RU2780954C1 - Method for application of phycobiliproteins as optical sensors of local temperature in living cells and tissues - Google Patents
Method for application of phycobiliproteins as optical sensors of local temperature in living cells and tissues Download PDFInfo
- Publication number
- RU2780954C1 RU2780954C1 RU2021134204A RU2021134204A RU2780954C1 RU 2780954 C1 RU2780954 C1 RU 2780954C1 RU 2021134204 A RU2021134204 A RU 2021134204A RU 2021134204 A RU2021134204 A RU 2021134204A RU 2780954 C1 RU2780954 C1 RU 2780954C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fluorescence
- temperature
- phycobiliproteins
- tissues
- cells
- Prior art date
Links
- 108060006184 phycobiliprotein family Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 230000003287 optical Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 14
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 10
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 claims description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 3
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 claims 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 49
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000002292 fluorescence lifetime imaging microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 6
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 6
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 6
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 6
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000002609 media Substances 0.000 description 6
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000001685 time-resolved fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- HPTJABJPZMULFH-UHFFFAOYSA-N 12-(cyclohexylcarbamoylamino)dodecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCNC(=O)NC1CCCCC1 HPTJABJPZMULFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N Actinospectacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 210000001163 Endosomes Anatomy 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 210000003712 Lysosomes Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 101710045361 aunc Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005274 electronic transitions Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000000198 fluorescence anisotropy Methods 0.000 description 1
- 238000001857 fluorescence decay curve Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002113 nanodiamond Substances 0.000 description 1
- 230000001443 photoexcitation Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229910052904 quartz Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 230000028016 temperature homeostasis Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000000482 two photon fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- 238000007794 visualization technique Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к биотехнологии. Более подробно изобретение относится к технологиям, в частности к методикам определения температуры растворов и локальной температуры клеток и тканей. Группа изобретений может найти свое применение в качестве методики расширения функциональных возможностей in vivo микроскопии, метода FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), микроскопии сверхвысокого разрешения (SIM и STORM).The invention relates to biotechnology. In more detail the invention relates to technologies, in particular to methods for determining the temperature of solutions and the local temperature of cells and tissues. The group of inventions can be used as a technique for expanding the functionality of in vivo microscopy, the FLIM method (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), ultra-high resolution microscopy (SIM and STORM).
Уровень техникиState of the art
Терморегуляция - важнейший физиологический процесс в организме, регулирующийся на молекулярном уровне. Температура оказывает влияние на состояние и динамику молекул. Изменение температуры тела в целом или локальные изменения температуры на уровне отдельных клеток и тканей может происходить в ответ на различные стимулы и может применяться в качестве индикатора различных процессов, в том числе ассоциированных с патологическими состояниями организма, например изменения уровня экспрессии специфичных генов, активности ферментов, активацию ионных каналов и т.д. Так, известно, что развитие злокачественных новообразований, локализованные и системные инфекции, а также другие патологические состояния организма сопровождается повышенным тепловыделением [doi: 10.1111/j.1600-0609.1986.tb01749.x; doi: 10.1016/0002-9610(69)90090-7]. В последние годы активно ведется поиск способов детекции изменения температуры внутри клеток и тканей. Такие способы могут найти применение в диагностике ряда заболевания, в том числе ранней диагностики опухолей, а также для тестирования и определения цитотоксичности новых фармпрепаратов.Thermoregulation is the most important physiological process in the body, regulated at the molecular level. Temperature affects the state and dynamics of molecules. A change in body temperature as a whole or local changes in temperature at the level of individual cells and tissues can occur in response to various stimuli and can be used as an indicator of various processes, including those associated with pathological conditions of the body, for example, changes in the level of expression of specific genes, enzyme activity, activation of ion channels, etc. Thus, it is known that the development of malignant neoplasms, localized and systemic infections, as well as other pathological conditions of the body, is accompanied by increased heat release [doi: 10.1111/j.1600-0609.1986.tb01749.x; doi: 10.1016/0002-9610(69)90090-7]. In recent years, there has been an active search for ways to detect temperature changes inside cells and tissues. Such methods can find application in the diagnosis of a number of diseases, including the early diagnosis of tumors, as well as for testing and determining the cytotoxicity of new pharmaceuticals.
Из уровня техники известен ряд подходов к измерению температуры внутри клеток на основе флуоресцентных термосенсоров, которые можно разделить на несколько групп по способу детекции изменения температуры: измерение интенсивности фосфоресценции, измерение интенсивности флуоресценции, измерение интенсивности люминесценции, измерение времени жизни флуоресценции, вычисление отношения времени жизни флуоресценции к интенсивности флуоресценции, вычисление соотношения интенсивности флуоресценции двух или более молекул, измерение анизотропии флуоресценции, вычисление нормализованной флуоресценции, использование двухфотонной флуоресцентной микроскопии и квантовых точек и др. В качестве материалов термосенсоров используются комплексы металлов и флуоресцентных красителей, наноалмазы, нанокластеры золота, квантовые точки, наночастицы, флуоресцентные белки, красители и трейсеры, доставляемые внутрь клетки посредством липосом, физического контакта микропипетки с клеткой, интернализации клеткой из окружающей среды, микроинъекций, трансфекции, вирусов, инъекции мРНК, эндоцитоза [doi: 10.1007/s00424-018-2113-4]. Известные из уровня техники решения, касающиеся внутриклеточного определения температуры на основе измерения времени жизни флуоресценции [doi: 10.1016/j.snb.2017.06.041, doi: 10.1371/journal.pone.0117677, doi: 10.1002/anie.201306366, и doi: 10.1021/ac402128f] предлагают использовать либо инвазивные методы доставки термосенсора в клетки, например микроинъекции, либо интернализацию клетками комплексов на основе полиакриламидного полимера или эндоцитоз кластеров золота AuNC, которые накапливаются в эндосомах и лизосомах. Применение инвазивных методов доставки термосенсора, использование токсичных или влияющих на метаболизм клеток агентов в качестве термосенсоров не влияет на точность измерения температуры внутри клетки, но отражается на интерпретации взаимосвязи изменения внутриклеточной температуры и процессов, стимулировавших изменение температуры, что осложняет применение таких термосенсоров для индикации специфических внутриклеточных процессов и диагностики патологических состояний организма.From the prior art, a number of approaches to measuring the temperature inside cells based on fluorescent thermal sensors are known, which can be divided into several groups according to the method of detecting temperature changes: measuring the intensity of phosphorescence, measuring the intensity of fluorescence, measuring the intensity of luminescence, measuring the fluorescence lifetime, calculating the ratio of the fluorescence lifetime to fluorescence intensity, calculation of the ratio of fluorescence intensity of two or more molecules, measurement of fluorescence anisotropy, calculation of normalized fluorescence, use of two-photon fluorescence microscopy and quantum dots, etc. As materials for thermal sensors, metal complexes and fluorescent dyes, nanodiamonds, gold nanoclusters, quantum dots, nanoparticles, fluorescent proteins, dyes and tracers delivered inside the cell via liposomes, physical contact of the micropipette with the cell, internalization by the cell from the environment media, microinjection, transfection, viruses, mRNA injection, endocytosis [doi: 10.1007/s00424-018-2113-4]. Prior art solutions regarding intracellular temperature determination based on fluorescence lifetime measurement [doi: 10.1016/j.snb.2017.06.041, doi: 10.1371/journal.pone.0117677, doi: 10.1002/anie.201306366, and doi: 10.1021/ac402128f] propose to use either invasive methods for delivering a thermosensor into cells, such as microinjections, or internalization by cells of complexes based on a polyacrylamide polymer or endocytosis of AuNC gold clusters that accumulate in endosomes and lysosomes. The use of invasive thermosensor delivery methods, the use of toxic agents or agents affecting cell metabolism as thermosensors does not affect the accuracy of temperature measurement inside the cell, but affects the interpretation of the relationship between changes in intracellular temperature and the processes that stimulated temperature changes, which complicates the use of such thermosensors to indicate specific intracellular processes and diagnostics of pathological conditions of the body.
