RU2780589C1 - Method for activating the myogenic differentiation of myoblasts - Google Patents
Method for activating the myogenic differentiation of myoblasts Download PDFInfo
- Publication number
- RU2780589C1 RU2780589C1 RU2021129689A RU2021129689A RU2780589C1 RU 2780589 C1 RU2780589 C1 RU 2780589C1 RU 2021129689 A RU2021129689 A RU 2021129689A RU 2021129689 A RU2021129689 A RU 2021129689A RU 2780589 C1 RU2780589 C1 RU 2780589C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- differentiation
- concentration
- myoblasts
- cells
- activating
- Prior art date
Links
- 210000002351 Embryonic Muscle Cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 22
- 230000004070 myogenic differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000003213 activating Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 33
- OXOPZJSRBKSRBY-UHFFFAOYSA-N butanedioic acid;4-ethyl-3-methyl-1H-pyridin-2-one Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O.CCC1=CC=NC(O)=C1C OXOPZJSRBKSRBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001413 cellular Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 12
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 11
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 7
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 6
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 6
- 108010035768 MyoD Protein Proteins 0.000 description 5
- 108010056785 Myogenin Proteins 0.000 description 5
- 102000004364 Myogenin Human genes 0.000 description 5
- PFTAWBLQPZVEMU-UKRRQHHQSA-N (-)-epicatechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-UKRRQHHQSA-N 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000001114 myogenic Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 101710026064 ACTA2 Proteins 0.000 description 3
- 101710004932 ECU01_0460 Proteins 0.000 description 3
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 3
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 3
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 3
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 3
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 3
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 3
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 3
- 101700060536 MYOD1 Proteins 0.000 description 3
- 102000003505 Myosin family Human genes 0.000 description 3
- 108060008487 Myosin family Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 101710035583 myod1-a Proteins 0.000 description 3
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-3',4',5,7-Tetrahydroxy-2,3-trans-flavan-3-ol Natural products C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 description 2
- 229930013783 (-)-epicatechin Natural products 0.000 description 2
- 235000007355 (-)-epicatechin Nutrition 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- GNRIZKKCNOBBMO-UHFFFAOYSA-N Mangostin-alpha Chemical compound OC1=C(CC=C(C)C)C(O)=C2C(=O)C3=C(CC=C(C)C)C(OC)=C(O)C=C3OC2=C1 GNRIZKKCNOBBMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 2
- 229930003335 epicatechin Natural products 0.000 description 2
- 235000012734 epicatechin Nutrition 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGLDCGQYLSYYMO-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-3-methyl-1H-pyridin-2-one Chemical compound CCC=1C=CNC(=O)C=1C FGLDCGQYLSYYMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108009000409 Autophagy Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101700000140 MYF5 Proteins 0.000 description 1
- 102100005905 MYF5 Human genes 0.000 description 1
- 102100017112 MYH1 Human genes 0.000 description 1
- 101700068534 MYH1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008934 Muscle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074084 Muscle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002027 Muscle, Skeletal Anatomy 0.000 description 1
- 210000002464 Muscle, Smooth, Vascular Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- 210000001057 Myoblasts, Smooth Muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 102000000804 Pregnane X Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001511 Pregnane X Receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000000587 Skeletal Muscle Fibers Anatomy 0.000 description 1
- 238000003639 Student–Newman–Keuls (SNK) method Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic Proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 230000006877 autophagy Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000004387 flavanoid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- LBDSXVIYZYSRII-BJUDXGSMSA-N helion Chemical compound [3He+2] LBDSXVIYZYSRII-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 1
- 108091007522 housekeeping proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial Effects 0.000 description 1
- 230000021125 mitochondrion degradation Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001960 triggered Effects 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, фармакологии и клинической фармакологии, и может быть использовано для изучения механизмов дифференцировки миобластов и оценки влияния на нее фармакологических веществ. The invention relates to medicine, namely to biochemistry, pharmacology and clinical pharmacology, and can be used to study the mechanisms of myoblast differentiation and assess the effect of pharmacological substances on it.
