой распространенный патоген, использующий комплекс токсинов, который вызывает гистотоксические и кишечные инфекции у животных, а также у людей. C. perfringens представляет собой грамположительный, палочковидный, спорообразующий, толерантный к кислороду анаэроб. Не все штаммы C. perfringens являются вирулентными. Как патоген животных, C. perfringens является ответственным за несколько серьезных заболеваний, в том числе некротический энтерит птиц, на борьбу с которым в системе мирового сельского хозяйства расходуется примерно 6 миллиардов долларов США в год [Wade, B., Keyburn, A.L. (2015), “The true cost of necrotic enteritis” World Poultry 31, 16–17]. Clostridium perfringens is a common toxin-using pathogen that causes histotoxic and intestinal infections in animals as well as humans. C. perfringens is a Gram-positive, rod-shaped, spore-forming, oxygen-tolerant anaerobe . Not all strains of C. perfringens are virulent. As an animal pathogen, C. perfringens is responsible for several serious diseases, including avian necrotizing enteritis, which costs approximately US$6 billion per year in global agriculture [Wade, B., Keyburn, AL (2015) , “The true cost of necrotic enteritis” World Poultry 31, 16–17].
Кроме того, нарушение микробиоты, например, вследствие лечения антибиотиками, способствует росту патогенных бактерий, таких как Salmonella (Santos RL. Pathobiology of salmonella, intestinal microbiota, and the host innate immune response. Front Immunol. 26 мая 2014 г.;5:25), Campylobacter (Agunos A, Waddell L, Léger D, Taboada E. A systematic review characterizing on-farm sources of Campylobacter spp. for broiler chickens. PLoS One. 2014;9(8):e104905. опубликовано 29 августа 2014 г. doi:10.1371/journal.pone.0104905) Escherichia coli (colibacillosis:, Yersinia enterocolitica (Mohammad M. Soltan Dallal, Michael P. Doyle, Maryam Rezadehbashi, Hossein Dabiri, Maryam Sanaei, Shabnam Modarresi, Rounak Bakhtiari, Kazem Sharifiy, Mahnaz Taremi, Mohammad R. Zali, M.K. Sharifi-Yazdi, Prevalence and antimicrobial resistance profiles of Salmonella serotypes, Campylobacter and Yersinia spp. isolated from retail chicken and beef, Tehran, Iran, Food Control, том 21, выпуск 4, 2010 г., сс. 388-392) ), и Pseudomonas (Devriese LA, Viaene NJ, Demedts G. Pseudomonas aeruginosa infection on a broiler farm. Avian Pathol. 1975;4(3):233-7). In addition, disruption of the microbiota, for example due to antibiotic treatment, promotes the growth of pathogenic bacteria such as Salmonella (Santos RL. Pathobiology of salmonella, intestinal microbiota, and the host innate immune response. Front Immunol. May 26, 2014; 5:25 ), Campylobacter (Agunos A, Waddell L, Léger D, Taboada E. A systematic review characterizing on-farm sources of Campylobacter spp. for broiler chickens. PLoS One. 2014;9(8):e104905. published 29 August 2014. doi:10.1371/journal.pone.0104905) Escherichia coli ( colibacillosis:, Yersinia enterocolitica (Mohammad M. Soltan Dallal, Michael P. Doyle, Maryam Rezadehbashi, Hossein Dabiri, Maryam Sanaei, Shabnam Modarresi, Rounak Bakhtiari, Kazem Sharifiy, Mahnaz Taremi , Mohammad R. Zali, MK Sharifi-Yazdi, Prevalence and antimicrobial resistance profiles of Salmonella serotypes, Campylobacter and Yersinia spp. isolated from retail chicken and beef, Tehran, Iran, Food Control, Volume 21, Issue 4, 2010, ss .388-392) ), and Pseudomonas (Devriese LA, Viaene NJ, Demedts G. Pseudomonas aeruginosa infection on a broiler farm. Avian Pathol. 1975;4(3):233-7).
С учетом вышеизложенного и для обеспечения возможности своевременного и целенаправленного принятия мер в отношении дисбиоза кишечника у птиц возникла острая необходимость в обеспечении быстрого и надежного неинвазивного способа ante mortem обнаружения дисбиоза у субъектов-птиц или в популяциях птиц.In view of the foregoing, and in order to enable timely and targeted action on gut dysbiosis in birds, there is an urgent need to provide a fast and reliable non-invasive ante mortem method for detecting dysbiosis in avian subjects or bird populations.