Наиболее близкое решение по отношению к заявляемому способу, известное из уровня техники, раскрыто в патентом документе US 7413341 B1 «Imaging methods» («Методы визуализации»), который защищает способ локального определения температуры в одной или нескольких точках образца, содержащего флуорофор, например, флуоресцентный краситель, флуоресцентные наночастицы или флуоресцентный белок, в месте, измерения температуры. При этом флуорофор, применимый в данном изобретении должен обеспечивать излучение стоксовой флуоресценции и антистоксовой флуоресценции. А определение температуры осуществляется по интенсивности антистоксовой и стоксовой флуоресценции с использованием распределения Больцмана, в случае, если концентрация флуорофора в точке измерения неизвестна и с использованием калибровочной кривой зависимости температуры от интенсивности анти-стоксовой флуоресценции, если концентрация флуорофора в точке измерения образца известна. В качестве образцов для измерения температуры по данному способу могут быть использованы отдельные клетки, несколько клеток или ткани. При этом в документе не раскрыта чувствительность и точность измерения температуры по данному способу. Недостатками данного способа является низкая чувствительность и точность определения температуры по интенсивности флуоресценции и зависимость от концентрации, существенный вклад в получаемые значения интенсивности флуоресценции, на основе которых определяется температура, вносят конструкционные особенности образца. The closest solution in relation to the claimed method, known from the prior art, is disclosed in the patent document US 7413341 B1 "Imaging methods" ("Visualization methods"), which protects the method of local determination of temperature at one or more points of a sample containing a fluorophore, for example, fluorescent dye, fluorescent nanoparticles or fluorescent protein, in situ, temperature measurement. In this case, the fluorophore applicable in this invention must provide the emission of Stokes fluorescence and anti-Stokes fluorescence. And the determination of temperature is carried out by the intensity of anti-Stokes and Stokes fluorescence using the Boltzmann distribution, if the concentration of the fluorophore at the measurement point is unknown and using the calibration curve of the dependence of temperature on the intensity of anti-Stokes fluorescence, if the concentration of the fluorophore at the measurement point of the sample is known. Single cells, multiple cells, or tissues can be used as samples for measuring temperature in this method. However, the document does not disclose the sensitivity and accuracy of temperature measurement by this method. The disadvantages of this method are the low sensitivity and accuracy of determining the temperature from the fluorescence intensity and concentration dependence, a significant contribution to the obtained values of the fluorescence intensity, on the basis of which the temperature is determined, is made by the design features of the sample.
Раскрытие изобретения Disclosure of invention
В заявляемом изобретении предложено использование флуоресцентных пигмент-белковых комплексов - фикобилипротеинов - в качестве оптических температурных сенсоров. Получение информации о температуре локального окружения белка-сенсора осуществляется с помощью время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии и микроскопии. При этом регистрируются спектрально-временные характеристики флуоресценции фикобилипротеинов при возбуждении квантами с энергией, не превышающей энергию уровня S0-S1 поглощения - так называемая «антистоксова флуоресценция». Такой режим фотовозбуждения позволяет селективно регистрировать оптический ответ конформационно-активных хромофоров с отличным от основного состояния временем жизни с помощью время-разрешенной спектрофлуориметрии в импульсном режиме. Данный способ регистрации флуоресценции может быть использован для получения функциональных изображений клеток и тканей, оценки их метаболического состояния и исследования влияния факторов среды и различных воздействий.The claimed invention proposes the use of fluorescent pigment-protein complexes - phycobiliproteins - as optical temperature sensors. Obtaining information about the temperature of the local environment of the sensor protein is carried out using time-resolved fluorescence spectroscopy and microscopy. In this case, the spectral-temporal characteristics of the fluorescence of phycobiliproteins are recorded when excited by quanta with an energy not exceeding the energy of the S0-S1 absorption level - the so-called "anti-Stokes fluorescence". This mode of photoexcitation makes it possible to selectively record the optical response of conformationally active chromophores with a lifetime different from the ground state using time-resolved pulsed spectrofluorometry. This method of fluorescence registration can be used to obtain functional images of cells and tissues, assess their metabolic state and study the influence of environmental factors and various influences.
Фикобилипротеины широко применяются в биолюминесцентных методах анализа за счет высокой фотостабильности и квантового выхода флуоресценции, а также низкой токсичности для живых организмов. На основе представлений о структуре данных пигмент-белковых комплексов и конформационной подвижности хромофоров предлагается использование этих белков для визуализации локальной температуры с возможностью высокого пространственного разрешения.Phycobiliproteins are widely used in bioluminescent methods of analysis due to their high photostability and fluorescence quantum yield, as well as low toxicity to living organisms. Based on the ideas about the structure of these pigment-protein complexes and the conformational mobility of chromophores, it is proposed to use these proteins for visualizing local temperature with the possibility of high spatial resolution.
Задачей изобретения является разработка оптического способа измерения локальной температуры с высокой точностью (от 0,1°С до 0,3°С) и возможностью измерения с высоким пространственным разрешением (до 300 нм) в биологических средах (клетках и тканях), содержащих фикобилипротеины в различных конформационных состояниях. Анализ гетерогенности распределения конформационных состояний и связанных с ними спектрально-кинетических параметров осуществляется за счет регистрации кинетики затухания антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов в клетках и тканях.The objective of the invention is to develop an optical method for measuring local temperature with high accuracy (from 0.1°C to 0.3°C) and the ability to measure with high spatial resolution (up to 300 nm) in biological media (cells and tissues) containing phycobiliproteins in various conformational states. Analysis of the heterogeneity of the distribution of conformational states and the associated spectral-kinetic parameters is carried out by recording the decay kinetics of the anti-Stokes fluorescence of phycobiliproteins in cells and tissues.
Техническим результатом, достигаемым заявленным изобретением, является обеспечение возможности функциональной визуализации локальной температуры клеток и тканей за счет использования явления конформационной подвижности хромофоров фикобилипротеинов, время жизни флуоресценции которых при возбуждении инфракрасным светом от 750 до 790 нм зависит от локальной температуры.The technical result achieved by the claimed invention is to enable functional visualization of the local temperature of cells and tissues by using the phenomenon of conformational mobility of phycobiliprotein chromophores, the fluorescence lifetime of which, when excited by infrared light from 750 to 790 nm, depends on the local temperature.
