RU2777769C2

RU2777769C2 - Target antigen detection, phenotypic screening and its application for identification of specific target cell epitopes

Info

Publication number: RU2777769C2
Application number: RU2019101179A
Authority: RU
Inventors: Янь Чэнь; Стив ШАМАХ
Original assignee: Экс-Боди, Инк.
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2014-06-20
Publication date: 2022-08-09

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. A method for identifying a binding polypeptide that specifically binds to a cell surface antigen is described. The method includes the following steps: bringing into contact a library of cell-free display of various DNA-binding polypeptides with a cell surface antigen presented on the outer surface of cells of the first type; isolation from the library of at least one library element that specifically binds to the cell surface antigen on the outer surface of cells of the first type; selection of the DNA coding sequence of the selected library elements from the attached binding polypeptide by cleavage by restriction endonuclease in the restriction endonuclease recognition site, which is not present in the coding sequence of the elements of the DNA display library; and determination of the DNA coding sequence of at least part of the selected library elements, where the coding sequence of the DNA of the CDR3 region is determined.

EFFECT: invention expands the arsenal of identification tools for binding peptides.

15 cl, 10 dwg, 5 ex

Description

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИRELATED APPLICATIONS

По данной заявке испрашивают приоритет родственной предварительной заявки США № 61/840,583, поданной 28 июня 2013 года, которая озаглавлена «Target Antigen Discovery and Phenotypic Screens», содержание которой включено в настоящий документ в полном объеме.This application claims priority to related US Provisional Application No. 61/840,583, filed June 28, 2013, which is entitled "Target Antigen Discovery and Phenotypic Screens", the contents of which are incorporated herein in their entirety.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Связывающие полипептиды, такие как антитела и их фрагменты, являются коммерчески важными в качестве терапевтических и диагностических средств. В традиционных способах скрининга для связывающего полипептида в целом используют растворимые антигены. Однако у определенных антигенов клеточной поверхности происходит изменение конформационных эпитопов на этих антигенах, когда антигены растворяются из плазматической мембраны, что ведет к невозможности создавать связывающие полипептиды, которые могут распознавать нативный антиген. Соответственно, в данной области существует необходимость в новых способах скрининга для связывающих полипептидов, которые могут специфически связываться с антигенами клеточной поверхности в их нативной конформации.Binding polypeptides such as antibodies and fragments thereof are commercially important as therapeutic and diagnostic agents. Traditional screening methods generally use soluble antigens for the binding polypeptide. However, certain cell surface antigens experience a change in conformational epitopes on those antigens when the antigens are dissolved from the plasma membrane, resulting in an inability to generate binding polypeptides that can recognize the native antigen. Accordingly, there is a need in the art for new screening methods for binding polypeptides that can specifically bind to cell surface antigens in their native conformation.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕSUMMARY

Изобретение относится к способам и композициям для идентификации связывающих полипептидов (например, антител или их антигенсвязывающих фрагментов), которые специфически связываются с антигеном клеточной поверхности. Способы по изобретению в целом включают приведение в контакт библиотеки дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов с антигеном клеточной поверхности, представленным на внешней поверхности клетки; и выделение из библиотеки по меньшей мере одного элемента библиотеки, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности на внешней поверхности клетки. Способы и композиции по изобретению, в частности, полезны тем, что они делают возможной быструю идентификацию связывающих полипептидов, которые связываются с нативными формами целевого антигена клеточной поверхности. Эти способы и композиции также делают возможной идентификацию новых терапевтически эффективных специфичных антигенов или эпитопов клеточного типа.The invention relates to methods and compositions for identifying binding polypeptides (eg, antibodies or antigen-binding fragments thereof) that specifically bind to a cell surface antigen. The methods of the invention generally include contacting a display library of a variety of nucleic acid binding polypeptides with a cell surface antigen present on the outer surface of the cell; and isolating from the library at least one library element that specifically binds to a cell surface antigen on the outer surface of the cell. The methods and compositions of the invention are particularly useful in that they allow rapid identification of binding polypeptides that bind to native forms of the target cell surface antigen. These methods and compositions also enable the identification of new therapeutically effective cell-type specific antigens or epitopes.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На фиг. 1 схематически представлены примерные композиции ДНК-дисплея и способы скрининга по изобретению.In FIG. 1 is a schematic representation of exemplary DNA display compositions and screening methods of the invention.

На фиг. 2 схематически представлены примерные композиции ДНК-дисплея и способы скрининга по изобретению.In FIG. 2 is a schematic representation of exemplary DNA display compositions and screening methods of the invention.

На фиг. 3 схематически представлены примерные стратегии скрининга целевых клеток, используемые в способах по изобретению.In FIG. 3 is a schematic representation of exemplary target cell screening strategies used in the methods of the invention.

На фиг. 4 схематически представлены примерные стратегии параллельного скрининга и глубокого секвенирования, используемых в способах по изобретению.In FIG. 4 is a schematic representation of exemplary parallel screening and deep sequencing strategies used in the methods of the invention.

На фиг. 5 схематически представлены примерные стратегии параллельного скрининга и глубокого секвенирования, используемых в способах по изобретению.In FIG. 5 is a schematic representation of exemplary parallel screening and deep sequencing strategies used in the methods of the invention.

На фиг. 6 схематически представлены примерные стратегии параллельного скрининга и глубокого секвенирования, используемые в способах по изобретению.In FIG. 6 is a schematic representation of exemplary parallel screening and deep sequencing strategies used in the methods of the invention.

На фиг. 7 схематически представлены результаты примерных стратегий параллельного скрининга, используемых в способах по изобретению.In FIG. 7 is a schematic representation of the results of exemplary parallel screening strategies used in the methods of the invention.

На фиг. 8 изображен график, показывающий результаты FACS анализа связывания молекул VH с высокой аффинностью, выбранных с использованием способов по изобретению.In FIG. 8 is a graph showing the results of a FACS binding assay of high affinity VH molecules selected using the methods of the invention.

