RU2774579C1 - Method for sterilizing acellular matrixes - Google Patents
Method for sterilizing acellular matrixes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2774579C1 RU2774579C1 RU2021133734A RU2021133734A RU2774579C1 RU 2774579 C1 RU2774579 C1 RU 2774579C1 RU 2021133734 A RU2021133734 A RU 2021133734A RU 2021133734 A RU2021133734 A RU 2021133734A RU 2774579 C1 RU2774579 C1 RU 2774579C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sterilization
- acellular
- peracetic acid
- acellular matrices
- deionized water
- Prior art date
Links
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 title claims abstract description 61
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 49
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 36
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 abstract description 17
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 abstract description 17
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 abstract description 17
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 8
- 238000011099 tissue engineering Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 8
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 6
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 5
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 5
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 5
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N oxane Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 3
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 3
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 3
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 3
- 210000002435 Tendons Anatomy 0.000 description 3
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 210000003932 Urinary Bladder Anatomy 0.000 description 3
- 230000001857 anti-mycotic Effects 0.000 description 3
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002808 Connective Tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102000013373 Fibrillar Collagens Human genes 0.000 description 2
- 108060002894 Fibrillar Collagens Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 210000003709 Heart Valves Anatomy 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 2
- 230000000271 cardiovascular Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000855 fungicidal Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 231100000803 sterility Toxicity 0.000 description 2
- SZIFAVKTNFCBPC-UHFFFAOYSA-N 2-Chloroethanol Chemical compound OCCCl SZIFAVKTNFCBPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 5-Sulfosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C1O YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000800 Allium ursinum Species 0.000 description 1
- 210000001264 Anterior Cruciate Ligament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002805 Bone Matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 Bone and Bones Anatomy 0.000 description 1
- 208000008787 Cardiovascular Disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003260 Chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 210000003238 Esophagus Anatomy 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Exidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast Growth Factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast Growth Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010073071 Hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 1
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000000578 Peripheral Nerves Anatomy 0.000 description 1
- 210000003102 Pulmonary Valve Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003437 Trachea Anatomy 0.000 description 1
- 231100000987 absorbed dose Toxicity 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 1
- -1 isopropyl alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000003253 viricidal Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно, к медицинским биотехнологиям и может быть использовано для стерилизации ацеллюлярных матриксов на основе нативного коллагена аллогенного и ксеногенного происхождения.SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely to medical biotechnologies and can be used for sterilization of acellular matrices based on native collagen of allogeneic and xenogenic origin.
Нативный фибриллярный коллаген является одной из составляющих соединительной ткани, которая широко представлена практически во всех органах человека и животных. Ацеллюлярные матриксы, по сути, представляют собой нативный фибриллярный компонент соединительной ткани человека или животных, полученный в ходе процесса децеллюляризации - удаления клеток, их компонентов и белков.Native fibrillar collagen is one of the constituents of connective tissue, which is widely represented in almost all organs of humans and animals. Acellular matrices, in fact, are a native fibrillar component of human or animal connective tissue, obtained during the process of decellularization - the removal of cells, their components and proteins.
В настоящее время получены ацеллюлярные матриксы из кожи, сердечных клапанов, печени, тонкой кишки, селезенки, легких, мочевого пузыря, почки, сухожилия и нервов.At present, acellular matrices have been obtained from the skin, heart valves, liver, small intestine, spleen, lungs, bladder, kidney, tendon, and nerves.
В стерильном и упакованном виде ацеллюлярные матриксы представляют собой новым поколением имплантируемых материалов для решения целого ряда клинических задач реконструктивно-восстановительной и пластической хирургии, урологии, гинекологии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии, косметологии.In a sterile and packaged form, acellular matrices represent a new generation of implantable materials for solving a number of clinical problems in reconstructive and plastic surgery, urology, gynecology, maxillofacial surgery and dentistry, and cosmetology.
Для имплантируемых изделий медицинского назначения на основе коллагена различного происхождения в настоящее время широко применяют различные виды стерилизации: ионизирующим излучением (γ-лучи, пучки электронов); газовую (этиленоксидом); плазменную (пероксидом водорода). Ввиду того, что нативные молекулы коллагена являются по своей организации белками, то, тот или иной способ стерилизации изделий на их основе приобретает множество ограничений. Нередко, перед финишной стерилизацией изделия медицинского назначения на основе нативного коллагена подвергают консервации путем химической/ферментативной сшивки их молекул, либо лиофилизации. Это позволяет не только увеличить срок хранения упакованных изделий, но и придать им большую устойчивость к воздействию ферментов, тем самым продляя сроки биорезорбции после имплантации, имеющих значение для достижения должного клинического эффекта.For implantable medical products based on collagen of various origins, various types of sterilization are currently widely used: ionizing radiation (γ-rays, electron beams); gas (ethylene oxide); plasma (hydrogen peroxide). Due to the fact that native collagen molecules are proteins in their organization, one or another method for sterilizing products based on them acquires many restrictions. Often, before final sterilization, medical products based on native collagen are subjected to conservation by chemical/enzymatic cross-linking of their molecules, or by lyophilization. This allows not only to increase the shelf life of packaged products, but also to give them greater resistance to enzymes, thereby prolonging the time of bioresorption after implantation, which is important for achieving the proper clinical effect.