Краткое описание настоящего изобретенияBrief description of the present invention
В настоящем изобретении предусмотрен способ обнаружения дисбиоза кишечника у птиц in vitro, где способ предусматривает определение присутствия и/или уровня изолейцил-аргинина (C12H25O3N5, Mw= 287,20) или его изомеров в материале образца птиц, при этом присутствие и/или повышенный уровень изолейцил-аргинина (C12H25O3N5, Mw= 287,20) или его изомеров по сравнению с непораженным контролем свидетельствует о дисбиозе кишечника у птиц. The present invention provides a method for detecting intestinal dysbiosis in birds in vitro , wherein the method involves determining the presence and/or level of isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw=287.20) or its isomers in a bird sample material, when the presence and/or elevated levels of isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw=287.20) or its isomers compared to unaffected controls are indicative of gut dysbiosis in birds.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению изолейцил-аргинина (C12H25O3N5, Mw= 287,20) или его изомеров в качестве маркеров для обнаружения дисбиоза кишечника у птиц, для исключения необходимости в мерах по изменению рациона или терапевтических мерах, которые следует принимать в отношении дисбиоза кишечника у птиц, или для контроля эффективности диетических или терапевтических мер, которые принимают в отношении дисбиоза кишечника у птиц.In addition, the present invention relates to the use of isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw=287.20) or its isomers as markers for the detection of intestinal dysbiosis in birds, to avoid the need for dietary modification measures or therapeutic measures to be taken against avian intestinal dysbiosis, or to monitor the effectiveness of dietary or therapeutic measures taken against avian intestinal dysbiosis.
Наконец, в настоящем изобретении предусмотрен основанный на масс-спектрометрии способ обнаружения дисбиоза кишечника у птиц in vitro, при этом способ предусматривает анализ материала образца птиц на содержание изолейцил-аргинина или его изомеров (C12H25O3N5, масса/заряд = 144,61, Mw = 287,20), при этом присутствие и/или повышенный уровень указанного биомаркера указывает на дисбиоз кишечника у птиц.Finally, the present invention provides a mass spectrometry-based method for the detection of gut dysbiosis in birds in vitro , the method comprising analyzing a bird sample material for the content of isoleucyl-arginine or its isomers (C 12 H 25 O 3 N 5 , mass/charge = 144.61, Mw = 287.20), while the presence and/or elevated level of this biomarker indicates gut dysbiosis in birds.
Ключевые аспекты настоящего изобретения подробно описаны далее.Key aspects of the present invention are described in detail below.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что изолейцил-аргинин (C12H25O3N5, Mw = 287,20) или его изомеры представляют собой диагностический маркер, подходящий для обнаружения дисбиоза кишечника у птиц. The present inventors surprisingly found that isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw = 287.20) or its isomers is a diagnostic marker suitable for detecting intestinal dysbiosis in birds.
Соответственно, предусмотрен способ обнаружения дисбиоза кишечника у птиц in vitro, где способ предусматривает определение присутствия и/или уровня изолейцил-аргинина (C12H25O3N5, Mw= 287,20) или его изомеров в материале образца птиц, при этом присутствие и/или повышенный уровень изолейцил-аргинина (C12H25O3N5, Mw= 287,20) или его изомеров по сравнению с непораженным контролем свидетельствует о дисбиозе кишечника у птиц.Accordingly, a method is provided for detecting gut dysbiosis in birds in vitro , wherein the method comprises determining the presence and/or level of isoleucyl arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw=287.20) or its isomers in a bird sample material, wherein the presence and/or elevated levels of isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw=287.20) or its isomers compared to unaffected controls are indicative of gut dysbiosis in birds.
C12H25O3N5 представляет собой димерную аминокислоту, встречающуюся в форме четырех возможных изомеров: C 12 H 25 O 3 N 5 is a dimeric amino acid occurring in the form of four possible isomers:
Поскольку каждый из этих изомеров может выполнять функцию биомаркера для обнаружения дисбиоза кишечника у птиц, термин «изолейцил-аргинин», используемый в контексте настоящего изобретения, включает все четыре изомера, изображенные выше.Since each of these isomers can function as a biomarker for detecting gut dysbiosis in birds, the term "isoleucyl-arginine" as used in the context of the present invention includes all four isomers depicted above.
При использовании в контексте настоящего изобретения кишечный дисбиоз представляет собой термин, обозначающий микробный дисбаланс или дезадаптацию в желудочно-кишечном тракте, как определено выше.When used in the context of the present invention, intestinal dysbiosis is a term denoting a microbial imbalance or maladaptation in the gastrointestinal tract, as defined above.
Неповрежденный контроль представляет собой эталонный образец, представляющий подтвержденный неповрежденный желудочно-кишечный тракт. В качестве примера эталонный образец может быть получен в рамках испытания на животных от контрольного животного, не подвергнутого обработке, которого проверяли с помощью патологических, гистопатологических и/или других измерений и не обнаружили признаков дисбиоза.The intact control is a reference sample representing the confirmed intact gastrointestinal tract. As an example, a reference sample may be obtained in an animal test from an untreated control animal that has been examined by pathological, histopathological, and/or other measurements and found to be free of signs of dysbiosis.
Способ по настоящему изобретению может применяться либо для отдельного субъекта-птицы, либо для группы или популяции птиц, например, для популяции птиц, встречающейся в животноводстве.The method of the present invention can be applied either to a single bird subject or to a group or population of birds, such as a population of birds found in animal husbandry.