Генетический материал, кодирующий апо-формы фикобилипротеинов и необходимый для синтеза билиновых хромофоров фикобилипротеинов, доставляется в клетки с помощью стандартных трансфекционных агентов, благодаря чему в клетках экспрессируются холо-формы белков. Для визуализации функционального состояния клеточных ассоциаций и тканей могут быть использованы химерные конструкции (коньюгаты) фикобилипротеинов и специфических антител.The genetic material encoding the apo-forms of phycobiliproteins and necessary for the synthesis of biline chromophores of phycobiliproteins is delivered to cells using standard transfection agents, due to which holo-forms of proteins are expressed in cells. To visualize the functional state of cell associations and tissues, chimeric constructs (conjugates) of phycobiliproteins and specific antibodies can be used.
Заявляемый способ характеризуется надежностью, простотой интерпретации результатов, возможностью работать с тканями на значительной глубине благодаря способности фикобилипротеинов (фикоцианина и аллофикоцианина) флуоресцировать и возбуждаться в диапазонах длин волн, прозрачных для клеток и тканей (длины волн флуоресценции 600-750 нм, длины волн возбуждения антистоксовой флюоресценции - 750-790 нм; фиг. 1), отсутствием необходимости дополнительных расходных материалов и специальных навыков персонала, что позволит быстро и широко внедрить его в практику. The proposed method is characterized by reliability, ease of interpretation of the results, the ability to work with tissues at a considerable depth due to the ability of phycobiliproteins (phycocyanin and allophycocyanin) to fluoresce and be excited in the wavelength ranges that are transparent to cells and tissues (fluorescence wavelengths 600-750 nm, anti-Stokes excitation wavelengths fluorescence - 750-790 nm; Fig. 1), the absence of the need for additional consumables and special skills of the staff, which will quickly and widely introduce it into practice.
Применение фикобилипротеинов в качестве оптических сенсоров локальной температуры в живых клетках и тканях включает следующие шаги:The use of phycobiliproteins as optical sensors of local temperature in living cells and tissues includes the following steps:
1. Проведение контрольных калибровочных исследований на фикобилипротеинах в растворе натрий-фосфатного буфера с pH 7,8 или в буферном растворе, соответствующем по составу и параметрам среде целевого образца, в диапазоне температур от 10 до 45°С методом импульсной время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии (фиг. 2);1. Carrying out control calibration studies on phycobiliproteins in a sodium phosphate buffer solution with pH 7.8 or in a buffer solution corresponding in composition and parameters to the medium of the target sample, in the temperature range from 10 to 45°C by the method of pulsed time-resolved fluorescence spectroscopy ( Fig. 2);
2. Окрашивание клеток или тканей за счет: (1) доставки генетического материала, позволяющего клеткам самостоятельно синтезировать хромофоры и белковую матрицу флуоресцентных белков; или (2) добавления в культуральную среду конъюгатов фикобилипротеинов с антителами, специфическими к рецепторам на поверхности плазматической мембраны целевых клеток.2. Staining of cells or tissues due to: (1) delivery of genetic material that allows cells to independently synthesize chromophores and a protein matrix of fluorescent proteins; or (2) adding to the culture medium conjugates of phycobiliproteins with antibodies specific for receptors on the plasma membrane surface of target cells.
3. Проведение измерений кинетики затухания антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов, находящихся в клетках и тканях, с помощью время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии или микроскопии (фиг. 2 и фиг. 3) и определение значения температуры по калибровочной кривой.3. Carrying out measurements of the decay kinetics of anti-Stokes fluorescence of phycobiliproteins located in cells and tissues using time-resolved fluorescence spectroscopy or microscopy (Fig. 2 and Fig. 3) and determining the temperature value from the calibration curve.
Фикобилипротеины фикоцианин и аллофикоцианин представляют собой водорастворимые белки, состоящие из субъединиц с молекулярной массой около 17 кДа. Взаимодействие хромофора и белковой матицы обуславливает специфической для различных типов фикобилипротеинов спектр флуоресценции в диапазоне от 600 до 750 нм. Такие значения энергий квантов флуоресценции являются оптимальными для получения флуоресцентных изображений клеток и тканей, так как совпадают с «окном прозрачности» биологических тканей. Хромофор фикобилипротеинов связан с белковой матрицей за счет ковалентной связи со специфическим остатком цистеина. Высокий квантовый выход флуоресценции (и времена жизни возбужденного состояния порядка 1.5 нс) достигаются за счет поддержания планарной структуры хромофора за счет нековалентных взаимодействий хромофора в локальном окружении белковой матрицы. Такие белок-хромофорные взаимодействия могут значительно изменяться в зависимости от внешних условий и, соответственно, чувствительны к локальному окружению хромофора, что определяет возможность наблюдения за состоянием белка и конформационной подвижностью хромофора с помощью оптических методов. Денатурирующие воздействия способны значительно менять конформацию белка и связанного хромофора, что сопровождается изменениями времени жизни флуоресценции фикобилипротеинов. В нормальных условиях фикобилипротеины характеризуются значительной стабильностью и гомогенностью наблюдаемых распределений спектрально-временных характеристик. Однако, наши экспериментальные данные показывают, что даже при нормальных условиях часть популяции хромофоров может находиться в измененном состоянии за счет флуктуаций тепловой энергии окружающей среды, вероятно, вызывающих изменения белок-белковых контактов между субъединицами фикобилипротеинов. Визуализация таких особых состояний хромофоров возможна за счет селективного возбуждения флуоресценции квантами с низкой энергией. При этом возбуждаются электронные переходы в колебательно-возбужденных состояниях хромофоров, которые, по всей видимости обладают большей конформационной подвижностью и, соответственно, более короткими временами жизни возбужденного состояния. Заселенность таких состояний и, соответственно, интенсивность антистоксовой флуоресценции зависит от температуры среды. Анализ спектрально-временных характеристик антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов показывает, что именно время жизни является наиболее чувствительным параметром для детектирования нетипичных конформационных состояний хромофоров, поэтому использование импульсной флуориметрии открывает новые возможности для использования этих флуоресцентных пигмент-белковых комплексов для решения задач биологического имиджинга и регистрации локальной температуры.The phycobiliproteins phycocyanin and allophycocyanin are water-soluble proteins composed of subunits with a molecular weight of about 17 kDa. The interaction of the chromophore and the protein matrix determines the fluorescence spectrum specific for various types of phycobiliproteins in the range from 600 to 750 nm. Such values of fluorescence photon energies are optimal for obtaining fluorescent images of cells and tissues, since they coincide with the “transparency window” of biological tissues. The phycobiliprotein chromophore is bound to the protein matrix by covalent bonding to a specific cysteine residue. The high quantum yield of fluorescence (and the lifetime of the excited state of about 1.5 ns) is achieved by maintaining the planar structure of the chromophore due to non-covalent interactions of the chromophore in the local environment of the protein matrix. Such protein-chromophore interactions can significantly change depending on external conditions and, accordingly, are sensitive to the local environment of the chromophore, which determines the possibility of observing the state of the protein and the conformational mobility of the chromophore using optical methods. Denaturing effects can significantly change the conformation of the protein and associated chromophore, which is accompanied by changes in the fluorescence lifetime of phycobiliproteins. Under normal conditions, phycobiliproteins are characterized by significant stability and homogeneity of the observed distributions of spectral and temporal characteristics. However, our experimental data show that even under normal conditions, a part of the chromophore population may be in an altered state due to fluctuations in the thermal energy of the environment, probably causing changes in protein-protein contacts between phycobiliprotein subunits. Visualization of such special states of chromophores is possible due to the selective excitation of fluorescence by low-energy quanta. In this case, electronic transitions are excited in the vibrationally excited states of chromophores, which, apparently, have greater conformational mobility and, accordingly, shorter lifetimes of the excited state. The population of such states and, accordingly, the intensity of anti-Stokes fluorescence depends on the temperature of the medium. An analysis of the spectral and temporal characteristics of the anti-Stokes fluorescence of phycobiliproteins shows that it is the lifetime that is the most sensitive parameter for detecting atypical conformational states of chromophores; therefore, the use of pulsed fluorimetry opens up new possibilities for using these fluorescent pigment-protein complexes for solving problems of biological imaging and recording local temperature.