На фиг. 9 изображены графики, показывающие дифференциальное связывание молекул VH, выбранных с использованием способов по изобретению.In FIG. 9 are graphs showing the differential binding of VH molecules selected using the methods of the invention.

На фиг. 10 изображены графики, показывающие дифференциальное связывание молекул VH, выбранных с использованием способов по изобретению.In FIG. 10 are graphs showing the differential binding of VH molecules selected using the methods of the invention.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION

I. ОпределенияI. Definitions

Как используют в настоящем документе, термин «библиотека дисплея нуклеиновых кислот» относится к любому принятому в данной области бесклеточному дисплею со связью фенотип-генотип in vitro, без ограничения включая то, что изложено, например, в патентах США №№ 7195880; 6951725; 7078197; 7022479; 6518018; 7125669; 6846655; 6281344; 6207446; 6214553; 6258558; 6261804; 6429300; 6489116; 6436665; 6537749; 6602685; 6623926; 6416950; 6660473; 6312927; 5922545; и 6348315 и в WO2010/011944, все они включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме.As used herein, the term "nucleic acid display library" refers to any cell-free in vitro phenotype-genotype display, without limitation including those set forth in, for example, US Pat. Nos. 7,195,880; 6951725; 7078197; 7022479; 6518018; 7125669; 6846655; 6281344; 6207446; 6214553; 6258558; 6261804; 6429300; 6489116; 6436665; 6537749; 6602685; 6623926; 6416950; 6660473; 6312927; 5922545; and 6348315 and WO2010/011944, all of which are hereby incorporated by reference in their entirety.

Как используют в настоящем документе, термин «антиген» относится к молекуле, распознаваемой связывающим полипептидом.As used herein, the term "antigen" refers to a molecule recognized by a binding polypeptide.

Как используют в настоящем документе, термин «специфически связывается с» относится к способности связывающей молекулы (например, домена VH или VL) связываться с антигеном с аффинностью по меньшей мере приблизительно 1×10^-6 M, 1×10^-7 M, 1×10^-8 M, 1×10^-9 M, 1×10^-10 M, 1×10^-11 M, 1×10^-12 M или больше и/или связываться с мишенью с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше, чем ее аффинность к неспецифическому антигену.As used herein, the term "specifically binds to" refers to the ability of a binding molecule (eg, VH or VL domain) to bind to an antigen with an affinity of at least about ^{1x10 -6} M, ^{1x10 -7} M, 1x 10 ^-8 M, ^{1x10 -9} M, ^{1x10 -10} M, ^{1x10 -11} M, ^{1x10 -12} M or more and/or bind to the target with an affinity that is at least twice more than its affinity for a non-specific antigen.

Как используют в настоящем документе, термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулинов, которые содержат четыре полипептидные цепи, две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, связанных дисульфидными связями, а также к их мультимерам (например, IgM). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (CL1). Области VH и VL можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, которые называют каркасными областями (FR).As used herein, the term "antibody" refers to immunoglobulin molecules that contain four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains linked by disulfide bonds, as well as their multimers (eg, IgM). Each heavy chain contains a heavy chain variable region (VH for short) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region contains three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain contains a light chain variable region (VL for short) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one domain (CL1). The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs) interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs).

Как используют в настоящем документе, термин «антигенсвязывающая часть» антитела включает какой-либо встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, которые специфически связывает антиген для того, чтобы формировать комплекс. Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно извлекать, например, из целых молекул антител с использованием любых подходящих стандартных способов, таких как протеолитическое расщепление или рекомбинантные способы генетической инженерии, в том числе манипуляции и экспрессия ДНК, кодирующих вариабельные и необязательно константные домены антител. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих частей включают: (i) фрагменты Fab; (ii) фрагменты F(ab')₂; (iii) фрагменты Fd; (iv) фрагменты Fv; (v) молекулы одноцепочечных Fv (scFv); (vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR)). Другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела и миниантитела, также включены в выражение «антигенсвязывающая часть».As used herein, the term "antigen-binding portion" of an antibody includes any naturally occurring, enzymatically produced, synthetic, or genetically engineered polypeptide or glycoprotein that the antigen specifically binds to form a complex. Antigen-binding antibody fragments can be extracted, for example, from whole antibody molecules using any suitable standard methods such as proteolytic cleavage or recombinant genetic engineering techniques, including manipulation and expression of DNA encoding the variable and optionally constant domains of antibodies. Non-limiting examples of antigen-binding portions include: (i) Fab fragments; (ii) F(ab') ₂ fragments; (iii) Fd fragments; (iv) Fv fragments; (v) single chain Fv molecules (scFv); (vi) dAb fragments; and (vii) minimal recognition units consisting of amino acid residues that mimic an antibody's hypervariable region (eg, a complementarity-determining region (CDR)). Other engineered molecules such as diabodies, tribodies, tetrabodies, and minibodies are also included in the expression "antigen-binding moiety".

Как используют в настоящем документе, термины «домен VH» и «домен VL» относятся к отдельным вариабельным тяжелым и легким доменам антител, соответственно, которые содержат FR (каркасные области) 1, 2, 3 и 4 и CDR (определяющие комплементарность области) 1, 2 и 3 (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (публикация NIH № 91-3242, Bethesda).As used herein, the terms "VH domain" and "VL domain" refer to the individual variable heavy and light domains of antibodies, respectively, which contain FRs (framework regions) 1, 2, 3 and 4 and CDRs (complementarity determining regions) 1 , 2 and 3 (see Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesda).

II. Антигены клеточной поверхностиII. Cell surface antigens

В определенных аспектах изобретение относится к способам идентификации связывающего полипептида, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности.In certain aspects, the invention relates to methods for identifying a binding polypeptide that specifically binds to a cell surface antigen.