Известно, что коллаген, как и любые другие белки являются термолабильными, поэтому повышение температуры от 41°С и выше в ходе стерилизации паром под повышенным давлением сопряжено с процессами их тепловой денатурации за счет изменения молекулярной структуры. Схожие изменения претерпевают фибриллы коллагена при действии ионизирующего излучения, при этом их выраженность находится в прямой зависимости от дозы ионизирующего излучения. Стерилизация потоком быстрых электронов является в большей степени деструктивной, чем гамма-излучение. В целом, степень повреждения коллагеновых фибрилл зависит от проникающей способности излучения, времени экспозиции и поглощенной дозы, что следует учитывать при выборе режимов стерилизации. Если радиационной стерилизации предшествует процесс лиофилизации, то это приводит к значительному снижению радиационной устойчивости коллагеновых фибрилл (Шангина О.Р. Сохранность структуры биоматериалов в зависимости от вида консервации и стерилизации // Морфология. Научно-теоретический медицинский журнал. Санкт-Петербург. - №5, том 124, 2003 г. - С. 82).It is known that collagen, like any other proteins, is thermolabile, therefore, an increase in temperature from 41°C and above during high-pressure steam sterilization is associated with the processes of their thermal denaturation due to changes in the molecular structure. Collagen fibrils undergo similar changes under the action of ionizing radiation, while their severity is directly dependent on the dose of ionizing radiation. Sterilization with a stream of fast electrons is more destructive than gamma radiation. In general, the degree of damage to collagen fibrils depends on the penetrating power of radiation, exposure time and absorbed dose, which should be taken into account when choosing sterilization modes. If radiation sterilization is preceded by the lyophilization process, then this leads to a significant decrease in the radiation resistance of collagen fibrils (Shangina O.R. Preservation of the structure of biomaterials depending on the type of conservation and sterilization // Morphology. Scientific and theoretical medical journal. St. Petersburg. - No. 5 , volume 124, 2003 - p. 82).
Применение газового метода стерилизации этиленоксидом для изделий медицинского назначения сопряжено с последующим обязательным определением остаточного этиленоксида, этиленхлоргидрина этиленгликоля на их поверхности. Безопасные концентрации этого вещества могут быть различными в зависимости от длительности контакта изделия с организмом человека (ГОСТ ISO 10993-7-2016 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 7. Остаточное содержание этиленоксида после стерилизации).The use of the gas method of sterilization with ethylene oxide for medical devices is associated with the subsequent mandatory determination of residual ethylene oxide, ethylene chlorohydrin, ethylene glycol on their surface. Safe concentrations of this substance may vary depending on the duration of contact of the device with the human body (GOST ISO 10993-7-2016 Medical devices. Evaluation of the biological effect of medical devices. Part 7. Residual content of ethylene oxide after sterilization).
Сравнительно недавно, определенное распространение получили методы плазменной (низкотемпературной) стерилизации пероксидом водорода. Последний, является мощным окислителем, а следовательно, эффективным, однако в условиях плазменного стерилизатора его воздействие реализуется в диапазоне температур 50°С-60°С.Relatively recently, methods of plasma (low-temperature) sterilization with hydrogen peroxide have gained some popularity. The latter is a powerful oxidizing agent and, therefore, effective, however, under the conditions of a plasma sterilizer, its effect is realized in the temperature range of 50°C-60°C.
Наиболее обоснованными методами стерилизации медицинских изделий на основе нативного фибриллярного коллагена следует признать химические способы, где в качестве стерилизующих агентов могут выступать антисептические вещества с бактерицидной, вирулицидной, фунгицидной активностью (этиловый и изопропиловый спирты, хлоргексидин, сульфосалициловая кислота, глутаровый альдегид, формальдегид, сангвиритрин и т.д.), антибиотики и фунгициды, а также их комбинации: Методические указания по стерилизации ксенобиопротезов раствором глутарового альдегида. Минздрав СССР, №28-6/26 от 19.09.1986 г.; Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», том 5, №11, 2004 г.; Матвейчук И.В., Сидельников Н.И., Литвинов Ю.В., Краснов В.В., Быков В.А., Розанов В.В. Способ получения костного имплантата на основе стерильного деминерализованного костного матрикса (патент RU №2679121, A61F 2/28, 06.02.2019); Костава В.Т., Анучина Н.М., Бакулева Н.П., Лютова И.Г., Кондратенко Ж.Е., Зеливянская М.В., Терещенкова И.А. Способ стерилизации и предимплантационного хранения биологических протезов из ксеногенной и аллогенной ткани для сердечно-сосудистой хирургии (патент RU №2291675, A61F 2/24, 20.01.2007); Кудрявцева Ю.А., Журавлева И.Ю., Леванова Р.Х., Барбараш Л.С., Гантимурова И.Л. Способ стерилизации и предимплантационного хранения биологических протезов для сердечно-сосудистой хирургии (патент RU №2357766, A61N 1/02, 10.06.2009). Для поддержания стерильности таких изделий широко применяют консерванты (парабены, глицерин и т.д.).The most reasonable methods for sterilizing medical devices based on native fibrillar collagen should be recognized as chemical methods, where antiseptic substances with bactericidal, virucidal, fungicidal activity (ethyl and isopropyl alcohols, chlorhexidine, sulfosalicylic acid, glutaraldehyde, formaldehyde, sanguirythrin and etc.), antibiotics and fungicides, as well as their combinations: Guidelines for the sterilization of xenobioprostheses with a solution of glutaraldehyde. Ministry of Health of the USSR, No. 28-6 / 26 of 19.09.1986; Bulletin of the NCSSH them. A.N. Bakuleva RAMS "Cardiovascular diseases", volume 5, No. 11, 2004; Matveychuk I.V., Sidelnikov N.I., Litvinov Yu.V., Krasnov V.V., Bykov V.A., Rozanov V.V. A method for obtaining a bone implant based on a sterile demineralized bone matrix (patent RU No. 2679121, A61F 2/28, 06.02.2019); Kostava V.T., Anuchina N.M., Bakuleva N.P., Lyutova I.G., Kondratenko Zh.E., Zelivyanskaya M.V., Tereshchenkova I.A. Method for sterilization and pre-implantation storage of biological prostheses from xenogenic and allogeneic tissue for cardiovascular surgery (patent RU No. 2291675, A61F 2/24, 20.01.2007); Kudryavtseva Yu.A., Zhuravleva I.Yu., Levanova R.Kh., Barbarash L.S., Gantimurova I.L. Method for sterilization and preimplantation storage of biological prostheses for cardiovascular surgery (patent RU No. 2357766, A61N 1/02, 10.06.2009). Preservatives (parabens, glycerin, etc.) are widely used to maintain the sterility of such products.