Для получения калибровочной зависимости времени жизни флуоресценции от температуры белки могут выделяться из природных источников или нарабатываться в бактериальной системе экспрессии по стандартной методике, например, описанной в статье [doi: 10.1007/s10529-008-9644-2].To obtain a calibration dependence of the fluorescence lifetime on temperature, proteins can be isolated from natural sources or produced in a bacterial expression system according to a standard method, for example, described in the article [doi: 10.1007/s10529-008-9644-2].
Полученные таким образом фикобилипротеины характеризуются следующими параметрами: для альфа-фикоцианина характерный диапазон поглощения (переход S0-S1) от 500 до 750 нм с максимумом поглощения 623 нм и спектра флуоресценции от 600 до 800 нм с максимумом интенсивности флуоресценции на 645 нм, для альфа-аллофикоцианина характерный диапазон спектра поглощения от 500 до 750 нм с максимумом поглощения 626 нм и спектра флуоресценции от 600 до 800 нм с максимумом интенсивности флуоресценции на 640 нм. Различные конформационные состояния хромофоров фикобилипротеинов характеризуются отличающимися длинами волн поглощения и эмиссии флуоресценции, величинами квантовых выходов флуоресценции и временами жизни возбужденных состояний, благодаря чему раствор фикобилипротеинов обладает гетерогенностью. В спектрах поглощения и флуоресценции можно выделить два состояния: «красное» (длинноволновое) и «синее» (коротковолновое). При возбуждении антистоксовой флуоресценции квантами низкоэнергетического излучения с длиной волны приблизительно 750 нм наблюдается более селективное возбуждение красных (длинноволновых) состояний хромофоров фикобилипротеинов, благодаря чему спектры эмиссии флуоресценции смещаются на несколько нм в красную область для альфа-субъединиц фикоцианина и аллофикоцианина (фиг. 1).The phycobiliproteins obtained in this way are characterized by the following parameters: for alpha-phycocyanin, the characteristic absorption range (S 0 -S 1 transition) is from 500 to 750 nm with an absorption maximum of 623 nm and a fluorescence spectrum from 600 to 800 nm with a fluorescence intensity maximum at 645 nm, for alpha allophycocyanin has a characteristic absorption spectrum range from 500 to 750 nm with an absorption maximum of 626 nm and a fluorescence spectrum from 600 to 800 nm with a fluorescence intensity maximum at 640 nm. Different conformational states of phycobiliprotein chromophores are characterized by different fluorescence absorption and emission wavelengths, fluorescence quantum yields, and lifetimes of excited states, due to which the phycobiliprotein solution is heterogeneous. Two states can be distinguished in the absorption and fluorescence spectra: "red" (long wavelength) and "blue" (short wavelength). Upon excitation of anti-Stokes fluorescence by low-energy radiation quanta with a wavelength of approximately 750 nm, a more selective excitation of the red (long-wavelength) states of phycobiliprotein chromophores is observed, due to which the fluorescence emission spectra are red-shifted by several nm for the alpha subunits of phycocyanin and allophycocyanin (Fig. 1).
Флуоресценция различных состояний хромофора характеризуется различиями в временах затухания флуоресценции, которые можно детектировать методами время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии, например методом счета одиночных фотонов с помощью гибридных детекторов со следующими характеристиками: квантовой эффективностью детекции эмиссии образца в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм не менее 10%, разбросом времени детектирования фотонов не более 180 пс. При использовании метода счета одиночных фотонов должно быть использовано импульсное возбуждающее лазерное излучение с частотой импульсов до 80 МГц, длительностью импульса не более 30 пс, длиной волны излучения от 750 до 790 нм и энергией одиночного импульса не менее 10 пДж. Полученные с помощью метода счета одиночных фотонов кинетики затухания флуоресценции аппроксимируют суммой одной или двух затухающих экспоненциальных функций, подбирая свободные параметры модели так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимальным.The fluorescence of different chromophore states is characterized by differences in fluorescence decay times, which can be detected by time-resolved fluorescence spectroscopy, for example, by single photon counting using hybrid detectors with the following characteristics: quantum efficiency of sample emission detection in the wavelength range from 600 to 750 nm, not less 10%, spread of photon detection time no more than 180 ps. When using the single photon counting method, pulsed exciting laser radiation with a pulse frequency of up to 80 MHz, a pulse duration of not more than 30 ps, a radiation wavelength of 750 to 790 nm and a single pulse energy of at least 10 pJ should be used. The fluorescence decay kinetics obtained using the single photon counting method are approximated by the sum of one or two decaying exponential functions, selecting the free parameters of the model so that the value of the sum of the squared discrepancies between the experimental data and the exponential function is minimal.
При возбуждении стоксовой флуоресценции высокоэнергетическими квантами (энергия кванта больше энергии S0-S1) возбуждается преимущественно синяя форма хромофора с временами жизни флуоресценции 1600±500 пс, поэтому в кинетике затухания флуоресценции выявляется только одна компонента. В отличие от обычной стоксовой флуоресценции фикобилипротеинов, в кинетике затухания антистоксовой флуоресценции существуют две компоненты с характерными временами 300±100 пс и 1600±500 пс, амплитуды которых, а также среднее характерное время жизни флуоресценции линейно зависят от температуры среды (фиг. 2). Для калибровки зависимости характерных времен жизни флуоресценции от температуры должен быть использован раствор фикобилипротеина в натрий-фосфатном буфере с pH 7,8 в концентрации не более 10 мкг на мл, чтобы значение оптической плотности не превышало 0,1 оптических единиц для предотвращения эффектов перепоглощения флуоресценции.When Stokes fluorescence is excited by high-energy quanta (the energy of a quantum is greater than the energy of S 0 -S 1 ), a predominantly blue form of the chromophore is excited with a fluorescence lifetime of 1600 ± 500 ps; therefore, only one component is detected in the fluorescence decay kinetics. In contrast to the usual Stokes fluorescence of phycobiliproteins, in the decay kinetics of anti-Stokes fluorescence there are two components with characteristic times of 300 ± 100 ps and 1600 ± 500 ps, the amplitudes of which, as well as the average characteristic fluorescence lifetime, linearly depend on the temperature of the medium (Fig. 2). To calibrate the dependence of characteristic fluorescence lifetimes on temperature, a solution of phycobiliprotein in sodium phosphate buffer with pH 7.8 should be used at a concentration of no more than 10 μg per ml so that the optical density value does not exceed 0.1 optical units to prevent fluorescence reabsorption effects.