Субъект-птица, подлежащая тестированию, предпочтительно является домашней птицей. Предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются куры, индейки, утки и гуси. Домашняя птица может иметь характеристики, оптимальные для получения поголовья молодняка. Данный тип домашней птицы также называется родительскими и прародительскими животными. Предпочтительными родительскими и прародительскими животными, соответственно, являются (пра)родительские бройлеры, (пра)родительские утки, (пра)родительские индейки и (пра)родительские гуси.The avian subject to be tested is preferably a poultry. Preferred poultry according to the present invention are chickens, turkeys, ducks and geese. Poultry may have characteristics that are optimal for producing young stock. This type of poultry is also called parent and grandparent animals. Preferred parent and grandparent animals, respectively, are (great)parent broilers, (great)parent ducks, (great)parent turkeys and (great)parent geese.
Домашняя птица в соответствии с настоящим изобретением также может быть выбрана из декоративной птицы и пернатой дичи. Предпочтительной декоративной птицей или пернатой дичью являются павлины, фазаны, куропатки, цесарки, перепела, глухари, гуси, голуби и лебеди. Кроме того, предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются страусы и попугаи. Наиболее предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются бройлеры.Poultry according to the present invention may also be selected from ornamental birds and game birds. Preferred ornamental birds or game birds are peacocks, pheasants, partridges, guinea fowls, quails, capercaillie, geese, pigeons and swans. In addition, the preferred poultry in accordance with the present invention are ostriches and parrots. The most preferred poultry in accordance with the present invention are broilers.
Предпочтительно, материал образца птиц представляет собой или содержит материал экскрементов, в частности, фекалии птиц. Preferably, the bird sample material is or contains feces material, in particular bird feces.
Материал образца кишечника, полученный от отдельной птицы, может быть выбран из группы, состоящей из образцов содержимого кишечника, образцов экскрементов организма и их растворов или суспензий, и из материалов, загрязненных экскрементами организма. Термин «содержимое кишечника» следует понимать как содержимое тонкой кишки, содержимое толстой кишки и/или содержимое слепой кишки. Способы получения таких образцов содержимого кишечника известны в данной области техники. The intestinal sample material obtained from an individual bird may be selected from the group consisting of intestinal contents samples, body feces samples and solutions or suspensions thereof, and materials contaminated with body feces. The term "intestinal contents" should be understood as the contents of the small intestine, the contents of the large intestine and/or the contents of the caecum. Methods for obtaining such samples of intestinal contents are known in the art.
Используемые в контексте настоящего изобретения образцы экскрементов организма представляют собой фекалии или экскременты из слепой кишки. Материалы, загрязненные экскрементами организма, представляют собой, например, образцы пыли, мазковые образцы, образцы помета, образцы жидкого навоза, образцы меха, образцы перьев и образцы кожи.Used in the context of the present invention, samples of excrement of the body are feces or excrement from the caecum. Materials contaminated with body excrement are, for example, dust samples, smear samples, droppings samples, slurry samples, fur samples, feather samples and skin samples.
В целом термин «помет» следует понимать как смесь экскрементов животного с материалом подстилки. In general, the term "litter" should be understood as a mixture of animal excrement with bedding material.
Используемый в контексте данного варианта осуществления термин «образцы помета» относится к выделенным экскрементам отдельного животного. Кроме того, в контексте данного варианта осуществления термин «образцы жидкого навоза» относится к образцу экскрементов, содержащему фекалии и мочу отдельного животного.As used in the context of this embodiment, the term "litter samples" refers to the excreted feces of an individual animal. In addition, in the context of this embodiment, the term "slurry samples" refers to a feces sample containing the faeces and urine of an individual animal.
Образцы от отдельных животных также можно отбирать непосредственно у животного, например, с помощью тампонов. В качестве альтернативы и особенно в случае индивидуального содержания животных материал образца можно собирать с пола загона, клетки или настила. Материал образца должен быть обозначен в соответствии с исследуемым животным.Samples from individual animals can also be taken directly from the animal, for example using swabs. Alternatively, and especially in the case of individual housing, sample material may be collected from the pen floor, cage or deck. The sample material should be labeled according to the animal being tested.
В одном варианте осуществления материал образца кишечника, применяемый для определения того, страдает ли отдельное животное дисбиозом, представляет собой фекалии.In one embodiment, the intestinal sample material used to determine whether an individual animal is suffering from dysbiosis is faeces.
Для определенных вариантов применения также применим анализ образцов содержимого кишечника, например, образцов из тонкой кишки, образцов из толстой кишки и/или образцов из слепой кишки.For certain applications, the analysis of samples of intestinal contents, for example, samples from the small intestine, samples from the large intestine and/or samples from the cecum, is also applicable.
