RU2776405C2

RU2776405C2 - Tablet for cell cultivation, devices and methods for in vitro effect

Info

Publication number: RU2776405C2
Application number: RU2020112321A
Authority: RU
Inventors: Давид БОВАР; Джулия ХЕНГ; Шоэйб МАДЖЕЕД; Антонин САНДОЗ
Original assignee: Филип Моррис Продактс С.А.
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2022-07-19

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: tablet for cell cultivation is presented, containing at least two sequentially located holes and a channel adapted for fluid communication between holes, where the cannel is connected or communicates with the first pump via holes at each end of the channel, and where the specified first pump is suitable for providing fluid circulation between at least two holes. Devices including a tablet for cell cultivation, and methods using it are also disclosed.

EFFECT: invention allows for effective cultivation of two or more different cell types at the same time with the least time costs.

17 cl, 23 dwg, 2 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

Настоящее изобретение относится к планшету для культивирования клеток и устройству для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии. Одним подходящим типом клеток для применения в настоящем изобретении являются клетки или ткани, представляющие собой 3D-органотипические культуры. Текучая среда, такая как среда для культивирования клеток или смесь сред для культивирования клеток, может перекачиваться или циркулировать по планшету для культивирования клеток, что обеспечивает одновременное культивирование клеток или тканей in vitro. Клетки могут подвергаться воздействию одного или более средств, таких как аэрозоли, с целью изучения влияния средства на клетки и с возможностью отбора образцов среды для культивирования клеток в режиме реального времени во время воздействия. The present invention relates to a cell culture plate and a cell culture fluid sampling device upon exposure. One suitable cell type for use in the present invention is 3D organotypic culture cells or tissues. A fluid medium, such as a cell culture medium or a mixture of cell culture media, can be pumped or circulated through the cell culture plate to allow simultaneous in vitro culture of cells or tissues. The cells may be exposed to one or more agents, such as aerosols, in order to study the effect of the agent on the cells and to allow real-time sampling of the cell culture medium during exposure.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

Токсикологические исследования с применением 2-мерных систем культивирования клеток применяли для изучения влияний одного или более средств (например, лекарственных средств) на выживание и ферментативную активность клеток и т. д. Хотя возможность выращивания клеток плоскими слоями на поверхностях пластмассовых материалов является незатейливой и обеспечивает возможность изучать некоторые аспекты клеточной физиологии и реакции на раздражители, они не отражают настоящую структуру и строение органа. В 2-мерных монослоях внеклеточный матрикс, межклеточные взаимодействия и взаимодействия клеток с матриксом, которые являются существенными для дифференцировки, пролиферации и клеточных функций, утрачиваются.Toxicology studies using 2D cell culture systems have been used to investigate the effects of one or more agents (eg, drugs) on cell survival and enzymatic activity and etc. Although the possibility of growing cells in flat layers on the surfaces of plastic materials is unpretentious and provides an opportunity to study some aspects of cellular physiology and response to stimuli, they do not reflect the real structure and structure of the organ. In 2-dimensional monolayers, the extracellular matrix, intercellular interactions, and cell-matrix interactions that are essential for differentiation, proliferation, and cellular functions are lost.

В 3-мерных системах для культивирования может образовываться функциональная ткань с признаками, сходными с наблюдаемыми in vivo. По сравнению с 2-мерными системами культивирования 3-мерная культура клеток обеспечивает взаимодействие клеток с их окружающей средой во всех трех измерениях и является физиологически более релевантным. Такие клетки могут демонстрировать улучшения в отношении жизнеспособности, пролиферации, дифференцировки, морфологических характеристик, реакции на раздражители, метаболизма лекарственных средств, экспрессии генов и синтеза белка и т. п. 3-Мерная культура клеток может обеспечить получение специфических тканеподобных структур и имитацию функций и реакций настоящих тканей таким образом, который является более физиологически релевантным, чем в традиционных 2-мерных клеточных монослоях. In 3D culture systems, functional tissue can be formed with features similar to those observed in vivo . Compared to 2D culture systems, 3D cell culture ensures that cells interact with their environment in all three dimensions and is more physiologically relevant. Such cells can show improvements in viability, proliferation, differentiation, morphological characteristics, response to stimuli, drug metabolism, gene expression and protein synthesis, etc. 3D cell culture can provide specific tissue-like structures and simulate functions and responses. real tissues in a manner that is more physiologically relevant than traditional 2D cell monolayers.

Коммерчески доступными являются несколько 3-мерных тканей, имитирующих органы человека. Например, 3-мерные органотипические ткани легкого можно получать c применением первичных клеток человека, выращиваемых на поверхности раздела жидкость-воздух (ALI), где эти клетки будут дифференцироваться и образовывать функциональную ткань. Эти 3-мерные ткани по морфологическим и метаболическим характеристикам имеют близкое сходство с бронхиальными тканями человека. Также были описаны другие 3-мерные модели, в том числе 3-мерные модели сфероидов из клеток печени. Сфероиды из клеток печени могут состоять из нескольких типов клеток, которые изначально применяли в 2-мерных культурах для определения влияний обработок на клетки печени. Several 3D tissues that mimic human organs are commercially available. For example, 3-dimensional organotypic tissues of the lung can be obtained using primary human cells grown at an air-liquid interface (ALI), where these cells will differentiate and form a functional tissue. These 3-dimensional tissues are morphologically and metabolically similar to human bronchial tissues. Other 3D models have also been described, including 3D models of spheroids from liver cells. Liver cell spheroids can be composed of several cell types, which were originally used in 2D cultures to determine the effects of treatments on liver cells.

Были разработаны разные методики для 2-мерных и 3-мерных культур клеток. Способы 3-мерного культивирования клеток включают применение планшетов для работы по методу висячей капли, магнитной левитации или каркасов из биоматериалов. Однако эти методики часто являются дорогостоящими и/или затратными по времени и могут не допускать возможности одновременного культивирования двух или более разных типов клеток. Они могут быть сложными для применения, не быть пригодными для автоклавирования, что означает, что их нельзя применять повторно, для них может требоваться значительный объем жидкости и поток для замены жидкости, может отсутствовать возможность их применения со стандартным оборудованием, при этом они часто не способны обеспечить водонепроницаемость и непригодны для путей применения, предусматривающих отбор образцов, где требуется высокая пропускная способность, или в режиме реального времени. Настоящее изобретение направлено на обеспечение улучшения в отношении культивирования клеток и отбора образцов среды для культивирования клеток. Different techniques have been developed for 2D and 3D cell cultures. 3D cell culture methods include the use of hanging drop plates, magnetic levitation, or biomaterial scaffolds. However, these techniques are often expensive and/or time consuming and may not allow the simultaneous cultivation of two or more different cell types. They can be difficult to use, not autoclavable which means they cannot be reused, they may require significant fluid volume and flow to replace fluid, they may not be usable with standard equipment, and they are often unable to ensure watertightness and are unsuitable for sampling applications where high throughput is required or in real time. The present invention aims to provide improvements in cell culture and sampling of cell culture media.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

В одном аспекте раскрыт планшет для культивирования клеток, содержащий по меньшей мере две последовательно расположенные лунки и канал, приспособленный для сообщения по текучей среде между лунками, где канал соединен или сообщается с первым насосом посредством отверстий на каждом конце канала, и где указанный первый насос является пригодным для обеспечения циркуляции текучей среды между по меньшей мере двумя лунками. Также раскрыта система для культивирования клеток или устройство для культивирования клеток, содержащие (i) планшет для культивирования клеток, содержащий по меньшей мере две последовательно расположенные лунки и канал, приспособленный для сообщения по текучей среде между лунками; и (ii) первый насос, где канал соединен или сообщается с первым насосом посредством отверстий на каждом конце канала, и где первый насос является пригодными для обеспечения циркуляции текучей среды между по меньшей мере двумя лунками. Соответственно, диаметр канала составляет 3 миллиметра или меньше или представляет собой микрофлюидный канал. In one aspect, a cell culture plate is disclosed, comprising at least two successive wells and a channel adapted for fluid communication between the wells, where the channel is connected or communicates with the first pump through holes at each end of the channel, and where the specified first pump is suitable for circulating fluid between at least two wells. Also disclosed is a cell culture system or cell culture device comprising (i) a cell culture plate comprising at least two consecutive wells and a channel adapted for fluid communication between the wells; and (ii) a first pump, where the conduit is connected to or communicates with the first pump through openings at each end of the conduit, and where the first pump is capable of circulating fluid between the at least two wells. Accordingly, the channel diameter is 3 millimeters or less, or is a microfluidic channel.

Соответственно, насос представляет собой перистальтический насос. Accordingly, the pump is a peristaltic pump.

Соответственно, насос содержит шаговый двигатель или бесщеточный двигатель, содержащие энкодер.Accordingly, the pump contains a stepper motor or a brushless motor containing an encoder.

Каждым двигателем можно управлять с помощью контроллера двигателя, функционированием и датчиками которого можно управлять с помощью микроконтроллера. Функционированием микроконтроллера можно управлять с помощью беспроводного контроллера, такого как контроллер Bluetooth®, при этом для облегчения применения это можно выполнять с помощью беспроводного устройства, такого как планшет.Each motor can be controlled by a motor controller whose operation and sensors can be controlled by a microcontroller. The operation of the microcontroller can be controlled by a wireless controller, such as a Bluetooth® controller, and for ease of use, this can be done by a wireless device, such as a tablet.

Соответственно, канал дополнительно выполнен с возможностью обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток. Accordingly, the channel is further configured to allow fluid to be withdrawn from the cell culture plate.

Соответственно, канал соединен или сообщается со вторым насосом, где указанный второй насос является пригодным для обеспечения выведения текучей среды из планшета. Accordingly, the channel is connected or communicated with the second pump, where the specified second pump is suitable for ensuring the withdrawal of fluid from the tablet.

Соответственно, двигатель первого насоса и/или второго насоса помещен в водонепроницаемую камеру. Accordingly, the motor of the first pump and/or the second pump is placed in a waterproof chamber.

Соответственно, планшет для культивирования клеток оснащен крышкой. Accordingly, the cell culture plate is provided with a lid.

В определенных вариантах осуществления применяют четыре наноса. In certain embodiments, four coats are used.

Соответственно, планшет для культивирования клеток с необязательной крышкой помещен в инкубатор. Инкубатор может быть выполнен с возможностью инкубирования при определенной фиксированной температуре, такой как приблизительно 37°C. Инкубатор может быть выполнен с возможностью инкубирования при разных температурах в течение периода времени, например, в ходе эксперимента. Accordingly, the cell culture plate with the optional lid is placed in the incubator. The incubator may be configured to be incubated at a certain fixed temperature, such as approximately 37°C. The incubator may be configured to be incubated at different temperatures for a period of time, such as during an experiment.

Соответственно, как планшет для культивирования клеток, так и насос(насосы) помещен в инкубатор. Accordingly, both the cell culture plate and the pump(s) are placed in the incubator.

Соответственно, температура внутри инкубатора не колеблется на более чем приблизительно 0,5°C во время применения, например, в ходе эксперимента. Accordingly, the temperature inside the incubator does not fluctuate by more than about 0.5° C. during use, for example during an experiment.

Соответственно, канал содержит два или более отверстий в стенках канала, при этом два или более отверстий канала сообщаются или соединены с лунками. Accordingly, the channel contains two or more holes in the walls of the channel, while two or more holes of the channel communicate with or connected to the wells.

Соответственно, канал соединен с основанием или верхней частью лунок. Accordingly, the channel is connected to the base or top of the wells.

Соответственно, канал соединен с верхней частью лунок, если в нем содержатся сфероиды из клеток печени. Accordingly, the channel is connected to the upper part of the wells if it contains spheroids from liver cells.

Соответственно, канал выполнен с возможностью образования петли, такой как U-изгиб. Accordingly, the channel is configured to form a loop, such as a U-bend.

Соответственно, лунки образуют линейное расположение лунок в планшете. Accordingly, the wells form a linear arrangement of wells in the plate.

Соответственно, планшет содержит 1, 2, 3 или 4 или более каналов, каждый из которых соединен с по меньшей мере одним насосом, который способен обеспечивать сообщение по текучей среде между лунками.Accordingly, the tablet contains 1, 2, 3 or 4 or more channels, each of which is connected to at least one pump, which is capable of providing fluid communication between the wells.

Соответственно, насос расположен снаружи от лунок планшета, соответственно, при этом насос расположен смежно с лунками, расположенными последовательно, что представляет собой схему расположения лунок планшета. При расположении снаружи насос может быть соединен с планшетом с помощью коннектора, такого как коннектор Люэра, или коннектор с фиксатором Люэра, или простой трубный коннектор. Accordingly, the pump is located outside the wells of the plate, respectively, while the pump is located adjacent to the wells located in series, which is the layout of the wells of the plate. When located externally, the pump may be connected to the plate using a connector such as a Luer-lock or Luer-lock connector or a simple tubing connector.

Соответственно, одна или более лунок содержат вставку для культивирования клеток, при этом указанная вставка содержит проницаемую мембрану, которая обеспечивает прохождение среды для культивирования между лункой и вставкой.Accordingly, one or more wells comprise a cell culture insert, said insert comprising a permeable membrane that allows passage of the culture medium between the well and the insert.

Соответственно, одна или более лунок содержат поверхностное покрытие. Accordingly, one or more wells contain a surface coating.

Соответственно, проницаемая мембрана расположена на основании вставки. Accordingly, the permeable membrane is located at the base of the insert.

Соответственно, лунки содержат текучую среду, соответственно, среду для культивирования клеток. Accordingly, the wells contain a fluid medium, respectively a cell culture medium.

Соответственно, лунки или вставки содержат клетки. Accordingly, the wells or inserts contain cells.

Соответственно, лунки являются открытыми и не запечатаны.Accordingly, the wells are open and not sealed.

Соответственно, клетки представляют собой 2-мерные или 3-мерные культуры клеток. Accordingly, the cells are 2-dimensional or 3-dimensional cell cultures.

Соответственно, среда для культивирования клеток содержит одно или более средств. Accordingly, the cell culture medium contains one or more agents.

Соответственно, тип клеток в каждой из лунок представляет собой такой же тип клеток или разный тип клеток. Accordingly, the cell type in each of the wells is the same cell type or a different cell type.

Соответственно, разные типы клеток выбраны из клеток надпочечника, мочевого пузыря, кровеносных сосудов, костной ткани, костного мозга, головного мозга, хрящевой ткани, шейки матки, роговицы, эндометрия, пищевода, желудочно-кишечного тракта, иммунной системы, печени, легкого, лимфатической системы, мышечной ткани, нервной ткани, яичника, поджелудочной железы, гипофиза, предстательной железы, почки, слюнной железы, кожи, сухожилия, яичка и щитовидной железы, соответственно, при этом типы клеток представляют собой клетки легкого или клетки печени, или нейроны. Accordingly, different cell types are selected from cells of the adrenal gland, bladder, blood vessels, bone tissue, bone marrow, brain, cartilage, cervix, cornea, endometrium, esophagus, gastrointestinal tract, immune system, liver, lung, lymphatic system, muscle tissue, nervous tissue, ovary, pancreas, pituitary gland, prostate gland, kidney, salivary gland, skin, tendon, testicle and thyroid gland, respectively, while cell types are lung cells or liver cells, or neurons.

Соответственно, скорость потока, обеспечиваемая первым насосом, составляет от приблизительно 10 мкл в минуту до приблизительно 1000 мкл в минуту. Соответственно, функция первого насоса управляется компьютером. Соответственно, лунки планшета для культивирования клеток или планшет для культивирования клеток изготовлены из полиэфирэфиркетона (PEEK). PEEK представляет собой молекулу из семейства полиарилэфиркетонов (PAEK).Accordingly, the flow rate provided by the first pump is from about 10 µl per minute to about 1000 µl per minute. Accordingly, the function of the first pump is controlled by the computer. Accordingly, the wells of the cell culture plate or the cell culture plate are made of polyetheretherketone (PEEK). PEEK is a molecule from the polyaryletherketone (PAEK) family.

Соответственно, лунки планшета для культивирования клеток или планшет для культивирования клеток содержат или состоят из PEEK. Соответственно, канал находится в сообщении по текучей среде с планшетом, содержащим один или более резервуаров, способных удерживать или хранить текучую среду. Accordingly, the wells of the cell culture plate or cell culture plate contain or consist of PEEK. Accordingly, the channel is in fluid communication with the tablet containing one or more reservoirs capable of holding or storing fluid.

Соответственно, основание лунки содержит неоднородную поверхность, приспособленную для обеспечения снижения степени или предотвращения агломерации сфероидов. Accordingly, the base of the well contains a non-uniform surface adapted to provide a reduction in the degree or prevention of spheroid agglomeration.

Соответственно, основание лунок является по сути круглым по форме, соответственно, при этом диаметр основания составляет от приблизительно 6 мм±5% до приблизительно 16 мм±5%, соответственно, при этом диаметр основания составляет приблизительно 6 мм±5%, приблизительно 11 мм±5% или приблизительно 16 мм±5%. Accordingly, the base of the wells is substantially circular in shape, respectively, with a base diameter of about 6 mm ± 5% to about 16 mm ± 5%, respectively, with a base diameter of approximately 6 mm ± 5%, approximately 11 mm ±5% or approximately 16 mm±5%.

Соответственно, неоднородная поверхность содержит множество канавок, в которых глубина и ширина канавок соответствуют максимальному диаметру сфероида ±10%. Accordingly, the inhomogeneous surface contains a plurality of grooves, in which the depth and width of the grooves correspond to the maximum diameter of the spheroid ±10%.

Соответственно, глубина и ширина множества канавок составляет от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, соответственно, от приблизительно 600 до приблизительно 1000 мкм. Accordingly, the depth and width of the plurality of grooves is from about 200 to about 1000 microns, respectively, from about 600 to about 1000 microns.

Соответственно, канавки образуют множество концентрических колец на основании лунки. Accordingly, the grooves form a plurality of concentric rings at the base of the well.

Соответственно, неоднородная поверхность содержит множество углублений, имеющих закрытое дно и открытую верхнюю часть, при этом размер углублений составляет в глубину и ширину на приблизительно 10% больше, чем максимальный диаметр сфероида.Accordingly, the heterogeneous surface contains a plurality of depressions having a closed bottom and an open top, the size of the depressions being approximately 10% greater in depth and width than the maximum diameter of the spheroid.

Соответственно, лунка содержит среду для культивирования клеток для обеспечения культивирования сфероидов. Accordingly, the well contains a cell culture medium to allow culturing of the spheroids.

Соответственно, лунка содержит отдельные сфероиды, удерживаемые на неоднородной поверхности лунки.Accordingly, the well contains individual spheroids held on the non-uniform surface of the well.

Соответственно, сфероиды представляют собой сфероиды клеток легкого.Accordingly, spheroids are spheroids of lung cells.

Соответственно, скорость потока текучей среды от впускного отверстия к выпускному отверстию лунки, при наличии в ней текучей среды, составляет от приблизительно 1 до приблизительно 500 мкл/мин, соответственно, приблизительно 40 мкл/мин. Accordingly, the fluid flow rate from the inlet to the outlet of the well, when fluid is present, is from about 1 to about 500 µl/min, respectively, about 40 µl/min.

Соответственно, напряжение сдвига в лунке составляет менее 0,1 дин/см². Accordingly, the shear stress in the hole is less than 0.1 dyne/cm ² .

Соответственно, основание по меньшей мере одной из лунок содержит плоскую поверхность, которая лишена неоднородностей. Accordingly, the base of at least one of the dimples contains a flat surface that is free from inhomogeneities.

Соответственно, по меньшей мере одна лунка содержит вставку, расположенную выше основания лунки, соответственно, при этом вставка расположена над проницаемой мембраной, расположенной внутри лунки, с образованием поверхности, которая способна обеспечивать культивирование клетки на границе раздела воздух/жидкость. Accordingly, at least one well contains an insert located above the base of the well, respectively, while the insert is located above the permeable membrane located inside the well, with the formation of a surface that is capable of culturing the cell at the air/liquid interface.

Соответственно, глубина по меньшей мере одной лунки, содержащей плоскую поверхность, которая лишена неоднородностей, отличается от глубины по меньшей мере одной лунки, содержащей неоднородную поверхность, соответственно, при этом глубина по меньшей мере одной лунки, содержащей плоскую поверхность, которая лишена неоднородностей, составляет меньше, чем глубина по меньшей мере одной лунки, содержащей неоднородную поверхность. Accordingly, the depth of at least one well containing a flat surface that is devoid of inhomogeneities is different from the depth of at least one well containing a non-uniform surface, respectively, while the depth of at least one well containing a flat surface that is devoid of inhomogeneities is less than the depth of at least one well containing a non-uniform surface.

Соответственно, лунка содержит среду для культивирования клеток для обеспечения культивирования клетки на поверхности раздела жидкость-воздух. Accordingly, the well contains a cell culture medium to allow the cell to be cultured at the liquid-air interface.

Соответственно, лунка содержит клетки, расположенные на проницаемой мембране, при этом указанные клетки способны расти на поверхности раздела воздух-жидкость.Accordingly, the well contains cells located on a permeable membrane, while these cells are able to grow at the air-liquid interface.

Соответственно, клетки представляют собой клетки легкого. Accordingly, the cells are lung cells.

Соответственно, канал находится в сообщении по текучей среде с планшетом, содержащим один или более резервуаров, способных удерживать текучую среду. В дополнительном аспекте раскрыто устройство для культивирования клеток, содержащее планшет для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, расположенное в инкубаторе. Accordingly, the channel is in fluid communication with the tablet containing one or more reservoirs capable of holding the fluid. In a further aspect, a cell culture device is disclosed comprising a cell culture plate according to the present invention located in an incubator.

В дополнительном аспекте раскрыт способ обеспечения циркуляции текучей среды между двумя или более последовательно расположенными лунками, включающий (a) обеспечение планшета для культивирования клеток или устройства для культивирования клеток, описанных в данном документе; (b) приведение в контакт по меньшей мере двух лунок с текучей средой; и (c) обеспечение циркуляции текучей среды через лунки планшета.In a further aspect, a method for circulating a fluid between two or more consecutive wells is disclosed, comprising (a) providing a cell culture plate or cell culture device as described herein; (b) contacting at least two wells with fluid; and (c) circulating the fluid through the wells of the plate.

Дополнительный аспект связан со способом определения влияния средства на клетку, включающим стадии (a) обеспечения планшета для культивирования клеток или устройства для культивирования клеток, описанных в данном документе; (b) приведения в контакт по меньшей мере двух лунок планшета для культивирования клеток с клетками и средой для культивирования клеток; (c) обеспечения циркуляции среды для культивирования клеток через лунки планшета; (d) воздействия на лунки планшета по меньшей мере одного средства; (e) удаления и исследования образца среды для культивирования клеток из одной или более лунок; и (f) определения влияния средства на клетки до и после воздействия по меньшей мере одного средства. A further aspect relates to a method for determining the effect of an agent on a cell, comprising the steps of (a) providing a cell culture plate or cell culture device as described herein; (b) contacting at least two wells of the cell culture plate with the cells and the cell culture medium; (c) circulating the cell culture medium through the wells of the plate; (d) exposing the wells of the plate to at least one agent; (e) removing and examining a sample of cell culture medium from one or more wells; and (f) determining the effect of the agent on cells before and after exposure to at least one agent.

Дополнительный аспект относится к устройству для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, содержащему (a) планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе; и (b) планшет для образцов, содержащий одну или более лунок для хранения множества образцов, где указанный второй насос является пригодным для обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов. A further aspect relates to a cell culture fluid sampling device upon exposure, comprising (a) a cell culture plate as described herein; and (b) a sample plate comprising one or more wells for storing a plurality of samples, wherein said second pump is suitable for causing fluid to be drawn from the cell culture plate to the sample plate.

Соответственно, текучая среда сообщается с планшетом для образцов с помощью многоканального микродозатора.Accordingly, the fluid is in communication with the sample plate by means of a multichannel microdispenser.

Соответственно, количество пипеток в дозирующей станции соответствует количеству лунок в рядах планшета для образцов. Accordingly, the number of pipettes in the dosing station corresponds to the number of wells in the rows of the sample plate.

Соответственно, устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии содержит резервуар для хранения текучей среды, где указанный резервуар находится в сообщении по текучей среде с лунками планшета для культивирования клеток. Accordingly, the cell culture fluid sampling device upon exposure comprises a fluid storage reservoir, wherein said reservoir is in fluid communication with the wells of the cell culture plate.

Соответственно, устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный насос, приспособленный для обеспечения выведения среды для культивирования клеток из резервуара с повторным заполнением лунок планшета для культивирования клеток.Accordingly, the device for sampling the cell culture fluid upon exposure further comprises at least one additional pump adapted to ensure that the cell culture medium is withdrawn from the reservoir to refill the wells of the cell culture plate.

Соответственно, по меньшей мере один дополнительный насос приспособлен для повторного заполнения лунок планшета для культивирования клеток таким же объемом среды для культивирования клеток, который отбирают в лунки планшета для образцов. Accordingly, the at least one additional pump is adapted to refill the wells of the cell culture plate with the same volume of cell culture medium that is drawn into the wells of the sample plate.

Соответственно, устройство для отбора образцов дополнительно содержит компьютеризованный контроллер, пригодный для автоматического управления функционированием устройства. Accordingly, the sampling device further comprises a computerized controller capable of automatically controlling the operation of the device.

В дополнительном аспекте предусмотрен способ отбора образцов среды для культивирования клеток, содержащей клетки, подвергшиеся воздействию одного или более средств, включающий стадии (a) обеспечения устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, описанного в данном документе; (b) приведения в контакт по меньшей мере одной из лунок со средой для культивирования клеток, содержащей клетки; (c) обеспечения циркуляции среды для культивирования клеток через лунки планшета для культивирования клеток; (d) воздействия на лунки планшета для культивирования клеток по меньшей мере одного средства; и (e) отбора образцов среды для культивирования клеток из планшета для культивирования клеток, где образцы среды для культивирования клеток необязательно отбирают в режиме реального времени во время воздействия средства.In a further aspect, a method is provided for sampling a cell culture medium containing cells exposed to one or more agents, comprising the steps of (a) providing a cell culture fluid sampling device upon exposure described herein; (b) contacting at least one of the wells with a cell culture medium containing the cells; (c) circulating the cell culture medium through the wells of the cell culture plate; (d) exposing the wells of the cell culture plate to at least one agent; and (e) sampling the cell culture medium from the cell culture plate, wherein the cell culture medium is optionally sampled in real time during exposure to the agent.

Соответственно, на стадии (d) лунки планшета для культивирования клеток подвергаются воздействию по меньшей мере одного средства в нескольких временных точках.Accordingly, in step (d), the wells of the cell culture plate are exposed to at least one agent at multiple time points.

Соответственно, объем среды для культивирования клеток, отобранный в качестве образцов на стадии (e), составляет от приблизительно 50 мкл до приблизительно 200 мкл. Accordingly, the volume of cell culture medium taken as samples in step (e) is from about 50 µl to about 200 µl.

Соответственно, способ включает дополнительную стадию (f) определения влияния средства(средств) на отобранные в качестве образцов клетки в среде для культивирования клеток.Accordingly, the method includes the additional step (f) of determining the effect of the agent(s) on sampled cells in the cell culture medium.

Соответственно, способ включает дополнительную стадию (g) определения кинетических показателей для средства(средств) на подвергнутой воздействию культуре клеток.Accordingly, the method includes the additional step (g) of determining the kinetics of the agent(s) on the exposed cell culture.

В дополнительном аспекте раскрыто применение планшета для культивирования клеток, описанного в данном документе, для циркуляции текучей среды между двумя или более лунками.In a further aspect, the use of the cell culture plate described herein to circulate a fluid between two or more wells is disclosed.

В дополнительном аспекте раскрыто применение устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии для отбора образцов текучей среды из лунок планшета для культивирования клеток, соответственно, в режиме реального времени.In a further aspect, the use of an on-impact cell culture fluid sampling device is disclosed for sampling fluid from the wells of a cell culture plate, respectively, in real time.

В дополнительном аспекте раскрыто устройство для культивирования клеток, содержащее полиэфирэфиркетон или состоящее из него, и содержащее средство, включающее (i) алкалоид табака; или (ii) табак-специфичный нитрозамин; или (iii) органический растворитель, при условии, что органический растворитель не представляет собой галогенированный органический растворитель, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или комбинацию двух или более из них.In a further aspect, a cell culture device is disclosed, comprising or consisting of polyetheretherketone, and comprising an agent comprising (i) a tobacco alkaloid; or (ii) tobacco-specific nitrosamine; or (iii) an organic solvent, provided that the organic solvent is not a halogenated organic solvent, or dimethyl sulfoxide, or tetrahydrofuran, or a combination of two or more of them.

Раскрыт способ приведения в контакт клетки с одним или более средствами, включающий (i) приведение в контакт клетки с устройством для культивирования клеток, содержащим полиэфирэфиркетон или состоящим из него; (ii) культивирование клетки и (iii) приведение в контакт клетки, содержащейся в устройстве для культивирования клеток, с одним или более средствами, включающими (i) алкалоид табака; или (ii) табак-специфичный нитрозамин; или (iii) органический растворитель, при условии, что органический растворитель не представляет собой галогенированный органический растворитель, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или комбинацию двух или более из них.Disclosed is a method of contacting a cell with one or more agents, comprising (i) contacting the cell with a cell culture device containing or consisting of polyetheretherketone; (ii) culturing the cell; and (iii) contacting the cell contained in the cell culture device with one or more agents comprising (i) a tobacco alkaloid; or (ii) tobacco-specific nitrosamine; or (iii) an organic solvent, provided that the organic solvent is not a halogenated organic solvent, or dimethyl sulfoxide, or tetrahydrofuran, or a combination of two or more of them.

В дополнительном аспекте раскрыт способ снижения или подавления поглощения средства с использованием устройства для культивирования клеток, содержащего полиэфирэфиркетон или состоящего из него, включающий приведение в контакт устройства для культивирования клеток с одним или более средствами, включающими (i) алкалоид табака; или (ii) табак-специфичный нитрозамин; или (iii) органический растворитель, при условии, что органический растворитель не представляет собой галогенированный органический растворитель, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или комбинацию двух или более из них.In a further aspect, a method of reducing or suppressing absorption of an agent using a cell culture device comprising or consisting of polyetheretherketone is disclosed, comprising contacting the cell culture device with one or more agents comprising (i) a tobacco alkaloid; or (ii) tobacco-specific nitrosamine; or (iii) an organic solvent, provided that the organic solvent is not a halogenated organic solvent, or dimethyl sulfoxide, or tetrahydrofuran, or a combination of two or more of them.

В дополнительном аспекте раскрыто применение устройства для культивирования клеток, содержащего полиэфирэфиркетон или состоящего из него, для снижения или подавления поглощения средства, включающего (i) алкалоид табака; или (ii) табак-специфичный нитрозамин; или (iii) органический растворитель, при условии, что органический растворитель не представляет собой галогенированный органический растворитель, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или комбинацию двух или более из них.In a further aspect, the use of a cell culture device comprising or consisting of polyetheretherketone is disclosed for reducing or suppressing uptake of an agent comprising (i) a tobacco alkaloid; or (ii) tobacco-specific nitrosamine; or (iii) an organic solvent, provided that the organic solvent is not a halogenated organic solvent, or dimethyl sulfoxide, or tetrahydrofuran, or a combination of two or more of them.

Соответственно, табак-специфичный низторазмин представляет собой 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон. Accordingly, tobacco-specific niztorazmin is 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone.

Соответственно, алкалоид табака выбран из группы, состоящей из никотина, анабазина, норникотина, анатабина, котинина и миосмина или комбинации двух или более из них.Accordingly, the tobacco alkaloid is selected from the group consisting of nicotine, anabasine, nornicotine, anatabine, cotinine and myosmin, or a combination of two or more of them.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS

На фигуре 1 изображена вставка для применения в настоящем изобретении. Figure 1 shows an insert for use in the present invention.