Калибровка получена для диапазона от 10 до 45°С с шагом 0,1°С при стабилизации необходимой температуры с помощью термостатируемого кюветного отделения, стенки которого представляют из себя элементы Пельтье с системой водяного охлаждения. Запись каждой кинетики начиналась после достижения необходимой температуры раствора, определяемой с помощью термопары, погруженной в белковый раствор.Calibration was obtained for the range from 10 to 45°C in steps of 0.1°C with the stabilization of the required temperature using a thermostatically controlled cell compartment, the walls of which are Peltier elements with a water cooling system. The recording of each kinetics began after reaching the required temperature of the solution, which was determined using a thermocouple immersed in the protein solution.
За счет своей известной структуры фикобилипротеины могут быть использованы в качестве генетически кодируемых температурных сенсоров в культурах животных клеток и тканях. Для использования в клетках нужно трансфецировать клеточную линию или первичную культуру согласно стандартным протоколам (желательная эффективность трансфекции больше 10%). Возможна также разработка стабильных клеточных линий, экспрессирующих фикобилипротеины, с применением стандартных методик, принятых в лабораторной практике, например методом трансдукции на основе вирусных векторов. Для стабильной экспрессии белков в животных клетках генетический материал, необходимый для получения холо-форм фикобилипротеинов альфа-фикоцианина и альфа-аллофикоцианина [doi: 10.1007/s10529-008-9644-2], может быть оптимизирован для использования кодонов искусственного гена, например, с помощью популярных программ Codon optimizer [doi: 10.1016/s1046-5928(03)00213-4] и OPTIMIZER [doi: 10.1093/nar/gkm219]. Кроме того, методика поддерживает также измерение температуры клеток или тканей, окрашенных фикобилипротеинами, например с помощью стандартных методик мечения клеточной поверхности антителами к специфическим или неспецифическим антигенам, включая обработку клеток или тканей антителами, меченными молекулами биотина, и последующую окраску стрептавидин-фикобилипротеином, например, стрептавидин-аллофикоцианином. Пример стандартной методики окраски клеточной поверхности стрептавидин-аллофикоцианином представлен в работе [doi: 10.1002/stem.1233].Due to their known structure, phycobiliproteins can be used as genetically encoded temperature sensors in animal cell cultures and tissues. For use in cells, the cell line or primary culture must be transfected according to standard protocols (desired transfection efficiency greater than 10%). It is also possible to develop stable cell lines expressing phycobiliproteins using standard laboratory techniques, such as viral vector-based transduction. For stable expression of proteins in animal cells, the genetic material required for the production of holo-forms of phycobiliproteins alpha-phycocyanin and alpha-allophycocyanin [doi: 10.1007/s10529-008-9644-2] can be optimized for the use of artificial gene codons, for example, with using popular programs Codon optimizer [doi: 10.1016/s1046-5928(03)00213-4] and OPTIMIZER [doi: 10.1093/nar/gkm219]. In addition, the method also supports the measurement of the temperature of cells or tissues stained with phycobiliproteins, for example, using standard techniques for labeling the cell surface with antibodies to specific or non-specific antigens, including treating cells or tissues with antibodies labeled with biotin molecules and subsequent staining with streptavidin-phycobiliprotein, for example, streptavidin allophycocyanin. An example of a standard technique for staining the cell surface with streptavidin-allophycocyanin is presented in [doi: 10.1002/stem.1233].
После модификации клеток генетическим материалом, позволяющим экспрессировать холо-формы фикобилипротеинов, или окраски клеток возможно измерение их температуры путем измерения кинетик затухания антистоксовой флуоресценции фикобилипротеинов. Измерение температуры возможно при использовании спектрометра с возможностью измерения время-разрешенных характеристик флуоресценции (фиг. 2), если не требуется получить пространственную картину распределения температур в клетке, что может быть использовано для проточной флуоресцентной цитометрии. В этом случае, требования к лазерному оборудованию и детектору будут аналогичными требованию для оборудования для получения калибровки времен затухания флуоресценции от температуры, изложенной выше, а значение среднего характерного времени затухания флуоресценции, полученного с помощью экспоненциального анализа экспериментальной кинетики затухания флуоресценции, будет однозначно указывать на среднюю температуру области образца, с которой детектировался флюоресцентный сигнал, согласно калибровочной зависимости, полученной ранее для раствора флуоресцентных белков.After cells have been modified with genetic material to express holo-forms of phycobiliproteins, or cells have been stained, their temperature can be measured by measuring the decay kinetics of anti-Stokes fluorescence of phycobiliproteins. Temperature measurement is possible using a spectrometer with the ability to measure time-resolved fluorescence characteristics (Fig. 2), if it is not required to obtain a spatial picture of the temperature distribution in the cell, which can be used for flow fluorescence cytometry. In this case, the requirements for the laser equipment and the detector will be similar to the requirement for the equipment for obtaining the calibration of fluorescence decay times versus temperature described above, and the value of the average characteristic fluorescence decay time obtained using the exponential analysis of the experimental fluorescence decay kinetics will unambiguously indicate the average the temperature of the sample area from which the fluorescent signal was detected, according to the calibration dependence obtained earlier for a solution of fluorescent proteins.
Также возможно использование клеток и тканей для измерения методом время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) (фиг. 3) для изучения пространственного распределения локальной температуры. Тогда применяются следующие технологические требования: 1) Наличие время-разрешенного флуоресцентного микроскопа (FLIM) (допускается также использование обычного флуоресцентного микроскопа с приставкой FLIM) с длиной волны возбуждения импульсного лазера от 750 до 790 нм; 2) Длительность импульса лазера не должна превышать 30 пс; 3) Частота импульсов лазера не должна быть больше 80 МГц; 4) Мощность лазера должна быть не менее 1 мВт; 5) Наличие детектора время-коррелированного счета фотонов с возможностью детекции эмиссии образца в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм, разбросом времени прохождения не более 180 пс и квантовой эффективностью не менее 10%; 6) Синхронизация лазера и детектора через модуль для время-коррелированного счета одиночных фотонов; 7) Программное обеспечение для управления детектором время-коррелированного счета фотонов, сбора и анализа данных с возможностью экспорта данных времен затухания флуоресценции по каждому пикселю; 8) Желательна видеокарта с поддержкой CUDA для более быстрого анализа FLIM изображений.It is also possible to use cells and tissues for measurement by time-resolved fluorescence microscopy (FLIM) (FIG. 3) to study the spatial distribution of local temperature. Then the following technological requirements apply: 1) Availability of a time-resolved fluorescence microscope (FLIM) (it is also possible to use a conventional fluorescence microscope with a FLIM attachment) with a pulsed laser excitation wavelength of 750 to 790 nm; 2) The duration of the laser pulse should not exceed 30 ps; 3) The laser pulse frequency should not exceed 80 MHz; 4) The laser power must be at least 1mW; 5) Availability of a time-correlated photon counting detector with the possibility of detecting sample emission in the wavelength range from 600 to 750 nm, with a travel time spread of no more than 180 ps and a quantum efficiency of at least 10%; 6) Synchronization of the laser and the detector through the module for the time-correlated counting of single photons; 7) Software for managing the time-correlated photon count detector, data collection and analysis with the ability to export fluorescence decay time data for each pixel; 8) A video card with CUDA support is desirable for faster analysis of FLIM images.
