RU2774366C1 - Aspergillus clavatus strain - producer of proteolitic enzymes with keratinolytic activity - Google Patents
Aspergillus clavatus strain - producer of proteolitic enzymes with keratinolytic activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2774366C1 RU2774366C1 RU2021133704A RU2021133704A RU2774366C1 RU 2774366 C1 RU2774366 C1 RU 2774366C1 RU 2021133704 A RU2021133704 A RU 2021133704A RU 2021133704 A RU2021133704 A RU 2021133704A RU 2774366 C1 RU2774366 C1 RU 2774366C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- activity
- keratinolytic
- aspergillus clavatus
- enzymes
- Prior art date
Links
- 230000001530 keratinolytic Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 241000228193 Aspergillus clavatus Species 0.000 title claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 15
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 title description 2
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 claims description 14
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 claims description 13
- 229940024999 Proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims description 7
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 abstract description 12
- 230000000963 caseinolytic Effects 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 3
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 abstract description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 210000003746 Feathers Anatomy 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N Sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 108010059345 keratinase Proteins 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 3
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229960004319 Trichloroacetic Acid Drugs 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N Trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000591119 Trichophyton sp. Species 0.000 description 2
- 210000002268 Wool Anatomy 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 229940091771 Aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000122824 Aspergillus ochraceus Species 0.000 description 1
- 241000134719 Aspergillus tamarii Species 0.000 description 1
- 241000122818 Aspergillus ustus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000228427 Eurotiales Species 0.000 description 1
- 241001326555 Eurotiomycetes Species 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L Iron(II) sulfate Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 241001523956 Parengyodontium album Species 0.000 description 1
- 241000228153 Penicillium citrinum Species 0.000 description 1
- 241001326562 Pezizomycotina Species 0.000 description 1
- 206010062080 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004430 Pulmonary Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010061531 Skin degenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 241001136486 Trichocomaceae Species 0.000 description 1
- 229940099259 Vaseline Drugs 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010828 animal waste Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 108010049062 beta-Keratins Proteins 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003763 carbonization Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003366 colagenolytic Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 1
- 101700084791 eprA1 Proteins 0.000 description 1
- 101700026663 expR Proteins 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000005431 greenhouse gas Substances 0.000 description 1
- 230000000774 hypoallergenic Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000010169 landfilling Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов с кератинолитической активностью.The invention relates to the field of biotechnology, obtaining proteolytic enzymes with keratinolytic activity.
Кератины - нерастворимые фибриллярные белки, синтезируемые в клетках эпителия позвоночных животных (Herrmann and Aebi, 2004). Кератины выполняют различные функции в организме, в том числе обеспечивают механическую защиту при онтогенетической и филогенетической адаптации животных к условиям внешней среды (Fraser et al., 1972; Schweizer et al., 2006).Keratins are insoluble fibrillar proteins synthesized in vertebrate epithelial cells (Herrmann and Aebi, 2004). Keratins perform various functions in the body, including providing mechanical protection during ontogenetic and phylogenetic adaptation of animals to environmental conditions (Fraser et al., 1972; Schweizer et al., 2006).
Ферменты, гидролизующие кератин, востребованы в различных сферах экономики: биомедицине для удаления прионных контаминаций, изготовления гипоаллергенных трансплантатов, лечения и диагностики ряда кожных и нейродегенеративных заболеваний; текстильной и кожевенной промышленности для предания материалу необходимых свойств; а также в сельском хозяйстве для утилизации (биодеградации) отходов, богатых кератином (перьев, щетины и др.), и изготовления кормовых добавок (Purchase et al., 2016).Enzymes that hydrolyze keratin are in demand in various areas of the economy: biomedicine for the removal of prion contamination, the manufacture of hypoallergenic transplants, the treatment and diagnosis of a number of skin and neurodegenerative diseases; textile and leather industry to give the material the necessary properties; as well as in agriculture for the disposal (biodegradation) of keratin-rich waste (feathers, bristles, etc.) and the manufacture of feed additives (Purchase et al., 2016).
Развитие методов переработки отходов сельского хозяйства -актуальная задача современной биотехнологии. Применяемые в настоящее время методы утилизации побочных продуктов животноводства и птицеводста, богатых кератином, не отвечают предъявляемым экономикой требованиям. Захоранивание, сжигание, химический гидролиз, а также карбонизация являются энергоемкими процессами, требующими больших территорий, высококвалифицированного персонала и сложного оборудования и приводящими к загрязнению среды парниковыми газами, сажей и патогенными микроорганизмами. Ферментативное расщепление кератинов позволит не только снизить нагрузку на окружающую среду, но также получать продукты переработки кератинсодержащих материалов, востребованных в косметологии, медицине и биохимической промышленности - аминокислоты и олигопептиды (Shestakova et al., 2021).The development of methods for processing agricultural waste is an urgent task of modern biotechnology. Current methods of disposal of keratin-rich animal and poultry by-products do not meet the economic demands. Landfilling, incineration, chemical hydrolysis, and carbonization are energy-intensive processes that require large areas, highly trained personnel, and sophisticated equipment, and result in pollution of the environment by greenhouse gases, soot, and pathogens. Enzymatic cleavage of keratins will not only reduce the burden on the environment, but also produce processing products of keratin-containing materials that are in demand in cosmetology, medicine, and the biochemical industry - amino acids and oligopeptides (Shestakova et al., 2021).