Любой антиген, который можно представлять на поверхности клетки, можно использовать в способах по изобретению, без ограничения включая, белковые, гликановые и/или липидные антигены. В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой встречающуюся в природе молекулу. Подходящие неограничивающие примеры встречающихся в природе антигенов включают трансмембранные белки (например, сопряженные с G-белком рецепторы) и якорные белки GPI. В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой не встречающийся в природе рекомбинантный или синтетический антиген. Подходящие неограничивающие примеры встречающихся в природе антигенов включают химерные антигены, содержащие части из различных антигенных молекул. В определенных вариантах осуществления отличительные черты антигена известны до выполнения способов по изобретению. В определенных вариантах осуществления отличительные черты антигена не известны до выполнения способов по изобретению.Any antigen that can be presented on the cell surface can be used in the methods of the invention, including without limitation, protein, glycan and/or lipid antigens. In certain embodiments, the antigen is a naturally occurring molecule. Suitable non-limiting examples of naturally occurring antigens include transmembrane proteins (eg, G-protein coupled receptors) and GPI anchor proteins. In certain embodiments, the antigen is a non-naturally occurring recombinant or synthetic antigen. Suitable non-limiting examples of naturally occurring antigens include chimeric antigens containing moieties from different antigenic molecules. In certain embodiments, the identity of the antigen is known prior to performing the methods of the invention. In certain embodiments, the identity of the antigen is not known prior to performing the methods of the invention.

Антигены клеточной поверхности, используемые в способах по изобретению, можно представлять на любой клетке или частице, похожей на клетку (например, липидной везикуле). В определенных вариантах осуществления клетки представляют собой клетки того типа, который в природе экспрессирует антиген клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой рекомбинантную клетку, которую конструируют для того, чтобы гетерологично экспрессировать антиген клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой связанный с заболеванием вариант нормальной клетки (например, опухолевую клетку).The cell surface antigens used in the methods of the invention can be presented on any cell or cell-like particle (eg, lipid vesicle). In certain embodiments, the cells are of a cell type that naturally expresses a cell surface antigen. In certain embodiments, the cell is a recombinant cell that is engineered to heterologously express a cell surface antigen. In certain embodiments, the cell is a disease-associated variant of a normal cell (eg, a tumor cell).

III. Связывающие полипептидыIII. Binding polypeptides

Связывающий полипептид любого типа можно использовать в способах по изобретению, без ограничения включая антитела или их фрагменты и иммуноглобулиноподобные домены. Подходящие иммуноглобулиноподобные домены включают, без ограничения, домены фибронектина (см., например, Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95–109, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), DARPin (см., например, Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15–16): 695–701, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Z домены белка A (см., Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668–76, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), липокалины (см., например, Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677–83, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Affilin® (см., например, Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172–85, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Affitin (см., например, Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058–68, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Avimer (см., например, Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556–61, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Fynomer (см., например, Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196–3204, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки) и пептиды домена Куница (см., например, Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261–8, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки). В определенных вариантах осуществления связывающий полипептид представляет собой домен VH или VL антитела.Any type of binding polypeptide can be used in the methods of the invention, including but not limited to antibodies or fragments thereof and immunoglobulin-like domains. Suitable immunoglobulin-like domains include, without limitation, fibronectin domains (see, e.g., Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95-109, which is incorporated herein by reference in its entirety), DARPin (see ., e.g., Stumpp et al.(2008) Drug Discov.Today 13(15-16):695-701, which is incorporated herein by reference in its entirety), Z domains of protein A (see, Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76, which is incorporated herein by reference in its entirety), lipocalins (see e.g. Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677 –83, which is incorporated herein by reference in its entirety), Affilin® (see, e.g., Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172–85, which is incorporated in its entirety herein by reference), Affitin (see e.g. Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68, which is incorporated herein by reference in its entirety), Avimer (see, for example, Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556–61, which is incorporated herein by reference in its entirety), Fynomer (see, e.g., Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196–3204, which incorporated herein by reference) and Kunitz domain peptides (see, e.g., Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261–8, which is incorporated herein by reference in its entirety) . In certain embodiments, the binding polypeptide is a VH or VL domain of an antibody.

IV. Способы дисплея на клеточной поверхностиIV. Cell surface display methods

В определенных аспектах изобретение относится к способу идентификации связывающего полипептида, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, способ включает: (a) приведение в контакт библиотеки дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов с антигеном клеточной поверхности, представленным на внешней поверхности клеток первого типа; и (b) выделение из библиотеки по меньшей мере одного элемента библиотеки, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности на внешней поверхности клеток первого типа, тем самым идентифицируя связывающий полипептид, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления перед стадией (a) библиотеку дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов приводят в контакт с клетками второго типа, на которых не представлен антиген, представленный на внешней поверхности, для того, чтобы предварительно очищать библиотеку связывающих полипептидов, которые специфически не связываются с антигеном.In certain aspects, the invention relates to a method for identifying a binding polypeptide that specifically binds to a cell surface antigen, the method comprising: (a) contacting a display library of various nucleic acid binding polypeptides with a cell surface antigen present on the outer surface of a first cell type; and (b) isolating from the library at least one library element that specifically binds to a cell surface antigen on the outer surface of the first cell type, thereby identifying a binding polypeptide that specifically binds to the cell surface antigen. In certain embodiments, prior to step (a), a display library of diverse nucleic acids of binding polypeptides is contacted with second type cells that do not display an antigen present on the outer surface in order to pre-purify the library of binding polypeptides that do not specifically bind to antigen.