Полученные с помощью время-разрешенной флуоресцентной микроскопии изображения обрабатываются таким образом, что экспоненциальные функции аппроксимируют кинетики затухания флуоресценции в каждом пикселе изображения, благодаря чему определяются значения характерных времен затухания флуоресценции в каждом отдельном пикселе. Каждое значение времени сопоставляется с калибровочной зависимостью характерного времени затухания флуоресценции от температуры, которая была получена заранее в контрольных экспериментах, благодаря чему может быть решена обратная задача, и значение времени жизни возбужденного состояния может быть однозначно представлено в виде соответствующей температуры. Преобразованное таким образом изображение является картой распределения значений локальной температуры фикобилипротеинов в окружении клеток или тканей.The images obtained using time-resolved fluorescence microscopy are processed in such a way that the exponential functions approximate the fluorescence decay kinetics in each pixel of the image, due to which the values of the characteristic fluorescence decay times in each individual pixel are determined. Each time value is compared with the calibration dependence of the characteristic fluorescence decay time on temperature, which was obtained in advance in control experiments, due to which the inverse problem can be solved, and the value of the excited state lifetime can be unambiguously represented as the corresponding temperature. The image transformed in this way is a map of the distribution of local temperature values of phycobiliproteins in the environment of cells or tissues.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.
На фиг. 1 представлен спектр антистоксовой флуоресценции хромофора фикоцианина при однофотонном возбуждении 770 нм.In FIG. Figure 1 shows the anti-Stokes fluorescence spectrum of the phycocyanin chromophore upon single-photon excitation at 770 nm.
На фиг. 2 представлена схема спектрофлуориметра для измерения кинетики затухания флуоресценции в растворе фикобилипротеинов при возбуждении антистоксовой флуоресценции, а также получения калибровки характерных времен жизни флуоресценции от температуры.In FIG. Figure 2 shows a diagram of a spectrofluorometer for measuring the kinetics of fluorescence decay in a solution of phycobiliproteins upon excitation of anti-Stokes fluorescence, as well as obtaining a calibration of the characteristic fluorescence lifetimes with temperature.
На фиг. 3 представлена схема время-разрешенного флуоресцентного микроскопа для получения температурных изображений клеток и тканей.In FIG. 3 is a diagram of a time-resolved fluorescent microscope for obtaining temperature images of cells and tissues.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Готовят раствор фикобилипротеина посредством растворения 0,5 мг фикобилипротеина в 1 мл натрий-фосфатного буфера (pH 7,8) при температуре 25°С. Полученный раствор помещают под микроскоп или в спектральную установку и облучают лазером с параметрами частоты излучения от 10 до 80 МГц и длиной волны излучения от 750 до 790 нм в течение одной минуты для возбуждения флуоресценции образца. Регистрируют сигнал флуоресценции в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм с отношением "сигнал-шум" не менее 10. Строят кривую кинетики затухания флуоресценции. Осуществляют аппроксимацию экспериментальных данных моделью из двух состояний. Определяют соотношения амплитуд и вкладов компонент с временами жизни флуоресценции 300±100 пс и 1600±500 пс. Затем по известным методикам готовят биологические образцы: клетки или ткани, экспрессирующие фикобилипротеины или окрашенные фикобилипротеинами и белковыми конструкциями на их основе. С использованием микроскопа или спектральной установки проводят измерение время-разрешенного сигнала антистоксовой флуоресценции. Для этого образец облучают лазером с параметрами частоты излучения от 10 до 80 МГц и длиной волны от 750 до 790 нм в течение не менее минуты и не более десяти минут. Регистрируют время разрешенный флуоресцентный сигнал в диапазоне длин волн от 600 до 750 нм с отношением "сигнал-шум" не менее 10. Строят кинетические кривые затухания флуоресценции и определяют соотношение амплитуд и вкладов компонент с временами жизни флуоресценции 300±100 пс и 1600±500 пс. С использованием калибровочной кривой определяют локальную температуру. Для приложений требующих исследование морфологии объектов и распределения неоднородностей локальной температуры: получение пространственной карты распределения кинетик затухания антистоксовой флуоресценции в режиме конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с пространственным разрешением не менее 400 нм.Prepare a solution of phycobiliprotein by dissolving 0.5 mg of phycobiliprotein in 1 ml of sodium phosphate buffer (pH 7.8) at a temperature of 25°C. The resulting solution is placed under a microscope or in a spectral setup and irradiated with a laser with a frequency of 10 to 80 MHz and a wavelength of 750 to 790 nm for one minute to excite the fluorescence of the sample. The fluorescence signal is recorded in the wavelength range from 600 to 750 nm with a signal-to-noise ratio of at least 10. A fluorescence decay kinetics curve is plotted. The experimental data are approximated by a two-state model. The ratios of the amplitudes and contributions of the components with fluorescence lifetimes of 300±100 ps and 1600±500 ps are determined. Then, according to known methods, biological samples are prepared: cells or tissues expressing phycobiliproteins or stained with phycobiliproteins and protein structures based on them. Using a microscope or a spectral setup, the time-resolved anti-Stokes fluorescence signal is measured. To do this, the sample is irradiated with a laser with a radiation frequency of 10 to 80 MHz and a wavelength of 750 to 790 nm for at least a minute and no more than ten minutes. The time-resolved fluorescent signal is recorded in the wavelength range from 600 to 750 nm with a signal-to-noise ratio of at least 10. Kinetic fluorescence decay curves are plotted and the ratio of the amplitudes and contributions of the components with fluorescence lifetimes of 300 ± 100 ps and 1600 ± 500 ps is determined . The local temperature is determined using the calibration curve. For applications requiring the study of the morphology of objects and the distribution of local temperature inhomogeneities: obtaining a spatial map of the distribution of the kinetics of the decay of anti-Stokes fluorescence in the mode of confocal laser scanning microscopy with a spatial resolution of at least 400 nm.
Ниже представлены детальные примеры, описание которых не ограничивает возможные применения заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.Below are detailed examples, the description of which does not limit the possible applications of the claimed invention, but demonstrates the possibility of carrying out the invention with the achievement of the claimed technical result.
Пример 1.Example 1
Построение калибровочной кривой зависимости времени жизни флуоресценции от температуры для альфа-фикоцианинаPlotting a Calibration Curve of Fluorescence Lifetime vs. Temperature for Alpha-Phycocyanin
Получение плазмиды с кДНК фикоцианина, добавление плазмиды для генетической модификации культуры клеток бактерии Escherichia coli, экспрессия белка в модифицированной культуре, а также выделение и очистку проводят по стандартной методике, например используют методику, описанную в статье [doi: 10.1007/s12010-007-8000-7]. Для измерений используют 1 мл раствора альфа-фикоцианина в 10 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 7,8 в концентрации 10 мкг на мл.Obtaining a plasmid with phycocyanin cDNA, adding a plasmid for genetic modification of the Escherichia coli bacterium cell culture, protein expression in the modified culture, as well as isolation and purification are carried out according to the standard method, for example, use the method described in the article [doi: 10.1007/s12010-007-8000 -7]. For measurements, use 1 ml of a solution of alpha-phycocyanin in 10 mM sodium phosphate buffer pH 7.8 at a concentration of 10 μg per ml.