К источникам кератинолитических ферментов относятся археи, бактерии и грибы. Мицелиальные грибы - одни из наиболее перспективных промышленных продуцентов кератиназ, так как они способны секретировать многокомпонентные комплексы протеаз с широкой субстратной специфичностью и широким диапазоном действия, что является несомненным преимуществом для биодеградации, а также их культивирование возможно в твердофазных условиях на отходах животноводства, что позволит снизить расходы воды и энергии для производства целевого продукта, тем самым снижая нагрузку на окружающую среду и повышая рентабельность производства кератинолитических ферментов (da Silva et al., 2016; de Oliveira et al., 2019).Sources of keratinolytic enzymes include archaea, bacteria, and fungi. Mycelial fungi are one of the most promising industrial producers of keratinases, since they are able to secrete multicomponent complexes of proteases with a wide substrate specificity and a wide range of action, which is an undoubted advantage for biodegradation, and their cultivation is possible in solid-phase conditions on animal waste, which will reduce water and energy costs for the production of the target product, thereby reducing the burden on the environment and increasing the profitability of the production of keratinolytic enzymes (da Silva et al., 2016; de Oliveira et al., 2019).
Известны коммерческие препараты протеиназы К, получаемые при культивировании Engyodontium album и некоторых рекомбинантных штаммов бактерий. Существенным недостатком этого фермента для биодеградации является проявление высокой кератинолитической активности лишь в высокоочищенном виде, что результирует в высокой стоимости продукта (Ebeling et al., 1974; Kuczius and Groschup, 1999).Known commercial preparations of proteinase K, obtained by cultivating Engyodontium album and some recombinant bacterial strains. A significant disadvantage of this enzyme for biodegradation is the manifestation of high keratinolytic activity only in highly purified form, which results in a high cost of the product (Ebeling et al., 1974; Kuczius and Groschup, 1999).
Известен продуцент кератинолитических ферментов штамм Trichophyton sp.95 (патент CN1405305 A). Протеазы этого штамма обладают широкой субстратной специфичностью, гидролизуют как альфа-, так и бета-кератин, и могут быть применены в пищевой промышленности, при производстве кормовых добавок и детергентов. Однако недостатками Trichophyton sp.95 являются патогенность для человека и длительное время культивирования (6-7 дней).Known producer of keratinolytic enzymes strain Trichophyton sp.95 (patent CN1405305 A). The proteases of this strain have a wide substrate specificity, hydrolyze both alpha- and beta-keratin, and can be used in the food industry, in the production of feed additives and detergents. However, the disadvantages of Trichophyton sp.95 are human pathogenicity and long cultivation time (6-7 days).
Ближайшим аналогом является культура микроскопического гриба Aspergillus fumigatus. Она наиболее близка к новому штамму по таксономическому положению. Синтезирует внеклеточные протеолитические ферменты с кератинолитической активностью при росте на среде с добавлением куриного пера в качестве основного источника углерода и азота. Недостатками этой культуры являются необходимость длительного культивирования (21 день) и патогенность для человека, так как Aspergillus fumigatus - основной инфекционный агент при аспергиллезах легких человека (Sivakumar and Raveendran, 2015).The closest analogue is the culture of the microscopic fungus Aspergillus fumigatus. It is closest to the new strain in taxonomic position. Synthesizes extracellular proteolytic enzymes with keratinolytic activity when grown on a medium with the addition of chicken feathers as the main source of carbon and nitrogen. The disadvantages of this culture are the need for long-term cultivation (21 days) and human pathogenicity, since Aspergillus fumigatus is the main infectious agent in human lung aspergillosis (Sivakumar and Raveendran, 2015).
В основу настоящего изобретения положена задача поиска нового продуцента протеолитических ферментов с кератинолитической активностью, обладающего способностью секретировать высокоактивный целевой продукт при культивировании на отходах птицеводства.The present invention is based on the task of finding a new producer of proteolytic enzymes with keratinolytic activity, which has the ability to secrete a highly active target product when cultivated on poultry waste.
