RU2774076C2 - Rat genetic modification - Google Patents
Rat genetic modification Download PDFInfo
- Publication number
- RU2774076C2 RU2774076C2 RU2019114118A RU2019114118A RU2774076C2 RU 2774076 C2 RU2774076 C2 RU 2774076C2 RU 2019114118 A RU2019114118 A RU 2019114118A RU 2019114118 A RU2019114118 A RU 2019114118A RU 2774076 C2 RU2774076 C2 RU 2774076C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rat
- cells
- cell
- genetic modification
- lif
- Prior art date
Links
- 241000700159 Rattus Species 0.000 title claims abstract description 813
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 title claims abstract description 172
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 title claims abstract description 172
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title claims abstract description 151
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 113
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 959
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 claims description 132
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 claims description 132
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 130
- 239000002609 media Substances 0.000 claims description 130
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 98
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 claims description 96
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims description 71
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 71
- 101700053614 FOXE1 Proteins 0.000 claims description 55
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 52
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 51
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 49
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 49
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 210000002459 Blastocyst Anatomy 0.000 claims description 40
- 102100014038 FOXE1 Human genes 0.000 claims description 39
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 36
- 230000001537 neural Effects 0.000 claims description 34
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 claims description 30
- 101700011792 CAMK4 Proteins 0.000 claims description 26
- 108060004140 ITPK1 Proteins 0.000 claims description 26
- 101700059316 LIFR Proteins 0.000 claims description 26
- 101710007397 GJB5 Proteins 0.000 claims description 24
- 101700054222 HEY2 Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 22
- 101700045878 CDX2 Proteins 0.000 claims description 21
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 claims description 20
- 210000000472 Morula Anatomy 0.000 claims description 19
- 101710026246 POU5F1 Proteins 0.000 claims description 19
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical group CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 101710026872 EPHA4 Proteins 0.000 claims description 18
- 101700006931 SOX2 Proteins 0.000 claims description 18
- 101700079116 QSOX1 Proteins 0.000 claims description 17
- 101700081294 LEF1 Proteins 0.000 claims description 15
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 15
- 230000001965 increased Effects 0.000 claims description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 15
- 101710036101 ARHGEF9 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 13
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 13
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 claims description 13
- 102100006982 CAMK4 Human genes 0.000 claims description 13
- 108050001278 CDC42 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 13
- 101710018270 CLDN5 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004646 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 4 Human genes 0.000 claims description 13
- 102000011068 Cdc42 Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000582 Claudin-5 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004057 Claudin-5 Human genes 0.000 claims description 13
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 claims description 13
- 102000020569 Ephrin-A1 Human genes 0.000 claims description 13
- 108010043945 Ephrin-A1 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100008658 FN1 Human genes 0.000 claims description 13
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 13
- 102000016285 Guanine Nucleotide Exchange Factors Human genes 0.000 claims description 13
- 108010067218 Guanine Nucleotide Exchange Factors Proteins 0.000 claims description 13
- 102000014343 Interleukin-36 beta Human genes 0.000 claims description 13
- 108050003379 Interleukin-36 beta Proteins 0.000 claims description 13
- 102100011647 LIFR Human genes 0.000 claims description 13
- 102100003075 LPAR2 Human genes 0.000 claims description 13
- 108090001093 Lymphoid enhancer-binding factor 1 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004857 Lymphoid enhancer-binding factor 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 108020000494 Protein Tyrosine Phosphatases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatases Human genes 0.000 claims description 13
- 101700062760 SATB1 Proteins 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 claims description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 12
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 claims description 12
- 102100006231 GJB5 Human genes 0.000 claims description 11
- 101710017551 LEFTY1 Proteins 0.000 claims description 11
- 101710018420 PTPN18 Proteins 0.000 claims description 11
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 11
- 101700084588 AJAP1 Proteins 0.000 claims description 10
- 101700037546 IL36B Proteins 0.000 claims description 9
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000051 modifying Effects 0.000 claims description 9
- 102100011829 CDX2 Human genes 0.000 claims description 8
- 101700040059 FANK1 Proteins 0.000 claims description 8
- 101700036125 FGF4 Proteins 0.000 claims description 8
- 101700008134 GATA6 Proteins 0.000 claims description 8
- 101710044671 IGFBPL1 Proteins 0.000 claims description 8
- 101700048573 KLF4 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100006525 KLF4 Human genes 0.000 claims description 8
- 101700083667 PAX6 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 8
- 101700057304 SOX17 Proteins 0.000 claims description 8
- 101700036900 SOX7 Proteins 0.000 claims description 8
- 101700010052 BMPR2 Proteins 0.000 claims description 7
- 101710027196 FBXO15 Proteins 0.000 claims description 7
- 101700054531 GDF3 Proteins 0.000 claims description 7
- 101710032940 LIN28A Proteins 0.000 claims description 7
- 102100015262 MYC Human genes 0.000 claims description 7
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 claims description 7
- 101700011059 SOX15 Proteins 0.000 claims description 7
- 101700026107 UTF1 Proteins 0.000 claims description 7
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 claims description 7
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 claims description 6
- 101710024922 hyg Proteins 0.000 claims description 6
- 102100001720 EPHA4 Human genes 0.000 claims description 5
- 101700012101 Khdc3 Proteins 0.000 claims description 5
- 101700061118 REXO1 Proteins 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 claims description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 4
- 230000021037 unidirectional conjugation Effects 0.000 claims description 4
- 108010045123 EC 3.5.4.23 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding Effects 0.000 claims description 2
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims 4
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 claims 2
- 102000020344 Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Human genes 0.000 claims 2
- 108091022066 Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Proteins 0.000 claims 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 2
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 claims 2
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 claims 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims 2
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 claims 2
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 claims 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims 1
- 101710017715 ZNF816 Proteins 0.000 claims 1
- 102100001628 ZNF816 Human genes 0.000 claims 1
- 101700070836 ZNFP Proteins 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 135
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 72
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 29
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 27
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 26
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 24
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 22
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 22
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 22
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 22
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 20
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102100019163 POU5F1 Human genes 0.000 description 15
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 14
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000001915 nurse cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 102000004375 Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 108090000957 Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 10
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 101700004651 SALL3 Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 230000014306 paracrine signaling Effects 0.000 description 8
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 7
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 7
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 7
- 101710033966 IFNLR1 Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 101710026494 Saci_0459 Proteins 0.000 description 6
- 210000004340 Zona Pellucida Anatomy 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 5
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 5
- 101700001131 EFNA1 Proteins 0.000 description 5
- 101000302135 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 5
- 102100010821 SATB1 Human genes 0.000 description 5
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 101700035175 AHL27 Proteins 0.000 description 4
- 102100011141 ALK Human genes 0.000 description 4
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 4
- 210000002304 ESC Anatomy 0.000 description 4
- 102000027757 FGF receptors Human genes 0.000 description 4
- 108091008101 FGF receptors Proteins 0.000 description 4
- 101700014779 GLB1 Proteins 0.000 description 4
- 210000003284 Horns Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 4
- 210000003101 Oviducts Anatomy 0.000 description 4
- 235000015076 Shorea robusta Nutrition 0.000 description 4
- 210000001541 Thymus Gland Anatomy 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003203 everyday Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 4
- BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CN=C2[C]1C(Cl)=C(Br)C=C2 BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 108010091358 EC 2.4.2.8 Proteins 0.000 description 3
- 102000018251 EC 2.4.2.8 Human genes 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 102100000851 NPTXR Human genes 0.000 description 3
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 230000000056 copulatory Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 108010001839 neuronal pentraxin receptor Proteins 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001015 Abdomen Anatomy 0.000 description 2
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 108060003435 Beta Proteins 0.000 description 2
- 241000219430 Betula pendula Species 0.000 description 2
- HAYVTMHUNMMXCV-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CS HAYVTMHUNMMXCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108010027570 EC 2.4.2.22 Proteins 0.000 description 2
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 2
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 2
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 2
- 101700037605 LIF Proteins 0.000 description 2
- 102100011646 LIF Human genes 0.000 description 2
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- -1 Nodal Proteins 0.000 description 2
- 108009000261 Non-homologous end joining Proteins 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 101700034865 SETD5 Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 101710027274 THUMPD3 Proteins 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000010807 litter Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- NVMMUAUTQCWYHD-ABHRYQDASA-N (2S)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 NVMMUAUTQCWYHD-ABHRYQDASA-N 0.000 description 1
- 210000003815 Abdominal Wall Anatomy 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GSMPSRPMQQDRIB-WHFBIAKZSA-N Asp-Gln Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O GSMPSRPMQQDRIB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700000123 BMP2 Proteins 0.000 description 1
- 101700005069 BMP4 Proteins 0.000 description 1
- 210000004952 Blastocoel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 208000008787 Cardiovascular Disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004436 Chromosomes, Artificial, Bacterial Anatomy 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 241000699662 Cricetomys gambianus Species 0.000 description 1
- LVNMAAGSAUGNIC-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Histidine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 LVNMAAGSAUGNIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N DATI Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700066124 DPPA2 Proteins 0.000 description 1
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 101710033923 ERAS Proteins 0.000 description 1
- 210000003981 Ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 Endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 210000003754 Fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003976 Gap Junctions Anatomy 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 210000001654 Germ Layers Anatomy 0.000 description 1
- JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N Gln-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N Glu-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N Gly-Cys Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C([O-])=O MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 101700080837 HNF1B Proteins 0.000 description 1
- 102100016993 HNF1B Human genes 0.000 description 1
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 229940084986 Human Chorionic Gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000026186 IL-6 family Human genes 0.000 description 1
- 108091013087 IL-6 family Proteins 0.000 description 1
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Aspartate Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWBDLNOCIDGPQE-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Lysine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN UWBDLNOCIDGPQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Threonine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710030888 KDR Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N L-tyrosyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N L-tyrosyl-L-tyrosine Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- IGRMTQMIDNDFAA-UHFFFAOYSA-N Lysyl-Histidine Chemical compound NCCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 IGRMTQMIDNDFAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060004865 MICU2 Proteins 0.000 description 1
- 210000003716 Mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N Met-Thr Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C([O-])=O KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- BJFJQOMZCSHBMY-YUMQZZPRSA-N Met-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BJFJQOMZCSHBMY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- JMEWFDUAFKVAAT-UHFFFAOYSA-N Methionyl-Asparagine Chemical compound CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O JMEWFDUAFKVAAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004857 Mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028549 Myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N PUROMYCIN Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 1
- 229950010131 PUROMYCIN Drugs 0.000 description 1
- 241000700145 Petromus typicus Species 0.000 description 1
- OHUXOEXBXPZKPT-STQMWFEESA-N Phe-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 OHUXOEXBXPZKPT-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- KLAONOISLHWJEE-UHFFFAOYSA-N Phenylalanyl-Glutamine Chemical compound NC(=O)CCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 KLAONOISLHWJEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N Prolyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001021910 Rhizomys sumatrensis Species 0.000 description 1
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Lysine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001685 Thyroid Gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 Uterus Anatomy 0.000 description 1
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000367326 Xenomys nelsoni Species 0.000 description 1
- 101700068938 ZFP42 Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 101710038860 hnf1ba Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 101500013013 human Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N p-acetaminophenol Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003559 rna-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N val-gly Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Плюрипотентные, тотипотентные и эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, не относящиеся к человеку, в частности крысиные плюрипотентные, тотипотентные и/или крысиные ЭС клетки и способы их получения. Предлагаются способы получения плюрипотентных, тотипотентных и ЭС клеток крыс. Предлагаются способы нацеливания плюрипотентных, тотипотентных и ЭС клеток крыс. Предлагаются способы достижения трансмиссии через зародышевую линию генетической модификации в клетку крысы. Предлагаются среды для получения, выращивания и поддержания плюрипотентных, тотипотентных и ЭС клеток крыс.Non-human pluripotent, totipotent and embryonic stem (ES) cells, in particular rat pluripotent, totipotent and/or rat ES cells and methods for their production. Proposed methods for obtaining pluripotent, totipotent and ES cells of rats. Methods for targeting rat pluripotent, totipotent, and ES cells are proposed. Methods are provided for achieving transmission through the germline of a genetic modification into a rat cell. Media are proposed for obtaining, growing and maintaining pluripotent, totipotent and ES cells in rats.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ВИДЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА ЧЕРЕЗ EFS-WEBLINK TO THE SEQUENCE LIST PROVIDED AS A TEXT FILE VIA EFS-WEB
Официальная копия перечня последовательностей представлена одновременно со спецификацией в виде текстового файла через EFS-Web в соответствии с Американским стандартным кодом для обмена информацией (ASCII), с названием файла 441914seqlist.txt, датой создания 20 февраля 2014 г.и размером 2 килобайта. Перечень последовательностей, поданный с помощью EFS-Web, является частью спецификации и включен в данное описание в полном объеме посредством ссылки.An official copy of the sequence listing is provided along with the specification as a text file via EFS-Web in accordance with the American Standard Code for Information Interchange (ASCII), file name 441914seqlist.txt, creation date February 20, 2014, and size 2 kilobytes. The sequence listing filed with EFS-Web is part of the specification and is incorporated herein in its entirety by reference.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Крыса является важной моделью для многих видов применения, включая, но не ограничиваясь этим, применение в разработке лекарственных средств. Практическая значимость крыс была несколько уменьшена из-за сложностей в получении генетически модифицированных крыс, в частности, в разработке способов генетической модификации крыс и создании пригодных для применения крысиных клеток, которые могут быть использованы в протоколах генетических модификаций, включая, но не ограничиваясь этим, протоколы, которые приводят к трансмиссии через зародышевую линию генетической модификации в геном крыс.The rat is an important model for many applications including, but not limited to, drug development applications. The practical value of rats has been somewhat reduced due to the difficulties in obtaining genetically modified rats, in particular, in the development of methods for genetic modification of rats and the creation of usable rat cells that can be used in genetic modification protocols, including, but not limited to, protocols , which lead to transmission through the germline of the genetic modification into the rat genome.
В данной области техники существует необходимость в крысиных клетках (например, эмбриональных стволовых клетках), которые могут быть генетически модифицированы таким образом, что генетическую модификацию можно передавать через зародышевую линию. В данной области техники существует необходимость в улучшении частоты трансмиссии через зародышевую линию генетических модификаций у крыс.There is a need in the art for rat cells (eg, embryonic stem cells) that can be genetically modified such that the genetic modification can be transferred through the germ line. There is a need in the art to improve the frequency of germline transmission of genetic modifications in rats.
В данной области техники существует необходимость в донорских крысиных плюрипотентных, тотипотентных и ЭС клетках от разных линий крыс, способных производить потомство F0, или полностью полученных из донорских клеток крыс F0. В данной области техники существует необходимость в донорских крысиных плюрипотентных, тотипотентных и ЭС клетках, способных производить крыс, имеющих генетическую модификацию зародышевой линии.There is a need in the art for donor rat pluripotent, totipotent, and ES cells from different strains of rats capable of producing F0 offspring, or entirely derived from donor F0 rat cells. There is a need in the art for donor rat pluripotent, totipotent and ES cells capable of producing rats having a germline genetic modification.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Предлагаются композиции и способы получения крысиных плюрипотентных и/или тотипотентных клеток, в том числе крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Предлагаются композиции и способы повышения эффективности или частоты трансмиссии через зародышевую линию генетических модификаций у крыс. В различных аспектах способы и композиции включают in vitro культуру, которая содержит фидерный клеточный слой и популяцию крысиных ЭС клеток или линию крысиных ЭС клеток, причем условия культивирования in vitro позволяют поддерживать плюрипотентность крысиной ЭС клетки. Дополнительно предлагаются различные способы создания крысиных ЭС клеточных линий. Также предлагается способ отбора генетически модифицированных крысиных ЭС клеток наряду с различными способами создания трансгенных крыс из генетически модифицированных крысиных ЭС клеток, представленными в настоящем документе. Дополнительно предлагаются различные наборы и изделия.Compositions and methods for producing rat pluripotent and/or totipotent cells, including rat embryonic stem (ES) cells, are provided. Compositions and methods are provided for increasing the efficiency or frequency of germline transmission of genetic modifications in rats. In various aspects, the methods and compositions comprise an in vitro culture that comprises a feeder cell layer and a population of rat ES cells or a rat ES cell line, wherein the in vitro culture conditions maintain the pluripotency of the rat ES cell. Additionally, various methods are provided for the generation of rat ES cell lines. Also provided is a method for selecting genetically modified rat ES cells along with various methods for generating transgenic rats from genetically modified rat ES cells presented herein. Additionally, various kits and products are offered.
Неограничивающие варианты реализации настоящего изобретения следующие:Non-limiting embodiments of the present invention are as follows:
1. Выделенная крысиная ЭС клетка из линии, выбранной из ACI или DA, где выделенная крысиная ЭС клетка способна передавать свой геном через зародышевую линию.1. An isolated rat ES cell from a lineage selected from ACI or DA, wherein the isolated rat ES cell is capable of germline transfer of its genome.
2. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 1, отличающаяся тем, что указанная клетка получена от крысы линии ACI.2. An isolated rat ES cell according to embodiment 1 of the present invention, characterized in that said cell is derived from an ACI rat.
3. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная клетка получена от крысы линии Dark Agouti (DA).2.3. An isolated rat ES cell according to embodiment 1 or 2 of the present invention, characterized in that said cell is derived from a Dark Agouti (DA) rat.
4. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 1, 2 или 3, отличающаяся тем, что указанная клетка является эуплоидной и способна передавать целевую генетическую модификацию через зародышевую линию.4. An isolated rat ES cell according to embodiment 1, 2 or 3 of the present invention, characterized in that said cell is euploid and capable of transmitting the targeted genetic modification through the germ line.
5. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 4, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка имеет эффективность трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации по меньшей мере 3%.5. An isolated rat ES cell according to
6. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 4, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка имеет эффективность трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации по меньшей мере 60%.6. An isolated rat ES cell according to
7. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-6, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка демонстрирует целевую эффективность гомологичной рекомбинации по меньшей мере 2%.7. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-6 of the present invention, wherein the rat ES cell exhibits a target homologous recombination efficiency of at least 2%.
8. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-8, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка способна к передаче целевой генетической модификации потомству после очередного цикла электропорации.8. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-8 of the present invention, characterized in that the rat ES cell is capable of transferring the targeted genetic modification to offspring after the next cycle of electroporation.
9. Выделенные крысиные ЭС клетки в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-8, отличающиеся тем, что крысиная ЭС клетка содержит одну или более, две или более или три или более целевых генетических модификаций.9. Isolated rat ES cells according to any one of embodiments 1-8 of the present invention, wherein the rat ES cell contains one or more, two or more, or three or more targeted genetic modifications.
10. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 4-9, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация представляет собой инсерцию, делецию, нокаут, нокин, точечную мутацию или их комбинацию.10. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 4-9 of the present invention, wherein the targeted genetic modification is an insertion, deletion, knockout, knockin, point mutation, or a combination thereof.
11. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 9, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация представляет собой по меньшей мере одну инсерцию гетерологичного полинуклеотида в геном клетки.11. An isolated rat ES cell according to
12. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения12. Isolated rat ES cell according to an embodiment of the present invention
11, отличающаяся тем, что гетерологичный полинуклеотид содержит селективный маркер.11, characterized in that the heterologous polynucleotide contains a selectable marker.
13. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения13. Isolated rat ES cell according to an embodiment of the present invention
12, отличающаяся тем, что (а) селективный маркер содержит неослабленный ген селективного маркера, функционально связанный с промотором; или (b) крысиная ЭС клетка содержит по меньшей мере 2 копии полинуклеотида, кодирующего селективный маркер.12, characterized in that (a) the selection marker contains an unattenuated selection marker gene operably linked to a promoter; or (b) the rat ES cell contains at least 2 copies of a polynucleotide encoding a selectable marker.
14. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 12, отличающаяся тем, что селективный маркер имеет повышенную активность по сравнению с селективным маркером дикого типа.14. An isolated rat ES cell in accordance with
15. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-14, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка образует сфероподобную колонию при посеве на фидерный клеточный слой в культуре, содержащей полипептид LIF, ингибитор GSK3 и ингибитор MEK.15. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-14 of the present invention, wherein the rat ES cell forms a spherical colony when seeded on a feeder cell layer in a culture containing a LIF polypeptide, a GSK3 inhibitor, and a MEK inhibitor.
16. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-15, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка, при культивации in vitro, свободно прикрепляются к фидернему клеточному слою.16. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-15 of the present invention, wherein the rat ES cell, when cultured in vitro, is loosely attached to the feeder cell layer.
17. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-16, отличающаяся тем, что для поддержания плюрипотентности указанной клетки нет необходимости в паракринной сигнализации LIF.17. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-16 of the present invention, characterized in that paracrine LIF signaling is not required to maintain the pluripotency of said cell.
18. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-17, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой мужскую (XY) крысиную ЭС клетку.18. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-17 of the present invention, wherein said cell is a male (XY) rat ES cell.
19. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-19, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой женскую (XX) крысиную ЭС клетку.19. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-19 of the present invention, wherein said cell is a female (XX) rat ES cell.
20. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-19, отличающаяся тем, что крысиную ЭС клетку можно пересевать до по меньшей мере 11 раз в среде, содержащей ингибитор GSK3 и ингибитор MEK , без снижения ее целевой эффективности или эффективности трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации.20. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-19 of the present invention, wherein the rat ES cell can be seeded up to at least 11 times in a medium containing a GSK3 inhibitor and a MEKα inhibitor without reducing its target efficacy, or efficiency of transmission through the germline of the target genetic modification.
21. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-20, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбранный из Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF-рецептора, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 или их комбинации.21. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-20 of the present invention, wherein the rat ES cells express at least one pluripotency marker selected from Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, or combinations thereof.
22. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-21, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности, выбранных из с-Мус, Ecat1, Rexo1 или их комбинации.22. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-21 of the present invention, wherein the rat ES cells do not express one or more pluripotency markers selected from c-Myc, Ecat1, Rexo1, or combinations thereof.
23. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-22, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более мезодермальных маркеров, выбранных из Brachyury, Bmpr2 или их комбинации.23. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-22 of the present invention, wherein the rat ES cells do not express one or more mesodermal markers selected from Brachyury, Bmpr2, or combinations thereof.
24. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-23, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более эндодермальных маркеров, выбранных из Gata6, Sox17, Sox7 или их комбинации.24. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-23 of the present invention, wherein the rat ES cells do not express one or more endodermal markers selected from Gata6, Sox17, Sox7, or combinations thereof.
25. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-24, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более нейронных маркеров, выбранных из Nestin, Рах6 или их комбинации.25. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-24 of the present invention, wherein the rat ES cells do not express one or more neuronal markers selected from Nestin, Pax6, or combinations thereof.
26. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-25, отличающаяся тем, что указанная клетка экспрессирует маркер плюрипотентности, включающий Oct-4, Sox2, щелочную фосфатазу или их комбинацию.26. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-25 of the present invention, wherein said cell expresses a pluripotency marker comprising Oct-4, Sox2, alkaline phosphatase, or a combination thereof.
27. Выделенная крысиная ЭС клетка в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-26, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка характеризуется экспрессией одного или более крысиных ЭСК-специфических генов, выбранных из одного или более: белка, связанного с адгезионными контактами (Ajap1), клаудина 5 (Cldn5), фактора 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы IV (Camk4), эфрина-А1 (Efnal), ЕРН рецептора А4 (Epha4), белка бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белка 1, подобного белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpl1), интерлейкина 36 бета (Il1f8), рецептора альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактора 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептора фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептора 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейронального рецептора пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазы нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокса 2 каудального типа (Cdx2), повторных доменов 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактора 1, связывающего лимфоидный энхансер (Lef1), гена 3, подобного Sal (дрозофила) (Sal13), гомеобокса 1 SATB (Satb1), miR-632 или их комбинации.27. An isolated rat ES cell according to any one of embodiments 1-26 of the present invention, wherein the rat ES cell is characterized by the expression of one or more rat ES cell-specific genes selected from one or more of: adhesion junction-associated protein ( Ajap1), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV (Camk4), ephrin-A1 (Efnal), EPH receptor A4 (Epha4), protein beta 5 intercellular gap contacts (Gjb5), insulin-like growth factor-binding protein 1 (Igfbpl1), interleukin 36 beta (Il1f8), interleukin 28 receptor alpha (Il28ra), asymmetry determination factor 1 (Lefty1), leukemia inhibitory factor receptor alpha (Lifr ), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), neuronal pentraxin receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal type homeobox 2 (Cdx2), repeated domains 1 fibro nectin III and ankyrin (Fank1), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split-related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer-binding factor 1 (Lef1), Sal-like gene 3 (Drosophila) (Sal13), SATB homeobox 1 (Satb1) , miR-632, or combinations thereof.
28. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток, отличающаяся тем, что по меньшей мере 70% крысиных ЭС клеток являются эуплоидными и образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro.28. An isolated population of rat ES cells, characterized in that at least 70% of rat ES cells are euploid and form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro.
29. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 28, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки получены от крысы линии ACI.29. An isolated population of rat ES cells according to embodiment 28, characterized in that the rat ES cells are derived from an ACI rat.
30. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 28, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки получены от крысы линии Dark Agouti (DA).30. An isolated population of rat ES cells according to embodiment 28, characterized in that the rat ES cells are derived from a Dark Agouti (DA) rat.
31. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-30, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки способны передавать свой геном через зародышевую линию.31. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-30, characterized in that the rat ES cells are capable of germline transfer of their genome.
32. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-31, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки имеют эффективность трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации по меньшей мере 3%.32. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-31, characterized in that the rat ES cells have a germline transmission efficiency of the targeted genetic modification of at least 3%.
33. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-31, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки имеют эффективность трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации по меньшей мере 60%.33. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-31, characterized in that the rat ES cells have a germline transmission efficiency of the targeted genetic modification of at least 60%.
34. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-31, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки демонстрируют целевую эффективность гомологичной рекомбинации по меньшей мере 2%.34. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-31, wherein the rat ES cells exhibit a target homologous recombination efficiency of at least 2%.
35. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-34, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки способны передавать целевую генетическую модификацию потомству после очередного цикла электропорации.35. An isolated population of rat ES cells according to any one of the embodiments of the present invention 28-34, characterized in that the rat ES cells are capable of transmitting the targeted genetic modification to offspring after the next cycle of electroporation.
36. Выделенная популяция в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-35, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки содержат одну или более, две или более или три или более целевых генетических модификаций и могут передавать целевую генетическую модификацию через зародышевую линию.36. An isolated population according to any of the embodiments of the present invention 28-35, wherein the rat ES cells contain one or more, two or more, or three or more targeted genetic modifications and can transmit the targeted genetic modification through the germline.
37. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 36, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация находится в локусе Rosa26 крысы.37. An isolated population of rat ES cells according to an embodiment of the present invention 36, characterized in that the target genetic modification is located at the Rosa26 locus of the rat.
38. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 36, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация представляет собой инсерцию, делецию, нокаут, нокин, точечную мутацию или их комбинацию.38. An isolated population of rat ES cells according to embodiment 36, wherein the targeted genetic modification is an insertion, deletion, knockout, knockin, point mutation, or a combination thereof.
39. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 36, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация содержит по меньшей мере одну инсерцию гетерологичного полинуклеотида в геном клетки.39. An isolated population of rat ES cells in accordance with embodiment 36 of the present invention, characterized in that the target genetic modification contains at least one insertion of a heterologous polynucleotide into the genome of the cell.
40. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 39, отличающаяся тем, что гетер о логичный полинуклеотид содержит селективный маркер.40. An isolated population of rat ES cells according to an embodiment of the present invention 39, characterized in that the heterologous polynucleotide contains a selectable marker.
41. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 40, отличающаяся тем, что41. An isolated population of rat ES cells according to embodiment 40, characterized in that
(a) селективный маркер содержит неослабленный ген селективного маркера, функционально связанный с промотором; или(a) the selectable marker comprises an unattenuated selectable marker gene operably linked to a promoter; or
(b) крысиная ЭС клетка содержит по меньшей мере 2 копии полинуклеотида, кодирующего селективный маркер.(b) the rat ES cell contains at least 2 copies of a polynucleotide encoding a selectable marker.
42. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 40, отличающаяся тем, что селективный маркер имеет повышенную активность по сравнению с селективным маркером дикого типа.42. An isolated population of rat ES cells in accordance with embodiment 40 of the present invention, characterized in that the selectable marker has increased activity compared to the wild-type selectable marker.
43. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-42, отличающаяся тем, что указанные клетки образуют сфероподобную колонию при посеве на фидерный клеточный слой в культуре, содержащей полипептид LIF, ингибитор GSK3 и ингибитор MEK.43. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-42, characterized in that said cells form a spherical colony when seeded on a feeder cell layer in a culture containing a LIF polypeptide, a GSK3 inhibitor and a MEK inhibitor.
44. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-43, отличающаяся тем, что указанные клетки при культивации in vitro свободно прикрепляются к фидернему клеточному слою.44. An isolated population of rat ES cells in accordance with any of the embodiments of the present invention 28-43, characterized in that these cells, when cultivated in vitro, freely attach to the feeder cell layer.
45. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-44, отличающаяся тем, что указанные клетки для поддержания плюрипотентности не требуют паракринной сигнализации LIF.45. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-44, characterized in that said cells do not require LIF paracrine signaling to maintain pluripotency.
46. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-44, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки представляют собой мужские (XY) крысиные ЭС клетки.46. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-44, wherein the rat ES cells are male (XY) rat ES cells.
47. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-44, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки представляют собой женские (XX) крысиные ЭС клетки.47. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-44, wherein the rat ES cells are female (XX) rat ES cells.
48. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-47, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки можно пересевать до по меньшей мере 11 раз в среде, содержащей ингибитор GSK3 и ингибитор MEK , без снижения ее целевой эффективности или эффективности трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации.48. An isolated population of rat ES cells according to any one of the embodiments of the present invention 28-47, characterized in that the rat ES cells can be plated up to at least 11 times in a medium containing a GSK3 inhibitor and a MEK inhibitor without reducing its target efficacy. or the efficiency of transmission through the germline of the targeted genetic modification.
49. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-48, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбранный из Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF-рецептора, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 или их комбинации.49. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-48, characterized in that the rat ES cells express at least one pluripotency marker selected from Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3 , Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, or combinations thereof.
50. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-49, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности, выбранных из с-Мус, Ecat1, Rexo1 или их комбинации.50. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-49, wherein the rat ES cells do not express one or more pluripotency markers selected from c-Myc, Ecat1, Rexo1, or combinations thereof.
51. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-50, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более мезодермальных маркеров, выбранных из Brachyury, Bmpr2 или их комбинации.51. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-50, wherein the rat ES cells do not express one or more mesodermal markers selected from Brachyury, Bmpr2, or combinations thereof.
52. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-51, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более эндодермальных маркеров, выбранных из Gata6, Sox17, Sox7 или их комбинации.52. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-51, wherein the rat ES cells do not express one or more endodermal markers selected from Gata6, Sox17, Sox7, or combinations thereof.
53. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-52, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более нейронных маркеров, выбранных из Nestin, Рах6 или их комбинации.53. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-52, wherein the rat ES cells do not express one or more neuronal markers selected from Nestin, Pax6, or combinations thereof.
54. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым вариантом реализации настоящего изобретения 28-53, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки экспрессируют маркер плюрипотентности, включающий Oct-4, Sox2, щелочную фосфатазу или их комбинацию.54. An isolated population of rat ES cells according to any embodiment of the present invention 28-53, wherein the rat ES cells express a pluripotency marker comprising Oct-4, Sox2, alkaline phosphatase, or a combination thereof.
55. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-54, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки характеризуются экспрессией одного или более крысиных ЭСК-специфических генов, выбранных из одного или более: белка, связанного с адгезионными контактами (Ajap1), клаудина 5 (Cldn5), фактора 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы IV (Camk4), эфрина-А1 (Efna1), ЕРН рецептора А4 (Epha4), белка бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белка 1, подобного белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpl1), интерлейкина 36 бета (Il1f8), рецептора альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактора 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептора фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептора 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейронального рецептора пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазы нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокса 2 каудального типа (Cdx2), повторных доменов 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (FoxE1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактора 1, связывающего лимфоидный энхансер (Lef1), гена 3, подобного Sal (дрозофила) (Sal13), гомеобокса 1 SATB (Satb 1), miR-632 или их комбинации.55. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-54, characterized in that the rat ES cells are characterized by the expression of one or more rat ES cells-specific genes selected from one or more of: adhesion junction-associated protein (Ajap1), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV (Camk4), ephrin-A1 (Efna1), EPH receptor A4 (Epha4), protein beta 5 intercellular gap junctions (Gjb5), insulin-like growth factor-binding protein 1 (Igfbpl1), interleukin 36 beta (Il1f8), interleukin 28 receptor alpha (Il28ra), asymmetry determination factor 1 (Lefty1), leukemia inhibitory factor receptor alpha ( Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), neuronal pentraxin receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal type homeobox 2 (Cdx2), repeat house new 1 fibronectin III and ankyrin (Fank1), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (FoxE1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer binding factor 1 (Lef1), Sal-like gene 3 (Drosophila) (Sal13), homeobox 1 SATB ( Satb 1), miR-632, or combinations thereof.
56. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-55, отличающаяся тем, что популяция содержит по меньшей мере 104 клеток.56. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-55, characterized in that the population contains at least 104 cells.
57. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-56, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки имеют одну или более характеристик, включающих:57. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-56, wherein the rat ES cells have one or more of the following characteristics:
a. по меньшей мере 90% крысиных ЭС клеток являются эуплоидными;a. at least 90% of rat ES cells are euploid;
b. по меньшей мере 70% крысиных ЭС клеток экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности; причем по меньшей мере один маркер плюрипотентности представляет собой Oct-4, Sox2, щелочную фосфатазу или их комбинацию;b. at least 70% of rat ES cells express at least one pluripotency marker; wherein at least one pluripotency marker is Oct-4, Sox2, alkaline phosphatase, or a combination thereof;
c. клетка из популяции крысиных ЭС клеток при объединении с крысиным эмбрионом-хозяином передает геном линии крысиных ЭС клеток потомству;c. a cell from a population of rat ES cells, when combined with a rat host embryo, transfers the genome of the rat ES cell line to offspring;
d. крысиные ЭС клетки при культивации in vitro свободно прикрепляются к фидернему клеточному слою;d. rat ES cells, when cultivated in vitro, are freely attached to the feeder cell layer;
e. крысиные ЭС клетки образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro; (f) крысиные ЭС клетки сохраняют плюрипотентность при культивации in vitro в средах, содержащих ингибитор GSK3, ингибитор MEK , LIF и фидерный клеточный слой, который не является генетически модифицированным для экспрессии LIF;e. rat ES cells form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro; (f) rat ES cells retain pluripotency when cultured in vitro in media containing a GSK3 inhibitor, a MEKα inhibitor, LIF, and a feeder cell layer that is not genetically modified to express LIF;
f. крысиная ЭС клетка демонстрирует целевую эффективность гомологичной рекомбинации по меньшей мере 2%;f. the rat ES cell demonstrates a target homologous recombination efficiency of at least 2%;
g. крысиные ЭС клетки сохраняют плюрипотентность in vitro без потребности в паракринной сигнализации LIF;g. rat ES cells retain pluripotency in vitro without the need for LIF paracrine signaling;
h. по меньшей мере 70% крысиных ЭС клеток являются эуплоидными и образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro;h. at least 70% of rat ES cells are euploid and form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro;
i. крысиные ЭС клетки экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбранный из Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF-рецептора, Lin28, Nanog, Oct4, Sox 15, Sox2, Utf1 или их комбинации;i. rat ES cells express at least one pluripotency marker selected from Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4,
j. крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более маркеров дифференциации, выбранных из с-Мус, Ecat 1, Rexo 1;j. rat ES cells do not express one or more differentiation markers selected from c-Myc, Ecat 1, Rexo 1;
k. крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более мезодермальных маркеров, выбранных из Brachyury, Bmpr2 или их комбинации;k. rat ES cells do not express one or more mesodermal markers selected from Brachyury, Bmpr2, or combinations thereof;
l. крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более эндодермальных маркеров, выбранных из Gata6, Sox17, Sox7 или их комбинации; и/илиl. rat ES cells do not express one or more endodermal markers selected from Gata6, Sox17, Sox7, or combinations thereof; and/or
m. крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более нейронных маркеров, выбранных из Nestin, Рах6 или их комбинации.m. rat ES cells do not express one or more neuronal markers selected from Nestin, Pax6, or combinations thereof.
58. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 28-57, отличающаяся тем, что (а) крысиные ЭС клетки получены из бластоцисты крысы; (b) крысиная ЭС клетка получена из эмбриона крысы на стадии морулы; и/или (с) линия крысиных ЭС клеток получена от крысы с суперовуляцией.58. An isolated population of rat ES cells according to any of the embodiments of the present invention 28-57, wherein (a) the rat ES cells are derived from a rat blastocyst; (b) a rat ES cell derived from a morula-stage rat embryo; and/or (c) the rat ES cell line is derived from a superovulating rat.
59. Культура in vitro, содержащая фидерный клеточный слой, популяцию крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и среду, содержащую фактор ингибирования лейкемии (LIF), ингибитор GSK3, и ингибитор MEK , причем по меньшей мере 70% крысиных ЭС клеток являются эуплоидными и крысиная ЭС клетка образует сфероподобную колонию.59. An in vitro culture containing a feeder cell layer, a population of rat embryonic stem (ES) cells, and a medium containing a leukemia inhibitory factor (LIF), a GSK3 inhibitor, and an MEKα inhibitor, wherein at least 70% of the rat ES cells are euploid and rat The ES cell forms a spherical colony.
60. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 59 или 60, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка свободно прикрепляется к фидернему клеточному слою.60. An in vitro culture according to embodiment 59 or 60, wherein the rat ES cell is loosely attached to the feeder cell layer.
61. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 59, 60 или 61, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки способны передавать свой геном через зародышевую линию.61. An in vitro culture according to embodiment 59, 60, or 61, wherein the rat ES cells are able to transfer their genome through the germ line.
62. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 59, 60 или 61, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки получены от крысы линии ACI.62. An in vitro culture according to embodiment 59, 60, or 61, wherein the rat ES cells are derived from an ACI rat.
63. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 59, 60 или 61, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки получены от крысы линии Dark Agouti (DA). 2.63. An in vitro culture according to embodiment 59, 60 or 61, wherein the rat ES cells are derived from a Dark Agouti (DA) rat. 2.
64. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-63, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки способны передавать целевую генетическую модификацию через зародышевую линию.64. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-63, characterized in that the rat ES cells are able to transmit the target genetic modification through the germ line.
65. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 64, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки имеют эффективность трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации по меньшей мере 3%.65. An in vitro culture according to an embodiment of the present invention 64, wherein the rat ES cells have a germline transmission efficiency of the target genetic modification of at least 3%.
66. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 64, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки имеют эффективность трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации по меньшей мере 60%.66. An in vitro culture according to an embodiment of the present invention 64, wherein the rat ES cells have a germline transmission efficiency of the target genetic modification of at least 60%.
67. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-66, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки демонстрируют целевую эффективность гомологичной рекомбинации по меньшей мере 2%.67. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-66, wherein the rat ES cells exhibit a target homologous recombination efficiency of at least 2%.
68. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-67, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка способна к передаче целевой генетической модификации потомству после очередного цикла электропорации.68. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-67, characterized in that the rat ES cell is capable of transferring the targeted genetic modification to the offspring after the next cycle of electroporation.
69. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-68, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка содержит одну или более, две или более или три или более целевых генетических модификаций.69. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-68, wherein the rat ES cell contains one or more, two or more, or three or more targeted genetic modifications.
70. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 69, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация представляет собой инсерцию, делецию, нокаут, нокин, точечную мутацию или их комбинацию.70. An in vitro culture according to an embodiment of the present invention 69, wherein the targeted genetic modification is an insertion, deletion, knockout, knockin, point mutation, or a combination thereof.
71. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 69, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация содержит по меньшей мере одну инсерцию гетерологичного полинуклеотида в геном клетки.71. An in vitro culture according to an embodiment of the present invention 69, characterized in that the target genetic modification contains at least one insertion of a heterologous polynucleotide into the genome of the cell.
72. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 71, отличающаяся тем, что гетерологичный полинуклеотид содержит селективный маркер.72. An in vitro culture according to embodiment 71, wherein the heterologous polynucleotide contains a selectable marker.
73. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 72, отличающаяся тем, что (а) селективный маркер содержит неослабленный ген селективного маркера, функционально связанный с промотором; или (b) крысиная ЭС клетка содержит по меньшей мере 2 копии полинуклеотида, кодирующего селективный маркер.73. An in vitro culture according to an embodiment of the present invention 72, wherein (a) the selectable marker comprises an unattenuated selectable marker gene operably linked to a promoter; or (b) the rat ES cell contains at least 2 copies of a polynucleotide encoding a selectable marker.
74. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 72, отличающаяся тем, что селективный маркер имеет повышенную активность по сравнению с селективным маркером дикого типа.74. An in vitro culture according to an embodiment of the present invention 72, wherein the selectable marker has increased activity compared to the wild-type selectable marker.
75. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-74, отличающаяся тем, что для поддержания плюрипотентности указанной клетки нет необходимости в паракринной сигнализации LIF.75. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-74, wherein paracrine LIF signaling is not required to maintain the pluripotency of said cell.
76. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-75, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой мужскую (XY) крысиную ЭС клетку.76. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-75, wherein said cell is a male (XY) rat ES cell.
77. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-75, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой женскую (XX) крысиную ЭС клетку.77. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-75, wherein said cell is a female (XX) rat ES cell.
78. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-77, отличающаяся тем, что крысиную ЭС клетку можно пересевать до по меньшей мере 11 раз в среде, содержащей ингибитор GSK3 и ингибитор MEK без снижения ее целевой эффективности или эффективности трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации.78. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-77, wherein the rat ES cell can be replated up to at least 11 times in a medium containing a GSK3 inhibitor and a MEK inhibitor without reducing its target efficiency or transmission efficiency. through the germline of targeted genetic modification.
79. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-78, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбранный из Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF-рецептора, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 или их комбинации.79. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-78, wherein the rat ES cells express at least one pluripotency marker selected from Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4 , Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, or combinations thereof.
80. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-79, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности, выбранных из с-Мус, Ecat1, Rexo1 или их комбинации.80. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-79, wherein the rat ES cells do not express one or more pluripotency markers selected from c-Myc, Ecat1, Rexo1, or combinations thereof.
81. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-80, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более мезодермальных маркеров, выбранных из Brachyury, Bmpr2 или их комбинации.81. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-80, wherein the rat ES cells do not express one or more mesodermal markers selected from Brachyury, Bmpr2, or combinations thereof.
82. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-81, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более эндодермальных маркеров, выбранных из Gata6, Sox17, Sox7 или их комбинации;82. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-81, wherein the rat ES cells do not express one or more endodermal markers selected from Gata6, Sox17, Sox7, or combinations thereof;
83. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-82, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более нейронных маркеров, выбранных из Nestin, Рах6 или их комбинации.83. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-82, wherein the rat ES cells do not express one or more neuronal markers selected from Nestin, Pax6, or combinations thereof.
84. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-83, отличающаяся тем, что указанная клетка экспрессирует маркер плюрипотентности, включающий Oct-4, Sox2, щелочную фосфатазу или их комбинацию.84. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-83, wherein said cell expresses a pluripotency marker comprising Oct-4, Sox2, alkaline phosphatase, or a combination thereof.
85. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-84, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки характеризуются экспрессией одного или более крысиных ЭСК-специфических генов, выбранных из одного или более: белка, связанного с адгезионными контактами (Ajap1), клаудина 5 (Cldn5), фактора 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы IV (Camk4), эфрина-А1 (Efna1), ЕРН рецептора А4 (Epha4), белка бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белка 1, подобного белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpl1), интерлейкина 36 бета(Il1f8), рецептора альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактора 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептора фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептора 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейронального рецептора пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазы нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокса 2 каудального типа (Cdx2), повторных доменов 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактора 1, связывающего лимфоидный энхансер (Lef1), генаЗ, подобного Sal (дрозофила) (Sal13), гомеобокса 1 SATB (Satb1), miR-632 или их комбинации.85. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-84, wherein the rat ES cells are characterized by the expression of one or more rat ES cells-specific genes selected from one or more of: adhesion junction-associated protein (Ajap1 ), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV (Camk4), ephrin-A1 (Efna1), EPH receptor A4 (Epha4), gap junction protein beta 5 (Gjb5), Insulin-like growth factor-binding protein 1 (Igfbpl1), Interleukin 36 beta (Il1f8), Interleukin 28 receptor alpha (Il28ra), Asymmetry determination factor 1 (Lefty1), Leukemia inhibitory factor receptor alpha (Lifr) , lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), neuronal pentraxin receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal type homeobox 2 (Cdx2), fibronectin III repeat domains 1 and ankyrin (Fank1), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1 ), hairy/enhancer-of-split-related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer-binding factor 1 (Lef1), Sal-like gene3 (Drosophila) (Sal13), homeobox 1 SATB (Satb1), miR- 632 or combinations thereof.
86. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-84, отличающаяся тем, что концентрация LIF составляет от 50 Ед/мл до 150 Ед/мл.86. In vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-84, characterized in that the concentration of LIF is from 50 U/ml to 150 U/ml.
87. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-85, отличающаяся тем, что концентрация LIF составляет 100 Ед/мл.87. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-85, characterized in that the concentration of LIF is 100 U/ml.
88. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-87, отличающаяся тем, что LIF получен от мыши или имеет по меньшей мере 92% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1.88. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-87, wherein the LIF is derived from a mouse or has at least 92% sequence identity with SEQ ID NO: 1.
89. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-88, отличающаяся тем, что крысиная ЭС клетка способна поддерживать плюрипотентность без потребности в паракринной сигнализации LIF.89. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-88, wherein the rat ES cell is capable of maintaining pluripotency without the need for LIF paracrine signaling.
90. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-89, отличающаяся тем, что фидерный клеточный слой не модифицирован генетически для экспрессии LIF.90. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-89, wherein the feeder cell layer is not genetically modified to express LIF.
91. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-90, отличающаяся тем, что фидерный клеточный слой содержит монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ).91. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-90, wherein the feeder cell layer contains a monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
92. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-91, отличающаяся тем, что ингибитор MEK представляет собой PD0325901.92. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-91, wherein the MEK inhibitor is PD0325901.
93. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-92, отличающаяся тем, что ингибитор GSK-3 представляет собой CHIR99021.93. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-92, wherein the GSK-3 inhibitor is CHIR99021.
94. Культура in vitro в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 59-93, отличающаяся тем, что популяция крысиных ЭС клеток получена из эмбриона крысы на стадии бластоцисты или эмбриона крысы на стадии морулы.94. An in vitro culture according to any of the embodiments of the present invention 59-93, wherein the rat ES cell population is derived from a rat blastocyst embryo or a rat morula embryo.
95. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 94, отличающаяся тем, что эмбрион крысы на стадии бластоцисты или на стадии морулы дополнительно содержит разрастание аморфной недифференцированной массы крысиных ЭС клеток.95. An in vitro culture according to an embodiment of the present invention 94, characterized in that the rat embryo at the blastocyst stage or at the morula stage additionally contains an outgrowth of an amorphous undifferentiated mass of rat ES cells.
96. Культура in vitro в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 94, отличающаяся тем, что популяция крысиных ЭС клеток содержит изолированное разрастание аморфной недифференцированной массы крысиных ЭС клеток.96. An in vitro culture according to an embodiment of the present invention 94, wherein the population of rat ES cells contains an isolated outgrowth of an amorphous undifferentiated mass of rat ES cells.
97. Способ создания линии крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, включающий: (а) культивирование in vitro первого фидерного клеточного слоя и эмбриона крысы на стадии морулы или бластоцисты, где у эмбриона крысы на стадии морулы или бластоцисты была удалена блестящая оболочка яйцеклетки, и где условия культивирования сохраняют плюрипотентность крысиной ЭС клетки и содержат среду с мышиным фактором ингибирования лейкемии (LIF) или последовательностью, имеющей по меньшей мере 91% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 и имеющей активность LIF, и с ингибитором GSK3, и ингибитором MEK ; и, (b) перенос разрастания аморфной недифференцированной массы крысиных ЭС клеток в лунку для культивирования in vitro, содержащую второй фидерный клеточный слой, и культивирование разрастания в условиях, включающих среду с мышиным LIF или активным вариантом мышиного LIF, поддерживая тем самым плюрипотентность крысиных ЭС клеток и создавая линию крысиных ЭС клеток.97. A method of creating a rat embryonic stem (ES) cell line, comprising: (a) in vitro cultivation of the first feeder cell layer and a rat embryo at the morula or blastocyst stage, where the zona pellucida has been removed from the rat embryo at the morula or blastocyst stage, and wherein the culture conditions retain the pluripotency of the rat ES cell and contain a medium with mouse leukemia inhibitory factor (LIF) or a sequence having at least 91% sequence identity with SEQ ID NO: 1 and having LIF activity, and with a GSK3 inhibitor and an MEK inhibitor; and, (b) transferring the outgrowth of an amorphous, undifferentiated mass of rat ES cells into an in vitro culture well containing a second feeder cell layer, and culturing the outgrowth under conditions including mouse LIF or mouse LIF active variant medium, thereby maintaining the pluripotency of the rat ES cells. and creating a line of rat ES cells.
98. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 97, отличающийся тем, что линию крысиных ЭС клеток пересевают по меньшей мере 5 раз.98. The method according to embodiment 97, wherein the rat ES cell line is seeded at least 5 times.
99. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 97 или 98, отличающийся тем, что линию крысиных ЭС клеток пересевают по меньшей мере 10 раз.99. The method according to embodiment 97 or 98, wherein the rat ES cell line is seeded at least 10 times.
100. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 97, 98 или 99, отличающийся тем, что среда содержит от около 50 Ед/мл до около 150 Ед/мл мышиного LIF.100. The method according to embodiment 97, 98 or 99, wherein the medium contains from about 50 U/ml to about 150 U/ml mouse LIF.
101. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 97-100, отличающийся тем, что среда содержит около 100 Ед/мл мышиного LIF.101. The method according to any of the embodiments of the present invention 97-100, wherein the medium contains about 100 U/ml mouse LIF.
102. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 97-101, отличающийся тем, что фидерный клеточный слой не модифицирован генетически для экспрессии LIF.102. The method according to any of the embodiments of the present invention 97-101, wherein the feeder cell layer is not genetically modified to express LIF.
103. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 97-102, отличающийся тем, что фидерный клеточный слой содержит монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ).103. The method according to any of the embodiments of the present invention 97-102, wherein the feeder cell layer contains a monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
104. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 97-103, отличающийся тем, что ингибитор MEK представляет собой PD0325901.104. The method according to any of the embodiments of the present invention 97-103, wherein the MEK inhibitor is PD0325901.
105. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 97-104,отличающийся тем, что ингибитор GSK-3 представляет собой CHIR99021.105. The method according to any of the embodiments of the present invention 97-104, wherein the GSK-3 inhibitor is CHIR99021.
106. Способ в соответствии с любым вариантом реализации настоящего изобретения 97-105, отличающийся тем, что (а) линия крысиных ЭС клеток получена от крыс линии ACI или получена от крыс линии Dark Agouti (DA); (b) линия крысиных ЭС клеток получена от эмбриона крысы на стадии морулы или на стадии бластоцисты; и/или, (с) линия крысиных ЭС клеток получена от эмбриона на стадии морулы или на стадии бластоцисты от крысы с суперовуляцией.106. The method according to any embodiment of the present invention 97-105, wherein (a) the rat ES cell line is derived from ACI rats or is derived from Dark Agouti (DA) rats; (b) the rat ES cell line is derived from a morula or blastocyst rat embryo; and/or, (c) the rat ES cell line is derived from a morula or blastocyst embryo from a superovulating rat.
107. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 97-106, отличающийся тем, что среда дополнительно содержит по меньшей мере один из: ингибитора рецептора FGF, ингибитора ROCK или ингибитора ALK.107. The method according to any of the embodiments of the present invention 97-106, wherein the medium further comprises at least one of an FGF receptor inhibitor, a ROCK inhibitor, or an ALK inhibitor.
108. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 107, отличающийся тем, что ингибитор рецептора FGF представляет собой PD184352, ингибитор ROCK представляет собой Y-27632 или ингибитор ALK представляет собой А-83-01.108. The method according to embodiment 107, wherein the FGF receptor inhibitor is PD184352, the ROCK inhibitor is Y-27632, or the ALK inhibitor is A-83-01.
109. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 97-108, отличающийся тем, что по меньшей мере одна крысиная ЭС клетка имеет эффективность трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации по меньшей мере 3%.109. The method according to any of the embodiments of the present invention 97-108, wherein at least one rat ES cell has a germline transmission efficiency of the target genetic modification of at least 3%.
110. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 97-109, отличающийся тем, что эффективность трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации составляет по меньшей мере 60%.110. A method according to any of the embodiments of the present invention 97-109, wherein the germline transmission efficiency of the target genetic modification is at least 60%.
111. Способ отбора крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, имеющих стабильно включенный в геном гетерологичный полинуклеотид, включающий: (а) предоставление in vitro популяции крысиных ЭС клеток; (b) введение по меньшей мере в одну крысиную ЭС клетку гетерологичного полинуклеотида, содержащего селективный маркер, функционально связанный с промотором, активным в крысиной ЭС клетке; и (с) культивирование in vitro популяции крысиных ЭС клеток попеременно в первой и второй культуральной среде, причем первая культуральная среда содержит эффективное количество селективного агента в течение первого периода времени, а вторая культуральная среда не содержит селективного агента, причем условия культивирования in vitro являются достаточными для сохранения плюрипотентности; тем самым обеспечивая отбор крысиных ЭС клеток, имеющих стабильно включенный в их геном гетерологичный полинуклеотид.111. A method for selecting rat embryonic stem (ES) cells having a heterologous polynucleotide stably included in the genome, comprising: (a) providing an in vitro population of rat ES cells; (b) introducing into at least one rat ES cell a heterologous polynucleotide containing a selectable marker operably linked to a promoter active in the rat ES cell; and (c) culturing in vitro a population of rat ES cells alternately in a first and a second culture medium, wherein the first culture medium contains an effective amount of a selective agent for a first period of time and the second culture medium does not contain a selective agent, wherein the in vitro culture conditions are sufficient to maintain pluripotency; thereby ensuring the selection of rat ES cells having a heterologous polynucleotide stably included in their genome.
112. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 111, отличающийся тем, что чередование первой и второй культуральной среды проводят каждые 24 часа.112. The method according to the embodiment of the present invention 111, characterized in that the alternation of the first and second culture medium is carried out every 24 hours.
113. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 111 или 112, отличающийся тем, что селективный маркер придает устойчивость к антибиотику.113. The method according to embodiment 111 or 112, wherein the selectable marker confers antibiotic resistance.
114. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 111-113, отличающийся тем, что антибиотик представляет собой G418.114. The method according to any of the embodiments of the present invention 111-113, wherein the antibiotic is G418.
115. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 111-114, отличающийся тем, что селективный маркер представляет собой неомицинфосфотрансферазу (neor), гигромицин-В фосфотрансферазу (hygr), пуромицин-М-ацетилтрансферазу (puror), бластицидин-S дезаминазу (bsrr), ксантин/гуанин фосфорибозилтрансферазу (gpt) и тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-k) или их комбинацию.115. The method according to any of the embodiments of the present invention 111-114, characterized in that the selection marker is neomycin phosphotransferase (neo r ), hygromycin-B phosphotransferase (hyg r ), puromycin-M-acetyltransferase (puro r ), blasticidin -S deaminase (bsr r ), xanthine/guanine phosphoribosyltransferase (gpt) and herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-k), or a combination thereof.
116. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 111-115, отличающийся тем, что (а) селективный маркер имеет повышенную активность по сравнению с селективным маркером дикого типа; и/или (b) множество копий селективного маркера стабильно введены в геном крысиной ЭС клетки.116. The method according to any of the embodiments of the present invention 111-115, characterized in that (a) the selection marker has increased activity compared to the wild-type selection marker; and/or (b) multiple copies of the selectable marker are stably introduced into the rat ES cell genome.
117. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 116, отличающийся тем, что селективный маркер представляет собой не ослабленный селективный маркер.117. The method according to embodiment 116, wherein the selection marker is an unattenuated selection marker.
118. Способ генетической модификации выделенной крысиной эмбриональной стволовой (ЭС) клетки, включающий введение в геном выделенной крысиной ЭС клетки в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-58 гетерологичного полинуклеотида для получения генетически модифицированной крысиной ЭС клетки.118. A method for genetically modifying an isolated rat embryonic stem (ES) cell, comprising introducing a heterologous polynucleotide into the genome of the isolated rat ES cell according to any of the embodiments of the present invention 1-58 to obtain a genetically modified rat ES cell.
119. Способ получения генетически модифицированной крысы, включающий:119. A method for obtaining a genetically modified rat, including:
(a) введение в геном выделенной крысиной эмбриональной стволовой (ЭС) клетки в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 1-58 гетерологичного полинуклеотида для получения крысиной ЭС клетки с генетической модификацией;(a) introducing into the genome of the isolated rat embryonic stem (ES) cell according to any of the embodiments of the present invention 1-58 a heterologous polynucleotide to obtain a genetically modified rat ES cell;
(b) введение по меньшей мере одной из крысиных ЭС клеток, имеющих целевую генетическую модификацию, в крысиный эмбрион-хозяин для получения эмбриона F0;(b) introducing at least one of the rat ES cells having the targeted genetic modification into a rat host embryo to obtain an F0 embryo;
(c) имплантацию эмбриона F0 суррогатной матери;(c) implantation of an F0 embryo in a surrogate mother;
(d) созревание эмбриона F0 в организме суррогатной матери до соответствующего срока; и (е) идентификацию крысы F0, имеющей целевую генетическую модификацию.(d) maturation of the F0 embryo in the body of the surrogate mother before the appropriate term; and (e) identifying an F0 rat having the targeted genetic modification.
120. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 119, дополнительно включающий скрещивание самцов крыс F0 с самками крыс дикого типа с получением потомства F1, являющегося гетерозиготным по целевой генетической модификации.120. The method according to embodiment 119, further comprising crossing male F0 rats with female wild-type rats to produce F1 offspring that are heterozygous for the targeted genetic modification.
121. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 120, дополнительно включающий скрещивание самцов крыс F0 с самками крыс дикого типа с получением потомства F1, являющегося гетерозиготным по целевой генетической модификации.121. The method of embodiment 120 further comprising crossing male F0 rats with female wild-type rats to produce F1 offspring that are heterozygous for the targeted genetic modification.
122. Способ в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения 119, дополнительно включающий скрещивание самцов крыс потомства F1 с самками крыс потомства F1 с получением потомства F2, являющегося гомозиготным по генетической модификации.122. The method according to embodiment 119 further comprising mating male F1 progeny rats with female F1 progeny rats to produce F2 progeny that are homozygous for the genetic modification.
123. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 119-122, отличающийся тем, что по меньшей мере 3% крыс F0, имеющих генетическую модификацию, передают эту генетическую модификацию потомству F1.123. The method according to any of the embodiments of the present invention 119-122, wherein at least 3% of the F0 rats having the genetic modification pass the genetic modification to the F1 offspring.
124. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 119-123, отличающийся тем, что по меньшей мере 10% крыс F0, имеющих генетическую модификацию, передают эту генетическую модификацию потомству F1.124. The method according to any of the embodiments of the present invention 119-123, wherein at least 10% of the F0 rats having the genetic modification pass the genetic modification to the F1 offspring.
125. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 119-124, отличающийся тем, что по меньшей мере 60% крыс F0, имеющих генетическую модификацию, передают эту генетическую модификацию потомству F1.125. The method according to any of the embodiments of the present invention 119-124, wherein at least 60% of the F0 rats having the genetic modification pass the genetic modification to the F1 offspring.
126. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 119-125, отличающийся тем, что генетически модифицированная крысиная ЭС клетка получена из той же линии крыс, что и крысиный эмбрион-хозяин.126. The method according to any of the embodiments of the present invention 119-125, wherein the genetically modified rat ES cell is derived from the same strain of rats as the rat host embryo.
127. Способ в соответствии с любым из вариантов реализации настоящего изобретения 119-127, отличающийся тем, что генетически модифицированная крысиная ЭС клетка получена из линии крыс, отличной от той, к которой принадлежит крысиный эмбрион-хозяин.127. The method according to any of the embodiments of the present invention 119-127, wherein the genetically modified rat ES cell is derived from a strain of rats other than that of the rat host embryo.
128. Выделенная популяция крысиных ЭС клеток по любому из предшествующих пунктов, культивирование in vitro по любому из предшествующих пунктов или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что крысиные ЭС клетки в популяции содержат следующее:128. An isolated population of rat ES cells according to any of the preceding claims, in vitro culture according to any of the preceding claims, or a method according to any of the preceding claims, characterized in that the rat ES cells in the population contain the following:
(a) по меньшей мере 90% крысиных ЭС клеток являются эуплоидными;(a) at least 90% of rat ES cells are euploid;
(b) по меньшей мере 70% крысиных ЭС клеток экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности; причем по меньшей мере один маркер плюрипотентности представляет собой Oct-4, Sox2, щелочную фосфатазу или их комбинацию;(b) at least 70% of rat ES cells express at least one pluripotency marker; wherein at least one pluripotency marker is Oct-4, Sox2, alkaline phosphatase, or a combination thereof;
(c) клетка из популяции крысиных ЭС клеток при объединении с крысиным эмбрионом-хозяином передает геном линии крысиных ЭС клеток потомству;(c) a cell from a rat ES cell population, when combined with a rat host embryo, transfers the genome of the rat ES cell line to offspring;
(d) крысиные ЭС клетки при культивации in vitro свободно прикрепляются к фидернему клеточному слою;(d) rat ES cells, when cultured in vitro, freely attach to the feeder cell layer;
(e) крысиные ЭС клетки образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro;(e) rat ES cells form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro;
(f) крысиные ЭС клетки сохраняют плюрипотентность при культивации in vitro в средах, содержащих ингибитор GSK3, ингибитор MEK , LIF и фидерный клеточный слой, который не является генетически модифицированным для экспрессии LIF;(f) rat ES cells retain pluripotency when cultured in vitro in media containing a GSK3 inhibitor, a MEKα inhibitor, LIF, and a feeder cell layer that is not genetically modified to express LIF;
(g) крысиная ЭС клетка демонстрирует целевую эффективность гомологичной рекомбинации по меньшей мере 2%;(g) the rat ES cell exhibits a target homologous recombination efficiency of at least 2%;
(h) крысиные ЭС клетки сохраняют плюрипотентность in vitro без потребности в паракринной сигнализации LIF;(h) rat ES cells retain pluripotency in vitro without the need for LIF paracrine signaling;
(i) по меньшей мере 70% крысиных ЭС клеток являются эуплоидными и образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro;(i) at least 70% of rat ES cells are euploid and form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro;
(j) крысиные ЭС клетки экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбранный из Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF-рецептора, Lin28, Nanog, Oct4, Sox 15, Sox2, Utf1 или их комбинации;(j) rat ES cells express at least one pluripotency marker selected from Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4,
(k) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более маркеров дифференциации, выбранных из с-Мус, Ecat 1, Rexo 1.(k) rat ES cells do not express one or more differentiation markers selected from c-Myc, Ecat 1, Rexo 1.
(l) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более мезодермальных маркеров, выбранных из Brachyury, Bmpr2 или их комбинации;(l) rat ES cells do not express one or more mesodermal markers selected from Brachyury, Bmpr2, or combinations thereof;
(m) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более эндодермальных маркеров, выбранных из Gata6, Sox17, Sox7 или их комбинации; и/или(m) rat ES cells do not express one or more endodermal markers selected from Gata6, Sox17, Sox7, or combinations thereof; and/or
(n) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более нейронных маркеров, выбранных из Nestin, Рах6 или их комбинации.(n) rat ES cells do not express one or more neuronal markers selected from Nestin, Pax6, or combinations thereof.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУРBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Файл настоящего патента или заявки содержит по меньшей мере один цветной рисунок. Копии публикации этого патента или патентной заявки с цветным рисунком (рисунками) будут предоставлены Управлением по запросу и после оплаты необходимой пошлины.The present patent or application file contains at least one color drawing. Copies of the publication of this patent or patent application with color drawing(s) will be made available by the Office upon request and upon payment of the required fee.
На ФИГ. 1 изображены кЭСК, растущие в виде компактных сферических колоний, которые обычно не прикреплены и плавают в чашке для культивирования.FIG. 1 shows hESCs growing as compact spherical colonies that are usually not attached and float in the culture dish.
На ФИГ. 2A-D изображены различные маркеры плюрипотентности, экспрессируемые кЭСК: на А изображен Oct-4 (зеленый); на В изображен Sox-2 (красный); на С изображен DAPI (голубой); на D изображено наложение маркеров плюрипотентности, экспрессируемых кЭСК.FIG. 2A-D depict various pluripotency markers expressed by hESCs: A depicts Oct-4 (green); B depicts Sox-2 (red); C depicts DAPI (blue); D depicts an overlay of pluripotency markers expressed by hESCs.
На ФИГ. 3 показано, что кЭСК экспрессируют слабые уровни щелочной фосфатазы (маркер плюрипотентности) (слева) и кариотип для линии DA.2B представляет собой 42X,Y (справа). Кариотипирование выполняли потому что кЭСК часто становятся тетраплоидными; таким образом, был проведен предварительный скрининг линий путем подсчета препаратов метафазных хромосом, и линии в основном с нормальными количествами были затем кариотипированы по соответствующей форме.FIG. 3 shows that hESCs express low levels of alkaline phosphatase (a marker of pluripotency) (left) and the karyotype for the DA.2B lineage is 42X,Y (right). Karyotyping was performed because hESCs often become tetraploid; thus, a preliminary screening of lines by counting preparations of metaphase chromosomes was carried out, and lines with mostly normal numbers were then karyotyped in the appropriate form.
На ФИГ. 4 показан вид вблизи кЭСК, представленных на ФИГ. 1.FIG. 4 is a near view of the hESCs shown in FIG. one.
На ФИГ. 5 изображено получение химер путем инъекций бластоцисты и передачи генома кЭСК через зародышевую линию; химеры, произведенные посредством инъекций бластоцисты с использованием родительских ACI.G1 кЭСК; у высокого процента химер, как правило, морды альбиносов.FIG. 5 shows the production of chimeras by injection of a blastocyst and transfer of the hESC genome through the germline; chimeras produced by blastocyst injection using parental ACI.G1 kESCs; a high percentage of chimeras tend to have albino faces.