На фигуре 2 изображен один вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению. Figure 2 depicts one embodiment of the cell culture plate of the present invention.

На фигуре 3 изображен дополнительный вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению. Figure 3 depicts a further embodiment of the cell culture plate of the present invention.

На фигуре 4 представлено 3-мерное изображение планшета для культивирования клеток, представленного на фигуре 3. Figure 4 is a 3D view of the cell culture plate shown in Figure 3.

На фигуре 5 представлена фотография сконструированного планшета для культивирования клеток, представленного на фигуре 4. Figure 5 is a photograph of the engineered cell culture plate shown in Figure 4.

На фигуре 6 изображен дополнительный вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению. Figure 6 depicts a further embodiment of the cell culture plate of the present invention.

На фигуре 7 изображен дополнительный вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению, в котором планшет для культивирования клеток (который может быть оснащен необязательной крышкой) и насос(насосы) помещен в инкубатор. Figure 7 depicts a further embodiment of the cell culture plate of the present invention in which the cell culture plate (which may be fitted with an optional lid) and pump(s) are placed in an incubator.

На фигуре 8 изображено устройство для отбора образцов, которое включает планшет для культивирования клеток по настоящему изобретению. Figure 8 shows a sampling device that includes a cell culture plate of the present invention.

На фигуре 9(a) изображен один вариант осуществления планшета для культивирования клеток по настоящему изобретению, содержащего один канал с 2 лунками и один канал без лунок, который обеспечивает возвращение текучей среды. Коннектор применяется для соединения трубки с обеспечением прохождения текучей среды из канала с 2 лунками в канал без лунок и затем обратно к одному насосу. Figure 9(a) depicts one embodiment of the cell culture plate of the present invention, comprising one 2-well channel and one no-well channel that allows fluid to be returned. The connector is used to connect tubing to allow fluid to flow from a 2-well channel to a no-well channel and then back to a single pump.

На фигуре 9(b) изображен вариант осуществления, в котором более 2 лунок соединены друг с другом с обеспечением соединения вместе большего числа клеток или тканей. Таким образом можно соединить 2, 4, 6 или 8 лунок и т. д. Каждый конец канала соединен с таким же одним насосом. On thefigure 9(b) depicts an embodiment in which more than 2 wells are connected to each other to allow more cells or tissues to be joined together. This way you can connect 2, 4, 6 or 8 holes etc. Each end of the channel is connected to the same one pump.

На фигуре 10 изображен дополнительный вариант осуществления устройства для отбора образцов по настоящему изобретению, которое включает планшет для культивирования клеток и три насоса. Figure 10 depicts a further embodiment of the sampling apparatus of the present invention, which includes a cell culture plate and three pumps.

На фигуре 11 представлено поперечное сечение лунки с множеством концентрических канавок для удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B» на фигуре 14). Размеры представлены в миллиметрах. Figure 11 is a cross-sectional view of a well with a plurality of concentric grooves for holding individual spheroids (labeled "see Detail B" in Figure 14). Dimensions are in millimeters.

На фигуре 12 представлен схематический вид сверху лунки с множеством концентрических канавок для удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B» на фигуре 14). Размеры представлены в миллиметрах. Figure 12 is a schematic plan view of a well with a plurality of concentric grooves for holding individual spheroids (labeled "see Detail B" in Figure 14). Dimensions are in millimeters.

На фигуре 13 представлен схематический вид сверху лунки, содержащей микрофлюидный канал (обозначено как «см. деталь С» на фигуре 4). Размеры представлены в миллиметрах. Figure 13 is a schematic top view of a well containing a microfluidic channel (labeled "see Detail C" in Figure 4). Dimensions are in millimeters.

На фигуре 14 представлен схематический вид сверху многолуночного планшета, содержащего лунки с множеством концентрических канавок для удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B») и лунки, содержащие вставку (обозначено как «см. деталь С»). Лунки соединены с помощью канала таким образом, что каждая из первой лунки («см. деталь B») и второй лунки («см. деталь C») находится в сообщении по текучей среде друг с другом. Размеры представлены в миллиметрах. Figure 14 is a schematic plan view of a multiwell plate containing wells with a plurality of concentric grooves to hold individual spheroids (labeled "see detail B") and wells containing an insert (labeled "see detail C"). The wells are connected by a channel such that the first well ("see detail B") and the second well ("see detail C") are each in fluid communication with each other. Dimensions are in millimeters.

На фигуре 15 представлено поперечное сечение по линии C-C на фигуре 14. Figure 15 is a cross section along line CC in Figure 14.

На фигуре 16 представлено поперечное сечение лунки с множеством углублений для обеспечения функции удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B» на фигуре 15). Figure 16 is a cross-sectional view of a well with a plurality of depressions to provide the function of holding individual spheroids (labeled "see Detail B" in Figure 15).

На фигуре 17 представлен схематический вид сверху отдельной лунки с множеством углублений для удерживания отдельных сфероидов, как показано на фигуре 16. Размеры представлены в миллиметрах. Figure 17 is a schematic plan view of a single well with multiple recesses for holding individual spheroids as shown in Figure 16. Dimensions are in millimeters.

На фигуре 18 представлен схематический вид сверху многолуночного планшета, содержащего лунки с множеством углублений для удерживания отдельных сфероидов (обозначено как «см. деталь B») и лунки, содержащие вставку (обозначено как «см. деталь С»). Лунки соединены с помощью канала таким образом, что каждая из первой лунки («см. деталь B») и второй лунки («см. деталь C») находится в сообщении по текучей среде друг с другом. Размеры представлены в миллиметрах. Figure 18 is a schematic top view of a multiwell plate containing wells with multiple recesses for holding individual spheroids (labeled "see detail B") and wells containing an insert (labeled as "see detail C"). The wells are connected by a channel such that the first well ("see detail B") and the second well ("see detail C") are each in fluid communication with each other. Dimensions are in millimeters.

На фигуре 19 представлено поперечное сечение по линии C-C на фигуре 18. Figure 19 is a cross section along line CC in Figure 18.

На фигуре 20 показаны результаты определения напряжения сдвига, рассчитанные для каждой из двух разных лунок, как показано на фигуре, и параметры, используемые для расчета напряжения сдвига. Figure 20 shows the shear stress results calculated for each of the two different wells as shown in the figure and the parameters used to calculate the shear stress.

На фигуре 21(a) показаны агломерированные сфероиды. На фигуре 21(b) показаны неагломерированные сфероиды в индивидуализированной форме, полученные в соответствии с настоящим изобретением. Figure 21(a) shows agglomerated spheroids. Figure 21(b) shows non-agglomerated spheroids in individualized form obtained in accordance with the present invention.

На фигуре 22 показан график, на котором приведено сравнение количества никотина, оставшегося в планшете PEEK и планшете PDMS после 8 часов инкубации при 4 °C. Figure 22 shows a graph comparing the amount of nicotine remaining in a PEEK tablet and a PDMS tablet after 8 hours of incubation at 4°C.

На фигуре 23 показан планшет для культивирования клеток, соединенный с планшетом с резервуарами, который можно применять для увеличения объема циркулирующей текучей среды. Figure 23 shows a cell culture plate connected to a reservoir plate that can be used to increase the volume of circulating fluid.

НЕКОТОРЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВАSOME BENEFITS

В настоящем изобретении могут применяться стандартные планшеты для культивирования клеток, что упрощает разработку, снижает стоимость и обеспечивает прочную основу для осуществления экспериментов, поскольку стандартные планшеты для культивирования клеток широко применяются в лабораториях. Например, анализ с применением стандартного планшета для культивирования клеток может выполняться с применением стандартного лабораторного оборудования. Соответственно, стандартный планшет для культивирования клеток содержит две или более или множество лунок, которые по сути являются круглыми по форме. Соответственно, диаметр основания лунок составляет от приблизительно 6 мм±5% до приблизительно 16 мм±5%, соответственно, при этом диаметр основания составляет приблизительно 6 мм±5%, приблизительно 11 мм±5% или приблизительно 16 мм±5%. В одном варианте осуществления диаметр основания лунок составляет от приблизительно 6 мм±5% (например, приблизительно 6,4 мм) до приблизительно 16 мм±5% (например, приблизительно 15,5 мм). The present invention can use standard cell culture plates, which simplifies development, reduces cost, and provides a solid basis for experimentation since standard cell culture plates are widely used in laboratories. For example, analysis using a standard cell culture plate can be performed using standard laboratory equipment. Accordingly, a standard cell culture plate contains two or more or multiple wells that are substantially circular in shape. Accordingly, the base diameter of the wells is from about 6 mm±5% to about 16 mm±5%, respectively, with the base diameter being about 6 mm±5%, about 11 mm±5%, or about 16 mm±5%. In one embodiment, the base diameter of the wells is from about 6 mm±5% (eg, about 6.4 mm) to about 16 mm±5% (eg, about 15.5 mm).

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии можно применять со стандартными вставками для культивирования клеток, что упрощает разработку и обеспечивает снижение стоимости планшета для культивирования клеток. The cell culture plate/exposed cell culture fluid sampler can be used with standard cell culture inserts, which simplifies development and reduces the cost of the cell culture plate.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии можно применять для культивирования и изучения 3-мерных культур клеток. The cell culture plate/exposed cell culture fluid sampler can be used to culture and study 3D cell cultures.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивает преодоление ограничений стандартных методик культивирования клеток. Например, они могут точно имитировать естественное микроокружение для клеток. The cell culture plate/exposed cell culture fluid sampling device overcomes the limitations of standard cell culture techniques. For example, they can accurately mimic the natural microenvironment for cells.

Разные 3-мерные культуры клеток могут быть культивированы на одном и том же планшете, который обеспечивает соединение вместе разных типов клеток таким образом, что можно определять взаимодействие между клетками.Different 3-dimensional cell cultures can be cultured on the same plate, which allows different types of cells to be brought together in such a way that interactions between cells can be determined.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии могут обеспечивать снижение риска контаминации, поскольку они пригодны для автоклавирования.The cell culture plate/cell culture fluid sampler, when exposed, can reduce the risk of contamination because it is autoclavable.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток можно изготавливать без применения клея, что может обеспечить улучшение биосовместимости. The cell culture plate/cell culture fluid sampler can be made without the use of an adhesive, which can improve biocompatibility.

Планшет для культивирования клеток и соответствующий(соответствующие) насос(насосы), применяемые для обеспечения циркуляции текучей среды между лунками, могут быть помещены вместе в инкубатор. Инкубатор может оставаться закрытым во время применения и клетки могут оставаться непотревоженными. Скорость потока текучей среды, которая определяется насосами, можно модулировать (например, посредством Bluetooth®) не потревожив клетки. Поскольку инкубатор может оставаться закрытым во время применения, температура внутри инкубатора может оставаться стабильной с обеспечением сведения к минимуму колебаний температуры. Поскольку планшет для культивирования клеток и соответствующий(соответствующие) насос(насосы) помещают вместе в один и тот же инкубатор, количество проводов, проходящих между внутренней частью и наружной частью инкубатора, можно свести к минимуму и это может обеспечить улучшение в отношении герметичности инкубатора и дополнительное снижение частоты колебаний температуры. Обычно потребуется только один кабель снаружи инкубатора для соединения насоса с источником энергии, хотя при необходимости можно применять насосы, работающие на аккумуляторах. Это может обеспечить упрощение разработки инкубатора, содержащего планшет для культивирования клеток и соответствующий(соответствующие) насос(насосы), что делает его менее громоздким и более легким для применения. Циркулирующую текучую среду, такую как среда для культивирования клеток, можно смешивать автоматически, что может обеспечить улучшение в отношении культивирования клеток/тканей.The cell culture plate and the appropriate pump(s) used to circulate fluid between wells can be placed together in an incubator. The incubator may remain closed during use and the cells may remain undisturbed. The fluid flow rate, which is determined by the pumps, can be modulated (eg via Bluetooth®) without disturbing the cells. Since the incubator can remain closed during use, the temperature inside the incubator can remain stable, ensuring that temperature fluctuations are minimized. Because the cell culture plate and the respective pump(s) are placed together in the same incubator, the number of wires running between the inside and outside of the incubator can be kept to a minimum and this can provide an improvement in terms of the tightness of the incubator and additional reduction in the frequency of temperature fluctuations. Usually only one cable will be needed outside the incubator to connect the pump to the power source, although battery powered pumps can be used if required. This can provide a simplification of the development of an incubator containing a cell culture plate and the corresponding pump(s), making it less bulky and easier to use. A circulating fluid, such as cell culture medium, can be mixed automatically, which can provide an improvement in cell/tissue culture.

Лунки планшета для культивирования клеток могут быть открытыми и не запечатанными. Во время применения ткани или клетки в лунках могут подвергаться воздействию воздуха окружающей среды, присутствующему в инкубаторе. Такая система обеспечивает уравновешивание среды с воздухом, присутствующим в инкубаторе, поддерживая pH среды на физиологическом уровне и обеспечивая удаление газов, испускаемых тканями, из среды. Данная конфигурация является особенно предпочтительной при применении тканей или клеток, выращиваемых на поверхности раздела воздух-жидкость, которые являются более зависимыми от влажности воздуха окружающей среды и концентрации газов. The wells of the cell culture plate may be open or unsealed. During use, the tissues or cells in the wells may be exposed to the ambient air present in the incubator. Such a system balances the medium with the air present in the incubator, maintaining the pH of the medium at a physiological level and ensuring the removal of gases emitted by the tissues from the medium. This configuration is particularly preferred when using tissues or cells grown at the air-liquid interface, which are more dependent on ambient air humidity and gas concentrations.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивают возможность культивирования двух или более типов клеток одновременно. Это обеспечивает возможность взаимодействия клеток, подлежащих изучению, друг с другом. The cell culture plate/exposed cell culture fluid sampler allows two or more types of cells to be cultured simultaneously. This allows the cells to be studied to interact with each other.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивает возможность специалисту в данной области техники изучать как метаболизируемое средство из первого типа клеток влияет на второй тип клеток. The cell culture plate/exposed cell culture fluid sampling device allows one skilled in the art to study how a metabolizable agent from a first cell type affects a second cell type.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивает возможность специалисту в данной области техники изучать, как метаболизируемое средство из второго типа клеток влияет на первый тип клеток. The cell culture plate/exposed cell culture fluid sampling device allows one skilled in the art to study how a metabolizable agent from a second cell type affects the first cell type.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии обеспечивает возможность изучать влияние метаболизируемых средств из разных типов клеток, в том числе комбинаций разных типов клеток. The cell culture plate/exposed cell culture fluid sampler provides the ability to study the effects of metabolizable agents from different cell types, including combinations of different cell types.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии можно приспособить для применения в анализах, где требуется высокая пропускная способность, таких как отбор образцов или скрининг, где требуется высокая пропускная способность. The cell culture plate/impact cell culture fluid sampler can be adapted for use in assays where high throughput is required, such as sampling or screening where high throughput is required.

Планшет для культивирования клеток/устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии можно приспособить для применения в анализах в режиме реального времени, таких как отбор образцов или скрининг в режиме реального времени. The cell culture plate/exposed cell culture fluid sampling device can be adapted for use in real-time assays such as sampling or real-time screening.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION

При осуществлении на практике настоящего изобретения применяют, если не указано иное, традиционные методики инженерии, микроинженерии, микробиологии, клеточной биологии и биохимии. Такие методики полностью объяснены в литературе, такой как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. CeIMs, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, IB. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994). Процедуры, в которых применяются коммерчески доступные наборы и реагенты, обычно будут применяться в соответствии с протоколами, определенными производителем, если не указано иное.In the practice of the present invention, unless otherwise indicated, conventional techniques of engineering, microengineering, microbiology, cell biology and biochemistry are used. Such techniques are fully explained in literature such as Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. CeIMs, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, IB. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994). Procedures that use commercially available kits and reagents will generally be used according to the protocols specified by the manufacturer, unless otherwise specified.

Используемым в данном документе техническим терминам и выражениям следует придавать значение, которое обычно применяется к ним в соответствующей области молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и биохимии. Все нижеследующие определения терминов применяются ко всему содержанию настоящей заявки. The technical terms and expressions used herein should be given the meaning normally applied to them in the relevant field of molecular biology, microbiology, cell biology and biochemistry. All of the following definitions of terms apply to the entire content of this application.

Используемые в данном документе формы единственного числа включают формы единственного и множественного числа, если из контекста явно не следует иное. As used herein, the singular forms include the singular and plural forms, unless the context clearly dictates otherwise.

Термин «и/или» означает (а) или (b) или как (а), так и (b).The term "and/or" means (a) or (b) or both (a) and (b).

Термины «содержащий», «содержит» и «в состав входят», используемые в данном документе, являются синонимами «включающий», «включает» или «содержащий в себе», «содержит в себе» и являются включающими или неограничивающими и не исключают дополнительных, не перечисленных представителей, элементов или этапов способа. The terms “comprising,” “comprises,” and “comprises” as used herein are synonymous with “comprising,” “comprises,” or “comprising,” “comprises,” and are inclusive or non-limiting and do not exclude additional , not listed representatives, elements or steps of the method.

Термин «состоящий из» означает, что дополнительные компоненты исключены и имеются только упомянутые элементы и ничего больше.The term "consisting of" means that the additional components are excluded and there are only the mentioned elements and nothing else.

Упоминание числовых диапазонов с помощью конечных точек включает все числа и дробные значения, включенные в соответствующие диапазоны, а также упомянутые конечные точки.References to numeric ranges with endpoints include all numbers and decimals included in the respective ranges, as well as the endpoints mentioned.

Предусматривается, что термин «приблизительно», используемый в данном документе в отношении измеряемого значения, такого как параметр, количество, продолжительность и т. п., охватывает изменчивость указанного значения и отклонения от него, в частности отклонения на +/-10% или менее, предпочтительно на +/-5% или менее, более предпочтительно на +/-1% или менее и еще более предпочтительно на +/-0,1% или менее от указанного значения, если такие изменения являются допустимыми при осуществлении настоящего изобретения. Следует понимать, что значение, к которому относится модификатор «приблизительно», также конкретно и предпочтительно раскрыто само по себе.The term "approximately" as used herein in relation to a measurable value, such as a parameter, quantity, duration, etc., is intended to cover the variability of the specified value and deviations from it, in particular deviations of +/-10% or less , preferably +/-5% or less, more preferably +/-1% or less, and even more preferably +/-0.1% or less of the specified value, if such changes are acceptable in the implementation of the present invention. It should be understood that the meaning to which the modifier "about" refers is also specifically and preferably disclosed on its own.

Принимая во внимание, что термин «один или более», как, например, один или более членов из группы членов, является ясным per se, с целью дополнительного пояснения термин охватывает, inter alia, ссылку на любой из указанных членов или на любые два или более из указанных членов, как, например, любые ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 или ≥7 и т. д. из указанных членов и вплоть до всех указанных членов.Whereas the term "one or more", such as one or more members of a group of members, is clear per se, for purposes of further clarification, the term encompasses, inter alia , reference to any of said members or to any two or more of the specified members, such as any ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 or ≥7, etc. of the specified members and up to all of the specified members.

Планшет для культивирования клеток cell culture plate

Планшет для культивирования клеток для применения в настоящем изобретении может быть изготовлен в различных форматах, таких как 24, 48 или 96-луночные форматы, и может быть легко выбран специалистом в данной области техники на основе размера и выбора эксперимента, который предполагается выполнять. Соответственно, планшет для культивирования клеток для применения в настоящем изобретении, представляет собой планшет для культивирования клеток в 24, 48 или 96-луночном формате. Обычно планшет для культивирования клеток имеет размеры, составляющие приблизительно 12 см в длину и приблизительно 8 см в ширину. The cell culture plate for use in the present invention can be made in various formats, such as 24, 48, or 96 well formats, and can be easily selected by one skilled in the art based on the size and choice of experiment to be performed. Accordingly, the cell culture plate for use in the present invention is a cell culture plate in 24, 48 or 96 well format. Typically, the cell culture plate has dimensions of approximately 12 cm in length and approximately 8 cm in width.

Планшет для культивирования клеток обычно будет находиться в виде плоского планшета, содержащего множество лунок. Как правило, весь планшет является прямоугольным. The cell culture plate will typically be in the form of a flat plate containing a plurality of wells. Typically, the entire tablet is rectangular.

Соответственно, диаметр основания лунок составляет от приблизительно 6 мм±5% до приблизительно 16 мм±5%, соответственно, при этом диаметр основания составляет приблизительно 6 мм±5%, приблизительно 11 мм±5% или приблизительно 16 мм±5%. В одном варианте осуществления диаметр основания лунок составляет от приблизительно 6 мм±5% (например, приблизительно 6,4 мм) до приблизительно 16 мм±5% (например, приблизительно 15,5 мм). Accordingly, the base diameter of the wells is from about 6 mm±5% to about 16 mm±5%, respectively, with the base diameter being about 6 mm±5%, about 11 mm±5%, or about 16 mm±5%. In one embodiment, the base diameter of the wells is from about 6 mm±5% (eg, about 6.4 mm) to about 16 mm±5% (eg, about 15.5 mm).

Емкость каждой лунки может составлять от приблизительно 300 мкл до приблизительно 3400 мкл, или от приблизительно 350 мкл до приблизительно 3400 мкл, или от приблизительно 370 мкл до приблизительно 3400 мкл. Обычно объем текучей среды, которая циркулирует в планшете для культивирования клеток, будет составлять от приблизительно 2,5 мл до приблизительно 12 мл, например, приблизительно 8 мл. Планшет для культивирования клеток выполнен с возможностью содержания по меньшей мере двух последовательно расположенных лунок. Планшет для культивирования клеток может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере двух линейно расположенных лунок. The capacity of each well may be from about 300 µl to about 3400 µl, or from about 350 µl to about 3400 µl, or from about 370 µl to about 3400 µl. Typically, the volume of fluid that circulates in the cell culture plate will be from about 2.5 ml to about 12 ml, for example, about 8 ml. The cell culture plate is configured to contain at least two consecutive wells. The cell culture plate may be configured to contain at least two linearly spaced wells.

Обычно лунки в планшете для культивирования клеток будут расположены по рядам и столбцам. Например, 24-луночный планшет может быть выполнен в виде 6 линейных рядов из 4 смежных лунок в каждом ряду. В качестве дополнительного примера, 48-луночный планшет может быть выполнен в виде 8 линейных рядов из 6 смежных лунок в каждом ряду. В качестве дополнительного примера, 96-луночный планшет может быть выполнен в виде 12 линейных рядов из 8 смежных лунок в каждом ряду. Планшеты для культивирования клеток при необходимости можно даже изготовить или выполнить индивидуально для обеспечения необходимого количества лунок в планшете. Typically, wells in a cell culture plate will be arranged in rows and columns. For example, a 24-well plate can be made in 6 linear rows of 4 adjacent wells in each row. As an additional example, a 48-well plate can be made in 8 linear rows of 6 adjacent wells in each row. As an additional example, a 96-well plate can be made in 12 linear rows of 8 adjacent wells in each row. The cell culture plates can even be custom made or customized to provide the desired number of wells in the plate if needed.

Необязательно использовать каждую лунку в планшете. При условии, что по меньшей мере две последовательно расположенные лунки используются в планшете для культивирования клеток, этого будет достаточно для выполнения эксперимента в соответствии с настоящим изобретением. It is not necessary to use every well in the plate. Provided that at least two consecutive wells are used in a cell culture plate, this will be sufficient to carry out an experiment in accordance with the present invention.

Лунки планшета для культивирования клеток обычно будут открытыми и не запечатанными, что может облегчить культивирование/поддержание клеток и циркуляцию аэрозоля. The wells of the cell culture plate will typically be open and unsealed, which can facilitate cell culture/maintenance and aerosol circulation.

Планшет для культивирования клеток может быть оснащен крышкой сверху планшета, которая способствует снижению риска контаминации в лунках. Крышка предпочтительно является не припаянной к планшету с тем, чтобы воздух мог циркулировать внутри планшета, что также может облегчать культивирование/поддержание клеток и циркуляцию аэрозоля.The cell culture plate can be fitted with a lid on top of the plate to help reduce the risk of contamination in the wells. The lid is preferably not soldered to the plate so that air can circulate within the plate, which can also facilitate cell culture/maintenance and aerosol circulation.

Планшет для культивирования клеток может быть изготовлен из политетрафторэтилена (PTFE), нержавеющей стали (например, 316L/1.4435), PEEK, полипропилена, или полисульфона, или комбинации двух или более из них. Покрытие, такое как покрытие из парилена, может быть нанесено на любой из материалов, представляющих собой PTFE, нержавеющую сталь (например, 316L/1.4435), PEEK, полипропилен или полисульфон.The cell culture plate can be made of polytetrafluoroethylene (PTFE), stainless steel (eg 316L/1.4435), PEEK, polypropylene, or polysulfone, or a combination of two or more of these. A coating, such as a parylene coating, can be applied to any of PTFE, stainless steel (eg 316L/1.4435), PEEK, polypropylene, or polysulfone.

В определенных вариантах осуществления применение PEEK является предпочтительным, поскольку он имеет преимущество, проявляющееся в отсутствии поглощения никотина и NNK, как описано в данном документе. In certain embodiments, the use of PEEK is preferred because it has the advantage of not absorbing nicotine and NNK as described herein.

При необходимости планшеты для культивирования клеток могут быть разработаны с помощью компьютерного дизайна (CAD) или они являются коммерчески доступными. Планшеты CAD могут быть изготовлены с помощью микромеханической обработки с применением способов, которые хорошо известны из уровня техники. If desired, cell culture plates can be designed using computer-aided design (CAD) or they are commercially available. CAD plates can be manufactured by micromachining using methods that are well known in the art.

Соответственно, планшет для культивирования клеток представляет собой цельный планшет для культивирования клеток. Поскольку планшет для культивирования клеток является цельным, то он лишен слоев. Поскольку планшет для культивирования клеток является цельным, то он не содержит клея. Поскольку планшет для культивирования клеток является цельным, то он не содержит слоев и клея. Это может облегчать стерилизацию планшета для культивирования клеток, поскольку его можно полностью автоклавировать. Accordingly, the cell culture plate is an integral cell culture plate. Because the cell culture plate is one piece, it is devoid of layers. Since the cell culture plate is one piece, it does not contain any adhesive. Because the cell culture plate is one-piece, it does not contain layers or adhesives. This can facilitate sterilization of the cell culture plate since it can be completely autoclaved.

В одном варианте осуществления планшет для культивирования клеток представляет собой микрофлюидный планшет для культивирования клеток, который широкодоступен из уровня техники. Например, микрофлюидный планшет для культивирования клеток M04S доступен от Cellasic, Калифорния, США, и содержит 4 независимые лунки, при этом диаметр каждой лунки составляет приблизительно 2,8 мм при высоте 120 микрон. Размеры этого планшета составляют приблизительно 8,5 см в ширину, приблизительно 12,7 см в длину и приблизительно 1,4 см в высоту.In one embodiment, the cell culture plate is a microfluidic cell culture plate, which is widely available in the art. For example, the M04S microfluidic cell culture plate is available from Cellasic, CA, USA, and contains 4 independent wells, each well having a diameter of approximately 2.8 mm at a height of 120 microns. This tablet measures approximately 8.5 cm wide, approximately 12.7 cm long and approximately 1.4 cm high.

В определенных вариантах осуществления длина планшета для культивирования клеток составляет приблизительно 10 см или больше в длину, или приблизительно 11 см или больше в длину, или более 12 см в длину. В определенных вариантах осуществления длина планшета для культивирования клеток составляет менее приблизительно 10 см в длину, например, приблизительно 9 см в длину, приблизительно 8 см в длину, приблизительно 7 см в длину, приблизительно 6 см в длину или приблизительно 5 см в длину. In certain embodiments, the cell culture plate is about 10 cm or more in length, or about 11 cm or more in length, or more than 12 cm in length. In certain embodiments, the cell culture plate is less than about 10 cm long, such as about 9 cm long, about 8 cm long, about 7 cm long, about 6 cm long, or about 5 cm long.

Планшет для культивирования клеток приспособлен для обеспечения сообщения по текучей среде между по меньшей мере двумя последовательно расположенными лунками. Этого можно достичь путем образования по меньшей мере одного отверстия в каждой из двух лунок планшета для культивирования клеток и затем соединения каждой из лунок посредством отверстия(отверстий) с каналом (например, трубой или трубкой). В одном варианте осуществления канал(каналы) непосредственно вырезан(вырезаны) или встроен(встроены) внутри планшета для культивирования клеток для обеспечения соединения вместе по меньшей мере двух лунок. Соответственно, канал(каналы) проходит(проходят) под лунками планшета для культивирования клеток. При необходимости канал(каналы) может(могут) соединяться с дном или верхней частью лунок. Диаметр канала может составлять приблизительно 3 мм, приблизительно 1,6 мм или приблизительно 1 мм или меньше. Канал может иметь круговой диаметр с целью снижения образования воздушных пузырьков. Канал может представлять собой микрофлюидный канал, который будет иметь диаметр менее 1 мм. Применение микрофлюидных каналов хорошо известно специалисту в данной области техники.The cell culture plate is adapted to provide fluid communication between at least two consecutive wells. This can be achieved by forming at least one hole in each of the two wells of the cell culture plate and then connecting each of the wells via the hole(s) to a channel (eg, pipe or tube). In one embodiment, the channel(s) are directly cut(s) or embedded(s) within the cell culture plate to allow at least two wells to be connected together. Accordingly, the channel(s) extend(s) under the wells of the cell culture plate. If necessary, the channel(s) may be connected to the bottom or top of the wells. The channel diameter may be about 3 mm, about 1.6 mm, or about 1 mm or less. The channel may have a circular diameter to reduce the formation of air bubbles. The channel may be a microfluidic channel, which will have a diameter of less than 1 mm. The use of microfluidic channels is well known to the person skilled in the art.

Канал содержит отверстия на каждом конце. Обычно каждый конец с отверстием соединен с тем же насосом. Соответственно, каждый конец с отверстием будет заканчиваться в том же насосе. The channel contains holes at each end. Usually each orifice end is connected to the same pump. Accordingly, each end with a hole will end in the same pump.

Различные виды коннекторов могут применяться для соединения канала с первым насосом. Один пример представляет собой коннектор Люэра, такой как коннектор с фиксатором Люэра, или простой трубный коннектор. Применение коннекторов Люэра является предпочтительным, поскольку они являются легкодоступными, легкими в установке и могут обеспечивать улучшение в отношении стерильности и герметичности. Various types of connectors can be used to connect the channel to the first pump. One example is a Luer connector, such as a Luer lock connector, or a simple tube connector. The use of Luer connectors is preferred because they are readily available, easy to install, and can provide an improvement in terms of sterility and sealing.

Часть канала, которая обеспечивает выведение текучей среды в направлении первого насоса или от него, называется в данном документе «канал для передачи текучей среды». Стенки канала для передачи текучей среды обычно будут запаянными за исключением отверстия на одном конце, которое может быть соединено или сообщаться с первым насосом. Другими словами, стенки этой части канала будут лишены каких-либо отверстий. Другая часть канала называется в данном документе «канал для сообщения лунок», поскольку он обеспечивает сообщение по текучей среде с каждой лункой через отверстия в стенках канала. Количество отверстий в стенках канала для сообщения лунок будет зависеть от количества лунок, с которыми текучая среда должна сообщаться. Обычно отверстия в стенках канала для сообщения лунок будут располагаться в верхней части канала для сообщения лунок. Канал для сообщения лунок обычно будет соединяться либо с основанием, либо с верхней частью лунок. В определенных вариантах осуществления предпочтительно, чтобы канал для сообщения лунок был соединен с верхней частью лунок, если в нем содержатся сфероиды из клеток печени. Канал для сообщения лунок может обеспечивать сообщение по текучей среде в направлении насоса или от него. Канал для передачи текучей среды и канал для сообщения лунок, как правило, будут выполнены по сути в линейном расположении и могут быть расположены по сути параллельно друг с другом. The portion of the conduit that allows fluid to flow towards or away from the first pump is referred to herein as a "fluid transmission conduit". The walls of the fluid transfer channel will typically be sealed except for an opening at one end which may be connected to or in communication with the first pump. In other words, the walls of this part of the channel will be devoid of any holes. The other part of the channel is referred to herein as a "well communication channel" because it provides fluid communication with each well through holes in the walls of the channel. The number of holes in the walls of the well communication channel will depend on the number of wells with which fluid is to be communicated. Typically, holes in the walls of the well communication channel will be located at the top of the well communication channel. The well communication channel will typically connect to either the base or the top of the wells. In certain embodiments, the well communication channel is preferably connected to the top of the wells if it contains spheroids from liver cells. The well communication channel may provide fluid communication towards or away from the pump. The fluid transfer channel and the well communication channel will generally be in a substantially linear arrangement and may be arranged substantially parallel to each other.