Задача решается с помощью вновь выделенного авторами почвенного штамма Aspergillus clavatus А16. Штамм А16 депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) под номером F-1593.The problem is solved with the help of the soil strain Aspergillus clavatus A16 newly isolated by the authors. The A16 strain was deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms (VKM) under the number F-1593.
Штамм Aspergillus clavatus F-1593 при глубинном и твердофазном культивировании на питательной среде с добавлением перемолотого или цельного куриного пера синтезирует внеклеточные ферменты с казеинолитической и кератинолитической активностью. Выделение кератинолитических ферментов из культуральной жидкости проводят известными методами с помощью осаждения белков сульфатом аммония до степени насыщения 80%. Сформированные осадки центрифугируют, переносят в буфер (рН 8.2) и диализуют для удаления солей аммония при 4°С против того же буфера, далее снова центрифугируют и удаляют нерастворимую часть (Ландау и др., 1998). Раствор хранят в холодильнике при 4°С или лиофилизируют для длительного хранения. Активность измеряют за счет проведения реакций с 1% суспензией кератина шерсти (рН 8.2).The Aspergillus clavatus F-1593 strain during deep and solid-phase cultivation on a nutrient medium with the addition of ground or whole chicken feather synthesizes extracellular enzymes with caseinolytic and keratinolytic activity. Isolation of keratinolytic enzymes from the culture fluid is carried out by known methods by precipitation of proteins with ammonium sulfate to a degree of saturation of 80%. The formed precipitates are centrifuged, transferred into a buffer (pH 8.2) and dialyzed to remove ammonium salts at 4°C against the same buffer, then centrifuged again and the insoluble part is removed (Landau et al., 1998). The solution is stored in a refrigerator at 4°C or freeze-dried for long-term storage. Activity is measured by conducting reactions with a 1% suspension of wool keratin (pH 8.2).
Штамм Aspergillus clavatus A16 (F-1593) идентифицирован по морфолого-культуральным признакам (Domsch et al., 2007) и методом секвенирования ITS-региона рДНК (Henry et al., 2000). Его нуклеотидная последовательность депонирована в Генбанке под номером OK559552. Штамм относится к семейству Trichocomaceae, порядку Eurotiales, классу Eurotiomycetes, подотделу Pezizomycotina, отделу Ascomycota.The strain Aspergillus clavatus A16 (F-1593) was identified by morphological and cultural features (Domsch et al., 2007) and rDNA ITS region sequencing (Henry et al., 2000). Its nucleotide sequence has been deposited at the Genbank under the number OK559552. The strain belongs to the family Trichocomaceae, order Eurotiales, class Eurotiomycetes, subdivision Pezizomycotina, division Ascomycota.
Культурально-морфологические признаки.Cultural and morphological features.
Штамм хорошо растет на стандартных агаризованных средах -сусло-агар, среда Чапека при температуре 25-28°С. Спороношение штамм начинает на 2-3 сут, формируя обильноспороносящие колонии. На среде сусло-агар штамм Aspergillus clavatus F-1593 образует широкорастущие бархатистые белые колонии с волнистыми краями, приобретающие сине-зеленую окраску на 2-4 день культивирования и травянисто-зеленую при старении. Ножки конидиеносцев бесцветные, споры, образующиеся на фиалидах, расположенных на элипсоидных головках, окрашены. Обратная сторона колонии гладкая, белая, бывает с охристой пигментацией в центре. На жидкой среде при перемешивании штамм растет в виде мелких пеллет от светло-бежевого до темно-бежевого цвета, состоящих из тяжей ветвящегося мицелия с конидиями. При твердофазном культивировании штамм обрастает цельные куриные перья, морфология культуры схожа с ростом на агаризованных средах.The strain grows well on standard agar media - wort-agar, Czapek's medium at a temperature of 25-28°C. Sporulation of the strain begins on 2-3 days, forming abundantly spore-bearing colonies. On the medium wort-agar strain Aspergillus clavatus F-1593 forms wide-growing velvety white colonies with wavy edges, acquiring a blue-green color on 2-4 days of cultivation and grassy-green with aging. The legs of the conidiophores are colorless, the spores formed on the phialides located on the ellipsoid heads are colored. The reverse side of the colony is smooth, white, sometimes with buffy pigmentation in the center. On a liquid medium with stirring, the strain grows in the form of small pellets from light beige to dark beige in color, consisting of strands of branching mycelium with conidia. During solid-phase cultivation, the strain overgrows whole chicken feathers; the morphology of the culture is similar to growth on agar media.
Физиолого-биохимические признаки.Physiological and biochemical signs.