На ФИГ. 6 изображены детеныши агути F1 из помета с альбиносами, произведенными от химеры ACI/SD, помеченной звездочкой (*) на ФИГ. 5.FIG. 6 depicts F1 agouti pups from an albino litter derived from the ACI/SD chimera marked with an asterisk (*) in FIG. 5.
На ФИГ. 7 на панели А изображено нацеливание на крысиный локус Rosa 26, который находится между генами Setd5 и Thumpd3 как и у мыши, на том же расстоянии. На панели А показана структура мышиного локуса Rosa 26. Транскрипты mRosa26 состоят из 2 или 3 экзонов. На панели В показана структура локуса rRosa26; крысиный локус содержит второй экзон 1 (Exlb) в дополнение к гомологичному экзону мышиного экзона 1 (Exla); у крыс не был выявлен третий экзон. На панели С показан целевой аллель rRosa26; группы гомологии по 5 тысяч оснований каждая клонировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК от кЭСК DA; целевой аллель содержит кассету SA-lacZ-hUB-neo замещающую делецию 117 п.о. в интроне rRosa26.FIG. 7, panel A shows the targeting of the rat Rosa 26 locus, which is located between the Setd5 and Thumpd3 genes as in the mouse, at the same distance. Panel A shows the structure of the mouse Rosa 26 locus. mRosa26 transcripts consist of 2 or 3 exons. Panel B shows the structure of the rRosa26 locus; the rat locus contains a second exon 1 (Exlb) in addition to the homologous exon of the mouse exon 1 (Exla); in rats, the third exon was not detected. Panel C shows the target rRosa26 allele; homology groups of 5 kb each were cloned by PCR using genomic DNA from DA hESCs; the target allele contains the SA-lacZ-hUB-neo cassette with a 117 bp replacement deletion. in the rRosa26 intron.
На ФИГ. 8А изображен контрольный мозг 14-недельных крыс дикого типа, которых лечили X-gal. В контрольном мозге продемонстрирован низкий уровень фонового окрашивания в отношении LacZ (вид сзади).FIG. 8A shows the control brains of 14 week old X-gal treated wild type rats. The control brain showed a low level of background staining for LacZ (posterior view).
На ФИГ. 8В изображена экспрессия LacZ в мозге гетерозиготных крыс rRosa26 (в возрасте 14 недель). Репортер lacZ экспрессировался повсеместно в мозге гетерозиготной крысы rRosa26.FIG. 8B depicts LacZ expression in the brains of heterozygous rRosa26 rats (at 14 weeks of age). The lacZ reporter was expressed ubiquitously in the brain of the heterozygous rat rRosa26.
На ФИГ. 8С изображены контрольное сердце и тимус (вставка) 14-недельной крысы дикого типа, которую лечили X-gal. В контрольном сердце и тимусе продемонстрирован низкий уровень фонового окрашивания в отношении LacZ.FIG. 8C shows the control heart and thymus (inset) of a 14 week old WT rat treated with X-gal. The control heart and thymus showed a low level of background staining for LacZ.
На ФИГ. 8D изображена экспрессия LacZ в сердце и тимусе (вставка) гетерозиготной крысы rRosa26 в возрасте 14 недель. Репортер lacZ экспрессировался повсеместно в сердце и тимусе гетерозиготной крысы rROSA26.FIG. 8D shows LacZ expression in the heart and thymus (inset) of a heterozygous rRosa26 rat at 14 weeks of age. The lacZ reporter was expressed ubiquitously in the heart and thymus of heterozygous rat rROSA26.
На ФИГ. 8Е изображено контрольное легкое 14-недельной крысы дикого типа, которую лечили X-gal. В контрольном легком продемонстрирован низкий уровень фонового окрашивания в отношении LacZ.FIG. 8E shows a control lung from a 14 week old WT rat treated with X-gal. The control lung showed a low level of background staining for LacZ.
На ФИГ. 8F изображена экспрессия LacZ в легком гетерозиготной крысы rRosa26 в возрасте 14 недель. Репортер lacZ экспрессировался повсеместно в легком гетерозиготной крысы rRosa26.FIG. 8F depicts LacZ expression in the lung of a heterozygous rRosa26 rat at 14 weeks of age. The lacZ reporter was expressed ubiquitously in the lung of the heterozygous rat rRosa26.
На ФИГ. 8G и Η изображена экспрессия LacZ у эмбриона е12.5. В отличие от контрольного эмбриона дикого типа (Н), который демонстрирует низкий уровень фонового окрашивания LacZ, гетерозиготный эмбрион rRosa26 демонстрирует повсеместную экспрессию репортера LacZ по всему эмбриону.FIG. 8G and Η depict LacZ expression in the e12.5 embryo. In contrast to the wild-type (H) control embryo, which exhibits low levels of LacZ background staining, the heterozygous rRosa26 embryo exhibits ubiquitous expression of the LacZ reporter throughout the embryo.
На ФИГ. 8I и J изображена экспрессия LacZ у эмбриона e14.5. В отличие от контрольного эмбриона дикого типа (J), который демонстрирует низкий уровень фонового окрашивания LacZ, гетерозиготный эмбрион rRosa26 крысы демонстрирует повсеместную экспрессию репортера LacZ по всему эмбриону.FIG. 8I and J depict LacZ expression in the e14.5 embryo. In contrast to the wild-type control embryo (J), which exhibits low levels of LacZ background staining, the heterozygous rRosa26 rat embryo exhibits ubiquitous expression of the LacZ reporter throughout the embryo.
На Фиг. 9А-В представлена фотография, демонстрирующая анализ числа хромосом в линии ЭС клеток крыс ACI.G1.On FIG. 9A-B is a photograph showing the analysis of the number of chromosomes in the rat ES cell line ACI.G1.
На Фиг. 10А-В представлена фотография, демонстрирующая анализ числа хромосом в линии ЭС клеток крыс DA.2B.On FIG. 10A-B is a photograph showing an analysis of the number of chromosomes in the DA.2B rat ES cell line.
На Фиг. 11А-В представлена фотография, демонстрирующая анализ числа хромосом в линии крысиных ЭС клеток DA.C2.On FIG. 11A-B is a photograph showing an analysis of the number of chromosomes in the DA.C2 rat ES cell line.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Ниже более подробно описаны настоящие способы и композиции со ссылкой на прилагаемые рисунки, на которых показаны некоторые, но не все, варианты реализации способов и композиций данного изобретения. Действительно, эти способы и композиции могут быть реализованы во многих различных формах и не должны быть истолкованы как ограниченные вариантами реализации настоящего изобретения, изложенными в данном документе; скорее эти варианты реализации настоящего изобретения представлены таким образом, что это описание будет удовлетворять соответсвующим требованиям законодательства. Одинаковые номера относятся к одинаковым элементам по всему описанию.The present methods and compositions are described in more detail below with reference to the accompanying drawings, which show some, but not all, embodiments of the methods and compositions of the present invention. Indeed, these methods and compositions may be implemented in many different forms and should not be construed as being limited to the embodiments of the present invention set forth herein; rather, these embodiments of the present invention are presented in such a way that this description will satisfy the relevant legal requirements. Like numbers refer to like elements throughout the description.
Многие модификации и другие варианты реализации способов и композиций, изложенные в настоящем документе, будут очевидны специалистам в той области техники, к которой эти способы и композиции относятся, с преимуществом идей изобретения, представленных в изложенном выше описании и сопутствующих рисунках. Таким образом, следует понимать, что способы и композиции не должны быть ограничены конкретными раскрытыми вариантами реализации настоящего изобретения и что модификации и другие варианты реализации настоящего изобретения включены в объем прилагаемой формулы изобретения. Хотя в данном документе используются конкретные термины, они используются только в общем и описательном смысле, а не для целей ограничения.Many modifications and other embodiments of the methods and compositions set forth herein will be apparent to those skilled in the art to which these methods and compositions pertain, taking advantage of the teachings of the invention presented in the foregoing description and accompanying drawings. Thus, it should be understood that the methods and compositions are not to be limited to the specific disclosed embodiments of the present invention and that modifications and other embodiments of the present invention are included within the scope of the appended claims. Although specific terms are used in this document, they are used in a general and descriptive sense only and not for purposes of limitation.
I. Общие сведенияI. General information
Крысы уже давно являются предпочтительными организмами моделей грызунов в нескольких областях биомедицинских исследований, таких как сердечно-сосудистые заболевания, обмен веществ, токсикология, нейробиология и поведение. Были разработаны сотни крысиных линий; некоторые являются отличными моделями сложных заболеваний человека, таких как гипертония, диабет и рак. Однако понимание генетики этих моделей было сильно затруднено из-за сложности модификации генома крыс контролируемым образом. Благодаря использованию сайт-специфических эндонуклеаз можно получать мутации в гене, представляющем интерес, но этот способ остается неточным и дорогостоящим. Нацеливание и передача зародышевой линии крысиных ЭС клеток остается сложной задачей.Rats have long been the preferred rodent model organisms in several areas of biomedical research, such as cardiovascular disease, metabolism, toxicology, neuroscience, and behavior. Hundreds of rat lines have been developed; some are excellent models of complex human diseases such as hypertension, diabetes, and cancer. However, understanding the genetics of these models has been difficult due to the difficulty of modifying the rat genome in a controlled manner. Through the use of site-specific endonucleases it is possible to obtain mutations in the gene of interest, but this method remains inaccurate and costly. Targeting and germline transmission of rat ES cells remains challenging.
В данном документе описано выделение крысиных ЭС клеток (кЭСК) от двух инбредных крысиных линий. Были получены кЭСК от линий DA и ACI. Эти клетки экспрессируют маркеры плюрипотентности и демонстрируют нормальный кариотип 42X,Y. Высокий процент химер был получен посредством микроинъекции в эмбрионы SD-хозяев на стадии бластоцисты, и передача генома кЭСК была продемонстрирована через зародышевую линию для обеих линий. Используя плазмидные нацеливающие векторы, авторы настоящего изобретения разработали целевые мутации в крысином эквиваленте локуса ROSA26 и добились трансмиссии через зародышевую линию целевого аллеля в обеих линиях. Эти гетерозиготные животные экспрессируют lacZ во всех тканях на всех исследованных стадиях.This document describes the isolation of rat ES cells (cESCs) from two inbred rat lines. qESCs were obtained from DA and ACI lines. These cells express pluripotency markers and show a normal 42X,Y karyotype. A high percentage of chimeras have been generated by microinjection into SD host embryos at the blastocyst stage, and transmission of the hESC genome has been demonstrated through the germline for both lines. Using plasmid targeting vectors, the present inventors designed target mutations in the rat equivalent of the ROSA26 locus and achieved germline transmission of the target allele in both lines. These heterozygous animals express lacZ in all tissues at all stages studied.
В различных аспектах ЭС клетки получали от линии ACI, чтобы получить благоприятное количество мужского потомства от ACI-доноров ЭС клеток. В одном варианте реализации изобретения мужское потомство составляет приблизительно 50%.In various aspects, ES cells were obtained from the ACI line in order to obtain a favorable number of male progeny from ACI ES cell donors. In one embodiment, the male offspring is approximately 50%.
В различных аспектах ЭС клетки были получены из линии DA, чтобы получить преимущественно потомство женского пола.In various aspects, ES cells have been derived from the DA line to produce predominantly female offspring.
II. Крысиные эмбриональные стволовые (ЭС) клеткиII. Rat embryonic stem (ES) cells
В настоящем документе предлагаются различные композиции и способы, включающие эмбриональные стволовые (ЭС) клетки крысы. Стволовые клетки являются популяцией клеток, которые обладают бесконечной способностью к самообновлению и являются плюрипотентными. «Эмбриональная стволовая клетка», или «ЭС клетка», представляет собой стволовую клетку, полученную из эмбриона или плода. Различные крысиные ЭС клетки, представленные в настоящем документе, могут иметь одно или более из следующих свойств:Various compositions and methods are provided herein, including rat embryonic stem (ES) cells. Stem cells are a population of cells that have an infinite capacity for self-renewal and are pluripotent. An "embryonic stem cell" or "ES cell" is a stem cell derived from an embryo or fetus. The various rat ES cells provided herein may have one or more of the following properties:
(а) обладают компетентностью зародышевой линии, что означает, что при имплантации крысиной ЭС клетки в крысиный эмбрион-хозяин, геном линии крысиных ЭС клеток передается потомству;(a) have germline competence, meaning that upon implantation of a rat ES cell into a rat embryonic host, the genome of the rat ES cell line is passed on to offspring;
(b) обладают компетентностью зародышевой линии после по меньшей мере одной целевой генетической модификации, что означает, что при имплантации крысиной ЭС клетки с целевой генетической модификацией в крысиный эмбрион-хозяин целевая генетическая модификация в геноме линии крысиных ЭС клеток передается потомству;(b) have germline competence after at least one targeted genetic modification, meaning that when a rat ES cell with the targeted genetic modification is implanted into a rat embryonic host, the targeted genetic modification in the genome of the rat ES cell line is passed on to offspring;
(c) обладают плюрипотентностью in vitro;(c) have in vitro pluripotency;
(d) обладают тотипотентностью in vitro;(d) are totipotent in vitro;
(e) при культивации in vitro свободно прикрепляются к фидернему клеточному слою;(e) when cultivated in vitro freely attached to the feeder cell layer;
(f) при культивации in vitro образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro;(f) when cultivated in vitro form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro;
(g) сохраняют плюрипотентность при культивации in vitro в условиях, включающих фидерный клеточный слой, который не является генетически модифицированным для экспрессии фактора ингибирования лейкемии (LIF), причем культуральная среда содержит достаточную концентрацию LIF;(g) retain pluripotency when cultured in vitro under conditions including a feeder cell layer that is not genetically modified to express leukemia inhibitory factor (LIF), and the culture medium contains a sufficient concentration of LIF;
(h) сохраняют плюрипотентность при культивации in vitro в условиях, включающих фидерный клеточный слой, причем культуральная среда содержит мышиный LIF или его активный вариант или фрагмент;(h) retain pluripotency when cultured in vitro under conditions including a feeder cell layer, wherein the culture medium contains mouse LIF or an active variant or fragment thereof;
(i) имеют молекулярную сигнатуру, которая характеризуется следующим:(i) have a molecular signature that is characterized by the following:
i) экспрессией одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, включая белок, связанный с адгезионными контактами (Ajap1), клаудин 5 (Cldn5), фактор 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимую протеинкиназу IV (Camk4), эфрин-А1 (Efna1), ЕРН рецептор А4 (Epha4), белок бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белок 1, подобный белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpll), интерлейкин 36 бета (Il1f8), рецептор альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактор 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептор фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептор 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейрональный рецептор пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазу нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокс 2 каудального типа (Cdx2), повторные домены 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), ген forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), ген forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактор 1, связывающий лимфоидный энхансер (Lef1), ген 3, подобный Sal (дрозофила) (Sal13), гомеобокс 1 SATB (Satb1), miR-632 или их комбинацию;i) expression of one or more genes specific to rat ES cells, including adhesion junction protein (Ajap1), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV ( Camk4), ephrin-A1 (Efna1), NPH receptor A4 (Epha4), gap junction protein beta 5 (Gjb5), insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbpll), interleukin 36 beta (Il1f8), receptor alpha interleukin 28 (Il28ra), asymmetry determination factor 1 (Lefty1), leukemia inhibitory factor alpha receptor (Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), pentraxin neuronal receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal homeobox 2 type (Cdx2), repeated domains 1 of fibronectin III and ankyrin (Fank1), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead gene box E1 (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer-binding factor 1 (Lef1), Sal-like gene 3 (Drosophila) (Sal13), homeobox 1 SATB (Satb1), miR-632 or a combination thereof;
ii) экспрессией по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, включая белок, связанный с адгезионными контактами (Ajap1), клаудин 5 (Cldn5), фактор 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимую протеинкиназу IV (Camk4), эфрин-А1 (Efna1), ЕРН рецептор А4 (Epha4), белок бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белок 1, подобный белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpl1), интерлейкин 36 бета (Il1f8), рецептор альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактор 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептор фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептор 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейрональный рецептор пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазу нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокс 2 каудального типа (Cdx2), повторные домены 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), ген forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), ген forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактор 1, связывающий лимфоидный энхансер (Lef1), ген 3, подобный Sal (дрозофила) (Sal13), гомеобокс 1 SATB (Satb1), miR-632 или их комбинацию;ii) expressing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 or more genes specific to rat ES cells, including adhesion junction protein (Ajap1), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV (Camk4 ), ephrin-A1 (Efna1), NPH receptor A4 (Epha4), gap junction protein beta 5 (Gjb5), insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbpl1), interleukin 36 beta (Il1f8), interleukin receptor alpha 28 (Il28ra), asymmetry determination factor 1 (Lefty1), leukemia inhibitory factor alpha receptor (Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), pentraxin neuronal receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal type homeobox 2 (Cdx2), repeat domains 1 of fibronectin III and ankyrin (Fank1), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer binding factor 1 (Lef1), Sal (Drosophila)-like gene 3 (Sal13), SATB homeobox 1 (Satb1), miR-632, or a combination thereof;
iii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 14, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;iii) at least 20-fold increase in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 14, compared with ES cell line F1H4 mice;
iv) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 14, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;iv) at least a 20-fold increase in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 14, compared with the mouse ES cell line F1H4;
ν) экспрессией одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13;v) expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13;
vi) экспрессией по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13;vi) expressing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as listed in Table 13;
vii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;vii) at least 20-fold increase in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13, compared with ES cell line F1H4 mice;
viii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;viii) at least a 20-fold increase in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13, compared with the mouse ES cell line F1H4;
ix) по меньшей мере 20-кратным снижением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 12, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4; и/илиix) at least 20-fold reduction in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 12, compared with the mouse ES cell line F1H4; and/or
x) по меньшей мере 20-кратным снижением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 12, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;x) at least a 20-fold reduction in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 12, compared with the mouse ES cell line F1H4;
xi) любой комбинацией экспрессии генов, специфических для крысиных ЭС клеток согласно разделам (i)-(x);xi) any combination of expression of genes specific for rat ES cells according to sections (i)-(x);
xii) уровнем относительной экспрессии маркеров плюрипотентности, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 перечисленных маркеров плюрипотентности. См. уровни относительной экспресии в колонке ранжирования плюрипотентности Таблицы 15;xii) the level of relative expression of pluripotency markers as shown in Table 15 for at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, or 18 listed markers of pluripotency. See relative expression levels in the pluripotency ranking column of Table 15;
xiii) уровнем относительной экспрессии мезодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3 или 4 перечисленных мезодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке мезодермального ранжирования Таблицы 15;xiii) the level of relative expression of mesodermal markers, as shown in Table 15, for at least 2, 3 or 4 listed mesodermal markers. See relative expression levels in the mesodermal ranking column of Table 15;
xiv) уровнем относительной экспрессии эндодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 перечисленных эндодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке эндодермального ранжирования Таблицы 15;xiv) the level of relative expression of endodermal markers as shown in Table 15 for at least 2, 3, 4, 5 or 6 of the listed endodermal markers. See relative expression levels in the endodermal ranking column of Table 15;
xv) уровнем относительной экспрессии нейронных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2 и 3 перечисленных нейронных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке нейронного ранжирования Таблицы 15;xv) the level of relative expression of neuronal markers, as shown in Table 15, for at least 2 and 3 of the listed neuronal markers. See relative expression levels in the neural ranking column of Table 15;
xvi) уровнем относительной экспрессии трофэктодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для перечисленных трофэктодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке трофэктодермального ранжирования Таблицы 15;xvi) the level of relative expression of trophectodermal markers, as shown in Table 15, for the listed trophectodermal markers. See relative expression levels in the trophectodermal ranking column of Table 15;
xvii) любым уровнем относительной экспрессии одного или более (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) маркеров плюрипотентности, мезодермальных маркеров, эндодермальных маркеров, нейронных маркеров и/или трофэктодермальных маркеров, приведенных в Таблице 15;xvii) any level of relative expression of one or more (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30) the pluripotency markers, mesodermal markers, endodermal markers, neuronal markers and/or trophectodermal markers shown in Table 15;
xviii) уровнем относительной экспрессии каждого из маркеров, приведенных в Таблице 15;xviii) the level of relative expression of each of the markers shown in Table 15;
xix) любой комбинацией сигнатур, приведенных в пунктах xii-xiix; и/илиxix) any combination of the signatures given in points xii-xiix; and/or
xx) любой комбинацией сигнатур, приведенных в пунктах i-xiix;xx) any combination of the signatures given in i-xiix;
(j) обладают способностью продуцировать крысу F0;(j) have the ability to produce rat F0;
(k) способны κ субкультивированию и поддержанию недифференцированного состояния;(k) capable of κ subculturing and maintaining an undifferentiated state;
(l) имеют то же количество хромосом, что и клетка нормальной крысы;(l) have the same number of chromosomes as a normal rat cell;
(m) сохраняют плюрипотентность in vitro без потребности в паракринной сигнализации LIF; и/или(m) retain pluripotency in vitro without the need for LIF paracrine signaling; and/or
(n) обладают способностью самообновления, что означает, что они делятся бесконечно, сохраняя плюрипотентность.(n) are self-renewing, meaning that they divide indefinitely while maintaining pluripotency.
Одна или более характеристик, приведенных в пунктах (а)-(n), может присутствовать в выделенной крысиной ЭС клетке, популяции крысиных ЭС клеток или линии крысиных ЭС клеток, представленных в данном документе, причем эти крысиные ЭС клетки не подвергались целевой генетической модификации. В других вариантах реализации изобретения одна или более характеристик, приведенных в пунктах (а)-(n) может присутствовать в выделенной крысиной ЭС клетке, популяции крысиных ЭС клеток или линии крысиных ЭС клеток, представленных в данном документе, имеющих одну или более целевых генетических модификаций. Целевая генетическая модификация содержит изменение в геноме крысиной ЭС клетки и включает, например, инсерцию, делецию, нокаут, нокин, мутацию или их комбинацию. В других случаях целевая генетическая модификация содержит по меньшей мере одну инсерцию гетерологичного полинуклеотида в геном крысиной ЭС клетки. Дополнительное описание таких целевых генетических модификаций представлено в других разделах данного документа.One or more of the characteristics in (a)-(n) may be present in an isolated rat ES cell, rat ES cell population, or rat ES cell line provided herein, and the rat ES cells have not undergone targeted genetic modification. In other embodiments, one or more of the characteristics set forth in paragraphs (a)-(n) may be present in an isolated rat ES cell, rat ES cell population, or rat ES cell line provided herein having one or more targeted genetic modifications. . The targeted genetic modification comprises a change in the rat ES cell genome and includes, for example, an insertion, a deletion, a knockout, a knockin, a mutation, or a combination thereof. In other cases, the targeted genetic modification contains at least one insertion of a heterologous polynucleotide into the rat ES cell genome. Additional description of such targeted genetic modifications is provided elsewhere in this document.
В специфических вариантах реализации изобретения различные крысиные ЭС клетки и клеточные линии, представленные в данном документе, являются компетентными в отношении зародышевой линии, что означает, что когда крысиную ЭС клетку имплантируют в крысиный эмбрион-хозяин, геном крысиной ЭС клетки передается потомству. Такая трансмиссия потомству (т.е. популяции F1) может произойти в случае, если крысиная ЭС клетка не подвергалась целевой генетической модификации. Кроме того, крысиная ЭС клетка, имеющая целевую генетическую модификацию, также является компетентной в отношении зародышевой линии, что означает, что когда крысиную ЭС клетку, имеющую целевую генетическую модификацию, имплантируют в крысиный эмбрион-хозяин, целевая генетическая модификация крысиной ЭС клетки передается потомству (т.е. популяции F1). Таким образом, в различных аспектах крысиные ЭС клетки и способы, описанные в данном документе, используются для получения высокой частоты или высокой эффективности передачи зародышевой линии генома крысиной клетки как от крысиных ЭС клеток,, которые не подвергались целевой генетической модификации, так и от крысиных ЭС клеток, которые подвергались целевой генетической модификации. В различных вариантах реализации изобретения частота передачи зародышевой линии составляет больше чем 1:600, больше чем 1:500, больше чем 1:400, больше чем 1:300, больше чем 1:200 и больше чем 1:100. В различных вариантах реализации изобретения частота передачи зародышевой линии составляет больше чем 1%, больше чем 2%, больше чем 3%, больше чем 4%, больше чем 5%, больше чем 6%, больше чем 7%, больше чем 8%, больше чем 9%, больше чем 10%, до около 16%, больше чем 25%, больше чем 50%, больше чем 60%, больше чем 65%, больше чем 70%, больше чем 75% или больше. В различных вариантах реализации изобретения частота передачи зародышевой линии находится в диапазоне от 9% до 16%. В различных аспектах процент потомства, полученного из донорских кЭСК, в поколении F1 составляет 1% или больше, 2% или больше, 3% или больше, 10% или больше, 20% или больше, 30% или больше, 40% или больше, 50% или больше, 60% или больше, от 3% до около 10% или больше; от 3% или больше до около 63%, от около 10% до около 30%, от около 10% до около 50%, от около 30% до около 70%, от около 30% до около 60%, от около 20% до около 40%, от около 20% до 65% или от около 40% до 70%. Таким образом, крысиная ЭС клетка, представленная в настоящем документе, которая не подвергалась целевой генетической модификации, или, в альтернативном варианте, крысиная ЭС клетка, имеющая целевую генетическую модификацию, обладает способностью передавать их геном популяции F1.In specific embodiments, the various rat ES cells and cell lines provided herein are germline competent, meaning that when a rat ES cell is implanted into a rat embryonic host, the rat ES cell genome is passed on to offspring. Such transmission to offspring (ie, the F1 population) can occur if the rat ES cell has not undergone targeted genetic modification. In addition, a rat ES cell having a targeted genetic modification is also germline competent, meaning that when a rat ES cell having a targeted genetic modification is implanted into a rat embryonic host, the targeted genetic modification of the rat ES cell is passed on to offspring ( i.e. populations F1). Thus, in various aspects, rat ES cells and the methods described herein are used to obtain high frequency or high efficiency germline transfer of the rat cell genome from both rat ES cells that have not undergone targeted genetic modification, and from rat ES cells. cells that have undergone targeted genetic modification. In various embodiments, the germline transmission frequency is greater than 1:600, greater than 1:500, greater than 1:400, greater than 1:300, greater than 1:200, and greater than 1:100. In various embodiments of the invention, the frequency of germline transmission is greater than 1%, greater than 2%, greater than 3%, greater than 4%, greater than 5%, greater than 6%, greater than 7%, greater than 8%, more than 9%, more than 10%, up to about 16%, more than 25%, more than 50%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75% or more. In various embodiments of the invention, the frequency of transmission of the germline is in the range from 9% to 16%. In various aspects, the percentage of offspring derived from donor hESCs in the F1 generation is 1% or more, 2% or more, 3% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 3% to about 10% or more; 3% or more to about 63%, about 10% to about 30%, about 10% to about 50%, about 30% to about 70%, about 30% to about 60%, about 20% up to about 40%, from about 20% to 65%, or from about 40% to 70%. Thus, a rat ES cell provided herein that has not undergone a targeted genetic modification, or alternatively a rat ES cell having a targeted genetic modification, has the ability to pass them on to the F1 population genome.
Крысиная ЭС клетка, которая не подвергалась целевой генетической модификации, или крысиная ЭС клетка, имеющая целевую генетическую модификацию, может быть плюрипотентной и/или тотипотентной. Термин «плюрипотентная» или «плюрипотентность» относится к стволовой клетке, которая обладает потенциалом в любом из трех зародышевых слоев: энтодерме, мезодерме или эктодерме. Потентность клетки - это общий термин, который описывает способность дифференцироваться в другие типы клеток. См., например, публикацию Hans et al. (2007). «The Potential of Stem CE1ls: An Inventory)). Human biotechnology as Social Challenge. Ashgate Publishing, Ltd. p.28, включенную в данный документ посредством ссылки. Термин «тотипотентность» или «тотипотентный) представляет способность одной клетки делиться и производить все дифференцированные клетки в организме. См., например, публикацию Western Ρ (2009). Int. J. Dev. Biol. 53 (2-3): 393-409, включенную в данный документ посредством ссылки. В специфических вариантах реализации изобретения различные ЭС клетки, описанные в данном документе, могут быть плюрипотентными и/или тотипотентными.A rat ES cell that has not undergone targeted genetic modification or a rat ES cell that has targeted genetic modification may be pluripotent and/or totipotent. The term "pluripotent" or "pluripotency" refers to a stem cell that has potential in any of the three germ layers: endoderm, mesoderm, or ectoderm. Cell potency is a general term that describes the ability to differentiate into other cell types. See, for example, Hans et al. (2007). "The Potential of Stem CE1ls: An Inventory)). Human Biotechnology as Social Challenge. Ashgate Publishing Ltd. p.28, incorporated herein by reference. The term totipotency or totipotent) represents the ability of a single cell to divide and produce all differentiated cells in an organism. See, for example, Western P (2009). Int. J. Dev. Biol. 53 (2-3): 393-409, incorporated herein by reference. In specific embodiments of the invention, the various ES cells described herein may be pluripotent and/or totipotent.
Для определения того, является ли крысиная ЭС клетка плюрипотентной, можно использовать разные способы. Например, можно проводить анализ ЭС клетки на экспрессию различных маркеров плюрипотентности, включая, но не ограничиваясь этим, Oct-4, Sox2, щелочную фосфатазу или их комбинацию. См., например, публикации Okamoto, K. et al., CEll, 60: 461-472 (1990), Scholer, Η. R. et al., EMBOJ. 9: 2185-2195 (1990)) и Nanog (Mitsui, K. et al., CEll, 113: 631-642 (2003), Chambers, I. et al., CEll, 113: 643-655 (2003) относительно различных анализов на наличие таких маркеров или их уровней. См., также Фигуры 2 и 3, представленные в данном документе. Другие маркеры плюрипотентности включают, например, присутствие по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 маркеров плюрипотентности, которые включают Nanog, Klf4, Dppa2, Fgf4, Rex1, Eras, Err-бета и/или Sal13. Другие маркеры плюрипотентности включают, например, отсутствие по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 маркеров плюрипотентности, которые включают T/Brachyury, Flk1, Nodal, Bmp4, Bmp2, Gata6, Sox17, Hhex1, Sox7 и/или Рах6.Various methods can be used to determine whether a rat ES cell is pluripotent. For example, an ES cell can be analyzed for the expression of various pluripotency markers, including, but not limited to, Oct-4, Sox2, alkaline phosphatase, or a combination thereof. See, for example, Okamoto, K. et al., CEll, 60: 461-472 (1990), Scholer, Η. R. et al., EMBOJ. 9: 2185-2195 (1990)) and Nanog (Mitsui, K. et al., CEll, 113: 631-642 (2003), Chambers, I. et al., CEll, 113: 643-655 (2003) regarding different assays for the presence of such markers or their levels.See also Figures 2 and 3 presented herein.Other markers of pluripotency include, for example, the presence of at least 1, 2, 3, 4, or 5 markers of pluripotency, which include Nanog , Klf4, Dppa2, Fgf4, Rex1, Eras, Err-beta and/or Sal13 Other markers of pluripotency include, for example, the absence of at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 markers pluripotencies that include T/Brachyury, Flk1, Nodal, Bmp4, Bmp2, Gata6, Sox17, Hhex1, Sox7 and/or Pax6.
В специфических вариантах реализации изобретения экспрессию и/или уровень экспрессии этих маркеров можно определить с использованием ОТ-ПЦР. Для определения уровня и/или наличия щелочной фосфатазы доступны различные наборы, в том числе, например, набор для окрашивания ткани ALP tissue staining kit (Sigma) и набор Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Funakoshi) и тому подобное. Дополнительные анализы включают гибридизацию in situ, иммуногистохимический анализ, анализ иммунофлюоресценции. В специфических вариантах реализации изобретения крысиная ЭС клетка характеризуется экспрессией по меньшей мере одного маркера плюрипотентности, включая, например, экспрессию Oct-4, Sox2, щелочной фосфатазы или их комбинации и предпочтительно всех трех этих маркеров.In specific embodiments of the invention, the expression and/or level of expression of these markers can be determined using RT-PCR. Various kits are available for determining the level and/or presence of alkaline phosphatase, including, for example, the ALP tissue staining kit (Sigma) and the Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Funakoshi) and the like. Additional assays include in situ hybridization, immunohistochemical analysis, immunofluorescence analysis. In specific embodiments, the rat ES cell is characterized by the expression of at least one pluripotency marker, including, for example, the expression of Oct-4, Sox2, alkaline phosphatase, or combinations thereof, and preferably all three of these markers.
Различные крысиные ЭС клетки, представленные в настоящем документе (т.е. крысиные ЭС клетки, которые не подвергались целевой генетической модификации и/или крысиные ЭС клетки, имеющие целевую генетическую модификацию), способны сохранять плюрипотентность и/или тотипотентность при поддержании в условиях культивирования in vitro. Различные крысиные ЭС клетки, представленные в настоящем документе, в некоторых вариантах реализации изобретения могут быть субкультивированными, все еще сохраняя недифференцированное состояние. Различные способы культивации крысиных ЭС клеток описаны более подробно в других разделах данного документа.The various rat ES cells provided herein (i.e., rat ES cells that have not undergone targeted genetic modification and/or rat ES cells that have targeted genetic modification) are capable of maintaining pluripotency and/or totipotency when maintained under culture conditions in vitro. The various rat ES cells provided herein may, in some embodiments, be subcultured while still maintaining an undifferentiated state. Various methods for culturing rat ES cells are described in more detail elsewhere in this document.