Независимо от выбора стерилизующего вещества суть всех способов сводится к погружению ацеллюлярных матриксов в стерилизующий раствор; экспозиции ацеллюлярных матриксов в нем в течение определенного времени при дополнительном воздействии одного или нескольких физических факторов (различные температуры; пониженное атмосферное давление); удалению стерилизующего раствора; подготовке к последующей консервации путем лиофилизации и/или криоконсервации (Савельев В.И. Способ стерилизации биологических тканей для трансплантации (патент RU, №2362589, A61L 2/16, 27.07.2009); Журавлева И.Ю. Биоцидная композиция для асептического хранения консервированного протезного материала из тканей животного происхождения (патент RU №2580621, A61L 2/16, 10.04.2016).Regardless of the choice of the sterilizing agent, the essence of all methods is to immerse acellular matrices in a sterilizing solution; exposure of acellular matrices in it for a certain time with additional exposure to one or more physical factors (different temperatures; low atmospheric pressure); removal of the sterilizing solution; preparation for subsequent preservation by lyophilization and / or cryopreservation (Saveliev V.I. Method for sterilizing biological tissues for transplantation (patent RU, No. 2362589, A61L 2/16, 27.07.2009); Zhuravleva I.Yu. prosthetic material from tissues of animal origin (patent RU No. 2580621, A61L 2/16, 10.04.2016).
Недостатками известных способов являются применение сложных составов стерилизующих растворов; необходимость длительной экспозиции ацеллюлярных матриксов, в том числе с соблюдением определенного температурного режима; наличие токсичности стерилизующего вещества или образуемых им промежуточных и/или конечных химических веществ; риски недостаточной широты спектра активности некоторых стерилизующих веществ, в частности относительно спорообразующих микроорганизмов, некоторых вирусов и плесневых грибов; необходимость постоянного мониторинга за спектром антибактериальной, антифунгицидной активности стерилизующих веществ с периодической заменой при развитии устойчивости микроорганизмов и плесневых грибов к их действию; сложная трехмерная природная конфигурация ацеллюлярных матриксов, включающая многочисленные поры, в том числе содержащих воздух, что затрудняет контакт стерилизующего раствора со всей его поверхностью.The disadvantages of the known methods are the use of complex compositions of sterilizing solutions; the need for long-term exposure of acellular matrices, including compliance with a certain temperature regime; the presence of toxicity of the sterilant or the intermediate and / or final chemicals formed by it; risks of insufficient breadth of the spectrum of activity of some sterilizing substances, in particular with respect to spore-forming microorganisms, some viruses and mold fungi; the need for constant monitoring of the spectrum of antibacterial, antifungal activity of sterilizing substances with periodic replacement in the development of resistance of microorganisms and mold fungi to their action; a complex three-dimensional natural configuration of acellular matrices, including numerous pores, including those containing air, which makes it difficult for the sterilizing solution to contact with its entire surface.
В последнее время для стерилизации ацеллюлярных матриксов на основе нативного коллагена и изделий из них применяется надуксусная кислота, которая, с одной стороны является низко стабильным соединением и обладает высокой кислотностью, с другой стороны разлагается с образованием нетоксичных продуктов, сначала - уксусной кислоты и пероксида водорода, а затем кислорода и воды. Надуксусная кислота является эффективной для уничтожения широкого спектра не только вегетативных форм грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе спорообразующих, а также всех известных вирусов и плесневых грибов.Recently, for the sterilization of acellular matrices based on native collagen and products made from them, peracetic acid is used, which, on the one hand, is a low-stable compound and has a high acidity, on the other hand, it decomposes with the formation of non-toxic products, first - acetic acid and hydrogen peroxide, and then oxygen and water. Peracetic acid is effective for the destruction of a wide range of not only vegetative forms of gram-positive and gram-negative microorganisms, including spore-forming, but also all known viruses and molds.
В литературе описаны способы применения надуксусной кислоты для стерилизации ацеллюлярных матриксов, полученных из:The literature describes methods of using peracetic acid to sterilize acellular matrices obtained from:
- сердечных клапанов (Luo J., Korossis S.A., Wilshaw S.-P., Jennings L.M., Fisher J., Ingham E. Development and characterization of acellular porcine pulmonary valve scaffolds for tissue engineering, Tissue engineering. Part. Accel. 2014; 20(21-22):2963-2974);- heart valves (Luo J., Korossis S.A., Wilshaw S.-P., Jennings L.M., Fisher J., Ingham E. Development and characterization of acellular porcine pulmonary valve scaffolds for tissue engineering, Tissue engineering. Part. Accel. 2014; 20(21-22):2963-2974);
- печени (Sun D., Liu Y., Wang H., Deng F., Zhang Y., Zhao S., Ma X., Wu H., Sun G. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int. J. Biol. Macromol. 2018; 109:1154-1163);- liver (Sun D., Liu Y., Wang H., Deng F., Zhang Y., Zhao S., Ma X., Wu H., Sun G. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells Int J Biol Macromol 2018 109:1154-1163);