Оптимум роста штамма лежит в интервале температур 25-30°С. Использует широкий спектр источников азота, как восстановленные -аммоний, пептон, казеин, гидролизат рыбной муки, кератин, так и окисленные - нитраты. В глубинной культуре лучше растет на полусинтетической среде, содержащей перемолотое куриное перо, нитрат натрия и гидролизат рыбной муки, и значениях рН, близким к нейтральным (6.0-7.0), постепенно подщелачивая среду. При росте в твердофазных условиях перемолотое куриное перо заменяют на цельное. Условия аналогичные. Штамм обладает хорошей протеолитической (казеинолитической) и относительно невысокой липолитической активностью.The optimum growth of the strain lies in the temperature range of 25-30°C. It uses a wide range of nitrogen sources, both reduced - ammonium, peptone, casein, fishmeal hydrolyzate, keratin, and oxidized - nitrates. In deep culture, it grows better on a semi-synthetic medium containing ground chicken feather, sodium nitrate and fishmeal hydrolyzate, and pH values close to neutral (6.0-7.0), gradually alkalizing the medium. When growing under solid-phase conditions, the ground chicken feather is replaced with a whole one. The conditions are similar. The strain has good proteolytic (caseinolytic) and relatively low lipolytic activity.
Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5°Б с начальным рН 6.0-6.2 или на среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 4°С с пересевом через 6-12 месяцев или под вазелиновым маслом с пересевом 1 раз в год. Штамм культивируют при 28°С на среде сусло-агар (сусло - 4, агар - 2, %) 5-7 суток.The strain is maintained on shoals with wort agar 4-5°B with an initial pH of 6.0-6.2 or on Chapek-agar medium at room temperature with subculture after 1-3 months, and when stored at 4°C with subculture after 6-12 months or under vaseline oil with reseeding once a year. The strain is cultivated at 28°C on a wort-agar medium (wort - 4, agar - 2, %) for 5-7 days.
Пример 1. Казеинолитическая и кератинолитическая активность протеаз культуральной жидкости Aspergillus clavatus F-1593 при глубинном культивировании.Example 1. Caseinolytic and keratinolytic activity of Aspergillus clavatus F-1593 culture liquid proteases during deep cultivation.
В качестве посевного материала используют двухсуточную культуру, полученную на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон. Штамм Aspergillus clavatus F-1593 выращивают в условиях глубинного культивирования в 100 мл питательной среды в качалочных колбах объемом 750 мл на орбитальных качалках (200 об/мин) при 28°С. Дальнейшее культивирование штамма проводят при тех же условиях на многокомпонентной полусинтетической среде следующего состава, %:A two-day culture obtained on a medium containing wort, glucose and peptone is used as an inoculum. The Aspergillus clavatus F-1593 strain is grown under submerged culture conditions in 100 ml of nutrient medium in 750 ml shake flasks on orbital shakers (200 rpm) at 28°C. Further cultivation of the strain is carried out under the same conditions on a multicomponent semi-synthetic medium of the following composition, %:
NaNO3 - 0.3;NaNO3 - 0.3;
K2HPO4 - 0.1;K 2 HPO 4 - 0.1;
MgSO4×7H2O - 0.05;MgSO 4 × 7H 2 O - 0.05;
KCl - 0.05;KCl - 0.05;
FeSO4×7H2O - 0.001;FeSO4×7H 2 O - 0.001;
глюкоза - 3.0;glucose - 3.0;
гидролизат рыбной муки - 0.5;fishmeal hydrolyzate - 0.5;
перемолотое куриное перо - 0.5; рН 6.0.ground chicken feather - 0.5; pH 6.0.
Пробы мицелия отделяют от среды (фильтрованием через бумажный фильтр или центрифугированием) и получают культуральную жидкость, которую используют для определения казеинолитической и кератинолитической активности.Samples of mycelium are separated from the medium (by filtration through a paper filter or centrifugation) and culture fluid is obtained, which is used to determine caseinolytic and keratinolytic activity.
Кератинолитическую активность внеклеточных протеаз определяют спектрофотометрически с использованием 1% суспензии кератина шерсти в 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 8.2). Для проведения реакции к 100 мкл культуральной жидкости добавляют 200 мкл суспензии кератина. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин в термошейкере при 600 об/мин. Реакцию останавливают добавлением 300 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Далее образцы центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об/мин, после чего в надосадочной жидкости измеряют оптическую плотность при длине волны 280 нм. За единицу активности (Е) принимают количество фермента, которое вызывает изменение оптической плотности на 0.01 ед. в условиях проведения реакции.The keratinolytic activity of extracellular proteases is determined spectrophotometrically using a 1% suspension of wool keratin in 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8.2). To carry out the reaction, 200 µl of a keratin suspension is added to 100 µl of the culture liquid. The reaction mixture is incubated at 37°C for 30 min in a thermoshaker at 600 rpm. The reaction is stopped by adding 300 µl of 10% trichloroacetic acid solution. Next, the samples are centrifuged for 5 min at 14,000 rpm, after which the absorbance is measured in the supernatant at a wavelength of 280 nm. Per unit of activity (E) is the amount of enzyme that causes a change in optical density by 0.01 units. under the reaction conditions.