Эти каналы могут быть в виде трубок, таких как гибкие трубки. Таким образом, каналы могут быть выполнены с соединением трубкой, таким как соединение гибкой трубкой, или соединение силиконовой трубкой, или соединение трубкой Pharmed. Петля или U-изгиб соединяет канал для передачи текучей среды и канал для сообщения лунок. Петля выполнена с возможностью выведения текучей среды из насоса, а затем возвращения ее в направлении насоса. These channels may be in the form of tubes, such as flexible tubes. Thus, the channels can be made with a tube connection, such as a flexible tube connection, or a silicone tube connection, or a Pharmed tube connection. A loop or U-bend connects the fluid transfer channel and the well communication channel. The loop is configured to withdraw fluid from the pump and then return it towards the pump.

Петля может быть расположена внутри или снаружи планшета для культивирования клеток. Если петля расположена снаружи планшета для культивирования клеток, то коннектор, такой как коннектор Люэра, или коннектор с фиксатором Люэра, или простой трубный коннектор, можно применять для обеспечения герметичности и включения петли в планшет для культивирования клеток.The loop may be located inside or outside the cell culture plate. If the loop is located on the outside of the cell culture plate, then a connector such as a Luer or Luer lock or simple tubing connector can be used to seal and incorporate the loop into the cell culture plate.

Соединение трубкой можно применять для соединения разных каналов вместе, такое как соединение силиконовой трубкой или трубкой Pharmed. Tubing can be used to connect different channels together, such as silicone tubing or Pharmed tubing.

Когда текучая среда переносится в канале, она может переноситься из насоса, а затем возвращаться обратно в насос. При необходимости текучая среда может циркулировать по часовой или против часовой стрелки через лунки. Первый насос обычно выполнен с возможностью ориентации на противоположную сторону планшета для культивирования клеток в направлении петли, которая обеспечивает возвращение текучей среды через канал для передачи текучей среды или канал для сообщения лунок. Первый насос и петля могут располагаться на противоположных сторонах планшета для культивирования клеток по сути в линейном расположении. При этом в определенных вариантах осуществления текучая среда передается из первого насоса в канал для передачи текучей среды и в канал для сообщения лунок через петлю и обратно в первый насос (см. фигура 2), также предусмотрено, что текучая среда передается из первого насоса в канал для сообщения лунок и в канал для передачи текучей среды через петлю и обратно в первый насос (см., фигура 3c и 9a, например). Также предусмотрено, что текучая среда передается из первого насоса в первый канал для передачи текучей среды и затем в первый канал для сообщения лунок через первую петлю, а затем через вторую петлю во второй канал для передачи текучей среды и во второй канал для сообщения лунок через третью петлю (см. фигура 9b, например) и затем обратно в первый насос. When fluid is carried in the channel, it may be carried out of the pump and then returned back to the pump. If necessary, the fluid may be circulated clockwise or counterclockwise through the wells. The first pump is typically configured to be oriented toward the opposite side of the cell culture plate towards a loop that allows fluid to return through the fluid transfer channel or well communication channel. The first pump and loop may be located on opposite sides of the cell culture plate in a substantially linear arrangement. At the same time, in certain embodiments, the implementation of the fluid is transferred from the first pump into the channel for transferring the fluid and into the channel for communicating wells through the loop and back to the first pump (see figure 2), it is also provided that the fluid is transferred from the first pump into the channel to communicate the wells and into the channel to transfer the fluid through the loop and back to the first pump (see, figure 3c and 9a, for example). It is also provided that the fluid is transferred from the first pump to the first fluid transmission channel and then to the first well communication channel through the first loop, and then through the second loop to the second fluid transmission channel and to the second well communication channel through the third loop. loop (see figure 9b for example) and then back to the first pump.

Планшет для культивирования клеток, содержащий по меньшей мере две последовательно расположенные лунки и канал, приспособленный для сообщения по текучей среде между лунками, который соединен или сообщается с первым насосом посредством отверстий на каждом конце канала, может образовывать контур для циркуляции текучей среды между по меньшей мере двумя лунками. Текучая среда может циркулировать между лунками через канал и насос. В определенных вариантах осуществления планшет составлен из 1, 2, 3 или 4 или более контуров. Каждый контур может содержать 2, или 4, или 6, или 8 или более лунок. Одна или более лунок могут быть разработаны с целью специфического обеспечения расположения вставок, таких как вставки Transwell™, в лунках. При необходимости планшет может быть различных размеров, таким как стандартный 24- или 96-луночный планшет. Соответственно, стандартные планшеты содержат две или более или множество лунок, которые по сути являются круглыми по форме. A cell culture plate comprising at least two consecutive wells and a channel adapted for fluid communication between the wells, which is connected or communicates with the first pump through holes at each end of the channel, can form a circuit for circulating fluid between at least two holes. The fluid may be circulated between the wells through the channel and the pump. In certain embodiments, the tablet is made up of 1, 2, 3, or 4 or more loops. Each circuit may contain 2, or 4, or 6, or 8 or more wells. One or more wells can be designed to specifically position inserts, such as Transwell™ inserts, in the wells. If necessary, the plate can be of various sizes, such as a standard 24- or 96-well plate. Accordingly, standard plates contain two or more or multiple wells that are substantially circular in shape.

Эти 2, или 4, или 6, или 8 лунок на контур могут быть соединены между собой с помощью канала, такого как микроканал, проходящего вдоль их дна. На одной стороне каждого контура могут присутствовать два коннектора для обеспечения соединения каждого контура с перистальтическим насосом. Поскольку контуры заполнены средой и соединены с насосом, дизайн планшета обеспечивает достаточный уровень циркулирующей среды для осуществления контакта с вставкой в первой лунке и для покрытия сфероидов, присутствующих во второй лунке. These 2, or 4, or 6, or 8 wells per circuit can be interconnected by a channel, such as a microchannel, running along their bottom. Two connectors may be present on one side of each circuit to allow each circuit to be connected to a peristaltic pump. Because the circuits are filled with media and connected to a pump, the plate design provides sufficient circulating media to make contact with the insert in the first well and to cover the spheroids present in the second well.

Два контура также могут быть соединены вместе (путем соединения отводящего коннектора одного контура с загрузочным коннектором второго контура) с обеспечением соединения между собой вплоть до 4 тканей. Two circuits can also be connected together (by connecting the outflow connector of one circuit to the loading connector of the second circuit) to allow up to 4 tissues to be interconnected.

Также можно менять путь, по которому среда циркулирует в контурах: контуры могут быть в виде замкнутой петли, где среда циркулирует повторно, или открытой петли со средой, выполняющей один проход через каждую лунку. В последнем случае первая трубка может быть соединена с резервуаром, заполненным средой в первой концевой части и с загрузочным коннектором контура на второй стороне. Отводящий коннектор этого последнего контура затем будет соединяться с трубкой, проходящей через насос, и отводить среду в коллектор.It is also possible to change the way in which the medium circulates in the circuits: the circuits can be in the form of a closed loop, where the medium circulates repeatedly, or an open loop with the medium making one pass through each well. In the latter case, the first tube may be connected to a reservoir filled with medium at the first end and to a loop loading connector on the second side. The outlet connector of this last circuit will then be connected to the tube passing through the pump and will divert the medium to the manifold.

Планшет для культивирования клеток может быть открытым с тем, чтобы обеспечивать оптимальный газообмен между тканями в планшете и воздухом, присутствующим в инкубаторе. В определенных вариантах осуществления планшет для культивирования клеток оснащен крышкой или покрытием, которые обеспечивают циркуляцию воздуха, идентичную для таковой для стандартного планшета для культивирования клеток. The cell culture plate may be open to allow optimal gas exchange between the tissues in the plate and the air present in the incubator. In certain embodiments, the cell culture plate is provided with a lid or cover that provides identical air circulation to that of a standard cell culture plate.

Возвращаясь к фигурам, более подробно описаны конкретные неограничивающие варианты осуществления планшета для культивирования клеток. На фигуре 2 изображен один вариант осуществления планшета 20 для культивирования клеток, содержащего 24 лунки 17, расположенные в 6 рядов, содержащих 4 линейно расположенные лунки 17. Каждые 4 из рядов выполнены с возможностью обеспечения сообщения по текучей среде между каждой из 4 линейно расположенных лунок 17 посредством канала 23. Показаны канал 23a для передачи текучей среды и канал 23b для сообщения лунок. Канал может содержать впускное отверстие 26 для обеспечения сообщения по текучей среде с подачей в планшет 20 для культивирования клеток и выпускное отверстие 25 для обеспечения сообщения по текучей среде с выведением текучей среды из планшета 20 для культивирования клеток и обратно в насос 17. По меньшей мере каждая из двух лунок 17 будет содержать по меньшей мере одно отверстие для обеспечения соединения с ними канала 23b для сообщения лунок. Канал 23 может быть выполнен с возможностью образования петли 24 на одном его конце. Петля 24 может содержаться внутри планшета 20 для культивирования клеток или снаружи планшета 20 для культивирования клеток, как представлено в качестве примера на фигуре 3, на которой изображена расположенная снаружи петля 39. При расположении снаружи петля 24 будет соединена с планшетом 20 для культивирования клеток посредством коннекторов, которые соединяют петлю с планшетом 20 для культивирования клеток. Возвращаясь к фигуре 2, канал 23 соединен на одном конце с по меньшей мере одним насосом 29 посредством отверстий 25, 26 на каждом конце канала 23 для перекачивания текучей среды между лунками 17. Концы с отверстиями 25, 26 соединены с насосом 29 посредством коннекторов 28, которые можно видеть на фигуре 3. Если применяют два или более насосов 29, для удобства они могут быть выполнены в шахматной конфигурации на противоположных сторонах планшета 20 для культивирования клеток. Returning to the figures, specific non-limiting embodiments of the cell culture plate are described in more detail. Figure 2 depicts one embodiment of a cell culture plate 20 comprising 24 wells 17 arranged in 6 rows containing 4 linearly spaced wells 17. Each 4 of the rows is configured to provide fluid communication between each of the 4 linearly spaced wells 17 through channel 23. Channel 23a for transferring fluid and channel 23b for communicating wells are shown. The channel may include an inlet 26 to provide fluid communication to the cell culture plate 20 and an outlet 25 to provide fluid communication to withdraw fluid from the cell culture plate 20 and back to the pump 17. At least each of the two wells, 17 will contain at least one hole to allow connection of the well communication channel 23b therewith. The channel 23 may be configured to form a loop 24 at one end. The loop 24 may be contained within the cell culture plate 20 or outside the cell culture plate 20 as exemplified in Figure 3, which shows the loop 39 on the outside. that connect the loop to the cell culture plate 20. Returning to figure 2, the channel 23 is connected at one end to at least one pump 29 through holes 25, 26 at each end of the channel 23 for pumping fluid between the holes 17. The ends with holes 25, 26 are connected to the pump 29 through connectors 28, which can be seen in Figure 3. If two or more pumps 29 are used, for convenience they can be staggered on opposite sides of the cell culture plate 20.

На фигуре 3 изображен дополнительный вариант осуществления планшета 20 для культивирования клеток. На фигуре 3a изображено поперечное сечение A-A, проходящее через лунки 17, изображенные на фигуре 3c, на которой изображена конфигурация лунок 17 и вставок 10 в планшете. На фигуре 3b изображены поперечные сечения B-B и C-C, проходящие через каналы 23, содержащиеся в планшете 20 для культивирования клеток, показанные на фигуре 3d. На фигуре 3c изображено направление кругового потока текучей среды при нахождении в канале 23. Жидкость передается из насоса в канал 23b для сообщения лунок и в канал 23a для передачи текучей среды через петлю и обратно в насос (не показано). Водонепроницаемый кожух 34 может быть использован для вмещения планшета 20 для культивирования клеток. Водонепроницаемый кожух может содержать крышку 38. В иллюстративном варианте осуществления коннекторы 28 и петля 39 каналов 23 расположены снаружи водонепроницаемого кожуха. На фигуре 3d изображена линейная конфигурация канала 23a для передачи текучей среды. The figure 3 shows an additional embodiment of the tablet 20 for culturing cells. Figure 3a shows a cross-section A-A through the wells 17 shown in figure 3c, showing the configuration of the wells 17 and inserts 10 in the plate. Figure 3b shows cross sections B-B and C-C passing through channels 23 contained in the cell culture plate 20 shown in figure 3d. Figure 3c shows the direction of the circular flow of fluid while in channel 23. Fluid is transferred from the pump to the well communication channel 23b and to the fluid channel 23a through a loop and back to the pump (not shown). The waterproof case 34 may be used to contain the cell culture plate 20. The waterproof housing may include a cover 38. In an exemplary embodiment, the connectors 28 and loop 39 of channels 23 are located on the outside of the waterproof housing. The figure 3d shows the linear configuration of the channel 23a for the transfer of fluid.

На фигуре 4 представлено 3-мерное изображение планшета для культивирования клеток, представленного на фигуре 3.Figure 4 is a 3D view of the cell culture plate shown in Figure 3.

На фигуре 5 представлена фотография сконструированного планшета для культивирования клеток, представленного на фигуре 4. Figure 5 is a photograph of the engineered cell culture plate shown in Figure 4.

На фигуре 6 изображен дополнительный вариант осуществления планшета 40 для культивирования клеток. На фигуре 6(a) изображен планшет 40 для культивирования клеток, содержащий 48 лунок, выполненных в виде 8 рядов, содержащих 6 линейно расположенных лунок 47. Каждый из рядов выполнен с обеспечением сообщения по текучей среде между каждой из 6 линейно расположенных лунок 47 посредством канала 43. Канал, представленный на данной фигуре, представляет собой канал для передачи текучей среды. Канал может содержать впускное отверстие 45 для обеспечения сообщения по текучей среде с подачей в лунки 47 и выпускное отверстие 46 для обеспечения сообщения по текучей среде с выведением текучей среды из лунок 47. На фигуре 6(b) представлено поперечное сечение, проходящее через планшет, изображенный на фигуре 6(a). На фигуре 6(c) представлен схематический вид сверху планшета, изображенного на фигуре 6(a). Figure 6 an additional embodiment of cell culture plate 40 is shown. In figure 6(a) shows a cell culture plate 40 containing 48 wells arranged in 8 rows containing 6 linearly spaced wells 47. Each of the rows is configured to provide fluid communication between each of the 6 linearly spaced wells 47 via a channel 43. The channel shown in this figure, is a channel for the transfer of fluid. The channel may include an inlet 45 to provide fluid communication to the wells 47 and an outlet 46 to provide fluid communication to withdraw fluid from the wells 47. Figure 6(b) is a cross section through the plate shown in figure 6(a). Figure 6(c) is a schematic top view of the tablet shown in figure 6(a).

На фигуре 7 изображен дополнительный вариант осуществления планшета 50 для культивирования клеток, содержащий в общей сложности 8 лунок 57, выполненных в виде 4 рядов, содержащих 2 линейно расположенные лунки 57 в каждом ряду. Каждый ряд соединен с отдельным насосом 59, содержащим двигатель 54. Каждый насос может характеризоваться отличающимся параметром накачки. Показаны флюидные коннекторы 52. Двигатели насоса(насосов) могут находиться в герметизированной камере 56, которая может быть водонепроницаемой. Герметизированная камера 56 может содержать крышку. Планшет для культивирования клеток может быть расположен на подложке планшета 55. Каждым двигателем 54 можно управлять с помощью контроллера двигателя, функционированием которого можно управлять с помощью микроконтроллера. Функционированием микроконтроллера можно управлять с помощью беспроводного контроллера, такого как контроллер Bluetooth®, при этом для облегчения применения это можно выполнять с помощью беспроводного устройства, такого как планшет. Планшет для культивирования клеток и насос(насосы) можно вместе помещать в инкубатор 51. Figure 7 a further embodiment of a cell culture plate 50 is shown, containing a total of 8 wells 57 arranged in 4 rows containing 2 linearly spaced wells 57 in each row. Each row is connected to a separate pump 59 containing a motor 54. Each pump may have a different pumping parameter. Fluid connectors 52 are shown. The motors of the pump(s) may be contained in a sealed chamber 56, which may be waterproof. Sealed chamber 56 may include a lid. The cell culture plate may be positioned on the plate support 55. Each motor 54 may be controlled by a motor controller, the operation of which may be controlled by a microcontroller. The operation of the microcontroller can be controlled by a wireless controller, such as a Bluetooth® controller, and can be controlled by a wireless device, such as a tablet, for ease of use. The cell culture plate and the pump(s) can be placed together in the incubator 51.

В определенных вариантах осуществления скорость потока текучей среды через лунку составляет от приблизительно 1 до приблизительно 100 мкл/мин. In certain embodiments, the fluid flow rate through the well is from about 1 to about 100 µl/min.

В определенных вариантах осуществления скорость потока текучей среды через лунку составляет от приблизительно 1 до приблизительно 500 мкл/мин. In certain embodiments, the fluid flow rate through the well is from about 1 to about 500 µl/min.

В определенных вариантах осуществления скорость потока текучей среды через лунку составляет от приблизительно 10 до приблизительно 400 мкл/мин, или от приблизительно 10 до 250 мкл/мин, или от приблизительно 10 до 100 мкл/мин. In certain embodiments, the fluid flow rate through the well is from about 10 to about 400 µl/min, or from about 10 to 250 µl/min, or from about 10 to 100 µl/min.

В определенных вариантах осуществления скорость потока текучей среды через лунку составляет приблизительно 40 мкл/мин.In certain embodiments, the fluid flow rate through the well is approximately 40 μl/min.

При применении более одного насоса один или более из разных насосов могут характеризоваться разными скоростями потока. При применении более одного насоса каждый из разных насосов может характеризоваться отличающейся скоростью потока. Соответственно, скорости потока в каждом контуре могут быть одинаковыми или разными. When more than one pump is used, one or more of the different pumps may have different flow rates. When using more than one pump, each of the different pumps can have a different flow rate. Accordingly, the flow rates in each circuit may be the same or different.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, если текучая среда течет по границе твердого тела, она будет подвергаться напряжению сдвига на этой границе, что может привести к нарушению спокойного состояния клеток, подвергающихся воздействию напряжения сдвига. В контексте настоящего изобретения, если текучая среда перемещается через лунку, будет возникать напряжение сдвига. Требуется, чтобы напряжение сдвига в лунке составляло менее 0,1 дин/см², например, приблизительно 0,08 дин/см² или меньше, или 0,04 дин/см² или меньше, поскольку оно не вызывает нарушения спокойного состояния клеток, подвергающихся воздействию напряжения сдвига. Напряжение сдвига может быть разным в разных лунках. Например, лунка с неоднородной поверхностью может характеризоваться напряжением сдвига, составляющим приблизительно 0,04 дин/см². Например, лунка с плоской и не являющейся неоднородной поверхностью может характеризоваться напряжением сдвига, составляющим приблизительно 0,08 дин/см². Соответственно, напряжение сдвига в лунке с неоднородной поверхностью является более низким, чем в лунке с плоской и не являющейся неоднородной поверхностью. As will be appreciated by one of skill in the art, if a fluid flows along a solid boundary, it will be subjected to shear stress at that boundary, which may result in disruption of the quiescent state of cells subjected to shear stress. In the context of the present invention, if fluid moves through the well, shear stress will occur. The shear stress in the well is required to be less than 0.1 dyne/cm ² , for example about 0.08 dyne/cm ² or less, or 0.04 dyne/cm ² or less, since it does not disturb the quiescent state of the cells, subjected to shear stress. The shear stress can be different in different wells. For example, a well with a non-uniform surface may have a shear stress of approximately 0.04 dyne/cm ² . For example, a well with a flat and non-uniform surface may have a shear stress of approximately 0.08 dynes/cm ² . Accordingly, the shear stress in a hole with a non-uniform surface is lower than in a hole with a flat and non-uniform surface.

Поскольку для скрининга можно применять оптический анализ, дно лунки может быть сделано из материала, характеризующегося общим светопропусканием, составляющим 70%, или 80%, или 90% или больше. Since optical analysis can be used for screening, the bottom of the well can be made from a material having a total light transmission of 70% or 80% or 90% or more.

Глубина множества лунок не должна быть одинаковой по всему планшету для культивирования клеток, и предполагается, что лунки могут иметь разную глубину. Канал, соединяющий по меньшей мере две лунки, может располагаться на такой же высоте, что и канал, расположенный на разных расстояниях от основания по меньшей мере двух лунок. Данная конфигурация обеспечивает то, что поток текучей среды, поступающий в лунку, не нарушает спокойного состояния сфероидов или не тревожит их, при этом обеспечивает то, чтобы текучая среда могла все еще проходить через проницаемую мембрану вставки. В одном варианте осуществления лунка(лунки) для культивирования сфероидов имеет(имеют) самую большую глубину. В одном варианте осуществления лунка(лунки) для культивирования сфероидов имеет(имеют) глубину, которая больше, чем у лунки(лунок) для культивирования клеток, отличных от сфероидов. В одном варианте осуществления лунка(лунки) для культивирования сфероидов имеет(имеют) глубину, которая больше, чем у лунки(лунок), содержащей(содержащих) вставку. The depth of the plurality of wells need not be the same throughout the cell culture plate, and it is contemplated that the wells may have different depths. The channel connecting the at least two wells may be located at the same height as the channel located at different distances from the base of the at least two wells. This configuration ensures that the flow of fluid entering the well does not disturb or disturb the spheroids while ensuring that the fluid can still pass through the permeable membrane of the insert. In one embodiment, the spheroid culture well(s) has(have) the deepest depth. In one embodiment, the spheroid culture well(s) has(have) a depth that is greater than that of the non-spheroid cell culture well(s). In one embodiment, the spheroid culture well(s) has(have) a depth that is greater than that of the well(s) containing the insert.

При необходимости планшет для культивирования клеток можно применять вместе с планшетом 261 с резервуарами, представленным на фигуре 23. Планшет с резервуарами содержит один или более резервуаров 269 для текучей среды. Резервуар(резервуары) 269 для текучей среды может(могут) быть выполнен(выполнены) с возможностью содержать текучую среду. На данной фигуре изображен один вариант осуществления планшета 20 для культивирования клеток, содержащего 8 лунок 17, выполненных в виде 4 рядов, содержащих 2 линейно расположенные лунки 17, хотя будет понятно, что можно легко применять другие конфигурации лунок. В отличие от каналов 23, образующих петлю на планшете для культивирования клеток или смежно с ним, каналы проходят в одном или более резервуарах 269 для текучей среды планшета 261 с резервуарами. Каналы образуют петлю на планшете 261 с резервуарами или смежно с ним. Текучая среда передается из одного или более резервуаров 269 для текучей среды в планшет для культивирования клеток и циркулирует. Планшет 261 с резервуарами можно применять для обеспечения увеличения объема текучей среды. Обычно объем текучей среды, применяемой в данной конфигурации, будет составлять от приблизительно 8 мл до приблизительно 12 мл. If desired, the cell culture plate may be used in conjunction with the reservoir plate 261 shown in Figure 23. The reservoir plate contains one or more fluid reservoirs 269. The fluid reservoir(s) 269 may be configured to contain a fluid. This figure depicts one embodiment of a cell culture plate 20 containing 8 wells 17 arranged in 4 rows containing 2 linearly spaced wells 17, although it will be understood that other well configurations can easily be used. Unlike the channels 23 that form a loop on or adjacent to the cell culture plate, the channels run in one or more fluid reservoirs 269 of the reservoir plate 261. The channels form a loop on or adjacent to the reservoir plate 261. Fluid is transferred from one or more fluid reservoirs 269 to the cell culture plate and circulated. Tablet 261 with reservoirs can be used to provide an increase in the volume of the fluid. Typically, the volume of fluid used in this configuration will be from about 8 ml to about 12 ml.

Планшет для образцовSample plate

Планшет для образцов для применения в настоящем изобретении может быть изготовлен в различных форматах, таких как 24, 48 или 96-луночные форматы, и может быть легко выбран специалистом в данной области техники на основе размера и выбора эксперимента, который предполагается выполнять. The sample plate for use in the present invention can be made in various formats such as 24, 48 or 96 well formats and can be easily selected by one of skill in the art based on the size and choice of experiment to be performed.

Планшет для образцов также выполнен с возможностью содержания по меньшей мере двух последовательно расположенных лунок. Планшет для образцов может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере двух линейно расположенных лунок. The sample plate is also configured to contain at least two consecutive wells. The sample plate may be configured to contain at least two linearly spaced wells.

Обычно лунки в планшете для образцов будут расположены по рядам и столбцам. Например, 8-луночный планшет может быть выполнен в виде 4 линейных рядов из 2 смежных лунок в каждом ряду. В данной конфигурации отдельные насосы можно применять для каждого ряда. Каждый насос может характеризоваться отличающимся параметром накачки. Typically, wells in a sample plate will be arranged in rows and columns. For example, an 8-well plate can be made in 4 linear rows of 2 adjacent wells in each row. In this configuration, separate pumps can be used for each row. Each pump may have a different pumping parameter.

В качестве дополнительного примера, 24-луночный планшет может быть выполнен в виде 6 линейных рядов из 4 смежных лунок в каждом ряду. As an additional example, a 24-well plate can be made in 6 linear rows of 4 adjacent wells in each row.

В качестве дополнительного примера, 48-луночный планшет может быть выполнен в виде 8 линейных рядов из 6 смежных лунок в каждом ряду. В данной конфигурации можно применять один насос для всех рядов таким образом, что такой же параметр накачки применяется во всех рядах. В другой конфигурации применяют 3 насоса. Такой же параметр накачки можно применять во всех рядах. As an additional example, a 48-well plate can be made in 8 linear rows of 6 adjacent wells in each row. In this configuration it is possible to apply one pump to all rows so that the same pump setting is applied to all rows. In another configuration, 3 pumps are used. The same pump setting can be applied to all rows.

В качестве дополнительного примера, 96-луночный планшет может быть выполнен в виде 12 линейных рядов из 8 смежных лунок в каждом ряду. Планшеты для образцов при необходимости можно даже изготовить или выполнить индивидуально для обеспечения необходимого количества лунок в планшете для образцов. As an additional example, a 96-well plate can be made in 12 linear rows of 8 adjacent wells in each row. The sample plates can even be made or customized to provide the required number of wells in the sample plate if required.

При условии, что планшет для образцов содержит по меньшей мере две последовательно расположенные лунки, его можно применять в соответствии с настоящим изобретением, несмотря на то, что применение планшетов большего размера является предпочтительным, поскольку можно проводить больше экспериментов. Необязательно использовать каждую лунку в планшете для образцов. При условии, что по меньшей мере две последовательно расположенные лунки используются в планшете для образцов, этого будет достаточно для выполнения эксперимента в соответствии с настоящим изобретением. Provided that the sample plate contains at least two consecutive wells, it can be used in accordance with the present invention, although the use of larger plates is preferred because more experiments can be performed. It is not necessary to use every well in a sample plate. Provided that at least two consecutive wells are used in the sample plate, this will be sufficient to perform the experiment in accordance with the present invention.

Планшет для образцов может быть оснащен крышкой сверху планшета, которая способствует снижению риска контаминации.The sample plate can be fitted with a lid on top of the plate to help reduce the risk of contamination.

Планшет для образцов может быть изготовлен из политетрафторэтилена (PTFE), нержавеющей стали (например, 316L/1.4435), полиэфирэфиркетона (PEEK), полипропилена, полисульфона, или РТЕЕ, или комбинации двух или более из них, необязательно с покрытием из парилена. The sample plate can be made of polytetrafluoroethylene (PTFE), stainless steel (e.g. 316L/1.4435), polyether ether ketone (PEEK), polypropylene, polysulfone, or PTEE, or a combination of two or more of these, optionally coated with parylene.

При необходимости планшеты для образцов могут быть разработаны с помощью компьютерного дизайна (CAD) или они являются коммерчески доступными. Планшеты CAD могут быть изготовлены с помощью микромеханической обработки с применением способов, которые хорошо известны из уровня техники. If necessary, sample plates can be designed using computer-aided design (CAD) or they are commercially available. CAD plates can be manufactured by micromachining using methods that are well known in the art.

В одном варианте осуществления планшет для образцов представляет собой микрофлюидный планшет для культивирования клеток, который широкодоступен из уровня техники. Например, микрофлюидный планшет для культивирования клеток M04S доступен от Cellasic, Калифорния, США, и содержит 4 независимые лунки, при этом диаметр каждой лунки составляет приблизительно 2,8 мм при высоте приблизительно 120 микрон. In one embodiment, the sample plate is a microfluidic cell culture plate, which is widely available in the art. For example, the M04S microfluidic cell culture plate is available from Cellasic, CA, USA, and contains 4 independent wells, each well having a diameter of approximately 2.8 mm and a height of approximately 120 microns.

В отличие от планшета для культивирования клеток, планшет для образцов обычно будет лишен канала в планшете для образцов, поскольку текучая среда может сообщаться с лунками планшета для образцов с помощью микродозатора, такого как автоматический микродозатор. Кроме того, боковые стенки и основание лунок планшета для образцов будут обычно запаяны, поскольку сообщение по жидкой среде с каналом не требуется. Unlike a cell culture plate, a sample plate will typically lack a channel in the sample plate because fluid can be communicated with the wells of the sample plate using a microsipiser, such as an automatic microsampler. In addition, the sidewalls and base of the wells of the sample plate will typically be sealed since fluid communication with the channel is not required.

Планшет для культивирования клеток и планшет для образцов могут иметь одинаковое количество рядов лунок или планшет для образцов может иметь большее количество рядов лунок, как обсуждается ниже. The cell culture plate and sample plate may have the same number of rows of wells, or the sample plate may have more rows of wells, as discussed below.

НасосPump

В одном варианте осуществления насос(насосы) для применения в настоящем изобретении представляет(представляют) собой поршневой(поршневые) насосы прямого вытеснения, который(которые) пригоден(пригодны) для обеспечения циркуляции текучей среды, такие как перистальтический насос. Как понимается в данной области техники, перистальтический насос представляет собой насос, применяемый для обеспечения движения текучей среды. Текучая среда содержится в канале, описанном в данном документе, при этом канал может представлять собой гибкую трубку, которая помещена внутрь корпуса насоса. В качестве альтернативы, если канал непосредственно вырезан (например, встроен) в планшете, то адаптор может быть использован для соединения вырезанного или встроенного канала с насосом. Ротор, прикрепленный к его внешней окружности, сжимает гибкую трубку или канал. По мере того, как ротор поворачивается, часть трубки или канала при сжатии сдавливается с проталкиванием текучей среды через трубку или канал. In one embodiment, the pump(s) for use in the present invention is(are) positive displacement piston pump(s) that is(are) suitable for circulating a fluid, such as a peristaltic pump. As understood in the art, a peristaltic pump is a pump used to move a fluid. The fluid is contained in the channel described herein, the channel may be a flexible tube that is placed inside the pump housing. Alternatively, if the conduit is directly cut (eg embedded) in the tablet, then an adapter can be used to connect the cut or embedded conduit to the pump. A rotor attached to its outer circumference compresses a flexible tube or conduit. As the rotor turns, a portion of the tube or passage is compressed under compression to force fluid through the tube or passage.