- тонкой кишки (Gosztyla С, Ladd M.R., Werts A., Fulton W., Johnson В., Sodhi C, Hackam D.J. A comparison of sterilization techniques for production of decellularized intestine in mice, tissue engineering. Part C, Methods. 2020; 26(2):67-79);- small intestine (Gosztyla C, Ladd M.R., Werts A., Fulton W., Johnson B., Sodhi C, Hackam D.J. A comparison of sterilization techniques for production of decellularized intestine in mice, tissue engineering. Part C, Methods. 2020; 26(2):67-79);
- селезенки (Liu P., Tian В., Yang L., Zheng X., Zhang X., Li J., Liu X., Lv Y., Xiang J. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed. Mater. 2019; 14(2); - легких (Zvarova В., Uhl F.E., Uriarte J.J., Borg Z.D., Coffey A.L., Bonenfant N.R., Weiss D.J., Wagner D.E. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds, tissue engineering. Part C, Methods. 2016; 22(5):418 28);- spleens (Liu P., Tian B., Yang L., Zheng X., Zhang X., Li J., Liu X., Lv Y., Xiang J. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed. Mater. 2019; 14(2); - lungs (Zvarova V., Uhl F.E., Uriarte J.J., Borg Z.D., Coffey A.L., Bonenfant N.R., Weiss D.J., Wagner D.E. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds, tissue engineering Part C, Methods 2016;22(5):418 28);
- мочевого пузыря (O'Neill J.D., Freytes D.O., Anandappa A.J., Oliver J.A., Vunjak-Novakovic G.V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 2013;34(38):9830-9841);- bladder (O'Neill J.D., Freytes D.O., Anandappa A.J., Oliver J.A., Vunjak-Novakovic G.V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 2013;34(38) :9830-9841);
- почки (Moradi L., Mohammadi Jobania В., Jafarnezhad-Ansariha F., Ghorbani F., Esmaeil-Pour R., Majidi Zolbina M., Kajbafzadeh A.-M. Evaluation of different sterilization methods for decellularized kidney tissue. Tissue Cell. 2020;66:101396);- kidneys (Moradi L., Mohammadi Jobania B., Jafarnezhad-Ansariha F., Ghorbani F., Esmaeil-Pour R., Majidi Zolbina M., Kajbafzadeh A.-M. Evaluation of different sterilization methods for decellularized kidney tissue. Tissue Cell. 2020;66:101396);
- сухожилия (Jones G., Herbert A., Berry H., Edwards J.H., Fisher J., Ingham E. Decellularization and characterization of porcine superflexor tendon: a potential anterior cruciate ligament replacement, tissue engineering. Part. Accel. 2017;23(3-4): 124-134);- tendons (Jones G., Herbert A., Berry H., Edwards J.H., Fisher J., Ingham E. Decellularization and characterization of porcine superflexor tendon: a potential anterior cruciate ligament replacement, tissue engineering. Part. Accel. 2017;23 (3-4): 124-134);
- нервов (Sridharan R., Reilly R.B., Buckley C.T. Decellularized grafts with axially aligned channels for peripheral nerve regeneration. J Mech Behav Biomed Mater. 2015; 41: 124-35).- nerves (Sridharan R., Reilly R.B., Buckley C.T. Decellularized grafts with axially aligned channels for peripheral nerve regeneration. J Mech Behav Biomed Mater. 2015; 41: 124-35).
Наряду с изолированным применением надуксусной кислоты, предложена ее комбинация с этанолом для стерилизации ацеллюлярных матриксов, полученных из:Along with the isolated use of peracetic acid, its combination with ethanol for the sterilization of acellular matrices obtained from:
- кровеносных сосудов (Fercana G.R., Yemeni S., Billaud M., Hill J.C., VanRyzin P., Richards T.D., Sicari B.M., Johnson S.A., Badylak S.F., Campbell P.G., Gleason T.G., Phillippi J.A. Perivascular extracellular matrix hydrogels mimic native matrix microarchitecture and promote angiogenesis via basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 2017; 123:142-154);- blood vessels (Fercana G.R., Yemeni S., Billaud M., Hill J.C., VanRyzin P., Richards T.D., Sicari B.M., Johnson S.A., Badylak S.F., Campbell P.G., Gleason T.G., Phillippi J.A. Perivascular extracellular matrix hydrogels mimic native matrix microarchitecture and promote angiogenesis via basic fibroblast growth factor Biomaterials 2017;123:142-154);
- пищевода (Barnes C.A., Brison J., Michel R., Brown B.N., Castner D.G., Badylak S.F., Ratner B.D. The surface molecular functionality of decellularized extracellular matrices. Biomaterials. 2011; 32(1): 137-143);- esophagus (Barnes C.A., Brison J., Michel R., Brown B.N., Castner D.G., Badylak S.F., Ratner B.D. The surface molecular functionality of decellularized extracellular matrices. Biomaterials. 2011; 32(1): 137-143);
- печени (Hussein К.Н., Park K.M., Teotia P.K., Hong S.H., Yang S.R., Park S.M., Ahn C, Woo H.M. Sterilization using electrolyzed water highly retains the biological properties in tissue-engineered porcine liver scaffold. Int. J. Artif. Organs. 2013; 36(ll):781-792);- liver (Hussein K.N., Park K.M., Teotia P.K., Hong S.H., Yang S.R., Park S.M., Ahn C, Woo H.M. Sterilization using electrolyzed water highly retains the biological properties in tissue-engineered porcine liver scaffold. Int. J. Artif Organs 2013;36(ll):781-792);
- тонкой кишки (Luo J.-C, Chen W., Chen X.-H., Qin T.-W., Huang Y.-C, Xie H.-Q., Li X.-Q., Qian Z.-Y., Yang Z.-M. A multi-step method for preparation of porcine small intestinal submucosa (SIS) Biomaterials. 2011; 32(3):706-713);- small intestine (Luo J.-C, Chen W., Chen X.-H., Qin T.-W., Huang Y.-C, Xie H.-Q., Li X.-Q., Qian Z .-Y., Yang Z.-M. A multi-step method for preparation of porcine small intestinal submucosa (SIS) Biomaterials 2011;32(3):706-713);
- трахеи (Kutten J.C., McGovern D., Hobson СМ., Luffy S.A., Nieponice A., Tobita K., Francis R.J., Reynolds S.D., Isenberg J.S., Gilbert T.W. Decellularized tracheal extracellular matrix supports epithelial migration, differentiation, and function, Tissue engineering. Part. Accel. 2015; 21(1-2):75- 84);- trachea (Kutten J.C., McGovern D., Hobson CM., Luffy S.A., Nieponice A., Tobita K., Francis R.J., Reynolds S.D., Isenberg J.S., Gilbert T.W. Decellularized tracheal extracellular matrix supports epithelial migration, differentiation, and function, Tissue engineering Part Accel 2015;21(1-2):75-84);