Казеинолитическую активность внеклеточных протеаз микромицета определяют модифицированным методом Ансона-Хагихары, суть которого заключается в определении активности фермента как характеристики пропорциональной количеству аминокислоты тирозина, входящей в состав олигопептидов, образующихся во время гидролиза казеина. Для проведения реакции к 100 мкл культуральной жидкости добавляют 200 мкл 1% раствора казеина по Хаммерштайну в 0.1 М Трис-HCl буфере (рН 8.2). Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин в термошейкере при 600 об/мин. Реакцию останавливают добавлением 300 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Далее образцы центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об/мин, после чего в надосадочной жидкости измеряют оптическую плотность при длине волны 275 нм (Осмоловский и др., 2016). За единицу активности (Е) принимают количество фермента, которое вызывает изменение оптической плотности на 0.01 ед. в условиях проведения реакции.The caseinolytic activity of extracellular micromycete proteases is determined by the modified Anson-Hagihara method, the essence of which is to determine the activity of the enzyme as a characteristic proportional to the amount of the amino acid tyrosine, which is part of the oligopeptides formed during the hydrolysis of casein. To carry out the reaction, 200 µl of 1% Hammerstein casein solution in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.2) was added to 100 µl of the culture liquid. The reaction mixture is incubated at 37°C for 10 min in a thermoshaker at 600 rpm. The reaction is stopped by adding 300 µl of 10% trichloroacetic acid solution. Next, the samples are centrifuged for 5 min at 14000 rpm, after which the optical density is measured in the supernatant at a wavelength of 275 nm (Osmolovsky et al., 2016). Per unit of activity (E) is the amount of enzyme that causes a change in optical density by 0.01 units. under the reaction conditions.
Повторность в опытах - 3-х кратная.Repetition in the experiments - 3-fold.
Максимум казеинолитической и кератинолитической активности штамма Aspergillus clavatus F-1593 при росте в глубинных условиях составляет 47.5 Е и 55.6 Е, соответственно, и приходится на 4 сутки культивирования.The maximum caseinolytic and keratinolytic activity of the Aspergillus clavatus F-1593 strain during growth in deep conditions is 47.5 Å and 55.6 Å, respectively, and falls on the 4th day of cultivation.
Пример 2. Казеинолитическая и кератинолитическая активность протеаз культуральной жидкости Aspergillus clavatus F-1593 при твердофазном культивировании.Example 2 Caseinolytic and keratinolytic activity of Aspergillus clavatus F-1593 culture liquid proteases during solid phase cultivation.
В качестве посевного материала используют споровую суспензию Aspergillus clavatus F-1593. Твердофазное культивирование проводят в конических колбах объемом 250 мл с цельными куриными перьями (0.7 г). В колбы добавляют 10 мл питательной среды следующего состава, %:A spore suspension of Aspergillus clavatus F-1593 is used as seed material. Solid-phase cultivation is carried out in 250 ml conical flasks with whole chicken feathers (0.7 g). Add 10 ml of the nutrient medium of the following composition to the flasks, %:
NaNO3 - 0.3;NaNO3 - 0.3;
K2HPO4 - 0.1;K 2 HPO 4 - 0.1;
MgSO4×7H2O - 0.05;MgSO 4 × 7H 2 O - 0.05;
KCl - 0.05;KCl - 0.05;
FeSO4×7H2O - 0.001;FeSO 4 × 7H 2 O - 0.001;
глюкоза - 3.0;glucose - 3.0;
гидролизат рыбной муки - 0.5;fishmeal hydrolyzate - 0.5;
рН 6.0.pH 6.0.
Засев осуществляют споровой суспензией объемом 1 мл, полученной путем смыва спор с выращенной на сусло-агаре культуры (5-7 сутки) стерильным водным 0.001% раствором Твина-80. Культивирование проводят в статичных условиях при 28°С.Seeding is carried out with a spore suspension of 1 ml, obtained by washing the spores from a culture grown on wort agar (5-7 days) with a sterile aqueous 0.001% solution of Tween-80. Cultivation is carried out under static conditions at 28°C.