В определенных аспектах изобретение относится к способу идентификации связывающего полипептида, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, способ включает: (a) приведение в контакт библиотеки дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов с клетками первого типа, экспрессирующими антиген клеточной поверхности, и выделение из библиотеки по меньшей мере одного элемента библиотеки, который специфически связывается с клетками первого типа; (b) приведение в контакт библиотеки дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов с клетками второго типа, которые не экспрессируют антиген клеточной поверхности, и выделение из библиотеки по меньшей мере одного элемента библиотеки, который специфически связывается с клетками второго типа; и (c) отбор элементов библиотеки, которые специфически связываются с клетками первого типа, но не с клетками второго типа, тем самым идентифицируя связывающий полипептид, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности.In certain aspects, the invention relates to a method for identifying a binding polypeptide that specifically binds to a cell surface antigen, the method comprising: (a) contacting a display library of various binding polypeptide nucleic acids with first type cells expressing the cell surface antigen, and isolating from the library at at least one element of the library that specifically binds to cells of the first type; (b) contacting a display library of various nucleic acid binding polypeptides with second type cells that do not express a cell surface antigen, and isolating from the library at least one library element that specifically binds to second type cells; and (c) selecting library elements that specifically bind to cells of the first type but not to cells of the second type, thereby identifying a binding polypeptide that specifically binds to the cell surface antigen.

Подходящие библиотеки дисплея нуклеиновых кислот для использования в способах по изобретению приведены, например, в патентах США №№ 7195880; 6951725; 7078197; 7022479; 6518018; 7125669; 6846655; 6281344; 6207446; 6214553; 6258558; 6261804; 6429300; 6489116; 6436665; 6537749; 6602685; 6623926; 6416950; 6660473; 6312927; 5922545; и 6348315 и в WO2010/011944, все они включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме. В определенных вариантах осуществления библиотека дисплея разнообразных нуклеиновых кислот представляет собой библиотеку ДНК-дисплея. В одном из вариантов осуществления дисплей нуклеиновых кислот библиотека представляет собой библиотеку ДНК-дисплея, описанную в настоящем документе или в WO2010/011944, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме.Suitable nucleic acid display libraries for use in the methods of the invention are, for example, US Pat. Nos. 7,195,880; 6951725; 7078197; 7022479; 6518018; 7125669; 6846655; 6281344; 6207446; 6214553; 6258558; 6261804; 6429300; 6489116; 6436665; 6537749; 6602685; 6623926; 6416950; 6660473; 6312927; 5922545; and 6348315 and WO2010/011944, all of which are hereby incorporated by reference in their entirety. In certain embodiments, the diverse nucleic acid display library is a DNA display library. In one embodiment, the nucleic acid display library is the DNA display library described herein or in WO2010/011944, which is hereby incorporated by reference in its entirety.

В определенных вариантах осуществления каждый элемент библиотеки ДНК-дисплея содержит связывающий полипептид, соединенный через промежуточный ДНК линкер с кодирующей последовательностью ДНК, которая кодирует связывающий полипептид, где ДНК линкер содержит участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы (см. например, фиг. 1). Можно использовать любой участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы. В одном конкретном варианте осуществления участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы не присутствует в кодирующей последовательности ДНК элементов библиотеки ДНК-дисплея, таким образом избегая отщепления кодирующей последовательности ДНК при расщеплении элементов библиотеки рестрикционной эндонуклеазой. В одном конкретном варианте осуществления участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы представляет собой сайт Not1.In certain embodiments, each DNA display library element contains a binding polypeptide connected via an intermediate DNA linker to a DNA coding sequence that encodes a binding polypeptide, wherein the DNA linker contains a restriction endonuclease recognition site (see, for example, FIG. 1). Any restriction endonuclease recognition site can be used. In one particular embodiment, the restriction endonuclease recognition site is not present in the DNA coding sequence of the DNA display library elements, thus avoiding cleavage of the DNA coding sequence when the library elements are cleaved with a restriction endonuclease. In one specific embodiment, the restriction endonuclease recognition site is a Not1 site.

В определенных вариантах осуществления желательно физически отделять кодирующую последовательность ДНК выделенных элементов библиотеки от соединенного связывающего полипептида. Можно использовать любые способы физического разделения. Когда выделенные элементы библиотеки содержат ДНК линкер, содержащий участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы (см. например, фиг. 1), физического разделения можно достичь посредством расщепления выделенных элементов библиотеки рестрикционной эндонуклеазой. Получаемые высвобожденные кодирующие последовательности ДНК дополнительно можно отделять от комплексов клетка/связывающий полипептид с помощью любого принятого в данной области способа, например, центрифугирования.In certain embodiments, it is desirable to physically separate the DNA coding sequence of the isolated library elements from the linked binding polypeptide. Any means of physical separation may be used. When the isolated library elements contain a DNA linker containing a restriction endonuclease recognition site (see, for example, FIG. 1), physical separation can be achieved by digesting the isolated library elements with a restriction endonuclease. The resulting released DNA coding sequences can further be separated from the cell/binding polypeptide complexes using any method accepted in the art, such as centrifugation.

В определенных вариантах осуществления желательно физически отделять интактные выделенные элементы библиотеки от клеток первого и/или второго типа. Можно использовать любые способы физического разделения. В определенных вариантах осуществления выделенные элементы библиотеки отделяют от клеток первого или второго типа посредством ферментативного отщепления антигена клеточной поверхности. Можно использовать любые способы ферментативного отщепления антигена, например, протеазное, липидное и/или гликозидазное ферментативное отщепление. В определенных вариантах осуществления, когда антиген клеточной поверхности прикрепляют к клеточной поверхности с помощью гликолипидного якоря, выделенные элементы библиотеки отделяют от клеток первого или второго типа посредством фосфолипазного отщепления гликолипидного якоря. Получаемые высвобожденные выделенные элементы библиотеки дополнительно можно отделять от клеток первого или второго типа с помощью любого способа, принятого в данной области, например, центрифугирования.In certain embodiments, it is desirable to physically separate intact isolated library elements from first and/or second type cells. Any means of physical separation may be used. In certain embodiments, isolated library elements are separated from type I or type II cells by enzymatic cleavage of a cell surface antigen. Any means of enzymatic cleavage of the antigen may be used, for example, protease, lipid and/or glycosidase enzymatic cleavage. In certain embodiments, when a cell surface antigen is attached to the cell surface with a glycolipid anchor, the isolated library elements are separated from type I or type II cells by phospholipase cleavage of the glycolipid anchor. The resulting released isolated library elements can additionally be separated from the first or second type of cells using any method accepted in this field, for example, centrifugation.