- легкого (Bonenfant N.R., Sokocevic D., Wagner D.E., Borg Z.D., Lathrop M.J., Lam Y.W., Deng В., Desarno M.J., Ashikaga Т., Loi R., Weiss D.J. The effects of storage and sterilization on de-cellularized and re-cellularized whole lung. Biomaterials. 2013; 34(13):3231-3245);- lung (Bonenfant N.R., Sokocevic D., Wagner D.E., Borg Z.D., Lathrop M.J., Lam Y.W., Deng B., Desarno M.J., Ashikaga T., Loi R., Weiss D.J. The effects of storage and sterilization on de-cellularized and re-cellularized whole lung Biomaterials 2013;34(13):3231-3245);
- мочевого пузыря (Liu Y., Bharadwaj S., Lee S.J., Atala A., Zhang Y. Optimization of a natural collagen scaffold to aid cell-matrix penetration for urologic tissue engineering. Biomaterials. 2009; 30(23-24):3865-3873);- bladder (Liu Y., Bharadwaj S., Lee S.J., Atala A., Zhang Y. Optimization of a natural collagen scaffold to aid cell-matrix penetration for urologic tissue engineering. Biomaterials. 2009; 30(23-24): 3865-3873);
- почки (Poornejad N., Nielsen J.J., Morris R.J., Gassman J.R., Reynolds P.R., Roeder B.L., Cook A.D. Comparison of four decontamination treatments on porcine renal decellularized extracellular matrix structure, composition, and support of human renal cortical tubular epithelium cells. J. Biomater. Appl. 2016; 30(8):1154-1167);- kidneys Biomater Appl 2016;30(8):1154-1167);
- селезенки (Xiang J., Zheng X., Liu P., Yang L., Dong D., Wu W., Liu X., Li J., Lv Y. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 2016; 12(3):128-142);- spleens (Xiang J., Zheng X., Liu P., Yang L., Dong D., Wu W., Liu X., Li J., Lv Y. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells Organogenesis 2016;12(3):128-142);
- нервов (Crapo P.M., Medberry C.J., Reing J.E., Tottey S., van der Merwe Y., Jones K.E., Badylak S.F. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 2012; 33(13):3539-3547).- nerves (Crapo P.M., Medberry C.J., Reing J.E., Tottey S., van der Merwe Y., Jones K.E., Badylak S.F. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 2012; 33(13):3539-3547) .
Суть всех предложенных способов заключается в предварительном (для ряда способов) погружении матриксов в коктейль, состоящий из смеси антибиотика и антимикотика; перекладывании матриксов в предварительно подготовленный раствор надуксусной кислоты с концентрацией 0,05% или 0,08% или 0,2% или 0,5% или 1% или 1,5%, с добавлением (не во всех случаях) 4,0%) или 4,8% раствора этанола; экспозиции матриксов в стерилизующем растворе в течение 50 минут или 2 часов или 3 часов или 4 часов или 24 часов при температуре 4°С или комнатной температуре или 37°С; последующим промыванием деионизированной водой или фосфатно-солевым раствором с доведением рН 7,2-7,4 и лиофилизацией или криоконсервацией в финале.The essence of all the proposed methods is the preliminary (for a number of methods) immersion of matrices in a cocktail consisting of a mixture of an antibiotic and an antimycotic; transferring matrices to a pre-prepared solution of peracetic acid with a concentration of 0.05% or 0.08% or 0.2% or 0.5% or 1% or 1.5%, with the addition (not in all cases) of 4.0% ) or 4.8% ethanol solution; exposure of matrices in sterilizing solution for 50 minutes or 2 hours or 3 hours or 4 hours or 24 hours at 4°C or room temperature or 37°C; followed by rinsing with deionized water or phosphate-brine solution with pH adjustment to 7.2-7.4 and lyophilization or cryopreservation in the final.
Недостатками предложенных способов является наличие этапа (для ряда способов) обработки ацеллюлярных матриксов антибиотиками и антимикотиками, что удлиняет процесс производства и предусматривает обязательные мероприятия по мониторингу спектра активности применяемых антибиотиков и антимикотиков. Добавление в стерилизующий раствор наряду с надуксусной кислотой этанола способствует частичной сшивке нативных молекул коллагена, что изменяет не только физические свойства ацеллюлярных матриксов, но и их биосовместимость. Погружение ацеллюлярных матриксов в стерилизующий раствор с последующей экспозицией является недостаточной мерой, вследствие сложной трехмерной организации их структуры с множеством пор, в том числе содержащих воздух, который препятствует эффективному и полному взаимодействию стерилизующего вещества с его поверхностью.The disadvantages of the proposed methods is the presence of a stage (for a number of methods) of treating acellular matrices with antibiotics and antimycotics, which lengthens the production process and provides for mandatory measures to monitor the spectrum of activity of antibiotics and antimycotics used. The addition of ethanol to the sterilizing solution, along with peracetic acid, promotes partial cross-linking of native collagen molecules, which changes not only the physical properties of acellular matrices, but also their biocompatibility. Immersion of acellular matrices in a sterilizing solution with subsequent exposure is an insufficient measure, due to the complex three-dimensional organization of their structure with many pores, including those containing air, which prevents the effective and complete interaction of the sterilizing substance with its surface.
Проведя анализ существующих способов стерилизации ацеллюлярных матриксов, автор не выбрал ни один из них в качестве прототипа.After analyzing the existing methods for sterilizing acellular matrices, the author did not choose any of them as a prototype.