Крысиные эмбриональные стволовые клетки, представленные в данном документе, были выделены из эмбриона крысы с использованием различных способов выделения, очистки и роста культуры, которые подробно описаны в других разделах данного документа. Используемый в данном документе термин «клетка» относится к отдельным клеткам, клеточным линиям или культурам, полученным из таких клеток. «Выделенная» ЭС клетка крысы или крысиного эмбриона была извлечена из ее природной среды. Термин «выделенный» может означать отсутствие 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% составляющих, с которыми компонент находится в своем естественном состоянии. В данном документе определение «линия крысиных ЭС клеток» означает популяцию выделенных крысиных клеток, которые развивали из одной крысиной ЭС клетки, и, следовательно, популяция клеток в пределах данной клеточной линии имеет единую генетическую структуру, отличную от мутаций или кариотипических изменений, происходящих в процессе культивирования или во время целевых генетических модификаций. Например, как указано в других разделах данного документа, описанные крысиные ЭС клетки характеризуются высоким уровнем эуплоидии. Тем не менее, в некоторых клеточных линиях уровень эуплоидии составляет меньше 100% из-за кариотипических изменений при культивировании линии из одной клетки. Более того, данная популяция крысиных ЭС клеток может содержать по меньшей мере 10 в 3 степени, 10 в 4 степени, 10x104, 10x105, 10x106, 10x107, 10x108, 10x109 или 10x1010 клеток или больше. Некоторые клеточные популяции имеют достаточное количество клеток, что позволяет провести отбор желательной модифицированной клетки, но не слишком большое количество, чтобы уменьшить возможность мутаций или кариотипических изменений, развивающихся в клеточной линии. Например, некоторые популяции клеток имеют от 10 в 3 степени до 10 в 6 степени клеток.The rat embryonic stem cells provided herein were isolated from rat embryos using various isolation, purification, and culture growth methods, which are described in detail elsewhere in this document. Used in this document, the term "cell" refers to individual cells, cell lines or cultures derived from such cells. An "isolated" rat or rat embryo ES cell was extracted from its natural environment. The term "isolated" can mean the absence of 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% of the components with which the component is in its natural state. In this document, the definition of "rat ES cell line" means a population of isolated rat cells that have developed from a single rat ES cell, and therefore, the population of cells within a given cell line has a single genetic structure, distinct from mutations or karyotypic changes occurring during cultivation or during targeted genetic modifications. For example, as described elsewhere in this document, the described rat ES cells are characterized by a high level of euploidy. However, in some cell lines, the euploidy rate is less than 100% due to karyotypic changes when the line is cultured from a single cell. Moreover, a given population of rat ES cells may contain at least 103, 104, 10x10 4 , 10x10 5 , 10x10 6 , 10x10 7 , 10x10 8 , 10x10 9 , or 10x10 10 cells or more. Some cell populations have enough cells to allow selection of the desired modified cell, but not too many to reduce the possibility of mutations or karyotypic changes developing in the cell line. For example, some populations of cells have from 10 to the 3rd power to 10 to the 6th power of cells.
Как описано в других разделах данного документа, для целевой генетической модификации линии крысиных ЭС клеток предлагаются различные способы. При осуществлении таких способов по меньшей мере одна клетка в линии крысиных ЭС клеток содержит целевую генетическую модификацию. С помощью различных способов культивирования и/или отбора получают линии крысиных ЭС клеток, имеющие одну или больше желательных целевых генетических модификаций.As described elsewhere in this document, various methods have been proposed for targeted genetic modification of a rat ES cell line. In such methods, at least one cell in the rat ES cell line contains the targeted genetic modification. Using various cultivation and/or selection methods, rat ES cell lines are obtained having one or more desired genetic modifications of interest.
В специфических вариантах реализации изобретения крысиная ЭС клетка, популяция крысиных ЭС клеток или линия крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) являются эуплоидными и, таким образом, имеют число хромосом, кратное гаплоидному числу. В дополнительном варианте реализации изобретения крысиная ЭС клетка, популяция крысиных ЭС клеток или линия крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) являются диплоидными и, таким образом, имеют два гаплоидных набора гомологичных хромосом. При упоминании популяции крысиных ЭС клеток или популяции клеток из данной популяции крысиных ЭС клеток или линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию), по меньшей мере около 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% клеток в данной популяции являются или эуплоидными и/или диплоидными. В других случаях при упоминании популяции крысиных ЭС клеток или популяции клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) по меньшей мере от около 50% до 95%, от около 60% до 90%, от около 60% до 95%, от около 60% до 85%, от около 60% до 80%, от около 70% до 80%, от около 70% до 85%, от около 70% до около 90%, от около 70% до около 95%, от около 70% до около 100%, от около 80% до около 100%, от около 80% до около 95%, от около 80% до около 90%, от около 90% до около 100%, от около 90% до около 99%, от около 90% до около 98%, от около 90% до около 97%, от около 90% до около 95% клеток в данной популяции являются эуплоидными и/или диплоидными.In specific embodiments, a rat ES cell, a population of rat ES cells, or a rat ES cell line (which has not undergone the targeted genetic modification and/or has the targeted genetic modification) is euploid and thus has a chromosome number that is a multiple of the haploid number. In a further embodiment, the rat ES cell, rat ES cell population, or rat ES cell line (which has not undergone targeted genetic modification and/or has targeted genetic modification) is diploid and thus has two haploid sets of homologous chromosomes. When referring to a population of rat ES cells or a population of cells from a given population of rat ES cells or a rat ES cell line (which has not undergone targeted genetic modification and/or has targeted genetic modification), at least about 50%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% of the cells in a given population are either euploid and/or diploid. In other cases, when referring to a population of rat ES cells or a population of cells from a given rat ES cell line (that have not been subjected to targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) at least about 50% to 95%, from about 60% to 90 %, about 60% to 95%, about 60% to 85%, about 60% to 80%, about 70% to 80%, about 70% to 85%, about 70% to about 90% , about 70% to about 95%, about 70% to about 100%, about 80% to about 100%, about 80% to about 95%, about 80% to about 90%, from about 90% up to about 100%, about 90% to about 99%, about 90% to about 98%, about 90% to about 97%, about 90% to about 95% of the cells in a given population are euploid and/or diploid .
В дополнительных вариантах реализации изобретения крысиная ЭС клетка, популяция крысиных ЭС клеток или линия крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеют 42 хромосомы. При упоминании популяции крысиных ЭС клеток или популяции клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) по меньшей мере около 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% клеток в данной популяции имеют 42 хромосомы. В других случаях, при упоминании популяции крысиных ЭС клеток или популяции клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию), по меньшей мере от около 50% до 95%, от около 60% до 90%, от около 60% до 95%, от около 60% до 85%, от около 60% до 80%, от около 70% до 80%, от около 70% до 85%, от около 70% до около 90%, от около 70% до около 95%, от около 70% до около 100%, от около 80% до около 100%, от около 80% до около 95%, от около 80% до около 90%, от около 90% до около 100%, от около 90% до около 99%, от около 90% до около 98%, от около 90% до около 97%, от около 90% до около 95% клеток в данной популяции имеют 42 хромосомы.In additional embodiments, a rat ES cell, a population of rat ES cells, or a rat ES cell line (which has not been targeted and/or has a targeted genetic modification) has 42 chromosomes. When referring to a population of rat ES cells or a population of cells from a given rat ES cell line (which has not been targeted and/or has targeted genetic modification) at least about 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% cells in this population have 42 chromosomes. In other instances, when referring to a population of rat ES cells or a population of cells from a given rat ES cell line (which has not undergone targeted genetic modification and/or has targeted genetic modification), at least about 50% to 95%, from about 60% up to 90%, about 60% to 95%, about 60% to 85%, about 60% to 80%, about 70% to 80%, about 70% to 85%, about 70% to about 90%, about 70% to about 95%, about 70% to about 100%, about 80% to about 100%, about 80% to about 95%, about 80% to about 90%, from about 90% to about 100%, about 90% to about 99%, about 90% to about 98%, about 90% to about 97%, about 90% to about 95% of cells in a given population have 42 chromosomes.
В дополнительных вариантах реализации изобретения крысиная ЭС клетка, популяция крысиных ЭС клеток или линия крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию), представленные в данном документе, образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro. «Сфероподобная» морфология относится к форме колоний крысиных ЭС клеток в культуре, а не к форме отдельных ЭС клеток. Колонии крысиных ЭС клеток являются сфероподобными. Колонии, свободно прикрепленные к питающим клеткам, являются круглыми (имеют морфологию, подобную кругу). Свободно плавающие колонии являются сфероподобными. Колонии крысиных ЭС клеток являются сфероподобными и очень компактными, что означает, что очень трудно увидеть границы между клетками. Край колонии яркий и четкий. Отдельные ядра трудно различить, потому что клетки очень малы (так что ядро занимает большую часть объема клетки). Мышиные ЭС клетки образуют вытянутые колонии и прочно прикрепляются к питающим клеткам. Морфология мЭСК может изменяться в зависимости от линии; например, колонии В6 более круглые и более куполообразные, чем колонии F1H4, но все еще более удлиненные по сравнению с кЭСК. Колонии ЭС клеток человека более плоские и более распространенные по сравнению с колониями мЭСК. Непосредственно колонии крысиных ЭС не являются плоскими и не похожи на колонии ЭС клеток человека.In additional embodiments, a rat ES cell, a population of rat ES cells, or a rat ES cell line (that has not undergone targeted genetic modification and/or has targeted genetic modification) provided herein forms spherical colonies when seeded onto a feeder cell layer in vitro. . "Sphere-like" morphology refers to the shape of colonies of rat ES cells in culture, and not to the shape of individual ES cells. Colonies of rat ES cells are spherical. Colonies loosely attached to nurse cells are round (have a morphology similar to a circle). Free floating colonies are spherical. Rat ES cell colonies are spherical and very compact, which means that it is very difficult to see the boundaries between cells. The edge of the colony is bright and clear. Individual nuclei are difficult to distinguish because the cells are very small (so that the nucleus takes up most of the volume of the cell). Mouse ES cells form elongated colonies and are firmly attached to the feeding cells. The mESC morphology may vary depending on the lineage; for example, B6 colonies are rounder and more domed than F1H4 colonies, but still more elongated than hESCs. Human ES cell colonies are flatter and more spread out than mESC colonies. Rat ES colonies are not flat and do not look like colonies of human ES cells.
В дополнительных вариантах реализации изобретения крысиная ЭС клетка, популяция крысиных ЭС клеток или линия крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеют круглую морфологию. Морфологическая шкала для круга приводится ниже, где оценка 10 представляет идеальный круг, а оценка 1 представляет эллипс.In additional embodiments, the rat ES cell, rat ES cell population, or rat ES cell line (which has not been targeted and/or has targeted genetic modification) has a round morphology. The morphological scale for a circle is given below, where a score of 10 represents a perfect circle and a score of 1 represents an ellipse.
Морфологическая шкала круга:Morphological scale of the circle:
10 = Круг со структурой, имеющей продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры и имеют одинаковую длину.10 = Circle with a structure having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the structure and are of the same length.
9 = Структура, имеющая продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры, причем одна ось составляет 0,9999-0,9357 длины другой оси.9 = Structure having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the structure, with one axis being 0.9999-0.9357 the length of the other axis.
8 = Структура, имеющая продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры, причем одна ось составляет 0,9357-0,875 длины другой оси.8 = A structure having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the structure, with one axis being 0.9357-0.875 times the length of the other axis.
7 = Структура, имеющая продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры, причем одна ось составляет от 0,875 до около 0,8125 длины другой оси.7 = Structure having a longitudinal axis and a vertical axis that extend through the center of the structure, with one axis being 0.875 to about 0.8125 the length of the other axis.
6 = Структура, имеющая продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры, причем одна ось составляет 0,8125-0,750 длины другой оси.6 = A structure having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the structure, with one axis being 0.8125-0.750 times the length of the other axis.
5 = Структура, имеющая продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры, причем одна ось составляет 0,750-0,6875 длины другой оси.5 = Structure having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the structure, with one axis being 0.750-0.6875 the length of the other axis.
4 = Структура, имеющая продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры, причем одна ось составляет 0,6875-0,625 длины другой оси.4 = Structure having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the structure, with one axis being 0.6875-0.625 the length of the other axis.
3 = Структура, имеющая продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры, причем одна ось составляет 0,625-0,5625 длины другой оси.3 = Structure having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the structure, with one axis being 0.625-0.5625 the length of the other axis.
2 = Структура, имеющая продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр круга, причем одна ось составляет 0,5625-0,523 длины другой оси.2 = A structure having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the circle, with one axis being 0.5625-0.523 the length of the other axis.
1 = Эллипс, который определяется как имеющий продольную ось и вертикальную ось, которые проходят через центр структуры, причем одна ось составляет 0,523-0,500 длины другой оси.1 = Ellipse, which is defined as having a longitudinal axis and a vertical axis that pass through the center of the structure, with one axis being 0.523-0.500 times the length of the other axis.
В одном неограничивающем варианте реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или популяция клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеют по меньшей мере около 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% клеток в данной популяции с оценкой по шкале морфологии круга 10, 9 или 8. В других вариантах реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или популяция клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеют по меньшей мере от около 50% до 95%, от около 60% до 90%, от около 60% до 95%, от около 60% до 85%, от около 60% до 80%, от около 70% до 80%, от около 70% до 85%, от около 70% до около 90%, от около 70% до около 95%, от около 70% до около 100%, от около 80% до около 100%, от около 80% до около 95%, от около 80% до около 90%, от около 90% до около 100%, от около 90% до около 99%, от около 90% до около 98%, от около 90% до около 97%, от около 90% до около 95% клеток в данной популяции с оценкой по шкале морфологии круга 10, 9 или 8.In one non-limiting embodiment of the invention, a population of rat ES cells, or a population of cells from a given rat ES cell line (that have not undergone targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) have at least about 50%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % or 100% of cells in a given population with a circle morphology score of 10, 9, or 8. In other embodiments, the population of rat ES cells or a population of cells from a given rat ES cell line genetic modification) have at least about 50% to 95%, about 60% to 90%, about 60% to 95%, about 60% to 85%, about 60% to 80%, about 70 % to 80%, about 70% to 85%, about 70% to about 90%, about 70% to about 95%, about 70% to about 100%, about 80% to about 100%, from about 80% to about 95%, about t about 80% to about 90%, from about 90% to about 100%, from about 90% to about 99%, from about 90% to about 98%, from about 90% to about 97%, from about 90% to about 95% of cells in a given population with a circle morphology score of 10, 9, or 8.
В другом неограничивающем варианте реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или популяция клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеют по меньшей мере около 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% клеток в данной популяции с оценкой по шкале морфологии круга 7, 6, 5, 4 или 3. В других неограничивающих вариантах реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или популяция клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеют по меньшей мере от около 50% до 95%, от около 60% до 90%, от около 60% до 95%, от около 60% до 85%, от около 60% до 80%, от около 70% до 80%, от около 70% до 85%, от около 70% до около 90%, от около 70% до около 95%, от около 70% до около 100%, от около 80% до около 100%, от около 80% до около 95%, от около 80% до около 90%, от около 90% до около 100%, от около 90% до около 99%, от около 90% до около 98%, от около 90% до около 97%, от около 90% до около 95% клеток в данной популяции с оценкой по шкале морфологии круга 7, 6, 5, 4 или 3.In another non-limiting embodiment of the invention, a population of rat ES cells, or a population of cells from a given rat ES cell line (that have not been subjected to targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) have at least about 50%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % or 100% of cells in a given population with a circle morphology score of 7, 6, 5, 4, or 3. and/or have targeted genetic modification) have at least about 50% to 95%, about 60% to 90%, about 60% to 95%, about 60% to 85%, about 60% to 80 %, from about 70% to 80%, from about 70% to 85%, from about 70% to about 90%, from about 70% to about 95%, from about 70% to about 100%, from about 80% to about 100%, from ok about 80% to about 95%, about 80% to about 90%, about 90% to about 100%, about 90% to about 99%, about 90% to about 98%, about 90% to about 97%, about 90% to about 95% of cells in a given population with a circle morphology score of 7, 6, 5, 4, or 3.
8 дополнительных вариантах реализации изобретения, когда крысиные ЭС клетки (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) высевают на фидерный клеточный слой in vitro, образуются сфероподобные колонии. Морфологическая шкала для сферы приводится ниже, где оценка 10 представляет идеальную сферу, а оценка 1 представляет трехмерную эллиптическую структуру.In 8 additional embodiments, when rat ES cells (that have not undergone targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) are plated on a feeder cell layer in vitro, sphere-like colonies are formed. The morphological scale for a sphere is given below, where a score of 10 represents a perfect sphere and a score of 1 represents a three-dimensional elliptical structure.
Морфологическая шкала сфероподобной структуры:Morphological scale of sphere-like structure:
10 = Сфера представляет собой структуру, имеющую ось X, ось Υ и ось Ζ, каждая из которых проходит через центр структуры, и которые имеют одинаковую длину.10 = A sphere is a structure having an X-axis, a Y-axis, and a Z-axis, each of which passes through the center of the structure, and are all the same length.
9 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,9999 до 0,9357 длины по меньшей мере одной из других осей.9 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.9999 to 0.9357 times the length of at least one of the other axes.
8 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,9357 до 0,875 длины по меньшей мере одной или двух других осей.8 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.9357 to 0.875 times the length of at least one or two other axes.
7 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,875 до 0,8125 длины по меньшей мере одной или двух других осей.7 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.875 to 0.8125 times the length of at least one or two other axes.
6 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,8125 до 0,750 длины по меньшей мере одной или двух других осей.6 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.8125 to 0.750 times the length of at least one or two other axes.
5 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,750 до 0,6875 длины по меньшей мере одной или двух других осей.5 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.750 to 0.6875 times the length of at least one or two other axes.
4 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,6875 до 0,625 длины по меньшей мере одной или двух других осей.4 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.6875 to 0.625 times the length of at least one or two other axes.
3 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,625 до 0,5625 длины по меньшей мере одной или двух других осей.3 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.625 to 0.5625 times the length of at least one or two other axes.
2 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,5625 до 0,523 длины по меньшей мере одной или двух других осей.2 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.5625 to 0.523 times the length of at least one or two other axes.
1 = Структура, имеющая ось X, ось Υ и ось Ζ, которые проходят через центр структуры, причем одна из указанных осей составляет от 0,523 до 0,500 длины по меньшей мере одной или двух других осей.1 = A structure having an X-axis, a Y-axis and a Z-axis that pass through the center of the structure, one of said axes being 0.523 to 0.500 times the length of at least one or two other axes.
В одном неограничивающем варианте реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или популяция клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеет по меньшей мере около 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% колоний, образованных при посеве клеток на фидерный клеточный слой in vitro, с оценкой по шкале сфероподобной морфологии 10, 9 или 8. В других вариантах реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или популяция клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеет по меньшей мере от около 50% до 95%, от около 60% до 90%, от около 60% до 95%, от около 60% до 85%, от около 60% до 80%, от около 70% до 80%, от около 70% до 85%, от около 70% до около 90%, от около 70% до около 95%, от около 70% до около 100%, от около 80% до около 100%, от около 80% до около 95%, от около 80% до около 90%, от около 90% до около 100%, от около 90% до около 99%, от около 90% до около 98%, от около 90% до около 97%, от около 90% до около 95% колоний, образованных при посеве клеток на фидерный клеточный слой in vitro с оценкой по шкале сфероподобной морфологии 10, 9 или 8.In one non-limiting embodiment of the invention, a population of rat ES cells, or a population of cells from a given rat ES cell line (that have not undergone targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) has at least about 50%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % or 100% of colonies formed by seeding cells on a feeder cell layer in vitro, with a score of 10, 9, or 8 on a sphere-like morphology scale. have undergone targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) has at least about 50% to 95%, about 60% to 90%, about 60% to 95%, about 60% to 85%, from about 60% to 80%, about 70% to 80%, about 70% to 85%, about 70% to about 90%, about 70% to about 95%, about 70% to about 100 %, from about 80% to about 100%, from about 80% to about 95%, from about 80% to about 90%, from about 90% to about 100%, from about 90% to about 99%, from about 90 % to about 98%, from about 90% to about 97%, from about 90% to about 95% of colonies formed by seeding cells on a feeder cell layer in vitro with a score on a sphere-like morphology scale of 10, 9 or 8.
В другом неограничивающем варианте реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или популяция клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеет по меньшей мере около 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% колоний, образованных при посеве клеток на фидерный клеточный слой in vitro, с оценкой по шкале сфероподобной морфологии 7, 6, 5, 4 или 3. В других вариантах реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или популяция клеток из данной линии крысиных ЭС клеток (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию) имеет по меньшей мере от около 50% до 95%, от около 60% до 90%, от около 60% до 95%, от около 60% до 85%, от около 60% до 80%, от около 70% до 80%, от около 70% до 85%, от около 70% до около 90%, от около 70% до около 95%, от около 70% до около 100%, от около 80% до около 100%, от около 80% до около 95%, от около 80% до около 90%, от около 90% до около 100%, от около 90% до около 99%, от около 90% до около 98%, от около 90% до около 97%, от около 90% до около 95% колоний, образованных при посеве клеток на фидерный клеточный слой in vitro, с оценкой по шкале сфероподобной морфологии 7, 6, 5, 4 или 3.In another non-limiting embodiment of the invention, a population of rat ES cells, or a population of cells from a given rat ES cell line (that have not undergone targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) has at least about 50%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % or 100% of colonies formed by seeding cells on a feeder cell layer in vitro, with a score on a sphere-like morphology scale of 7, 6, 5, 4, or 3. In other embodiments of the invention, a population of rat ES cells or a population of cells from a given rat ES line cells (that have not undergone targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) has at least about 50% to 95%, about 60% to 90%, about 60% to 95%, about 60% to 85 %, about 60% to 80%, about 70% to 80%, about 70% to 85%, about 70% to about 90%, about 70% to about 95%, about 70% to approx. 100%, about 80% to about 100%, about 80% to about 95%, about 80% to about 90%, about 90% to about 100%, about 90% to about 99%, from about 90% to about 98%; about 90% to about 97%; 4 or 3.
Данная крысиная ЭС клетка, популяция крысиных ЭС клеток или линия крысиных ЭС клеток, представленная в настоящем документе, может быть мужской (XY) крысиной ЭС клеткой, мужской (XY) популяцией крысиных ЭС клеток или мужской (XY) линией крысиных ЭС клеток. В других вариантах реализации изобретения популяция крысиных ЭС клеток или линия крысиных ЭС клеток, представленная в данном документе, может быть женской (XX) крысиной ЭС клеткой, женской (XX) популяцией крысиных ЭС клеток или женской (XX) линией крысиных ЭС клеток. Любая такая крысиная ЭС клетка, популяция крысиных ЭС клеток или линия крысиных ЭС клеток может быть эуплоидной и/или диплоидной, как описано выше.A given rat ES cell, rat ES cell population, or rat ES cell line provided herein may be a male (XY) rat ES cell, a male (XY) rat ES cell population, or a male (XY) rat ES cell line. In other embodiments, the rat ES cell population or rat ES cell line provided herein can be a female (XX) rat ES cell, a female (XX) rat ES cell population, or a female (XX) rat ES cell line. Any such rat ES cell, rat ES cell population, or rat ES cell line may be euploid and/or diploid, as described above.
Различные крысиные ЭС клетки, представленные в данном документе, могут происходить от любой линии крыс, включая, но не ограничиваясь этим, линию крыс ACI, линию крыс Dark Agouti (DA), линию крыс Wistar rat, линию крыс LEA, линию крыс Sprague Dawley (SD) или линию крыс Fischer, такую как Fisher F344 или Fisher F6. Различные крысиные ЭС клетки также можно получать из линии, полученной из смеси двух или больше линий, перечисленных выше. В одном варианте реализации изобретения крысиная ЭС клетка получена из линии, выбранной из линии DA и линии ACI. В специфическом варианте реализации изобретения крысиная ЭС клетка получена из линии ACI. Линия крыс ACI характеризуется наличием черного агути с белым животом и лапами и гаплотипом RT1av1. Такие линии являются коммерчески доступными из различных источников, включая Harlan Laboratories. В других вариантах реализации изобретения разные крысиные ЭС клетки получены из линии крыс Dark Agouti (DA), которая характеризуется наличием покрова агути и гаплотипом RT1av1. Такие крысы являются коммерчески доступными из различных источников, включая Charles River и Harlan Laboratories.The various rat ES cells provided herein can be derived from any rat strain, including, but not limited to, the ACI rat strain, the Dark Agouti (DA) rat strain, the Wistar rat rat strain, the LEA rat strain, the Sprague Dawley rat strain ( SD) or a Fischer rat line such as Fisher F344 or Fisher F6. Various rat ES cells can also be obtained from a line derived from a mixture of two or more of the lines listed above. In one embodiment, the rat ES cell is derived from a lineage selected from the DA lineage and the ACI lineage. In a specific embodiment of the invention, the rat ES cell is derived from the ACI line. The ACI rat line is characterized by the presence of a black agouti with a white belly and paws and the RT1 av1 haplotype. Such lines are commercially available from various sources including Harlan Laboratories. In other embodiments, the various rat ES cells are derived from the Dark Agouti (DA) rat line, which is characterized by the presence of an agouti coat and the RT1 av1 haplotype. Such rats are commercially available from various sources including Charles River and Harlan Laboratories.
В дополнительном варианте реализации изобретения разные крысиные ЭС клетки, представленные в данном документе, получены из инбредных линий крыс.In a further embodiment, the various rat ES cells provided herein are derived from inbred rat strains.
В специфических вариантах реализации изобретения линия крысиных ЭС клеток получена от крысы ACI и содержит крысиную ЭС клетку ACI.G1, описанную в данном документе. В другом варианте реализации изобретения линия крысиных ЭС клеток получена от крысы DA и содержит крысиную ЭС клеточную линию DA.2B или крысиную ЭС клеточную линию DA.2C, описанную в настоящем документе.In specific embodiments, the rat ES cell line is derived from the ACI rat and contains the ACI.G1 rat ES cell described herein. In another embodiment, the rat ES cell line is derived from the DA rat and contains the DA.2B rat ES cell line or the DA.2C rat ES cell line described herein.
Данная крысиная ЭС клетка, представленная в настоящем документе, может быть получена из эмбриона крысы на любой стадии развития эмбриона крысы. Типичные стадии развития эмбриона крысы представлены ниже в Таблице 1. Эмбрионы крыс, которые используют для получения крысиных ЭС клеток, могут представлять собой эмбрион на стадии морулы, эмбрион на стадии бластоцисты или эмбрион крысы на стадии развития между эмбрионом на стадии морулы и эмбрионом на стадии бластоцисты. Таким образом, в специфических вариантах реализации изобретения используемый эмбрион крысы находится между стадиями 5 и 7 по Вичи. В других вариантах реализации изобретения используемый эмбрион крысы находится на стадии 5, 6 или 7 по Вичи.The rat ES cell presented herein can be obtained from a rat embryo at any stage of rat embryo development. Typical developmental stages of a rat embryo are shown in Table 1 below. Rat embryos that are used to obtain rat ES cells can be a morula embryo, a blastocyst embryo, or a rat embryo at a developmental stage between a morula embryo and a blastocyst embryo. . Thus, in specific embodiments, the rat embryo used is between Vici stages 5 and 7. In other embodiments, the rat embryo used is at
В одном варианте реализации изобретения крысиная ЭС клетка получена из бластоцисты крысы. В других вариантах реализации изобретения крысиная ЭС клетка получена из бластоцисты крысы с суперовуляцией. В других вариантах реализации изобретения крысиные ЭС клетки получают из эмбриона на стадии 8 клеток, который затем культивируют in vitro до его развития в эмбрион на стадии морулы, эмбрион на стадии бластоцисты или эмбрион на стадии развития между стадиями 5 и 7 по Вичи либо в эмбрион на стадии 5, 6 или 7 по Вичи. После чего в этот момент время эмбрионы высевали. Эмбрионы на стадии морулы представляют собой компактный шар клеток без внутренней полости. Эмбрионы на стадии бластоцисты имеют видимую внутреннюю полость (бластоцель) и содержат внутреннюю клеточную массу (ВКМ). ВКМ клетки из ЭС клетки.In one embodiment, the rat ES cell is derived from a rat blastocyst. In other embodiments, the rat ES cell is derived from a superovulating rat blastocyst. In other embodiments, rat ES cells are obtained from an 8-cell stage embryo which is then cultured in vitro until it develops into a morula embryo, a blastocyst-stage embryo, or a developmental stage embryo between Vici stages 5 and 7, or into an embryo at
Дополнительно представлены различные крысиные ЭС клетки (которые не подвергались целевой генетической модификации и/или имеют целевую генетическую модификацию), которые характеризуются следующим.Additionally, various rat ES cells (which have not undergone targeted genetic modification and/or have targeted genetic modification) are presented, which are characterized as follows.
Крысиная ЭС клетка характеризуются:Rat ES cells are characterized by:
i) экспрессией одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, включая белок, связанный с адгезионными контактами (Ajap1), клаудин 5 (Cldn5), фактор 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимую протеинкиназу IV (Camk4), эфрин-А1 (Efha1), ЕРН рецептор А4 (Epha4), белок бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белок 1, подобный белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpl1), интерлейкин 36 бета (Il1f8), рецептор альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактор 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептор фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептор 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейрональный рецептор пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазу нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокс 2 каудального типа (Cdx2), повторные домены 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), ген forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), ген forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактор 1, связывающий лимфоидный энхансер (Lef1), ген 3, подобный Sal (дрозофила) (Sal13), гомеобокс 1 SATB (Satb1), miR-632 или их комбинацию;i) expression of one or more genes specific to rat ES cells, including adhesion junction protein (Ajap1), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV ( Camk4), ephrin-A1 (Efha1), NPH receptor A4 (Epha4), gap junction protein beta 5 (Gjb5), insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbpl1), interleukin 36 beta (Il1f8), receptor alpha interleukin 28 (Il28ra), asymmetry determination factor 1 (Lefty1), leukemia inhibitory factor alpha receptor (Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), pentraxin neuronal receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal homeobox 2 type (Cdx2), repeat domains 1 of fibronectin III and ankyrin (Fank1), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead gene box E1 (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer binding factor 1 (Lef1), Sal-like gene 3 (Drosophila) (Sal13), homeobox 1 SATB (Satb1), miR-632 or a combination thereof;
ii) экспрессией по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, включая белок, связанный с адгезионными контактами (Ajap1), клаудин 5 (Cldn5), фактор 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимую протеинкиназу IV (Camk4), эфрин-А1 (Efna1), ЕРН рецептор А4 (Epha4), белок бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белок 1, подобный белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpl1), интерлейкин 36 бета (Il1f8), рецептор альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактор 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептор фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептор 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейрональный рецептор пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазу нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокс 2 каудального типа (Cdx2), повторные домены 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), ген forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), ген forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактор 1, связывающий лимфоидный энхансер (Lef1), ген 3, подобный Sal (дрозофила) (Sal13), гомеобокс 1 SATB (Satb1), miR-632 или их комбинацию;ii) expressing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 or more genes specific to rat ES cells, including adhesion junction protein (Ajap1), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV (Camk4 ), ephrin-A1 (Efna1), NPH receptor A4 (Epha4), gap junction protein beta 5 (Gjb5), insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbpl1), interleukin 36 beta (Il1f8), interleukin receptor alpha 28 (Il28ra), asymmetry determination factor 1 (Lefty1), leukemia inhibitory factor alpha receptor (Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), pentraxin neuronal receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal type homeobox 2 (Cdx2), fibronectin III and ankyrin repeat domains 1 (Fank1), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead box E1 gene (thyroid transcription factor 2) (Foxe1), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer binding factor 1 (Lef1), Sal (Drosophila)-like gene 3 (Sal13), SATB homeobox 1 (Satb1), miR-632, or a combination thereof;
iii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 14, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;iii) at least 20-fold increase in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 14, compared with ES cell line F1H4 mice;
iv) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 14, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;iv) at least a 20-fold increase in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 14, compared with ES cell line F1H4 mice;
ν) экспрессией одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13;v) expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13;
vi) экспрессией по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13;vi) expressing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as listed in Table 13;
vii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;vii) at least 20-fold increase in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13, compared with the ES cell line F1H4 mice;
viii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;viii) at least a 20-fold increase in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13, compared with the mouse ES cell line F1H4;
ix) по меньшей мере 20-кратным снижением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 12, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4; и/илиix) at least 20-fold reduction in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 12, compared with ES cell line F1H4 mice; and/or
x) по меньшей мере 20-кратным снижением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 12, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;x) at least a 20-fold reduction in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 12, compared with the mouse ES cell line F1H4;
xi) любой комбинацией экспрессии генов, специфических для крысиных ЭС клеток согласно пунктам (i)-(x);xi) any combination of expression of genes specific for rat ES cells according to points (i)-(x);
xii) уровнем относительной экспрессии маркеров плюрипотентности, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 перечисленных маркеров плюрипотентности. См. уровни относительной экспрессии в колонке ранжирования плюрипотентности Таблицы 15;xii) the level of relative expression of pluripotency markers as shown in Table 15 for at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, or 18 listed markers of pluripotency. See relative expression levels in the pluripotency ranking column of Table 15;
xiii) уровнем относительной экспрессии мезодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3 или 4 перечисленных мезодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке мезодермального ранжирования Таблицы 15;xiii) the level of relative expression of mesodermal markers, as shown in Table 15, for at least 2, 3 or 4 listed mesodermal markers. See relative expression levels in the mesodermal ranking column of Table 15;
xiv) уровнем относительной экспрессии эндодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 перечисленных эндодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке эндодермального ранжирования Таблицы 15;xiv) the level of relative expression of endodermal markers as shown in Table 15 for at least 2, 3, 4, 5 or 6 of the listed endodermal markers. See relative expression levels in the endodermal ranking column of Table 15;
xv) уровнем относительной экспрессии нейронных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2 и 3 перечисленных нейронных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке нейронного ранжирования Таблицы 15;xv) the level of relative expression of neuronal markers, as shown in Table 15, for at least 2 and 3 of the listed neuronal markers. See relative expression levels in the neural ranking column of Table 15;
xvi) уровнем относительной экспрессии трофэктодермальных маркеров, как показано в таблице 15, для перечисленных трофэктодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке трофэктодермального ранжирования Таблицы 15;xvi) the level of relative expression of trophectodermal markers, as shown in Table 15, for the listed trophectodermal markers. See relative expression levels in the trophectodermal ranking column of Table 15;
xvii) любым уровнем относительной экспрессии одного или более (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,xvii) any level of relative expression of one or more (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) маркеров плюрипотентности, мезодермальных маркеров, эндодермальных маркеров, нейронных маркеров и/или трофэктодермальных маркеров, приведенных в Таблице 15;13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30) pluripotency markers, mesodermal markers, endodermal markers, neuronal markers and/or trophectodermal markers shown in Table 15;
xviii) уровнем относительной экспрессии каждого из маркеров, приведенных в таблице 15;xviii) the level of relative expression of each of the markers shown in Table 15;
xix) любой комбинацией сигнатур, приведенных в пунктах xii-xiix; и/илиxix) any combination of the signatures given in points xii-xiix; and/or
xx) любой комбинацией сигнатур, приведенных в пунктах i-xiix.xx) any combination of the signatures given in i-xiix.