Когда выделены элементы библиотеки, которые специфически связываются с клетками первого и/или второго типа, можно определять кодирующую последовательность ДНК этих молекул. Соответственно, в определенных вариантах осуществления способы по изобретению дополнительно включают стадию определения кодирующей последовательности ДНК по меньшей мере части выделенных элементов библиотеки. Можно использовать любые принятые в данной области средства для определения последовательности ДНК. В одном конкретном варианте осуществления кодирующую последовательность ДНК определяют с помощью способов глубокого секвенирования отдельных молекул (например, пиросеквенирования). Способы глубокого секвенирования отдельных молекул хорошо известны в данной области (см., например, те, что описаны в US6210891, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме). В определенных вариантах осуществления, где связывающие полипептиды представляют собой антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, определяют кодирующую последовательность ДНК области CDR3. В определенных вариантах осуществления определяют кодирующие последовательности ДНК элемента библиотеки, который связывается с клетками первого и второго типа. Считают, что элементы библиотеки, которые специфически связываются с клетками первого типа, но не с клетками второго типа, содержат связывающие полипептиды, которые специфически связываются с антигеном, специфичным для клеток первого типа.Once library elements have been isolated that specifically bind to cells of the first and/or second type, the DNA coding sequence of these molecules can be determined. Accordingly, in certain embodiments, the methods of the invention further comprise the step of determining the DNA coding sequence of at least a portion of the isolated library elements. Any means accepted in the art for determining the DNA sequence can be used. In one particular embodiment, the DNA coding sequence is determined using single molecule deep sequencing methods (eg, pyrosequencing). Single molecule deep sequencing methods are well known in the art (see, for example, those described in US6210891, which is hereby incorporated by reference in its entirety). In certain embodiments, where the binding polypeptides are antibodies or antigen-binding fragments thereof, the DNA coding sequence of the CDR3 region is determined. In certain embodiments, DNA coding sequences for a library element that binds to first and second type cells are determined. It is believed that library elements that specifically bind to cells of the first type, but not to cells of the second type, contain binding polypeptides that specifically bind to the antigen specific for cells of the first type.

Когда идентифицирован связывающий полипептид, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, его можно гетерологично экспрессировать in vitro (например, в клетках или в бесклеточной экспрессирующей системе) или in vivo (например, в трансгенном животном). Соответственно, в определенных вариантах осуществления способы по изобретению дополнительно включают стадию гетерологичной экспрессии in vitro (например, в клетках или в бесклеточной экспрессирующей системе) или in vivo (например, в трансгенном животном) идентифицированного связывающего полипептида.Once a binding polypeptide has been identified that specifically binds to a cell surface antigen, it can be heterologously expressed in vitro (eg, in cells or in a cell-free expression system) or in vivo (eg, in a transgenic animal). Accordingly, in certain embodiments, the methods of the invention further comprise the step of heterologously expressing in vitro (eg, in cells or in a cell-free expression system) or in vivo (eg, in a transgenic animal) the identified binding polypeptide.

В определенных вариантах осуществления отличительные черты антигена известны до выполнения способов по изобретению. Однако нет необходимости знать отличительные черты антигена. В действительности, в определенных вариантах осуществления отличительные черты антигена не известны до выполнения способов по изобретению. Таким образом, в последнем случае способы по изобретению позволяют идентифицировать новые антигены и эпитопы, присутствующие на поверхности клеток определенного типа, представляющего интерес (например, опухолевая клетка).In certain embodiments, the identity of the antigen is known prior to performing the methods of the invention. However, it is not necessary to know the distinguishing features of the antigen. Indeed, in certain embodiments, the identity of the antigen is not known prior to performing the methods of the invention. Thus, in the latter case, the methods of the invention make it possible to identify novel antigens and epitopes present on the surface of a particular cell type of interest (eg, a tumor cell).

В определенных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, включают отбор связывающих полипептидов, которые способны к функциональной интернализации после связывания с антигеном клеточной поверхности. Такие связывающие полипептиды, в частности, можно использовать при получении конъюгатов лекарственных средств, поскольку они делают возможной доставку цитотоксического лекарственного средства внутрь целевой клетки. Можно использовать любой способ скрининга функциональной интернализации. Например, библиотеку дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов можно приводить в контакт с клетками-мишенями в условиях, которые делают возможной интернализацию связывающего полипептида (например, в течение приблизительно 1-2 часов при 37°C). Затем клетки можно промывать и лизировать с использованием клеточного лизирующего буфера в присутствии ингибиторов протеаз. Затем интернализированные элементы библиотеки можно преципитировать этанолом и обогащать кодирующие последовательности ДНК с помощью ПЦР амплификации. Способы, описанные в настоящем документе, можно применять к любому процессу обнаружения эпитопа-мишени. Например, эпитопы-мишени могут включать: домены хоуминга для воспаления; опухолеспецифичные эпитопы-мишени из первичных опухолей с устойчивостью к лечению или без нее, линии опухолевых клеток и опухоли, которые несут какие-либо мутации, которые могут вести к неоэпитопам; и другие эпитопы, специфичные для заболеваний, которые опосредуют нарушение функции, специфичное для заболевания, и должны служить мишенью для биологической терапии,In certain embodiments, the methods described herein include selecting binding polypeptides that are capable of functional internalization upon binding to a cell surface antigen. Such binding polypeptides are particularly useful in the preparation of drug conjugates because they allow delivery of the cytotoxic drug into the target cell. Any screening method for functional internalization may be used. For example, a display library of various binding polypeptide nucleic acids can be contacted with target cells under conditions that allow internalization of the binding polypeptide (eg, for about 1-2 hours at 37°C). The cells can then be washed and lysed using cell lysis buffer in the presence of protease inhibitors. The internalized library elements can then be precipitated with ethanol and enriched for DNA coding sequences by PCR amplification. The methods described herein can be applied to any process for detecting a target epitope. For example, target epitopes may include: homing domains for inflammation; tumor-specific target epitopes from primary tumors with or without treatment resistance, tumor cell lines, and tumors that carry any mutations that may lead to neoepitopes; and other disease-specific epitopes that mediate disease-specific dysfunction and should be targeted for biological therapy,

