RU2780369C1

RU2780369C1 - METHOD FOR DETERMINING THE SPECIFIC CELLULAR IMMUNE RESPONSE TO CORONAVIRUS ANTIGENS (SARS-CoV-2)

Info

Publication number: RU2780369C1
Application number: RU2021139712A
Authority: RU
Inventors: Мария Сергеевна БЛЯХЕР; Иван Всеволодович Капустин; Светлана Игоревна Котелева; Евгений Евгеньевич Одинцов; Зарема Керимовна Рамазанова; Светлана Вячеславовна Сандалова; Елена Анатольевна Тульская; Ирина Михайловна Федорова
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-09-21

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely immunology, and can be used to determine a specific cellular immune response to antigens of the SARS-CoV-2 coronavirus. Isolation of blood mononuclears is carried out, stimulation of isolated blood mononuclears in the wells of polystyrene tablets with SARS-CoV-2 antigens sorbed in them, collection of the supernatant fluid at the end of stimulation and subsequent determination of the concentration of interferon gamma (IFNγ) in the supernatant fluid by enzyme immunoassay (ELISA). Stimulation of isolated blood mononuclears can be carried out by incubating them at 37°C in an atmosphere of 5% CO₂ with the addition of a complete culture medium RPMI-1640 with gentamicin and 10% embryonic calf serum (ECS) to a working concentration in the well of the tablet of 2.5×10⁵ cells. The concentration of IFNγ in the supernatant fluid is defined as the difference between antigen-induced and spontaneous IFNγ production.

EFFECT: method provides the possibility of a simple, effective and convenient assessment of the specific cellular immune response to the antigens of the SARS-CoV-2 coronavirus by determining the specific antigen-stimulated production of IFNγ.

2 cl, 4 tbl

Description

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения специфического клеточного иммунного ответа и может быть использовано в медицине для определения специфического клеточного иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 у переболевших и привитых пациентов.The invention relates to medical immunology, namely to a method for determining a specific cellular immune response and can be used in medicine to determine a specific cellular immune response to the SARS-CoV-2 virus in recovered and vaccinated patients.

Известно, что наряду с гуморальным, клеточный иммунитет играет важную роль в защите организма от вирусов, но на сегодняшний момент нет стандартного, удобного в исполнении метода оценки специфического клеточного иммунного ответа. При исследованиях специфического клеточного иммунного ответа на вирус SARS-CoV-2, которые проводились при испытании вакцин в разных странах, а также при обследовании пациентов, перенесших COVID-19, чаще всего использовались следующие методы: ELISPOT [1] и внутриклеточное мечение различных цитокинов на лимфоцитах [2]. Оба этих метода трудоемки, требуют высокотехнологичного оборудования, дорогих реагентов и высококвалифицированного персонала.It is known that, along with humoral, cellular immunity plays an important role in protecting the body from viruses, but at the moment there is no standard, convenient method for assessing a specific cellular immune response. In studies of the specific cellular immune response to the SARS-CoV-2 virus, which were carried out when testing vaccines in different countries, as well as in examining patients who underwent COVID-19, the following methods were most often used: ELISPOT [1] and intracellular labeling of various cytokines for lymphocytes [2]. Both of these methods are time-consuming, require high-tech equipment, expensive reagents and highly qualified personnel.

Методы, используемые для оценки антиген-специфического Т-клеточного иммунитета многообразны, так как характеризуют различные активности Т-клеток, запускаемые при их контакте с антигеном: способность пролиферировать, продуцировать различные цитокины (например, ИФНγ), лизировать клетки-мишени с помощью перфорина или гранзимов, накапливать перфорин, гранзимы А и В в виде гранул внутри Т-клетки. Почти все они требуют выделения лимфоцитов из крови обследуемого человека. Несколько вариантов таких методов реализуются на базе технологии проточной цитофлуориметрии (метод тетрамеров [3], [4], [5], метод внутриклеточного мечения [6], [7], метод дегрануляции лимфоцитов [8], [4], [9]). Для реализации этих методов требуются дорогостоящие высокоочищенные эпитопы антигенов, а в большинстве случаев еще и молекулы главного комплекса гистосовместимости. Данные методы очень точны и специфичны, но малопригодны для массовых исследований из-за трудоемкости и/или высокой стоимости.The methods used to assess antigen-specific T-cell immunity are diverse, as they characterize the various activities of T-cells triggered by their contact with antigen: the ability to proliferate, to produce various cytokines (for example, IFNγ), to lyse target cells with perforin, or granzymes, accumulate perforin, granzymes A and B in the form of granules inside the T cell. Almost all of them require the isolation of lymphocytes from the blood of the person being examined. Several variants of such methods are implemented on the basis of flow cytometry technology (tetramer method [3], [4], [5], intracellular labeling method [6], [7], lymphocyte degranulation method [8], [4], [9] ). These methods require expensive, highly purified antigen epitopes and, in most cases, major histocompatibility complex molecules. These methods are very accurate and specific, but are of little use for mass studies due to laboriousness and/or high cost.

Антигенспецифическая пролиферация Т-клеток также может быть реализована на платформе проточной цитофлуориметрии, однако, чаще оценивается по включению радионуклидной метки [10].Antigen-specific T-cell proliferation can also be realized on the platform of flow cytometry, however, it is more often assessed by the inclusion of a radionuclide label [10].