В одном варианте реализации изобретения при трансплантации в эмбрион крысы на стадии преморулы крысиная ЭС клетка (которая не подвергалась целевой генетической модификации и/или имеет целевую генетическую модификацию) может вносить вклад по меньшей мере 90% клеток в поколение F0, вносить вклад по меньшей мере 95% клеток в поколение F0, вносить вклад по меньшей мере 96% клеток в поколение F0, вносить вклад по меньшей мере 97% клеток в поколение F0, вносить вклад по меньшей мере 98% клеток в поколение F0 или вносить вклад по меньшей мере 99% клеток в поколение F0.In one embodiment, when transplanted into a premorula stage rat embryo, a rat ES cell (which has not undergone targeted genetic modification and/or has targeted genetic modification) can contribute at least 90% of the cells to the F0 generation, contribute at least 95 % of cells in the F0 generation, contribute at least 96% of the cells to the F0 generation, contribute at least 97% of the cells to the F0 generation, contribute at least 98% of the cells to the F0 generation, or contribute at least 99% of the cells in generation F0.
III. Деривация и культивирование эмбриональных стволовых (ЭС) клетокIII. Derivation and cultivation of embryonic stem (ES) cells
Предложены различные способы получения крысиных ЭС клеток, описанных в данном документе. В специфических вариантах реализации изобретения такие способы включают (а) предоставление культуры in vitro, содержащей фидерный клеточный слой и популяцию выделенных крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток; (b) культивирование in vitro в условиях, достаточных для поддержания плюрипотентности и/или тотипотентности выделенной крысиной ЭС клетки. Такие способы, таким образом, позволяют культивировать популяцию крысиных ЭС клеток и/или линию крысиных ЭС клеток.Various methods have been proposed for the production of rat ES cells described herein. In specific embodiments of the invention, such methods include (a) providing an in vitro culture containing a feeder cell layer and a population of isolated rat embryonic stem (ES) cells; (b) in vitro cultivation under conditions sufficient to maintain the pluripotency and/or totipotency of the isolated rat ES cell. Such methods thus allow the cultivation of a rat ES cell population and/or a rat ES cell line.
В одном варианте реализации изобретения предложен способ культивирования линии крысиных эмбриональных стволовых клеток. Такие способы включают культивирование in vitro фидерного клеточного слоя и линии крысиных ЭС клеток, причем условия культивирования сохраняют плюрипотентность крысиных ЭС клеток и содержат среду с мышиным фактором ингибирования лейкемии (LIF) либо его активным вариантом или фрагментом. Различные способы дополнительно включают пересев и культивирование in vitro клеток линии крысиных ЭС клеток, причем каждое последующее культивирование in vitro включает культивирование крысиных ЭС клеток на фидерном клеточном слое в условиях, которые сохраняют плюрипотентность крысиных ЭС клеток и содержат среду с мышиным LIF либо его активным вариантом или фрагментом.In one embodiment, the invention provides a method for culturing a rat embryonic stem cell line. Such methods include in vitro culture of the feeder cell layer and rat ES cell line, wherein the culture conditions maintain the pluripotency of rat ES cells and contain media with mouse leukemia inhibitory factor (LIF) or an active variant or fragment thereof. The various methods further comprise subculturing and in vitro culture of the rat ES cell line, each subsequent in vitro culture comprising culturing the rat ES cells on the feeder cell layer under conditions that preserve the pluripotency of the rat ES cells and contain media with mouse LIF or an active variant or fragment.
i. Условия культивированияi. Cultivation conditions
Культуральная среда, используемая в различных способах и композициях, будет поддерживать крысиные ЭС клетки. Термины «поддержание» и «поддерживать» относятся к стабильному сохранению по меньшей мере одной или больше характеристик или фенотипов крысиных ЭС клеток, описанных в данном документе. Такие фенотипы могут включать поддержание плюрипотентности и/или тотипотентности, морфологии клеток, профилей экспрессии генов и других функциональных характеристик крысиных стволовых клеток, описанных в данном документе. Термин «поддерживать» может также включать культивирование стволовых клеток или увеличение количества культивируемых стволовых клеток. Этот термин также предусматривает условия культивирования, обеспечивающие сохранение плюрипотентности стволовых клеток, в то время как стволовые клетки могут продолжать или не продолжать делиться и увеличиваться в количестве.The culture medium used in various methods and compositions will support rat ES cells. The terms "maintenance" and "maintain" refer to the stable maintenance of at least one or more characteristics or phenotypes of rat ES cells described in this document. Such phenotypes may include maintenance of pluripotency and/or totipotency, cell morphology, gene expression profiles, and other functional characteristics of rat stem cells described herein. The term "maintain" may also include culturing stem cells or increasing the amount of culturable stem cells. The term also includes culture conditions that maintain the pluripotency of the stem cells while the stem cells may or may not continue to divide and increase in number.
Термин «питающая клетка» или «фидерный клеточный слой» относится к культуре клеток, которая растет in vitro и секретирует по меньшей мере один фактор в культуральную среду, используемую для поддержания роста другой клетки, представляющей интерес, в культуре. Питающие клетки используются в настоящем изобретении с целью поддержания плюрипотентности крысиных ЭС клеток и, в специфических вариантах реализации изобретения, одной или больше других характеристик или фенотипов, описанных в данном документе. Можно использовать различные питающие клетки, включая, например, мышиные эмбриональные фибробласты, в том числе мышиные эмбриональные фибробласты, полученные между 12-м и 16-м днями беременности. В специфических вариантах реализации изобретения фидерный клеточный слой содержит монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ).The term "feeder cell" or "feeder cell layer" refers to a cell culture that grows in vitro and secretes at least one factor into the culture medium used to support the growth of another cell of interest in culture. Feeder cells are used in the present invention to maintain the pluripotency of rat ES cells and, in specific embodiments of the invention, one or more of the other characteristics or phenotypes described herein. You can use a variety of feeder cells, including, for example, mouse embryonic fibroblasts, including mouse embryonic fibroblasts obtained between the 12th and 16th days of pregnancy. In specific embodiments of the invention, the feeder cell layer contains a monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEF).
Культуры in vitro крысиных ЭС клеток дополнительно содержат эффективное количество фактора ингибирования лейкемии (LIF) либо его активного варианта или фрагмента. Фактор ингибирования лейкемии (LIF) принадлежит к семейству рецепторов IL-6. LIF связывается с гетеродимерным мембранным рецептором, состоящим из LIF-специфических субъединиц, gp190 или LIFR, и субъединицы gp130, которые являются общими с другими членами семейства IL-6. LIF ингибирует дифференциацию эмбриональных стволовых клеток у мышей и вносит вклад в самообновление стволовых клеток. LIF человека и мыши разделяют 79% гомологии последовательности и демонстрируют межвидовую активность. LIF крысы (rtLIF) представляет собой белок массой 22,1 кДа, содержащий 202 аминокислотных остатка, который демонстрирует 91% идентичности аминокислотной последовательности LIF мыши (Takahama et al. 1998). Существуют шесть возможных аспарагин-связанных сайтов гликозилирования (N-гликозилирование), которые являются консервативными среди LIF полипептидов от различных видов и дополнительного сайта Asn150, специфического для LIF крыс. Третичная структура LIF мыши и ее функции более подробно описаны в публикациях Aikawa etal. (1998) Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 1318-1325 и Senturk et al. (2005) Immunology of Pregnancy, editor Gil Mor., патенте США №5750654 и публикации D Ρ Gearing (1987) EMBO Journal 1987-12-20, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Частичная последовательность LIF мыши зарегистрирована на веб-сайте SwissProt под номером доступа Р09056.In vitro cultures of rat ES cells further contain an effective amount of leukemia inhibitory factor (LIF), or an active variant or fragment thereof. Leukemia inhibitory factor (LIF) belongs to the IL-6 receptor family. LIF binds to a heterodimeric membrane receptor composed of LIF-specific subunits, gp190 or LIFR, and gp130 subunits, which are shared with other members of the IL-6 family. LIF inhibits differentiation of embryonic stem cells in mice and contributes to stem cell self-renewal. Human and mouse LIFs share 79% sequence homology and show cross-species activity. Rat LIF (rtLIF) is a 22.1 kDa protein containing 202 amino acid residues that exhibits 91% amino acid sequence identity of mouse LIF (Takahama et al. 1998). There are six possible asparagine-linked glycosylation sites (N-glycosylation) that are conserved among LIF polypeptides from various species and an additional Asn150 site specific to rat LIF. The mouse LIF tertiary structure and functions are described in more detail in Aikawa et al. (1998) Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 1318-1325 and Senturk et al. (2005) Immunology of Pregnancy, editor Gil Mor., US Pat. No. 5,750,654 and D P Gearing (1987) EMBO Journal 1987-12-20, which are incorporated herein in their entirety by reference. A partial mouse LIF sequence is registered on the SwissProt website under accession number P09056.
Активность LIF мыши оценивают по его способности индуцировать дифференциацию клеток миелолейкоза M1. Специфическая активность составляет 1 x 106 единиц/мл (номер по каталогу 03-0011 от Stemgent) и 1 χ 107 единиц/мл (номер по каталогу 03-0011-100 от Stemgent), где 50 единиц определяется как количество мышиного LIF, необходимого для индукции дифференциации у 50% колоний Ml в 1 мл среды. См. также публикации Williams, R.L. et al. (1988) Nature 336: 684-687.; Metcalf, D. et al. (1988) Leukemia2: 216-221; Niwa, H. etal. (2009) Nature 460: 118-122; Xu, J. et al. (2010) Cell Biol Int. 34: 791-797; Fukunaga, N. et al. (2010) Cell Reprogram. 12: 369-376; и Metcalf D. (2003) Stem Cells 21: 5-14, к которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. «Эффективное количество LIF» означает концентрацию LIF, которая позволяет культуре крысиных ЭС клеток in vitro оставаться в недифференцированном плюрипотентном состоянии. Различные маркеры, которые могут быть использованы для анализа клеток, остающихся в плюрипотентном состоянии, описаны в других разделах данного документа.Mouse LIF activity is assessed by its ability to induce differentiation of M1 myeloid leukemia cells. The specific activity is 1 x 10 6 units/mL (Stemgent catalog number 03-0011) and 1 χ 107 units/ml (Stemgent catalog number 03-0011-100), where 50 units is defined as the amount of mouse LIF required to induce differentiation in 50% Ml colonies in 1 ml of medium. See also Williams, RL et al. (1988) Nature 336: 684-687.; Metcalf, D. et al. (1988) Leukemia2: 216-221; Niwa, H. et al. (2009) Nature 460: 118-122; Xu, J. et al. (2010) Cell Biol Int. 34:791-797; Fukunaga, N. et al. (2010) Cell Reprogram. 12:369-376; and Metcalf D. (2003) Stem Cells 21: 5-14, which are incorporated herein in their entirety by reference. "An effective amount of LIF" means the concentration of LIF that allows the in vitro culture of rat ES cells to remain in an undifferentiated pluripotent state. Various markers that can be used to analyze cells remaining in a pluripotent state are described elsewhere in this document.
Полипептид LIF, используемый в различных способах и композициях, представленных в данном документе, может быть получен от любого организма, включая млекопитающее, грызуна, человека, крысу или мышь. В одном варианте реализации изобретения полипептид LIF получен от мыши. В дополнительных вариантах реализации изобретения мышиный полипептид LIF имеет аминокислотную последовательность, приведенную под номером доступа SwissProt: Р09056, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки, а также приведена в SEQ ID NO: 1.The LIF polypeptide used in the various methods and compositions provided herein can be obtained from any organism, including a mammal, rodent, human, rat, or mouse. In one embodiment, the LIF polypeptide is derived from a mouse. In additional embodiments, the murine LIF polypeptide has the amino acid sequence listed under SwissProt accession number: P09056, which is incorporated herein by reference in its entirety, and is also listed in SEQ ID NO: 1.
В других вариантах реализации изобретения можно использовать активный вариант или фрагмент мышиного полипептида LIF, приведенного в SEQ ID NO: 1 или под номером доступа SwissProt: Р09056. Такие активные варианты и фрагменты (включая активные варианты, имеющие по меньшей мере 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1) более подробно описаны в других разделах данного документа.In other embodiments, an active variant or fragment of the murine LIF polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 or SwissProt accession number: P09056 can be used. Such active variants and fragments (including active variants having at least 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99 % sequence identity with SEQ ID NO: 1) are described in more detail elsewhere in this document.
Полипептид LIF, или его активный вариант, или фрагмент может быть предоставлен в культуру in vitro различными способами. В одном варианте реализации изобретения эффективное количество полипептида LIF, или его активного варианта, или фрагмента добавляют в культуральную среду. В других вариантах реализации изобретения питающие клетки генетически модифицируют для сверхэкспрессии полипептида LIF либо его активного варианта или фрагмента. Такие питающие клетки включают питающие клетки, полученные из фибробластов мышей линии DIA-M, подвергшихся гамма-облучению или обработке митомицином-С, которые экспрессируют связанный с матриксом LIF. Способ создания и использования таких генетически модифицированных питающих клеток можно найти, например, в публикациях Buehr et al. (2003) BiolReprod 68:222-229, Rathjen et al. (1990) Cell 62 1105-1115 и Buehr et al. (2008) Cell 135:1287-1298, которые включены в данный документ посредством ссылки. Гетерологичный LIF, экспрессируемый в питающих клетках, может быть из того же организма, что и питающие клетки, или из организма, отличного от того, из которого получена питающая клетка. Кроме того, гетерологичный LIF, экспрессируемый в питающих клетках, может быть из того же или из другого организма, что и ЭС клетки, которые поддерживает фидерный слой.A LIF polypeptide, or active variant or fragment thereof, can be introduced into in vitro culture in a variety of ways. In one embodiment, an effective amount of the LIF polypeptide, or active variant or fragment thereof, is added to the culture medium. In other embodiments, the nurse cells are genetically modified to overexpress the LIF polypeptide, or active variant or fragment thereof. Such feeder cells include feeder cells derived from gamma-irradiated or mitomycin-C treated DIA-M mouse fibroblasts that express matrix-bound LIF. A method for creating and using such genetically modified nurse cells can be found, for example, in Buehr et al. (2003) BiolReprod 68:222-229, Rathjen et al. (1990) Cell 62 1105-1115 and Buehr et al. (2008) Cell 135:1287-1298, which are incorporated herein by reference. The heterologous LIF expressed in the nurse cells may be from the same organism as the nurse cells or from a different organism from which the nurse cell is derived. In addition, the heterologous LIF expressed in the feeder cells may be from the same or different organism as the ES cells that support the feeder layer.
В других вариантах реализации изобретения питающие клетки, используемые в различных способах, описанных в настоящем документе, не являются генетически модифицированными для экспрессии гетерологичного полипептида LIF либо его активного варианта или фрагмента. Таким образом, в конкретных вариантах реализации изобретения монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов, используемый в способах настоящего изобретения, не был генетически модифицирован для экспрессии гетерологичного полипептида LIF.In other embodiments, the nurse cells used in the various methods described herein are not genetically modified to express a heterologous LIF polypeptide or active variant or fragment thereof. Thus, in specific embodiments, the monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts used in the methods of the present invention has not been genetically modified to express a heterologous LIF polypeptide.
В других вариантах реализации изобретения полипептид LIF либо его активный вариант или фрагмент добавляют в культуральную среду. Если LIF добавляют в культуральную среду, указанный LIF может быть получен от любого организма, включая млекопитающее, грызуна, человека, крысу или мышь. В одном варианте реализации изобретения LIF, находящийся в культуральной среде, получен от мыши. В дополнительных вариантах реализации изобретения мышиный полипептид LIF имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации изобретения может быть использован активный вариант или фрагмент мышиного полипептида LIF, приведенный в SEQ ID NO: 1. Такие активные варианты и фрагменты (включая активные варианты, имеющие по меньшей мере 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1) более подробно описаны в других разделах настоящего документа.In other embodiments of the invention, the LIF polypeptide or its active variant or fragment is added to the culture medium. If the LIF is added to the culture medium, said LIF may be from any organism, including a mammal, rodent, human, rat, or mouse. In one embodiment, the LIF in the culture medium is from a mouse. In additional embodiments, the mouse LIF polypeptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In other embodiments, the active variant or fragment of the mouse LIF polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 can be used. Such active variants and fragments ( including active variants having at least 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with SEQ ID NO: 1) are described in more detail elsewhere in this document.
В специфических вариантах реализации изобретения крысиные ЭС клетки и линии крысиных ЭС клеток, представленные в данном документе, сохраняют плюрипотентность in vitro без потребности в паракринной сигнализации LIF.In specific embodiments, the rat ES cells and rat ES cell lines provided herein retain pluripotency in vitro without the need for LIF paracrine signaling.
В специфических вариантах реализации изобретения LIF, или его активный вариант или фрагмент присутствует в культуральной среде в любой концентрации, которая сохраняет крысиные ЭС клетки. Полипептид LIF, или его активный вариант, или фрагмент присутствует в культуральной среде в концентрации от около 25 Ед/мл до около 50 Ед/мл, от около 50 Ед/мл до около 100 Ед/мл, от около 100 Ед/мл до около 125 Ед/мл, от около 125 Ед/мл до около 150 Ед/мл, от около 150 Ед/мл до около 175 Ед/мл, от около 175 Ед/мл до около 200 Ед/мл, от около 200 Ед/мл до около 225 Ед/мл, от около 225 Ед/мл до около 250 Ед/мл, от около 250 Ед/мл до около 300 Ед/мл, от около 300 Ед/мл до около 325 Ед/мл, от около 325 Ед/мл до около 350 Ед/мл, от около 350 Ед/мл до около 400 Ед/мл, от около 400 Ед/мл до около 425 Ед/мл, от около 425 Ед/мл до около 450 Ед/мл, от около 450 Ед/мл до около 475 Ед/мл, от около 475 Ед/мл до около 500 Ед/мл, от около 75 Ед/мл до около 500 Ед/мл или больше. В других вариантах реализации изобретения полипептид LIF, или его активный вариант, или фрагмент присутствует в культуральной среде в концентрации от около 25 Ед/мл до около 50 Ед/мл, от около 25 Ед/мл до около 100 Ед/мл, от около 75 Ед/мл до около 125 Ед/мл, от около 50 Ед/мл до около 150 Ед/мл, от около 90 Ед/мл до около 125 Ед/мл, от около 90 Ед/мл до около 110 Ед/мл, от около 80 Ед/мл до около 150 Ед/мл, от около 80 Ед/мл до около 125 Ед/мл. В специфическом варианте реализации изобретения полипептид LIF, или его активный вариант, или фрагмент присутствует в культуральной среде в концентрации около 100 Ед/мл.In specific embodiments of the invention, LIF, or an active variant or fragment thereof, is present in the culture medium at any concentration that retains rat ES cells. The LIF polypeptide, or active variant or fragment thereof, is present in the culture medium at a concentration of from about 25 U/mL to about 50 U/mL, from about 50 U/mL to about 100 U/mL, from about 100 U/mL to about 125 U/ml, about 125 U/ml to about 150 U/ml, about 150 U/ml to about 175 U/ml, about 175 U/ml to about 200 U/ml, from about 200 U/ml up to about 225 U/ml, from about 225 U/ml to about 250 U/ml, from about 250 U/ml to about 300 U/ml, from about 300 U/ml to about 325 U/ml, from about 325 U /ml to about 350 U/ml, from about 350 U/ml to about 400 U/ml, from about 400 U/ml to about 425 U/ml, from about 425 U/ml to about 450 U/ml, from about 450 U/ml to about 475 U/ml, about 475 U/ml to about 500 U/ml, about 75 U/ml to about 500 U/ml or more. In other embodiments, the LIF polypeptide or active variant or fragment is present in the culture medium at a concentration of from about 25 U/mL to about 50 U/mL, from about 25 U/mL to about 100 U/mL, from about 75 U/mL. U/mL to about 125 U/mL, from about 50 U/mL to about 150 U/mL, from about 90 U/mL to about 125 U/mL, from about 90 U/mL to about 110 U/mL, from about 80 U/ml to about 150 U/ml, from about 80 U/ml to about 125 U/ml. In a specific embodiment, the LIF polypeptide, or active variant or fragment thereof, is present in the culture medium at a concentration of about 100 U/mL.
Если используется мышиный LIF, мышиный полипептид LIF, или его активный вариант, или фрагмент присутствует в культуральной среде в любой концентрации, которая сохраняет крысиные ЭС клетки. Мышиный полипептид LIF, или его активный вариант, или фрагмент присутствует в концентрации от около 25 Ед/мл до около 50 Ед/мл, от около 50 Ед/мл до около 100 Ед/мл, от около 100 Ед/мл до около 125 Ед/мл, от около 125 Ед/мл до около 150 Ед/мл, от около 150 Ед/мл до около 175 Ед/мл, от около 175 Ед/мл до около 200 Ед/мл, от около 200 Ед/мл до около 225 Ед/мл, от около 225 Ед/мл до около 250 Ед/мл, от около 250 Ед/мл до около 300 Ед/мл, от около 300 Ед/мл до около 325 Ед/мл, от около 325 Ед/мл до около 350 Ед/мл, от около 350 Ед/мл до около 400 Ед/мл, от около 400 Ед/мл до около 425 Ед/мл, от около 425 Ед/мл до около 450 Ед/мл, от около 450 Ед/мл до около 475 Ед/мл, от около 475 Ед/мл до около 500 Ед/мл, от около 75 Ед/мл до около 500 Ед/мл или больше. В других вариантах реализации изобретения мышиный полипептид LIF, или его активный вариант, или фрагмент присутствует в концентрации от около 25 Ед/мл до около 50 Ед/мл, от около 25 Ед/мл до около 100 Ед/мл, от около 75 Ед/мл до около 125 Ед/мл, от около 50 Ед/мл до около 150 Ед/мл, от около 90 Ед/мл до около 125 Ед/мл, от около 90 Ед/мл до около 110 Ед/мл, от около 80 Ед/мл до около 150 Ед/мл, от около 80 Ед/мл до около 125 Ед/мл. В специфическом варианте реализации изобретения мышиный полипептид LIF, или его активный вариант, или фрагмент присутствует в культуральной среде в концентрации около 100 Ед/мл.If mouse LIF is used, the mouse LIF polypeptide or active variant or fragment is present in the culture medium at any concentration that retains rat ES cells. The murine LIF polypeptide, or active variant or fragment thereof, is present at a concentration of about 25 U/ml to about 50 U/ml, about 50 U/ml to about 100 U/ml, about 100 U/ml to about 125 U /ml, from about 125 U/ml to about 150 U/ml, from about 150 U/ml to about 175 U/ml, from about 175 U/ml to about 200 U/ml, from about 200 U/ml to about 225 U/ml, about 225 U/ml to about 250 U/ml, about 250 U/ml to about 300 U/ml, about 300 U/ml to about 325 U/ml, from about 325 U/ml up to about 350 U/ml, from about 350 U/ml to about 400 U/ml, from about 400 U/ml to about 425 U/ml, from about 425 U/ml to about 450 U/ml, from about 450 U /ml to about 475 U/ml, from about 475 U/ml to about 500 U/ml, from about 75 U/ml to about 500 U/ml or more. In other embodiments, the mouse LIF polypeptide, or active variant or fragment thereof, is present at a concentration of about 25 U/mL to about 50 U/mL, about 25 U/mL to about 100 U/mL, about 75 U/mL ml to about 125 U/ml, from about 50 U/ml to about 150 U/ml, from about 90 U/ml to about 125 U/ml, from about 90 U/ml to about 110 U/ml, from about 80 U/ml to about 150 U/ml, from about 80 U/ml to about 125 U/ml. In a specific embodiment, the murine LIF polypeptide, or active variant or fragment thereof, is present in the culture medium at a concentration of about 100 U/mL.
Используемая культуральная среда поддерживает крысиные ЭС клетки. Таким образом, в специфических вариантах реализации изобретения культуральная среда, используемая в различных способах и композициях, будет поддерживать плюрипотентность всех или большинства (т.е. более 50%) крысиных ЭС клеток в клеточной линии в течение периода, равного по меньшей мере 5, 10 или 15 пересевам. В одном варианте реализации изобретения культуральная среда содержит одно или больше соединений, помогающих в поддержании плюрипотентности. В одном варианте реализации изобретения культуральная среда содержит ингибитор пути МЕК и ингибитор гликогенсинтазы-киназы-3 (GSK-3). Среда может дополнительно содержать дополнительные компоненты с целью поддержания ЭС клеток, включая, например, ингибиторы рецептора FGF, ингибиторы ROCK и/или ингибиторы ALK (рецептор TGFb). Неограничивающий пример ингибиторов рецептора FGF включает PD184352. Неограничивающий пример ингибитора ROCK включает Y-27632, а неограничивающий пример ингибитора ALK (рецептор TGFb) включает А-83-01. В специфических вариантах реализации изобретения при оттаивании криоконсервированных кЭСК или при пересеве кЭСК после диссоциации трипсином используется среда 2i (Таблица 2) с 10 мкМ ROCKi.The culture medium used supports rat ES cells. Thus, in specific embodiments of the invention, the culture medium used in various methods and compositions will maintain the pluripotency of all or most (i.e., more than 50%) of the rat ES cells in the cell line for a period of at least 5, 10 or 15 reseedings. In one embodiment of the invention, the culture medium contains one or more compounds that help maintain pluripotency. In one embodiment, the culture medium contains an inhibitor of the MEK pathway and an inhibitor of glycogen synthase kinase-3 (GSK-3). The medium may further contain additional components for the purpose of maintaining ES cells, including, for example, FGF receptor inhibitors, ROCK inhibitors and/or ALK (TGFb receptor) inhibitors. A non-limiting example of FGF receptor inhibitors includes PD184352. A non-limiting example of a ROCK inhibitor includes Y-27632 and a non-limiting example of an ALK (TGFb receptor) inhibitor includes A-83-01. In specific embodiments of the invention, when thawing cryopreserved hESCs or when replating kESCs after dissociation with trypsin, medium 2i (Table 2) with 10 μM ROCKi is used.
В других вариантах реализации изобретения среда содержит комбинацию ингибиторов, состоящую из ингибитора пути МЕК и ингибитора гликогенсинтазы-киназы-3 (GSK-3).In other embodiments of the invention, the medium contains a combination of inhibitors, consisting of an inhibitor of the MEK pathway and an inhibitor of glycogen synthase kinase-3 (GSK-3).
В одном неограничивающем варианте реализации изобретения культуральная среда содержит ингибитор GSK-3, представляющий собой CHIR99021, и/или содержит ингибитор MEK, представляющий собой PD0325901. В других вариантах реализации изобретения среда содержит комбинацию ингибиторов, состоящую из CHIR99021 и PD0325901. Любое из этих соединений может быть получено, например, от компании Stemgent. В специфических вариантах реализации изобретения CHIR99021 присутствует в культуральной среде в концентрации от около 0,5 мкМ до около 3 мкМ, от около 0,5 мкМ до около 3,5 мкМ, от около 0,5 мкМ до около 4 мкМ, от около 0,5 мкМ до около 1 мкМ, от около 1 мкМ до около 1,5 мкМ, от около 1,5 мкМ до около 2 мкМ, от около 2 мкМ до около 2,5 мкМ, от около 2,5 до около 3 мкМ, от 3 мкМ до около 3,5 мкМ. В дополнительных вариантах реализации изобретения CHIR99021 присутствует в культуральной среде в концентрации около 3 мкМ. В других вариантах реализации изобретения PD0325901 присутствует в культуральной среде в концентрации от около 0,4 мкМ до около 1 мкМ, от около 0,4 мкМ до около 1,5 мкМ, от около 0,4 мкМ до около 2 мкМ, от около 0,4 мкМ до около 0,8 мкМ, от 0,8 мкМ до около 1,2 мкМ, от около 1,2 до около 1,5 мкМ. В дополнительных вариантах реализации изобретения PD0325901 присутствует в культуральной среде в концентрации около 1 мкМ. В специфических вариантах реализации изобретения CHIR99021 присутствует в культуральной среде в концентрации около 3 мкМ, a PD0325901 присутствует в концентрации около 1 мкМ.In one non-limiting embodiment of the invention, the culture medium contains a GSK-3 inhibitor, which is CHIR99021, and/or contains a MEK inhibitor, which is PD0325901. In other embodiments of the invention, the environment contains a combination of inhibitors, consisting of CHIR99021 and PD0325901. Any of these compounds can be obtained from Stemgent, for example. In specific embodiments, CHIR99021 is present in the culture medium at a concentration of about 0.5 µM to about 3 µM, about 0.5 µM to about 3.5 µM, about 0.5 µM to about 4 µM, about 0 .5 µM to about 1 µM, about 1 µM to about 1.5 µM, about 1.5 µM to about 2 µM, about 2 µM to about 2.5 µM, about 2.5 to about 3 µM , from 3 μM to about 3.5 μM. In additional embodiments of the invention CHIR99021 is present in the culture medium at a concentration of about 3 μm. In other embodiments, PD0325901 is present in the culture medium at a concentration of about 0.4 µM to about 1 µM, about 0.4 µM to about 1.5 µM, about 0.4 µM to about 2 µM, about 0 .4 µM to about 0.8 µM, 0.8 µM to about 1.2 µM, about 1.2 to about 1.5 µM. In additional embodiments of the invention, PD0325901 is present in the culture medium at a concentration of about 1 μm. In specific embodiments of the invention, CHIR99021 is present in the culture medium at a concentration of about 3 μM, and PD0325901 is present at a concentration of about 1 μM.
В одном неограничивающем варианте реализации изобретения культуральная среда, используемая в различных способах и композициях, описанных в данном документе, представлена в Таблице 2. В контексте данной заявки среда, описанная в Таблице 2, называется средой 2i.In one non-limiting embodiment of the invention, the culture medium used in various methods and compositions described herein is presented in Table 2. In the context of this application, the medium described in Table 2 is referred to as medium 2i.
Дополнительные среды, которые могут быть использованы, включают описанные в публикациях Li et at. (2008) Celt 135:1299-1310, Yamamoto et at. (2012) Transgenic Rats 21:743-755, Ueda et at. (2008) PLoS ONE 3(6):e2800, Meek et at. (2010) PLoS ONE 4 (12): el4225; Tong et at. (2010) Nature 467:211-213; публикации патента США 2012/0142092, Buehr et at. (2008) Cell 135:1287-1298, Li et at. (135) Cell 1299-1310, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. При использовании таких сред концентрация и источник LIF могут быть изменены, как описано в данном документе. В специфических вариантах реализации изобретения различные культуральные среды используют в комбинации с мышиным LIF либо его активным вариантом или фрагментом, и в дополнительных вариантах реализации изобретения различные культуральные среды содержат мышиный LIF либо его активный вариант или фрагмент в концентрации от около 50 Ед/мл до около 100 Ед/мл, от около 50 Ед/мл до около 150 Ед/мл или около 100 Ед/мл.Additional media that may be used include those described in Li et al. (2008) Celt 135:1299-1310, Yamamoto et at. (2012) Transgenic Rats 21:743-755, Ueda et at. (2008) PLoS ONE 3(6):e2800, Meek et at. (2010) PLoS ONE 4 (12): el4225; Tong et at. (2010) Nature 467:211-213; U.S. Patent Publication 2012/0142092, Buehr et at. (2008) Cell 135:1287-1298 Li et at. (135) Cell 1299-1310, which are incorporated herein in their entirety by reference. When using such media, the concentration and source of LIF can be changed, as described in this document. In specific embodiments, various culture media are used in combination with mouse LIF, or an active variant or fragment thereof, and in additional embodiments, the various culture media contain mouse LIF, or an active variant or fragment thereof, at a concentration of from about 50 U/ml to about 100 U/ml, about 50 U/ml to about 150 U/ml, or about 100 U/ml.