Способы, описанные в настоящем документе, также можно применять для обнаружения биологических маркеров, чтобы осуществлять мониторинг присутствия или отсутствия конкретных эпитопов клеточной поверхности в ходе лечения пациентов лекарственными средствами. Антитела, полученные при обнаружении биологических маркеров, также можно использовать в качестве инструментов для обнаружения биологических маркеров. Дополнительно или альтернативно, способы, описанные в настоящем документе, можно применять к обнаружению мишеней или эпитопов у других биологических видов, например, у трансгенных животных и в моделях заболеваний на животных.The methods described herein can also be used to detect biological markers to monitor the presence or absence of specific cell surface epitopes during drug treatment of patients. Antibodies derived from the detection of biological markers can also be used as tools for the detection of biological markers. Additionally or alternatively, the methods described herein can be applied to the detection of targets or epitopes in other species, for example, transgenic animals and animal models of disease.

V. ПримерыV. Examples

A. Краткое изложениеA. Summary

Конструировали библиотеку VH полного антитела человека, полученного из костного мозга, периферической крови и спленоцитов людей-доноров и идентифицировали множество VH связывающих средств с высокой аффинностью и специфичностью к множеству мишеней с использованием технологии дисплея дцДНК. Специфичные к клеткам-мишеням эпитопы идентифицировали посредством отбора живых клеток и анализа глубокого секвенирования с использованием библиотеки VH человека и технологии дисплея дцДНК. В этих способах применяли стратегии параллельного дифференциального отбора и селективного отбора клеток-мишеней (см. фиг. 4, 5, 6). Табличное представление частоты CDR3 по глубокому секвенированию всех пулов по всем раундам предсказывает избирательность клонов VH. Идентифицировали VH с высокой аффинностью, которые избирательно связываются с клетками-мишенями и клетками родственных типов.A complete human VH antibody library derived from human bone marrow, peripheral blood, and splenocytes from human donors was constructed and a plurality of VH binding agents with high affinity and multi-target specificity were identified using dsDNA display technology. Target cell-specific epitopes were identified by live cell selection and deep sequencing analysis using the human VH library and dsDNA display technology. These methods used strategies of parallel differential selection and selective selection of target cells (see Fig. 4, 5, 6). Tabular presentation of CDR3 frequency from deep sequencing of all pools across all rounds predicts the selectivity of VH clones. High affinity VHs have been identified that bind selectively to target cells and related cell types.

B. Способы конструирования библиотек и отбора для обнаружения эпитопов живых клетокB. Methods for Library Construction and Selection for Live Cell Epitope Detection

Разработаны два способа эффективного нахождения элементов библиотеки, которые связываются с живыми клетками.Two methods have been developed to efficiently find library elements that bind to living cells.

Первый способ включает удаление связывающих средств с живых клеток посредством рестрикционного расщепления ДНК, слитой со связанными антителами. Этот способ делает возможным полное обнаружение VH, связанных со всеми эпитопами на клетках. C-концы в библиотеке ДНК VH конструировали так, чтобы нести участок рестрикции NotI (см. фиг. 1). В наивных каркасах VH сайты NotI отсутствуют и, следовательно, из клеток для последующей амплификации элюируют только полноразмерные VH связывающие средства. Буфер для рестрикционного расщепления NotI тестировали на живых клетках, и при инкубации в течение 2 часов при 37°C клетки были жизнеспособными. NotI расщепление имело высокую эффективность. После связывания библиотеки с клетками в течение 1 часа при 4°C, клетки промывали и расщепляли с использованием NotI буфера при 37°C в течение 1 часа, затем клетки осаждали, супернатант (содержащий связанную ДНК VH) собирали для ПЦР амплификации (см. фиг. 1).The first method involves the removal of binding agents from living cells by restriction cleavage of DNA fused with bound antibodies. This method allows complete detection of VH associated with all epitopes on cells. The C-termini in the VH DNA library were designed to carry a NotI restriction site (see FIG. 1). Naive VH scaffolds lack NotI sites and therefore only full-length VH binding agents are eluted from cells for subsequent amplification. The NotI restriction cleavage buffer was tested on living cells, and when incubated for 2 hours at 37°C, the cells were viable. NotI cleavage was highly efficient. After binding the library to cells for 1 hour at 4°C, the cells were washed and digested with NotI buffer at 37°C for 1 hour, then the cells were pelleted, the supernatant (containing bound VH DNA) was collected for PCR amplification (see Fig. . one).

Второй способ состоит в отщеплении VH связывающих средств от живых клеток посредством отщепления фосфолипазой C (PLC). Этот способ позволяет элюировать VH, которые связаны с эпитопами любого якорного мембранного белка GPI (т. е., с поднабором эпитопов). PLC отщепление имеет высокую эффективность, как подтверждали на FACS с использованием контрольной молекулы. После инкубации библиотеки с клетками в течение 1 часа при 4°C, клетки промывали и инкубировали с PLC при 37°C в течение 15 минут. Впоследствии клетки осаждали и супернатант, содержащий слитый VH в комплексе с внеклеточным доменом якорного мембранного белка GPI, подвергали ПЦР амплификации (см. фиг. 2).The second method is to cleave VH binding agents from living cells via phospholipase C (PLC) cleavage. This method allows the eluting of VHs that are bound to epitopes of any GPI anchor membrane protein (ie, a subset of epitopes). PLC cleavage is highly efficient, as confirmed by FACS using a control molecule. After incubating the library with cells for 1 hour at 4°C, the cells were washed and incubated with PLC at 37°C for 15 minutes. Subsequently, the cells were pelleted and the supernatant containing the fused VH complexed with the extracellular domain of the GPI anchor membrane protein was subjected to PCR amplification (see FIG. 2).