Для метода ELISPOT требуется специальное оборудование, где в планшетах с мембраной, содержащей антитела против ИФНγ, определяется количество Т-клеток, распознавших антиген и продуцирующих ИФНγ [11].The ELISPOT method requires special equipment, where in plates with a membrane containing antibodies against IFNγ, the number of T cells that recognize the antigen and produce IFNγ is determined [11].

Общим ограничением перечисленных способов, затрудняющим массовые исследования Т-клеточного иммунного ответа, сравнимые по масштабам с определением гуморального иммунного ответа, является генетическая рестрикция распознавания антигенов Т-клетками. Это означает, что лимфоциты людей, генетически различающихся по антигенам главного комплекса гистосовместимости (HLA), в одном и том же белке распознают разные эпитопы.A common limitation of these methods, which complicates mass studies of the T-cell immune response, comparable in scale with the determination of the humoral immune response, is the genetic restriction of antigen recognition by T-cells. This means that lymphocytes of people genetically different in major histocompatibility complex (HLA) antigens recognize different epitopes in the same protein.

Таким образом, существуют сложности при создании тест-системы, подходящей для всех людей и каждый вариант надо конкретизировать.Thus, there are difficulties in creating a test system suitable for all people, and each option must be specified.

Это затруднение преодолевается несколькими способами.This difficulty is overcome in several ways.

Во-первых, можно для активации лимфоцитов использовать целую «библиотеку» перекрывающихся эпитопов белка или надмолекулярной белковой структуры. Тогда в этом наборе с большой вероятностью найдется эпитоп, который способны распознать Т-клетки памяти любого человека. Этот вариант используется только для научной работы.First, it is possible to use a whole "library" of overlapping epitopes of a protein or supramolecular protein structure to activate lymphocytes. Then, in this set, there is a high probability that there will be an epitope that any person's memory T-cells can recognize. This option is used only for scientific work.

Во-вторых, если необходимо выявить Т-клетки памяти у максимально возможного числа людей, в коммерческую тест-систему в качестве стимулирующего антигена добавляется набор из 3-7 эпитопов, которые способны распознать 50-80% всех людей. Таким образом, организованы тест-системы ELISPOT для диагностики состояния Т-клеток при инфекциях, вызываемых вирусами герпес-группы, как важных для исхода трансплантаций или лечения цитостатиками.Secondly, if it is necessary to detect memory T cells in the maximum possible number of people, a set of 3-7 epitopes that are able to recognize 50-80% of all people are added to the commercial test system as a stimulating antigen. Thus, ELISPOT test systems were organized to diagnose the state of T cells in infections caused by herpes group viruses, as important for the outcome of transplantations or treatment with cytostatics.

В-третьих, для стимуляции можно использовать целые белковые антигены, вирусные частицы и т.п., однако не все эпитопы, против которых в организме сформированы Т-клетки памяти, находятся на поверхности таких крупных антигенов. В этом случае необходимо предусмотреть условия для того, чтобы крупные антигены могли пройти процессинг в антигенпредставляющих клетках и были представлены Т-клеткам памяти в доступной для них форме. Такими условиями является наличие в клеточной взвеси не только лимфоцитов, среди которых надо выявить Т-клетки памяти, но и элементов, способных трансформироваться в антигенпредставляющую клетку (например, моноциты).Thirdly, whole protein antigens, viral particles, etc., can be used for stimulation, but not all epitopes against which memory T-cells are formed in the body are located on the surface of such large antigens. In this case, it is necessary to provide conditions for large antigens to be processed in antigen-presenting cells and presented to memory T-cells in a form accessible to them. Such conditions are the presence in the cell suspension not only of lymphocytes, among which it is necessary to identify T-memory cells, but also of elements capable of transforming into an antigen-presenting cell (for example, monocytes).

Для разработки метода мониторинга Т-клеточного иммунитета, предполагающего массовые обследования людей, подходит только этот последний вариант стимуляции, однако при этом должны соблюдаться и иные условия.For the development of a method for monitoring T-cell immunity, which involves mass examinations of people, only this last stimulation option is suitable, but other conditions must also be met.

В российской и иностранной научной литературе предлагаются различные методы для мониторинга Т-клеток памяти у пациентов, вакцинированных той или иной вакциной, в частности, против SARS-CoV-2. Для этого среди лимфоцитов привитых людей определяют процент клеток с иммунофенотипом Т-клеток памяти [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]. В настоящее время существуют коммерчески доступные реагенты (флуоресцентно меченные моноклональные антитела), которые позволяют провести такой анализ в лабораториях, имеющих оборудование для проточной цитофлуориметрииRussian and foreign scientific literature offers various methods for monitoring memory T cells in patients vaccinated with a particular vaccine, in particular against SARS-CoV-2. To do this, among the lymphocytes of vaccinated people, the percentage of cells with the immunophenotype of memory T-cells is determined [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]. Currently, there are commercially available reagents (fluorescently labeled monoclonal antibodies) that allow such analysis to be carried out in laboratories with flow cytometry equipment.

В наиболее простом варианте реализации данного подхода проводят сравнение количества лимфоцитов, имеющих иммунофенотип Т-клеток памяти до проведения вакцинации и после нее. Такая оценка неточна, т.к. клетки памяти к конкретному антигену (набору антигенов) составляют доли процента от общего количества таких клеток у взрослого человека [17], [18], [19].In the simplest implementation of this approach, a comparison is made of the number of lymphocytes with the immunophenotype of T-memory cells before and after vaccination. Such an estimate is inaccurate, because memory cells to a particular antigen (set of antigens) make up a fraction of a percent of the total number of such cells in an adult [17], [18], [19].