Задачей изобретения является получение стерильного биосовместимого ацеллюлярного матрикса с сохраненной нативной структурой, образующего его коллагена.The objective of the invention is to obtain a sterile biocompatible acellular matrix with a preserved native structure of the collagen that forms it.
Технический результат предлагаемого способа заключается в возможности стерилизации ацеллюлярного матрикса в относительно короткие сроки без нарушения нативной молекулярной структуры коллагена.The technical result of the proposed method lies in the possibility of sterilizing the acellular matrix in a relatively short time without disturbing the native molecular structure of collagen.
Указанный технический результат достигается тем, что ацеллюлярные матриксы погружают во флакон для стерилизации, добавляют стерилизующий раствор 0,5% надуксусной кислоты в соотношении к ацеллюлярным матриксам 1:4. Устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 150 движений в минуту на 60 минут при комнатной температуре. После чего стерилизующий раствор сливают и заливают деионизированную воду в том же соотношении, затем флакон для стерилизации устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 250 движений в минуту на 12 часов при комнатной температуре; по истечении времени процедуру промывки ацеллюлярных матриксов деионизированной водой повторяют при тех же условиях. По истечении времени деионизированную воду из флакона для стерилизации сливают, а в промывных водах определяют остаточное содержание надуксусной кислоты и пероксида водорода. При отсутствии остатков надуксусной кислоты и продуктов ее распада в виде пероксида водорода ацеллюлярные матриксы промывают стерильным фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2 в соотношении 1:4 при помощи шейкера в режиме работы платформы 250 движений в минуту в течение 12 часов при комнатной температуре. При обнаружении остаточных количеств надуксусной кислоты и пероксида водорода процедуру промывки деионизированной водой повторяют до полного их удаления. Фасовку стерильных ацеллюлярных матриксов осуществляют в индивидуальную стерильную тару, содержащую предварительно подготовленный стерильный и разведенный в 9 раз фосфатно-солевой раствор с рН 7,2-7,4, соблюдая при фасовке соотношение ацеллюлярный матрикс - фосфатно-солевой раствор 1:2. Все работы выполняют в ламинарном боксе не ниже второго класса с защитой продукта.The specified technical result is achieved by the fact that the acellular matrices are immersed in a vial for sterilization, a sterilizing solution of 0.5% peracetic acid is added in a ratio of 1:4 to the acellular matrices. Installed on the shaker and run it in the operating mode of the platform 150 movements per minute for 60 minutes at room temperature. After that, the sterilizing solution is drained and deionized water is poured in the same ratio, then the vial for sterilization is placed on a shaker and launched in the platform mode of 250 movements per minute for 12 hours at room temperature; after the time has elapsed, the procedure for washing the acellular matrices with deionized water is repeated under the same conditions. After the time has elapsed, deionized water is drained from the sterilization vial, and the residual content of peracetic acid and hydrogen peroxide is determined in the wash water. In the absence of peracetic acid residues and its decomposition products in the form of hydrogen peroxide, the acellular matrices are washed with a sterile phosphate-buffered saline solution with a pH of 7.2 in a ratio of 1:4 using a shaker in the platform mode of 250 movements per minute for 12 hours at room temperature . If residual amounts of peracetic acid and hydrogen peroxide are detected, the washing procedure with deionized water is repeated until they are completely removed. Packing of sterile acellular matrices is carried out in an individual sterile container containing a pre-prepared sterile and diluted 9 times phosphate-saline solution with a pH of 7.2-7.4, observing the ratio of acellular matrix - phosphate-saline solution 1:2 during packaging. All work is carried out in a laminar flow hood not lower than the second class with product protection.
Физический фактор в виде удара и встряхивания, создаваемый платформой шейкера, обеспечивает эффективное проникновение надуксусной кислоты и полное взаимодействие с поверхностями ацеллюлярных матриксов. Контроль остаточного содержания надуксусной кислоты и продуктов ее распада в виде пероксида водорода позволяет регулировать число отмывок ацеллюлярных матриксов при полном удалении продуктов ее распада, тем самым сокращая время агрессивного воздействия образующегося пероксида водорода на молекулярную структуру ацеллюлярных матриксов, представленную нативным коллагеном.The physical factor in the form of shock and shaking created by the shaker platform ensures effective penetration of peracetic acid and full interaction with the surfaces of acellular matrices. The control of the residual content of peracetic acid and its decomposition products in the form of hydrogen peroxide makes it possible to regulate the number of washings of acellular matrices with the complete removal of its decomposition products, thereby reducing the time of aggressive action of the resulting hydrogen peroxide on the molecular structure of acellular matrices represented by native collagen.
Стерилизуемые и консервируемые в фосфатно-солевой буферной системе с рН 7,2-7,4 ацеллюлярные матриксы готовы к применению, так как в клинике нет необходимости их предварительной регидратации, как это требуют лиофилизированные. Это делает возможным применение ацеллюлярных матриксов сразу после вскрытия и извлечения их из первичной упаковки совместно с персонифицированными продуктами на базе клеток и крови человека. Такие ацеллюлярные матриксы полностью готовы для процесса сокультивирования, протекающего в жидких средах с различными клетками in vitro при создании ткане-инженерных конструкций и прототипов органов.Sterilized and preserved in a phosphate-buffered saline system with a pH of 7.2-7.4, acellular matrices are ready for use, since there is no need for their preliminary rehydration in the clinic, as is required by lyophilized ones. This makes it possible to use acellular matrices immediately after opening and removing them from the primary packaging together with personalized products based on human cells and blood. Such acellular matrices are completely ready for the process of co-cultivation in liquid media with various cells in vitro when creating tissue-engineering structures and organ prototypes.