C. Параллельный отбор, дифференциальный отбор и селективный отбор клеток-мишеней на клетках-мишенях и клетках родственных/нежелательных типовC. Parallel selection, differential selection and selective selection of target cells on target cells and related/undesired cell types

Исходную наивную слитую библиотеку получали в соответствии с протоколом, изложенным в WO2010/011944 (которая включена, таким образом, посредством ссылки в полном объеме). Для первого раунда отбора, очищенную слитую библиотеку равномерно делили на множество библиотек, которые несут то же разнообразие для всех ветвей отбора (см. фиг. 5).The original naive fusion library was prepared according to the protocol set forth in WO2010/011944 (which is hereby incorporated by reference in its entirety). For the first round of selection, the purified fusion library was evenly divided into multiple libraries that carry the same diversity for all selection arms (see FIG. 5).

Начальные клетки, полученные от нормальных доноров или пациентов, или размораживали свежими или выделяли из колб с клеточными культурами, придерживаясь стандартных протоколов клеточной биологии. Затем клетки восстанавливали в течение 1 часа в полных средах при 37°C, после чего следовало блокирование в буфере для отбора в течение 30 мин на льду. Весь отбор осуществляли на льду для того, чтобы предотвращать интернализацию антител и мишеней.Initial cells, obtained from normal donors or patients, were either thawed fresh or isolated from cell culture flasks following standard cell biology protocols. Cells were then reconstituted for 1 hour in complete media at 37° C. followed by blocking in selection buffer for 30 min on ice. All screening was done on ice to prevent internalization of antibodies and targets.

Для параллельного отбора библиотеки предварительно очищали с использованием 200 мкл предварительно блокированных стрептавидиновых гранул и 200 мкл предварительно блокированных гранул hIgG-Epoxy в течение 30 мин при комнатной температуре последовательно для того, чтобы удалять какие-либо неправильно уложенные и липкие элементы библиотеки. Затем предварительно очищенные библиотеки охлаждали на льду и подвергали воздействию предварительно блокированных клеток и инкубировали на льду в течение 1 часа.For side-by-side selection, libraries were pre-purified using 200 µl of streptavidin pre-blocked beads and 200 µl of hIgG-Epoxy pre-blocked beads for 30 min at room temperature sequentially to remove any misfolded and sticky library elements. The pre-purified libraries were then chilled on ice and exposed to the pre-blocked cells and incubated on ice for 1 hour.

Для селективного отбора клеток-мишеней осуществляли предварительную очистку на клетках нежелательных и близкородственных типов в течение 1 часа на льду для того, чтобы удалять какие-либо неизбирательные связывающие средства и затем подвергали воздействию клеток-мишеней.For selective selection of target cells, pre-purification was carried out on cells of unwanted and closely related types for 1 hour on ice in order to remove any non-selective binding agents and then exposed to target cells.

На раунде отбора 4 способы дифференциального отбора применяли к ветвям отбора на клетках-мишенях (с предварительной очисткой на клетках и без нее). На этом раунде библиотеки делили на множество пробирок и связывали с клетками каждого типа и клетками пациентов с различных стадий заболеваний параллельно. Эта стратегия делала возможным непосредственное сравнение клеток-мишеней с клетками других типов посредством анализа глубокого секвенирования и идентификации связывающих средств, распознающих различные эпитопы, которые возникали при прогрессировании заболевания (см. фиг. 6).In selection round 4, differential selection methods were applied to selection arms on target cells (with and without pre-purification on cells). In this round, the libraries were divided into multiple tubes and linked to cells of each type and to cells from patients at various disease stages in parallel. This strategy allowed direct comparison of target cells with other cell types through deep sequencing analysis and identification of binding agents recognizing various epitopes that arose as the disease progressed (see FIG. 6).

Для всех ветвей отбора, после связывания, клетки промывали в 10 мл буфера для связывания и подвергали или NotI рестрикционному расщеплению, чтобы извлекать все связывающие средства для мембранного белка, или PLC отщеплению для того, чтобы извлекать связывающие средства для якорных мембранных белков GPI, как описано выше.For all selection arms, after binding, cells were washed in 10 ml binding buffer and subjected to either NotI restriction digestion to extract all membrane protein binding agents or PLC digestion to extract binding agents for GPI anchor membrane proteins, as described. above.

D. Анализ глубокого секвенирования для предсказания избирательных связывающих средств для клеток-мишенейD. Deep Sequencing Assay for Predicting Selective Binding Agents for Target Cells

После каждого раунда отбора объединенные образцы связывающих средств подвергали ПЦР амплификации. HCDR3 каждого объединенного образца связывающих средств поднимали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов, праймирующих C-конец каркаса 3 и N-конец каркаса 4 фрагментов VH. Затем эти фрагменты HCDR3, полученные из отдельных раундов отбора и ветвей метили специфичным ДНК штриховым кодом, используемым для секвенирования Illumina, посредством ПЦР. Меченные HCDR3 объединяли и отправляли для высокопропускного секвенирования с использованием технологии Hi Seq. Объединенные образцы связывающих средств раунда 4 от клеток-мишеней также метили с использованием ДНК штрихового кода и подвергали 454 секвенированиям, чтобы получать полноразмерные последовательности VH.After each round of selection, pooled binding agent samples were subjected to PCR amplification. The HCDR3 of each pooled binder sample was raised by PCR using oligonucleotides priming the C-terminus of framework 3 and the N-terminus of framework 4 of the VH fragments. Then, these HCDR3 fragments obtained from individual rounds of selection and branches were labeled with the specific DNA barcode used for Illumina sequencing by PCR. Labeled HCDR3s were pooled and sent for high-throughput sequencing using Hi Seq technology. Pooled samples of round 4 binding agents from target cells were also labeled with barcode DNA and subjected to 454 sequencing to obtain full-length VH sequences.