Первый (циркулирующий) насос может быть использован для управления потоком текучей среды в планшете для культивирования клеток. Второй (для образцов) насос может быть использован для продвижения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов. The first (circulating) pump can be used to control the flow of fluid in the cell culture plate. A second (sample) pump may be used to move fluid from the cell culture plate into the sample plate.

В одном варианте осуществления скорость потока, обеспечиваемая первым насосом, составляет от приблизительно 10 мкл в минуту до приблизительно 1000 мкл в минуту.In one embodiment, the flow rate provided by the first pump is from about 10 µl per minute to about 1000 µl per minute.

В одном варианте осуществления скорость потока, обеспечиваемая вторым насосом, составляет от приблизительно 10 мкл в минуту до 2000 мкл в минуту. Скорость потока, обеспечиваемая вторым насосом, может быть выше скорости потока, обеспечиваемой первым насосом. Это может облегчать смешивание перед отбором образцов. Иллюстративные более высокие скорости потока, обеспечиваемые вторым насосом, составляют от 550 мкл в минуту до 2000 мкл в минуту. In one embodiment, the flow rate provided by the second pump is from about 10 µl per minute to 2000 µl per minute. The flow rate provided by the second pump may be higher than the flow rate provided by the first pump. This may facilitate mixing prior to sampling. Exemplary higher flow rates provided by the second pump are from 550 µl per minute to 2000 µl per minute.

В одном варианте осуществления насос(насосы) содержит(содержат) шаговый двигатель или бесщеточный двигатель, содержащие энкодер. In one embodiment, the pump(s) comprises(comprises) a stepper motor or a brushless motor containing an encoder.

Каждым двигателем можно управлять с помощью контроллера двигателя, функционированием и датчиками которого можно управлять с помощью микроконтроллера. Функционированием микроконтроллера можно управлять с помощью беспроводного контроллера, такого как контроллер Bluetooth®, при этом для облегчения применения это можно выполнять с помощью беспроводного устройства, такого как планшет. В дополнительном варианте осуществления первый насос расположен либо внутри, либо снаружи планшета для культивирования клеток. Соответственно, расположенный снаружи первый насос расположен смежно с последовательно расположенными лунками планшета для культивирования клеток. При применении нескольких первых насосов вместе с одним планшетом для культивирования клеток, все первые насосы могут располагаться на одной и той же стороне планшета для культивирования клеток, как представлено в качестве примера на фигуре 5. В качестве альтернативы, в связи с пространственными ограничениями первые насосы могут быть расположены на противоположных сторонах планшета для культивирования клеток, соответственно, в шахматном порядке, как представлено в качестве примера на фигуре 2. Each motor can be controlled by a motor controller whose operation and sensors can be controlled by a microcontroller. The operation of the microcontroller can be controlled by a wireless controller, such as a Bluetooth® controller, and for ease of use, this can be done by a wireless device, such as a tablet. In a further embodiment, the first pump is located either inside or outside the cell culture plate. Accordingly, an externally located first pump is located adjacent to the successive wells of the cell culture plate. When multiple first pumps are used with a single cell culture plate, all first pumps may be located on the same side of the cell culture plate, as exemplified in Figure 5. Alternatively, due to space constraints, the first pumps may be located on opposite sides of the cell culture plate, respectively, in a checkerboard pattern, as exemplified in Figure 2.

Второй насос обычно будет расположен снаружи планшета для образцов. Соответственно, расположенный снаружи второй насос расположен смежно с планшетом для культивирования клеток таким образом, что он может обеспечивать выведение текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов. Соответственно, второй насос расположен на противоположной стороне планшета для культивирования клеток относительно первого насоса. The second pump will usually be located on the outside of the sample plate. Accordingly, an externally located second pump is positioned adjacent to the cell culture plate, such that that it can transfer fluid from the cell culture plate to the sample plate. Accordingly, the second pump is located on the opposite side of the cell culture plate from the first pump.

Пример коммерчески доступного второго насоса для применения в настоящем изобретении представляет собой перистальтический насос WPM (Welco Co, Ltd, Япония) или перистальтический насос Boxer 6KP Series (Boxer GmbH, Германия).An example of a commercially available second pump for use in the present invention is a WPM peristaltic pump (Welco Co, Ltd, Japan) or a Boxer 6KP Series peristaltic pump (Boxer GmbH, Germany).

В определенных вариантах осуществления можно применять три или более насосов. По меньшей мере один насос можно применять для отбора образцов, по меньшей мере один насос можно применять для повторного заполнения текучей средой и по меньшей мере один насос можно применять для обеспечения циркуляции текучей среды через планшет (см., например, фигуру 10). In certain embodiments, three or more pumps may be used. At least one pump may be used to sample, at least one pump may be used to refill fluid, and at least one pump may be used to circulate fluid through the plate (see, for example, Figure 10).

По меньшей мере один насос может содержаться в кожухе, таком как герметизированная камера. Герметизированная камера может быть водонепроницаемой. Если применяют более одного насоса, то при необходимости насосы могут содержаться в одном и том же кожухе или в отдельных кожухах. At least one pump may be contained in a housing, such as a sealed chamber. The sealed chamber may be waterproof. If more than one pump is used, the pumps may be contained in the same housing or in separate housings, if necessary.

По меньшей мере один насос может содержаться в инкубаторе. At least one pump may be contained in the incubator.

Если по меньшей мере один насос содержится в кожухе, то насос в кожухе может дополнительно содержаться в инкубаторе. Данный вариант осуществления представлен в качестве примера на фигуре 7, на которой каждый из двигателей 56 содержится в герметизированной камере 56 и помещен в инкубатор 51. If at least one pump is contained in a casing, then the casing pump may additionally be contained in an incubator. This embodiment is shown as an example in Figure 7, in which each of the motors 56 is contained in a sealed chamber 56 and placed in an incubator 51.

Культивирование клетокCell culture

Культивирование клеток в целом относится к удалению клеток из ткани перед ростом в искусственной среде. Клетки, подлежащие культивированию, можно удалять непосредственно из ткани, содержащей клетки, подлежащие культивированию, и необязательно обрабатывать с помощью ферментных или механических средств перед культивированием. В качестве альтернативы, клетки, подлежащие культивированию, можно получать из ранее установившихся штамма или линии клеток. Планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе, может обеспечивать систему или устройство для отбора образцов текучей среды, такой как среда для культивирования клеток, из лунок. Планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе, может обеспечивать систему или устройство для изучения различных аспектов клетки, в том числе физиологии; биохимии; влияний средств, в том числе аэрозолей; скрининга и разработки или оптимизации средств; изучения эффективности средств; изучения поглощения средств; скрининговых исследований токсичности; токсикологии; выявления мишеней; фармакокинетики; фармакодинамики и регенеративной медицины, необязательно в реальном времени. Cell culture generally refers to the removal of cells from tissue prior to growth in an artificial environment. The cells to be cultured can be removed directly from the tissue containing the cells to be cultured and optionally treated with enzymatic or mechanical means prior to culture. Alternatively, the cells to be cultured can be obtained from a previously established strain or cell line. The cell culture plate described herein may provide a system or device for sampling a fluid, such as cell culture medium, from wells. The cell culture plate described herein may provide a system or device for studying various aspects of a cell, including physiology; biochemistry; influences of means, including aerosols; screening and development or optimization of tools; studying the effectiveness of funds; studying absorption of funds; screening studies of toxicity; toxicology; target detection; pharmacokinetics; pharmacodynamics and regenerative medicine, optionally in real time.

Планшет для культивирования клеток может быть использован в биологических анализах критических точек, таких как клеточные анализы, которые указывают на общее состояние здоровья клеток (например, анализ жизнеспособности 3D клеток CellTiter-Glo® и анализ ApoTox-Glo®Triplex). Он может быть использован для изучения морфологии и фенотипа клеток (например, гистологии и иммуногистохимии). Он может быть использован для изучения метаболической способности (например, анализы P450-Glo®). Он может быть использован для изучения функции клеток (например, анализ ROS-Glo® H₂0₂или анализ GSH/GSSG-Glo®). The cell culture plate can be used in critical point biological assays, such as cellular assays that indicate overall cell health (eg, CellTiter-Glo® 3D cell viability assay and ApoTox-Glo®Triplex assay). It can be used to study cell morphology and phenotype (eg histology and immunohistochemistry). It can be used to study metabolic capacity (eg P450-Glo® assays). It can be used to study cell function (eg ROS-Glo® H ₂ 0 ₂ assay or GSH/GSSG-Glo® assay).

Планшет для культивирования клеток может быть использован для изучения, например, токсикологии в целом, для изучения токсикологии средств, для изучения токсикологии метаболизируемых средств и для изучения влияния средств на одну или более клеток.The cell culture plate can be used to study, for example, toxicology in general, to study the toxicology of agents, to study the toxicology of metabolizable agents, and to study the effect of agents on one or more cells.

Вставки и лункиInserts and wells

Определенные клетки для применения в настоящем изобретении можно культивировать во вставках, которые располагаются в лунках планшета для культивирования клеток. Определенные клетки можно выращивать на проницаемой мембране, содержащейся во вставке. Как правило, клетки будут расти на верхней части проницаемой мембраны. Вставку помещают в лунку планшета для культивирования клеток. Если лунку планшета для культивирования клеток заполняют текучей средой, такой как среда для культивирования клеток, то текучая среда будет проходить через проницаемую мембрану и контактировать с клетками таким образом, что их можно культивировать во вставке. Текучая среда может касаться только нижней части вставки. Разные типы клеток можно культивировать во вставке, как описано в данном документе. Пример типа клеток, который культивируют с применением вставки, представляет собой клетку легкого. Certain cells for use in the present invention can be cultured in inserts that are placed in the wells of a cell culture plate. Certain cells can be grown on the permeable membrane contained in the insert. Typically, cells will grow on top of a permeable membrane. The insert is placed in the well of the cell culture plate. If a well of a cell culture plate is filled with a fluid medium, such as a cell culture medium, the fluid will pass through the permeable membrane and contact the cells so that they can be cultured in the insert. The fluid may only touch the bottom of the insert. Different cell types can be cultured in the insert as described herein. An example of a cell type that is cultured using the insert is a lung cell.

Другие типы клеток для применения в настоящем изобретении можно культивировать без применения вставки, а вместо этого можно культивировать в лунках планшета для культивирования клеток, содержащего поверхностное покрытие. Например, сфероиды можно выращивать с применением микропланшетов для сфероидов Corning®, которые имеют поверхностное покрытие для прикрепления, которое является гидрофильным, биологически инертным и неразлагающимся, и ковалентно связано с внутренней поверхностью дна лунки. Дизайн дна лунки обеспечивает высоковоспроизводимый рост 3D-сфероидов клеточных культур. Пример типа клеток, который культивируют без применения вставки, представляет собой клетку печени.Other cell types for use in the present invention may be cultured without the use of an insert, and may instead be cultured in the wells of a cell culture plate containing a surface coating. For example, spheroids can be grown using Corning® spheroid microplates that have an attachment surface coating that is hydrophilic, biologically inert, and non-degradable and is covalently bonded to the inner bottom surface of the well. The well bottom design ensures highly reproducible growth of 3D cell culture spheroids. An example of a cell type that is cultured without the use of an insert is a liver cell.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере две лунки имеют различную глубину. Например, если применяют клетку легкого и клетку печени, то лунка, содержащая клетку печени, будет более глубокой, поскольку необходимо, чтобы текучая среда покрывала сфероиды из клеток легкого, в то время как в лунке, содержащей клетки легкого, необходимо, чтобы текучая среда достигала только нижней части вставки. In certain embodiments, at least two of the wells have different depths. For example, if a lung cell and a liver cell are used, the well containing the liver cell will be deeper because the fluid needs to cover the lung cell spheroids, while the well containing the lung cells needs the fluid to reach only the bottom of the insert.

В определенных вариантах осуществления уровень текучей среды в по меньшей мере двух лунках характеризуется разной глубиной. In certain embodiments, the fluid level in the at least two wells is at different depths.

На фигуре 1 изображен вариант осуществления, в котором вставка 10 содержит проницаемую мембрану 12 у основания вставки 10. Ткань/клетки 14 могут содержаться во вставке 10 у ее основания. Вставка может содержать необязательную крышку 19 на верхней части вставки 10 с целью снижения риска контаминации. Вставка 10 может содержаться в лунке 17. Лунка 17 может содержать текучую среду. Несколько лунок 17 могут быть соединены вместе с помощью канала, такого как микрофлюидный канал, описанный в данном документе. The figure 1 shows an embodiment in which the insert 10 contains a permeable membrane 12 at the base of the insert 10. Tissue/cells 14 may be contained in the insert 10 at its base. The insert may include an optional cap 19 on top of the insert 10 to reduce the risk of contamination. Insert 10 may be contained in well 17. Well 17 may contain fluid. Several wells 17 may be connected together using a conduit such as the microfluidic conduit described herein.

Преимущественно вставки являются коммерчески доступными, что способствует упрощению разработки и конструирования планшета для культивирования клеток. В качестве примера можно использовать проницаемые вставки для культивирования клеток ThinCert^TM (USA Scientific, Флорида, США). Они доступны с различными размерами и видами конечного покрытия и могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники для применения в настоящем изобретении. Каждая вставка может иметь самоустанавливающиеся крепления, которые обеспечивают устранение капиллярных эффектов и максимальный доступ микродозатора в лунку путем расположения вставки слегка эксцентрично. Вставки для культивирования клеток ThinCert^TM являются совместимыми со стандартными многолуночными планшетами. В качестве дополнительного примера могут быть использованы проницаемые подложки Corning® HTS Transwell® (Sigma Aldrich, Дорсет, Великобритания). Проницаемые подложки Corning® HTS Transwell® имеют схему размещения из 24 или 96 лунок с проницаемыми вставками, соединенными с помощью жесткой пластинки.Advantageously, the inserts are commercially available to facilitate the development and construction of the cell culture plate. As an example, ThinCert ^™ cell culture permeable inserts (USA Scientific, Florida, USA) can be used. They are available in a variety of sizes and finishes and can be easily selected by one of skill in the art for use in the present invention. Each insert can have self-aligning fasteners that eliminate capillary effects and maximize the access of the microsipulator into the well by positioning the insert slightly eccentric. ThinCert ^™ cell culture inserts are compatible with standard multiwell plates. As a further example, Corning® HTS Transwell® permeable substrates (Sigma Aldrich, Dorset, UK) can be used. Corning® HTS Transwell® Permeable Pads are available in a 24 or 96 well pattern with permeable inserts connected by a rigid plate.

Неоднородная поверхностьNon-homogeneous surface

Авторами настоящего изобретения было замечено, что сфероиды могут иметь склонность к агломерации друг с другом в одном и том же месте во время 3-мерного культивирования клеток с образованием одного большого участка ткани. Не ограничиваясь теорией, авторами настоящего изобретения было замечено, что клетки в середине сфероида имеют меньше доступа к питательным веществам по сравнению с клетками, расположенными вблизи наружной части сфероида, так что клетки, расположенные вблизи середины сфероида, имеют склонность к гибели. Если сфероиды агломерируют (что может происходить спустя 5 часов культивирования клеток), то это становится проблематичным, поскольку большее количество клеток в сфероиде будет иметь меньше доступа к питательным веществам. Это также дополнительно увеличивает количество погибших клеток в сфероиде. Это может быть проблематичным по ряду причин, включая (1) молекулы, высвобождаемые из погибших клеток, могут оказывать отрицательное влияние на другие клетки в сфероиде; (2) погибшие клетки не являются метаболически активными, поэтому метаболическая активность сфероида будет снижена; и (3) многие анализы требуют применения одного сфероида. Авторы настоящего изобретения попытались решить проблему агломерации сфероидов в 3-мерных культурах клеток. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эта проблема могла быть легко решена с помощью образования неоднородной поверхности на основании лунки, такой как лунка многолуночного планшета, поскольку на неоднородной поверхности сфероиды становятся удерживаемыми на неоднородной поверхности. Это обеспечивает эффективное снижение степени агломерации сфероидов или предотвращает ее. Преимущественно авторы настоящего изобретения обнаружили, что сфероиды можно поддерживать в виде индивидуализированных одиночных сфероидов. It has been observed by the present inventors that spheroids may tend to agglomerate with each other at the same location during 3D cell culture to form one large area of tissue. Without being limited by theory, it has been observed by the present inventors that cells in the middle of the spheroid have less access to nutrients compared to cells located near the outside of the spheroid, so that cells located near the middle of the spheroid are prone to death. If the spheroids agglomerate (which can happen after 5 hours of cell culture), then this becomes problematic because more cells in the spheroid will have less access to nutrients. This also further increases the number of dead cells in the spheroid. This can be problematic for a number of reasons, including (1) molecules released from dead cells can have a negative effect on other cells in the spheroid; (2) dead cells are not metabolically active, so the metabolic activity of the spheroid will be reduced; and (3) many analyzes require a single spheroid. The present inventors have attempted to solve the problem of spheroid agglomeration in 3D cell cultures. The inventors of the present invention surprisingly found that this problem could be easily solved by forming a non-uniform surface at the base of the well, such as the well of a multi-well plate, since on the non-uniform surface the spheroids become retained on the non-uniform surface. This provides an effective reduction in the degree of spheroid agglomeration or prevents it. Advantageously, the present inventors have found that spheroids can be maintained as individualized single spheroids.

В определенных вариантах осуществления основание одой или более лунок, такое как основание одной или более лунок многолуночного планшета, может содержать неоднородную поверхность, приспособленную для обеспечения снижения степени или предотвращения агломерации сфероидов. Следует понимать, что не каждая лунка должна содержать неоднородную поверхность, поскольку не все лунки могут быть использованы для культивирования сфероидов. Например, некоторые лунки могут быть использованы для культивирования других типов клеток, которые не требуют применения неоднородной поверхности. Например, некоторые лунки могут быть использованы для культивирования других типов клеток, которые требуют применения вставки для создания поверхности раздела жидкость-воздух. In certain embodiments, the base of one or more wells, such as the base of one or more wells of a multiwell plate, may comprise a non-uniform surface adapted to reduce or prevent spheroid agglomeration. It should be understood that not every well needs to contain a non-uniform surface since not all wells can be used for culturing spheroids. For example, some wells can be used to culture other cell types that do not require the use of a heterogeneous surface. For example, some wells can be used to culture other types of cells that require the use of an insert to create a liquid-air interface.

Соответственно, неоднородная поверхность удерживает сфероиды с обеспечением снижения степени или предотвращения их агломерации. Соответственно, неоднородная поверхность удерживает одиночные сфероиды с обеспечением снижения степени или предотвращения их агломерации. Accordingly, the non-uniform surface holds the spheroids in a manner that reduces or prevents their agglomeration. Accordingly, the non-uniform surface holds the single spheroids in a manner that reduces or prevents their agglomeration.

В определенных вариантах осуществления неоднородная поверхность образована одной или более канавками. Канавки могут выполнять функцию удерживания сфероидов с обеспечением снижения степени или предотвращения их агломерации. Размер канавки(канавок) будет, как правило, соответствовать максимальному диаметру сфероида ±10%, так что сфероиды могут удерживаться или содержаться в канавке(канавках). Соответственно, канавка(канавки) будет(будут) покрывать большую часть основания лунки, поскольку наличие плоской поверхности на основании лунки может приводить к агломерации сфероидов, что может приводить к образованию больших клеточных агрегатов, которое является нежелательным. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% основания лунки будет содержать неоднородную поверхность, такую как канавка(канавки). In certain embodiments, the heterogeneous surface is formed by one or more grooves. The grooves may serve the function of retaining the spheroids to reduce or prevent their agglomeration. The size of the groove(s) will typically correspond to a maximum spheroid diameter of ±10% so that spheroids can be held or contained in the groove(s). Accordingly, the groove(s) will cover most of the base of the well since having a flat surface at the base of the well can result in agglomeration of the spheroids, which can lead to the formation of large cell aggregates, which is undesirable. In certain embodiments, at least 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, or 100% of the base of the well will contain a non-uniform surface, such as a groove(s).

Соответственно, глубина и ширина неоднородной поверхности, такой как множество канавок в основании лунки, составляет от приблизительно 200 мкм до приблизительно 1000 мкм, соответственно, от приблизительно 600 мкм до приблизительно 1000 мкм. Фактическая глубина и ширина будет определяться размером сфероидов, которые предполагается использовать в лунке и удерживать. Таким образом, например, некоторые сфероиды имеют максимальный диаметр, составляющий приблизительно 600 мкм, и в таком случае глубина и ширина неоднородной поверхности, такой как множество канавок, будет составлять приблизительно 600 мкм ±10%. В некоторых вариантах осуществления требуется, чтобы глубина и ширина неоднородной поверхности, такой как множество канавок, были больше максимального диаметра сфероида, например, на 20%, 30%, 40%, 50% или 60% или больше максимального диаметра сфероида. В одном варианте осуществления сфероид имеет максимальный диаметр, составляющий 600 мкм, а неоднородная поверхность, такая как множество канавок, имеет высоту, составляющую приблизительно 1 мм, и ширину, составляющую приблизительно 1 мм, или ширину, составляющую приблизительно 2 мм. Accordingly, the depth and width of an inhomogeneous surface, such as a plurality of grooves at the base of a well, is from about 200 µm to about 1000 µm, respectively, from about 600 µm to about 1000 µm. The actual depth and width will be determined by the size of the spheroids that are intended to be used in the well and held. Thus, for example, some spheroids have a maximum diameter of approximately 600 µm, in which case the depth and width of an inhomogeneous surface such as a plurality of grooves would be approximately 600 µm±10%. In some embodiments, the depth and width of a non-uniform surface, such as a plurality of grooves, is required to be greater than the maximum spheroid diameter, such as 20%, 30%, 40%, 50%, or 60% or greater than the maximum spheroid diameter. In one embodiment, the spheroid has a maximum diameter of 600 µm and a non-uniform surface, such as a plurality of grooves, has a height of approximately 1 mm and a width of approximately 1 mm, or a width of approximately 2 mm.

Как правило, форма канавок может характеризоваться плоским дном, быть U-образной, V-образной или V-образной с плоским дном и т. п. В одном варианте осуществления канавки имеют V-образную форму с плоским дном. В одном варианте осуществления максимальная ширина отверстия канавки составляет приблизительно 2,4 мм, глубина канавки составляет приблизительно 1 мм и ширина плоского дна в основании канавки составляет приблизительно 400 мкм. Угол между противоположными сторонами канавки в соответствии с данным вариантом осуществления составляет приблизительно 90 градусов. Typically, the shape of the grooves may be flat bottomed, U-shaped, V-shaped, or V-shaped with a flat bottom, and the like. In one embodiment, the grooves are V-shaped with a flat bottom. In one embodiment, the maximum opening width of the groove is about 2.4 mm, the depth of the groove is about 1 mm, and the width of the flat bottom at the base of the groove is about 400 µm. The angle between opposite sides of the groove according to this embodiment is approximately 90 degrees.

Возвращаясь к фигуре 11, на ней показан планшет 110 для культивирования клеток, содержащий лунку 112 с множеством канавок 116 на его основании, содержащем V-образные канавки, каждая из которых имеет плоское дно. Максимальная ширина отверстия в канавках составляет приблизительно 2,4 мм, глубина канавок составляет приблизительно 1 мм и ширина плоского дна в основании канавок составляет приблизительно 400 мкм. Угол между противоположными сторонами канавок составляет приблизительно 90 градусов. Несмотря на то, что множество канавок показаны таким образом, что они имеют одинаковую форму, предполагается, что могут быть использованы канавки с разными формами. Например, основание лунки может содержать множество канавок, у которых форма одной или более канавок является разной. Таким образом, основание лунки может содержать множество канавок, содержащее две или более канавки с плоским дном, U-образные, V-образные или V-образные с плоским дном и т. п. Returning to Figure 11, it shows a cell culture plate 110 containing a well 112 with a plurality of grooves 116 on its base containing V-shaped grooves, each of which has a flat bottom. The maximum opening width in the grooves is approximately 2.4 mm, the depth of the grooves is approximately 1 mm, and the width of the flat bottom at the base of the grooves is approximately 400 µm. The angle between opposite sides of the grooves is approximately 90 degrees. While a plurality of grooves are shown to have the same shape, it is contemplated that grooves with different shapes may be used. For example, the base of the well may contain a plurality of grooves in which the shape of one or more of the grooves is different. Thus, the base of the well may comprise a plurality of grooves, comprising two or more flat-bottomed, U-shaped, V-shaped, or V-shaped flat-bottomed grooves, and the like.

В определенных вариантах осуществления канавки образуют множество концентрических колец на основании лунки. В одном варианте осуществления радиус концентрических колец составляет приблизительно 1,05 мм, приблизительно 3,45 и приблизительно 5,85 мм. Возвращаясь к фигуре 12, на ней показано основание планшета 112 для культивирования клеток с множеством концентрических колец 117, образованных канавками 116, при этом радиус концентрических колец составляет приблизительно 1,05 мм, приблизительно 3,45 и приблизительно 5,85 мм. In certain embodiments, the grooves form a plurality of concentric rings at the base of the well. In one embodiment, the radius of the concentric rings is about 1.05 mm, about 3.45, and about 5.85 mm. Returning to Figure 12, the base of the cell culture plate 112 is shown with a plurality of concentric rings 117 defined by grooves 116, the radius of the concentric rings being approximately 1.05 mm, approximately 3.45 and approximately 5.85 mm.

Возвращаясь к фигуре 14, на ней показан схематический вид сверху планшета 110 для культивирования клеток в виде многолуночного планшета. Планшет 110 для культивирования клеток содержит множество лунок 112, при этом лунки содержат либо множество концентрических канавок 117, либо содержат микрофлюидный канал 118. Лунки линейно расположены по рядам. Ряд может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере одной лунки, содержащей концентрические канавки 117. Ряд может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере одной лунки, содержащей концентрические канавки 117, и по меньшей мере одной лунки, содержащей микрофлюидный канал 118, как показано на фигуре 4. Returning to Figure 14, there is shown a schematic plan view of a cell culture plate 110 in the form of a multiwell plate. The cell culture plate 110 comprises a plurality of wells 112, wherein the wells comprise either a plurality of concentric grooves 117 or a microfluidic channel 118. The wells are linearly arranged in rows. The row may be configured to contain at least one well containing concentric grooves 117. The row may be configured to contain at least one well containing concentric grooves 117 and at least one well containing the microfluidic channel 118, as shown in figure 4.

Канал 119 соединяет лунку, содержащую множество концентрических канавок 117, и лунку, содержащую микрофлюидный канал 118. Каждая лунка содержит впускное отверстие и выпускное отверстие для обеспечения сообщения по текучей среде с подачей в каждую лунку и с выведением из каждой лунки. Несмотря на то, что на фигуре 14 показано, что каждая лунка 112 для клеток в планшете 110 для культивирования клеток содержит либо концентрические канавки 117, либо содержит микрофлюидный канал 118, специалисту в данной области техники будет понятно, что необязательно, чтобы каждая лунка 112 была выполнена таким образом, и что возможно, чтобы одна или более лунок 12 не содержали концентрические канавки 117 и/или не содержали микрофлюидный канал 118. При необходимости некоторые из лунок 112 могут быть пустыми и не использоваться. Channel 119 connects a well containing a plurality of concentric grooves 117 and a well containing a microfluidic channel 118. Each well includes an inlet and an outlet to provide fluid communication to and from each well. Although Figure 14 shows that each cell well 112 in the cell culture plate 110 contains either concentric grooves 117 or contains a microfluidic channel 118, one skilled in the art will appreciate that it is not necessary for each well 112 to be so configured, and that it is possible for one or more of the wells 12 not to contain the concentric grooves 117 and/or not to contain the microfluidic channel 118. If desired, some of the wells 112 may be empty and not used.

В определенных вариантах осуществления неоднородная поверхность образована с помощью одной или более канавок, которые имеют форму волн и проходят по основанию лунки. In certain embodiments, the heterogeneous surface is formed by one or more grooves that are shaped like waves and extend along the base of the well.

В определенных вариантах осуществления неоднородная поверхность содержит множество углублений. Обычно углубления будут иметь закрытое дно и открытую верхнюю часть. Углубления выполняют функцию удерживания отдельных сфероидов с обеспечением снижения степени или предотвращения их агломерации. Размер углублений будет, как правило, соответствовать максимальному диаметру сфероида ±10% так что сфероиды могут удерживаться или содержаться в отверстиях. Неоднородная поверхность может содержать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 или более углублений, распределенных по дну лунки. Неоднородная поверхность может содержать от 130 до 160 углублений, распределенных по дну лунки. Неоднородная поверхность может содержать от 130 до 150 углублений, распределенных по дну лунки. Неоднородная поверхность может содержать от 130 до 140 углублений, распределенных по дну лунки. Как правило, форма углублений может предусматривать плоское дно, быть U-образной, V-образной или V-образной с плоским дном и т. п. Форма углублений не является особенно ограниченной, при условии, что отверстия способны вместить сфероид с максимальным диаметром ±10% с целью удерживания отдельных сфероидов. В определенных вариантах осуществления глубина и ширина углублений составляет от приблизительно 200 до приблизительно 1000 мкм, соответственно, от приблизительно 600 до приблизительно 1000 мкм. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере 70%, 80% или 90% или более основания лунки будет занято углублениями. In certain embodiments, the heterogeneous surface comprises a plurality of depressions. Typically, the recesses will have a closed bottom and an open top. The depressions have the function of retaining individual spheroids to reduce or prevent their agglomeration. The size of the recesses will typically correspond to a maximum spheroid diameter of ±10% so that the spheroids can be held or contained in the holes. A non-homogeneous surface may contain 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 or 200 or more recesses distributed along the bottom wells. The heterogeneous surface may contain from 130 to 160 recesses distributed along the bottom of the hole. The heterogeneous surface may contain from 130 to 150 recesses distributed along the bottom of the hole. The heterogeneous surface may contain from 130 to 140 recesses distributed along the bottom of the hole. Generally, the shape of the recesses may be flat-bottomed, U-shaped, V-shaped or V-shaped with a flat bottom, etc. The shape of the recesses is not particularly limited, provided that the holes are able to accommodate a spheroid with a maximum diameter of ±10 % in order to hold individual spheroids. In certain embodiments, the depth and width of the recesses is from about 200 to about 1000 microns, respectively, from about 600 to about 1000 microns. In certain embodiments, at least 70%, 80%, or 90% or more of the base of the well will be occupied by depressions.

Возвращаясь к фигуре 16, на ней показан планшет 120 для культивирования клеток, содержащий лунку 122 с множеством углублений 126 в ее основании. Углубления имеют закрытое дно и открытую верхнюю часть. Максимальная ширина каждого углубления оставляет приблизительно 0,8 мм, глубина канавок составляет приблизительно 0,5 мм. Угол между противоположными сторонами углублений составляет приблизительно 118 градусов. Несмотря на то, что множество углублений показаны таким образом, что они имеют одинаковую форму, предполагается, что могут быть использованы углубления с разными формами. Например, основание лунки может содержать множество углублений, у которых форма одного или более углублений является разной. Таким образом, основание лунки может содержать множество углублений, содержащее два или более углубления с плоским дном, U-образные, V-образные или V-образные с плоским дном и т. п. Returning to Figure 16, a cell culture plate 120 is shown comprising a well 122 with a plurality of depressions 126 at its base. The recesses have a closed bottom and an open top. The maximum width of each recess is approximately 0.8 mm, the depth of the grooves is approximately 0.5 mm. The angle between opposite sides of the recesses is approximately 118 degrees. While a plurality of recesses are shown to have the same shape, it is contemplated that recesses with different shapes may be used. For example, the base of the well may contain a plurality of recesses in which the shape of one or more recesses is different. Thus, the base of the well may comprise a plurality of wells, comprising two or more flat-bottomed, U-shaped, V-shaped, or V-shaped flat-bottomed recesses, and the like.