Более специфичной является оценка, основанная на том же методе, но включающая этап стимуляции лимфоцитов привитого человека вакцинными антигенами. При добавлении этого этапа клетки, которые в покое слабо экспрессируют на клеточной поверхности маркеры Т-клеток памяти, после стимуляции могут быть выявлены более точно. После проведения проточной цитофлуориметрии вычисляется коэффициент стимуляции экспрессии указанных маркеров примененным антигеном (смесью антигенов) [20], [21]. В обоих вариантах метод предполагает использование дорогостоящих реагентов и возможен только при оценке эффекта от вакцинации, т.к. предполагает сравнение с исходным (до вакцинации) уровнем реакции.More specific is an assessment based on the same method, but including the step of stimulating the vaccinated person's lymphocytes with vaccine antigens. By adding this step, cells that at rest weakly express memory T-cell markers on the cell surface can be more accurately detected after stimulation. After flow cytometry, the coefficient of stimulation of the expression of the indicated markers by the applied antigen (mixture of antigens) is calculated [20], [21]. In both versions, the method involves the use of expensive reagents and is possible only when assessing the effect of vaccination, because. involves comparison with baseline (pre-vaccination) response rates.

Антигенная стимуляция вакцинным антигеном в этой группе известных методов не предполагает типирования лимфоцитов человека в отношении антигенов главного комплекса гистосовместимости, что с одной стороны удешевляет процедуру, делая ее пригодной для массовых обследований, но одновременно и снижает специфичность оценки по сравнению с методами, перечисленными выше и предназначенными в основном для научных исследований.Antigenic stimulation with a vaccine antigen in this group of known methods does not imply typing of human lymphocytes in relation to major histocompatibility complex antigens, which, on the one hand, reduces the cost of the procedure, making it suitable for mass examinations, but at the same time reduces the specificity of the assessment compared to the methods listed above and intended mainly for scientific research.

Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является технология QuantiFERON. Она, как и ELISPOT, относится к группе технологий IGRA (interferon gamma releasing assay - тесты, основанные на регистрации антиген-стимулированного выделения интерферона гамма(IFNγ)). Первоначально эта технология имела коммерческую реализацию в виде набора для диагностики Т-клеточного иммунитета против туберкулеза (QuantiFERON-TB Gold), затем для диагностики Т-клеточного иммунитета против цитомегаловирусной инфекции (QuantiFERON- CMV), а в настоящее время и против SARS-CoV-2 (QuantiFERON SARS-CoV-2) [22].The closest analogue of the present invention is the QuantiFERON technology. It, like ELISPOT, belongs to the IGRA technology group (interferon gamma releasing assay - tests based on the registration of antigen-stimulated release of interferon gamma (IFNγ)). Initially, this technology was commercialized as a kit for the diagnosis of T-cell immunity against tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold), then for the diagnosis of T-cell immunity against cytomegalovirus infection (QuantiFERON-CMV), and now against SARS-CoV- 2 (QuantiFERON SARS-CoV-2) [22].

Набор реагентов QuantiFERON-SARS-CoV-2 предназначен для определения клеточного ответа к пептидным антигенам S1 S2 RBD из спайкового белка короновируса SARS-CoV-2 по уровню продукции IFNγ в образцах цельной гепаринизированной крови. Для реализации метода цельную кровь делят на 4 порции: негативный контроль, позитивный контроль, антиген S1, антиген S2 RBD. Полученные 4 пробирки (по 1 мл крови в каждой) сутки инкубируют в термостате, затем отделяют плазму центрифугированием. Уровень продукции IFNγ определяют методом иммуноферментного анализа.The QuantiFERON-SARS-CoV-2 reagent kit is designed to determine the cellular response to the S1 S2 RBD peptide antigens from the SARS-CoV-2 coronovirus spike protein by the level of IFNγ production in heparinized whole blood samples. To implement the method, whole blood is divided into 4 portions: negative control, positive control, antigen S1, antigen S2 RBD. The resulting 4 test tubes (1 ml of blood each) are incubated for a day in a thermostat, then the plasma is separated by centrifugation. The level of production of IFNγ is determined by enzyme immunoassay.

Однако реализация данного метода требует использования реагентов от зарубежных производителей, что делает его неэкономичным и усложняет его применение для массовых исследований. Кроме того, в стандартном наборе QuantiFERON- SARS-CoV-2 отсутствует отрицательный контроль специфичности.However, the implementation of this method requires the use of reagents from foreign manufacturers, which makes it uneconomical and complicates its use for mass studies. In addition, there is no negative specificity control in the standard QuantiFERON-SARS-CoV-2 kit.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Задачей настоящего изобретения является разработка простого, эффективного и удобного в применении способа оценки специфического клеточного иммунного ответа на антигены коронавируса SARS-CoV-2 на основе специфической антигенстимулированной продукции IFNγ.The object of the present invention is to develop a simple, efficient and easy-to-use method for assessing a specific cellular immune response to SARS-CoV-2 coronavirus antigens based on specific antigen-stimulated production of IFNγ.