Линия клеток C2C12 представляет собой мышиные миобластные клетки, происходящие из сателлитных клеток, обладающие способностью спонтанно дифференцироваться в мышечные волокна после удаления сыворотки [D. Yaffe, O. Saxel. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. Vol. 270. P. 725 – 727. 1977; H.M. Blau, C.P. Chiu, C. Webster. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. Vol. 32, P. 1171-1180. 1983]. При этом дифференцируется около 50% клеток, а остальные миобласты остаются в недифференцированном состоянии [N. Yoshida, S. Yoshida, K. Koishi, K. Masuda, Y. Nabeshima. Cell heterogeneity upon myogenic differentiation: down-regulation of MyoD and Myf-5 generates 'reserve cells. J. Cell Sci. Vol. 111. P. 769-779. 1998].The C2C12 cell line is a mouse myoblast cell derived from satellite cells with the ability to spontaneously differentiate into muscle fibers after serum removal [D. Yaffe, O. Saxel. Serial passing and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. Vol. 270. P. 725 - 727. 1977; H.M. Blau, C.P. Chiu, C. Webster. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. cell. Vol. 32, P. 1171-1180. 1983]. At the same time, about 50% of cells differentiate, and the remaining myoblasts remain in an undifferentiated state [N. Yoshida, S. Yoshida, K. Koishi, K. Masuda, Y. Nabeshima. Cell heterogeneity upon myogenic differentiation: down-regulation of MyoD and Myf-5 generates 'reserve cells. J. Cell Sci. Vol. 111. P. 769-779. 1998].
Данная клеточная линия является классической моделью для изучения механизмов дифференцировки миобластов и оценки влияния на нее фармакологических веществ. Известно, что флаваноид (-)-Epicatechin индуцируeт миогенную дифференцировку клеток линии С2С12 за счет индукции прегнан Х рецептора [M. Ortiz-Flores et al. PXR is a target of (-)-epicatechin in skeletal muscle. Heliyon. Vol. 6, N 10, e05357 (2020); doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e05357]. This cell line is a classic model for studying the mechanisms of myoblast differentiation and evaluating the effect of pharmacological substances on it. It is known that the flavanoid (-)-Epicatechin induces myogenic differentiation of C2C12 cells due to the induction of the pregnane X receptor [M. Ortiz-Flores et al. PXR is a target of (-)-epicatechin in skeletal muscle. Helion. Vol. 6, No. 10, e05357 (2020); doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e05357].
Известо, что альфа-магостин активирует миогенную дифференцировку миобластов [M. Lin, S. Zhou, K. Sakamoto. Alpha Mangostin promotes myogenic differentiation of C2C12 mouse myoblast cells. Biochemical and Biophysical Research CommunicationsIt is known that alpha-magostine activates myogenic differentiation of myoblasts [M. Lin, S. Zhou, K. Sakamoto. Alpha Mangostin promotes myogenic differentiation of C2C12 mouse myoblast cells. Biochemical and Biophysical Research Communications
Vol. 528, Is.1, 2020, P. 193-198. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2020.04.128].Vol. 528, Is.1, 2020, P. 193-198. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2020.04.128].
Известно, что эпикатехин вызывает MyoD-зависимую дифференцировку миобластов и миогенную конверсию фибробластов [Lee S.J. et al. Epicatechin elicits MyoD-dependent myoblast differentiation and myogenic conversion of fibroblasts. Plos One. 2017. DOI: 10.1371 / journal.pone.0175271].Epicatechin is known to induce MyoD-dependent myoblast differentiation and myogenic conversion of fibroblasts [Lee S.J. et al. Epicatechin elicits MyoD-dependent myoblast differentiation and myogenic conversion of fibroblasts. Plo One. 2017. DOI: 10.1371 / journal.pone.0175271].
Техническим результатом изобретения является разработка простого, эффективного способа активации миогенной дифференцировки миобластов клеточной линии C2C12.The technical result of the invention is the development of a simple, effective method for activating myogenic differentiation of myoblasts of the C2C12 cell line.
Для достижения технического результата выполнено следующее исследование.To achieve a technical result, the following study was carried out.