Для каждой партии ацеллюлярных матриксов, подвергнутых стерилизации раствором надуксусной кислоты, были проведены исследования на присутствие жизнеспособных микроорганизмов в стерилизующем растворе, в консервирующем растворе, представленном разведенным фосфатно-солевым буфером и в готовых продуктах.For each batch of acellular matrices sterilized with a peracetic acid solution, studies were carried out for the presence of viable microorganisms in the sterilizing solution, in the preservative solution represented by diluted phosphate-buffered saline, and in the finished products.
Контроль стерильности ацеллюлярных матриксов осуществляли путем посевов в тиогликолевую среду и в среду Сабуро, после чего их инкубировали при температуре 32-35°С и 20-22°С в течение 14 суток. По истечении времени признаков роста микроорганизмов не были обнаружены.The sterility of acellular matrices was controlled by inoculation in thioglycol medium and Sabouraud medium, after which they were incubated at 32–35°C and 20–22°C for 14 days. After the time had elapsed, no signs of microorganism growth were found.
Также проводилась оценка молекулярной структуры стерильных ацеллюлярных матриксов при помощи метода электрофореза. Для этого образцы стерильных матриксов помещали в стеклянные пробирки, содержащие 2% SDS с 5% меркаптоэтанола и инкубировали в водяной бане при 100°С в течении 5 минут. Стандарты молекулярной массы (Sigma-Aldrich) обрабатывали аналогично. После чего центрифугировали элюат в течение 10 минут при 3 тыс.об./мин и наносили на гель. Электрофоретическое разделение вели в фосфатной буферной системе в течении 7 часов. После окончания электрофореза гели извлекали и окрашивали Кумасси и дифференцировали 7% уксусной кислотой.The molecular structure of sterile acellular matrices was also evaluated using the electrophoresis method. For this, samples of sterile matrices were placed in glass tubes containing 2% SDS with 5% mercaptoethanol and incubated in a water bath at 100°C for 5 minutes. Molecular weight standards (Sigma-Aldrich) were treated similarly. After that, the eluate was centrifuged for 10 minutes at 3 thousand rpm and applied to the gel. Electrophoretic separation was carried out in a phosphate buffer system for 7 hours. After the end of electrophoresis, the gels were removed and stained with Coomassie and differentiated with 7% acetic acid.
В исследуемых образцах, так же, как и в нативных, отчетливо визуализировали фракции в зонах коллагенов (α-цепи - 130 кДа, димеры - 260 кДа), а также фракции в зоне молекулярных масс более 80 кДа. Таким образом, процесс химической стерилизации надуксусной кислотой позволил сохранить нативную структуру коллагена, входящего в состав матрикса.In the studied samples, as well as in native ones, fractions in the collagen zones (α-chains - 130 kDa, dimers - 260 kDa), as well as fractions in the zone of molecular weights over 80 kDa, were clearly visualized. Thus, the process of chemical sterilization with peracetic acid made it possible to preserve the native structure of collagen, which is part of the matrix.
На практике способ стерилизации ацеллюлярных матриксов осуществляют следующим образом. Полученные ацеллюлярные матриксы из различных органов и тканей человека или животных погружают во флакон для стерилизации, добавляют 0,5% стерилизующего раствора надуксусной кислоты в соотношении к ацеллюлярным матриксам 1:4 и неплотно завинчивают крышкой. Перемещают флакон для стерилизации с ацеллюлярными матриксами на шейкер, запускают его в режиме работы платформы 150 движений в минуту на 60 минут при комнатной температуре. После чего стерилизующий раствор во флаконе для стерилизации заменяют на деионизированную воду в том же объеме, а флакон для стерилизации неплотно завинчивают крышкой и устанавливают на шейкер и запускают его в режиме работы платформы 250 движений в минуту на 12 часов при комнатной температуре. По истечении времени процедуру промывки ацеллюлярных матриксов деионизированной водой повторяют, при этом, повторную промывку осуществляют при тех же условиях. По истечении времени деионизированную воду из флакона для стерилизации сливают, а в промывных водах определяют остаточное содержание надуксусной кислоты и пероксида водорода. При отсутствии надуксусной кислоты и продуктов ее распада в виде пероксида водорода, переходят к промывке ацеллюлярных матриксов стерильным фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,2 в соотношении 1:4 при помощи шейкера в режиме работы платформы 250 движений в минуту в течение 12 часов при комнатной температуре. При обнаружении остаточных количеств надуксусной кислоты и пероксида водорода, процедуру промывки деионизированной водой повторяют до полного удаления продуктов распада надуксусной кислоты. Далее осуществляют фасовку стерильных ацеллюлярных матриксов в индивидуальную стерильную тару, содержащую предварительно подготовленный стерильный и разведенный в 9 раз фосфатно-солевой раствор с рН 7,2-7,4, соблюдая при фасовке соотношение ацеллюлярный матрикс - раствор 1:2.In practice, the method of sterilization of acellular matrices is carried out as follows. The resulting acellular matrices from various organs and tissues of a human or animal are immersed in a sterilization vial, 0.5% sterilizing solution of peracetic acid is added in a ratio of 1:4 to acellular matrices, and the lid is screwed loosely. Move the vial for sterilization with acellular matrices to the shaker, start it in the operating mode of the platform 150 movements per minute for 60 minutes at room temperature. After that, the sterilizing solution in the sterilization vial is replaced with deionized water in the same volume, and the sterilization vial is loosely screwed with a lid and placed on a shaker and run in the platform mode of 250 movements per minute for 12 hours at room temperature. After the time has elapsed, the procedure for washing the acellular matrices with deionized water is repeated, while the repeated washing is carried out under the same conditions. After the time has elapsed, deionized water is drained from the sterilization vial, and the residual content of peracetic acid and hydrogen peroxide is determined in the wash water. In the absence of peracetic acid and its decomposition products in the form of hydrogen peroxide, they proceed to washing the acellular matrices with a sterile phosphate-buffered saline solution with a pH of 7.2 in a ratio of 1: 4 using a shaker in the platform operating mode of 250 movements per minute for 12 hours at room temperature. If residual amounts of peracetic acid and hydrogen peroxide are detected, the washing procedure with deionized water is repeated until the decomposition products of peracetic acid are completely removed. Next, sterile acellular matrices are packed into an individual sterile container containing a pre-prepared sterile and 9-fold diluted phosphate-saline solution with a pH of 7.2-7.4, observing the ratio acellular matrix - solution 1:2 during packaging.