Температуру культур крысиных ЭС клеток, как для производства ЭС клеточной линии, так и для культивирования и поддержания линии ЭС, обычно поддерживают на уровне от около 35°С до около 37,5°С. В специфическом варианте реализации изобретения температура составляет 37,0°С. Культивирование обычно осуществляют с использованием 7,5% CO2.The temperature of rat ES cell cultures, both for producing an ES cell line and for cultivating and maintaining an ES line, is typically maintained at about 35°C to about 37.5°C. In a specific embodiment of the invention, the temperature is 37.0°C. Cultivation is usually carried out using 7.5% CO 2 .
ii. Создание линии крысиных ЭС клетокii. Establishment of a rat ES cell line
Предлагаются способы создания крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Такие способы включают (а) культивирование in vitro первого фидерного клеточного слоя и эмбриона на стадии морулы, эмбриона на стадии бластоцисты или эмбриона крысы на стадии развития между эмбрионом на стадии морулы и эмбрионом на стадии бластоцисты, где у эмбриона крысы была удалена блестящая оболочка яйцеклетки и где условия культивирования сохраняют плюрипотентность крысиной ЭС клетки и содержат среду с мышиным фактором ингибирования лейкемии (LIF) либо его активным вариантом или фрагментом; и (b) перенос разрастания аморфной недифференцированной массы крысиных ЭС клеток в лунку для культивирования in vitro, содержащую второй фидерный клеточный слой, и культивирование разрастания в условиях, которые сохраняют плюрипотентность крысиных ЭС клеток, и содержат среды с мышиным LIF либо его активным вариантом или фрагментом, тем самым создавая линию крысиных ЭС клеток. Различные способы дополнительно включают пересев и культивирование in vitro клеток линии крысиных ЭС клеток, причем каждое последующее культивирование in vitro включает культивирование крысиных ЭС клеток на фидерном клеточном слое в условиях, которые сохраняют плюрипотентность крысиных ЭС клеток и содержат среду с мышиным LIF либо его активным вариантом или фрагментом. Также предлагаются линии крысиных ЭС клеток, полученных такими способами.Methods for generating rat embryonic stem (ES) cells are provided. Such methods include (a) culturing in vitro the first feeder cell layer and a morula embryo, a blastocyst embryo, or a developmental rat embryo between a morula embryo and a blastocyst embryo, where the zona pellucida has been removed from the rat embryo and wherein the culture conditions retain the pluripotency of the rat ES cell and contain a medium containing mouse leukemia inhibitory factor (LIF) or an active variant or fragment thereof; and (b) transferring the outgrowth of an amorphous, undifferentiated mass of rat ES cells into an in vitro culture well containing a second feeder cell layer and culturing the outgrowth under conditions that preserve the pluripotency of the rat ES cells and contain media with mouse LIF or an active variant or fragment thereof. , thereby creating a line of rat ES cells. The various methods further comprise subculturing and in vitro culture of the rat ES cell line, each subsequent in vitro culture comprising culturing the rat ES cells on the feeder cell layer under conditions that preserve the pluripotency of the rat ES cells and contain media with mouse LIF or an active variant or fragment. Rat ES cell lines prepared by such methods are also provided.
Неограничивающие примеры способов создания линии крысиных ЭС клеток, имеющей различные характеристики, которые рассматриваются в данном документе, представлены в Примере 3. Вкратце, эмбрион крысы (т.е. эмбрион на стадии морулы, эмбрион на стадии бластоцисты или эмбрион крысы на стадии развития между эмбрионом на стадии морулы и эмбрионом на стадии бластоцисты) вымывают из маток самок крыс. В специфических вариантах реализации изобретения получают бластоцисту или 8-клеточный эмбрион. Блестящую оболочку яйцеклетки удаляют и эмбрионы крыс культивируют на питающих клетках (как описано в других разделах данного документа), которые в специфических вариантах реализации изобретения содержат монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ). Клетки эмбриона на стадии морулы, эмбриона на стадии бластоцисты или эмбриона крысы на стадии развития между эмбрионом на стадии морулы и эмбрионом на стадии бластоцисты культивируют in vitro в условиях, которые сохраняют крысиные ЭС клетки и, таким образом, являются достаточными для сохранения плюрипотентности и/или тотипотентности ЭС клеток. На этой стадии можно использовать различные среды, в том числе любую из различных сред, рассмотренных выше, которые содержат в средах LIF, в том числе мышиный LIF либо его активный вариант или фрагмент.Non-limiting examples of methods for generating a rat ES cell line having the various characteristics discussed herein are provided in Example 3. at the morula stage and with an embryo at the blastocyst stage) are washed out from the uterus of female rats. In specific embodiments of the invention, a blastocyst or an 8-cell embryo is obtained. The zona pellucida is removed and the rat embryos are cultured on feeder cells (as described elsewhere herein) which, in specific embodiments, contain a monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Morula embryo, blastocyst embryo, or developmental rat embryo cells between morula embryo and blastocyst embryo are cultured in vitro under conditions that preserve rat ES cells and are thus sufficient to maintain pluripotency and/or totipotency of ES cells. Various media can be used at this stage, including any of the various media discussed above that contain LIFs in the media, including mouse LIF or an active variant or fragment thereof.
Культуры наблюдают на наличие разрастания (аморфная недифференцированная масса клеток). После того как разрастание достигает соответствующего размера, данное разрастание переносят на новый фидерный планшет и культивируют. Для получения множества колоний перенос сопровождается ферментативной диссоциацией с использованием трипсина. Этот перенос обычно называют «пересев 1». Скорость, с которой растет каждая линия, различна. Среды меняют по мере необходимости, чтобы поддерживать плюрипотентность или тотипотентность крысиных ЭС клеток. Культуры наблюдают на наличие колоний, имеющих морфологию эмбриональных стволовых клеток. Такая морфология включает одну или больше следующих характеристик: (а) круглые, циркулярные бугорки, возвышающиеся над монослоем питающих клеток; (b) клетки, плотно упакованные вместе, так что клеточные границы трудно увидеть; (с) более маленький размер клеток; (d) небольшое количество цитоплазмы и увеличенное ядро, (е) образуют сфероподобные колонии при посеве на питающие клетки in vitro. После того, как появляются такие колонии, культивирование может продолжаться до достижения примерно 50% слияния. Колонии затем переносят на новый фидерный планшет. Для увеличения числа колоний перенос сопровождается ферментативной диссоциацией с использованием трипсина. Этот процесс называют «пересев 2». Клетки продолжают культивировать с питающими клетками до достижения около 50% слияния, после чего эти клетки могут подвергаться дополнительным пересевам для поддержания клеточных линий или эти линии могут быть заморожены. См. также публикации Tong et al. (2010) Nature 467 (9):211-215; Li et al. (2008) Cell 135:1299-1310 и Buehr et al. (2008) Cell 135:1287-1298, которые включены в данный документ посредством ссылки. Таким образом, в специфических вариантах реализации изобретения возможна субкультивация и поддержание недифференцированного состояния различных крысиных ЭС клеток, линий клеток и популяций клеток, описанных в данном документе.Cultures are observed for outgrowth (amorphous undifferentiated mass of cells). Once the outgrowth reaches an appropriate size, the outgrowth is transferred to a new feeder plate and cultured. To obtain multiple colonies, the transfer is followed by enzymatic dissociation using trypsin. This transfer is commonly referred to as "reseeding 1". The rate at which each line grows is different. Media is changed as needed to maintain pluripotency or totipotency of rat ES cells. The cultures are observed for the presence of colonies having the morphology of embryonic stem cells. This morphology includes one or more of the following characteristics: (a) round, circular tubercles that rise above a monolayer of nurse cells; (b) cells tightly packed together so that cell boundaries are difficult to see; (c) smaller cell size; (d) a small amount of cytoplasm and an enlarged nucleus, (e) form spherical colonies when seeded on nurse cells in vitro. Once such colonies appear, cultivation can continue until about 50% confluence is reached. The colonies are then transferred to a new feeder plate. To increase the number of colonies, the transfer is accompanied by enzymatic dissociation using trypsin. This process is called "reseeding 2". The cells continue to be cultured with nurse cells until about 50% confluence is reached, after which these cells may be subjected to additional passages to maintain the cell lines or the lines may be frozen. See also Tong et al. (2010) Nature 467(9):211-215; Li et al. (2008) Cell 135:1299-1310 and Buehr et al. (2008) Cell 135:1287-1298, which are incorporated herein by reference. Thus, in specific embodiments of the invention, it is possible to subcultivate and maintain an undifferentiated state of various rat ES cells, cell lines and cell populations described herein.
В одном неограничивающем варианте реализации изобретения деривация крысиных ЭС клеток происходит следующим образом. В день 0 самок крыс умерщвляют и отсекают маточные трубы и рога матки и помещают в чашку с культурой ткани, содержащую теплую среду N2B27. Средой промывают рога матки и маточные трубы, чтобы извлечь бластоцисты в среду. Бластоцисты собирают и переносят на чашку для культивирования эмбриона, содержащую KSOM+2i (1мкMPD0325901, 3мк М CHIR99021). KSOM можно приобрести в компании Millipore, номер по каталогу MR-106-D. Среда 2i, упоминавшаяся в данном документе, содержит набор сред, приведенный в Таблице 2. Клетки культивируют в течение ночи при 37°С и 7,5% CO2.In one non-limiting embodiment of the invention, the derivation of rat ES cells occurs as follows. On day 0, female rats are sacrificed and the fallopian tubes and uterine horns are cut off and placed in a tissue culture dish containing warm N2B27 medium. The uterine horns and fallopian tubes are washed with the medium to remove the blastocysts into the medium. Blastocysts are harvested and transferred to an embryo culture dish containing KSOM+2i (1µ MPD0325901, 3µ M CHIR99021). KSOM is available from Millipore, part number MR-106-D. Environment 2i mentioned in this document contains a set of environments shown in Table 2. Cells are cultured overnight at 37°C and 7.5% CO 2 .
В других неограничивающих вариантах реализации изобретения крысиные ЭС клетки получают от 8-клеточных эмбрионов или замороженных 8-клеточных эмбрионов. Эмбрионы культивируют в среде М2 в течение 10 минут при комнатной температуре, а потом переносят на среду KSOM+2i и культивируют в течение ночи.In other non-limiting embodiments of the invention, rat ES cells are obtained from 8-cell embryos or frozen 8-cell embryos. Embryos are cultured in M2 medium for 10 minutes at room temperature, and then transferred to KSOM+2i medium and cultured overnight.
В неограничивающем примере деривация крысиных ЭС клеток происходит следующим образом: на День 1 - перенос эмбрионов с наличием полости в среду 2i (Таблица 2) и культивирование в течение ночи. Культивирование эмбрионов без сформированной полости продолжают в среде KSOM+2i. Надень 2 все оставшиеся эмбрионы переносят в среду 2i, независимо от того, произошло ли образование в них полости. Культивирование продолжают в течение ночи в среде 2i. На день 3 эмбрионы инкубируют с кислотой Тироде для удаления блестящей оболочки яйцеклетки и промывают 3 раза в среде 2i для удаления кислоты Тироде. Каждый эмбрион депонируют в отдельной лунке питающего планшета, в котором каждая лунка содержит монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ). Клетки культивируют в течение ночи в среде 2i. На день 4 и 5 посеянные клетки эмбрионов наблюдают на наличие разрастания, аморфной недифференцированной массы клеток. Разрастания готовы для переноса, когда их размер увеличивается в два раза по сравнению с размером высеянного эмбриона. Каждый день истощенную среду удаляют и заменяют свежей средой 2i. Разрастания переносят в новые питающие лунки, и снова удаляют истощенную среду, и питающие лунки промывают фосфатно-солевым буферным раствором, ФСБ. Удаляют ФСБ, добавляют трипсин и инкубируют около 10 минут. Реакцию с трипсином останавливают добавлением 30 мкл среды 2i и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Клетки осторожно диссоциируют и все содержимое переносят в лунку питающего планшета. Этот процесс называют «Пересев 1» 1 (Р1). Клетки культивируют в течение ночи в среде 2i. С дня 5-8, в зависимости от того, как быстро растет каждая линия, среду 2i меняют каждый день и культуры наблюдают на наличие колоний, имеющих морфологию ЭСК. Такая морфология ЭСК подробно описана в других разделах данного документа. Культивирование продолжается до тех пор, пока колонии не разрастутся до около 50% слияния. Затем колонии обрабатывают трипсином и пересевают, как и раньше, в питающие лунки. Этот процесс называют «пересев 2». Питание и наблюдение за каждой линией продолжается до тех пор, пока не произойдет около 50% слияния. Клетки, как обычно, обрабатывают трипсином. Реакцию с трипсином останавливают добавлением среды 2i+10% ФБС. Клетки осаждают центрифугированием, и клетки помещают в 400 мкл среды для замораживания (70% 2i, 20% ФБС, 10% ДМСО). После этого клетки можно заморозить. Этот процесс называют «пересев 3».In a non-limiting example, derivation of rat ES cells occurs as follows: on Day 1 - transfer of cavity embryos to medium 2i (Table 2) and cultivation overnight. Cultivation of embryos without formed cavity is continued in KSOM+2i medium. Put on 2, all remaining embryos are transferred to medium 2i, whether or not they have developed a cavity. Cultivation is continued overnight in medium 2i. On day 3, embryos are incubated with Tyrode's acid to remove the zona pellucida and washed 3 times in 2i medium to remove Tyrode's acid. Each embryo is deposited in a separate well of a feeding plate, in which each well contains a monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEF). Cells are cultured overnight in medium 2i. On
iii. Поддержание и пересев линии крысиных ЭС клетокiii. Maintenance and replating of the rat ES cell line
Дополнительно предложены способы поддержания или культивирования клеточной линии эмбриональных стволовых клеток крысы. Этот способ включает культивирование in vitro фидерного клеточного слоя и линии крысиных ЭС клеток, причем условия культивирования сохраняют плюрипотентность крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и содержат среду с мышиным фактором ингибирования лейкемии (LIF) либо его активным вариантом или фрагментом. В таких способах используют культуральную среду и фидерный клеточный слой, как описано выше. В одном варианте реализации изобретения линию крысиных ЭС клеток можно пересевать по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 или больше раз. В вариантах реализации изобретения крысиные ЭС клетки можно пересевать до по меньшей мере 11 раз в среде, содержащей ингибитор GSK3 и ингибитор MEK, без снижения ее целевой эффективности или эффективности трансмиссии через зародышевую линию целевой генетической модификации.Additionally, methods are provided for maintaining or cultivating a rat embryonic stem cell line. The method includes in vitro cultivation of a feeder cell layer and a rat ES cell line, wherein the culture conditions preserve the pluripotency of rat embryonic stem (ES) cells and contain a medium with mouse leukemia inhibitory factor (LIF) or an active variant or fragment thereof. Such methods use a culture medium and a feeder cell layer as described above. In one embodiment, the rat ES cell line can be seeded at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 or more times. In embodiments of the invention, rat ES cells can be passaged up to at least 11 times in a medium containing a GSK3 inhibitor and a MEK inhibitor without reducing its target efficiency or the efficiency of transmission through the germline of the target genetic modification.
Линии крысиных ЭС клеток питают и наблюдают. В специфических вариантах реализации изобретения пересев осуществляют при слиянии культуры, составляющем около 30%, 40%, 50% или 60%. В других вариантах реализации изобретения пересев осуществляют при слиянии культуры на 50%. В зависимости оттого, как быстро растет каждая линия, пересев можно осуществлять каждые 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95 или 100 часов. В других вариантах реализации изобретения время между пересевами находится в диапазоне от 24 часов до 96 часов, от около 30 до 50 часов, от около 25 до 75 часов, от около 50 до 96 часов, от около 25 до 75 часов, от около 35 до 85 часов или от около 40 до 70 часов. В одном варианте реализации изобретения время удвоения крысиной ЭС клетки, линии клеток или популяции клеток, описанной в настоящем документе, находится в диапазоне от около 24 часов до около 36 часов. В одном варианте реализации изобретения время удвоения крысиной ЭС клетки составляет 25 часов.Rat ES cell lines are fed and observed. In specific embodiments of the invention, reseeding is carried out at a culture confluence of about 30%, 40%, 50%, or 60%. In other embodiments of the invention, reseeding is carried out when the culture is 50% confluent. Depending on how fast each line grows, reseeding can be done every 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95 or 100 hours. In other embodiments, the time between passages is in the range of 24 hours to 96 hours, about 30 to 50 hours, about 25 to 75 hours, about 50 to 96 hours, about 25 to 75 hours, about 35 to 85 hours or about 40 to 70 hours. In one embodiment, the doubling time of the rat ES cell, cell line, or cell population described herein is in the range of about 24 hours to about 36 hours. In one embodiment of the invention, the doubling time of the rat ES cell is 25 hours.
Различные линии крысиных ЭС клеток при получении и поддержании, описанном в данном документе, могут иметь одно или более следующих свойств:Various rat ES cell lines, when prepared and maintained as described herein, may have one or more of the following properties:
(a) обладают компетентностью зародышевой линии, что означает, что при имплантации крысиной ЭС клетки в крысиный эмбрион-хозяин геном линии крысиных ЭС клеток передается потомству;(a) have germline competence, meaning that when a rat ES cell is implanted in a rat embryonic host, the genome of the rat ES cell line is passed on to offspring;
(b) обладают компетентностью зародышевой линии после целевой генетической модификации, что означает, что при имплантации крысиной ЭС клетки в крысиный эмбрион-хозяин целевая генетическая модификация в геноме линии крысиных ЭС клеток передается потомству;(b) have germline competence after the targeted genetic modification, meaning that upon implantation of the rat ES cell into a rat host embryo, the targeted genetic modification in the genome of the rat ES cell line is passed on to offspring;
(c) обладают плюрипотентностью in vitro;(c) have in vitro pluripotency;
(d) обладают тотипотентностью in vitro;(d) are totipotent in vitro;
(e) при культивации in vitro свободно прикрепляются к фидернему клеточному слою;(e) when cultivated in vitro freely attached to the feeder cell layer;
(f) при культивации in vitro образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro;(f) when cultivated in vitro form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro;
(g) сохраняют плюрипотентность при культивации in vitro в условиях, включающих фидерный клеточный слой, который не является генетически модифицированным для экспрессии фактора ингибирования лейкемии (LIF), причем культуральная среда содержит достаточную концентрацию LIF;(g) retain pluripotency when cultured in vitro under conditions including a feeder cell layer that is not genetically modified to express leukemia inhibitory factor (LIF), and the culture medium contains a sufficient concentration of LIF;
(h) сохраняют плюрипотентность при культивации in vitro в условиях, включающих фидерный клеточный слой, причем культуральная среда содержит мышиный LIF либо его активный вариант или фрагмент;(h) retain pluripotency when cultured in vitro under conditions including a feeder cell layer, wherein the culture medium contains mouse LIF or an active variant or fragment thereof;
(i) имеют молекулярную сигнатуру, которая характеризуется следующим:(i) have a molecular signature that is characterized by the following:
i) экспрессией одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, включая белок, связанный с адгезионными контактами (Ajap1), клаудин 5 (Cldn5), фактор 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимую протеинкиназу IV (Camk4), эфрин-А1 (Efnal), ЕРН рецептор А4 (Epha4), белок бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белок 1, подобный белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbp11), интерлейкин 36 бета (Illf8), рецептор альфа интерлейкина 28 (Il128ra), фактор 1 детерминации асимметрии (Leftyl), альфа-рецептор фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептор 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейрональный рецептор пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазу нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокс 2 каудального типа (Cdx2), повторные домены 1 фибронектина III и анкирина (Fankl), ген forkhead box El (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxel), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), ген forkhead box El (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxel), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактор 1, связывающий лимфоидный энхансер (Lefl), ген 3, подобный Sal (дрозофила) (Sall3), гомеобокс 1 SATB (Satbl), miR-632 или их комбинацию;i) expression of one or more genes specific to rat ES cells, including adhesion junction protein (Ajap1), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV ( Camk4), ephrin-A1 (Efnal), NPH receptor A4 (Epha4), gap junction protein beta 5 (Gjb5), insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbp11), interleukin 36 beta (Illf8), receptor alpha interleukin 28 (Il128ra), asymmetry determination factor 1 (Leftyl), leukemia inhibitory factor alpha receptor (Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), pentraxin neuronal receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal homeobox 2 type (Cdx2), repeat domains 1 of fibronectin III and ankyrin (Fankl), forkhead box El gene (thyroid transcription factor 2) (Foxel), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead gene box El (thyroid transcription factor 2) (Foxel), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer-binding factor 1 (Lefl), Sal-like gene 3 (Drosophila) (Sall3), homeobox 1 SATB (Satbl), miR-632 or a combination;
ii) экспрессией по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, включая белок, связанный с адгезионными контактами (Ajapl), клаудин 5 (Cldn5), фактор 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимую протеинкиназу IV (Camk4), эфрин-А1 (Efnal), ЕРН рецептор А4 (Epha4), белок бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белок 1, подобный белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpll), интерлейкин 36 бета (Illf8), рецептор альфа интерлейкина 28 (Il128ra), фактор 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептор фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептор 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейрональный рецептор пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазу нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокс 2 каудального типа (Cdx2), повторные домены 1 фибронектина III и анкирина (Fankl), ген forkhead box El (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxel), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), ген forkhead box El (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxel), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактор 1, связывающий лимфоидный энхансер (Lefl), ген 3, подобный Sal (дрозофила) (Sall3), гомеобокс 1 SATB (Satbl), miR-632 или их комбинацию;ii) expressing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 or more genes specific to rat ES cells, including adhesion junction protein (Ajapl), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV (Camk4 ), ephrin-A1 (Efnal), NPH receptor A4 (Epha4), gap junction protein beta 5 (Gjb5), insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbpll), interleukin 36 beta (Illf8), interleukin receptor alpha 28 (Il128ra), asymmetry determination factor 1 (Lefty1), leukemia inhibitory factor alpha receptor (Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), pentraxin neuronal receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal type homeobox 2 (Cdx2), fibronectin III and ankyrin repeat domains 1 (Fankl), forkhead box El gene (thyroid transcription factor 2) (Foxel) , hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead box El gene (thyroid transcription factor 2) (Foxel), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2) , lymphoid enhancer binding factor 1 (Lefl), Sal (Drosophila)-like gene 3 (Sall3), SATB homeobox 1 (Satbl), miR-632, or a combination thereof;
iii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 14, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;iii) at least 20-fold increase in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 14, compared with ES cell line F1H4 mice;
iv) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 14, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;iv) at least a 20-fold increase in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 14, compared with ES cell line F1H4 mice;
v) экспрессией одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13;v) expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13;
vi) экспрессией по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13;vi) expressing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as listed in Table 13;
vii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;vii) at least 20-fold increase in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13, compared with the ES cell line F1H4 mice;
viii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;viii) at least a 20-fold increase in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13, compared with the mouse ES cell line F1H4;
ix) по меньшей мере 20-кратным снижением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 12, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4; и/илиix) at least 20-fold reduction in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 12, compared with ES cell line F1H4 mice; and/or
x) по меньшей мере 20-кратным снижением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 12, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;x) at least a 20-fold reduction in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 12, compared with the mouse ES cell line F1H4;
xi) любой комбинацией экспрессии генов, специфических для крысиных ЭС клеток согласно разделам (i)-(x);xi) any combination of expression of genes specific for rat ES cells according to sections (i)-(x);
xii) уровнем относительной экспрессии маркеров плюрипотентности, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 перечисленных маркеров плюрипотентности. См. уровни относительной экспрессии в колонке ранжирования плюрипотентности Таблицы 15;xii) the level of relative expression of pluripotency markers as shown in Table 15 for at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, or 18 listed markers of pluripotency. See relative expression levels in the pluripotency ranking column of Table 15;
xiii) уровнем относительной экспрессии мезодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3 или 4 перечисленных мезодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке мезодермального ранжирования Таблицы 15;xiii) the level of relative expression of mesodermal markers, as shown in Table 15, for at least 2, 3 or 4 listed mesodermal markers. See relative expression levels in the mesodermal ranking column of Table 15;
xiv) уровнем относительной экспрессии эндодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 перечисленных эндодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке эндодермального ранжирования таблицы 15;xiv) the level of relative expression of endodermal markers as shown in Table 15 for at least 2, 3, 4, 5 or 6 of the listed endodermal markers. See relative expression levels in the endodermal ranking column of Table 15;
xv) уровнем относительной экспрессии нейронных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2 и 3 перечисленных нейронных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке нейронного ранжирования Таблицы 15;xv) the level of relative expression of neuronal markers, as shown in Table 15, for at least 2 and 3 of the listed neuronal markers. See relative expression levels in the neural ranking column of Table 15;
xvi) уровнем относительной экспрессии трофэктодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для перечисленных трофэктодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке трофэктодермального ранжирования Таблицы 15;xvi) the level of relative expression of trophectodermal markers, as shown in Table 15, for the listed trophectodermal markers. See relative expression levels in the trophectodermal ranking column of Table 15;
xvii) любым уровнем относительной экспрессии одного или более (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) маркеров плюрипотентности, мезодермальных маркеров, эндодермальных маркеров, нейронных маркеров и/или трофэктодермальных маркеров, приведенных в Таблице 15;xvii) any level of relative expression of one or more (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30) the pluripotency markers, mesodermal markers, endodermal markers, neuronal markers and/or trophectodermal markers shown in Table 15;
xviii) уровнем относительной экспрессии каждого из маркеров, приведенных в Таблице 15;xviii) the level of relative expression of each of the markers shown in Table 15;
xix) любой комбинацией сигнатур, приведенных в разделах xii-xiix; и/илиxix) any combination of the signatures given in sections xii-xiix; and/or
xx) любой комбинацией сигнатур, приведенных в разделах i-xiix;xx) any combination of the signatures given in sections i-xiix;
(j) обладают способностью продуцировать крысу F0;(j) have the ability to produce rat F0;
(k) способны к субкультивированию и поддержанию недифференцированного состояния;(k) are capable of subculturing and maintaining an undifferentiated state;
(l) имеют то же количество хромосом, что и клетка нормальной крысы; и/или(l) have the same number of chromosomes as a normal rat cell; and/or
(m) сохраняют плюрипотентность in vitro без потребности в паракринной сигнализации LIF;(m) retain pluripotency in vitro without the need for LIF paracrine signaling;
(n) обладают способностью самообновления, что означает, что они делятся бесконечно, сохраняя плюрипотентность.(n) are self-renewing, meaning that they divide indefinitely while maintaining pluripotency.
Такие свойства данной линии крысиных ЭС клеток могут присутствовать в любом из пересевов, в том числе в пересевах 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 или позже.Such properties of this rat ES cell line can be present in any of the passages, including
Таким образом, в одном неограничивающем варианте реализации изобретения предлагается культура in vitro, содержащая фидерный клеточный слой и популяцию крысиных ЭС клеток, причем условия культивирования in vitro сохраняют плюрипотентность крысиных ЭС клеток и содержат среду с мышиным фактором ингибирования лейкемии (LIF) либо его активным вариантом или фрагментом. В специфических вариантах реализации изобретения в крысиных ЭС клетках, культивируемых в таких условиях, плюрипотентность сохраняется по меньшей мере у 50% популяции клеток на протяжении по меньшей мере 10 пересевов, плюрипотентность сохраняется по меньшей мере у 60% популяции клеток на протяжении по меньшей мере 10 пересевов, плюрипотентность сохраняется по меньшей мере у 70% популяции клеток на протяжении по меньшей мере 10 пересевов, плюрипотентность сохраняется по меньшей мере у 75% популяции клеток на протяжении по меньшей мере 10 пересевов, плюрипотентность сохраняется по меньшей мере у 80% популяции клеток на протяжении по меньшей мере 10 пересевов, плюрипотентность сохраняется по меньшей мере у 85% популяции клеток на протяжении по меньшей мере 10 пересевов, плюрипотентность сохраняется по меньшей мере у 90% популяции клеток на протяжении по меньшей мере 10 пересевов или плюрипотентность сохраняется по меньшей мере у 95% популяции клеток на протяжении по меньшей мере 10 пересевов.Thus, in one non-limiting embodiment of the invention, an in vitro culture is provided comprising a feeder cell layer and a population of rat ES cells, wherein the in vitro culture conditions maintain the pluripotency of the rat ES cells and contain a mouse leukemia inhibitory factor (LIF) medium, or an active variant thereof, or fragment. In specific embodiments of the invention, in rat ES cells cultured under such conditions, pluripotency is maintained in at least 50% of the cell population for at least 10 passages, pluripotency is maintained in at least 60% of the cell population for at least 10 passages , pluripotency is maintained in at least 70% of the cell population for at least 10 passages, pluripotency is maintained in at least 75% of the cell population for at least 10 passages, pluripotency is maintained in at least 80% of the cell population for at least 10 passages at least 10 passages, pluripotency is maintained in at least 85% of the cell population for at least 10 passages, pluripotency is maintained in at least 90% of the cell population for at least 10 passages, or pluripotency is maintained in at least 95% of the population cells for at least 10 passages ov.
Дополнительно в настоящем документе предлагаются культуры in vitro, содержащие различные крысиные ЭС клетки, популяции клеток и линии клеток, описанные вданном документе, а также наборы для культивирования этих различных ЭС клеток. Например, как описано выше, в специфических вариантах реализации изобретения различные крысиные ЭС клетки, представленные в данном документе, имеют одну или больше следующих характеристик: (1) при культивации in vitro свободно прикрепляются к фидернему клеточному слою; (2) при культивации in vitro они образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro; (3) они поддерживают плюрипотентность при культивации in vitro в условиях, включающих фидерный клеточный слой, который не является генетически модифицированным для экспрессии фактора ингибирования лейкемии (LIF), причем культуральная среда содержит достаточную концентрацию LIF; и/или (4) они способны к субкультивированию и поддержанию недифференцированного состояния. Более того, популяции крысиных ЭС клеток в любой их этих in vitro культур могут содержать, например, популяцию клеток, в которой по меньшей мере 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% клеток в популяции являются эуплоидными, диплоидными и/или имеют 42 хромосомы.Additionally provided herein are in vitro cultures containing the various rat ES cells, cell populations and cell lines described herein, as well as kits for culturing these various ES cells. For example, as described above, in specific embodiments of the invention, various rat ES cells provided herein have one or more of the following characteristics: (1) when cultured in vitro, freely attach to the feeder cell layer; (2) when cultivated in vitro, they form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro; (3) they maintain pluripotency when cultured in vitro under conditions that include a feeder cell layer that is not genetically modified to express leukemia inhibitory factor (LIF), and the culture medium contains a sufficient concentration of LIF; and/or (4) they are capable of subculturing and maintaining an undifferentiated state. Moreover, populations of rat ES cells in any of these in vitro cultures may contain, for example, a population of cells in which at least 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% of the cells in the population are euploid, diploid and/or have 42 chromosomes.