Кинетики затухания флуоресценции регистрируют с помощью детектора, коррелированного по времени счета одиночных фотонов HPM-100-07C со сверхвысоким соотношением «сигнал-шум» и разбросом времени детектирования единичного фотона менее 20 пс (Becker & Hickl, Германия) и монохроматора ML-44 (Solar LS, Беларусь) на длине волны 670 нм (фиг. 1). Антистоксову флуоресценцию возбуждают лазерным импульсным излучением при 770 нм (частота 80 МГц, время полуширины импульса 150 фс, мощность излучения 685 мВт), полученным с использованием режима «signal» фемтосекундного параметрического генератора TOPOL (ООО «Авеста-Проект», Россия), способного генерировать лазерный луч с длиной волны от 680 до 2400 нм, с накачкой фемтосекундным Yb-лазером ТЕМА-150 (ООО «Авеста-Проект», Россия). Лазерный луч расфокусируют на образце с помощью рассеивающей линзы до диаметра примерно 0,6 см, для предотвращения нелинейных оптических эффектов (двухфотонного поглощения). Флуоресценцию образца детектируют перпендикулярно возбуждающему пучку. Чтобы избежать регистрации рассеянного излучения лазера, используют краевой коротковолновый светофильтр (Thorlabs, США) с пропусканием не менее 80 % до 750 нм (и менее 1 % после 750 нм). Температуру образца во время экспериментов поддерживают на постоянном уровне с помощью системы Qpod 2e с магнитной мешалкой (Quantum Northwest, Liberty Lake, WA, США), способной поддерживать температуру кюветного отделения с точностью 0,05°С. Запись каждой кинетики затухания флуоресценции начинают после достижения необходимой температуры раствора, определяемой с помощью термопары, погруженной в белковый раствор. Измерения проводят в кварцевой кювете 10 x 10 мм. Время накопления сигнала при каждой температуре составляет приблизительно 1 минуту. Получение и обработка данных проводится с помощью программного обеспечения SPCM и SPCImage (Becker & Hickl, Германия). Полученные кинетики затухания флуоресценции при разных температурах аппроксимируют двумя затухающими экспоненциальными функциями, так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимальным. С помощью этой процедуры определяют соответствующие характерные кинетические компоненты (время жизни возбужденного состояния) и величины соответствующих амплитуд компонент кинетики. Полученные в экспериментах зависимости в дальнейшем используют для определения локальной температуры с помощью измерения времени жизни флуоресценции альфа-фикоцианина с точностью не менее 0,1°С.Fluorescence decay kinetics are recorded using an HPM-100-07C single-photon time-correlated detector with an ultra-high signal-to-noise ratio and a single photon detection time spread of less than 20 ps (Becker & Hickl, Germany) and an ML-44 monochromator (Solar LS, Belarus) at a wavelength of 670 nm (Fig. 1). Anti-Stokes fluorescence is excited by laser pulsed radiation at 770 nm (frequency 80 MHz, pulse half-width 150 fs, radiation power 685 mW) obtained using the “signal” mode of the TOPOL femtosecond parametric oscillator (LLC Avesta-Proekt, Russia), capable of generating laser beam with a wavelength of 680 to 2400 nm, pumped by a TEMA-150 femtosecond Yb laser (LLC Avesta-Proekt, Russia). The laser beam is defocused on the sample with a diverging lens to a diameter of approximately 0.6 cm to prevent non-linear optical effects (two-photon absorption). Sample fluorescence is detected perpendicular to the excitation beam. To avoid registration of scattered laser radiation, a short-wavelength edge filter (Thorlabs, USA) with a transmission of at least 80% up to 750 nm (and less than 1% after 750 nm) is used. The sample temperature was kept constant during the experiments using a Qpod 2e system with a magnetic stirrer (Quantum Northwest, Liberty Lake, WA, USA) capable of maintaining the cell compartment temperature with an accuracy of 0.05°C. The recording of each fluorescence decay kinetics is started after reaching the required temperature of the solution, which is determined using a thermocouple immersed in the protein solution. The measurements are carried out in a 10 x 10 mm quartz cuvette. The signal accumulation time at each temperature is approximately 1 minute. Data acquisition and processing is carried out using the SPCM and SPCImage software (Becker & Hickl, Germany). The obtained fluorescence decay kinetics at different temperatures are approximated by two decaying exponential functions, so that the value of the sum of the squared discrepancies between the experimental data and the exponential function is minimal. Using this procedure, the corresponding characteristic kinetic components (the lifetime of the excited state) and the values of the corresponding amplitudes of the kinetic components are determined. The dependences obtained in the experiments are further used to determine the local temperature by measuring the fluorescence lifetime of alpha-phycocyanin with an accuracy of at least 0.1°C.
Пример 2.Example 2
Картирование температуры клеток HEK293, меченных альфа-аллофикоцианином, с помощью время разрешенной флуоресцентной микроскопииTemperature mapping of alpha-allophycocyanin-labeled HEK293 cells by time-resolved fluorescence microscopy
Клетки HEK293 обрабатывают поликлональными биотинилированными антителами кролика CABT-L347R (Creative Diagnostics, США) и окрашивают стрептавидин-аллофикоцианином по стандартной технологии: клетки промывают натрий-фосфатным буфером, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина, добавляют антитела в конечной концентрации 1 мкг на мл и инкубируют в течение 20 минут при 4°С, после чего еще раз промывают и окрашивают стрептавидин-аллофикоцианином (eBioscience, США), разведенным в 500 раз, в течение 20 минут при +4°С. После проведения окрашивания клетки инкубируют 2 часа при +37°С в атмосфере 5% углекислого газа в среде F12/DMEM с 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 15 мМ HEPES.HEK293 cells are treated with polyclonal biotinylated rabbit antibodies CABT-L347R (Creative Diagnostics, USA) and stained with streptavidin-allophycocyanin according to standard technology: cells are washed with sodium phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin, antibodies are added at a final concentration of 1 μg per ml and incubated for 20 minutes at 4°C, then washed again and stained with streptavidin-allophycocyanin (eBioscience, USA), diluted 500 times, for 20 minutes at +4°C. After staining, the cells are incubated for 2 hours at +37°C in an atmosphere of 5% carbon dioxide in F12/DMEM medium with 10% fetal bovine serum and 15 mm HEPES.