Для решения поставленной задачи настоящее изобретение предлагает способ определения специфического клеточного иммунного ответа на антигены коронавируса SARS-CoV-2, включающий выделение мононуклеаров крови, стимуляцию выделенных мононуклеаров крови в лунках полистироловых планшетов с сорбированными в них антигенами SARS-CoV-2, сбор надосадочной жидкости по окончании стимуляции и последующее определение концентрации интерферона гамма (IFNγ) в надосадочной жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА).To solve this problem, the present invention proposes a method for determining a specific cellular immune response to SARS-CoV-2 coronavirus antigens, including the isolation of blood mononuclear cells, stimulation of the isolated blood mononuclear cells in the wells of polystyrene plates with SARS-CoV-2 antigens adsorbed in them, collection of the supernatant by the end of stimulation and the subsequent determination of the concentration of interferon gamma (IFNγ) in the supernatant by enzyme immunoassay (ELISA).

Предложенный способ имеет следующие преимущества, которые делают его пригодным для мониторинга Т-клеточного ответа в популяции:The proposed method has the following advantages, which make it suitable for monitoring the T-cell response in a population:

1. Способ является более экономичным по сравнению с наиболее близким аналогом, так как не требует дорогостоящего оборудования и может быть реализован с использованием реагентов российских производителей, т.е. способ не сопряжен с риском задержки поставок.1. The method is more economical compared to the closest analogue, since it does not require expensive equipment and can be implemented using reagents from Russian manufacturers, i.e. the method does not involve the risk of delaying deliveries.

2. Способ позволяет использовать готовые полистироловые планшеты ИФА-тест-систем, прошедших регистрацию для медицинских целей, с фиксированным антигеном вируса SARS-CoV-2, которые применяются для титрования антител соответствующей специфичности, что позволяет дополнительно стандартизовать метод.2. The method allows the use of ready-made polystyrene plates of ELISA test systems registered for medical purposes with a fixed antigen of the SARS-CoV-2 virus, which are used for titration of antibodies of the appropriate specificity, which allows additional standardization of the method.

3. Способ подходит для людей с любым гаплотипом по антигенам главного комплекса гистосовместимости (HLA) и может быть осуществлен в течение суток.3. The method is suitable for people with any major histocompatibility complex (HLA) haplotype and can be carried out within a day.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

В описании данного изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя» следует понимать, как «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.In the description of the present invention, the terms "comprises", "including" and "comprises" should be understood as "includes, among other things". These terms are not intended to be construed as "consisting only of". Unless otherwise defined, the technical and scientific terms in this application have the standard meanings generally accepted in the scientific and technical literature.

Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают объем изобретения.The following examples are given to illustrate the present invention and do not limit the scope of the invention.

Пример осуществления изобретения 1.An example of the invention 1.

Определение специфического клеточного иммунного ответа на антигены коронавируса SARS-CoV-2 в образцах крови доноров, перенесших COVID-19 (диагноз подтвержден методом ПЦР и серологически) весной и летом 2020 г. (группа 1), и в образцах крови доноров, не болевших COVID-19 (группа 2).Determination of specific cellular immune response to SARS-CoV-2 coronavirus antigens in blood samples of donors who underwent COVID-19 (the diagnosis was confirmed by PCR and serologically) in the spring and summer of 2020 (group 1), and in blood samples of donors who did not have COVID -19 (group 2).

Методика исследования.Research methodology.

3 мл крови, взятой в гепарин, смешивали с 3 мл раствора ЗФР (забуференный фосфатами физиологический раствор, рН=7,2) и центрифугировали в градиенте плотности (d=1,077) при 400g 20 минут. По окончании центрифугирования из интерфазы собирали слой мононуклеаров. Эти клетки отмывали культуральной средой RPMI-164 0 путем центрифугирования при 1100 об/мин 10 минут. Полученный клеточный осадок разводили полной культуральной средой (среда RPMI-1640 с гентамицином и 10% эмбриональной телячьей сывороткой). Рабочая концентрация лимфоцитов в лунке - 2,5×10⁵ клеток.3 ml of blood taken in heparin was mixed with 3 ml of PBS solution (phosphate buffered saline, pH=7.2) and centrifuged in a density gradient (d=1.077) at 400g for 20 minutes. At the end of centrifugation, a layer of mononuclear cells was collected from the interphase. These cells were washed with RPMI-1640 culture medium by centrifugation at 1100 rpm for 10 minutes. The resulting cell pellet was diluted with complete culture medium (RPMI-1640 medium with gentamicin and 10% fetal calf serum). The working concentration of lymphocytes in the well is 2.5×10 ⁵ cells.

Для антигенной стимуляции мононуклеаров использовали полистироловые планшеты с сорбированным цельновирионным инактивированным антигеном SARS-CoV-2, предназначенные для выявления IgG-антител к SARS-CoV-2 (производство ФБУН ГНЦ «Вектор», № РЗН 2020/10017 от 10.04.2020, далее Антиген 1). Планшет инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO₂ 24 часа (на тест-системе производства ФБУН ГНЦ «Вектор»).For antigenic stimulation of mononuclear cells, polystyrene plates with adsorbed whole-virion inactivated SARS-CoV-2 antigen were used, designed to detect IgG antibodies to SARS-CoV-2 (manufactured by FBSI SRC "Vector", No. RZN 2020/10017 dated 10.04.2020, hereinafter Antigen one). The tablet was incubated at 37°C in an atmosphere of 5% CO ₂ for 24 hours (on a test system produced by FBSI GNTs "Vector").