На фигуре 17 показан схематический вид сверху планшета 120 для культивирования клеток, показанного на фигуре 16. Радиус планшета 120 для культивирования клеток составляет приблизительно 8 мм. Радиус основания лунки 122, содержащей множество углублений 126, составляет приблизительно 5,8 мм. Радиус каждого углубления 26 составляет приблизительно 0,4 мм. Figure 17 shows a schematic plan view of the cell culture plate 120 shown in Figure 16. The cell culture plate 120 has a radius of approximately 8 mm. The base radius of the well 122 containing the plurality of recesses 126 is approximately 5.8 mm. The radius of each recess 26 is approximately 0.4 mm.

Возвращаясь к фигуре 18, на ней показан схематический вид сверху планшета 121 для культивирования клеток в виде многолуночного планшета. Планшет 121 для культивирования клеток содержит множество лунок 122, при этом лунки содержат либо множество углублений 127, либо содержат микрофлюидный канал 128. Лунки 122 линейно расположены по рядам. Ряд может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере одной лунки, содержащей множество отверстий 127. Ряд может быть выполнен с возможностью содержания по меньшей мере одной лунки, содержащей множество углублений 127, и по меньшей мере одной лунки, содержащей микрофлюидный канал 128, как показано на фигуре 14. Канал 129 соединяет лунку, содержащую множество углублений 127, и лунку, содержащую микрофлюидный канал 128. Каждая лунка содержит впускное отверстие и выпускное отверстие для обеспечения сообщения по текучей среде с подачей в каждую лунку и с выведением из каждой лунки. Returning to Figure 18, there is shown a schematic top view of a cell culture plate 121 in the form of a multiwell plate. The cell culture plate 121 comprises a plurality of wells 122, wherein the wells either comprise a plurality of wells 127 or contain a microfluidic channel 128. The wells 122 are linearly arranged in rows. The row may be configured to contain at least one well containing a plurality of holes 127. The row may be configured to contain at least one well containing a plurality of recesses 127 and at least one well containing a microfluidic channel 128, as shown in Figure 14. Channel 129 connects a well containing a plurality of recesses 127 and a well containing a microfluidic channel 128. Each well includes an inlet and outlet to provide fluid communication to and from each well.

Несмотря на то, что на фигуре 18 показано, что каждая лунка 122 в планшете 121 для культивирования клеток содержит либо углубления 127, либо содержит микрофлюидный канал 128, специалисту в данной области техники будет понятно, что необязательно, чтобы каждая лунка 122 была выполнена таким образом, и что возможно, чтобы одна или более лунок 122 не содержали углубления 127 и/или не содержали микрофлюидный канал 128. При необходимости некоторые из лунок 122 могут быть пустыми и не использоваться. Although Figure 18 shows that each well 122 in the cell culture plate 121 contains either recesses 127 or contains a microfluidic channel 128, one skilled in the art will appreciate that it is not necessary for each well 122 to be configured in this manner. , and that it is possible that one or more wells 122 do not contain recesses 127 and/or do not contain microfluidic channel 128. If desired, some of the wells 122 may be empty and not used.

Глубина множества лунок при использовании в соответствии с настоящим изобретением не должна быть одинаковой по всему планшету для культивирования клеток, и предполагается, что лунки могут иметь разную глубину. В одном варианте осуществления лунка, содержащая неоднородную поверхность или углубления, имеет глубину, которая больше, чем у лунки, содержащей вставку. Канал, соединяющий по меньшей мере две лунки, может располагаться на такой же высоте, что и канал, расположенный на разных расстояниях от основания по меньшей мере двух лунок для клеток. Данная конфигурация обеспечивает то, что поток текучей среды, поступающий в лунку, не нарушает спокойного состояния сфероидов, удерживаемых на неоднородной поверхности, или не тревожит их, при этом обеспечивает то, чтобы текучая среда могла все еще проходить через проницаемую мембрану вставки. The depth of a plurality of wells when used in accordance with the present invention need not be the same throughout the cell culture plate, and it is contemplated that the wells may have different depths. In one embodiment, the well containing the non-uniform surface or recesses has a depth that is greater than that of the well containing the insert. The channel connecting the at least two wells may be located at the same height as the channel located at different distances from the base of the at least two cell wells. This configuration ensures that the flow of fluid entering the well does not disturb or disturb the spheroids held on the heterogeneous surface while ensuring that the fluid can still pass through the permeable membrane of the insert.

Данная конфигурация представлена на фигуре 15, где показан планшет 110 для культивирования клеток, содержащий первую лунку 112a с множеством канавок 116 в ее основании и вторую лунку 112b с микрофлюидным каналом 118 в ней. Первая лунка 112a имеет глубину, которая больше, чем у второй лунки 112b. Первая лунка 112a имеет глубину, составляющую приблизительно 20 мм, а вторая лунка 112b для клеток имеет глубину, составляющую приблизительно 18,3 мм. Канал 119 находится в сообщении по текучей среде с каждой из лунок 112a и 112b. Канал 119 расположен дальше от основания первой лунки 112a по сравнению со второй лункой 112b. This configuration is shown in Figure 15, which shows a cell culture plate 110 comprising a first well 112a with a plurality of grooves 116 at its base and a second well 112b with a microfluidic channel 118 therein. The first hole 112a has a depth that is greater than that of the second hole 112b. The first well 112a has a depth of approximately 20 mm and the second cell well 112b has a depth of approximately 18.3 mm. Channel 119 is in fluid communication with each of wells 112a and 112b. The channel 119 is further from the base of the first well 112a compared to the second well 112b.

Данная конфигурация также представлена на фигуре 19, где показан планшет 120 для культивирования клеток, содержащий первую лунку 122a с множеством углублений 126 в ее основании и вторую лунку 122b с микрофлюидным каналом 128 в ней. Первая лунка 122a имеет глубину, которая больше, чем у второй лунки 122b. Первая лунка 122a имеет глубину, составляющую приблизительно 20 мм, а вторая лунка 112b имеет глубину, составляющую приблизительно 18,3 мм. Канал 129 находится в сообщении по текучей среде с каждой из лунок 122a и 122b. Канал 129 расположен дальше от основания первой лунки 122a по сравнению со второй лункой 122b. This configuration is also shown in Figure 19, which shows a cell culture plate 120 comprising a first well 122a with a plurality of depressions 126 at its base and a second well 122b with a microfluidic channel 128 therein. The first hole 122a has a depth that is greater than that of the second hole 122b. The first well 122a has a depth of approximately 20 mm and the second well 112b has a depth of approximately 18.3 mm. Channel 129 is in fluid communication with each of wells 122a and 122b. The channel 129 is further from the base of the first well 122a compared to the second well 122b.

Источники клетокCell Sources

В настоящем изобретении используют разные источники клеток. В одном варианте осуществления настоящее изобретение не включает стадию выделения или получения образца клеток от субъекта. Клетки могут быть криоконсервированными. Клетки могут находиться в трехмерной культуре. Клетки могут быть представлены в форме сфероидов. Клетки могут активно делиться. Клетки можно культивировать в среде для культивирования клеток (например, содержащей питательные вещества (например, белки, пептиды, аминокислоты), источник энергии (например, углеводы), основные металлы и минеральные вещества (например, кальций, магний, железо, фосфаты, сульфаты), буферные средства (например, фосфаты, ацетаты), индикаторы изменения pH (например, феноловый красный, бромкрезоловый пурпурный), селективные средства (например, химические соединения, противомикробные средства) и т. д.). Среда для культивирования одиночных клеток может быть использована для выращивания клеток одинаковых или разных типов. Разные среды для культивирования клеток могут быть использованы для выращивания разных типов клеток. Поскольку среда для культивирования клеток циркулирует в соответствии с настоящим изобретением, то будет происходить смешивание разных сред для культивирования клеток. The present invention uses different sources of cells. In one embodiment, the present invention does not include the step of isolating or obtaining a cell sample from a subject. Cells may be cryopreserved. The cells may be in a three-dimensional culture. Cells can be represented in the form of spheroids. Cells can actively divide. Cells can be cultured in a cell culture medium (e.g., containing nutrients (e.g., proteins, peptides, amino acids), energy source (e.g., carbohydrates), base metals, and minerals (e.g., calcium, magnesium, iron, phosphates, sulfates) buffer agents (eg phosphates, acetates), pH change indicators (eg phenol red, bromocresol purple), selective agents (eg chemicals, antimicrobials), etc.). Single cell culture medium can be used to grow cells of the same or different cell types. Different cell culture media can be used to grow different types of cells. Since the cell culture medium is circulated according to the present invention, mixing of different cell culture media will occur.

В некоторых вариантах осуществления одно или более средств добавляют в среду для культивирования клеток или среды для культивирования клеток. Клетки можно выделять из ткани или текучей среды с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Клетки можно получить в результате дифференцировки из стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, или непосредственно получить в результате дифференцировки из соматических клеток. Клетки могут представлять собой встречающиеся в природе клетки или измененные клетки (например, клетку, содержащую одно или более не встречающихся в природе генетических изменений). Клетка может представлять собой клетку с патологией или клетку модели заболевания. Например, клетка может представлять собой раковую клетку или клетку, которая может быть индуцирована в гиперпролиферативное состояние (например, трансформированные клетки).In some embodiments, one or more agents are added to the cell culture medium or cell culture medium. Cells can be isolated from tissue or fluid using methods well known in the art. Cells can be obtained by differentiation from stem cells, such as embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, or directly obtained by differentiation from somatic cells. The cells may be naturally occurring cells or altered cells (eg, a cell containing one or more non-naturally occurring genetic alterations). The cell may be a pathology cell or a disease model cell. For example, the cell may be a cancer cell or a cell that can be induced into a hyperproliferative state (eg, transformed cells).

Клетки могут быть получены от субъектов-людей или субъектов-животных или из клеток человека или животного, в том числе любого из совокупности видов млекопитающих, предпочтительно человека, но в том числе из крысы, мыши, свиньи, кролика и приматов, отличных от человека, и т. п., или происходить из них. Клетки и линии клеток можно получать из коммерческих источников. Клетки могут быть получены из любого требуемого типа ткани или органа, в том числе без ограничения из надпочечника, мочевого пузыря, кровеносного сосуда, кости, костного мозга, головного мозга, хряща, шейки матки, роговицы, эндометрия, пищевода, гастроинтестинального тракта, иммунной системы (например, T-лимфоциты, B-лимфоциты, лейкоциты, макрофаги и дендритные клетки), печени, легкого, лимфатической системы, мышцы (например, сердечной мышцы), нервной ткани, яичника, поджелудочной железы (например, островковые клетки), гипофиза, предстательной железы, почки, слюнной железы, кожи, сухожилия, яичка и щитовидной железы, или происходить из них. The cells may be derived from human or animal subjects, or from human or animal cells, including any of a population of mammalian species, preferably human, but including rat, mouse, pig, rabbit, and non-human primates, etc., or come from them. Cells and cell lines can be obtained from commercial sources. Cells may be derived from any desired type of tissue or organ, including, but not limited to, adrenal, bladder, blood vessel, bone, bone marrow, brain, cartilage, cervix, cornea, endometrium, esophagus, gastrointestinal tract, immune system (eg, T-lymphocytes, B-lymphocytes, leukocytes, macrophages, and dendritic cells), liver, lung, lymphatic system, muscle (eg, heart muscle), nervous tissue, ovary, pancreas (eg, islet cells), pituitary gland, prostate, kidney, salivary gland, skin, tendon, testicle and thyroid gland, or originate from them.

Одним типом клеток, представляющим особый интерес, являются клетки легкого, в том числе клетки легочного эпителия. Клетки бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей являются особенно применимыми в настоящем изобретении. Клетки бронхиального эпителия человека можно отбирать посредством браш-биопсии легких донора в ходе процедуры бронхоскопии. В одном варианте осуществления клетки легкого представляют собой нормальные клетки бронхиального эпителия человека (NHBE). Клетки легочного эпителия можно культивировать в виде монослоя недифференцированных клеток, или из них можно дополнительно сформировать органотипическую ткань, подобную легочному эпителию, на поверхности раздела жидкость-воздух. Клетки легочного эпителия можно получать от субъектов-людей или субъектов-животных с разными патологиями, в том числе от субъектов, классифицированных как курящие или некурящие. One cell type of particular interest is lung cells, including lung epithelial cells. Bronchial and/or respiratory epithelial cells are particularly useful in the present invention. Human bronchial epithelial cells can be collected by brushing a donor lung biopsy during a bronchoscopy procedure. In one embodiment, the lung cells are normal human bronchial epithelial cells (NHBE). Lung epithelial cells can be cultured as a monolayer of undifferentiated cells, or they can be further formed into an organotypic tissue similar to lung epithelium at the liquid-air interface. Lung epithelial cells can be obtained from human or animal subjects with various pathologies, including subjects classified as smokers or non-smokers.

Другим типом клеток, представляющим особый интерес, являются клетки печени. В одном варианте осуществления используемыми клетками являются гепатоциты. Гепатоциты представляют собой клетки печени, которые составляют 70-85% цитоплазматической массы печени. Функциональность гепатоцитов сильно зависит от их способности образовывать фенотип полярности, который устанавливается только при 3-мерном культивировании. Одним источником клеток печени являются первичные гепатоциты, которые представляют собой модель in vitro, широко используемую для исследования многочисленных аспектов физиологии и патологии печени. Методика, используемая для выделения гепатоцитов человека, может основываться на двухстадийной перфузии донорской печени коллагеназой. Однако данные клетки не экспрессируют ферменты метаболизма в течение более 5 дней. Другим ограничением является их низкая жизнеспособность. Эти недостатки можно преодолеть путем применения альтернативных, долгоживущих линий клеток печени, таких как линии клеток-предшественников печени человека или животного. Одним таким примером линии клеток-предшественников печени человека является линия клеток HepaRG (ThermoFisher Scientific). Клетки HepaRG сохраняют многие характеристики первичных гепатоцитов человека. Они характеризуются более высокой экспрессией печеночноспецифических генов и генов метаболизма и большей продолжительностью жизни по сравнению с первичными гепатоцитами. Реорганизация клеток HepaRG в 3-мерные сфероиды дополнительно увеличивает как продолжительность их жизни, так и метаболические способности, давая возможность предположить, что сфероиды могут предоставить лучшую альтернативную модель печени in vitro для токсикологического тестирования. Сфероиды из клеток печени также можно создавать из смеси первичных гепатоцитов и звездчатых клеток печени или первичных гепатоцитов и стволовых клеток, полученных из жировой ткани. Another cell type of particular interest is the liver cells. In one embodiment, the cells used are hepatocytes. Hepatocytes are liver cells that make up 70-85% of the cytoplasmic mass of the liver. The functionality of hepatocytes is highly dependent on their ability to form a polarity phenotype, which is established only by 3D culture. One source of liver cells are primary hepatocytes, which are an in vitro model widely used to study numerous aspects of liver physiology and pathology. The technique used to isolate human hepatocytes may be based on a two-stage perfusion of the donor liver with collagenase. However, these cells do not express metabolic enzymes for more than 5 days. Another limitation is their low viability. These shortcomings can be overcome by using alternative, long-lived liver cell lines, such as human or animal liver progenitor cell lines. One such example of a human liver progenitor cell line is the HepaRG cell line (ThermoFisher Scientific). HepaRG cells retain many of the characteristics of primary human hepatocytes. They are characterized by a higher expression of liver-specific genes and metabolism genes and a longer lifespan compared to primary hepatocytes. Reorganization of HepaRG cells into 3D spheroids further increases both their lifespan and metabolic capacity, suggesting that spheroids may provide a better alternative in vitro liver model for toxicological testing. Liver cell spheroids can also be created from a mixture of primary hepatocytes and liver stellate cells, or primary hepatocytes and adipose-derived stem cells.

В одном варианте осуществления клетка легкого представляет собой клетку легочного эпителия, такую как клетка бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей. In one embodiment, the lung cell is a lung epithelial cell, such as a bronchial and/or airway epithelial cell.

В одном варианте осуществления клетка печени представляет собой клетку HepaRG, предпочтительно клетку сфероида HepaRG. In one embodiment, the liver cell is a HepaRG cell, preferably a HepaRG spheroid cell.

Комбинации клетокCell Combinations

Также рассматривается применение комбинаций любых клеток, описанных в данном документе. Рассматривается применение комбинаций любых клеток, описанных в данном документе, в планшете для культивирования клеток или в системе или устройстве, содержащих планшет для культивирования клеток. Одной иллюстративной комбинацией клеток является комбинация клеток печени и клеток легкого. Также рассматривается комбинация клетки легочного эпителия, такой как клетка бронхиального эпителия и/или эпителия дыхательных путей, и клетки печени, такой как клетка HepaRG, предпочтительно клетки сфероида HepaRG. При необходимости дополнительные клетки могут быть использованы вместе с этой комбинацией. Also contemplated is the use of combinations of any of the cells described herein. The use of combinations of any of the cells described herein in a cell culture plate or in a system or device containing a cell culture plate is contemplated. One exemplary combination of cells is a combination of liver cells and lung cells. Also contemplated is a combination of a lung epithelial cell, such as a bronchial and/or respiratory tract epithelium cell, and a liver cell, such as a HepaRG cell, preferably a HepaRG spheroid cell. If necessary, additional cells can be used along with this combination.

Разные клетки в комбинации будут, как правило, культивироваться в отдельных лунках. Different cells in combination will generally be cultured in separate wells.

В планшете для культивирования клеток, содержащем по меньшей мере две лунки или по меньшей мере две вставки, каждая из лунок или вставок могут содержать одинаковый или разный тип клеток. Соответственно, каждая из по меньшей мере двух лунок или вставок содержит разный тип клеток. Разный тип клеток может представлять собой разную линию клеток. Разный тип клеток может представлять собой разную клетку или ткань. В одном иллюстративном варианте осуществления разные типы клеток в планшете для культивирования клеток представляют собой клетки легкого и клетки печени. In a cell culture plate containing at least two wells or at least two inserts, each of the wells or inserts may contain the same or a different cell type. Accordingly, each of the at least two wells or inserts contains a different cell type. A different cell type may represent a different cell line. A different cell type can be a different cell or tissue. In one exemplary embodiment, the different cell types in the cell culture plate are lung cells and liver cells.

Одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что влияние первого типа клеток на второй тип клеток может быть изучено, необязательно в режиме реального времени, по мере того, как текучая среда от первого типа клеток достигнет второго типа клеток, поскольку она циркулирует в планшете для культивирования клеток, описанном в данном документе. One advantage of the present invention is that the effect of the first cell type on the second cell type can be studied, optionally in real time, as the fluid from the first cell type reaches the second cell type as it circulates in the culture plate. cells described in this document.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что влияние второго типа клеток на первый тип клеток может быть изучено, необязательно в режиме реального времени, по мере того, как текучая среда от второго типа клеток достигнет первого типа клеток, поскольку она циркулирует в планшете для культивирования клеток, описанном в данном документе. Another advantage of the present invention is that the effect of the second cell type on the first cell type can be studied, optionally in real time, as the fluid from the second cell type reaches the first cell type as it circulates in the culture plate. cells described in this document.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние метаболизируемого средства из первого типа клеток на второй тип клеток, необязательно в режиме реального времени. Another advantage of the present invention is that the effect of a metabolizable agent from a first cell type on a second cell type can be studied, optionally in real time.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние метаболизируемого средства из второго типа клеток на первый тип клеток, необязательно в режиме реального времени. Another advantage of the present invention is that the effect of the metabolizable agent from the second cell type on the first cell type can be studied, optionally in real time.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние метаболизируемого средства из первого типа клеток и метаболизируемого средства из второго типа клеток на третий тип клеток и т.д., необязательно в режиме реального времени.Another advantage of the present invention is that it can the effect of the metabolizable agent from the first cell type and the metabolizable agent from the second cell type on the third cell type, etc., can be studied, optionally in real time.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние метаболизируемого средства из комбинаций типов клеток, необязательно в режиме реального времени.Another advantage of the present invention is that it can the effect of the metabolizable agent from combinations of cell types can be studied, optionally in real time.

Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что может быть изучено влияние воздействия двух или более типов клеток на средство, необязательно в режиме реального времени.Another advantage of the present invention is that the effect of exposing two or more cell types to an agent can be studied, optionally in a mode real time.

3-мерные культуры клеток3D cell cultures

Настоящее изобретение включает применение «3-мерного культивирования клеток», которое включает любой способ, обеспечивающий культивирование клетки в 3-х измерениях с применением или без применения матрицы или подложки, такой как проницаемая мембрана во вставке. Был разработан ряд разных способов 3-мерного культивирования клеток, в том числе сфероидные культуры и органотипические культуры. 3-мерные клетки можно выращивать и/или поддерживать в планшете для культивирования клеток, описанном в данном документе. The present invention includes the use of "3-dimensional cell culture", which includes any method that provides cell culture in 3 dimensions with or without the use of a matrix or support, such as a permeable membrane in an insert. A number of different 3D cell culture methods have been developed, including spheroid cultures and organotypic cultures. 3D cells can be grown and/or maintained in the cell culture plate described herein.

Термин «сфероид» предполагает значение, обычно понимаемое в данной области техники, которое представлено одиночной клеткой, делящейся с образованием 3-мерной шарообразной структуры, либо 3-мерным агрегатом нескольких клеток с применением или без применения матрицы или подложки для поддержания 3-мерного роста клеток в пределах сфероида. 3-Мерный сфероид может представлять собой адгезивный сфероид или сфероид, растущий в суспензии. The term "spheroid" is intended to mean the meaning commonly understood in the art, which is represented by a single cell dividing to form a 3-dimensional spheroid, or a 3-dimensional aggregate of multiple cells with or without the use of a matrix or support to support 3-dimensional cell growth. within the spheroid. The 3-dimensional spheroid can be an adhesive spheroid or a suspension-growing spheroid.

В некоторых вариантах осуществления сфероид содержит один тип клеток. В некоторых вариантах осуществления сфероид содержит более одного типа клеток. В некоторых вариантах осуществления, где выращивается более одного сфероида, каждый сфероид может принадлежать к одному и тому же типу, в то время как в других вариантах осуществления выращивают два или более разных типов сфероидов. In some embodiments, the implementation of the spheroid contains one type of cells. In some embodiments, the implementation of the spheroid contains more than one type of cells. In some embodiments where more than one spheroid is grown, each spheroid may be of the same type, while in other embodiments two or more different types of spheroids are grown.

3-Мерные сфероиды в большей степени повторяют ткань in vivo в том, что касается их клеточной коммуникации и формирования внеклеточных матриксов. Эти матриксы помогают клеткам перемещаться в пределах сфероида подобно тому, как клетки перемещаются в живой ткани. Таким образом, сфероиды представляют собой намного улучшенные модели дифференцировки, выживания, миграции клеток, поляризации клеток, экспрессии генов и роста. 3D spheroids more closely mimic in vivo tissue in terms of their cellular communication and extracellular matrix formation. These matrices help cells move within the spheroid, similar to how cells move in living tissue. Thus, spheroids represent much improved models of differentiation, survival, cell migration, cell polarization, gene expression, and growth.

Сфероиды можно собирать и изучать с помощью разных способов, хорошо известных в данной области техники, в том числе колориметрического, флуоресцентного и люминесцентного анализов с измерениями с помощью планшет-ридера, или их можно без труда оценивать с помощью микроскопии. Дополнительные методики включают вестерн-, нозерн- или Саузерн-блоттинг, гистологические методики (например, иммуногистохимический анализ, гибридизацию in situ, иммунофлуоресценцию) и т. п. Также рассматривается применение способов оптической визуализации, таких как методики инвертированной светлопольной микроскопии, флуоресцентной микроскопии, однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT), позитронно-эмиссионной томографии (PET), магнитно-резонансной визуализации (MRI) и люминесцентной визуализации по методу Черенкова (CLI). Spheroids can be collected and studied using a variety of methods well known in the art, including colorimetric, fluorescent, and luminescent assays with plate reader measurements, or they can be easily assessed using microscopy. Additional techniques include Western, Northern, or Southern blotting, histological techniques (e.g., immunohistochemistry, in situ hybridization , immunofluorescence), and the like. Optical imaging techniques such as inverted brightfield microscopy, fluorescence, single photon emission computed tomography (SPECT), positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI), and Cherenkov luminescence imaging (CLI).

Варианты применения 3-мерных сфероидов включают изучение пролиферации клеток и тканей in vitro в среде, которая наиболее приближена к существующей in vivo, скрининг соединений или средств, токсикологические анализы, клеточную терапию, доставку клеток, доставку средств, биохимическое замещение, получение биологически активных молекул, тканевую инженерию, получение биоматериалов и клинические испытания и т. п.Applications for 3D spheroids include the study of cell and tissue proliferation in vitro in an environment that most closely approximates that of in vivo , screening for compounds or agents, toxicological assays, cell therapy, cell delivery, agent delivery, biochemical displacement, production of biologically active molecules, tissue engineering, obtaining biomaterials and clinical trials, etc.

Применение сфероидов в 3-мерном культивировании клеток в целом рассматривается в Expert Opin. Drug Discov. (2015) 10, 519-540.The use of spheroids in 3D cell culture is generally reviewed in Expert Opin. Drug Discov . (2015) 10, 519-540.

3-Мерные системы культивирования органов могут быть использованы в настоящем изобретении и они позволяют изучать функционирование органов. Можно изучать ответ на определенные раздражители, ответ на одно или более средств и фармакокинетическую активность таких средств. Миниатюризированные системы 3-мерного культивирования клеток предоставляют возможность комплексного изучения групп клеток или органов. Это позволяет воспроизводить сложность взаимодействия между разными тканями. 3-Мерное культивирование органов может быть органотипическим, что означает, что он стремится воспроизвести основные функции органа или системы органов. Также предусматривается миниатюризированная жидкостная система, соединяющая лунки. 3D organ culture systems can be used in the present invention and allow the study of organ function. One can study the response to certain stimuli, the response to one or more agents, and the pharmacokinetic activity of such agents. Miniaturized 3D cell culture systems offer the possibility of complex study of groups of cells or organs. This allows you to reproduce the complexity of the interaction between different tissues. 3D organ culture can be organotypic, meaning that it seeks to replicate the basic functions of an organ or organ system. A miniaturized fluid system connecting the wells is also provided.

Планшет для культивирования клеток может иметь по меньшей мере одну физиологическую функцию по меньшей мере одного типа ткани, или более предпочтительно имеет по меньшей мере одну физиологическую функцию по меньшей мере двух разных типов тканей. The cell culture plate may have at least one physiological function of at least one tissue type, or more preferably has at least one physiological function of at least two different tissue types.

3-Мерные культуры печени3D liver cultures

Печень играет ключевую роль в детоксикации, метаболизме углеводов, липидов и белков, а также в биотрансформации эндогенных и экзогенных веществ. Функциональные возможности печени тесно связаны со сборкой высокоспециализированных клеток, большинство из которых представляют собой гепатоциты, встроенных в сложную 3-мерную структуру, состоящую из так называемых долек. Биотрансформация соединений, как правило, приводит к образованию нетоксичных и лучше растворимых метаболитов, однако иногда могут образовываться более токсичные метаболиты, вызывающие гепатотоксичность. The liver plays a key role in detoxification, metabolism of carbohydrates, lipids and proteins, as well as in the biotransformation of endogenous and exogenous substances. The functionality of the liver is closely related to the assembly of highly specialized cells, most of which are hepatocytes, embedded in a complex 3-dimensional structure consisting of so-called lobules. Biotransformation of compounds generally results in the formation of non-toxic and better soluble metabolites, but sometimes more toxic metabolites can be formed causing hepatotoxicity.

Гепатоциты можно трансформировать в 3-х мерные структуры посредством использования различных способов, в том числе путем применения многослойной культуры, подложки из твердых материалов, таких как полистирольные подложки, гидрогелей, таких как коллаген I типа, или самостоятельной сборки гепатоцитов в сфероиды. Hepatocytes can be transformed into 3D structures using a variety of methods, including the use of multilayer culture, support of solid materials such as polystyrene supports, hydrogels such as type I collagen, or self-assembly of hepatocytes into spheroids.

При том, что используемые свежевыделенные первичные гепатоциты и клетки легкого человека могут быть предпочтительными типами клеток, их доступность ограничена. Другие варианты выбора линий клеток печени человека включают HepG2 и Hep2/C3A. Особенно подходящим источником клеток является линия клеток HepaRG. Другими источниками гепатоцитов человека являются гепатоциты, происходящие из эмбриональных стволовых клеток человека (hESC), и гепатоциты, происходящие из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC).While freshly isolated primary human hepatocytes and lung cells may be the preferred cell types, their availability is limited. Other choices for human liver cell lines include HepG2 and Hep2/C3A. A particularly suitable cell source is the HepaRG cell line. Other sources of human hepatocytes are hepatocytes derived from human embryonic stem cells (hESC) and hepatocytes derived from induced pluripotent stem cells (iPSC).

В одном варианте осуществления сфероид представляет собой клетку печени или получен из нее с образованием 3-мерного сфероида из клеток печени. Такие сфероиды из клеток печени можно получать с использованием различных способов, известных из уровня техники и описанных, например, в ALTEX (2014) 31, 441-477 и Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. (2013) 133, 67-78.In one embodiment, the spheroid is or derived from a liver cell to form a 3-dimensional spheroid from liver cells. Such spheroids from liver cells can be obtained using various methods known in the art and described, for example, in ALTEX (2014) 31, 441-477 and Toxicol. sci. off. J. Soc. Toxicol. (2013) 133, 67-78.

3-Мерные культуры легкого3D lung cultures

Поскольку морфология респираторного тракта изменяется от верхних к нижним дыхательным путям, были получены многие разные установившиеся модели культур клеток с применением первичных клеток или линий клеток, и их применение рассматривается в настоящем изобретении. Выбор конкретной клетки или линии клеток с целью применения будет зависеть от участка респираторного тракта, представляющего интерес для данного исследования.Because the morphology of the respiratory tract varies from the upper to the lower respiratory tract, many different established cell culture models have been generated using primary cells or cell lines, and their use is contemplated in the present invention. The choice of a particular cell or cell line to be used will depend on the area of the respiratory tract of interest for this study.

Поскольку поверхность легкого подвергается воздействию воздуха, клеточную модель можно культивировать на поверхности раздела жидкость-воздух с целью более реалистичной имитации легкого. Since the surface of the lung is exposed to air, the cell model can be cultured at the liquid-air interface to more realistically mimic the lung.

В одном варианте осуществления сфероид представляет собой клетку легкого или получен из нее с образованием 3-мерного сфероида из клеток легкого. Такие сфероиды из клеток легкого можно получать с помощью различных способов, известных из уровня техники, таких как описанные в ALTEX (2014) 31, 441-477 и Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. (2013) 133, 67-78.In one embodiment, the spheroid is or is derived from a lung cell to form a 3-dimensional lung cell spheroid. Such spheroids from lung cells can be obtained using various methods known in the art, such as those described in ALTEX (2014) 31, 441-477 and Toxicol. sci. off. J. Soc. Toxicol. (2013) 133, 67-78.