После секвенирования последовательности развертывали на основании ДНК штрихового кода. Миллионы последовательностей, полученных из каждого раунда отбора и ветви отбора, представляли в виде таблицы посредством сравнения частоты конкретной последовательности CDR3, присутствующей в различных раундах и ветвях отбора. Использовали следующие критерии для идентификации избирательных связывающих средств: 1) специфичное обогащение CDR3 последовательности от более раннего раунда к более позднему раунду на клетках-мишенях, а не на клетках контрольных или близкородственных типов; 2) более высокая частота на клетках конкретного целевого типа и низкая на клетках контрольного или близкородственного типа на дифференциальном раунде отбора (см. фиг. 7); и 3) последовательности не присутствуют в других отборах мишеней или клеток из других программ в базе данных. Избирательные клоны, идентифицированные с помощью секвенирования Illumina, после этого синтезировали на основании информации о 454 полноразмерных последовательностях.After sequencing, the sequences were deployed based on the DNA barcode. The millions of sequences obtained from each round of selection and branch of selection were tabulated by comparing the frequency of a particular CDR3 sequence present in different rounds and branches of selection. The following criteria were used to identify selective binders: 1) specific enrichment of the CDR3 sequence from earlier round to later round on target cells rather than on control or closely related cell types; 2) higher frequency on cells of a specific target type and low on cells of a control or closely related type in a differential round of selection (see Fig. 7); and 3) the sequences are not present in other selections of targets or cells from other programs in the database. Selective clones identified by Illumina sequencing were then synthesized based on 454 full-length sequence information.

E. Получение, очистка и FACS анализ связыванияE. Preparation, purification and FACS binding analysis

Затем объединенные образцы связывающих средств и синтезированные VH субклонировали в экспрессирующие векторы pET22b. VH получали в клетках E. coli BL-21 и очищали посредством использования стандартных протоколов с C-концевыми гистидиновыми метками. FACS анализ осуществляли для того, чтобы оценивать связывание и избирательность VH с клетками различных типов и EC₅₀ связывающих средств. Высокоаффинные и избирательные VH связывающие средства идентифицировали посредством процесса отбора живых клеток (см. фиг. 8, 9 и 10).The pooled binding agent samples and synthesized VHs were then subcloned into pET22b expression vectors. VH was generated in E. coli BL-21 cells and purified using standard protocols with C-terminal histidine tags. FACS analysis was performed in order to assess the binding and selectivity of VH with various cell types and EC ₅₀ binding agents. High affinity and selective VH binding agents were identified through a live cell selection process (see FIGS. 8, 9 and 10).

Claims

1. A method for identifying a binding polypeptide that specifically binds to a cell surface antigen, comprising:

(a) contacting a cell-free display library of various DNA-binding polypeptides with a cell surface antigen present on the outer surface of first type cells, where each element of the DNA display library contains an antibody VH domain connected via an intermediate DNA linker to a DNA coding sequence that encodes a binding polypeptide, and where the DNA linker contains a restriction endonuclease recognition site that is not present in the coding sequence of the elements of the DNA display library;

(b) isolating from the library at least one library element that specifically binds to a cell surface antigen on the outer surface of the first cell type;

(c) selecting the DNA coding sequence of the isolated library elements from the attached binding polypeptide by restriction endonuclease cleavage at a restriction endonuclease recognition site that is not present in the DNA display library element coding sequence; and

(d) determining the DNA coding sequence of at least a portion of the isolated library elements, where the DNA coding sequence of the CDR3 region is determined.

2. The method of claim. 1, where the method is carried out for each of several rounds of selection.

3. The method of claim 2, wherein determining the DNA coding sequence for at least a portion of the isolated library elements comprises:

(a) amplifying the pooled samples of binding agents by polymerase chain reaction (PCR);

(b) lifting the HCDR3 fragments of the pooled sample of binding agents by PCR using oligonucleotide primers C-terminus of framework 3 and N-terminus of framework 4 of the VH fragments;

(c) labeling the amplified HCDR3 DNA fragments with a barcode specific to a particular round of selection;

(d) sequencing barcoded HCDR3 fragments; and

(e) unfolding the sequences of the HCDR3 fragments based on the barcode DNA sequences,

thus identifying a binding polypeptide as one that specifically binds to a cell surface antigen when there is a specific enrichment of the CDR3 fragment from an earlier round to a later round on the target cells.

4. The method according to any one of paragraphs. 1-3, where the binding polypeptide DNA display library is derived from the naive VH library.

5. The method according to any one of paragraphs. 1-4, where the binding polypeptide DNA display library is derived from a naive human VH library.

6. The method according to any one of paragraphs. 1-5, wherein the antigen is a naturally occurring protein, glycan, lipid, or glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor protein.

7. The method according to any one of paragraphs. 1-6, where the cells of the first type are cells that naturally express the cell surface antigen.

8. The method according to any one of paragraphs. 1-7, wherein the first cell type is a disease-associated variant of normal cells.

9. The method according to any one of paragraphs. 1-8, where the cells of the first type are tumor cells.

10. The method according to any one of paragraphs. 1-9, where prior to step (a), the display library of various DNA binding polypeptides is prepurified with second type cells that do not present cell surface antigen on their outer surface.

11. The method of claim 10 wherein the first type of cells are tumor cells and optionally where the second type of cells are normal cells.

12. The method according to any one of paragraphs. 1-6, wherein the cells of the first type are recombinant cells that are engineered to heterologously express a cell surface antigen.

13. The method of claim 12 wherein the cell surface antigen is a recombinant antigen or a chimeric antigen.

14. The method according to any one of paragraphs. 2-13 where the multiple selection rounds comprise 2, 3 or 4 selection rounds, optionally where the multiple selection rounds represent 4 selection rounds.

15. The method according to any one of paragraphs. 3-13 where sequencing includes deep sequencing, optionally where deep sequencing is pyrosequencing.