Для контроля специфичности использовали полистироловые планшеты с сорбированным вирусом Денге (тип 1 штамм Гавайи, тип 2 Новая Гвинея, тип 3 штамм Н87 и тип 4 штамм Н241), предназначенные для выявления IgG-антител к вирусу Денге (производство Vircell, S.L., Испания,REF-G1018).To control the specificity, polystyrene plates with adsorbed Dengue virus (type 1 strain Hawaii, type 2 New Guinea, type 3 strain H87 and type 4 strain H241) were used to detect IgG antibodies to Dengue virus (manufactured by Vircell, S.L., Spain, REF -G1018).

Контрольный образец представлял собой пробу, инкубированную в аналогичных условиях без антигена.The control sample was a sample incubated under similar conditions without antigen.

Собранные через 24 часа культивирования супернатанты хранили до исследования в замороженном состоянии (-40°С). Концентрацию IFNγ определяли на ИФА-тест-системах (производство ООО «Вектор-Бест», № РЗН 2017/16008 от 24.07.2017).Collected after 24 hours of cultivation, the supernatants were stored frozen (-40°C) until the study. The concentration of IFNγ was determined using ELISA test systems (manufactured by Vector-Best LLC, no. RZN 2017/16008 of 07/24/2017).

Результаты учитывали как разницу между антиген индуцированной и спонтанной продукцией IFNγ (Δ). Полученные данные представлены в таблицах 1-3.The results were taken into account as the difference between antigen-induced and spontaneous production of IFNγ (Δ). The data obtained are presented in tables 1-3.

В таблице 1 для каждого из обследованных людей, перенесших COVID-19, увеличение продукции ИФНγ при стимуляции их мононуклеаров на ИФА-планшете, содержащем цельновирионный антиген SARS-COV-2, превышает таковую при стимуляции на планшете с антигенами вируса Денге в 1,5-4 0 раз, а само увеличение этого ответа на вирус Денге у половины доноров не превышает 5 пг/мл.In Table 1, for each of the examined people who underwent COVID-19, the increase in IFNγ production upon stimulation of their mononuclear cells on an ELISA plate containing the SARS-COV-2 whole-virion antigen exceeds that upon stimulation on a plate with Dengue virus antigens by 1.5- 40 times, and the increase in this response to the Dengue virus in half of the donors does not exceed 5 pg/ml.

Из таблицы 2 видно, что у лиц, не болевших COVID-19 реакция мононуклеаров на антигены SARS-CoV-2 практически такая же низкая, как и на антигены вируса Денге.Table 2 shows that in individuals who have not had COVID-19, the response of mononuclear cells to SARS-CoV-2 antigens is almost as low as to Dengue virus antigens.

Статистическая обработка результатов данного примера, приведенная в таблице 3, показывает, что после стимуляции in vitro антигенами SARS-CoV-2 продукция IFNγ мононуклеарными клетками периферической крови доноров, не болевших COVID-19, значимо ниже, чем у лиц, перенесших это заболевание. На стимуляцию посторонним антигеном (вирус Денге) реакция мононуклеаров в обеих группах была низкой и практически одинаковой.Statistical processing of the results of this example, shown in Table 3, shows that after in vitro stimulation with SARS-CoV-2 antigens, the production of IFNγ by peripheral blood mononuclear cells of donors who did not have COVID-19 was significantly lower than in individuals who had this disease. To stimulation with a foreign antigen (Dengue virus), the response of mononuclear cells in both groups was low and almost the same.

Пример осуществления изобретения 2.An example of the invention 2.

Определение специфического клеточного иммунного ответа на антигены коронавируса SARS-CoV-2 в образцах крови доноров, перенесших COVID-19.Determination of the specific cellular immune response to SARS-CoV-2 coronavirus antigens in blood samples from donors who underwent COVID-19.

Методика исследования.Research methodology.

Приготовление взвеси мононуклеаров осуществлялось как в примере 1.The preparation of a suspension of mononuclear cells was carried out as in example 1.

Для антигенной стимуляции мононуклеаров использовали полистироловые планшеты:Polystyrene plates were used for antigenic stimulation of mononuclear cells:

• с иммобилизованным рекомбинантным антигеном SARS-CoV-2(полноразмерным поверхностным гликопротеином S, включающим рецептор-связывающий домен (RBD)), предназначенные для выявления IgG-антител к SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2- IgG-ИФА-БЕСТ, производство АО Вектор-Бест, Россия, № РЗН 2020/10388 от 18.05.2020, далее Антиген 2),• with immobilized recombinant SARS-CoV-2 antigen (full-length surface glycoprotein S, including receptor-binding domain (RBD)), designed to detect IgG antibodies to SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-IgG-ELISA-BEST , manufactured by JSC Vector-Best, Russia, No. RZN 2020/10388 dated 05/18/2020, hereinafter Antigen 2),

• с сорбированным антигеном SARS-CoV-2, предназначенные для выявления IgG к рецептор-связывающему домену (RBD) поверхностного гликопротеина S (spike) коронавируса SARS-CoV-2 («SARS-CoV-2-RBD-ИФА-Гамалеи», производство ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России (филиал "Медгамал"), № РЗН 2020/10393 от 18.05.2020, далее Антиген 3).• with adsorbed SARS-CoV-2 antigen, designed to detect IgG to the receptor-binding domain (RBD) of the surface glycoprotein S (spike) of SARS-CoV-2 coronavirus (“SARS-CoV-2-RBD-ELISA-Gamaleya”, production FSBI "N.F. Gamaleya Research Center for Epidemiology and Microbiology" of the Ministry of Health of Russia (branch "Medgamal"), No. RZN 2020/10393 dated 05/18/2020, hereinafter Antigen 3).