Для элюции протеолитических ферментов используют 0.05 М Трис-HCl буфер, рН 8.2. В колбы с культурой добавляют по 35 мл буфера, после чего их помещают на орбитальную качалку (200 об/мин) на 60 мин. Элюат отфильтровывают через бумажные фильтры и используют для определения казеинолитической и кератинолитической активности аналогично примеру 1.For the elution of proteolytic enzymes, 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.2, is used. 35 ml of buffer are added to culture flasks, after which they are placed on an orbital shaker (200 rpm) for 60 min. The eluate is filtered through paper filters and used to determine caseinolytic and keratinolytic activity as in example 1.
Повторность в опытах - 3-х кратная.Repetition in the experiments - 3-fold.
Максимум казеинолитической и кератинолитической активности штамма Aspergillus clavatus F-1593 при росте в твердофазных условиях составляет 73.4 Е и 55.2 Е, соответственно, и приходится на 3-5 сутки культивирования.The maximum caseinolytic and keratinolytic activity of the Aspergillus clavatus F-1593 strain during growth under solid-phase conditions is 73.4 U and 55.2 U, respectively, and falls on days 3-5 of cultivation.
Пример 3. Сравнение длительности культивирования Aspergillus clavatus F-1593 и ближайших аналогов - штаммов-продуцентов кератинолитических ферментов.Example 3. Comparison of the duration of cultivation of Aspergillus clavatus F-1593 and closest analogues - strains-producers of keratinolytic enzymes.
Длительность культивирования штаммов микроскопических грибов для наработки протеолитических ферментов с кератинолитической активностью представлено в Таблице 1.The duration of cultivation of strains of microscopic fungi for the production of proteolytic enzymes with keratinolytic activity is presented in Table 1.
Штамм Aspergillus clavatus F-1593 является продуцентом внеклеточных протеолитических ферментов с кератинолитической активностью, при этом необходимое время культивирования для наработки целевого продукта снижается по сравнению с известными ближайшими аналогами.The Aspergillus clavatus F-1593 strain is a producer of extracellular proteolytic enzymes with keratinolytic activity, while the required cultivation time for the production of the target product is reduced compared to the closest known analogues.
Список литературы:Bibliography:
1. Ландау Н.С., Кураков А.В., Туликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С., 1998. Экстрацеллюлярные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулятными свойствами. Микробиология, 67, 2,215-220.1. Landau N.S., Kurakov A.V., Tulikova O.M., Batomunkueva B.P., Strukova S.M., Egorov N.S., 1998. Extracellular proteinases of micromycetes with fibrinolytic and anticoagulant properties. Microbiology, 67, 2,215-220.
2. Осмоловский А.А., Попова Е.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н. С. 2016. Фибринолитическая и коллагенолитическая активность внеклеточных протеиназ штаммов микромицетов Aspergillus ochraceus L-1 и Aspergillus ustus 1. Вестник Московского университета, 16, 1, 71-75.2. Osmolovsky A.A., Popova E.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. 2016. Fibrinolytic and collagenolytic activity of extracellular proteinases of micromycete strains Aspergillus ochraceus L-1 and Aspergillus ustus 1 Moscow University Bulletin, 16, 1, 71-75.
3. Патент CN1405305 А, 2001. Efficient, broad-spectrum keratinase and its gene3. Patent CN1405305 A, 2001. Efficient, broad-spectrum keratinase and its gene
4. Патент RU2499833 C1, 2012. PRODUCTION METHOD OF KERATINASE FROM Penicillium citrinum 5. da Silva O.S., de Oliveira R.L., Souza-Motta С.М., Porto A.L.F., Porto T.S. 2016. Novel protease from Aspergillus tamarii URM4634: production and characterization using inexpensive agroindustrial substrates by solid-state fermentation. Advances in Enzyme Research, 4, 04, 125.4. Patent RU2499833 C1, 2012. PRODUCTION METHOD OF KERATINASE FROM Penicillium citrinum 5. da Silva O.S., de Oliveira R.L., Souza-Motta C.M., Porto A.L.F., Porto T.S. 2016. Novel protease from Aspergillus tamarii URM4634: production and characterization using inexpensive agroindustrial substrates by solid-state fermentation. Advances in Enzyme Research, 4, 04, 125.
6. de Oliveira C.C., de Souza A.K.S., de Castro R.J.S. 2019. Bioconversion of chicken feather meal by Aspergillus niger: simultaneous enzymes production using a cost-effective feedstock under solid state fermentation. Indian journal of microbiology, 59, 2, 209-216.6. de Oliveira C.C., de Souza A.K.S., de Castro R.J.S. 2019. Bioconversion of chicken feather meal by Aspergillus niger: simultaneous enzymes production using a cost-effective feedstock under solid state fermentation. Indian journal of microbiology, 59, 2, 209-216.