В альтернативном варианте осуществления способ применяют для определения того, страдает ли популяция птиц дисбиозом. В этом случае материал образца представляет собой объединенный образец, полученный от популяции птиц, подлежащей тестированию. Материал образца птиц предпочтительно представляет собой или содержит объединенные фекалии птиц, полученные от поголовья птиц. Популяция животных предпочтительно представляет собой поголовье птиц. Поголовье птиц в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой поголовье домашних птиц. Предпочтительная домашняя птица указана выше. In an alternative embodiment, the method is used to determine if a bird population is suffering from dysbiosis. In this case, the sample material is a pooled sample from the bird population to be tested. The bird sample material preferably is or contains pooled bird faeces obtained from the bird population. The animal population is preferably a bird population. The bird population according to the present invention is preferably a poultry population. Preferred poultry is listed above.
Соответственно, способ по настоящему изобретению является особенно подходящим для определения состояния здоровья популяции птиц посредством массового тестирования. Используемый в данном документе термин «массовое тестирование» относится к способу тестирования, в котором материал образца представляет собой объединенный образец от популяции животных. «Объединенный образец» в контексте данного варианта осуществления следует понимать как смешанный образец из выбранных произвольным образом отдельных образцов, при этом один образец отобран с помощью одного или более увлажненных тканевых тампонов на палочке, или объединенные образцы получены из отдельных свежих образцов, отобранных произвольным образом из ряда мест в помещении или в месте, где содержится популяция животных или поголовье животных. Перед проведением анализа образца может потребоваться гомогенизация материала образца. Подходящие методики гомогенизации известны в данной области техники. Accordingly, the method of the present invention is particularly suitable for determining the health status of a bird population through mass testing. As used herein, the term "bulk testing" refers to a testing method in which the sample material is a pooled sample from a population of animals. "Pooled sample" in the context of this embodiment should be understood as a mixed sample from randomly selected individual samples, with one sample collected using one or more moistened tissue swabs on a stick, or pooled samples obtained from separate fresh samples randomly selected from a number of places in a room or in a place where an animal population or animal population is kept. It may be necessary to homogenize the sample material prior to analysis of the sample. Suitable homogenization techniques are known in the art.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «образцы помета» означает смешанные выделенные экскременты в загоне, клетке или на настиле. Кроме того, в контексте данного варианта осуществления термин «образцы жидкого навоза» относится к смешанным образцам экскрементов, содержащим фекалии и мочу.When used in the context of the present invention, the term "samples of litter" means mixed excreted feces in a pen, cage or on a deck. In addition, in the context of this embodiment, the term "slurry samples" refers to mixed fecal samples containing feces and urine.
Такие образцы помета могут быть, например, отобраны от популяции животных с помощью методики с использованием бахил или с помощью захватов-щипцов для мусора в различных местах в загоне. Such litter samples may, for example, be collected from the animal population using shoe covers or with tongs at various locations in the pen.
Бахилы для сбора образцов с пола, обладающие достаточными поглощающими свойствами для впитывания влаги, являются особенно подходящими для отбора объединенных образцов у животных. Трубчатые марлевые чулки также приемлемы. Floor sample covers having sufficient absorbent properties to absorb moisture are particularly suitable for collecting pooled animal samples. Tubular gauze stockings are also acceptable.
В случае популяции животных, которых содержат в клетках или с напольным содержанием, образцы экскрементов могут быть отобраны с помощью ленточного транспортера. In the case of a caged or floor animal population, excrement samples can be taken using a conveyor belt.
Подходящие значения объема образца составляют, например, от 0,05 мл до 20 мл или от 0,1 до 20 мл, в частности от 0,2 до 10 мл, предпочтительно от 0,5 до 5 мл. Подходящие значения массы образца составляют, например от 0,05 г до 20 г или от 0,1 до 20 г, в частности от 0,2 до 10 г, предпочтительно от 0,5 до 5 г.Suitable sample volumes are, for example, 0.05 ml to 20 ml or 0.1 to 20 ml, in particular 0.2 to 10 ml, preferably 0.5 to 5 ml. Suitable sample weights are, for example, 0.05 g to 20 g, or 0.1 to 20 g, in particular 0.2 to 10 g, preferably 0.5 to 5 g.
Объединенные образцы отражают количество изолейцил-аргинина (C12H25O3N5, Mw = 287,20), присутствующего в популяции животных. Pooled samples reflect the amount of isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw = 287.20) present in the animal population.
Изолейцил-аргинин (C12H25O3N5, Mw = 287,20) или его изомеры можно обнаруживать и/или количественно оценивать с помощью LC-MS. В качестве альтернативы, изолейцил-аргинин (C12H25O3N5, Mw = 287,20) или его изомеры можно обнаруживать и/или количественно оценивать с помощью ферментативного анализа.Isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw = 287.20) or its isomers can be detected and/or quantified by LC-MS. Alternatively, isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw = 287.20) or its isomers can be detected and/or quantified by enzymatic analysis.