Один способ культивирования крысиных эмбриональных стволовых клеток in vitro включает (а) предоставление культуры in vitro, содержащей фидерный клеточный слой, в популяцию выделенных крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток; и (b) культивирование in vitro в условиях, достаточных для поддержания плюрипотентности и/или тотипотентности выделенной крысиной эмбриональной стволовой (ЭС) клетки, причем крысиные ЭС клетки образуют колонии, свободно прикрепляющиеся к фидернему клеточному слою. «Свободное прикрепление» или «прикрепляются свободно» означает, что если чашку с культурой оставить в покое на какое-то время (минимум 8 часов), некоторые колонии будут прикрепляться к фидернему слою таким образом, что они могут сохранять прикрепление при осторожном перемещении чашки для культивирования. В более мелких лунках (в которых среда перемещается меньше) свободное прикрепление происходит чаще. В любом случае, эти колонии могут быть смещены либо путем а) создания завихрения в чаше для культивирования, либо посредством осторожного отбора пипеткой среды по всей поверхности фидерного слоя. Морфология этих свободно прикрепленных колоний по-прежнему остается сферической. В таких случаях крысиные ЭС клетки образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro. Такие сфероподобные колонии показаны, например, на Фигуре 1.One method for in vitro culturing rat embryonic stem cells comprises (a) providing an in vitro culture containing a feeder cell layer to a population of isolated rat embryonic stem (ES) cells; and (b) culturing in vitro under conditions sufficient to maintain the pluripotency and/or totipotency of the isolated rat embryonic stem (ES) cell, wherein the rat ES cells form colonies that freely adhere to the feeder cell layer. “Loose attachment” or “attach loosely” means that if the culture dish is left alone for a period of time (
iv. Наборы и культуры in vitroiv. Kits and in vitro cultures
Крысиные ЭС клетки и линии крысиных ЭС клеток, предложенных в настоящем документе, могут содержаться в наборе или в изделии. В специфических вариантах реализации изобретения набор или изделие содержит любую из линий или популяций крысиных ЭС клеток, описанных в данном документе. Набор может дополнительно содержать любую культуральную среду, поддерживающую крысиную ЭС клетку, включая среду, поддерживающую плюрипотентность крысиных ЭС клеток. Такая среда может представлять собой культуральную среду, содержащую мышиный LIF либо его активный вариант или фрагмент, как более подробно описано в других разделах данного документа. Среда в наборе может дополнительно содержать ингибитор MEK и ингибитор GSK-3, или, в альтернативном варианте, среда в наборе может дополнительно содержать комбинацию ингибиторов, состоящую из ингибитора MEK и ингибитора GSK-3. В специфических вариантах реализации изобретения среда в наборе содержит ингибитор MEK, представляющий собой PD0325901, и/или ингибитор GSK-3, представляющий собой CHIR99021. Любая из различных сред, описанных в данном документе, может содержаться в наборе.The rat ES cells and rat ES cell lines provided herein may be contained in a kit or product. In specific embodiments of the invention, the kit or product contains any of the rat ES cell lines or populations described herein. The kit may further comprise any culture medium supporting the rat ES cell, including medium supporting the pluripotency of rat ES cells. Such a medium may be a culture medium containing mouse LIF or an active variant or fragment thereof, as described in more detail elsewhere in this document. The media in the kit may further comprise a MEK inhibitor and a GSK-3 inhibitor, or alternatively, the media in the kit may further contain an inhibitor combination consisting of a MEK inhibitor and a GSK-3 inhibitor. In specific embodiments, the medium in the kit contains a MEK inhibitor, which is PD0325901, and/or a GSK-3 inhibitor, which is CHIR99021. Any of the various environments described in this document may be contained in a kit.
Дополнительно предложены набор или изделие, содержащее любую из линий или популяций крысиных ЭС клеток, описанных в данном документе, любую из различных сред, описанных в данном документе, и популяцию питающих клеток. В одном варианте реализации изобретения питающие клетки в наборе или изделии не являются генетически модифицированными для экспрессии LIF и/или питающие клетки содержат митотически инактивированные мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ). Любые питающие клетки, описанные в данном документе, могут использоваться в наборе или в изделии.Additionally, a kit or article of manufacture is provided that contains any of the rat ES cell lines or populations described herein, any of the various media described herein, and a population of nurse cells. In one embodiment, the feeder cells in the kit or article are not genetically modified to express LIF and/or the feeder cells contain mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Any feeder cells described herein may be used in a kit or article.
IV. Генетическая модификация крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клетокIV. Genetic modification of rat embryonic stem (ES) cells
Различные крысиные ЭС клетки и клеточные линии, описанные в данном документе, могут быть модифицированы и могут содержать по меньшей мере одну целевую генетическую модификацию. Таким образом, предлагаются различные способы генетической модификации выделенных крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, описанных в данном документе. Способ включает введение в геном выделенной крысиной ЭС клетки, описанной в данном документе, целевой генетической модификации для получения генетически модифицированной крысиной ЭС клетки. Целевая генетическая модификация может представлять собой любую модификацию в геноме крысиной ЭС, включая, например, инсерцию, делецию, нокаут, нокин, мутацию или их комбинацию. В одном варианте реализации изобретения целевая генетическая модификация представляет собой инсерцию гетерологичного полинуклеотида в геном крысиной ЭС клетки. В данном документе термин «гетерологичный» со ссылкой на последовательность означает последовательность, которая происходит из чужеродных видов, или, если она происходит из того же вида, является существенно модифицированной по сравнению с нативной формой в композиции и/или геномном локусе посредством преднамеренного вмешательства человека.The various rat ES cells and cell lines described herein may be modified and may contain at least one targeted genetic modification. Thus, various methods for genetically modifying the isolated rat embryonic stem (ES) cells described herein are provided. The method includes introducing into the genome of the isolated rat ES cell described herein a targeted genetic modification to produce a genetically modified rat ES cell. The targeted genetic modification can be any modification in the rat ES genome, including, for example, an insertion, deletion, knockout, knockin, mutation, or a combination thereof. In one embodiment, the targeted genetic modification is the insertion of a heterologous polynucleotide into the rat ES cell genome. As used herein, the term "heterologous" with reference to a sequence means a sequence that is derived from an alien species, or, if derived from the same species, is substantially modified from its native form in a composition and/or genomic locus by intentional human intervention.
В одном аспекте предлагается выделенная крысиная ЭС клетка или линия крысиных ЭС клеток, которая способна поддерживать плюрипотентность после одной или большего количества генетических модификаций in vitro и которая способна передавать генетически модифицированный геном зародышевой линии поколению F1. Таким образом, крысиная ЭС клетка сохраняет свою плюрипотентность, чтобы развиться во множество типов клеток после одной или больше серийных генетических модификаций in vitro (например, двух, трех, четырех, пяти, шести или больше серийных генетических модификаций). В других вариантах реализации изобретения выполняют множество целевых генетических модификаций в данной крысиной ЭС клетке, включая, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15 или больше. Таким образом, в геном также можно интегрировать множество гетерологичных полинуклеотидов, включая, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15 или больше.In one aspect, an isolated rat ES cell or rat ES cell line is provided that is capable of maintaining pluripotency after one or more in vitro genetic modifications and that is capable of passing the genetically modified germline genome to the F1 generation. Thus, the rat ES cell retains its pluripotency to develop into multiple cell types after one or more serial genetic modifications in vitro (eg two, three, four, five, six or more serial genetic modifications). In other embodiments, a plurality of targeted genetic modifications are made in a given rat ES cell, including, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or more. Thus, a variety of heterologous polynucleotides can also be integrated into the genome, including, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15 or more.
В одном варианте реализации изобретения после любой из от одной до 15 серийных генетических модификаций генетически модифицированные крысиные ЭС клетки при воздействии среды для дифференциации способны дифференцироваться во множество типов клеток. В одном варианте реализации изобретения после любой из от одной до 15 серийных генетических модификаций генетически модифицированные крысиные ЭС клетки способны сохраняться в культуре в недифференцированном состоянии. В одном варианте реализации изобретения генетически модифицированные и культивированные крысиные ЭС клетки в недифференцированном состоянии, при использовании в качестве донорских клеток в крысином эмбрионе-хозяине, заселяют эмбрион и образуют бластоцисту, содержащую от одной до пятнадцати генетических модификаций. В одном варианте реализации изобретения при имплантации бластоцисты суррогатной матери в условиях, подходящих для развития беременности, она развивается в потомство F0 крыс, которое содержит от одной до 15 генетических модификаций.In one embodiment of the invention, after any one to 15 serial genetic modifications, the genetically modified rat ES cells, when exposed to a differentiation medium, are capable of differentiating into a plurality of cell types. In one embodiment of the invention, after any of one to 15 serial genetic modifications, genetically modified rat ES cells are able to remain in culture in an undifferentiated state. In one embodiment of the invention, genetically modified and cultured rat ES cells in an undifferentiated state, when used as donor cells in a rat embryo host, colonize the embryo and form a blastocyst containing one to fifteen genetic modifications. In one embodiment of the invention, when a surrogate mother's blastocyst is implanted under conditions suitable for the development of pregnancy, it develops into offspring of F0 rats that contain from one to 15 genetic modifications.
Можно использовать различные способы создания целевых генетических модификаций в геноме крысиной ЭС клетки. Например, в одном случае для целевой генетической модификации используется система, которая будет создавать целевую генетическую модификацию посредством события гомологичной рекомбинации. В других случаях крысиные ЭС клетки могут быть модифицированы с использованием нуклеазных агентов, которые создают разрыв одиночной или двойной цепи в целевом участке генома. Одно- или двухцепочечный разрыв затем восстанавливается по пути негомологичного соединения концов (NHEJ). Такие системы находят применение, например, в создании целевой потери функциональных генетических модификаций. См., например, публикацию Tesson et al. (2011) Nature Biotechnology 29:695-696, включенную в данный документ посредством ссылки. Такие агенты включают эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN) (WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas. 1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; и Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148; заявки на патент №№2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1 и 2006/0063231 A1 (включены в данный документ посредством ссылки); нуклеазу белкового домена «цинковые пальцы» (ZFN) (US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; и WO/2011/017293А2, которые включены в данный документ посредством ссылки); мегануклеазу (см., Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et at, (2002)Mol Cell 10:895-905; Gimble et al, (2003)Mol Biol 334:993-1008; Seligman et al, (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al, (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al, (2006) Nucleic AcidsRes 34:4791-800; Chames et al, (2005) Nucleic Acids Res 33:el78; Smith et al, (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al, (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:el54; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; и WO2004031346); и систему CAS/CRISPER (Mali P et al. (2013) Science 2013 Feb 15;339(6121):823-6; Jinek M et al. Science 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol 2013 Mar; 31(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol 2013 Mar; 31(3):233-9; и Cong L et al. Science 2013 Feb 15; 339(6121):819-23, которые включены в данный документ посредствос ссылки).Various methods can be used to create targeted genetic modifications in the rat ES cell genome. For example, in one instance, a system is used for targeted genetic modification that will generate the targeted genetic modification via a homologous recombination event. In other cases, rat ES cells can be modified using nuclease agents that create a single or double strand break at a target genome site. The single or double strand break is then repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway. Such systems find use, for example, in generating targeted loss of functional genetic modifications. See, for example, Tesson et al. (2011) Nature Biotechnology 29:695-696, incorporated herein by reference. Such agents include effector nucleases like transcription activators (TALEN) (WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas. 1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761, Li et al (2010) Nuc Acids Res (2010) doi:10.1093/nar/gkq704, and Miller et al (2011) Nature Biotechnology 29:143-148; Patent No. 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1 and 2006/0063231 A1 (included in the herein by reference); zinc finger domain nuclease (ZFN) (US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; and WO/20133)19 ; meganuclease (see, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et at, (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al, (2003) Mol Biol 334:993 -1008 Seligman et al, (20 02) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al, (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al, (2006) Nucleic AcidsRes 34:4791-800; Chames et al, (2005) Nucleic Acids Res 33:el78; Smith et al, (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al, (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:el54; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; and WO2004031346); and CAS/CRISPER system (Mali P et al. (2013) Science 2013 Feb 15;339(6121):823-6; Jinek M et al. Science 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol 2013 Mar;31(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol 2013 Mar; 31(3):233-9; and Cong L et al. Science 2013 Feb 15;339(6121) :819-23, which are incorporated herein by reference).
В других вариантах реализации настоящего изобретения целевую геномную модификацию можно выполнить с использованием нацеленного вектора гомологичной рекомбинации. В таких случаях нацеленный вектор содержит вставку полинуклеотида и дополнительно содержит расположенные выше и ниже группы гомологии, которые фланкируют вставку полинуклеотида. Группы гомологии, которые фланкируют вставку полинуклеотида, соответствуют областям генома в целевом геномном локусе. Для удобства, соответствующие геномные области в пределах целевого геномного локуса называют в данном описании «сайтами-мишенями». Таким образом, в одном примере, нацеленный вектор может содержать первую вставку полинуклеотида, которую фланкируют первая и вторая группы гомологии, соответствующие первому и второму сайтам-мишеням, расположенным в целевом геномном локусе. Нацеленный вектор, таким образом, помогает в интеграции вставки полинуклеотида в целевой геномный локус посредством события гомологичной рекомбинации, которое происходит между группами гомологии и соответствующими сайтами-мишенями в геноме клетки.In other embodiments of the present invention, targeted genomic modification can be performed using a targeted homologous recombination vector. In such cases, the targeted vector contains a polynucleotide insert and further contains upstream and downstream homology groups that flank the polynucleotide insert. The homology groups that flank the polynucleotide insert correspond to regions of the genome at the target genomic locus. For convenience, the corresponding genomic regions within a target genomic locus are referred to herein as "target sites". Thus, in one example, the targeted vector may comprise a first polynucleotide insert flanked by first and second homology groups corresponding to the first and second target sites located at the target genomic locus. The targeted vector thus assists in integrating the polynucleotide insert into the target genomic locus via a homologous recombination event that occurs between homology groups and corresponding target sites in the cell's genome.
В данном документе термины группа гомологии и сайт-мишень «соответствуют» друг другу или являются «соответствующими», когда две области разделяют достаточный уровень идентичности последовательности друг с другом, чтобы действовать в качестве субстратов для реакции гомологичной рекомбинации. Термин «гомологии» означает ДНК-последовательности, которые являются идентичными или разделяют идентичность последовательности с соответствующей последовательностью. Идентичность последовательности между данным сайтом-мишенью и соответствующей группой гомологии, имеющихся на нацеленном векторе, может представлять собой любую степень идентичности последовательностей, которая позволяет произойти гомологичной рекомбинации. Например, величина идентичности последовательности, разделяемой группой гомологии нацеленного вектора (или его фрагмента) и сайтом-мишенью (или его фрагментом), может составлять по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% идентичности последовательности, таким образом, что последовательности подвергаются гомологичной рекомбинации. Более того, соответствующая область гомологии между группой гомологии и соответствующим сайтом-мишенью может быть любой длины, достаточной для содействия гомологичной рекомбинации в отщепленном сайте распознавания.As used herein, the terms homology group and target site "match" each other, or are "matched" when two regions share a sufficient level of sequence identity with each other to act as substrates for a homologous recombination reaction. The term "homologies" means DNA sequences that are identical or share sequence identity with the corresponding sequence. Sequence identity between a given target site and the corresponding homology group present on the targeted vector can be any degree of sequence identity that allows homologous recombination to occur. For example, the amount of sequence identity shared by the homology group of the targeted vector (or fragment thereof) and the target site (or fragment thereof) may be at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% or 100% sequence identity such that the sequences undergo homologous recombination. Moreover, the corresponding region of homology between the homology group and the corresponding target site may be of any length sufficient to promote homologous recombination at the cleaved recognition site.
В специфических вариантах реализации изобретения выделенная крысиная ЭС клетка, линия клеток или популяция клеток демонстрируют эффективность гомологичной рекомбинации, составляющую по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 80%. В одном варианте реализации изобретения эффективность гомологичной рекомбинации при использовании крысиной ЭС клетки составляет больше 4%.In specific embodiments, the isolated rat ES cell, cell line, or cell population exhibits a homologous recombination efficiency of at least 2%, at least 3%, at least 4%, at least 5%, at least 6% , at least 7%, at least 8%, at least 9%, at least 10%, at least 11%, at least 12%, at least 13%, at least 14%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, or at least 80%. In one embodiment of the invention, the efficiency of homologous recombination using rat ES cells is greater than 4%.
В специфических вариантах реализации изобретения при создании целевой генетической модификации в крысиной ЭС клетке используют селективный маркер. Полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, может присутствовать в нацеленном векторе, предназначенном для введения целевой генетической модификации в геном, либо он может быть на отдельной плазмиде или векторе. Полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, может содержаться в кассете экспрессии. Различные компоненты такой кассеты экспрессии более подробно описаны в других разделах данного документа.In specific embodiments of the invention, a selectable marker is used to create a targeted genetic modification in a rat ES cell. The polynucleotide encoding the selectable marker may be present in a targeted vector designed to introduce the targeted genetic modification into the genome, or it may be on a separate plasmid or vector. A polynucleotide encoding a selectable marker may be contained in an expression cassette. The various components of such an expression cassette are described in more detail elsewhere in this document.
Различные селективные маркеры могут быть использованы в способах и композициях, описанных в настоящем документе. Такие селективные маркеры могут, например, придавать устойчивость к антибиотику, такому как G418, гигромицину, бластоцидину, пуромицину или неомицину. Такие селективные маркеры включают неомицинфосфотрансферазу (neor), гигромицин-В фосфотрансферазу (hygf), пуромицин N-ацетилтрансферазу и бластицидин S дезаминазу (bsrr). В других вариантах реализации изобретения селективный маркер функционально связан с индуцибельным промотором и экспрессия селективного маркера токсична для клетки. Неограничивающие примеры таких селективных маркеров включают ксантин/гуанин фосфорибозилтрансферазу (gpt), гагипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазу (HGPRT) или тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK). См., например, публикации Santerre et al. (1984) Gene 30:147-56; Joyner (1999) The Practical Approach Series, 293; Santerre et al. (1984) Gene 30:147-56; Bernard et al. (1985) Exp Cell Res 158:237-43; Giordano and McAllister (1990) Gene, 88:285-8; Izumi et al. (1991) Sep Cell Res 197:229-33), которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В специфических вариантах реализации изобретения селективный маркер neoR представляет собой ген неомицинфосфотрансферазы (пео), описанный в публикации Beck et al. (1982) Gene, 19:327-36, которая включена в данный документ посредством ссылки. Селективный маркер neoR представляет собой тот, что использовался в патентах США №7205148 или 6596541, которые включены в данный документ посредством ссылки.Various selectable markers can be used in the methods and compositions described herein. Such selectable markers may, for example, confer resistance to an antibiotic such as G418, hygromycin, blastocidin, puromycin or neomycin. Such selectable markers include neomycin phosphotransferase (neo r ), hygromycin-B phosphotransferase (hyg f ), puromycin N-acetyltransferase, and blasticidin S deaminase (bsr r ). In other embodiments, the selectable marker is operably linked to an inducible promoter and expression of the selectable marker is toxic to the cell. Non-limiting examples of such selectable markers include xanthine/guanine phosphoribosyltransferase (gpt), hahypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT), or herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK). See, for example, Santerre et al. (1984) Gene 30:147-56; Joyner (1999) The Practical Approach Series, 293; Santerre et al. (1984) Gene 30:147-56; Bernard et al. (1985) Exp Cell Res 158:237-43; Giordano and McAllister (1990) Gene 88:285-8; Izumi et al. (1991) Sep Cell Res 197:229-33), which are incorporated herein in their entirety by reference. In specific embodiments, the neoR selectable marker is the neomycin phosphotransferase (peo) gene described in Beck et al. (1982) Gene, 19:327-36, which is incorporated herein by reference. The neoR selectable marker is that used in US Pat. Nos. 7,205,148 or 6,596,541, which are incorporated herein by reference.
В специфических вариантах реализации изобретения используемый селективный маркер представляет собой неослабленный селективный маркер. «Неослабленный селективный маркер» представляет собой селективный маркер, который сохраняет активность нативного полипептида, или селективный маркер имеет повышенную активность по сравнению с нативной формой полипептида. Повышенная активность селективного маркера может представлять собой любое статистически значимое повышение активности, включая, например, повышение по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80% или выше. Таким образом, экспрессия неослабленного селективного маркера в клетке-хозяине обеспечит более высокий процент клеток-хозяев, выживающих в присутствии более высокой концентрации селективного агента, чем при использовании ослабленного селективного маркера. Неослабленные селективные маркеры включают, например, неомициновый неослабленный селективный маркер. См., например, публикацию Beck et al. (1982) Gene, 19:327-36 либо патент США №7205148 или 6596541, которые включены в данный документ посредством ссылки.In specific embodiments of the invention, the selection marker used is an unattenuated selection marker. A "non-attenuated selectable marker" is a selectable marker that retains the activity of the native polypeptide, or the selectable marker has increased activity compared to the native form of the polypeptide. An increased activity of a selectable marker can be any statistically significant increase in activity, including, for example, an increase of at least 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80% or greater. Thus, expression of an unattenuated selection marker in a host cell will provide a higher percentage of host cells surviving in the presence of a higher concentration of the selection agent than when using an attenuated selection marker. Non-attenuated selectable markers include, for example, neomycin non-attenuated selective marker. See, for example, Beck et al. (1982) Gene, 19:327-36 or US Pat. No. 7,205,148 or 6,596,541, which are incorporated herein by reference.
В других случаях повышенная активность селективного маркера по сравнению с ослабленным селективным маркером и/или селективным маркером дикого типа (нативным) может быть результатом увеличения количества копий какого-либо из неослабленного, ослабленного или интактного селективного маркера в геноме крысиной ЭС клетки. Таким образом, данная крысиная ЭС клетка может содержать в своем геноме по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше копий данного селективного маркера (т.е. неослабленного селективного маркера, ослабленного селективного маркера или нативного (дикого типа) селективного маркера).In other cases, the increased activity of the selectable marker compared to the attenuated selectable marker and/or the wild-type (native) selectable marker may be the result of an increase in the copy number of any of the unattenuated, attenuated or intact selectable marker in the genome of the rat ES cell. Thus, a given rat ES cell may contain in its genome at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more copies of a given selection marker (i.e., an unattenuated selection marker, attenuated selectable marker or native (wild type) selectable marker).
Различные используемые селективные маркеры кодируются полинуклеотидом, функционально связанным с промотором, активным в крысиной ЭС клетке. В специфических вариантах реализации изобретения повышенная активность селективного маркера может быть результатом увеличения экспрессии селективного маркера. Таким образом, для повышения уровней экспрессии данного селективного маркера может быть использован промотор. Промоторы, представляющие интерес, включают, но не ограничиваются ими, промотор CMV, промотор PGK и промотор CAG. В одном варианте реализации изобретения для экспрессии селективного маркера используют промотор убиквитина (hUb) человека. См. публикацию Valenzuela et al. (2003) Nature Biotechnology 21:652-659, включенную в данный документ в полном объеме посредством ссылки.The various selectable markers used are encoded by a polynucleotide operably linked to a promoter active in the rat ES cell. In specific embodiments of the invention, increased selective marker activity may be the result of increased expression of the selectable marker. Thus, a promoter can be used to increase expression levels of a given selectable marker. Promoters of interest include, but are not limited to, the CMV promoter, the PGK promoter, and the CAG promoter. In one embodiment, the human ubiquitin promoter (hUb) is used to express the selectable marker. See Valenzuela et al. (2003) Nature Biotechnology 21:652-659, incorporated herein in its entirety by reference.
В одном варианте реализации изобретения крысиная ЭС клетка сохраняет свою плюрипотентность для развития во множество типов клеток после одного цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой. В другом варианте реализации изобретения крысиная ЭС клетка сохраняет свою плюрипотентность для развития во множество типов клеток после второго цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после третьего цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после четвертого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после пятого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после шестого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после седьмого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после восьмого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после девятого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после десятого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после одиннадцатого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после двенадцатого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после тринадцатого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой, после четырнадцатого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой и/или после пятнадцатого цикла электропорации с экзогенной нуклеиновой кислотой. В других вариантах реализации изобретения крысиная ЭС клетка способна к передаче целевой генетической модификации потомству после очередного цикла электропорации (т.е. по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше раундов электропорации).In one embodiment, the rat ES cell retains its pluripotency for development into multiple cell types after a single cycle of electroporation with exogenous nucleic acid. In another embodiment, the rat ES cell retains its pluripotency for development into multiple cell types after the second cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the third cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the fourth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the fifth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the fifth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid nucleic acid, after the sixth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the seventh cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the eighth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the ninth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the tenth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the eleventh cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the twelfth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after the thirteenth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid, after fourteenth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid and/or after the fifteenth cycle of electroporation with exogenous nucleic acid. In other embodiments of the invention, the rat ES cell is capable of transferring the targeted genetic modification to the offspring after the next cycle of electroporation (i.e., at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more rounds of electroporation ).
i. Введение последовательностей в крысиную эмбриональную стволовую клеткуi. Introduction of sequences into a rat embryonic stem cell
Способы, представленные в настоящем документе, включают введение в клетку одной или больше полинуклеотидных или полипептидных конструкций, содержащих различные композиции, необходимые для выполнения целевой геномной модификации. «Введение» означает предоставление в клетку последовательности (полипептидной или полинуклеотидной) таким образом, что последовательность получает доступ к внутренней части клетки. Способы, представленные в данном документе, не зависят от конкретного способа введения любого компонента системы целевой геномной интеграции в клетку, а только от того, получил ли полинуклеотид доступ к внутренней части по меньшей мере одной клетки. Способы введения полинуклеотидов в различные типы клеток известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, способы стабильной трансфекции, способы временной трансфекции и вирус-опосредованные способы. Такие способы включают, но не ограничивается ими, электропорацию, внутрицитоплазматическую инъекцию, инфицирование вирусом (включая аденовирусные, лентивирусные и ретровирусные векторы), трансфекцию, опосредованную липидами трансфекцию и/или Nucleofaction™. См., например, публикацию Stadtfeld et al. (2009) Nature Methods 6(5):329-330; Yusaef al. (2009) Nat. Methods 6:363-369; Woltjen et al. (2009) Nature 458, 766-770. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, прямую доставку ДНК, например путем ex vivo трансфекции (Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), необязательно с Fugene6 (Roche) илилипофектамином (Invitrogen), посредством инъекции (патенты США №№5994624, 5981274, 5945100, 5780448, 5736524, 5702932, 5656610, 5589466 и 5580859, включены в данный документ посредством ссылки), включая микроинъекцию (Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; патент США No. 5789215, включенные в настоящий документ путем ссылки); посредством электропорации (патент США №5384253, включенный в данный документ посредством ссылки; Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984); посредством преципитации фосфатом кальция (Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990); с использованием DEAE-декстрана, a потом полиэтиленгликоля (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); посредством прямой ультразвуковой загрузки (Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); посредством трансфекции, опосредованной липосомами (Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991) и с помощью трансфекции, опосредованной рецепторами (Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); и при помощи комбинации таких способов, которые включены в данный документ посредством ссылки.The methods provided herein include introducing into a cell one or more polynucleotide or polypeptide constructs containing various compositions necessary to perform targeted genomic modification. "Introducing" means providing a sequence (polypeptide or polynucleotide) into a cell in such a way that the sequence gains access to the interior of the cell. The methods provided herein are independent of the particular manner in which any component of the targeted genomic integration system is introduced into the cell, but only whether the polynucleotide has gained access to the interior of at least one cell. Methods for introducing polynucleotides into various cell types are known in the art and include, but are not limited to, stable transfection methods, transient transfection methods, and virus-mediated methods. Such methods include, but are not limited to, electroporation, intracytoplasmic injection, virus infection (including adenoviral, lentiviral, and retroviral vectors), transfection, lipid-mediated transfection, and/or Nucleofaction™. See, for example, Stadtfeld et al. (2009) Nature Methods 6(5):329-330; Yusaef al. (2009) Nat. Methods 6:363-369; Woltjen et al. (2009) Nature 458, 766-770. Such methods include, but are not limited to, direct DNA delivery, for example by ex vivo transfection (Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), optionally with Fugene6 (Roche) or lipofectamine (Invitrogen), by injection (US Pat. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; US Pat. No. 5,789,215 incorporated herein by reference); by electroporation (U.S. Pat. No. 5,384,253 incorporated herein by reference; Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984); by calcium phosphate precipitation (Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990); using DEAE-dextran followed by polyethylene glycol (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); via direct ultrasonic loading (Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); via liposome mediated transfection (Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991) and by receptor-mediated transfection (Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429- 4432, 1987); and using a combination of such methods, which are incorporated herein by reference.
В некоторых вариантах реализации изобретения клетки, используемые в способах и композициях, содержат конструкцию ДНК, стабильно включенную в их геном. Термин «стабильно включенная» или «стабильно введенная» означает введение полинуклеотида в клетку таким образом, что нуклеотидная последовательность интегрируется в геном клетки и может быть унаследована потомством клетки. Для стабильного включения конструкций ДНК или различных компонентов, используемых для создания целевой геномной модификации, может быть использован любой протокол.In some embodiments, the cells used in the methods and compositions contain a DNA construct stably incorporated into their genome. The term "stably included" or "stably introduced" means the introduction of a polynucleotide into a cell in such a way that the nucleotide sequence is integrated into the genome of the cell and can be inherited by the progeny of the cell. Any protocol can be used to stably incorporate the DNA constructs or various components used to generate the targeted genomic modification.
Протоколы трансфекции, а также протоколы для введения полипептидных или полинуклеотидных последовательностей в клетки могут изменяться. Неограничивающие способы трансфекции включают химические способы трансфекции, которые включают использование липосом; наночастиц; фосфата кальция (Graham et al. (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 и Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company, pp. 96-97); дендримеров; или катионных полимеров, таких как DEAE-декстран или полиэтиленамин. Нехимические способы включают электропорацию; сонопорацию и оптическую трансфекцию. Трансфекция частицами включает использование генной пушки, магнитную трансфекцию (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). Для трансфекции также можно использовать вирусные способы.Transfection protocols, as well as protocols for introducing polypeptide or polynucleotide sequences into cells, may vary. Non-limiting methods of transfection include chemical methods of transfection, which include the use of liposomes; nanoparticles; calcium phosphate (Graham et al. (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 and Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual, New York: W. H. Freeman and Company, pp. 96-97); dendrimers; or cationic polymers such as DEAE-dextran or polyethyleneamine. Non-chemical methods include electroporation; sonoporation and optical transfection. Particle transfection includes the use of a gene gun, magnetic transfection (Bertram, J. (2006)
Неограничивающий пример способа введения гетерологичного полинуклеотида в крысиную ЭС клетку описан ниже. Крысиные ЭС клетки, описанные в данном документе, пересевают в течение от около 24 до около 48 часов до электропорации. Примерно за 24 часа до электропорации среду меняют на RVG2i+ROCKi (10 мкМ Y-27632). Крысиные ЭС клетки обрабатывают трипсином и крысиные ЭС клетки изолируют. Крысиные ЭС клетки суспендируют до достижения конечной концентрации клеток от около 2×10^6 до около 10×10^6 клеток на 75 мкл. Около 75Я, крысиных ЭС клеток добавляют к около 50А, ДНК, содержащей гетерологичный полинуклеотид, и добавляют около 125Х, буфера ЕР. В одном неограничивающем варианте реализации изобретения электропорацию осуществляют со следующими параметрами: 400 В; 400 В; Q; 100 мкФ. Затем клетки культивируют в RVG2i и 10 мкМ ROCKi, и их можно переносить на питающие клетки.A non-limiting example of a method for introducing a heterologous polynucleotide into a rat ES cell is described below. The rat ES cells described herein are subcultured for about 24 to about 48 hours prior to electroporation. Approximately 24 hours before electroporation, the medium is changed to RVG2i+ROCKi (10 μM Y-27632). Rat ES cells are trypsinized and rat ES cells are isolated. Rat ES cells are suspended to achieve a final cell concentration of about 2×10^6 to about 10×10^6 cells per 75 μl. About 75X rat ES cells are added to about 50A DNA containing the heterologous polynucleotide and about 125X EP buffer is added. In one non-limiting embodiment of the invention, electroporation is carried out with the following parameters: 400 V; 400 V; Q; 100 uF. Cells are then cultured in RVG2i and 10 μM ROCKi and can be transferred to feeder cells.
ii. Отбор крысиных эмбриональных стволовых клеток, имеющих целевую геномную модификациюii. Selection of Rat Embryonic Stem Cells Having a Targeted Genomic Modification
Предлагаются различные способы отбора и поддержания крысиных ЭС клеток, имеющих стабильно включенную в их геном целевую генетическую модификацию. В одном неограничивающем примере при введении гетерологичного полинуклеотида в крысиную ЭС клетку способ может включать (а) предоставление in vitro популяции крысиных ЭС клеток; (b) введение по меньшей мере в одну крысиную ЭС клетку гетерологичного полинуклеотида, содержащего селективный маркер, функционально связанный с промотором, активным в крысиной ЭС клетке; и (с) культивирование in vitro популяции крысиных ЭС клеток попеременно в первой и второй культуральной среде, причем первая культуральная среда содержит эффективное количество селективного агента в течение первого периода времени, а вторая культуральная среда не содержит селективного агента, причем условия культивирования in vitro сохраняют плюрипотентность или тотипотентность; и тем самым обеспечивают отбор крысиных ЭС клеток, имеющих стабильно включенный в их геном гетерологичный полинуклеотид. В различных способах, посредством которых в данной популяции можно произвести отбор крысиной ЭС клетки, имеющей целевую генетическую модификацию, можно использовать систему культивирования in vitro, которая позволяет крысиным ЭС клеткам сохранять плюрипотентность. Таким образом, можно использовать любые культуральные среды in vitro и питающие клетки, описанные в данном документе.Various methods are proposed for selecting and maintaining rat ES cells that have a targeted genetic modification stably included in their genome. In one non-limiting example, when introducing a heterologous polynucleotide into a rat ES cell, the method may include (a) providing an in vitro population of rat ES cells; (b) introducing into at least one rat ES cell a heterologous polynucleotide containing a selectable marker operably linked to a promoter active in the rat ES cell; and (c) culturing in vitro a population of rat ES cells alternately in a first and a second culture medium, wherein the first culture medium contains an effective amount of a selective agent for a first period of time and the second culture medium does not contain a selective agent, wherein the in vitro culture conditions retain pluripotency. or totipotency; and thereby ensure the selection of rat ES cells having a heterologous polynucleotide stably included in their genome. Various methods by which a rat ES cell having a target genetic modification can be selected from a given population can use an in vitro culture system that allows the rat ES cells to retain pluripotency. Thus, any in vitro culture media and nurse cells described herein can be used.
В специфических вариантах реализации изобретения чередование первой и второй культуральной среды проводят каждые 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 часов или больше. В специфическом варианте реализации изобретения чередование первой и второй культуральной среды проводят каждые 24 часа.In specific embodiments of the invention, the alternation of the first and second culture medium is carried out every 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 hours or more. In a specific embodiment of the invention, the alternation of the first and second culture medium is carried out every 24 hours.