Устройство для отбора проб текучей среды для культивирования клеток при воздействииCell Culture Fluid Sampling Device When Exposed

Планшет для культивирования клеток может представлять собой компонент более крупного устройства, такого как устройство для отбора образцов, соответственно, устройство для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии. Текучая среда, которая вступает контакт с клетками из по меньшей мере двух лунок, может циркулировать в устройстве или системе, и из нее можно отбирать образцы и необязательно измерять и/или анализировать, если это необходимо. С целью доставки образцов текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов второй (для отбора проб) насос может быть использован для обеспечения выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов. Второй насос описан выше. Как правило, устройство может содержать три или более насосов. По меньшей мере один насос можно применять для отбора образцов, по меньшей мере один насос можно применять для повторного заполнения текучей средой и по меньшей мере один насос можно применять для обеспечения циркуляции текучей среды через планшет (см., например, фигуру 10). Преимущественно устройство для образцов представляет собой автоматическое устройство для отбора образцов, которое сводит к минимуму ручное взаимодействие с повышением производительности и снижением риска контаминации. В определенных вариантах осуществления устройство для отбора образцов представляет собой высокопроизводительное устройство для отбора образцов. В определенных вариантах осуществления устройство для отбора образцов выполнено с возможностью отбора образцов в режиме реального времени. В определенных вариантах осуществления устройство для отбора образцов выполнено с возможностью высокопроизводительного отбора образцов в режиме реального времени. The cell culture plate may be a component of a larger device such as a sampling device, respectively, a cell culture fluid sampling device upon exposure. Fluid that comes into contact with cells from at least two wells can be circulated in the device or system and can be sampled and optionally measured and/or analyzed as needed. For the purpose of delivering fluid samples from the cell culture plate to the sample plate, a second (sampling) pump may be used to draw fluid from the cell culture plate to the sample plate. The second pump is described above. Typically, the device may contain three or more pumps. At least one pump may be used to sample, at least one pump may be used to refill fluid, and at least one pump may be used to circulate fluid through the plate (see, for example, Figure 10). Preferably, the sampler is an automatic sampling device that minimizes manual interaction, increasing productivity and reducing the risk of contamination. In certain embodiments, the sampling device is a high performance sampling device. In certain embodiments, the sampling device is configured to take samples in real time. In certain embodiments, the sampling device is configured for high throughput sampling in real time.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит множество (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или больше) планшетов для культивирования клеток и множество (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более) планшетов для образцов. In some embodiments, the sampling device comprises a plurality (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more) cell culture plates and a plurality (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 or more) sample plates.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит инкубатор для размещения планшета для культивирования клеток для поддержания его в оптимальных условиях культивирования (например, температуры, газообразной среды и влажности). In some embodiments, the sampling device comprises an incubator for housing the cell culture plate to maintain it under optimal culture conditions (eg, temperature, gaseous environment, and humidity).

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов размещено в инкубаторе. In some embodiments, the sampling device is placed in an incubator.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит один или более насосов или других компонентов, предназначенных для доставки или повторной доставки текучей среды к планшету (планшетам) для культивирования клеток. In some embodiments, the sampling device comprises one or more pumps or other components for delivering or redelivering fluid to the cell culture plate(s).

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит один или более компонентов с автоматизированным управлением (например, дозаторов, держателей, манипуляторов планшетов и т. п.) для автоматизации применения и/или анализа устройств для культивирования или обращения с ними. In some embodiments, the sampling device comprises one or more automated components (eg, dispensers, holders, plate handlers, and the like) for automating the application and/or analysis of culture devices or their handling.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит один или более резервуаров для доставки или восполнения (свежей или неиспользованной) текучей среды в устройство для отбора образцов. In some embodiments, the sampling device comprises one or more reservoirs for delivering or replenishing (fresh or unused) fluid to the sampling device.

В некоторых вариантах осуществления устройство для отбора образцов содержит один или более резервуаров для очистки, предназначенных для доставки очищающей текучей среды в устройство. In some embodiments, the sampling device comprises one or more cleaning reservoirs for delivering a cleaning fluid to the device.

Устройство для отбора образцов может быть полностью или частично автоматизированным. The sampling device may be fully or partially automated.

Устройство для отбора образцов содержит планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе. Для обеспечения передачи текучей среды между планшетом для культивирования клеток и планшетом для образцов второй насос может быть использован для выведения текучей среды из планшета для культивирования клеток в планшет для образцов. Второй насос может обеспечивать сообщение с планшетом для культивирования клеток путем подгонки канала к дополнительному удлинению второго насоса. Альтернативно второй канал может соединяться или сообщаться с (первым) каналом в планшете для культивирования клеток, как это показано на фиг. 8 посредством номера позиции 64. Второй канал может соединяться или сообщаться со вторым насосом, который выполнен с возможностью выведения текучей среды из лунок в планшет для культивирования клеток и в планшет для образцов. The sampling device contains a cell culture plate as described herein. In order to transfer fluid between the cell culture plate and the sample plate, a second pump may be used to transfer fluid from the cell culture plate to the sample plate. The second pump can communicate with the cell culture plate by fitting the conduit to an additional extension of the second pump. Alternatively, the second channel can be connected to or communicated with the (first) channel in the cell culture plate, as shown in FIG. 8 through reference number 64. The second conduit may be connected to or communicated with a second pump that is configured to draw fluid from the wells into the cell culture plate and into the sample plate.

Устройство для отбора образцов может дополнительно содержать резервуар для хранения текучей среды в устройстве, при этом указанный резервуар находится в сообщении по текучей среде с лунками. The sampling device may further comprise a fluid storage reservoir in the device, said reservoir being in fluid communication with the wells.

В определенных вариантах осуществления он может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный насос, приспособленный для обеспечения выведения текучей среды из резервуара с повторным заполнением лунок планшета для культивирования клеток и/или планшета для сбора образцов. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный насос приспособлен для повторного заполнения лунок планшета для культивирования клеток таким же объемом текучей среды, который отбирают в лунки планшета для сбора образцов. В определенных вариантах осуществления он дополнительно содержит дозатор, приспособленный для переноса текучей среды в лунки планшета для сбора образца. Один или более образцов в одной или более разных точках времени для последовательно расположенных лунок в планшете для культивирования клеток могут быть отобраны с целью проведения анализа. In certain embodiments, it may further comprise at least one additional pump adapted to allow fluid to be withdrawn from the reservoir to refill the wells of the cell culture plate and/or the sample collection plate. In certain embodiments, at least one additional pump is adapted to refill the wells of the cell culture plate with the same volume of fluid drawn into the wells of the sample collection plate. In certain embodiments, it further comprises a dispenser adapted to transfer fluid into the wells of the sample collection plate. One or more samples at one or more different time points for consecutive wells in the cell culture plate may be taken for analysis.

В определенных вариантах осуществления устройство для отбора образцов может содержать компьютеризованный контроллер, выполненный с возможностью автоматического управления функционированием устройства. В определенных вариантах осуществления оно может содержать средства для определения уровней текучей среды в устройстве. In certain embodiments, the sampling device may include a computerized controller configured to automatically control the operation of the device. In certain embodiments, it may include means for determining fluid levels in the device.

Конкретный неограничивающий пример устройства для отбора образцов, в которое может быть вставлен планшет для культивирования клеток и планшет для образцов, более подробно описан далее. На фигуре 8 изображено устройство 60 для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, в которое может быть вставлен планшета для культивирования клеток в конфигурации по настоящему изобретению и планшет для образцов. Устройство 60 для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии содержит первый резервуар 61, который содержит текучую среду, используемую для подачи текучей среды в устройство для отбора образцов с целью циркуляции в нем. Второй резервуар 75 может быть соединен с насосом 66a, таким как перистальтический насос, с помощью коннекторов 65. Между коннекторами 65 и насосом 66a можно использовать впускные клапаны 68a, такие как электроклапаны, для выбора того, какой резервуар использовать. Между насосом 66a и планшетом 62 для культивирования клеток могут быть встроены выпускные клапаны 68b для управления потоком текучей среды из насоса 66a в планшет 62 для культивирования клеток. Данная конфигурация позволяет точно управлять потоком и количеством текучей среды, доставляемой в планшет 62 для культивирования клеток. Жидкость циркулирует в планшете 62 для культивирования клеток, описанном в данном документе. Для доставки образцов текучей среды из планшета 62 для культивирования клеток в планшет 63 для образцов второй канал 64 можно соединяться или сообщаться с первым каналом 23 в планшете для культивирования клеток. Второй насос 66b может быть использован для перекачивания текучей среды из 62 планшета для культивирования клеток в планшет 63 для образцов. Текучая среда может передаваться в планшет 63 для образцов с помощью дозатора 67, такого как многоканальный дозатор. Дозатор 67 при необходимости может быть использован для передачи текучей среды из устройства для отбора образцов с целью проведения дополнительного анализа. Дозатор 67 может представлять собой автоматический дозатор, необязательно содержащий один или более датчиков 72 и необязательно один или более электрических двигателей 74, предназначенных для управления его функционированием. Может обеспечиваться горизонтальное перемещение дозатора 67, при этом текучая среда может перемещаться к последовательно расположенным лункам в планшете 63 для образцов. Показаны коннекторы 77. Также показан резервуар для удаления отходов 78. В определенных вариантах осуществления скорость потока может быть одинаковой во всех каналах. Каждый из используемых разных насосов может иметь свои собственные параметры накачивания. Далее более подробно описан дополнительный неограничивающий пример устройства для отбора образцов, в которое может быть вставлен планшет для культивирования клеток и планшет для образцов, которое показано на фигуре 10. В данном примере показаны три насоса. Насос 1 используется для повторного заполнения резервуара. Насос 2 используется для обеспечения циркуляции текучей среды в планшете. Насос 3 используется для отбора образцов. A specific, non-limiting example of a sampling device into which a cell culture plate and a sample plate can be inserted is described in more detail below. Figure 8 shows a cell culture fluid sampler 60 on impact into which a cell culture plate in the configuration of the present invention and a sample plate can be inserted. The exposure cell culture fluid sampler 60 includes a first reservoir 61 that contains a fluid used to supply fluid to the sampler to circulate therein. The second reservoir 75 may be connected to a pump 66a, such as a peristaltic pump, via connectors 65. Inlet valves 68a, such as electrovalves, may be used between connectors 65 and pump 66a to select which reservoir to use. Exhaust valves 68b may be incorporated between pump 66a and cell culture plate 62 to control the flow of fluid from pump 66a into cell culture plate 62. This configuration allows precise control of the flow and amount of fluid delivered to the cell culture plate 62. Fluid circulates in the cell culture plate 62 described herein. To deliver fluid samples from the cell culture plate 62 to the sample plate 63, the second channel 64 may be connected to or communicate with the first channel 23 in the cell culture plate. The second pump 66b can be used to transfer fluid from the cell culture plate 62 to the sample plate 63. The fluid may be transferred to the sample plate 63 using a dispenser 67 such as a multichannel dispenser. Dispenser 67 may be used to transfer fluid from the sampling device, if desired, for further analysis. The dispenser 67 may be an automatic dispenser, optionally including one or more sensors 72 and optionally one or more electric motors 74 for controlling its operation. The dispenser 67 can be horizontally moved, whereby the fluid can be moved to successive wells in the sample plate 63. Connectors 77 are shown. Waste disposal tank 78 is also shown. In certain embodiments, the flow rate may be the same in all channels. Each of the different pumps used may have its own inflation parameters. The following describes in more detail an additional non-limiting example of a sampling device into which a cell culture plate and a sample plate can be inserted, which is shown in figure 10. In this example, three pumps are shown. Pump 1 is used to refill the tank. Pump 2 is used to circulate the fluid in the tablet. Pump 3 is used for sampling.

Планшет 62 для культивирования клеток и планшет 63 для образцов могут иметь одинаковое количество рядов лунок или планшет 63 для образцов может иметь меньшее или большее количество рядов лунок. Образец отбирают из ряда всех лунок, содержащих текучую среду, в планшете 62 для культивирования клеток и доставляют в одну или более лунок планшета 63 для образцов. Множество аликвот одного и того же образца могут быть распределены во множество лунок планшета 63 для образцов, которые все, соответственно, расположены в одном и том же ряду. Или же множество образцов могут быть отобраны из ряда лунок, содержащих текучую среду, планшета 62 для культивирования клеток в различные временные точки или после воздействия различных средств и перенесены в планшет для образцов 63. Как правило, образец, отобранный из ряда лунок, содержащих текучую среду, планшета 62 для культивирования клеток будет перенесен в соответствующий ряд планшета 63 для образцов, за счет чего можно отслеживать перемещение образцов из планшета 62 для культивирования клеток в планшет 63 для образцов. В качестве примера образец, отобранный из ряда лунок, содержащих текучую среду, планшета 62 для культивирования клеток в ряду 1 будет перенесен в одну или более лунок планшета 63 для образцов в ряду 1. В качестве дополнительного примера образец, отобранный из ряда лунок, содержащих текучую среду, планшета 62 для культивирования клеток в ряду 2 будет перенесен в одну или более лунок планшета 63 для образцов в ряду 2 и т. д. The cell culture plate 62 and the sample plate 63 may have the same number of rows of wells, or the sample plate 63 may have fewer or more rows of wells. A sample is taken from a row of all fluid-containing wells in the cell culture plate 62 and delivered to one or more wells of the sample plate 63. Multiple aliquots of the same sample can be dispensed into multiple wells of the sample plate 63, which are all respectively arranged in the same row. Alternatively, a plurality of samples may be taken from a series of fluid wells of the cell culture plate 62 at different time points or after exposure to various agents and transferred to the sample plate 63. Typically, a sample taken from a series of fluid wells , the cell culture plate 62 will be transferred to the corresponding row of the sample plate 63, whereby the movement of samples from the cell culture plate 62 to the sample plate 63 can be monitored. As an example, a sample taken from a row of wells containing fluid of a cell culture plate 62 in row 1 will be transferred to one or more wells of a sample plate 63 in row 1. As a further example, a sample taken from a row of wells containing fluid medium, the 62 cell culture plate in row 2 will be transferred to one or more wells of the 63 sample plate in row 2, etc.

Параметры сбора образцов при необходимости могут быть заданы в пользовательском интерфейсе до начала проведения экспериментов.Sample collection parameters, if necessary, can be set in the user interface before the start of the experiments.

Устройство может быть использовано для различных областей применения, описанных в данном документе. Например, устройство может быть использовано для изучения влияния одного или более средств в ходе воздействия в режиме реального времени. В качестве дополнительного примера устройство может быть использовано для изучения кинетики воздействия одного или более средств в ходе воздействия в режиме реального времени.The device can be used for various applications described in this document. For example, the device can be used to study the effects of one or more agents during exposure in real time. As an additional example, the device can be used to study the kinetics of the action of one or more agents during exposure in real time.

В одном аспекте предусмотрен способ, например полностью или частично автоматизированный способ, предназначенный для отбора образцов среды для культивирования клеток, подвергшихся воздействию одного или более средств, включающий стадии (a) обеспечения устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии, описанного в данном документе; (b) приведения в контакт по меньшей мере одной из лунок со средой для культивирования клеток, содержащей клетки; (c) обеспечения циркуляции среды для культивирования клеток через лунки планшета для культивирования клеток; (d) воздействия на лунки планшета для культивирования клеток по меньшей мере одного средства; и (e) отбора образцов среды для культивирования клеток из планшета для культивирования клеток, где необязательно образцы среды для культивирования клеток отбирают в режиме реального времени в ходе воздействия средства. На стадии (d) лунки многолуночного планшета могут быть подвергнуты воздействию по меньшей мере одного средства в нескольких временных точках. Объем среды для культивирования клеток, отобранный на стадии (e), может составлять от приблизительно 50 до приблизительно 200 мкл. Способ может включать дополнительную стадию (f) определения влияния средства (средств) на отобранные в качестве образцов клетки. In one aspect, a method is provided, such as a fully or partially automated method, for collecting cell culture medium samples exposed to one or more agents, comprising the steps of (a) providing a cell culture fluid sampling device upon exposure described herein. document; (b) contacting at least one of the wells with a cell culture medium containing the cells; (c) circulating the cell culture medium through the wells of the cell culture plate; (d) exposing the wells of the cell culture plate to at least one agent; and (e) sampling the cell culture medium from the cell culture plate, where optionally the cell culture medium is sampled in real time during exposure to the agent. In step (d), the wells of the multiwell plate may be exposed to at least one agent at multiple time points. The volume of cell culture medium selected in step (e) may be from about 50 to about 200 µl. The method may include the additional step of (f) determining the effect of the agent(s) on the sampled cells.

Также раскрыто применение устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии для отбора образцов клеток из одной или более лунок планшета для культивирования клеток. Also disclosed is the use of an excitation cell culture fluid sampling device to sample cells from one or more wells of a cell culture plate.

Также раскрыто применение устройства для отбора образцов текучей среды для культивирования клеток при воздействии для отбора среды для культивирования клеток, подвергнутых влиянию одного или более средств из одной или более лунок планшета для культивирования клеток и скрининга клеток в среде для культивирования клеток для определения влияния одного или более средств на клетки.Also disclosed is the use of a cell culture fluid sampling device upon exposure to collect cell culture medium affected by one or more agents from one or more wells of a cell culture plate and screen cells in the cell culture medium to determine the effect of one or more funds for cells.

Скрининг Screening

Планшет для культивирования клеток или устройство для отбора образцов можно использовать в отборе образцов или скрининге необязательно в режиме реального времени. Влияние одного или более средств на клетки, содержащиеся в планшете для культивирования клеток, можно определить необязательно в режиме реального времени. Планшет для культивирования клеток и/или устройство для отбора образцов можно использовать, например, в разработке средств/лекарственных средств, определении характеристик средств/лекарственных средств, исследовании эффективности и исследовании токсичность и т. п. Такое исследование включает без ограничения оценку фармакологического эффекта, оценку канцерогенности, оценку характеристик средств для медицинской визуализации, оценку времени полужизни, оценку радиационной безопасности, исследование генотоксичности, исследование иммунотоксичности, исследование воздействия на репродуктивную систему и развитие эмбриона, оценку лекарственных взаимодействий/взаимодействий средств, оценку дозы, оценку поглощения, оценку метаболизма, исследования элиминации и т. п. Для определенных тестов можно использовать определенные типы клеток (например, гепатоциты для исследования гепатотоксичности, эпителиальные клетки проксимальных почечных канальцев для исследований нефротоксичности, клетки сосудистого эндотелия для исследования ангитоксичности, нейроны и клетки глии для исследования нейротоксичности, кардиомиоциты для исследования кардиотоксичности). The cell culture plate or sampling device can be used in sampling or screening, optionally in real time. The effect of one or more agents on the cells contained in the cell culture plate can optionally be determined in real time. The cell culture plate and/or sampling device can be used, for example, in drug/drug development, drug/drug characterization, efficacy study and toxicity study, etc. Such study includes, without limitation, pharmacological effect evaluation, evaluation carcinogenicity, medical imaging characterization, half-life assessment, radiation safety assessment, genotoxicity study, immunotoxicity study, reproductive and embryonic effects study, drug/drug interaction assessment, dose assessment, uptake assessment, metabolism assessment, elimination studies etc. Certain cell types may be used for certain tests (eg, hepatocytes for hepatotoxicity studies, proximal renal tubular epithelial cells for nephrotoxicity studies, vascular e endothelium for angitoxicity studies, neurons and glial cells for neurotoxicity studies, cardiomyocytes for cardiotoxicity studies).

В одном аспекте описан способ in vitro оценки реакции клетки или ткани на определенное средство, при этом способ включает: (i) приведение клетки или ткани, содержащейся в планшете для культивирования клеток или устройстве для отбора образцов, описанных в данном документе, в контакт с по меньшей мере одним средством и (ii) измерение одной или более реакций после контакта с по меньшей мере одним средством; где различие в одной или более реакциях до и после контакта с по меньшей мере одним средством указывает на то, что средство модулирует реакцию клетки или ткани. In one aspect, a method is described for evaluating the response of a cell or tissue to a particular agent in vitro , the method comprising: (i) bringing a cell or tissue contained in a cell culture plate or sampling device described herein into contact with a at least one agent and (ii) measuring one or more reactions after contact with at least one agent; where the difference in one or more reactions before and after contact with at least one agent indicates that the agent modulates the response of the cell or tissue.

В дополнительном аспекте описан способ in vitro оценки реакции двух или более клеток, тканей или органов на определенное средство, при этом способ включает: (i) приведение по меньшей мере одного из клеток, тканей или органов, описанных в данном документе, в контакт с по меньшей мере одним средством и (ii) измерение одной или более реакций в одной (одном) или более клетках, тканях или органах после контакта с по меньшей мере одним средством; где различие в одной или более реакциях в одной или более клетках до и после контакта с по меньшей мере одним средством указывает на то, что средство модулирует реакцию по меньшей мере одной клетки, ткани или одного органа. In a further aspect, a method is described for evaluating the response of two or more cells, tissues, or organs to a particular agent in vitro , the method comprising: (i) bringing at least one of the cells, tissues, or organs described herein into contact with at least one agent and (ii) measuring one or more reactions in one (one) or more cells, tissues or organs after contact with at least one agent; where the difference in one or more reactions in one or more cells before and after contact with at least one agent indicates that the agent modulates the response of at least one cell, tissue or one organ.

Соответственно, измеряют или определяют влияние или проникновение по меньшей мере одного средства в клетку или ткань. Соответственно, измеряют или определяют биоактивацию по меньшей мере одного средства в клетке или ткани. Соответственно, измеряют или определяют метаболизм по меньшей мере одного средства в клетке или ткани. Эти стадии можно проводить одновременно или последовательно относительно друг друга. Accordingly, the effect or penetration of at least one agent into a cell or tissue is measured or determined. Accordingly, the bioactivation of at least one agent in a cell or tissue is measured or determined. Accordingly, the metabolism of at least one agent in a cell or tissue is measured or determined. These stages can be carried out simultaneously or sequentially with respect to each other.

Влияние одного или более средств на проникновение такого средства, как аэрозоль, в одну (один) или более клеток, тканей или органов и его дополнительной биоактивации или метаболизма в другой клетке или ткани может быть определено с использованием способов, описанных в данном документе. The effect of one or more agents on the penetration of an agent, such as an aerosol, into one (one) or more cells, tissues or organs and its additional bioactivation or metabolism in another cell or tissue can be determined using the methods described herein.

Средство может быть добавлено в одну или более лунок планшета для культивирования клеток, описанного в данном документе, и/или оно может быть добавлено в канал планшета для культивирования клеток, а его влияние на культивируемую клетку или ткань можно отслеживать или определять. При необходимости средство также может быть добавлено в резервуар (резервуары). Примеры эффектов, которые можно измерять, включают поглощение кислорода, продуцирование диоксида углерода, жизнеспособность клеток, экспрессию белка, активность фермента, проникновение, функцию проницаемости барьера, продуцирование сурфактанта, реакцию на цитокины, функции транспортеров, экспрессию цитохрома P450, секрецию альбумина и т. п. The agent can be added to one or more wells of the cell culture plate described herein and/or it can be added to the channel of the cell culture plate, and its effect on the cultured cell or tissue can be monitored or determined. If necessary, the agent can also be added to the tank(s). Examples of effects that can be measured include oxygen uptake, carbon dioxide production, cell viability, protein expression, enzyme activity, permeation, barrier permeability function, surfactant production, cytokine response, transporter functions, cytochrome P450 expression, albumin secretion, etc. .

Одна или более лунок планшета для культивирования клеток может быть подвергнута влиянию аэрозоля, при этом его влияние на культивируемую клетку или ткань можно отслеживать или определять. Примеры эффектов, которые можно измерять, включают поглощение кислорода, продуцирование диоксида углерода, жизнеспособность клеток, экспрессию белка, активность фермента, проникновение, функцию проницаемости барьера, продуцирование сурфактанта, реакцию на цитокины, функции транспортеров, экспрессию цитохрома P450, секрецию альбумина и т. п. One or more wells of the cell culture plate can be exposed to the aerosol, and its effect on the cultured cell or tissue can be monitored or determined. Examples of effects that can be measured include oxygen uptake, carbon dioxide production, cell viability, protein expression, enzyme activity, permeation, barrier permeability function, surfactant production, cytokine response, transporter functions, cytochrome P450 expression, albumin secretion, etc. .

Параллельно можно проводить несколько анализов с разными концентрациями средства с получением различающейся реакции на разные концентрации. Как известно из уровня техники, в способе определения эффективной концентрации средства обычно используют диапазон концентраций, получаемый в результате разведений 1:10 или других разведений по логарифмической шкале. В случае необходимости концентрации можно дополнительно скорректировать посредством второй серии разведений. Как правило, одна из этих концентраций служит в качестве отрицательного контроля. Several assays can be run in parallel with different concentrations of the agent, with different responses to different concentrations. As is known in the art, a range of concentrations resulting from 1:10 dilutions or other dilutions on a logarithmic scale is typically used in a method for determining the effective concentration of an agent. If necessary, the concentrations can be further adjusted by means of a second series of dilutions. Typically, one of these concentrations serves as a negative control.

СредствоMeans

Средство может представлять собой любое представляющее интерес соединение и включает низкомолекулярные органические соединения, полипептиды, пептиды, относительно высокомолекулярные углеводы, полинуклеотиды, жирные кислоты и липиды, наночастицы, аэрозоль или один или более компонентов аэрозоля и т. п., лекарственное средство, токсин, патоген, антиген, антитело и малую молекулу и т. п. Средства можно подвергать скринингу по отдельности или в группах или комбинаторных библиотеках соединений. Средства можно получать из широкого разнообразия источников, в том числе из библиотек синтетических или встречающихся в природе соединений. Можно использовать библиотеки природных соединений в виде бактериальных, грибных, растительных и животных экстрактов. Природные или полученные синтетическим путем библиотеки и соединения, модифицированные посредством традиционных химических, физических и биохимических способов, можно использовать для получения комбинаторных библиотек. Известные фармакологические средства можно подвергать направленным или случайным химическим модификациям, таким как ацилирование, алкилирование, этерификация, превращение в кислотную форму, с получением структурных аналогов для скрининга. При скрининге с применением комбинаторной библиотеки можно подвергать скринингу большую библиотеку химически сходных или отличающихся средств. При комбинаторном скрининге количество обнаруженных хитов является пропорциональным количеству исследуемых средств. Большое количество соединений, которое может достигать нескольких тысяч тестируемых в день соединений, можно подвергнуть скринингу, в ходе которого можно использовать лабораторное автоматизированное оборудование и робототехнику. В уровне техники можно найти много примеров способов синтеза молекулярных библиотек. Низкомолекулярное органическое соединение включает соединение с молекулярной массой, составляющей менее приблизительно 5000, как правило, менее приблизительно 2500, как правило, менее приблизительно 2000, чаще менее приблизительно 1500, предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 1000. Низкомолекулярные органические соединения могут представлять собой биологические либо синтетические органические соединения. Атомы, присутствующие в низкомолекулярном органическом соединении, обычно расположены в группе, состоящей из атомов углерода, водорода, кислорода и азота, и могут включать атомы галогенов, бора, фосфора, селена и серы, если они представлены в фармацевтически приемлемой форме. Как правило, атомы кислорода, азота, серы или фосфора, если такие присутствуют, связаны с атомом углерода, или друг с другом с одним или более из них, или с атомом водорода с образованием различных функциональных групп, таких как, например, карбоновые кислоты, спирты, тиолы, карбоксамиды, карбаматы, сложные эфиры карбоновых кислот, амиды, простые эфиры, тиоэфиры, сложные тиоэфиры, фосфаты, фосфонаты, олефины, кетоны, амины, альдегиды и т. п. Низкомолекулярные органические соединения в качестве термина, используемого в данном документе, также включают низкомолекулярные пептиды, низкомолекулярные олигонуклеотиды, низкомолекулярные полисахариды, жирные кислоты, липиды и т. п., имеющие молекулярную массу, составляющую менее приблизительно 5000. Примеры фамацевтических средств описаны в The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition. Средство может представлять собой токсин.The agent can be any compound of interest and includes low molecular weight organic compounds, polypeptides, peptides, relatively high molecular weight carbohydrates, polynucleotides, fatty acids and lipids, nanoparticles, an aerosol or one or more components of an aerosol, etc., a drug, a toxin, a pathogen , antigen, antibody, and small molecule, and the like. Agents can be screened individually or in groups or combinatorial libraries of compounds. Funds can be obtained from a wide variety of sources, including libraries of synthetic or naturally occurring compounds. You can use libraries of natural compounds in the form of bacterial, fungal, plant and animal extracts. Natural or synthetically derived libraries and compounds modified by conventional chemical, physical, and biochemical methods can be used to generate combinatorial libraries. Known pharmacological agents can be subjected to targeted or random chemical modifications, such as acylation, alkylation, esterification, conversion to an acid form, to obtain structural analogues for screening. When screening using a combinatorial library, a large library of chemically similar or different agents can be screened. In combinatorial screening, the number of hits detected is proportional to the number of agents under study. A large number of compounds, which can reach several thousand tested compounds per day, can be screened, which can use laboratory automation equipment and robotics. Many examples of methods for synthesizing molecular libraries can be found in the prior art. The low molecular weight organic compound includes a compound with a molecular weight of less than about 5000, typically less than about 2500, typically less than about 2000, more often less than about 1500, preferably from about 100 to about 1000. Low molecular weight organic compounds can be biological or synthetic organic compounds. The atoms present in the low molecular weight organic compound are typically arranged in a group consisting of carbon, hydrogen, oxygen, and nitrogen atoms, and may include halogen, boron, phosphorus, selenium, and sulfur atoms when present in a pharmaceutically acceptable form. Typically, oxygen, nitrogen, sulfur or phosphorus atoms, if present, are bonded to a carbon atom, or to each other with one or more of them, or to a hydrogen atom to form various functional groups, such as, for example, carboxylic acids, alcohols, thiols, carboxamides, carbamates, carboxylic acid esters, amides, ethers, thioethers, thioesters, phosphates, phosphonates, olefins, ketones, amines, aldehydes, etc. Low molecular weight organic compounds as the term used in this document also include low molecular weight peptides, low molecular weight oligonucleotides, low molecular weight polysaccharides, fatty acids, lipids, and the like having a molecular weight of less than about 5000. Examples of pharmaceutical agents are described in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition. The agent may be a toxin.

Анализу можно подвергать средства в растворе и твердых образцах, которые можно растворять в подходящем растворителе. Средства в газообразной форме можно также подвергать анализу посредством воздействия на образцы газом в течение некоторого периода времени. Образцы, представляющие интерес, включают образцы окружающей среды, биологические образцы, производственные образцы, библиотеки соединений, а также синтетические и встречающиеся в природе соединения.The analysis can be subjected to means in solution and solid samples, which can be dissolved in a suitable solvent. Means in gaseous form can also be analyzed by exposing samples to gas for a period of time. Samples of interest include environmental samples, biological samples, manufacturing samples, compound libraries, and synthetic and naturally occurring compounds.

Можно подвергать скринингу полипептиды, которые имеют молекулярную массу, составляющую по меньшей мере приблизительно 5000, как правило, по меньшей мере приблизительно 10000. Тестируемые полипептиды, как правило, будут иметь молекулярную массу от приблизительно 5000 до приблизительно 5000000 или больше, как правило, будут иметь молекулярную массу от приблизительно 20000 до приблизительно 1000000. Можно рассматривать широкое разнообразие полипептидов, как, например, семейство полипептидов, имеющих сходные характерные структурные особенности, полипептидов, имеющих конкретные биологические функции, полипептидов, связанных с определенными микроорганизмами, в частности болезнетворными микроорганизмами. Такие полипептиды включают цитокины или интерлейкины, ферменты, протамины, гистоны, альбумины, иммуноглобулины, склерополипептиды, фосфополипептиды, мукополипептиды, хромополипептиды, липополипептиды, нуклеополипептиды, гликополипептиды, T-клеточные рецепторы, протеогликаны, соматотропин, пролактин, инсулин, пепcин, полипептиды, обнаруживаемые в плазме крови человека, факторы свертывания крови, факторы, определяющие группу крови, полипептидные гормоны, раковые антигены, тканеспецифические антигены, пептидные гормоны, маркеры алиментарного статуса, тканеспецифические антигены и синтетические пептиды, которые могут являться или не являться гликированными. You can screen for polypeptides that have a molecular weight of at least about 5,000, typically at least about 10,000. a molecular weight from about 20,000 to about 1,000,000. A wide variety of polypeptides can be considered, such as a family of polypeptides having similar structural characteristics, polypeptides having specific biological functions, polypeptides associated with certain microorganisms, in particular pathogens. Such polypeptides include cytokines or interleukins, enzymes, protamines, histones, albumins, immunoglobulins, scleropolypeptides, phosphopolypeptides, mucopolypeptides, chromopolypeptides, lipopolypeptides, nucleopolypeptides, glycopolypeptides, T-cell receptors, proteoglycans, somatotropin, prolactin, insulin, pepsin, polypeptides found in human plasma, coagulation factors, blood grouping factors, polypeptide hormones, cancer antigens, tissue-specific antigens, peptide hormones, nutritional status markers, tissue-specific antigens, and synthetic peptides that may or may not be glycated.