Изолейцил-аргинин (C12H25O3N5, Mw = 287,20) или его изомеры также можно обнаруживать и/или количественно оценивать с помощью жидкостной хроматографии (LC) в сочетании с пред- или послеколоночной дериватизацией и с флуоресцентным или УФ-детектированием. Таким образом, можно применять множество альтернативных протоколов пред- или послеколоночной дериватизации, такие как нингидридрин, о-фталевый альдегид (OPA), фенил-изотиоцианат (PITC), 4-(диметиламино)азобензол-4'-сульфонила (DABSYL) хлорид, 5-(диметиламино)нафталин-1-сульфонила (DANSYL) хлорид или 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамат (AQC), включая УФ- или (в основном) флуоресцентное детектирование.Isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw = 287.20) or its isomers can also be detected and/or quantified by liquid chromatography (LC) in combination with pre- or post-column derivatization and with fluorescence or UV -detection. Thus, many alternative pre- or post-column derivatization protocols can be applied, such as ninhydridrin, o-phthalaldehyde (OPA), phenyl isothiocyanate (PITC), 4-(dimethylamino)azobenzene-4'-sulfonyl (DABSYL) chloride, 5 -(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl (DANSYL) chloride or 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamate (AQC), including UV or (mostly) fluorescent detection.
В соответствии с вышеизложенным, настоящее изобретение также направлено на применение изолейцил-аргинина (C12H25O3N5, Mw = 287,20) или его изомеров в качестве маркеров для обнаружения дисбиоза кишечника у птиц.In accordance with the above, the present invention is also directed to the use of isoleucyl-arginine (C 12 H 25 O 3 N 5 , Mw = 287.20) or its isomers as markers for detecting intestinal dysbiosis in birds.
В настоящем изобретении представлены вышеуказанные способы выявления дисбиоза и, соответственно, определения его степени. Это позволяет фермеру принимать компетентное решение в плане того, следует ли принимать меры по улучшению состояния здоровья кишечника. The present invention presents the above methods for detecting dysbiosis and, accordingly, determining its degree. This allows the farmer to make an informed decision as to whether or not to take action to improve gut health.
Соответственно, способы в соответствии с настоящим изобретением можно применять для исключения необходимости мер по изменению рациона или терапевтических мер, которые следует принимать в отношении дисбиоза кишечника у птиц, или, в качестве альтернативы, для контроля эффективности диетических или терапевтических мер, которые принимают против дисбиоза кишечника у птиц.Accordingly, the methods of the present invention can be used to eliminate the need for dietary or therapeutic measures to be taken for gut dysbiosis in birds, or alternatively to monitor the effectiveness of dietary or therapeutic measures that are taken against gut dysbiosis. in birds.
Меры, направленные в отношении развития и/или прогрессирования дисбиоза, включают скармливание или введение веществ для укрепления здоровья, таких как зоотехнические кормовые добавки или терапевтические средства. Выражение «введение» или связанные с ним выражения включают пероральное введение. Пероральное введение может осуществляться с помощью питьевой воды, зонда для перорального введения, распыляемого аэрозоля или корма для животных. Термин «зоотехническая кормовая добавка» относится к любой добавке, используемой для положительного воздействия на продуктивность здоровых животных или используемой для положительного воздействия на внутреннюю среду организма. Примерами зоотехнических кормовых добавок являются усилители перевариваемости, т. е. вещества, которые при скармливании животным повышают перевариваемость рациона за счет воздействия на целевые кормовые материалы; стабилизаторы кишечной микрофлоры; микроорганизмы или другие вещества с химически установленным составом, которые при скармливании животным проявляют положительный эффект в отношении микрофлоры кишечника; или вещества, которые положительно воздействуют на внутреннюю среду организма. Предпочтительно лечебно-профилактические вещества выбраны из группы, состоящей из пробиотических средств, пребиотических средств, лекарственных средств на основе растительного сырья, органических/жирных кислот, цеолитов, бактериофагов и бактериолитических ферментов или любых их комбинаций.Measures to address the development and/or progression of dysbiosis include feeding or administering health promoting substances such as zootechnical feed additives or therapeutic agents. The expression "administration" or related expressions include oral administration. Oral administration can be by drinking water, oral tube, spray aerosol, or animal feed. The term "zootechnical feed additive" refers to any additive used to positively affect the performance of healthy animals or used to positively influence the internal environment of the body. Examples of zootechnical feed additives are digestibility enhancers, i.e. substances that, when fed to animals, increase the digestibility of the diet by affecting the target feed materials; stabilizers of intestinal microflora; microorganisms or other substances with a chemically determined composition, which, when fed to animals, show a positive effect on the intestinal microflora; or substances that have a positive effect on the internal environment of the body. Preferably, the therapeutic agents are selected from the group consisting of probiotic agents, prebiotic agents, herbal drugs, organic/fatty acids, zeolites, bacteriophages, and bacteriolytic enzymes, or any combination thereof.