7. Domsch K.H., Gams W., Anderson T-H., 2007. Compendium of soil fungi. Second edition revised by W.Gams. IHW-Verlag & Verlagsbuchhandlung. 700 pp.7. Domsch K.H., Gams W., Anderson T-H., 2007. Compendium of soil fungi. Second edition revised by W.Gams. IHW-Verlag & Verlagsbuchhandlung. 700 pp.
8. Ebeling W., Hennrich N., Klockow M., Metz H., Orth H.D., Lang H. 1974. Proteinase K from Tritirachium album Limber. European journal of biochemistry, 47, 91-97.8. Ebeling W., Hennrich N., Klockow M., Metz H., Orth H. D., Lang H. 1974. Proteinase K from Tritirachium album Limber. European journal of biochemistry, 47, 91-97.
9. Fraser R.D.B., MacRae T.P., Rogers G.E. 1972. Keratins. Their Composition, Structure and Biosynthesis. Ill.: Springfield, 378-379.9. Fraser R.D.B., MacRae T.P., Rogers G.E. 1972 Keratins. Their Composition, Structure and Biosynthesis. Ill.: Springfield, 378-379.
10.Henry Т., Iwen P., Hinrichs H., 2000. Identification of Aspergillus species using Internal transcribed spacer regions 1 and 2. J. Clinical Microb., 1510-1515.10. Henry T., Iwen P., Hinrichs H., 2000. Identification of Aspergillus species using Internal transcribed spacer regions 1 and 2. J. Clinical Microb., 1510-1515.
11. Herrmann H., Aebi U. 2004. Intermediate filaments: molecular structure, assembly mechanism, and integration into functionally distinct intracellular scaffolds. Annual review of biochemistry, 73,1, 749-789.11. Herrmann H., Aebi U. 2004. Intermediate filaments: molecular structure, assembly mechanism, and integration into functionally distinct intracellular scaffolds. Annual review of biochemistry, 73.1, 749-789.
12. Kuczius Т., Groschup M.H. 1999. Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Molecular medicine, 5, 6, 406-418.12. Kuczius T., Groschup M.H. 1999. Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Molecular medicine, 5, 6, 406-418.
13. Masood S., Hussain A., Javid A., Bukahri S.M., Ali W., Ali S., Ghaffar I., Imtiaz A., Amin H., Salahuddin H., Inayat M., Razzaq S., Kafayat F., Rafiq H., Yasmeen M., Muneeb M., Sattar S. 2021. Fungal decomposition of chicken-feather waste in submerged and solid-state fermentation. Brazilian journal of biology. Revista brasleira de biologia, 83, e246389. https://doi.org/10.1590/1519-6984.24638913. Masood S., Hussain A., Javid A., Bukahri S.M., Ali W., Ali S., Ghaffar I., Imtiaz A., Amin H., Salahuddin H., Inayat M., Razzaq S., Kafayat F., Rafiq H., Yasmeen M., Muneeb M., Sattar S. 2021. Fungal decomposition of chicken-feather waste in submerged and solid-state fermentation. brazilian journal of biology. Revista brasleira de biology, 83, e246389. https://doi.org/10.1590/1519-6984.246389
14. Preczeski K.P., Dalastra C., Czapela F.F., Kubeneck S., Scapini Т., Camargo A. F., Zanivan J., Bonatto C., Stefanski F.S., Venturin В., Fongaro G., Treichel H. 2020. Fusarium oxysporum and Aspergillus sp.as Keratinase Producers Using Swine Hair From Agroindustrial Residues. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 8, 71. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.0007114. Preczeski K.P., Dalastra C., Czapela F.F., Kubeneck S., Scapini T., Camargo A.F., Zanivan J., Bonatto C., Stefanski F.S., Venturin B., Fongaro G., Treichel H. 2020. Fusarium oxysporum and Aspergillus sp.as Keratinase Producers Using Swine Hair From Agroindustrial Residues. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 8, 71. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00071
15. Purchase D. 2016. Microbial keratinases: characteristics, biotechnological applications and potential. CAB International. The Handbook of Microbial Bioresources, 10.15. Purchase D. 2016. Microbial keratinases: characteristics, biotechnological applications and potential. CAB International. The Handbook of Microbial Bioresources, 10.
16. Schweizer J., Bowden P.E., Coulombe P.A., Langbein L., Lane E.B., Magin T.M., Maltais L., Omary M.B., Parry D.A., Rogers M.A., Wright M.W. 2006. New consensus nomenclature for mammalian keratins. The Journal of cell biology, 174, 2, 169-174.16. Schweizer J., Bowden P.E., Coulombe P.A., Langbein L., Lane E.B., Magin T.M., Maltais L., Omary M.B., Parry D.A., Rogers M.A., Wright M.W. 2006. New consensus nomenclature for mammalian keratins. The Journal of cell biology, 174, 2, 169-174.