Полинуклеотиды можно подвергать скринингу. Тестируемый полинуклеотид может представлять собой природное соединение или синтетическое соединение. Полинуклеотиды включают олигонуклеотиды и состоят из природных нуклеотидов, таких как рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды, и их производных, хотя также рассматриваются неприродные миметики нуклеотидов, такие как 2'-модифицированные нуклеозиды, пептидные нуклеиновые кислоты и олигомерные нуклеозидфосфонаты. Сравнительно высокомолекулярные полинуклеотиды могут иметь от приблизительно 20 до приблизительно 5000000 или больше нуклеотидов. Polynucleotides can be screened. The test polynucleotide may be a natural compound or a synthetic compound. Polynucleotides include oligonucleotides and consist of natural nucleotides such as ribonucleotides and deoxyribonucleotides and their derivatives, although non-natural nucleotide mimetics such as 2'-modified nucleosides, peptide nucleic acids, and oligomeric nucleoside phosphonates are also contemplated. Relatively high molecular weight polynucleotides may have from about 20 to about 5,000,000 or more nucleotides.

Средство может представлять собой низкомолекулярную гидрофобную молекулу, такую как гидрофобную молекулу с молекулярной массой от 146 г/моль до 207 г/моль или от 146 г/моль до 176 г/моль, или органический растворитель, при условии, что органический растворитель не является галогенизированным органическим растворителем, или диметилсульфоксидом, или тетрагидрофураном. В одном варианте осуществления средство содержит алкалоид табака или состоит из него. В другом варианте осуществления средство представляет собой структуру формулы 1:The agent may be a low molecular weight hydrophobic molecule, such as a hydrophobic molecule with a molecular weight of 146 g/mol to 207 g/mol or 146 g/mol to 176 g/mol, or an organic solvent, provided that the organic solvent is not halogenated an organic solvent, or dimethyl sulfoxide, or tetrahydrofuran. In one embodiment, the agent contains or consists of a tobacco alkaloid. In another embodiment, the agent is a structure of formula 1:

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси; or a pharmaceutically acceptable salt thereof or mixtures thereof;

или более предпочтительно структуру формулы 2:or more preferably the structure of formula 2:

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси;or a pharmaceutically acceptable salt thereof or mixtures thereof;

при этом:wherein:

z равняется 0 или 1;z is 0 or 1;

R₁ представляет собой Н или C₁-C₇алкил;R ₁ is H or C ₁ -C ₇ alkyl;

R₂представляет собой H, =O или C₁-C₇алкил;R ₂ is H, =O or C ₁ -C ₇ alkyl;

R₃ представляет собой H, галоген или C₁-C₇алкил;R ₃ is H, halogen or C ₁ -C ₇ alkyl;

и пунктирной линией представлены либо and dotted line represent either

(a) одинарные связи;(a) single bonds;

(b) одна углерод-углеродная или углерод-азотная двойная связь и остальные одинарные связи; или(b) one carbon-carbon or carbon-nitrogen double bond and the remaining single bonds; or

(c) две конъюгированные двойные связи, независимо выбранные из углерод-азотной двойной связи и углерод-углеродной двойной связи, и остальные одинарные связи.(c) two conjugated double bonds independently selected from a carbon-nitrogen double bond and a carbon-carbon double bond, and the remaining single bonds.

Соответственно, средство формулы 2 представляет собой:Accordingly, the agent of formula 2 is:

,

или or

,

или ее фармацевтически приемлемую соль или их смеси.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or mixtures thereof.

,

илиor

,

Более предпочтительно средство формулы 1 или формулы 2 представляет собой алкалоид табака. More preferably, the formula 1 or formula 2 agent is a tobacco alkaloid.

Более предпочтительно средство формулы 1 или формулы 2 представляет собой никотин, анабазин, норникотин, анатабин, котинин, миосмин, или их фармацевтически приемлемую соль, или их смеси.More preferably, the formula 1 or formula 2 agent is nicotine, anabasine, nornicotine, anatabine, cotinine, myosmin, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or mixtures thereof.

Термин «C₁-C₇алкил» относится к прямой цепи и разветвленным насыщенным углеводородным группам, как правило, имеющим от 1 до 7 атомов углерода; более предпочтительно к C₁-C₆алкилу; более предпочтительно C₁-C₃алкилу. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, втор-бутил, изо-бутил, т-бутил, пент-1-ил, пент-2-ил, пент-3-ил, 3-метилбут-1-ил, 3-метилбут-2-ил, 2-метилбут-2-ил, 2,2,2-триметилэт-1-ил, н-гексил, н-гептил и т. п. Подходящей алкильной группой является метил.The term "C ₁ -C ₇ alkyl" refers to straight chain and branched saturated hydrocarbon groups typically having 1 to 7 carbon atoms; more preferably C ₁ -C ₆ alkyl; more preferably C ₁ -C ₃ alkyl. Examples of alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, iso-butyl, t-butyl, pent-1-yl, pent-2-yl, pent-3-yl, 3-methylbut-1-yl, 3-methylbut-2-yl, 2-methylbut-2-yl, 2,2,2-trimethylethyl-1-yl, n-hexyl, n-heptyl, etc. Suitable alkyl the group is methyl.

Термин «галоген» относится к F, Cl, Br или I. Подходящим галогеном является Cl.The term "halogen" refers to F, Cl, Br or I. A suitable halogen is Cl.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям, которые в объеме медицинской точки зрения являются подходящими для применения в контакте с тканями субъекта без проявления излишних токсичности, раздражения, аллергической реакции и т. п., соизмеримы с целесообразным соотношением польза/риск и являются эффективными для своего предполагаемого применения. Эти соли включают нетоксичные соли присоединения кислоты (в том числе двухосновные соли) и соли оснований. Если соединение или средство является катионным или имеет функциональную группу, которая может быть катионной (например, -NH₂ может представлять собой -NH₃ ⁺), то соль присоединения кислоты может быть образована с помощью соответствующего аниона. Примеры подходящих неорганических анионов включают без ограничения анионы, полученные из неорганических кислот хлористоводородной кислоты, азотной кислоты, азотистой кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, сернистой кислоты, бромистоводородной кислоты, йодистоводородной кислоты, фтористоводородной кислоты, фосфорной кислоты и фосфористых кислот. Примеры соответствующих органических анионов включают без ограничения анионы, полученные из следующих органических кислот: 2-ацетилоксибензойной, уксусной, аскорбиновой, аспарагиновой, бензойной, камфорсульфоновой, коричной, лимонной, этилендиаминтетрауксусной, этандисульфоновой, этансульфоновой, фумаровой, глюкгептоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гидроксималеиновой, гидроксинафталинкарбоновой, изэтиновой, молочной, лактобионовой, лауриновой, малеиновой, яблочной, метансульфоновой, слизевой, олеиновой, щавелевой, пальмитиновой, памоевой, пантотеновой, фенилуксусной, фенилсульфоновой, пропионовой, пировиноградной, салициловой, стеариновой, янтарной, сульфаниловой, винной, толуосульфоновой и валериановой. Примеры подходящих полимерных органических анионов включают без ограничения анионы, полученные из следующих полимерных кислот: дигалловой кислоты, карбоксиметилцеллюлозы. Такие соли включают ацетатные, адипатные, аспартатные, бензоатные, безилатные, бикарбонатные, карбонатные, бисульфатные, сульфатные, боратные, камзилатные, цитратные, цикламатные, эдизилатные, эзилатные, формиатные, фумаратные, глюцептатные, глюконатные, глюкуронатные, гексафторфосфонатные, гибензатные, гидроксихлоридные/хлоридные, гидроксибромидные/бромидные, гидроксийодидные/йодидные, изетионатные, лактатные, малатные, малеатные, малонатные, мезилатные, метилсульфонатные, нафтилатные, 2-напсилатные, никотинатные, нитратные, оротатные, оксалатные, пальмиатные, памоатные, фосфатные, гидрофосфатные, дигидрофосфатные, пироглутаматные, сахаратные, стеаратные, сукцинатные, таннатные, тартратные, тозилатные, трифторацетатные и ксинафоатные соли. Например, если соединение является анионным или имеет функциональную группу, которая может быть анионной (например, -COOH может представлять собой -COO^-, или -SO₂H может представлять собой -SO₂), то соль основания может быть образована с помощью соответствующего катиона. Примеры подходящих неорганических катионов включают без ограничения катионы металлов, такие как катионы щелочных или щелочно-земельных металлов, катионы аммония и замещенные аммоний-катионы, а также амины. Примеры подходящих катионов металлов включают натрий (Na⁺), калий (K⁺), магний (Mg²⁺), кальций (Ca²⁺), цинк (Zn²⁺) и алюминий (Al³⁺). Примеры подходящих органических катионов включают без ограничения ион аммония (т. е. NH4⁺) и замещенные аммоний-ионы (например, NH₃R⁺, NH₂R₂ ⁺, NHR₃ ⁺, NR₄ ⁺). Примеры некоторых подходящих замещенных аммоний-ионов представляют собой ионы, полученные из этиламина, диэтиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперазина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Пример традиционного иона четвертичного аммония представляет собой N(CH₃)₄ ⁺. Примеры подходящих аминов включают аргинин, N, N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтиламин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, глицин, лизин, N-метилглюкамин, оламин, 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол и прокаин. Обсуждение применимых солей присоединения кислот и солей оснований см. в S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci. (1977) 66:1-19; см. также Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (2011). Фармацевтически приемлемые соли могут быть получены с помощью различных способов. Например, можно провести реакцию соединения или средства с подходящей кислотой или основанием с получением требуемой соли. Также можно подвергнуть реакции предшественник соединения или средства с кислотой или основанием с удалением кислото- и щелоче-неустойчивой группы или с открытием лактоновой или лактамной группы предшественника. Кроме того, можно превратить соль соединения или средства в другую соль путем обработки соответствующими кислотой или основанием посредством приведения в контакт с ионообменной смолой. Затем после реакции можно выделить соль путем фильтрации, если она осаждается из раствора, или выпаривания с извлечением соли. Степень ионизации соли может варьировать от полностью ионизированной до практически неионизированной.The term "pharmaceutically acceptable salt" refers to salts that are medically suitable for use in contact with the tissues of a subject without causing undue toxicity, irritation, allergic reaction, etc., commensurate with a reasonable benefit/risk ratio, and are effective. for its intended application. These salts include non-toxic acid addition salts (including dibasic salts) and base salts. If the compound or agent is cationic or has a functional group that may be cationic (eg, -NH ₂ may be -NH ₃ ⁺ ), then an acid addition salt may be formed with the appropriate anion. Examples of suitable inorganic anions include, without limitation, anions derived from the inorganic acids hydrochloric acid, nitric acid, nitrous acid, phosphoric acid, sulfuric acid, sulphurous acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, hydrofluoric acid, phosphoric acid, and phosphorous acids. Examples of suitable organic anions include, but are not limited to, anions derived from the following organic acids: 2-acetyloxybenzoic, acetic, ascorbic, aspartic, benzoic, camphorsulfonic, cinnamic, citric, ethylenediaminetetraacetic, ethanedisulfonic, ethanesulfonic, fumaric, glucoheptonic, gluconic, glutamic, glycolic, hydroxymaleic , hydroxynaphthalenecarboxylic, isethic, lactic, lactobionic, lauric, maleic, malic, methanesulfonic, mucus, oleic, oxalic, palmitic, pamoic, pantothenic, phenylacetic, phenylsulfonic, propionic, pyruvic, salicylic, stearic, succinic, sulfanyl sulfonic, tartaric . Examples of suitable polymeric organic anions include, but are not limited to, anions derived from the following polymeric acids: digallic acid, carboxymethyl cellulose. Such salts include acetate, adipate, aspartate, benzoate, besylate, bicarbonate, carbonate, bisulfate, sulfate, borate, camsylate, citrate, cyclamate, edisylate, esylate, formate, fumarate, gluceptate, gluconate, glucuronate, hexafluorophosphonate, hibenza, hydroxychloride/chloride , hydroxybromide / bromide, hydroxyiodide / iodide, isethionate, lactate, malate, maleate, malonate, mesylate, methylsulfonate, naphthylate, 2-napsilate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, palmiate, pamoate, phosphate, hydrophosphate, dihydrophosphate, pyroglutamate , stearate, succinate, tannate, tartrate, tosylate, trifluoroacetate and xinafoate salts. For example, if a compound is anionic or has a functional group that may be anionic (for example, -COOH may be -COO ^- or -SO ₂ H may be -SO ₂ ), then the salt of the base may be formed with the appropriate cation . Examples of suitable inorganic cations include, without limitation, metal cations such as alkali or alkaline earth metal cations, ammonium and substituted ammonium cations, and amines. Examples of suitable metal cations include sodium (Na ⁺ ), potassium (K ⁺ ), magnesium (Mg ²⁺ ), calcium (Ca ²⁺ ), zinc (Zn ²⁺ ) and aluminum (Al ³⁺ ). Examples of suitable organic cations include, without limitation, the ammonium ion (ie, NH4 ⁺ ) and substituted ammonium ions (eg, NH ₃ R ⁺ , NH ₂ R ₂ ⁺ , NHR ₃ ⁺ , NR ₄ ⁺ ). Examples of some suitable substituted ammonium ions are those derived from ethylamine, diethylamine, dicyclohexylamine, triethylamine, butylamine, ethylenediamine, ethanolamine, diethanolamine, piperazine, benzylamine, phenylbenzylamine, choline, meglumine, and tromethamine, as well as amino acids such as lysine and arginine. . An example of a traditional quaternary ammonium ion is N(CH ₃ ) ₄ ⁺ . Examples of suitable amines include arginine, N,N'-dibenzylethylenediamine, chlorprocaine, choline, diethylamine, diethanolamine, dicyclohexylamine, ethylenediamine, glycine, lysine, N-methylglucamine, olamine, 2-amino-2-hydroxymethylpropane-1,3-diol, and procaine . For a discussion of applicable acid addition salts and base salts, see SM Berge et al., J. Pharm. sci. (1977) 66:1-19; see also Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (2011). Pharmaceutically acceptable salts can be obtained using various methods. For example, a compound or agent may be reacted with a suitable acid or base to form the desired salt. It is also possible to react the precursor of the compound or agent with an acid or base to remove the acid and alkali labile group or to open the lactone or lactam group of the precursor. In addition, it is possible to convert a salt of a compound or agent into another salt by treatment with an appropriate acid or base through contact with an ion exchange resin. The salt can then be isolated after the reaction by filtration if it precipitates out of solution, or by evaporation to recover the salt. The degree of ionization of the salt can vary from fully ionized to almost non-ionized.

В другом варианте осуществления средство представляет собой табак-специфичный нитрозамин (TSNA), который представляет собой химическое соединение, образованное с помощью нитрозирования вторичных и третичных аминов алкалоидов табака, в том числе никотина, норникотина, анатабина и анабазина. TSNA встречаются в табаке и табачных изделиях. Предпочтительно TSNA представляет собой N-нитрозоникотин (NNN), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK), N-нитрозоанабазин (NAB), N-нитрозоанатабин (NAT), 4-(метилнитрозамино)4-(3-пиридил)бутаналь (NNA), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанол (NNAL), 4-(метилнитрозамино)4-(3-пиридил)-1-бутанол (изо-NNAL) или 4-(метилнитрозамино)-4-(3-пиридил)-1-масляную кислоту (изо-NNAC), или их фармацевтически приемлемые соли, или их смеси. Более предпочтительно TSNA представляет собой 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK) или его фармацевтически приемлемую соль.In another embodiment, the agent is tobacco-specific nitrosamine (TSNA), which is a chemical compound formed by nitrosation of secondary and tertiary amines of tobacco alkaloids, including nicotine, nornicotine, anatabine, and anabasine. TSNAs are found in tobacco and tobacco products. Preferably TSNA is N-nitrosonicotine (NNN), 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), N-nitrosoanabasine (NAB), N-nitrosoanatabine (NAT), 4-(methylnitrosamino )4-(3-pyridyl)butanal (NNA), 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL), 4-(methylnitrosamino)4-(3-pyridyl)-1-butanol (iso-NNAL) or 4-(methylnitrosamino)-4-(3-pyridyl)-1-butyric acid (iso-NNAC), or their pharmaceutically acceptable salts, or mixtures thereof. More preferably, TSNA is 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте осуществления средство представляет собой органический растворитель, выбранный из насыщенных алифатических углеводородов (например, н-пентана, н-гексана, н-гептана, н-октана); ароматических углеводородов (например, бензола, толуола, ксилолов); алифатических спиртов (например, метанола, этанола, пропан-1-ола, пропан-2-ола, бутан-1-ола, 2-метилпропан-1-ола, бутан-2-ола, 2-метилпропан-2-ола, пентан-1-ола, 3-метилбутан-1-ола, гексан-1-ола, 2-метоксиэтанола, 2-этоксиэтанола, 2-бутоксиэтанола, 2-(2-метоксиэтокси)-этанола, 2-(2-этоксиэтокси)-этанола, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанола); простых эфиров, при условии, что простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан); кетонов (например, ацетона, метилэтилкетона); сложных эфиров (метилацетата, этилацетата); азотсодержащих растворителей (например, формамида, N, N-диметилформамида, ацетонитрила, N-метилпирролидона, пиридина, хинолина, нитробензола); серосодержащих растворителей, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид); и фосфорсодержащих растворителей (например, гексаметилфосфортриамида).In another embodiment, the agent is an organic solvent selected from saturated aliphatic hydrocarbons (eg, n-pentane, n-hexane, n-heptane, n-octane); aromatic hydrocarbons (eg benzene, toluene, xylenes); aliphatic alcohols (e.g. methanol, ethanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, 2-methylpropan-1-ol, butan-2-ol, 2-methylpropan-2-ol, pentane -1-ol, 3-methylbutan-1-ol, hexan-1-ol, 2-methoxyethanol, 2-ethoxyethanol, 2-butoxyethanol, 2-(2-methoxyethoxy)-ethanol, 2-(2-ethoxyethoxy)-ethanol , 2-(2-butoxyethoxy)-ethanol); ethers, provided that the ether is not tetrahydrofuran (e.g. diethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, 1,2-dimethoxyethane, 1,2-diethoxyethane, 1-methoxy-2-(2-methoxyethoxy )-ethane, 1-ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)ethane, 1,4-dioxane); ketones (eg acetone, methyl ethyl ketone); esters (methyl acetate, ethyl acetate); nitrogen-containing solvents (eg formamide, N,N-dimethylformamide, acetonitrile, N-methylpyrrolidone, pyridine, quinoline, nitrobenzene); sulfur-containing solvents, provided that the sulfur-containing solvent is not dimethyl sulfoxide (eg, carbon disulfide, tetrahydrothiophene-1,1-dioxide); and phosphorus-containing solvents (for example, hexamethylphosphoric triamide).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой насыщенный алифатический углеводород (например, н-пентан, н-гексан, н-гептан, н-октан).In one embodiment, the organic solvent is a saturated aliphatic hydrocarbon (eg, n-pentane, n-hexane, n-heptane, n-octane).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой ароматический углеводород (например, бензол, толуол, ксилолы).In one embodiment, the organic solvent is an aromatic hydrocarbon (eg, benzene, toluene, xylenes).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой алифатический спирт (например, метанол, этанол, пропан-1-ол, пропан-2-ол, бутан-1-ол, 2-метилпропан-1-ол, бутан-2-ол, 2-метилпропан-2-ол, пентан-1-ол, 3-метилбутан-1-ол, гексан-1-ол, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, 2-бутоксиэтанол, 2-(2-метоксиэтокси)-этанол, 2-(2-этоксиэтокси)-этанол, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанол). In one embodiment, the organic solvent is an aliphatic alcohol (e.g., methanol, ethanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, 2-methylpropan-1-ol, butan-2-ol, 2 -methylpropan-2-ol, pentan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol, hexan-1-ol, 2-methoxyethanol, 2-ethoxyethanol, 2-butoxyethanol, 2-(2-methoxyethoxy)-ethanol, 2 -(2-ethoxyethoxy)-ethanol, 2-(2-butoxyethoxy)-ethanol).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой простой эфир, при условии, что простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан). In one embodiment, the organic solvent is an ether, provided that the ether is not tetrahydrofuran (e.g., diethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, 1,2-dimethoxyethane, 1,2-diethoxyethane, 1- methoxy-2-(2-methoxyethoxy)-ethane, 1-ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)-ethane, 1,4-dioxane).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой кетон (например, ацетон, метилэтилкетон). In one embodiment, the organic solvent is a ketone (eg, acetone, methyl ethyl ketone).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой сложный эфир (метилацетат, этилацетат).In one embodiment, the organic solvent is an ester (methyl acetate, ethyl acetate).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой азотсодержащий растворитель (например, формамид, N, N-диметилформамид, ацетонитрил, N-метилпирролидон, пиридин, хинолин, нитробензол).In one embodiment, the organic solvent is a nitrogen containing solvent (eg, formamide, N,N-dimethylformamide, acetonitrile, N-methylpyrrolidone, pyridine, quinoline, nitrobenzene).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой серосодержащий растворитель, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид).In one embodiment, the organic solvent is a sulfur-containing solvent, provided that the sulfur-containing solvent is not dimethyl sulfoxide (eg, carbon disulfide, tetrahydrothiophene-1,1-dioxide).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой фосфорсодержащий растворитель (например, гексаметилфосфортриамид).В одном варианте осуществления средство представляет собой никотин или NNK или их комбинацию. In one embodiment, the organic solvent is a phosphorus-containing solvent (eg, hexamethylphosphorus triamide). In one embodiment, the agent is nicotine or NNK, or a combination thereof.

Одна или более переменных величин, которые можно измерить, включают поддающиеся количественному определению элементы клеток, субклеточный материал, субклеточные компоненты или клеточные продукты, в частности, элементы, которые можно точно измерить в высокопроизводительных аналитических системе или устройстве. Выходными данными могут являться признак, условие, состояние или функция любой клетки, клеточного компонента или клеточного продукта, в том числе жизнеспособность, дыхание, метаболизм, детерминанта клеточной поверхности, рецептор, белок или его конформационная, или посттрансляционная модификации, липид, углевод, органическая или неорганическая молекула, ДНК, РНК и т. п. или часть, полученная из такого клеточного компонента. Хотя переменная (переменные) величина (величины) может (могут) обеспечивать количественные считываемые данные, в некоторых случаях можно получить полуколичественный или качественный результат. Считываемые переменные величины могут включать, например, одиночное значение, или среднее значение, или медианное значение, или их дисперсию.One or more variables that can be measured include quantifiable cell elements, subcellular material, subcellular components, or cellular products, in particular elements that can be accurately measured in a high performance analytical system or device. The output may be a trait, condition, state, or function of any cell, cellular component, or cellular product, including viability, respiration, metabolism, cell surface determinant, receptor, protein, or conformational or post-translational modification, lipid, carbohydrate, organic, or an inorganic molecule, DNA, RNA, etc., or a portion derived from such a cellular component. While the variable(s) value(s) may provide quantitative readouts, in some cases a semi-quantitative or qualitative result may be obtained. The read variables may include, for example, a single value, or an average value, or a median value, or their variance.

Можно использовать разные способы для измерения переменной (переменных) величины (величин), чтобы определить реакцию клетки, ткани или органа на средство. Одним из способов измерения количества присутствующего средства является мечение средства поддающимся выявлению компонентом, который может быть флуоресцентным, люминесцентным, радиоактивным, ферментативно активным и т. п. Для мечения биомолекулы, структуры или типа клетки доступны флуоресцентные и люминесцентные компоненты. Иммунофлуоресцентные компоненты могут быть направлены на связывание не только с конкретными белками, но и также с конкретными конформациями, продуктами расщепления или сайтами для модификаций, такими как фосфорилировине. Отдельные пептиды и белки могут быть сконструированы для автофлуоресценции. Можно использовать методики иммунологических анализов, такие как иммуногистохимический анализ, радиоиммунологический анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), а также родственные неферментативные методики. В этих методиках используют определенные антитела в качестве репортерных молекул, которые являются особенно применимыми из-за их высокой степени специфичности прикрепления к одной молекулярной мишени. Клеточный ELISA или соответствующие неферментативные или флуоресцентные способы обеспечивают измерение параметров клеточной поверхности.You can use different methods to measure the variable (variables) value (s), to determine the response of the cell, tissue or organ to the agent. One way to measure the amount of an agent present is to label the agent with a detectable component, which can be fluorescent, luminescent, radioactive, enzymatically active, and the like. Fluorescent and luminescent components are available for labeling a biomolecule, structure, or cell type. Immunofluorescent components can be directed to bind not only to specific proteins, but also to specific conformations, cleavage products, or sites for modification, such as phosphorylin. Individual peptides and proteins can be designed for autofluorescence. Immunoassay techniques such as immunohistochemistry, radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as well as related non-enzymatic techniques can be used. These techniques use certain antibodies as reporter molecules, which are particularly useful because of their high degree of specificity for attachment to a single molecular target. Cellular ELISA or appropriate non-enzymatic or fluorescent methods provide a measurement of cell surface parameters.

Результаты скрининговых анализов можно сравнивать с результатами, полученными для эталонных соединений, кривых изменения концентрации, контролей и т. п. Средство может представлять собой аэрозоль, такой как дым или аэрозоль, полученный из дыма.The results of screening assays can be compared with those obtained for reference compounds, concentration curves, controls, etc. The agent may be an aerosol such as smoke or an aerosol derived from smoke.

Аэрозоль Spray can

Варианты осуществления настоящего изобретения можно использовать для изучения влияние аэрозоля на клетки, органы или ткани или проницаемость аэрозоля в клетки, органы или ткани. Аэрозоль может быть получен или образован посредством устройства, образующего аэрозоль. Курительные изделия и изделия для курения являются типами устройств, образующих аэрозоль. Примеры курительных изделий или изделий для курения включают без ограничения сигареты, сигариллы и сигары. В определенных устройствах, образующих аэрозоль, табачную композицию или другой материал, образующий аэрозоль, вместо сжигания нагревают с помощью одного или более электрических нагревательных элементов с получением аэрозоля. В другом типе нагреваемого устройства, образующего аэрозоль, аэрозоль образуется в результате передачи тепла от горючего топливного элемента или источника тепла к физически отделенному материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. Как правило, в нагреваемых курительных изделиях аэрозоль образуется в результате передачи тепла от источника тепла к физически отделенному субстрату или материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. При курении летучие соединения высвобождаются из материала, образующего аэрозоль, путем передачи тепла от источника тепла и захватываются воздухом, втягиваемым через курительное изделие. По мере охлаждения высвобождаемых соединений, они конденсируются с образованием аэрозоля, который вдыхается пользователем. Используемый в данном документе термин «материал, образующий аэрозоль» используется для описания материала, способного при нагревании высвобождать летучие соединения, которые могут образовывать аэрозоль. Материал, образующий аэрозоль, может быть растительного происхождения. Примеры материалов, образующих аэрозоль, включают без ограничения табачные композиции, виды табака, табачный экстракт, резаный табак, резаный наполнитель, сушеный табак, взорванный табак, гомогенизированный табак, восстановленный табак и виды трубочного табака. Материал, образующий аэрозоль, в качестве альтернативы может содержать материал нерастительного происхождения.Embodiments of the present invention can be used to study the effect of an aerosol on cells, organs, or tissues, or the permeability of an aerosol to cells, organs, or tissues. An aerosol can be produced or generated by an aerosol generating device. Smoking articles and smoking articles are types of aerosol generating devices. Examples of smoking or smoking articles include, without limitation, cigarettes, cigarillos, and cigars. In certain aerosol generating devices, the tobacco composition or other aerosol generating material is heated by one or more electrical heating elements to produce an aerosol instead of being burned. In another type of heated aerosol generating device, the aerosol is formed by transferring heat from a combustible fuel cell or heat source to a physically separated aerosol generating material that may be located in, around, or downstream of the heat source. Typically, in heated smoking articles, the aerosol is generated by the transfer of heat from the heat source to a physically separated aerosol-forming substrate or material, which may be located in, around, or downstream of the heat source. When smoking, volatile compounds are released from the aerosol-forming material by heat transfer from the heat source and are entrained in air drawn through the smoking article. As the released compounds cool, they condense to form an aerosol that is inhaled by the user. As used herein, the term "aerosol forming material" is used to describe a material that is capable of releasing volatile compounds when heated, which can form an aerosol. The material forming the aerosol may be of plant origin. Examples of aerosol forming materials include, without limitation, tobacco compositions, tobacco species, tobacco extract, cut tobacco, cut filler, dried tobacco, exploded tobacco, homogenized tobacco, reconstituted tobacco, and pipe tobacco species. The aerosol-forming material may alternatively comprise non-vegetable material.

Аэрозоль может присутствовать в виде дыма. Используемый в данном документе термин «дым» используют для описания типа аэрозоля, получаемого при сгорании, например, при курении сигарет, или при сгорании материала, образующего аэрозоль. Дым содержит различные средства, которые в случае необходимости могут быть предоставлены в виде отдельных соединений для исследования. Примеры таких средств включают сухое дисперсное вещество, не содержащее никотина, монооксид углерода, формальдегид, ацетальдегид, ацетон, акролеин, пропионовый альдегид, кротоновый альдегид, метилэтилкетон, бутиральдегид, бензо[a]пирен, фенол, м-крезол, o-крезол, п-крезол, катехол, резорцин, гидрохинон, 1,3-бутадиен, изопрен, акрилонитрил, бензол, толуол, пиридин, хинолин, стирол, N'-нитрозонорникотин (NNN), N′-нитрозоанатабин (NAT), N′-нитрозоанабазин (NAB), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (NNK), 1-аминонафталин, 2-аминонафталин, 3-аминобифенил, 4-аминобифенил, монооксид азота (NO), оксид азота (NOx), цианистоводородную кислоту, аммиак, мышьяк, кадмий, хром, свинец, никель, селен и ртуть. The aerosol may be present in the form of smoke. As used herein, the term "smoke" is used to describe the type of aerosol produced by combustion, such as smoking cigarettes, or by burning an aerosol-forming material. The smoke contains various agents, which, if necessary, can be provided in the form of separate compounds for research. Examples of such agents include nicotine free dry particulate matter, carbon monoxide, formaldehyde, acetaldehyde, acetone, acrolein, propionaldehyde, crotonaldehyde, methyl ethyl ketone, butyraldehyde, benzo[a]pyrene, phenol, m-cresol, o-cresol, p -cresol, catechol, resorcinol, hydroquinone, 1,3-butadiene, isoprene, acrylonitrile, benzene, toluene, pyridine, quinoline, styrene, N'-nitrosonornicotine (NNN), N'-nitrosoanatabine (NAT), N'-nitrosoanabasine ( NAB), 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), 1-aminonaphthalene, 2-aminonaphthalene, 3-aminobiphenyl, 4-aminobiphenyl, nitric monoxide (NO), nitric oxide (NOx ), hydrocyanic acid, ammonia, arsenic, cadmium, chromium, lead, nickel, selenium and mercury.

Планшет для культивирования клеток, описанный в данном документе, можно подвергать воздействию дыма в течение разной продолжительности времени. Дым можно доставлять с помощью модуля воздействия Vitrocell (см. Chem Cent J. (2014) 8(1):62). Можно использовать определенное количество затяжек на сигарету и определенное количество затяжек за минуту воздействия и варьировать количество сигарет для приспособления к времени воздействия. Эталонные сигареты, такие как эталонные сигареты 3R4F, можно использовать в качестве источника дыма и курить на курящем роботе в базовом соответствии с режимом курения, установленным Международной организацией по стандартизации (ISO 2000). The cell culture plate described herein can be exposed to smoke for varying lengths of time. Smoke can be delivered using a Vitrocell exposure module (see Chem Cent J. (2014) 8(1):62). You can use a certain number of puffs per cigarette and a certain number of puffs per minute of exposure, and vary the number of cigarettes to accommodate exposure time. Reference cigarettes, such as reference 3R4F cigarettes, can be used as a smoke source and smoked on a smoking robot in accordance with the basic smoking regimen established by the International Organization for Standardization (ISO 2000).