Способ может применяться при производстве изделий медицинского назначения, источником сырья для которых служат ткани и органы животных и человека.The method can be used in the production of medical products, the source of raw materials for which are tissues and organs of animals and humans.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2774579C1 true RU2774579C1 (en) | 2022-06-21 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1087756A1 (en) * | 1998-06-19 | 2001-04-04 | Lifecell Corporation | Particulate acellular tissue matrix |
| US6933326B1 (en) * | 1998-06-19 | 2005-08-23 | Lifecell Coporation | Particulate acellular tissue matrix |
| RU2362589C1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-27 | Федеральное государственное учреждение "Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (ФГУ "РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росмедтехнологий") | Way of sterilisation of biological tissues for transplantation |
| RU2627844C1 (en) * | 2016-10-24 | 2017-08-14 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Ниармедик Плюс" | Method for obtaining suspensional form of a ruled decellularized extracellular matrix |
| RU2716577C1 (en) * | 2019-05-17 | 2020-03-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Method of producing tissue-specific matrix for tissue engineering of cartilage |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1087756A1 (en) * | 1998-06-19 | 2001-04-04 | Lifecell Corporation | Particulate acellular tissue matrix |
| US6933326B1 (en) * | 1998-06-19 | 2005-08-23 | Lifecell Coporation | Particulate acellular tissue matrix |
| RU2362589C1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-27 | Федеральное государственное учреждение "Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (ФГУ "РНИИТО им. Р.Р. Вредена Росмедтехнологий") | Way of sterilisation of biological tissues for transplantation |
| RU2627844C1 (en) * | 2016-10-24 | 2017-08-14 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Ниармедик Плюс" | Method for obtaining suspensional form of a ruled decellularized extracellular matrix |
| RU2716577C1 (en) * | 2019-05-17 | 2020-03-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Method of producing tissue-specific matrix for tissue engineering of cartilage |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Пономарева Ю. В. и др. Морфология и патология. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ТРЕХМЕРНОГО БИОАКТИВНОГО КАРКАСА С ЗАДАННЫМИ СВОЙСТВАМИ НА ОСНОВЕ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОЙ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ КОСТНОЙ ТКАНИ // Вестник медицинского института "Реавиз". 2020, N3, с. 5-14. Старцева О.И., Синельников М.Е., Бабаева Ю.В., Трущенкова В.В. Децеллюляризация органов и тканей. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2019;8:59-62. Севастьянов В.И. Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины. Регенеративная медицина и клеточные технологии. том XVI N 3-2014, с. 93-108. Воробьев К.А. и др. Современные способы обработки и стерилизации аллогенных костных тканей (обзор литературы). Травматология и ортопедия России. 2017;23(3):134-147. Chan LK, Leung VY, Tarn V, Lu WW, Sze KY, Cheung KM. Decellularized bovine intervertebral disc as a natural scaffold for xenogenic cell studies. Acta Biomater. 2013; 9(2): 5262-5272. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bernhardt et al. | Improved sterilization of sensitive biomaterials with supercritical carbon dioxide at low temperature | |
| Matuska et al. | The effect of terminal sterilization on structural and biophysical properties of a decellularized collagen‐based scaffold; implications for stem cell adhesion | |
| US20200353126A1 (en) | Sterilization Process | |
| Moradi et al. | Evaluation of different sterilization methods for decellularized kidney tissue | |
| US6121041A (en) | Use of microorganisms for decellularizing bioprosthetic tissue | |
| RU2609201C1 (en) | Method for obtaining osteoplastic material | |
| Capella‐Monsonís et al. | Decellularized xenografts in regenerative medicine: From processing to clinical application | |
| Zhou et al. | Tendon allograft sterilized by peracetic acid/ethanol combined with gamma irradiation | |
| White et al. | The impact of sterilization upon extracellular matrix hydrogel structure and function | |
| Duarte et al. | Contributions of supercritical fluid technology for advancing decellularization and postprocessing of viable biological materials | |
| Bush et al. | Process development and manufacturing of human and animal acellular dermal matrices | |
| Łabuś et al. | Tissue engineering in skin substitute | |
| Yaldiz et al. | Effect of sterilization methods on the mechanical stability and extracellular matrix constituents of decellularized brain tissues | |
| RU2526429C1 (en) | Method of manufacturing bone implants | |
| US6379615B1 (en) | Methods of sterilizing articles | |
| Deepak et al. | A review of current approaches for decellularization, sterilization, and hemocompatibility testing on xenogeneic pericardium | |
| Gujjar et al. | Stabilized human amniotic membrane for enhanced sustainability and biocompatibility | |
| RU2774579C1 (en) | Method for sterilizing acellular matrixes | |
| EP3188596B1 (en) | Human dermis, preparation and use thereof | |
| Huang et al. | Covalent immobilization of VEGF on allogeneic bone through polydopamine coating to improve bone regeneration | |
| US20130225669A1 (en) | Sterilization of proteinaceous biomaterials and tissues with genipin | |
| WO2009050571A2 (en) | Method of treatment of connective tissues and organs and uses of said tissues and organs | |
| RU2769248C1 (en) | Method for obtaining acellular dermal matrix | |
| Feng et al. | Effect of radiation sterilization on the ability to induce adipose regeneration in vivo in decellularized adipose‐derived matrix | |
| Ostdiek et al. | Mechanical and in vitro characterisation of decellularised porcine aortic tissue conjugated with gold nanoparticles as a vascular repair material |