Настоящее изобретение также относится к основанному на масс-спектрометрии способу обнаружения дисбиоза кишечника у птиц, при этом способ предусматривает анализ материала образца птиц на содержание изолейцил-аргинина или его изомеров (C12H25O3N5, масса/заряд = 144,61, Mw = 287,20), при этом присутствие и/или повышенный уровень указанного биомаркера указывает на дисбиоз кишечника у птиц. The present invention also relates to a mass spectrometry-based method for detecting intestinal dysbiosis in birds, the method comprising analyzing the material of a sample of birds for the content of isoleucyl-arginine or its isomers (C 12 H 25 O 3 N 5 , mass/charge = 144.61 , Mw = 287.20), while the presence and/or elevated level of this biomarker indicates intestinal dysbiosis in birds.
Предпочтительно материал образца птиц представляет собой объединенный образец фекалий. Preferably the bird sample material is a pooled fecal sample.
Вариантами применения способов в соответствии с настоящим изобретением являются, например, (i) содействие диагностированию и/или прогнозированию дисбиоза кишечника у птиц; (ii) контроль прогрессирования или повторного возникновения дисбиоза кишечника у птиц или (iii) содействие в оценке эффективности лечения популяции животных, которую подвергают лечению, или в отношении которой предполагается проведение лечения.Applications of the methods of the present invention are, for example, (i) assisting in the diagnosis and/or prediction of intestinal dysbiosis in birds; (ii) monitoring the progression or recurrence of avian intestinal dysbiosis; or (iii) assisting in evaluating the efficacy of treatment in the population of animals being treated or proposed to be treated.
Варианты применения способов в соответствии с настоящим изобретением, в частности, способствуют предотвращению снижения показателей продуктивности животных, таких как, например, прирост массы тела и конверсия корма.Embodiments of the methods of the present invention, in particular, help to prevent declines in animal performance, such as, for example, weight gain and feed conversion.
Далее настоящее изобретение проиллюстрировано неограничивающими примерами и иллюстративными вариантами осуществления. The present invention is further illustrated by non-limiting examples and illustrative embodiments.
ПримерыExamples
СпособыWays
1. Протокол экстракции для метаболического фингерпринтинга фекалий бройлеров1. Extraction Protocol for Metabolic Fingerprinting of Broiler Feces
Отвесить 100 мг фекалий в пересчете на сухой вес в пробирке объемом 15 мл.Weigh 100 mg of faeces on a dry weight basis in a 15 ml tube.
Добавить 2 мл ледяного 80% раствора MeOH. Add 2 ml of ice-cold 80% MeOH solution.
Добавить 100 мкл 100 нг·мкл^−1 валина-d8 (внутренний стандарт).Add 100 µl 100 ng µl^−1 valine-d8 (internal standard).
Перемешивать на вортекс-мешалке в течение 1 мин. и вращать в течение 2 мин. Mix on a vortex mixer for 1 min. and rotate for 2 min.
Центрифугировать при 1000 об./мин. в течение 10 мин. (при комнатной температуре).Centrifuge at 1000 rpm. within 10 min. (at room temperature).
Перенести надосадочную жидкость в пробирку объемом 15 мл. Transfer the supernatant to a 15 ml tube.
С применением шприца объемом 1 мл с иглой перенести надосадочную жидкость на PA фильтр с размером пор 0,45 мкм. Using a 1 ml syringe with a needle, transfer the supernatant to a 0.45 µm PA filter.
Собрать фильтрат в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл.Collect the filtrate in a 1.5 ml Eppendorf tube.
Разбавить (1:3, т. е., одна часть фильтрата, 2 части H2O) фильтрат сверхчистой H2O и перемешивать на вортекс-мешалке в течение 15 секунд.Dilute (1:3, i.e. one part filtrate, 2 parts H2O) the ultrapure H2O filtrate and vortex for 15 seconds.
Перенести 125 мкл фильтрата во флакон для LC-MS.Transfer 125 µl of filtrate to the LC-MS vial.
2. Жидкостная хроматография2. Liquid chromatography
Хроматографическое разделение осуществляли на насосной системе Accela UHPLC (Thermo Scientific), оснащенной колонкой Acquity HSS T3 (150 × 2,1, 1,8 мкм, Waters). Подвижная фаза состояла из 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде и 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле, применяемых для градиентного элюирования целевых соединений (таблица 1). Хроматографическое разделение данных соединений осуществляли в течение 18 минут при расходе 0,4 мл·мин^−1 и температуре термостата колонки, составляющей 45°C. Применяли программу градиента элюирования в способе LC-MS с применением 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде (растворитель A) и 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель B).Chromatographic separation was performed on an Accela UHPLC pumping system (Thermo Scientific) equipped with an Acquity HSS T3 column (150 x 2.1, 1.8 µm, Waters). The mobile phase consisted of 0.1% formic acid in water and 0.1% formic acid in acetonitrile, used for gradient elution of the target compounds (Table 1). Chromatographic separation of these compounds was carried out for 18 minutes at a flow rate of 0.4 ml min^−1 and a column oven temperature of 45°C. An LC-MS elution gradient program was used using 0.1% formic acid in water (solvent A) and 0.1% formic acid in acetonitrile (solvent B).