Эксперимент был проведен in vitro на линии клеток мышиных миобластов С2С12, предоставленной Институтом биологии гена (Москва). Клетки культивировали при 37ºС и 5% содержании СО2 в инкубаторе WS-189C (World Science, Корея) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) (Sigma-Aldrich, Германия), содержащей L-глутамин (4 мМ) (Sigma-Aldrich, Германия), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Германия), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich, Германия) соответственно. После достижения 70−90% конфлюентности клетки снимали с флакона добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, Sigma-Aldrich, Германия), высевали в 6-луночные планшеты (Сorning, США). The experiment was carried out in vitro on the C2C12 mouse myoblast cell line provided by the Institute of Gene Biology (Moscow). Cells were cultured at 37°C and 5% CO 2 in a WS-189C incubator (World Science, Korea) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with a high glucose content (4500 mg/l) (Sigma-Aldrich, Germany) containing L- glutamine (4 mM) (Sigma-Aldrich, Germany), 10% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, Germany), 100 U/ml and 100 µg/ml penicillin and streptomycin (Sigma-Aldrich, Germany), respectively. After reaching 70–90% confluence, the cells were removed from the flask by adding a solution of trypsin-EDTA (0.25% trypsin and 0.2% EDTA, Sigma-Aldrich, Germany), seeded in 6-well plates (Corning, USA).
Были сформированы следующие экспериментальные группы:The following experimental groups were formed:
- клетки до дифференцировки – инкубация 7 дней с питательной средой, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (n=3);- cells before differentiation - incubation for 7 days with a nutrient medium containing 10% fetal bovine serum (n=3);
- индукция дифференцировки миобластов – клетки инкубировали 7 дней с дифференцировочной питательной средой, содержащей 2% лошадиной сыворотки (Sigma-Aldrich, Германия), L-глутамин (4 мМ), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (n=3) [J. Sin et al. Mitophagy is required for mitochondrial biogenesis and myogenic differentiation of C2C12 myoblasts. Autophagy. Vol.12 (2), P. 369-380. 2016; doi: 10.1080/15548627.2015.1115172];- induction of myoblast differentiation - cells were incubated for 7 days with a differentiation nutrient medium containing 2% horse serum (Sigma-Aldrich, Germany), L-glutamine (4 mM), 100 U/ml and 100 µg/ml penicillin and streptomycin (n= 3) [J. Sin et al. Mitophagy is required for mitochondrial biogenesis and myogenic differentiation of C2C12 myoblasts. autophagy. Vol.12(2), P. 369-380. 2016; doi: 10.1080/15548627.2015.1115172];
- индукция дифференцировки миобластов с добавлением этилметилгидроксипиридина сукцината (ЭМГПС) (Фармасофт, Россия) – клетки инкубировали 7 дней в дифференцировочной питательной среде, содержащей этилметилгидроксипиридина сукцинат в концентрации 10 мкМ в течение 7 дней (n=3).- induction of myoblast differentiation with the addition of ethylmethylhydroxypyridine succinate (EMHPS) (Pharmasoft, Russia) - cells were incubated for 7 days in a differentiation nutrient medium containing ethylmethylhydroxypyridine succinate at a concentration of 10 μM for 7 days (n=3).
Визуализацию клеток выполняли с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX-53 («Olympus», Япония). Cells were visualized using an inverted microscope Olympus CKX-53 (Olympus, Japan).
После окончания экспозиции, клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich, США), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 минут при +4°С и постоянном перемешивании из расчета 107 клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут (AvantiJXN-3, BeckmanCoulter, США). After the end of the exposure, the cells were removed from the wells with a trypsin-EDTA solution (Sigma-Aldrich, USA), washed three times with a phosphate buffer solution (BioRad, USA) and lysed in NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, USA) with the addition of a mixture of proteinase inhibitors (Sigma-Aldrich, USA) for 30 minutes at +4°C and constant stirring at the rate of 10 7 cells per 100 μl of buffer. The resulting lysate was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes (AvantiJXN-3, BeckmanCoulter, USA).
Цитоплазматические белки (30 мкг) подвергали электрофорезу с использованием TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit (Bio-Rad, США) в буферной системе Laemmli (BioRad,США). Перед загрузкой образцы обрабатывались в соответствии с протоколом Bio-Rad, их смешивали с буфером для образцов Laemmli (Bio-Rad, США), содержащем 2,5% β-меркаптоэтанола (Bio-Rad, США) в соотношении 1:3, инкубировали 10 мин при температуре 70°C. Гели прогоняли при 100 В в течение 90 мин.Cytoplasmic proteins (30 μg) were subjected to electrophoresis using a TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit (Bio-Rad, USA) in a Laemmli buffer system (BioRad, USA). Before loading, the samples were processed according to the Bio-Rad protocol, they were mixed with Laemmli sample buffer (Bio-Rad, USA) containing 2.5% β-mercaptoethanol (Bio-Rad, USA) in a ratio of 1:3, and incubated for 10 min at 70°C. The gels were run at 100 V for 90 min.