17. Shestakova A., Timorshina S., Osmolovskiy A. 2021. Biodegradation of keratin-rich husbandry waste as a path to sustainable agriculture. Sustainability, 13,16, 8691.17. Shestakova A., Timorshina S., Osmolovskiy A. 2021. Biodegradation of keratin-rich husbandry waste as a path to sustainable agriculture. Sustainability, 13.16, 8691.
18. Sivakumar N., Raveendran, S. 2015. Keratin degradation by bacteria and fungi isolated from a poultry farm and plumage. British poultry science, 56(2), 210-217. https://doi.org/10.1080/00071668.2014.996119.18. Sivakumar N., Raveendran, S. 2015. Keratin degradation by bacteria and fungi isolated from a poultry farm and plumage. British poultry science, 56(2), 210-217. https://doi.org/10.1080/00071668.2014.996119.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2774366C1 true RU2774366C1 (en) | 2022-06-17 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU208623A1 (en) * | ||||
| RU2034924C1 (en) * | 1993-03-03 | 1995-05-10 | Акционерное общество "Биотехнология" | Strain of streptomyces ornatus - a producer of keratinase |
| JP5699261B2 (en) * | 2010-03-05 | 2015-04-08 | 邦彦 渡部 | Keratinase and production method thereof |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU208623A1 (en) * | ||||
| RU2034924C1 (en) * | 1993-03-03 | 1995-05-10 | Акционерное общество "Биотехнология" | Strain of streptomyces ornatus - a producer of keratinase |
| JP5699261B2 (en) * | 2010-03-05 | 2015-04-08 | 邦彦 渡部 | Keratinase and production method thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SIVAKUMAR N., RAVEENDRAN S. "Keratin degradation by bacteria and fungi isolated from a poultry farm and plumage", British Poultry Science, 2015, N 56 (2), p.210-217. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2668353C (en) | Growth medium for clostridium histolyticum without ingredients from mammalian sources | |
| Maitig et al. | Isolation and screening of extracellular protease enzyme from fungal isolates of soil. | |
| CN102517235B (en) | Bacillus subtilis | |
| Lopes et al. | Production of proteolytic enzymes by a keratin-degrading Aspergillus niger | |
| Ortiz et al. | A comparative study of new Aspergillus strains for proteolytic enzymes production by solid state fermentation | |
| Pandian et al. | Isolation, identification and characterization of feather degrading bacteria | |
| Izgu et al. | Inhibition of Penicillium digitatum and Penicillium italicum in vitro and in planta with Panomycocin, a novel exo-β-1, 3-glucanase isolated from Pichia anomala NCYC 434 | |
| Awad et al. | Keratinase production by Bacillus pumilus GHD in solid-state fermentation using sugar cane bagasse: optimisation of culture conditions using a Box-Behnken experimental design | |
| Abirami et al. | Utilization of keratinolytic Lichtheimia corymbifera AS1 for degradation of cattle hoove—A slaughter house waste to use in plant growth | |
| Kanmani et al. | Studies on detergent additives of protease enzyme from an estuarine bacterium Bacillus cereus | |
| RU2774366C1 (en) | Aspergillus clavatus strain - producer of proteolitic enzymes with keratinolytic activity | |
| Avdiyuk et al. | Keratinolytic enzymes: producers, physical and chemical properties. Application for biotechnology | |
| Femi-Ola et al. | Isolation and characterization of feather degrading bacteria from poultry soil | |
| CN110423711B (en) | Low-temperature chitinase-producing strain from Antarctic and fermentation method thereof | |
| CN113122482A (en) | Pseudomonas aeruginosa GXun-2 and application thereof | |
| Jahan et al. | Screening of keratinolytic bacteria from poultry wastes | |
| RU2303066C1 (en) | Bacterium strain bacillus licheniformis as alkaline protease producer | |
| Yimer et al. | Production and Characterization of Bacterial Protease from Isolates of Soil and Agro-Industrial Wastes | |
| Sowjanya et al. | Study on Microsporum gyspeum, a fungus capable of biodegrading mammalian keratin. | |
| Bhari et al. | Fungal Keratinases: Enzymes with Immense Biotechnological Potential | |
| RU2758788C1 (en) | Method for producing a collagenolytic enzyme | |
| Timorshina et al. | Keratinolytic Potential of the Micromycete Aspergillus clavatus VKPM F-1593 and Comparison of Its Enzymes with the Commercial Keratinase Preparation | |
| Kačinová et al. | Production of extracellular keratinase by Chrysosporium tropicum and Trichophyton ajelloi. | |
| US3173847A (en) | Process of producing keratinase | |
| Correia et al. | Bioconversion of poultry residues for the production of proteases by Aspergillus sp. isolated from Amazonian forest soil |