3. Масс-спектрометрия 3. Mass spectrometry
Применяемый масс-спектрометр ExactiveTM Orbitrap с полным сканированием и высоким разрешением (Thermo Fisher Scientific) был оснащен источником HESI-II. Масс-спектрометрический анализ выполняли в режиме переключения полярности, таким образом чередовали режим положительной и отрицательной ионизации от сканирования к сканированию. Это позволяло получать данные о положительных и отрицательных ионах во время каждого одиночного цикла. Точные масс-спектры получали в диапазоне сканирования масса/заряд 50-800 Да при разрешении по массе 100000 FWHM. Остальные инструментальные параметры представлены в таблице 2. Оптимизация этих параметров была основана на стандартной смеси, содержащей аналитические стандарты 115 полярных метаболитов.The high resolution ExactiveTM Orbitrap mass spectrometer used (Thermo Fisher Scientific) was equipped with a HESI-II source. Mass spectrometric analysis was performed in the polarity switching mode, thus alternating the positive and negative ionization mode from scan to scan. This made it possible to obtain data on positive and negative ions during each single cycle. Accurate mass spectra were obtained over a mass/charge scan range of 50-800 Da at a mass resolution of 100,000 FWHM. Other instrumental parameters are presented in Table 2. Optimization of these parameters was based on a standard mixture containing analytical standards of 115 polar metabolites.
ПримерыExamples
Цыплят-бройлеров инфицировали C. perfringens. Кроме того, вызывали кокцидиоз и дисбиоз. Образцы помета собирали для последующего анализа из загонов в соответствии со следующей таблицей.Broiler chickens were infected with C. perfringens. In addition, they caused coccidiosis and dysbiosis. Litter samples were collected for subsequent analysis from the pens according to the following table.
Таблица образцов помета для метаболомических анализов от инфицированных, неинфицированных, инфицированных непатогенными штаммами, пораженных кокцидиозом и дисбиозом цыплят-бройлеровTable of litter samples for metabolomic analyzes from infected, non-infected, infected with non-pathogenic strains, affected by coccidiosis and dysbiosis of broiler chickens
Образцы экстрагировали и анализировали с помощью LC-MS, как подробно описано в разделе «Материалы и способы» выше. Samples were extracted and analyzed by LC-MS as detailed in the Materials and Methods section above.
Испытания и полевые исследования привели к обнаружению метаболита C12H25O3N5 с высокой точной массой, соответствующей 144,6056 масса/заряд, и временем удерживания (RT), составляющим 1,49 мин., в качестве маркера дисбиоза у цыплят-бройлеров. В частности, данный метаболит характеризовался более высоким содержанием в образцах помета, полученных от птиц с дисбиозом. Данный метаболит либо отсутствовал, либо его содержание было намного ниже в образцах от здоровых птиц и птиц с NE.Testing and field studies have led to the discovery of the C 12 H 25 O 3 N 5 metabolite with a high accurate mass corresponding to 144.6056 mass/charge and a retention time (RT) of 1.49 minutes as a marker of dysbiosis in chickens. broilers. In particular, this metabolite was characterized by a higher content in litter samples obtained from birds with dysbiosis. This metabolite was either absent or much lower in samples from healthy birds and birds with NE.
Результаты представлены ниже. Рассматривали три группы птиц: (1) здоровые птицы, (2) птицы с дисбиозом и (3) птицы, страдающие некротическим энтеритом. The results are presented below. Three groups of birds were considered: (1) healthy birds, (2) birds with dysbiosis, and (3) birds suffering from necrotizing enteritis.
Интегрированные площади пиков (условные единицы), полученные для биомаркера метаболита в различных образцах помета, классифицировали как некротический энтерит (NE), дисбактериоз или здоровый. The integrated peak areas (arbitrary units) obtained for the metabolite biomarker in various litter samples were classified as necrotic enteritis (NE), dysbacteriosis, or healthy.