Для определения относительного количества миозина, α-актина, Myod, миогенина, методом вестерн-блот использовали первичные мышиные моноклональные антитела (sc-377460 MyoD (G-1) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology,inc, США; sc-12732 myogenin (F5D) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology,inc, США; sc-53092, MYH1/2/3 (N3.36) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology,inc, США; sc-53142, Smooth Muscle Actin (B4), Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology,inc, США) в концентрации 1:200. Визуализацию первичных антител осуществляли с использованием вторичных кроличьих антител (Rabbit anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen) в разведении 1:4000. Primary mouse monoclonal antibodies (sc-377460 MyoD (G-1) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology, inc, USA; sc-12732 myogenin (F5D ) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology, inc, USA; sc-53092, MYH1/2/3 (N3.36) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology, inc, USA; sc-53142, Smooth Muscle Actin (B4), Monoclonal Antibody , Santa cruz biotechnology, inc, USA) at a concentration of 1:200. Visualization of primary antibodies was performed using secondary rabbit antibodies (Rabbit anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen) at a dilution of 1:4000.
Белки визуализировали хемилюминесценцией с помощью Chemi Doc XRS+ (Bio-Rad, США). Интенсивность полученных полос (бэндов) анализировали денситометрически с помощью программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad, США). Proteins were visualized by chemiluminescence using Chemi Doc XRS+ (Bio-Rad, USA). The intensity of the resulting bands (bands) was analyzed densitometrically using ImageLab software (Bio-Rad, USA).
Количество белков оценивали относительно содержания белка домашнего хозяйства GAPDH (первичные GAPDH Loading Control Monoclonal Antibody (GA1R), DyLight 68, Invitrogen, США, разведение 1:1000, вторичные антитела - вторичные кроличьи антитела к первичным антителам GAPDH - Rabbitanti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen, США, разведение 1:4000).The amount of proteins was estimated relative to the content of the housekeeping protein GAPDH (primary GAPDH Loading Control Monoclonal Antibody (GA1R), DyLight 68, Invitrogen, USA, dilution 1:1000, secondary antibodies - rabbit anti-rabbit secondary antibodies to GAPDH primary antibodies - Rabbitanti-Mouse IgG (H+ L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen, USA, dilution 1:4000).
Полученные результаты анализировали с помощью программ «Stat Soft Statistica 13.0» (США, номер лицензии JPZ811I521319AR25ACD-W) и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984-001-000001). Результаты представлены в виде M±SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), множественные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. The results were analyzed using the Stat Soft Statistica 13.0 software (USA, license number JPZ811I521319AR25ACD-W) and Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984-001-000001). The results are presented as M±SD. To assess the statistical significance of differences, analysis of variance (ANOVA) was used, multiple comparisons were performed using the Newman-Keuls test. Differences were considered statistically significant at p<0.05.
Смена питательной среды, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, на среду с содержанием 2% лошадиной сыворотки запускало процесс дифференцировки миобластов. Клетки меняли свою форму: из отростчатых или веретенообразных они превращались в более вытянутые. В дальнейшем отдельные миобласты сливались и формировали миотубы - веретенообразные структуры длиной 100-600 мкм, шириной 30-50 мкм с несколькими ядрами. Максимально выраженные изменения наблюдались на 7 день (фиг. 1).The change of nutrient medium containing 10% fetal bovine serum to a medium containing 2% horse serum triggered the process of myoblast differentiation. The cells changed their shape: from processes or fusiform they turned into more elongated ones. Subsequently, individual myoblasts merged and formed myotubes - spindle-
Добавление этилметилгидроксипиридина сукцината усиливало процесс дифференцировки миобластов клеточной линии С2С12. Большее количество клеток меняли форму и сливались в миотубы.The addition of ethylmethylhydroxypyridine succinate enhanced the process of myoblast differentiation of the C2C12 cell line. More cells changed shape and merged into myotubes.