Обработка данных с помощью компьютера Data processing with a computer

Методики и устройства, описанные в данном документе, могут быть реализованы с помощью любого подходящего аппаратного оборудования, в том числе в программируемой вычислительной системы. Аналогично управление системой или устройством может контролироваться программируемым компьютерным устройством. Настоящее изобретение пригодно к эксплуатации во многих других средах или конфигурациях вычислительных систем общего или специального назначения. Примеры хорошо известных вычислительных систем, сред и/или конфигураций, которые могут быть подходящими для применения в данном документе, могут включать без ограничения персональные компьютеры, серверные компьютеры, переносные или компактные устройства, многопроцессорные системы, микропроцессорные системы, телевизионные приставки, программируемую потребительскую электронику, сетевые ПК, мини-компьютеры, универсальные вычислительные машины, распределенные вычислительные среды или облачные вычислительные среды, которые включают любые из перечисленных выше систем или устройств и т. п. Вычислительная среда может выполнять исполняемые компьютером инструкции, такие как программные модули. Как правило, программные модули включают процедуры, программы, объекты, компоненты, структуры данных и т. д., которые осуществляют конкретные задачи или реализуют конкретные типы абстрактных данных. Настоящее изобретение также можно использовать на практике в распределенных вычислительных средах, где задачи выполняются удаленными устройствами обработки, которые связаны через сеть передачи данных. В распределенной вычислительной среде программные модули могут быть расположены как на локальных, так и на удаленных компьютерных носителях данных, в том числе запоминающих устройствах.The techniques and devices described herein may be implemented using any suitable hardware, including a programmable computer system. Similarly, the control of the system or device may be controlled by a programmable computer device. The present invention is usable in many other general purpose or special purpose computing system environments or configurations. Examples of well-known computing systems, environments, and/or configurations that may be suitable for use herein may include, without limitation, personal computers, server computers, portable or compact devices, multiprocessor systems, microprocessor systems, set-top boxes, programmable consumer electronics, networked PCs, minicomputers, mainframes, distributed computing environments or cloud computing environments, which include any of the systems or devices listed above, and the like. The computing environment may execute computer-executable instructions such as program modules. Generally, program modules include procedures, programs, objects, components, data structures, etc. that perform specific tasks or implement specific abstract data types. The present invention may also be practiced in distributed computing environments where tasks are performed by remote processing devices that are linked through a data network. In a distributed computing environment, program modules may be located on both local and remote computer storage media, including memory storage devices.

Компоненты компьютера для применения в настоящем раскрытии могут включать без ограничения блок обработки, системную память и системную шину, которая соединяет различные компоненты системы, в том числе системную память, с блоком обработки. Системная шина может представлять собой любой из нескольких типов шинных структур, в том числе шину памяти или контроллер памяти, периферийную шину и локальную шину, использующих любую из множества шинных архитектур. В качестве примера, а не ограничения, такие архитектуры включают шину промышленной стандартной архитектуры (ISA), шину микроканальной архитектуры (MCA), шину усовершенствованной ISA (EISA), локальную шину ассоциации по стандартам в области видеоэлектроники (VESA) и шину взаимодействия периферийных компонентов (PCI), также известную под названием шина расширения.Computer components for use in the present disclosure may include, without limitation, a processing unit, system memory, and a system bus that connects various system components, including system memory, to the processing unit. A system bus may be any of several types of bus structures, including a memory bus or memory controller, a peripheral bus, and a local bus using any of a variety of bus architectures. By way of example, and not limitation, such architectures include the Industry Standard Architecture (ISA) bus, Microchannel Architecture (MCA) bus, Evolved ISA (EISA) bus, Video Electronics Standards Association (VESA) local bus, and Peripheral Component Interconnect bus ( PCI), also known as the expansion bus.

Обычно компьютер включает множество машиночитаемых носителей. Машиночитаемые носители могут представлять собой любые доступные носители, которые могут быть доступны для компьютера и включают как незапоминающие, так запоминающие среды, как съемные, так и не съемные носители. Typically, a computer includes a variety of computer-readable media. Computer-readable media can be any available media that can be accessed by a computer and includes both non-storage and storage media, removable and non-removable media.

Компьютер может функционировать в сетевой среде с помощью логических соединений с одним или более удаленными компьютерами, такими как удаленный компьютер. Удаленный компьютер может представлять собой персональный компьютер, сервер, роутер, сетевой ПК, одноранговое устройство или какой-либо другой сетевой модуль, и обычно включает многие или все из элементов, описанных выше, по отношению к компьютеру.A computer may operate in a networked environment through logical connections to one or more remote computers, such as a remote computer. The remote computer may be a personal computer, a server, a router, a network PC, a peer device, or some other network module, and typically includes many or all of the elements described above with respect to a computer.

PEEKPEEK

Как описано в данном документе, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что РЕЕК имеет преимущество в том, что он не является поглотителем низкомолекулярных гидрофобных молекул, таких как гидрофобные молекулы с молекулярной массой от 146 г/моль до 207 г/моль или от 146 г/моль до 176 г/моль, или органического растворителя, при условии, что органический растворитель не является галогенизированным органическим растворителем, или диметилсульфоксидом, или тетрагидрофураном. Устойчивость PEEK к поглощению малых гидрофобных молекул или органических растворителей является важным для предупреждения или подавления захвата этих молекул данным материалом. Таким образом, планшеты для культивирования клеток и другие такие устройства, используемые для культивирования клеток, которые изготовлены из полимера, содержащего PEEK или состоящего из него, являются особенно подходящими для тестирования влияния лекарственных средств или других средств на клетки или ткани, расположенные в планшете или другом таком устройстве, с целью устранения или ослабления риска изменения концентрации лекарственного средства или другого средства (или их метаболитов) материалом.As described herein, the present inventors unexpectedly found that PEEK has the advantage of not being a scavenger for low molecular weight hydrophobic molecules, such as hydrophobic molecules with molecular weights from 146 g/mol to 207 g/mol or from 146 g/mol. mol to 176 g/mol, or an organic solvent, provided that the organic solvent is not a halogenated organic solvent, or dimethyl sulfoxide, or tetrahydrofuran. The resistance of PEEK to the uptake of small hydrophobic molecules or organic solvents is important to prevent or suppress the uptake of these molecules by the material. Thus, cell culture plates and other such devices used for cell culture, which are made of a polymer containing or consisting of PEEK, are particularly suitable for testing the effect of drugs or other agents on cells or tissues located in the plate or other such a device, in order to eliminate or reduce the risk of changing the concentration of the drug or other drug (or their metabolites) by the material.

Соответственно, раскрыто устройство для культивирования клеток, содержащее PEEK или состоящее из него. Accordingly, a cell culture device comprising or consisting of PEEK is disclosed.

Соответственно, также раскрыто устройство для культивирования клеток, изготовленного (исключительно) из PEEK. Accordingly, a cell culture device made (only) from PEEK is also disclosed.

Также раскрыт планшет для культивирования клеток, содержащий PEEK или состоящий из него. Also disclosed is a cell culture plate containing or consisting of PEEK.

Также раскрыт планшет для культивирования клеток, изготовленный (исключительно) из PEEK. Also disclosed is a cell culture plate made (exclusively) from PEEK.

Также раскрыта лунка планшета для культивирования клеток, содержащая PEEK или состоящая из него. Also disclosed is a well of a cell culture plate containing or consisting of PEEK.

Также раскрыта лунка планшета для культивирования клеток, изготовленная (исключительно) из PEEK. Also disclosed is a well of a cell culture plate made (exclusively) from PEEK.

Также раскрыт многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащий PEEK или состоящий из него. Also disclosed is a multiwell cell culture plate containing or consisting of PEEK.

Также раскрыт многолуночный планшет для культивирования клеток, изготовленный (исключительно) из PEEK. Also disclosed is a multiwell cell culture plate made (exclusively) from PEEK.

Соответственно, устройство для культивирования клеток, планшет для культивирования клеток, лунка или многолуночный планшет для культивирования клеток содержат одну или более гидрофобных молекул, таких как одно или более низкомолекулярных гидрофобных средств. В одном варианте осуществления средство содержит алкалоид табака или состоит из него.Accordingly, the cell culture device, cell culture plate, well or multiwell cell culture plate contains one or more hydrophobic molecules, such as one or more low molecular weight hydrophobic agents. In one embodiment, the agent contains or consists of a tobacco alkaloid.

В одном варианте осуществления средство представляет собой структуру формулы 1:In one embodiment, the agent is a formula 1 structure:

,

при этом:wherein:

z равняется 0 или 1;z is 0 or 1;

(a) одинарные связи;(a) single bonds;

,

илиor

,

илиor

,

Термин «алкалоид табака» относится к алкалоиду, который происходит или получен из растения табака, а также может включать синтетический алкалоид табака. Термин «растение табака» относится к растению, принадлежащему к роду Nicotiana, в том числе N. rustica и N. tabacum (например, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают N. acaulis, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. x sanderae. Предпочтительно, растение табака представляет собой N. tabacum. The term "tobacco alkaloid" refers to an alkaloid that is derived from or derived from the tobacco plant, and may also include a synthetic tobacco alkaloid. The term "tobacco plant" refers to a plant belonging to the genus Nicotiana, including N. rustica and N. tabacum (for example, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 and Petico). Other species include N. acaulis, N. acuminata , N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii , N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis , N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, and N. x sanderae. Preferably, the tobacco plant is N. tabacum.

Соответственно, органический растворитель выбран из насыщенных алифатических углеводородов (например, н-пентана, н-гексана, н-гептана, н-октана); ароматических углеводородов (например, бензола, толуола, ксилолов); алифатических спиртов (например, метанола, этанола, пропан-1-ола, пропан-2-ола, бутан-1-ола, 2-метилпропан-1-ола, бутан-2-ола, 2-метилпропан-2-ола, пентан-1-ола, 3-метилбутан-1-ола, гексан-1-ола, 2-метоксиэтанола, 2-этоксиэтанола, 2-бутоксиэтанола, 2-(2-метоксиэтокси)-этанола, 2-(2-этоксиэтокси)-этанола, 2-(2-бутоксиэтокси)-этанола); простых эфиров, при условии, что простой эфир не представляет собой тетрагидрофуран (например, простой диэтиловый эфир, простой диизопропиловый эфир, простой дибутиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, 1,2-диэтоксиэтан, 1-метокси-2-(2-метоксиэтокси)-этан, 1-этокси-2-(2-этоксиэтокси)-этан, 1,4-диоксан); кетонов (например, ацетона, метилэтилкетона); сложных эфиров (метилацетата, этилацетата); азотсодержащих растворителей (например, формамида, N, N-диметилформамида, ацетонитрила, N-метилпирролидона, пиридина, хинолина, нитробензола); серосодержащих растворителей, при условии, что серосодержащий растворитель не представляет собой диметилсульфоксид (например, дисульфид углерода, тетрагидротиофен-1,1-диоксид); и фосфорсодержащих растворителей (например, гексаметилфосфортриамида).Accordingly, the organic solvent is selected from saturated aliphatic hydrocarbons (eg n-pentane, n-hexane, n-heptane, n-octane); aromatic hydrocarbons (eg benzene, toluene, xylenes); aliphatic alcohols (e.g. methanol, ethanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, 2-methylpropan-1-ol, butan-2-ol, 2-methylpropan-2-ol, pentane -1-ol, 3-methylbutan-1-ol, hexan-1-ol, 2-methoxyethanol, 2-ethoxyethanol, 2-butoxyethanol, 2-(2-methoxyethoxy)-ethanol, 2-(2-ethoxyethoxy)-ethanol , 2-(2-butoxyethoxy)-ethanol); ethers, provided that the ether is not tetrahydrofuran (e.g., diethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, 1,2-dimethoxyethane, 1,2-diethoxyethane, 1-methoxy-2-(2-methoxyethoxy )-ethane, 1-ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)ethane, 1,4-dioxane); ketones (eg acetone, methyl ethyl ketone); esters (methyl acetate, ethyl acetate); nitrogen-containing solvents (eg formamide, N,N-dimethylformamide, acetonitrile, N-methylpyrrolidone, pyridine, quinoline, nitrobenzene); sulfur-containing solvents, provided that the sulfur-containing solvent is not dimethyl sulfoxide (eg, carbon disulfide, tetrahydrothiophene-1,1-dioxide); and phosphorus-containing solvents (eg, hexamethylphosphoric triamide).

В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой фосфорсодержащий растворитель (например, гексаметилфосфорный триамид).In one embodiment, the organic solvent is a phosphorus-containing solvent (eg, hexamethylphosphoric triamide).

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой простой петролейный эфир. In one embodiment, the organic solvent is not petroleum ether.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой толуол.In one embodiment, the organic solvent is not toluene.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой ацетон.In one embodiment, the organic solvent is not acetone.

В одном варианте осуществления органический растворитель не представляет собой этанол. В одном варианте осуществления средство представляет собой никотин или NNK или их комбинацию.In one embodiment, the organic solvent is not ethanol. In one embodiment, the agent is nicotine or NNK, or a combination thereof.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий применение устройства для культивирования клеток, такого как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащий РЕЕК или состоящий из него. Also disclosed is a cell culture method comprising using a cell culture device such as a cell culture plate or a multiwell cell culture plate containing or consisting of PEEK.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий применение устройства для культивирования клеток, такого как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет, изготовленный (исключительно) из РЕЕК. Also disclosed is a cell culture method comprising the use of a cell culture device such as a cell culture plate or a multiwell plate made (only) of PEEK.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий: (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащий РЕЕК или состоящий из него, и (ii) культивирование клетки. Also disclosed is a method for culturing a cell, comprising: (i) bringing the cell into contact with a cell culture device such as a cell culture plate or multiwell cell culture plate containing or consisting of PEEK, and (ii) culturing the cell.

Также раскрыт способ культивирования клетки, включающий: (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, изготовленный (исключительно) из РЕЕК; и (ii) культивирование клетки. Also disclosed is a method for culturing a cell, comprising: (i) bringing the cell into contact with a cell culture device, such as a cell culture plate or a multiwell cell culture plate made (only) of PEEK; and (ii) culturing the cell.

Соответственно, способы, обсуждаемые выше, включают дополнительную стадию приведения клетки в контакт с устройством для культивирования клеток с одной (одним) или более малыми гидрофобными молекулами или органическими растворителями, обсуждаемыми выше. Accordingly, the methods discussed above include the additional step of bringing the cell into contact with a cell culture device with one (one) or more small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above.

Соответственно, устройство для культивирования клеток может содержать клетку, содержащуюся в среде для культивирования клеток, и необязательно одну (один) или более малых гидрофобных молекул или органических растворителей , обсуждаемых выше.Accordingly, the cell culture device may comprise a cell contained in a cell culture medium and optionally one (one) or more of the small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above.

Также раскрыт способ определения влияния (например, реакции на воздействие) одного или более средств на клетку, включающий: (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, содержащим PEEK или состоящим из него; (ii) воздействие на клетку одной или более малыми гидрофобными молекулами или органическими растворителями, обсуждаемыми выше; и (iii) определение влияния средства (средств) на клетку. Also disclosed is a method for determining the effect (e.g., response to exposure) of one or more agents on a cell, comprising: (i) bringing the cell into contact with a cell culture device, such as a cell culture plate or a multiwell cell culture plate containing PEEK or consisting of it; (ii) exposing the cell to one or more of the small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above; and (iii) determining the effect of the agent(s) on the cell.

Также раскрыт способ определения влияния (например, реакции на воздействие) одного или более средств на клетку, включающий (i) приведение клетки в контакт с устройством для культивирования клеток, таким как планшет для культивирования клеток или многолуночный планшет для культивирования клеток, изготовленным (исключительно) из PEEK; (ii) воздействие на клетку одной или более малыми гидрофобными молекулами или органическими растворителями, обсуждаемыми выше; и (iii) определение влияния; малых гидрофобных молекул или органических растворителей, обсуждаемых выше, на клетку. Also disclosed is a method for determining the effect (e.g., response to exposure) of one or more agents on a cell, comprising (i) bringing the cell into contact with a cell culture device, such as a cell culture plate or multiwell cell culture plate, made (solely) from PEEK; (ii) exposing the cell to one or more of the small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above; and (iii) determining impact; small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above per cell.

Также раскрыт способ снижения или ингибирования поглощения одной или более малых гидрофобных молекул или органических растворителей, обсуждаемых выше, в устройстве для культивирования клеток, включающий приведение средства в контакт с устройством для культивирования клеток, содержащим PEEK или состоящим из него. Also disclosed is a method of reducing or inhibiting uptake of one or more small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above in a cell culture device, comprising contacting the agent with a cell culture device containing or consisting of PEEK.

Также раскрыт способ применения устройства для культивирования клеток, содержащего PEEK или состоящего из него, для снижения или ингибирования поглощения одной или более малых гидрофобных молекул или органических растворителей, обсуждаемых выше, в устройстве для культивирования клеток. Also disclosed is a method of using a cell culture device comprising or consisting of PEEK to reduce or inhibit uptake of one or more small hydrophobic molecules or organic solvents discussed above in the cell culture device.

Настоящее изобретение дополнительно описано в примере ниже, который представлен для более подробного описания настоящего изобретения. Данный пример, в котором изложен предпочтительный вариант, предполагаемый в настоящее время для осуществления настоящего изобретения, предназначен для иллюстрации, но не для ограничения настоящего изобретения.The present invention is further described in the example below, which is provided to describe the present invention in more detail. This example, which sets forth the preferred embodiment currently contemplated for carrying out the present invention, is intended to illustrate and not limit the present invention.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1Example 1

Проводили исследования различных материалов, используемых для изготовления планшета. Один материал, используемый для планшета, PEEK, представляет собой прочный износостойкий пластмассовый полимер. PEEK является предпочтительным в исследовании лекарственных средств, поскольку он является непоглощающим в отличие, например, от широко используемого поли(диметилсилоксана) (PDMS), который, как известно, удерживает малые гидрофобные молекулы. Неожиданно было обнаружено, что PEEK не удерживает алкалоиды, такие как никотин, или табак-специфические нитрозамины, такие как NNK. Таким образом, планшет является подходящим для тестирования влияния данных средств на ткани, находящиеся в планшете, с целью устранения или снижения риска изменения концентрации средства, обусловленного материалом. Conducted research on various materials used to manufacture the tablet. One material used for the tablet, PEEK, is a tough, wear-resistant plastic polymer. PEEK is preferred in drug research because it is non-absorbent in contrast to, for example, the widely used poly(dimethylsiloxane) (PDMS) which is known to retain small hydrophobic molecules. It has surprisingly been found that PEEK does not retain alkaloids such as nicotine or tobacco-specific nitrosamines such as NNK. Thus, the tablet is suitable for testing the effect of these agents on the tissues contained in the tablet in order to eliminate or reduce the risk of changing the concentration of the agent due to the material.

Биосовместимость планшета PEEK тестировали с органотипическими моделями легкого и печени.The biocompatibility of the PEEK tablet was tested with lung and liver organotypic models.

Модель легкого состоит из нормальных клеток бронхиального эпителия человека (NHBE), высеянных на вставку Transwell™ и дополнительно культивируемых на поверхности раздела жидкость-воздух с целью обеспечения дифференцировки клеток в бокаловидные или реснитчатые эпителиальные клетки. Используя данные ткани можно продемонстрировать, что ткани легкого могут выживать в течение 4 недель на планшете PEEK, что демонстрируется посредством следующего.The lung model consists of normal human bronchial epithelial cells (NHBE) seeded on a Transwell™ insert and further cultured at an air-liquid interface to allow cell differentiation into goblet or ciliated epithelial cells. Using these tissues, it can be demonstrated that lung tissues can survive for 4 weeks on a PEEK plate, as demonstrated by the following.

Присутствие реснитчатых и бокаловидных эпителиальных клеток в аналогичной пропорции относительно пропорции, наблюдаемой в контрольных тканях (из той же самой партии), поддерживаемым в 24-луночных поликарбонатных планшетах в течение того же самого периода времени. The presence of ciliated and goblet epithelial cells in a similar proportion to that observed in control tissues (from the same lot) maintained in 24-well polycarbonate plates for the same period of time.

Сохраненная морфология. Гистологический анализ тканей, поддерживаемых в планшете, и тканей, поддерживаемых в 24-луночном планшете в течение 4 недель, подтвердил аналогичные результаты морфологического исследования. Толщина эпителия, статус дифференцировки и пропорция бокаловидных, базальных и реснитчатых эпителиальных клеток были аналогичными между тканями, поддерживаемыми в данных двух условиях. Saved morphology. Histological analysis of tissues maintained in the plate and tissues maintained in the 24-well plate for 4 weeks confirmed similar results of the morphological study. Epithelial thickness, differentiation status, and proportion of goblet, basal, and ciliated epithelial cells were similar between tissues maintained under these two conditions.

Стабильная концентрация АТФ. АТФ используется для ряда процессов, поэтому все метаболически активные клетки содержат АТФ, что делает измерения содержания АТФ эффективным показателем состояния тканей. Ткани, поддерживаемые в планшете в течение 4 недель, характеризовались аналогичным содержанием АТФ (на приблизительно 10% меньше АТФ) по сравнению с контрольными тканями. Stable concentration of ATP. ATP is used for a number of processes, so all metabolically active cells contain ATP, making ATP measurements an effective indicator of tissue health. The tissues maintained in the plate for 4 weeks had a similar ATP content (approximately 10% less ATP) than the control tissues.

Активное колебательное движение ресничек. Реснитчатые эпителиальные клетки не только присутствовали в той же самой пропорции, что и в контрольных тканях, но также у них по-прежнему осуществлялись колебательные движения ресничек с частой, аналогичной частоте, наблюдаемой в контрольных тканях. Active oscillatory movement of cilia. The ciliated epithelial cells were not only present in the same proportion as in the control tissues, but also they still carried out oscillatory movements of cilia with a frequency similar to that observed in the control tissues.

Более высокое трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER). TEER является мерой целостности плотных контактов в эпителиальных тканях, и, следовательно, является эффективным показателем целостности барьера. Ткани, поддерживаемые в планшете PEEK, характеризовались на 50% более высоким значение TEER, чем контрольные ткани. Higher transepithelial electrical resistance (TEER). TEER is a measure of the integrity of tight junctions in epithelial tissues and is therefore an effective indicator of barrier integrity. The tissues supported in the PEEK tablet had a 50% higher TEER value than the control tissues.

Сохраненная метаболическая емкость. Индуцируемость цитохромов P450 (CYP), ключевого показателя метаболической емкости, исследовали путем воздействия на ткани специфических индукторов ферментов CYP. Было выявлено, что через 48 часов после воздействия активность CYP 1A1 повышалась в 100 раз, что указывало на сохраненную метаболическую индуцируемость тканей, выращиваемых в планшете.preserved metabolic capacity. Cytochrome P450 (CYP) inducibility, a key indicator of metabolic capacity, was studied by exposing tissues to specific inducers of CYP enzymes. It was found that 48 hours after exposure, the activity of CYP 1A1 increased by 100 times, indicating that the metabolic inducibility of tissues grown in the plate was preserved.

В качестве модели печени использовали сфероиды, состоящие из клеток HepaRG™. Первые результаты, полученные при использовании данных сфероидов клеток печени после 4 недель культивирования в планшете PEEK, показали следующее.Spheroids consisting of HepaRG™ cells were used as a liver model. The first results obtained using these liver cell spheroids after 4 weeks of cultivation in a PEEK plate showed the following.

Стабильная секреция альбумина в циркулирующей среде. Альбумин является основным маркером функции печени. Было обнаружено, что в чипе альбумин был стабильным в течение 4 недель, при этом аналогичные концентрации наблюдали и в случае контрольных тканей.Stable secretion of albumin in the circulating medium. Albumin is the main marker of liver function. In the chip, albumin was found to be stable for 4 weeks, with similar concentrations observed in control tissues.

Сохраненная метаболическая емкость. Индуцируемость цитохромов P450 (CYP), ключевого показателя метаболической емкости, исследовали путем воздействия на ткани специфических индукторов ферментов CYP. Было выявлено, что через 48 часов после воздействия активность CYP 1A1 была аналогичной индуцируемости, наблюдаемой в контрольных тканях.preserved metabolic capacity. Cytochrome P450 (CYP) inducibility, a key indicator of metabolic capacity, was studied by exposing tissues to specific inducers of CYP enzymes. It was found that 48 hours after exposure, CYP 1A1 activity was similar to the inducibility observed in control tissues.

Тестировали поглощение никотина и NNK материалом PEEK, и выявили, что молекулы не захватывались материалом. На фигуре 22 показаны результаты в виде графика сравнения количества никотина, оставшегося в планшете PEEK и планшете PDMS через 8 часов после инкубации при 4°C. Видно, что приблизительно 100% никотина оставалось в планшете PEEK по сравнению лишь с приблизительно 35% в планшете PDMS. Таким образом, материалы, используемые для коммерчески доступных планшетов с использованием PDMS, будут захватывать малые гидрофобные молекулы.The uptake of nicotine and NNK by the PEEK material was tested and found that the molecules were not taken up by the material. Figure 22 shows the results as a graph comparing the amount of nicotine remaining in the PEEK tablet and the PDMS tablet 8 hours after incubation at 4°C. It can be seen that approximately 100% of nicotine remained in the PEEK tablet compared to only approximately 35% in the PDMS tablet. Thus, materials used for commercially available plates using PDMS will trap small hydrophobic molecules.

Пример 2Example 2

Чтобы избежать агломерации сфероидов, лунки, разработанные для сфероидов из клеток печени, приспосабливали таким образом, чтобы они содержали концентрические канавки на дне лунки. Целью данных канавок было создание пространственного разделения между тканями для предотвращения их агломерации или слияния друг с другом. Для демонстрации функции канавок 40 сфероиды, каждый из которых содержал приблизительно 25000 клеток, помещали либо в лунку с канавками, либо в лунку с плоским дном (т. е. без канавок). Через 5 дней сфероиды, присутствующие в лунке с плоским дном, начинали агломерировать друг с другом (см. фигуру 21A), образуя агрегаты. Этого не наблюдали в лунке с канавками (см. фигура 21B). Ткань, показанную на фигуре 21A (3 сфероида, агломерировавшиеся или слившиеся с образованием одного скопления), нельзя было использовать для дальнейших экспериментов, обычно проводимых на сфероидах, таких как измерение содержания АТФ, поскольку агломерация или слияние нескольких сфероидов негативно влияли на получаемые результаты. Культивируемая ткань, представленная на фигуре 21B, не подвергалась агломерации или слиянию и ее использовали для дальнейших экспериментов. To avoid spheroid agglomeration, wells designed for liver cell spheroids were adapted to contain concentric grooves at the bottom of the well. The purpose of these grooves was to create a spatial separation between tissues to prevent them from agglomerating or merging with each other. To demonstrate the function of the grooves 40, spheroids, each containing approximately 25,000 cells, were placed in either a grooved well or a flat-bottomed (ie, no groove) well. After 5 days, the spheroids present in the flat bottom well began to agglomerate with each other (see Figure 21A) forming aggregates. This was not observed in the grooved well (see Figure 21B). The tissue shown in Figure 21A (3 spheroids agglomerated or merged to form a single cluster) could not be used for further experiments normally performed on spheroids, such as measuring ATP content, because agglomeration or fusion of several spheroids adversely affected the results obtained. The cultured tissue shown in Figure 21B was not agglomerated or fused and was used for further experiments.

Любая публикация, цитируемая или описанная в данном документе, предоставляет соответствующую информацию, раскрытую до даты подачи настоящей заявки. Заявления, сделанные в данном документе, не должны истолковываться как признание того, что авторы настоящего изобретения не имеют оснований для его противопоставления как более ранним таким раскрытиям. Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение описано применительно к конкретным предпочтительным вариантам осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно неправомерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. В действительности, предполагается, что разные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, очевидные специалистам в областях генной инженерии, клеточной биологии и молекулярной биологии или в смежных областях, находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.Any publication cited or described in this document provides relevant information disclosed prior to the filing date of this application. The statements made in this document should not be construed as an admission that the authors of the present invention have no reason to contrast it with earlier such disclosures. All publications mentioned in the above description are incorporated into this document by reference. Various modifications and variations of the present invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the present invention. Although the present invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the claimed invention should not be unduly limited to such specific embodiments. In fact, various modifications of the described methods for carrying out the present invention, obvious to experts in the fields of genetic engineering, cell biology and molecular biology or related fields, are expected to be within the scope of the following claims.

Claims

1. Tablet for culturing cells containing: at least two consecutive wells; and a channel configured to communicate in fluid between the wells, where part of the channel includes a channel for transmitting fluid, configured to remove fluid towards or away from the first pump, and the other part of the channel includes a channel for communicating wells, made with the possibility of providing fluid communication with each of the at least two consecutive wells through holes in the wall of the well communication channel; where the channel is connected or communicates with the first pump through holes at each end of the channel, and where the first pump is configured to circulate fluid between at least two wells.

2. Tablet according to claim 1, wherein the channel diameter is 3 millimeters or less.

3. Tablet according to claim. 1, where the channel is a microfluidic channel.

4. Tablet according to any of the previous paragraphs, where the pump is a peristaltic pump, respectively, where the peristaltic pump contains a stepper motor or a brushless motor containing an encoder.

5. A plate according to any one of the preceding claims, wherein the channel is further configured to allow fluid to be withdrawn from the cell culture plate.

6. The plate of claim. 5, where the channel is connected to or communicates with the second pump, where the second pump is configured to provide removal of fluid from the cell culture plate.

7. Tablet according to any of the previous claims, where the motor of the first pump and/or the second pump is placed in a waterproof chamber.

8. A plate according to any one of the preceding claims, wherein the cell culture plate is provided with a lid.

9. A plate according to any one of the preceding claims, wherein the cell culture plate is incubatorable and/or where the cell culture plate is made of polyetheretherketone (PEEK).

10. The tablet according to any one of the preceding claims, wherein the channel is in fluid communication with the tablet containing one or more fluid-retaining reservoirs.

11. A plate according to any one of the preceding claims, wherein each well has a circumferential diameter of from about 6 mm to about 16 mm.

12. A device for culturing cells containing a tablet for culturing cells according to any one of paragraphs. 1-11 placed in an incubator.

13. A method for circulating a fluid between two or more consecutive wells, comprising:

(a) providing a cell culture plate according to any one of paragraphs. 1-11 or devices for culturing cells according to claim 12;

(b) contacting at least two wells with fluid; and

(c) circulating fluid through the wells of the cell culture plate.

14. A method for determining the effect of an agent on a cell, including the steps:

(b) contacting at least two wells of the cell culture plate with the cells and the cell culture medium;

(c) circulating the cell culture medium through the wells of the cell culture plate;

(d) exposing the wells of the cell culture plate to at least one agent;

(e) removing and examining a sample of cell culture medium from successive wells; and

(f) determining the effect of the agent on cells before and after exposure to at least one agent.

15. A device for sampling fluid for cell culture upon exposure, comprising:

(a) a cell culture plate according to any one of paragraphs. 6-11 and

(b) a sample plate comprising one or more wells for storing a plurality of samples, wherein the second pump is configured to cause fluid to be drawn from the cell culture plate to the sample plate.

16. The apparatus of claim 15, wherein the multichannel microdispenser is configured to provide fluid communication with the sample plate.

17. A method for sampling a cell culture medium exposed to one or more agents, comprising the steps of:

(a) providing a cell culture fluid sampling device upon exposure according to claim 15 or 16;

(b) contacting at least two wells with a cell culture medium containing the cells;

(d) exposing the wells of the cell culture plate to at least one agent; and

(e) sampling the cell culture medium from the cell culture plate, wherein the cell culture medium is optionally sampled one or more times in real time during exposure to the agent.