Измерения проводят с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ti2-U (США), модифицированного мультифотонным гальваносканером FLIM DCS-120 (Becker & Hickl, Германия) c детектором время-коррелированного счета фотонов HMP-100-40 (Becker & Hickl, Германия) со следующими характеристиками: эффективность детекции в диапазоне от 600 до 750 нм не менее 10 %, разброс времени прохождения 180 пс. Получение и обработку данных осуществляют с помощью программного обеспечения SPCM и SPCImage (Becker & Hickl, Германия) для управления детектором время-коррелированного счета фотонов, сбора и анализа данных с возможностью экспорта данных времен затухания флуоресценции по каждому пикселю. Измерения клеток проводят при температуре +37°С. Полученные кинетики затухания флуоресценции аппроксимируют двумя затухающими экспоненциальными функциями, для каждого пикселя так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимально. Для более быстрой обработки данных расчет производят на компьютере с видеокартой с поддержкой графических ядер CUDA. Значения характерных времен затухания флуоресценции экспортируют для каждого пикселя в виде общей матрицы, после чего значения пересчитывают с учетом заранее полученной калибровки для альфа-аллофикоцианина в 10 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 7,8 в концентрации 10 мкг на мл по методике, аналогичной методике из Примера 1, и визуализируют в виде наложения температурной карты на конфокальное изображение клетки с помощью программного обеспечения Origin (США).The measurements are carried out using a Nikon Eclipse Ti2-U inverted fluorescence microscope (USA) modified with a FLIM DCS-120 multiphoton galvanoscanner (Becker & Hickl, Germany) with an HMP-100-40 time-correlated photon count detector (Becker & Hickl, Germany) with the following characteristics: the detection efficiency in the range from 600 to 750 nm is not less than 10%, the spread of the transit time is 180 ps. Data acquisition and processing is carried out using the SPCM and SPCImage software (Becker & Hickl, Germany) to control the time-correlated photon count detector, collect and analyze data with the ability to export fluorescence decay time data for each pixel. Cell measurements are carried out at a temperature of +37°C. The resulting fluorescence decay kinetics are approximated by two decaying exponential functions, for each pixel, so that the value of the sum of the squared discrepancies between the experimental data and the exponential function is minimal. For faster data processing, the calculation is performed on a computer with a video card supporting CUDA graphics cores. The values of the characteristic fluorescence decay times are exported for each pixel as a common matrix, after which the values are recalculated taking into account the previously obtained calibration for alpha allophycocyanin in 10 mM sodium phosphate buffer pH 7.8 at a concentration of 10 μg per ml using a procedure similar to the procedure from Example 1, and visualized as an overlay of a temperature map on a confocal image of a cell using Origin software (USA).
Claims (6)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2780954C1 true RU2780954C1 (en) | 2022-10-04 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2333153A (en) * | 1998-01-07 | 1999-07-14 | Univ Rockefeller | Detecting temperature or metabolic activity of cells |
| GB2350892A (en) * | 1999-05-27 | 2000-12-13 | Univ Rockefeller | A temperature-sensitive fluorescent bead comprising two fluorophores |
| US7413341B1 (en) * | 2004-08-16 | 2008-08-19 | The Research Foundation Of State University Of New York | Imaging methods |
| CN106017722A (en) * | 2016-08-10 | 2016-10-12 | 中国工程物理研究院流体物理研究所 | Single-point fluorescent temperature measurement device and method |
| RU171261U1 (en) * | 2015-03-20 | 2017-05-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" | PRODUCT DEFROST SENSOR BASED ON PHICOBILIPROTEINS |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2333153A (en) * | 1998-01-07 | 1999-07-14 | Univ Rockefeller | Detecting temperature or metabolic activity of cells |
| GB2350892A (en) * | 1999-05-27 | 2000-12-13 | Univ Rockefeller | A temperature-sensitive fluorescent bead comprising two fluorophores |
| US7413341B1 (en) * | 2004-08-16 | 2008-08-19 | The Research Foundation Of State University Of New York | Imaging methods |
| RU171261U1 (en) * | 2015-03-20 | 2017-05-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" | PRODUCT DEFROST SENSOR BASED ON PHICOBILIPROTEINS |
| CN106017722A (en) * | 2016-08-10 | 2016-10-12 | 中国工程物理研究院流体物理研究所 | Single-point fluorescent temperature measurement device and method |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Bur Anthony J. et al., "Fluorescence Based Temperature Measurements and Applications to Real-Time Polymer Processing", Polymer Engineering and Science, Aug. 2001, vol. 41, number 8, pp.1380-1389. * |
| МАКСИМОВ Е.Г., ЦОРАЕВ Г.В., ПАЩЕНКО В.З. "ПРИРОДА АНОМАЛЬНОЙ ТЕМПЕРАТУРНОЙ ЗАВИСИМОСТИ ВРЕМЕНИ ЖИЗНИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ АЛЛОФИКОЦИАНИНА", ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012 г., ТОМ 443, С.377-381. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Inada et al. | Temperature imaging using a cationic linear fluorescent polymeric thermometer and fluorescence lifetime imaging microscopy | |
| Zhao et al. | A red emitting mitochondria-targeted AIE probe as an indicator for membrane potential and mouse sperm activity | |
| Berlier et al. | Quantitative comparison of long-wavelength Alexa Fluor dyes to Cy dyes: fluorescence of the dyes and their bioconjugates | |
| Zhong et al. | Imaging fluorescence lifetime modulation of a ruthenium-based dye in living cells: the potential for oxygen sensing | |
| Broussard et al. | Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt | |
| Wessels et al. | Advances in cellular, subcellular, and nanoscale imaging in vitro and in vivo | |
| Schwille et al. | Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one-and two-photon excitation | |
| Brock et al. | Fluorescence correlation microscopy of cells in the presence of autofluorescence | |
| Vetschera et al. | Characterization of reversibly switchable fluorescent proteins in optoacoustic imaging | |
| Anees et al. | A protein–dye hybrid system as a narrow range tunable intracellular pH sensor | |
| Neto et al. | Seeing is believing: noninvasive microscopic imaging modalities for tissue engineering and regenerative medicine | |
| Stamentović et al. | Photophysical properties and bioimaging application of an aminonaphthalimide-squaraine non-conjugated system | |
| Liu et al. | Tumor cell pH detection based on CdSe quantum dots’ fluorescence charateristics | |
| Ruedas-Rama et al. | FLIM Strategies for Intracellular Sensing: Fluorescence Lifetime Imaging as a Tool to Quantify Analytes of Interest | |
| CN109060746B (en) | Ratio type fluorescence detection method and application | |
| Paredes et al. | Influence of the solvent on the ground-and excited-state buffer-mediated proton-transfer reactions of a xanthenic dye | |
| Jenkins et al. | Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM | |
| Waharte et al. | Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein–protein interaction measurements in living cells | |
| RU2780954C1 (en) | Method for application of phycobiliproteins as optical sensors of local temperature in living cells and tissues | |
| CN113008842B (en) | Fluorescence imaging method for observing surface of cell membrane of living cell and nearby biomacromolecules | |
| Werner et al. | Challenging a preconception: Optoacoustic spectrum differs from the absorption spectrum of proteins and dyes for molecular imaging | |
| RU2799016C1 (en) | Method of detecting local temperature in living cells and constructing temperature map of living cells | |
| Letuta et al. | Long-term luminescence of organic dyes in cells of biological tissues | |
| Jovin et al. | Photophysical processes exploited in digital imaging microscopy: Fluorescence resonance energy transfer and delayed luminescence | |
| Nagwekar et al. | Monitoring transmembrane and peripheral membrane protein interactions by Förster resonance energy transfer using fluorescence lifetime imaging microscopy |