Данные морфологические изменения сопровождались следующей динамикой в уровне белков клеток (фиг. 2). Количество миозина в клетках линии С2С12 на 7 день эксперимента, при использовании обычной дифференцировочной среды и среды с добавлением этилметилгидроксипиридина сукцината статистически значимо увеличивалось по сравнению с показателями клеток до дифференцировки на 35,6% (р=0,004) и 64,4% (р=0,001) соответственно. В группах с тестируемыми веществами отличий от клеток на 7 день при использовании обычной дифференцировочной среды отмечено не было.These morphological changes were accompanied by the following dynamics in the level of cell proteins (Fig. 2). The amount of myosin in cells of the C2C12 line on the 7th day of the experiment, using the usual differentiation medium and the medium with the addition of ethylmethylhydroxypyridine succinate, increased statistically significantly compared to the values of cells before differentiation by 35.6% (p=0.004) and 64.4% (p= 0.001) respectively. In the test substance groups, there was no difference from cells on
Уровень α-актина статистически значимо не отличался в клетках до и после дифференцировки. В то же время при использовании этилметилгидроксипиридина сукцината отмечалось увеличение содержания α-актина на 94,4 % (р=0,02) по сравнению с клетками до дифференцировки и на 62% (р=0,02) по сравнению с клетками на 7 день дифференцировки.The level of α-actin did not differ significantly in cells before and after differentiation. At the same time, when using ethylmethylhydroxypyridine succinate, there was an increase in the content of α-actin by 94.4% (p=0.02) compared with cells before differentiation and by 62% (p=0.02) compared with cells on
Содержание Myod (Myogenic determination gene number 1), который является главным регулятором миогенеза, в клетках линии С2С12 до дифференцировки и на 7 день дифференцировки не отличался. Однако, внесение в дифференцировочную питательную среду этилметилгидроксипиридина сукината приводило к увеличению количества Myod на 31,1 % (р=0,016) по сравнению с клетками до дифференцировки, а также на 19,1% (р=0,002) по сравнению с клетками на 7 день дифференцировки. The content of Myod (Myogenic determination gene number 1), which is the main regulator of myogenesis, did not differ in C2C12 cells before differentiation and on the 7th day of differentiation. However, the introduction of ethylmethylhydroxypyridine sukinata into the differentiation nutrient medium led to an increase in the amount of Myod by 31.1% (p=0.016) compared to cells before differentiation, and also by 19.1% (p=0.002) compared to cells on
Количество миогенина, другого регуляторного белка, статистически значимо возрастало в клетках на 7 день при обычных условиях дифференцировки на 44,3% (р=0,02), а при добавлении этилметигидроксипиридина сукцината в питательную среду на 94,8% (р=0,007) по сравнению с клетками линии С2С12 до дифференцировки. Этилметилгидроксипиридина сукцинат также стимулировал увеличение количества миогенина по сравнению с клетками на 7 день в обычных условиях дифференцировки на 35% (р=0,03).The amount of myogenin, another regulatory protein, increased statistically significantly in cells on
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фиг. 1. Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината 10 мкМ на дифференцировку клеток линии С2С12, х200. Фазово-контрастная микроскопия.Fig. Fig. 1. Effect of ethylmethylhydroxypyridine succinate 10 μM on the differentiation of C2C12 cell line, x200. Phase contrast microscopy.
Фиг. 2. Относительное количество Myod, миогенина, миозина, актина в клетках линии С2С12 при воздействии этилметилгидроксипиридина сукцината в концентрации 10 мкМ в течение 7 дней. Примечание: статистически значимые отличия * - p<0,05 по сравнению с клетками до дифференцировки; # - p<0,05 по сравнению с клетками на 7 день дифференцировкиFig. Fig. 2. The relative amount of Myod, myogenin, myosin, actin in C2C12 cells exposed to ethylmethylhydroxypyridine succinate at a concentration of 10 μM for 7 days. Note: statistically significant differences * - p<0.05 compared to cells before differentiation; # - p<0.05 compared to cells on