Все планшеты инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO₂ 72 часа.All plates were incubated at 37°C in an atmosphere of 5% CO ₂ 72 hours.

Сбор супернатантов, определение концентрации IFNγ и учет результатов выполняли как в примере 1.The collection of supernatants, determination of the concentration of IFNγ and accounting of the results were performed as in example 1.

Полученные данные представлены в таблице 4.The data obtained are presented in table 4.

В строках таблицы 4 можно видеть как мононуклеары одного и того же человека, переболевшего COVID-19, отвечают на два различающихся по размеру и структуре антигена SARS-COV-2: Антиген 2 (рекомбинантный поверхностный гликопротеин S (spike) коронавируса SARS-CoV-2) и Антиген 3 (рекомбинантный рецептор-связывающий домен (RBD) поверхностного гликопротеина S (spike) коронавируса SARS-CoV-2.In the rows of Table 4, you can see how the mononuclear cells of the same person who recovered from COVID-19 respond to two SARS-COV-2 antigens that differ in size and structure: Antigen 2 (recombinant surface glycoprotein S (spike) of the SARS-CoV-2 coronavirus ) and Antigen 3 (recombinant receptor-binding domain (RBD) of surface glycoprotein S (spike) of SARS-CoV-2 coronavirus.

Так же, как и в таблице 1, увеличение продукции ИФНγ при стимуляции мононуклеаров переболевших людей на ИФА-планшетах, содержащих тот или иной антиген SARS-COV-2, превышает таковую при стимуляции на планшете с антигенами вируса Денге. У всех переболевших мононуклеары реагировали на Антиген 2 и у 9 из 12 реагировали (примерно на том же уровне, что и на Антиген 2) на Антиген 3, являющийся небольшим фрагментом Антигена 2. Из научной литературы известно, что, в ходе заболевания (а не вакцинации), не у всех переболевших образуется Т-клеточная память к рецептор-связывающему домену (RBD) поверхностного гликопротеина S [23].As in Table 1, the increase in IFNγ production upon stimulation of mononuclear cells of recovered people on ELISA plates containing one or another SARS-COV-2 antigen exceeds that upon stimulation on a plate with Dengue virus antigens. In all recovered patients, mononuclear cells reacted to Antigen 2, and in 9 out of 12 they reacted (at about the same level as to Antigen 2) to Antigen 3, which is a small fragment of Antigen 2. It is known from the scientific literature that, during the course of the disease (and not vaccination), not all recovered patients develop T-cell memory to the receptor-binding domain (RBD) of surface glycoprotein S [23].

Таким образом, предложенный метод является специфичным, достаточно чувствительным и гораздо более доступным, чем методы оценки специфического клеточного иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2, используемые в настоящее время.Thus, the proposed method is specific, sufficiently sensitive, and much more accessible than the currently used methods for assessing the specific cellular immune response to the SARS-CoV-2 virus.

Список цитируемых публикацийList of cited publications

1. Feng-Cai Zhu, Xu-Hua Guan, Yu-Hua Li, Jian-Ying Huang, Tao Jiang, et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebocontrolled, phase 2 trial. Lancet 2020; 396: 479-488, DOI:10.1016/S0140-6736(20)31605-61. Feng-Cai Zhu, Xu-Hua Guan, Yu-Hua Li, Jian-Ying Huang, Tao Jiang, et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebocontrolled, phase 2 trial. Lancet 2020; 396:479-488, DOI:10.1016/S0140-6736(20)31605-6

2. DiPiazza А.Т., Graham B.S. and Ruckwardt T.J. T cell immunity to SARS-CoV-2 following natural infection and vaccination. Biochemical and Biophysical Research Communications, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.10.0602. DiPiazza A.T., Graham B.S. and Ruckwardt T.J. T cell immunity to SARS-CoV-2 following natural infection and vaccination. Biochemical and Biophysical Research Communications, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.10.060

3. Kostense S., Ogg G.S., Manting E.H., Gillespie G., Joling J., Vandenberghe K., Veenhof E. Z., van Baarle D., Jurriaans S., Klein M. R., Miedema F. High viral burden in the presence of major HIV-specific CD8⁺ T cell expansions: evidence for impaired CTL effector function Eur J Immunol. 2001 Mar;31(3):677-86. doi: 10.1002/1521-4141(200103)31:3<677::aid-immu677>3.0.со;2-m.3. Kostense S., Ogg GS, Manting EH, Gillespie G., Joling J., Vandenberghe K., Veenhof EZ, van Baarle D., Jurriaans S., Klein MR, Miedema F. High viral burden in the presence of major HIV-specific CD8 ⁺ T cell expansions: evidence for impaired CTL effector function Eur J Immunol. 2001 Mar;31(3):677-86. doi: 10.1002/1521-4141(200103)31:3<677::aid-immu677>3.0.co;2-m.

4. Ndhlovu Z.M., Oelke M., Schneck J.P., and Griffin D.E. Dynamic regulation of functionally distinct virus-specific T cells PNAS, February, 2010, vol. 107, no. 8, 3669-36744. Ndhlovu Z.M., Oelke M., Schneck J.P., and Griffin D.E. Dynamic regulation of functionally distinct virus-specific T cells PNAS, February, 2010, vol. 107, no. 8, 3669-3674

5. Callan M.F.C., Fazou C, Yang H., Rostron Т., Poon K., Hatton C., and McMichael A. J.. CD8+ T-cell selection, function, and death in the primary immune response in vivo J. Clin. Invest. 106:1251-1261 (2000).5. Callan M.F.C., Fazou C, Yang H., Rostron T., Poon K., Hatton C., and McMichael A. J.. CD8+ T-cell selection, function, and death in the primary immune response in vivo J. Clin. Invest. 106:1251-1261 (2000).