Фрагментационный анализFragmentation analysis
dd-MS2/dd-SIMdd-MS 2 /dd-SIM
Разрешение 17500Resolution 17500
Мишень AGC 2 e5Target AGC 2 e5
Максимальное время инъекции 80 мсMaximum injection time 80 ms
Изоляционное окно 2,0 масса/зарядIsolation window 2.0 mass/charge
NCE: 20; 35; 60NCE: 20; 35; 60
Минимальная мишень AGC 1 e4Minimum Target AGC 1 e4
Активатор верхушки от 2 до 5 сApex activator 2 to 5 s
Динамическое исключение 10,0 сDynamic exclusion 10.0 s
Спектр фрагментации C12H25O3N5 - фрагментируется при энергии 38,33 эВ Fragmentation spectrum C 12 H 25 O 3 N 5 - fragmented at an energy of 38.33 eV
На основании профиля фрагментации, изолейцил-аргинин является наиболее вероятной структурой C12H25O3N5. Однако нельзя исключать, что другие диаминокислоты (лейцил-аргинин, аргинил-изолейцин и аргинил-лейцин) соответствуют фактической природе C12H25O3N5.Based on the fragmentation profile, isoleucyl-arginine is the most likely C 12 H 25 O 3 N 5 structure. However, it cannot be excluded that other diamino acids (leucyl-arginine, arginyl-isoleucine and arginyl-leucine) correspond to the actual nature of C 12 H 25 O 3 N 5 .
Claims (4)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18212599.7 | 2018-12-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2781180C1 true RU2781180C1 (en) | 2022-10-07 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2510494C1 (en) * | 2012-07-25 | 2014-03-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет инженерных технологий" (ФГБОУ ВПО "ВГУИТ") | Method for detecting bird's dysbiosis |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2510494C1 (en) * | 2012-07-25 | 2014-03-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет инженерных технологий" (ФГБОУ ВПО "ВГУИТ") | Method for detecting bird's dysbiosis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DUCATELLE R. et al. Biomarkers for monitoring intestinal health in poultry: present status and future perspectives. Vet Res. 2018 May 8; 49(1): 43. ZHANG B. et al. Dietary L-arginine Supplementation Alleviates the Intestinal Injury and Modulates the Gut Microbiota in Broiler Chickens Challenged by Clostridium perfringens. Microbiol. 2018 July; Volume 9. Article 1716. P.1-13. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Razmi et al. | Prevalence of subclinical coccidiosis in broiler-chicken farms in the municipality of Mashhad, Khorasan, Iran | |
| Lolo et al. | Study of enrofloxacin depletion in the eggs of laying hens using diphasic dialysis extraction/purification and determinative HPLC-MS analysis | |
| Beyer et al. | Effects of ceftiofur treatment on the susceptibility of commensal porcine E. coli–comparison between treated and untreated animals housed in the same stable | |
| Gajda et al. | Oral fluid as a biological material for antemortem detection of Oxytetracycline in Pigs by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry | |
| Schreier et al. | Influence of heat stress on intestinal integrity and the caecal microbiota during Enterococcus cecorum infection in broilers | |
| CN113167803B (en) | In-vitro detection method for intestinal dysbiosis of poultry | |
| Sallam et al. | Health risk assessment of antimicrobial residues in sheep carcasses marketed in Kuwait | |
| RU2781180C1 (en) | Method for detecting intestinal dysbiosis in birds in vitro | |
| Khalil et al. | Residue withdrawal of florfenicol from the serum and edible tissues of broiler chickens | |
| RU2770104C2 (en) | In vitro method for detecting intestinal barrier insufficiency in animals by determining ovotransferrin | |
| EP4042165A1 (en) | 2-methylbutyrate, a biomarker for improvements of mood disorders | |
| M Choma et al. | Comparison of deproteinization methods used before TLC-DB and HPLC analysis of flumequine residues in milk | |
| Li et al. | Determination of sulphachloropyrazine-diaveridine residues by high performance liquid chromatography in broiler edible tissues | |
| Mahmoudi et al. | Determination of enrofloxacin residue in chicken eggs using FPT and ELISA methods | |
| de Castro et al. | Safety of an Intravenous Formulation of Voriconazole as an Intramuscular Injection in Pigeons (Columba livia f. domestica) | |
| Luo et al. | Andrographolide restored production performances and serum biochemical indexes and attenuated organs damage in Mycoplasma gallisepticum-infected broilers | |
| Yang et al. | Study of danofloxacin depletion in eggs of laying hens after oral administration | |
| Al-Gendy et al. | Assessment of oxytetracycline and ampicillin residues in sheep carcasses | |
| Scheuerle | Anthelmintic resistance of Haemonchus contortus and the famacha C-method as a tool to delay the development of anthelmintic resistance | |
| Elsayed et al. | Determination of Antibiotic Residues in Boiler Chickens by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry | |
| Said et al. | Detection of Tilmicosin Residues by HPLC and its Effect on Cardiac Enzymes and Hematology in Broiler Chickens | |
| Redondo et al. | Tannins and gut health in broilers: Effects of a blend of chestnut and quebracho tannins on gut health and performance of broiler chickens | |
| Arslan et al. | Comparative evaluation of the effects of florfenicol and tulathromycin on clinical recovery and acute phase proteins in undifferentiated natural bovine respiratory disease | |
| Acik et al. | Does Mutual Effect of Arcobacter butzleri and Stress in Mice Lead to Gastric Ulcer? | |
| Pintér et al. | Antimicrobial susceptibility of Pasteurella multocida strains isolated from different host species |