Таким образом, показано, что инкубирование клеточной линии С2С12 в дифференцировочной питательной среде с добавлением этилметилгидроксипиридина сукцината до достижения концентрации в среде 10 мкМ в течение 7 дней ускоряет процесс миогенной дифференцировки миобластов, о чем свидетельствуют морфологические изменения клеток, а также повышение уровня специфических мышечных белков α-актина, миозина и факторов миогенной дифференцировки – MyoD и миогенина. Thus, it has been shown that incubation of the C2C12 cell line in a differentiation nutrient medium with the addition of ethylmethylhydroxypyridine succinate to a concentration of 10 μM in the medium for 7 days accelerates the process of myogenic differentiation of myoblasts, as evidenced by morphological changes in cells, as well as an increase in the level of specific muscle proteins α -actin, myosin and myogenic differentiation factors - MyoD and myogenin.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2780589C1 true RU2780589C1 (en) | 2022-09-28 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2527701C1 (en) * | 2013-05-24 | 2014-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НЦРВХ" СО РАМН) | Method for preparing agent possessing property of cartilaginous, osseous, muscular tissue regeneration stimulation, and method for cartilaginous, osseous, muscular tissue regeneration stimulation with using prepared agent |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2527701C1 (en) * | 2013-05-24 | 2014-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НЦРВХ" СО РАМН) | Method for preparing agent possessing property of cartilaginous, osseous, muscular tissue regeneration stimulation, and method for cartilaginous, osseous, muscular tissue regeneration stimulation with using prepared agent |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BLAND CHRISTOPHER S. et al., Global regulation of alternative splicing during myogenic differentiation, Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 21, pp. 7651-7664, doi:10.1093/nar/gkq614. ARNESON-WISSINK PAIGE C. et al., The wasting-associated metabolite succinate disrupts myogenesis and impairs skeletal muscle regeneration, JCSM Rapid Communications, 2020, pp. 1-14, doi: 10.1002/rco2.14. LIN M. et al., Alpha Mangostin promotes myogenic differentiation of C2C12 mouse myoblast cells, Biochemical and biophysical research communications, Vol. 528, Is.1, 2020, pp. 193-198, doi: 10.1016 / j.bbrc.2020.04.128. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lin et al. | iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases | |
| Mollica et al. | 3D bioprinted mammary organoids and tumoroids in human mammary derived ECM hydrogels | |
| Ribeiro et al. | Functional maturation of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in vitro–correlation between contraction force and electrophysiology | |
| Pchelintseva et al. | Mesenchymal stem cell differentiation: Control by calcium‐activated potassium channels | |
| Gershlak et al. | Mesenchymal stem cells ability to generate traction stress in response to substrate stiffness is modulated by the changing extracellular matrix composition of the heart during development | |
| Tuli et al. | Transforming growth factor-β-mediated chondrogenesis of human mesenchymal progenitor cells involves N-cadherin and mitogen-activated protein kinase and Wnt signaling cross-talk | |
| Wozniak et al. | Signaling satellite‐cell activation in skeletal muscle: markers, models, stretch, and potential alternate pathways | |
| Sato et al. | β-Estradiol induces synaptogenesis in the hippocampus by enhancing brain-derived neurotrophic factor release from dentate gyrus granule cells | |
| Yazawa et al. | Androgen/androgen receptor pathway regulates expression of the genes for cyclooxygenase-2 and amphiregulin in periovulatory granulosa cells | |
| Sahana et al. | Decreased E‐Cadherin in MCF7 Human Breast Cancer Cells Forming Multicellular Spheroids Exposed to Simulated Microgravity | |
| Jia et al. | YAP balances the osteogenic and adipogenic differentiation of hPDLSCs in vitro partly through the Wnt/β-catenin signaling pathway | |
| Zito et al. | Neuritin 1 promotes neuronal migration | |
| Kotula-Balak et al. | Insights into the role of estrogen-related receptors α, β and γ in tumor Leydig cells | |
| Imamichi et al. | Transcriptional regulation of human ferredoxin 1 in ovarian granulosa cells | |
| RU2780589C1 (en) | Method for activating the myogenic differentiation of myoblasts | |
| Yu et al. | E2F1 effects on osteoblast differentiation and mineralization are mediated through up-regulation of frizzled-1 | |
| RU2776045C1 (en) | Method for stimulating myogenesis | |
| Wang et al. | Concomitant beige adipocyte differentiation upon induction of mesenchymal stem cells into brown adipocytes | |
| Kim et al. | Transforming growth factor-β-induced RBFOX3 inhibition promotes epithelial-mesenchymal transition of lung cancer cells | |
| Yu et al. | The calcium transient characteristics induced by fluid shear stress affect the osteoblast proliferation | |
| Paxton et al. | BTB-Kelch protein Krp1 regulates proliferation and differentiation of myoblasts | |
| Komiya et al. | Protocol for rat single muscle fiber isolation and culture | |
| Mangiacapra et al. | Paradoxical decrease in myf-5 messenger RNA levels during induction of myogenic differentiation by insulin-like growth factors. | |
| Zhou et al. | Thrap3 promotes osteogenesis by inhibiting the degradation of Runx2 | |
| Brooks et al. | Muscle satellite cells increase during hibernation in ground squirrels |