6. Badovinac V.P., Harty J.T. Intracellular staining for TNF and IFN-gamma detects different frequencies of antigen-specific CD8(+) T cells J Immunol Methods. 2000 Apr 21;238(1-2):107-17. doi: 10.1016/s0022-1759(00)00153-8.6. Badovinac V.P., Harty J.T. Intracellular staining for TNF and IFN-gamma detects different frequencies of antigen-specific CD8(+) T cells J Immunol Methods. 2000 Apr 21;238(1-2):107-17. doi: 10.1016/s0022-1759(00)00153-8.

7. Won DI, Park JR. Flow cytometric measurements of TB-specific T Cells comparing with QuantiFERON-TB gold. Cytometry Part В 2010; 78B: 71-80.7. Won DI, Park JR. Flow cytometric measurements of TB-specific T Cells comparing with QuantiFERON-TB gold. Cytometry Part In 2010; 78B:71-80.

8. Laing K.J., Magaret A.S., Mueller D.E., Zhao L., Johnston C, De Rosa S.C., Koelle D.M., Wald A., Corey L.. Diversity in CD8+ T Cell Function and Epitope Breadth Among Persons with Genital Herpes J Clin Immunol. 2010 September; 30(5): 703-722.8. Laing K.J., Magaret A.S., Mueller D.E., Zhao L., Johnston C, De Rosa S.C., Koelle D.M., Wald A., Corey L.. Diversity in CD8+ T Cell Function and Epitope Breadth Among Persons with Genital Herpes J Clin Immunol . September 2010; 30(5): 703-722.

9. Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Аксенова В.А. Иммунологические показатели как критерий оценки туберкулезного процесса у инфицированных микобактериями туберкулеза и больных туберкулезом легких детей и подростков Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2011, 2 (78), 2069. Mordovskaya L.I., Vladimirsky M.A., Aksenova V.A. Immunological indicators as a criterion for assessing the tuberculosis process in children and adolescents infected with mycobacterium tuberculosis and pulmonary tuberculosis Bulletin of the All-Russian Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, 2011, 2 (78), 206

10. Edelman K., Не Q., Makinen J, Sahlberg A., Haanpera M., Schuerman L.,Wolter J., and Jussi Mertsolal Immunity to Pertussis 5 Years after Booster Immunization during Adolescence Clinical Infectious Diseases 2007; 44:1271-7 DOI: 10.1086/51433810. Edelman K., He Q., Makinen J, Sahlberg A., Haanpera M., Schuerman L., Wolter J., and Jussi Mertsolal Immunity to Pertussis 5 Years after Booster Immunization during Adolescence Clinical Infectious Diseases 2007; 44:1271-7 DOI: 10.1086/514338

11. Moormann A.M., Heller K.N., Chelimo K., Embury P., Ploutz-Snyder R., Otieno J.A., Oduor, C.

M., and Rochford R.. Children with Endemic Burkitt Lymphoma are Deficient in EBNA1-Specific IFN-γ T Cell Responses, Int J Cancer. 2009 April 1; 124(7): 1721-1726. doi:10.1002/ijc.24014.11. Moormann AM, Heller KN, Chelimo K., Embury P., Ploutz-Snyder R., Otieno JA, Oduor, C.

M., and Rochford R.. Children with Endemic Burkitt Lymphoma are Deficient in EBNA1-Specific IFN-γ T Cell Responses, Int J Cancer. April 1, 2009; 124(7): 1721-1726. doi:10.1002/ijc.24014.

12. McElhaney J.E., Pinkoski M.J., Meneilly G.S. Changes in CD45 isoform expression vary according to the duration of T-cell memory after vaccination // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995; 2: 73-81.12. McElhaney J.E., Pinkoski M.J., Meneilly G.S. Changes in CD45 isoform expression vary according to the duration of T-cell memory after vaccination // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995; 2:73-81.

13. Waldrop S.L., Pitcher C.J., Peterson D.M., Maino V.C., Picker L.J. Determination of antigenspecific memory/effector CD4+ T cell frequencies by flow cytometry: evidence for a novel, antigenspecific homeostatic mechanism in HIV-associated immunodeficiency // J. Clin. Invest. 1997; 99: 1739-1750.13. Waldrop S.L., Pitcher C.J., Peterson D.M., Maino V.C., Picker L.J. Determination of antigenspecific memory/effector CD4+ T cell frequencies by flow cytometry: evidence for a novel, antigenspecific homeostatic mechanism in HIV-associated immunodeficiency // J. Clin. Invest. 1997; 99: 1739-1750.

14. Sallusto F., Lanzavecchia A. Exploring pathways for memory T cell generation // J. Clin. Invest. 2001; 108: 805-806.14. Sallusto F., Lanzavecchia A. Exploring pathways for memory T cell generation // J. Clin. Invest. 2001; 108:805-806.

15. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central Memory and Effector Memory T Cell Subsets: Function, Generation, and Maintenance // Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 745-763.15. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central Memory and Effector Memory T Cell Subsets: Function, Generation, and Maintenance // Annu. Rev. Immunol. 2004; 22:745-763.

16. Williams M.A., Bevan M.J. Effector and Memory CTL Differentiation // Annu. Rev. Immunol. 2007; 25: 171-192.16. Williams M.A., Bevan M.J. Effector and Memory CTL Differentiation // Annu. Rev. Immunol. 2007; 25:171-192.

17. Найхин А.Н., Кореньков Д.А., Петухова Г.Д. Оценка Т-клеточной иммунологической памяти по экспрессии молекул CD4 5 у людей, привитых живой реассортантной гриппозной вакциной. Медицинская иммунология. 2008; 10 (6): 535-42.17. Naikhin A.N., Korenkov D.A., Petukhova G.D. Assessment of T-cell immunological memory by the expression of CD4 5 molecules in humans vaccinated with a live reassortant influenza vaccine. Medical immunology. 2008; 10(6):535-42.

18. Щуковская Т.Н., Смолькова Е.А., Шмелькова Т.П. Индуцированная продукция INF-g и IL-4 как показатель функциональной активности Th1- и Th2-клеток у вакцинированных против чумы людей. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011; 6 (61): 78-83.18. Shchukovskaya T.N., Smolkova E.A., Shmelkova T.P. Induced production of INF-g and IL-4 as an indicator of the functional activity of Th1 and Th2 cells in people vaccinated against plague. Epidemiology and vaccination. 2011; 6(61):78-83.

19. Найхин А.Н., Донина С.А., Лосев И.В., Петухова Г.Д., Кореньков Д.А., Стукова М.А., Ерофеева М.К., Коншина О.С., Смолоногина Т.А., Дорошенко Е.М., Григорьева Е.П., Руденко Л.Г. Гомологичный и гетерологичный гуморальный и т-клеточный иммунный ответ людей на живые реассортантные гриппозные вакцины A(H5N2) и A(H7N3). // Медицинская иммунология. 2015; 17 (1): 59-70.19. Naikhin A.N., Donina S.A., Losev I.V., Petukhova G.D., Korenkov D.A., Stukova M.A., Erofeeva M.K., Konshina O.S., Smolonogina T.A., Doroshenko E.M., Grigorieva E.P., Rudenko L.G. Human homologous and heterologous humoral and t-cell immune response to live reassortant A(H5N2) and A(H7N3) influenza vaccines. // Medical immunology. 2015; 17(1):59-70.

20. Богачева Н.В., Крючков А.В., Дармов И.В., Воробьев К.А., Печенкин Д.В., Елагин Г.Д., Колесников Д.П. Экспериментальна я оценка методом проточной цитофлюориметрии уровня клеточной иммунологической памяти у лиц, вакцинированных против чумы и сибирской язвы. // Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 11: 48-53.20. Bogacheva N.V., Kryuchkov A.V., Darmov I.V., Vorobyov K.A., Pechenkin D.V., Elagin G.D., Kolesnikov D.P. Experimental assessment of the level of cellular immunological memory in individuals vaccinated against plague and anthrax by flow cytometry. // Clinical laboratory diagnostics. 2013; 11:48-53.

21. Куличенко А.Н., Абзаева Н.В., Гостищева С.Е., Ракитина Е.Л., Пономаренко Д.Г., Костюченко М.В. Использование антигенспецифических клеточных тестов in vitro для оценки формирования поствакцинального противочумного иммунитета. // Инфекция и иммунитет. 2017; 7 (2): 203-208.21. Kulichenko A.N., Abzaeva N.V., Gostishcheva S.E., Rakitina E.L., Ponomarenko D.G., Kostyuchenko M.V. The use of antigen-specific in vitro cell tests to assess the formation of post-vaccination anti-plague immunity. // Infection and immunity. 2017; 7(2):203-208.

22. https://www.qiagen.com/us/products/diagnostics-and-clinical-research/infectious-disease/quantiferon-sars-cov-2-ruo/?clear=true#orderinginformation22. https://www.qiagen.com/us/products/diagnostics-and-clinical-research/infectious-disease/quantiferon-sars-cov-2-ruo/?clear=true#orderinginformation

23. Ling Ni, Fang Ye, Meng-Li Cheng, Yu Feng, et al. Detection of SARS-CoV-2-Specific Humoral and Cellular Immunity in COVID-19 Convalescent Individuals/ Immunity. 2020; 52, 971-977.23. Ling Ni, Fang Ye, Meng-Li Cheng, Yu Feng, et al. Detection of SARS-CoV-2-Specific Humoral and Cellular Immunity in COVID-19 Convalescent Individuals/ Immunity. 2020; 52, 971-977.

Claims

1. A method for determining a specific cellular immune response to SARS-CoV-2 coronavirus antigens, including the isolation of blood mononuclear cells, stimulation of the isolated blood mononuclear cells in the wells of polystyrene plates with SARS-CoV-2 antigens adsorbed in them, collection of the supernatant at the end of stimulation and subsequent determination concentration of interferon gamma (IFNγ) in the supernatant by enzyme immunoassay (ELISA).

2. The method according to claim 1, where the stimulation of isolated blood mononuclear cells is carried out by incubating them at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ with the addition of a complete culture medium RPMI-1640 with gentamicin and 10% fetal calf serum (FBS) to a working concentration of well tablet 2.5×10 ⁵ cells and where the concentration of IFNγ in the supernatant is defined as the difference between antigen-induced and spontaneous production of IFNγ.