Можно использовать любой подходящий селективный маркер, и соответствующий селективный агент будет присутствовать в культуральной среде в эффективной концентрации. Такие селективные маркеры включают любой из нативного, ослабленного или неослабленного селективных маркеров, описанных в данном документе. В одном варианте реализации изобретения используемый селективный маркер придает устойчивость к антибиотику, включая, например, G418. Неограничивающие примеры селективных маркеров включают неомицинфосфотрансферазу II (nptII) или гигромицин фосфотрансферазу (hpt).Any suitable selectable marker may be used and the appropriate selective agent will be present in the culture medium at an effective concentration. Such selectable markers include any of the native, attenuated or non-attenuated selective markers described herein. In one embodiment, the selectable marker used confers resistance to an antibiotic, including, for example, G418. Non-limiting examples of selectable markers include neomycin phosphotransferase II (nptII) or hygromycin phosphotransferase (hpt).
Концентрация селективного агента является такой, которая позволяет произвести отбор крысиной ЭС клетки, имеющей селективный маркер, при сохранении плюрипотентности крысиных ЭС клеток, присутствующих в культуре. При использовании, например, G418 концентрация G418 в среде для отбора может находиться в диапазоне от около 50 мкг/мл до около 125 мкг/мл, от около 60 мкг/мл до около 125 мкг/мл, от около 70 мкг/мл до около 125 мкг/мл, от около 80 мкг/мл до около 125 мкг/мл, от около 90 мкг/мл до около 125 мкг/мл, от около 100 мкг/мл до около 125 мкг/мл, от около 110 мкг/мл до около 125 мкг/мл, от около 80 мкг/мл до около 100 мкг/мл, от около 65 мкг/мл до около 85 мкг/мл, от около 70 мкг/мл до около 80 мкг/мл. В одном варианте реализации изобретения концентрация G418 в культуре составляет 75 мкг/мл.The concentration of the selective agent is such that it allows selection of the rat ES cell having the selectable marker while maintaining the pluripotency of the rat ES cells present in culture. When using, for example, G418, the concentration of G418 in the selection medium may range from about 50 μg/ml to about 125 μg/ml, from about 60 μg/ml to about 125 μg/ml, from about 70 μg/ml to about 125 µg/ml, about 80 µg/ml to about 125 µg/ml, about 90 µg/ml to about 125 µg/ml, about 100 µg/ml to about 125 µg/ml, from about 110 µg/ml up to about 125 µg/ml, from about 80 µg/ml to about 100 µg/ml, from about 65 µg/ml to about 85 µg/ml, from about 70 µg/ml to about 80 µg/ml. In one embodiment of the invention, the concentration of G418 in the culture is 75 μg/ml.
Среда, используемая в отборе, позволяет сохранять плюрипотентность крысиных эмбриональных стволовых клеток. Такие среды описаны подробно в других разделах настоящего документа.The medium used in the selection allows maintaining the pluripotency of rat embryonic stem cells. Such environments are described in detail elsewhere in this document.
Протокол отбора может быть инициирован в любое время после введения полинуклеотида, кодирующего селективный маркер, в геном крысиной ЭС клетки. В специфических вариантах реализации изобретения протокол отбора начинается через 10, 15, 20, 24, 30, 35, 40, 50, 60 или больше часов после введения селективного маркера в крысиную ЭС клетку. В одном варианте реализации изобретения протокол отбора начинается около через 2 дня после введения полинуклеотида, кодирующего селективный маркер.The selection protocol can be initiated at any time after the introduction of a polynucleotide encoding a selectable marker into the rat ES cell genome. In specific embodiments of the invention, the selection protocol begins 10, 15, 20, 24, 30, 35, 40, 50, 60 or more hours after injection of the selectable marker into the rat ES cell. In one embodiment of the invention, the selection protocol begins about 2 days after the introduction of a polynucleotide encoding a selectable marker.
Неограничивающий пример протокола отбора с использованием G418 является следующим. На день 2 (2-й день после введения полинуклеотида, кодирующего селективный маркер) популяция крысиных ЭС клеток представляет собой клетки, инкубированные в среде 2i с добавлением G418 в концентрации 75 мкг/мл. На день 3 популяция крысиных ЭС клеток представляет собой клетки, инкубированные в среде 2i без G418. На день 4 популяцию крысиных ЭС клеток инкубируют в среде 2i с добавлением G418 в концентрации 75 мкг/мл. Надень 5 популяция крысиных ЭС клеток представляет собой клетки, инкубированные в среде 2i без G418. На день 6 популяцию крысиных ЭС клеток инкубируют в среде 2i с добавлением G418 в концентрации 75 мкг/мл. На день 7 популяцию крысиных ЭС клеток инкубируют в среде 2i без G418. На день 8 популяцию крысиных ЭС клеток инкубируют в среде 2i без добавления G418 в концентрации 75 мкг/мл. На день 9 популяция крысиных ЭС клеток представляет собой клетки, инкубированные в среде 2i без G418. На день 10 популяция крысиных ЭС клеток представляет собой клетки, инкубированные в среде 2i с добавлением G418 в концентрации 75 мкг/мл. На день 11 популяция крысиных ЭС клеток представляет собой клетки, инкубированные в среде 2i без G418. На день 12 выбирают колонии для роста и скрининга.A non-limiting example of a selection protocol using G418 is as follows. On day 2 (day 2 after administration of the polynucleotide encoding the selectable marker), the rat ES cell population is cells incubated in medium 2i supplemented with G418 at a concentration of 75 μg/ml. On day 3, the rat ES cell population is cells incubated in medium 2i without G418. On
После отбора крысиных ЭС клеток, имеющих селективный маркер, можно увеличивать количество колоний. В специфических вариантах реализации изобретения период роста для увеличения их количества может составлять 1, 2, 3, 4, 5 или больше дней в условиях культивирования, которые поддерживают плюрипотентность клеток. В одном неограничивающем варианте реализации настоящего изобретения отобранные колонии растут в течение 3 дней. В дополнительном варианте реализации изобретения используемая среда представляет собой среду 2i. Каждый клон можно пересевать и выращивать дальше.After selection of rat ES cells having a selectable marker, the number of colonies can be increased. In specific embodiments of the invention, the growth period to increase their number may be 1, 2, 3, 4, 5 or more days under culture conditions that maintain cell pluripotency. In one non-limiting embodiment of the present invention, selected colonies grow within 3 days. In a further embodiment of the invention, the medium used is medium 2i. Each clone can be reseeded and grown further.
Крысиные ЭС клетки и линии клеток, имеющие одну или больше целевых генетических модификаций, могут иметь одно или более из следующих свойств:Rat ES cells and cell lines having one or more targeted genetic modifications may have one or more of the following properties:
(a) обладают компетентностью зародышевой линии после целевой генетической модификации, что означает, что при имплантации крысиной ЭС клетки в крысиный эмбрион-хозяин целевая генетическая модификация в геноме линии крысиных ЭС клеток передается потомству;(a) have germline competence after the targeted genetic modification, meaning that upon implantation of the rat ES cell into a rat host embryo, the targeted genetic modification in the genome of the rat ES cell line is passed on to offspring;
(b) обладают плюрипотентностью in vitro;(b) have in vitro pluripotency;
(c) обладают тотипотентностью in vitro;(c) are totipotent in vitro;
(d) при культивации in vitro свободно прикрепляются к фидернему клеточному слою;(d) when cultivated in vitro freely attached to the feeder cell layer;
(e) при культивации in vitro образуют сфероподобные колонии при посеве на фидерный клеточный слой in vitro;(e) when cultivated in vitro form spherical colonies when seeded on a feeder cell layer in vitro;
(f) сохраняют плюрипотентность при культивации in vitro в условиях, включающих фидерный клеточный слой, который не является генетически модифицированным для экспрессии фактора ингибирования лейкемии (LIF), причем культуральная среда содержит достаточную концентрацию LIF;(f) retain pluripotency when cultured in vitro under conditions including a feeder cell layer that is not genetically modified to express leukemia inhibitory factor (LIF), and the culture medium contains a sufficient concentration of LIF;
(g) сохраняют плюрипотентность при культивации in vitro в условиях, включающих фидерный клеточный слой, причем культуральная среда содержит мышиный LIF или его активный фрагмент;(g) retain pluripotency when cultured in vitro under conditions including a feeder cell layer, wherein the culture medium contains mouse LIF or an active fragment thereof;
(h) имеют молекулярную сигнатуру, которая характеризуется следующим:(h) have a molecular signature that is characterized by the following:
i) экспрессией одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, включая белок, связанный с адгезионными контактами (Ajapl), клаудин 5 (Cldn5), фактор 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимую протеинкиназу IV (Camk4), эфрин-А1 (Efhal), ЕРН рецептор А4 (Epha4), белок бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белок 1, подобный белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpll), интерлейкин 36 бета (Illf8), рецептор альфа интерлейкина 28 (Il128ra), фактор 1 детерминации асимметрии (Leftyl), альфа-рецептор фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептор 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейрональный рецептор пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазу нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокс 2 каудального типа (Cdx2), повторные домены 1 фибронектина III и анкирина (Fankl), ген forkhead box El (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxel), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), ген forkhead box El (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxel), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактор 1, связывающий лимфоидный энхансер (Lefl), ген 3, подобный Sal (дрозофила) (Sall3), гомеобокс 1 SATB (Satbl), miR-632 или их комбинацию;i) expression of one or more genes specific to rat ES cells, including adhesion junction protein (Ajapl), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV ( Camk4), ephrin-A1 (Efhal), NPH receptor A4 (Epha4), gap junction protein beta 5 (Gjb5), insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbpll), interleukin 36 beta (Illf8), receptor alpha interleukin 28 (Il128ra), asymmetry determination factor 1 (Leftyl), leukemia inhibitory factor alpha receptor (Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), pentraxin neuronal receptor (Ntm), non-receptor type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpn18), caudal homeobox 2 type (Cdx2), repeated domains 1 of fibronectin III and ankyrin (Fankl), forkhead box El gene (thyroid transcription factor 2) (Foxel), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead gene box El (thyroid th transcription factor 2) (Foxel), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), lymphoid enhancer-binding factor 1 (Lefl), Sal-like gene 3 (Drosophila) (Sall3), homeobox 1 SATB (Satbl), miR-632 or their combination;
ii) экспрессией по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, включая белок, связанный с адгезионными контактами (Ajapl), клаудин 5 (Cldn5), фактор 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимую протеинкиназу IV (Camk4), эфрин-А1 (Efnal), ЕРН рецептор А4 (Epha4), белок бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белок 1, подобный белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpll), интерлейкин 36 бета (Illf8), рецептор альфа интерлейкина 28 (I128ra), фактор 1 детерминации асимметрии (Lefty 1), альфа-рецептор фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептор 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейрональный рецептор пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазу нерецепторного типа 18 (Ptpnl8), гомеобокс 2 каудального типа (Cdx2), повторные домены 1 фибронектина III и анкирина (Fankl), ген forkhead box El (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxel), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), ген forkhead box El (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxel), ген, родственный hairy/enhancer-of-split с мотивом 2 YRPW (Неу2), фактор 1, связывающий лимфоидный энхансер (Lefl), ген 3, подобный Sal (дрозофила) (Sall3), гомеобокс 1 SATB (Satbl), miR-632 или их комбинацию;ii) expressing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 or more genes specific to rat ES cells, including adhesion junction protein (Ajapl), claudin 5 (Cldn5), guanine nucleotide exchange factor 9 Cdc42 (Arhgef9), calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV (Camk4 ), ephrin-A1 (Efnal), NPH receptor A4 (Epha4), cell gap junction protein beta 5 (Gjb5), insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbpll), interleukin 36 beta (Illf8), interleukin receptor alpha 28 (I128ra), asymmetry determination factor 1 (Lefty 1), leukemia inhibitory factor alpha receptor (Lifr), lysophosphatidic acid receptor 2 (Lpar2), pentraxin neuronal receptor (Ntm), non-receptor-type protein tyrosine phosphatase 18 (Ptpnl8), caudal homeobox 2 type (Cdx2), repeat domains 1 of fibronectin III and ankyrin (Fankl), forkhead box El gene (thyroid transcription factor 2) (Foxel) , hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2), forkhead box El gene (thyroid transcription factor 2) (Foxel), hairy/enhancer-of-split related gene with YRPW motif 2 (Hey2) , lymphoid enhancer binding factor 1 (Lefl), Sal (Drosophila)-like gene 3 (Sall3), SATB homeobox 1 (Satbl), miR-632, or a combination thereof;
iii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 14, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;iii) at least 20-fold increase in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 14, compared with ES cell line F1H4 mice;
iv) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 14, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;iv) at least a 20-fold increase in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 14, compared with the mouse ES cell line F1H4;
v) экспрессией одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в таблице 13;v) expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in table 13;
vi) экспрессией по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13;vi) expressing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as listed in Table 13;
vii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;vii) at least 20-fold increase in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13, compared with ES cell line F1H4 mice;
viii) по меньшей мере 20-кратным повышением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 13, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;viii) at least a 20-fold increase in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 13, compared with the mouse ES cell line F1H4;
ix) по меньшей мере 20-кратным снижением экспрессии одного или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 12, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4; и/илиix) at least 20-fold reduction in the expression of one or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 12, compared with the mouse ES cell line F1H4; and/or
x) по меньшей мере 20-кратным снижением экспрессии по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более генов, специфических для крысиных ЭС клеток, как указано в Таблице 12, по сравнению с ЭС клеткой мышей линии F1H4;x) at least a 20-fold reduction in expression of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more genes specific for rat ES cells, as indicated in Table 12, compared with the mouse ES cell line F1H4;
xi) любой комбинацией экспрессии генов, специфических для крысиных ЭС клеток согласно разделам (i)-(x);xi) any combination of expression of genes specific for rat ES cells according to sections (i)-(x);
xii) уровнем относительной экспрессии маркеров плюрипотентности, как показано в таблице 15, для по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 перечисленных маркеров плюрипотентности. См. уровни относительной экспресии в колонке ранжирования плюрипотентности Таблицы 15;xii) the level of relative expression of pluripotency markers as shown in Table 15 for at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, or 18 listed markers of pluripotency. See relative expression levels in the pluripotency ranking column of Table 15;
xiii) уровнем относительной экспрессии мезодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3 или 4 перечисленных мезодермальных маркеров. См. уровни относительной экспресии в колонке мезодермального ранжирования Таблицы 15;xiii) the level of relative expression of mesodermal markers, as shown in Table 15, for at least 2, 3 or 4 listed mesodermal markers. See relative expression levels in the mesodermal ranking column of Table 15;
xiv) уровнем относительной экспрессии эндодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 перечисленных эндодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке эндодермального ранжирования Таблицы 15;xiv) the level of relative expression of endodermal markers as shown in Table 15 for at least 2, 3, 4, 5 or 6 of the listed endodermal markers. See relative expression levels in the endodermal ranking column of Table 15;
xv) уровнем относительной экспрессии нейронных маркеров, как показано в Таблице 15, для по меньшей мере 2 и 3 перечисленных нейронных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке нейронного ранжирования Таблицы 15;xv) the level of relative expression of neuronal markers, as shown in Table 15, for at least 2 and 3 of the listed neuronal markers. See relative expression levels in the neural ranking column of Table 15;
xvi) уровнем относительной экспрессии трофэктодермальных маркеров, как показано в Таблице 15, для перечисленных трофэктодермальных маркеров. См. уровни относительной экспрессии в колонке трофэктодермального ранжирования Таблицы 15;xvi) the level of relative expression of trophectodermal markers, as shown in Table 15, for the listed trophectodermal markers. See relative expression levels in the trophectodermal ranking column of Table 15;
xvii) любым уровнем относительной экспрессии одного или более (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) маркеров плюрипотентности, мезодермальных маркеров, эндодермальных маркеров, нейронных маркеров и/или трофэктодермальных маркеров, приведенных в Таблице 15;xvii) any level of relative expression of one or more (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30) the pluripotency markers, mesodermal markers, endodermal markers, neuronal markers and/or trophectodermal markers shown in Table 15;
xviii) уровнем относительной экспрессии каждого из маркеров, приведенных в Таблице 15;xviii) the level of relative expression of each of the markers shown in Table 15;
xix) любой комбинацией сигнатур, приведенных в разделах xii-xiix; и/илиxix) any combination of the signatures given in sections xii-xiix; and/or
xx) любой комбинацией сигнатур, приведенных в разделах i-xiix.xx) any combination of the signatures given in sections i-xiix.
(i) обладают способностью продуцировать крысу F0;(i) have the ability to produce rat F0;
(j) способны к субкультивированию и поддержанию недифференцированного состояния;(j) are capable of subculturing and maintaining an undifferentiated state;
(k) имеют то же количество хромосом, что и клетка нормальной крысы;(k) have the same number of chromosomes as a normal rat cell;
(1) сохраняют плюрипотентность in vitro без потребности в паракринной сигнализации LIF; и/или(1) retain pluripotency in vitro without the need for LIF paracrine signaling; and/or
(m) обладают способностью самообновления, что означает, что они делятся бесконечно, сохраняя плюрипотентность.(m) are self-renewing, meaning that they divide indefinitely while maintaining pluripotency.
iii. Кассеты экспрессииiii. Expression cassettes
Термины «полинуклеотид», «полинуклеотидная последовательность», «последовательность нуклеиновой кислоты» и «фрагмент нуклеиновой кислоты» используются в данном документе взаимозаменяемо. Эти термины охватывают нуклеотидные последовательности и т.п. Полинуклеотид может быть полимером РНК или ДНК, который является одно- или двухцепочечным и необязательно содержит синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания. Полинуклеотид в форме полимера ДНК может состоять из одного или больше сегментов кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или их смесей. Полинуклеотиды могут содержать дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды, включая как молекулы, встречающиеся в природе, так и синтетические аналоги и их любую комбинацию. Полинуклеотиды, представленные в данном документе, также охватывают все формы последовательностей, включая, но не ограничиваясь этим, одноцепочечные формы, двухцепочечные формы, шпильки, структуры типа «стебель - петля» и т.п.The terms "polynucleotide", "polynucleotide sequence", "nucleic acid sequence" and "nucleic acid fragment" are used interchangeably herein. These terms cover nucleotide sequences and the like. The polynucleotide may be an RNA or DNA polymer that is single or double stranded and optionally contains synthetic, non-natural or altered nucleotide bases. A polynucleotide in the form of a DNA polymer may be composed of one or more segments of cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, or mixtures thereof. Polynucleotides may contain deoxyribonucleotides and ribonucleotides, including both naturally occurring molecules and synthetic analogues, and any combination thereof. The polynucleotides provided herein also encompass all forms of sequences, including, but not limited to, single-stranded forms, double-stranded forms, hairpins, stem-loop structures, and the like.
Дополнительно представлены рекомбинантные полинуклеотиды. Термины «рекомбинантный полинуклеотид» и «конструкция рекомбинантной ДНК» используются в данном документе взаимозаменяемо. Ре комби нантная конструкция содержит искусственную или гетерологичную комбинацию последовательностей нуклеиновых кислот, например регуляторных и кодирующих последовательностей, которые вместе в природе не встречаются. В других вариантах реализации изобретения рекомбинантная конструкция может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из одного и того же источника, но расположены способом, отличным от встречающегося в природе. Такая конструкция может быть использована сама по себе или может быть использована в сочетании с вектором. Если используется вектор, то выбор вектора зависит от способа, который будет использоваться для трансформации клеток-хозяев, как хорошо известно специалисту в данной области. Например, может использоваться плазмидный вектор. В настоящем документе предложены генетические элементы, необходимые для успешной трансформации, селекции и размножения клеток-хозяев, содержащих любой из выделенных фрагментов нуклеиновой кислоты. Скрининг можно провести, среди прочего, саузерн-анализом ДНК, нозерн-анализом экспрессии мРНК, анализом иммуноблоттинга экспрессии белка или фенотипическим анализом.Additionally, recombinant polynucleotides are provided. The terms "recombinant polynucleotide" and "recombinant DNA construct" are used interchangeably herein. A recombinant construct contains an artificial or heterologous combination of nucleic acid sequences, such as regulatory and coding sequences, that do not occur together in nature. In other embodiments, the recombinant construct may contain regulatory sequences and coding sequences that come from different sources, or regulatory sequences and coding sequences that come from the same source but are arranged in a different way than naturally occurring. Such a construct may be used on its own or may be used in combination with a vector. If a vector is used, then the choice of vector depends on the method that will be used to transform the host cells, as is well known to the person skilled in the art. For example, a plasmid vector may be used. Provided herein are the genetic elements necessary for the successful transformation, selection, and propagation of host cells containing any of the isolated nucleic acid fragments. Screening can be performed by Southern DNA analysis, Northern analysis of mRNA expression, immunoblot analysis of protein expression, or phenotypic analysis, among others.
В специфических вариантах реализации изобретения один или больше компонентов, описанных в данном документе, могут быть предоставлены в кассете экспрессии для экспрессии в крысиной клетке. Кассета может включать 5' и 3' регуляторные последовательности, функционально связанные с полинуклеотидом, представленным в данном документе. «Функционально связанный» означает функциональную связь между двумя или больше элементами. Например, функциональная связь между полинуклеотидом, представляющим интерес, и регуляторной последовательностью (т.е. промотором) является функциональным звеном, которое позволяет экспрессию полинуклеотида, представляющего интерес. Функционально связанные элементы могут быть непрерывными или не непрерывными. При использовании для обозначения соединения двух кодирующих белок областей «функционально связанный» означает, что кодирующие области находятся в одной рамке считывания. В другом случае последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, может быть, функционально связана с регуляторными последовательностями {например, последовательностью промотера, энхансера, сайленсера и т.п.) таким образом, чтобы сохранить надлежащее регулирование транскрипции. Кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный полинуклеотид, представляющий интерес, для совместного введения в крысиную ЭС клетку. В альтернативном варианте дополнительный полинуклеотид, представляющий интерес, может быть представлен на множестве кассет экспрессии. Такая кассета экспрессии представлена со множеством сайтов рестрикции и/или сайтов рекомбинации для инсерции рекомбинантного полинуклеотида, который должен находиться под транскрипционным контролем регуляторных областей. Кассета экспрессии может дополнительно содержать селективные маркерные гены.In specific embodiments, one or more of the components described herein may be provided in an expression cassette for expression in a rat cell. The cassette may include 5' and 3' regulatory sequences operably linked to a polynucleotide provided herein. "Operably linked" means a functional relationship between two or more elements. For example, a functional link between a polynucleotide of interest and a regulatory sequence (ie, a promoter) is a functional link that allows expression of the polynucleotide of interest. Functionally related elements may or may not be continuous. When used to refer to the connection of two protein-coding regions, "operably linked" means that the coding regions are in the same reading frame. Alternatively, a nucleic acid sequence encoding a protein may be operably linked to regulatory sequences (eg, a promoter, enhancer, silencer, etc. sequence) in such a way as to maintain proper regulation of transcription. The cassette may further contain at least one additional polynucleotide of interest for co-introduction into the rat ES cell. Alternatively, an additional polynucleotide of interest may be present on multiple expression cassettes. Such an expression cassette is provided with a plurality of restriction sites and/or recombination sites for the insertion of a recombinant polynucleotide, which must be under the transcriptional control of regulatory regions. The expression cassette may further comprise selectable marker genes.
Кассета экспрессии может включать в 5'-3' направлении транскрипции, область инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), рекомбинантный полинуклеотид, представленный в данном документе, и область терминации транскрипции и трансляции (т.е. область терминации), функциональный в клетке млекопитающего или клетке-хозяине, представляющей интерес. Регуляторные области (т.е. промоторы, области, регулирующие транскрипцию и области терминации трансляции) и/или полинуклеотид, представленный в настоящем документе, могут быть нативными/аналогичными клетке-хозяину или друг другу. В альтернативном варианте регуляторные области и/или полинуклеотид, представленный в данном документе, могут быть гетерологичными клетке-хозяину или друг другу. Например, промотор, функционально связанный с гетерологичным полинуклеотидом, происходит от видов, отличных от видов, из которых был получен полинуклеотид, или, если он происходит из тех же/аналогичных видов, один или оба по сути изменены по сравнению с их первоначальной формой и/или геномным локусом, или промотор не является природным промотором для функционально связанного полинуклеотида. В альтернативном варианте регуляторные области и/или рекомбинантный полинуклеотид, представленные в данном документе, могут быть полностью синтетическими.An expression cassette may include, in the 5'-3' direction of transcription, a transcription and translation initiation region (i.e., a promoter), a recombinant polynucleotide provided herein, and a transcription and translation termination region (i.e., a termination region), a functional in a mammalian cell or host cell of interest. The regulatory regions (ie, promoters, transcriptional regulatory regions, and translation termination regions) and/or polynucleotide provided herein may be native/similar to the host cell or each other. Alternatively, the regulatory regions and/or polynucleotide provided herein may be heterologous to the host cell or to each other. For example, a promoter operably linked to a heterologous polynucleotide is from a species different from the species from which the polynucleotide was derived or, if it is from the same/similar species, one or both are substantially altered from their original form and/ or a genomic locus, or the promoter is not a natural promoter for the operably linked polynucleotide. Alternatively, the regulatory regions and/or recombinant polynucleotide provided herein may be wholly synthetic.
Область терминации может быть нативной с областью инициации транскрипции, может быть нативной с функционально связанным рекомбинантным полинуклеотидом, может быть нативной с клеткой-хозяином или может быть получена из другого источника (например, чужеродного или гетерологичного) промотора, рекомбинантного полинуклеотида, клетки-хозяина или любой их комбинации.The termination region may be native with a transcription initiation region, may be native with an operably linked recombinant polynucleotide, may be native with a host cell, or may be derived from another source (e.g., foreign or heterologous) promoter, recombinant polynucleotide, host cell, or any their combinations.
При подготовке кассеты экспрессии различными фрагментами ДНК можно манипулировать таким образом, чтобы предоставить последовательности ДНК в правильной ориентации. С этой целью могут быть использованы адаптеры или линкеры, чтобы присоединить фрагменты ДНК, или могут быть использованы другие манипуляции для обеспечения подходящих сайтов рестрикции, удаление избыточной ДНК, удаление сайтов рестрикции и т.п. С этой целью может быть использован in vitro мутагенез, восстановление праймеров, рестрикция, отжиг, перезамещения, например переходы и трансверсии.In preparing the expression cassette, the various DNA fragments can be manipulated so as to provide the DNA sequences in the correct orientation. To this end, adapters or linkers may be used to attach DNA fragments, or other manipulations may be used to provide suitable restriction sites, remove excess DNA, remove restriction sites, and the like. For this purpose, in vitro mutagenesis, primer recovery, restriction, annealing, substitutions, such as transitions and transversions, can be used.
В кассетах экспрессии, представленных в данном документе, может использоваться ряд промоторов. Промоторы могут быть выбраны на основе желаемого результата. Следует понимать, что различные виды применения могут быть улучшены за счет использования в кассетах экспрессии различных промоторов для модулирования выбора времени, расположения и/или уровня экспрессии полинуклеотида, представляющего интерес. Такие конструкции экспрессии также могут содержать, при желании, регулирующую область промотора (например, одну придающую индуцибельность, конститутивную, регулируемую условиями окружающей среды или развития, либо клеточно- или тканеспецифическую/селективную экспрессию), начало сайта инициации транскрипции, сайт связывания рибосом, сигнал обработки РНК, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.A number of promoters can be used in the expression cassettes provided herein. Promoters can be selected based on the desired result. It should be understood that various uses can be improved by using different promoters in the expression cassettes to modulate the timing, location and/or expression level of the polynucleotide of interest. Such expression constructs may also contain, if desired, a promoter regulatory region (e.g., one conferring inducibility, constitutive, environmental or developmental, or cell- or tissue-specific/selective expression), the start of a transcription initiation site, a ribosome binding site, a processing signal RNA, transcription termination site and/or polyadenylation signal.
iv. Создание крысиных эмбрионов F0 и потомства F1 с целевой генетической модификациейiv. Creation of F0 Rat Embryos and F1 Offspring with Targeted Genetic Modification
Для создания генетически модифицированных крыс можно использовать различные композиции и способы, предложенные в настоящем документе. Такие способы обычно включают (а) введение в геном выделенной крысиной ЭС клетки, описанной в данном документе, целевой генетической модификации для получения генетически модифицированной крысиной ЭС клетки, имеющей генетическую модификацию; (b) имплантацию по меньшей мере одной из генетически модифицированных крысиных ЭС клеток, имеющих генетическую модификацию, в крысиный эмбрион-хозяин для создания эмбриона F0; (с) имплантацию эмбриона F0 суррогатной матери; (d) созревание эмбриона F0 в организме суррогатной матери до соответствующего срока; и (е) идентификацию крыс F0, имеющих генетическую модификацию.Various compositions and methods provided herein can be used to create genetically modified rats. Such methods typically include (a) introducing into the genome of the isolated rat ES cell described herein a targeted genetic modification to produce a genetically modified rat ES cell having the genetic modification; (b) implanting at least one of the genetically modified rat ES cells having the genetic modification into a rat host embryo to create an F0 embryo; (c) implanting an F0 embryo into a surrogate mother; (d) maturation of the F0 embryo in the body of the surrogate mother before the appropriate term; and (e) identifying F0 rats having the genetic modification.
Генетически модифицированные крысиные ЭС клетки, имеющие генетическую модификацию, могут быть имплантированы в крысиный эмбрион-хозяин из той же крысиной линии или из другой крысиной линии. Например, генетически модифицированная крысиная ЭС клетка линии DA может быть имплантирована в крысиный эмбрион-хозяин линии DA или может быть имплантирована в эмбрион-хозяин линии SD, эмбрион-хозяин линии ACI или другой гетерологичный крысиный эмбрион-хозяин. Подобным образом, генетически модифицированная крысиная ЭС клетка линии ACI может быть введена в крысиный эмбрион-хозяин линии ACI или может быть введена в крысиный эмбрион-хозяин линии SD, эмбрион-хозяин линии DA или другой гетерологичный крысиный эмбрион-хозяин. Точно так же, суррогатная мать может быть из той же линии крыс, что и генетически модифицированная крысиная клетка и/или крысиный эмбрион-хозяин, или суррогатная мать может быть из другой линии крыс, а не из той, что генетически модифицированная крысиная клетка и/или крысиный эмбрион-хозяин. В одном неограничивающем варианте реализации изобретения генетически модифицированная крысиная клетка происходит от линии DA, эмбрион-хозяин происходит от эмбриона-хозяина линии SD, и суррогатная мать происходит от линии DA. В другом неограничивающем варианте реализации изобретения генетически модифицированная крысиная клетка происходит от линии ACI, эмбрион-хозяин происходит от линии SD, и суррогатная мать происходит от линии DA.Genetically modified rat ES cells having the genetic modification can be implanted into a rat host embryo from the same rat line or from another rat line. For example, a genetically modified DA rat ES cell may be implanted in a DA rat embryo host, or may be implanted in an SD host, an ACI host, or other heterologous rat embryo host. Similarly, a genetically modified ACI rat ES cell may be introduced into an ACI rat embryo host, or may be introduced into an SD rat embryo host, a DA embryo host, or other heterologous rat embryo host. Similarly, the surrogate mother may be from the same line of rats as the genetically modified rat cell and/or rat host embryo, or the surrogate mother may be from a different line of rats than the genetically modified rat cell and/or or rat embryo host. In one non-limiting embodiment of the invention, the genetically modified rat cell is from the DA lineage, the host embryo is from the SD host lineage, and the surrogate mother is from the DA lineage. In another non-limiting embodiment of the invention, the genetically modified rat cell is from the ACI lineage, the host embryo is from the SD lineage, and the surrogate mother is from the DA lineage.
В дополнительных вариантах реализации изобретения химерных крыс (F0) можно разводить для получения потомства F1, которое является гетерозиготным по целевой генетической модификации. Кроме того, самцов крыс потомства F1 можно скрещивать с самками крыс потомства F1 с получением потомства F2, являющегося гомозиготным по генетической модификации.In additional embodiments, chimeric (F0) rats can be bred to produce F1 offspring that are heterozygous for the targeted genetic modification. In addition, male F1 progeny rats can be bred with female F1 progeny rats to produce F2 progeny that are homozygous for the genetic modification.
Способы и композиции, предложенные в данном документе, обеспечивают получение по меньшей мере 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или больше крыс F0 F0, имеющих генетическую модификацию для передачи генетической модификации потомству F1.The methods and compositions provided herein provide at least 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% or more F0 F0 rats having the genetic modification to pass the genetic modification to F1 offspring.
В некоторых вариантах реализации изобретения крысиные ЭС клетки, имеющие целевую генетическую модификацию, вводят в эмбрион стадии преморулы из соответствующего организма, например, мышиный эмбрион на стадии 8 клеток. См., например, патенты US 7576259, US 7659442, US 7294754 и US 2008-0078000 A1, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В других вариантах реализации изобретения For, донорские крысиные ЭС клетки, могут быть имплантированы в эмбрион-хозяин на стадии 4 клеток, на стадии 8 клеток.In some embodiments, rat ES cells having the targeted genetic modification are introduced into a premorula stage embryo from an appropriate organism, eg, an 8 cell stage mouse embryo. See, for example, US Pat. In other embodiments of the invention For, donor rat ES cells can be implanted in the host embryo at the stage of 4 cells, at the stage of 8 cells.
Крысиные эмбрионы, содержащие генетически модифицированные крысиные ЭС клетки, инкубируют до стадии бластоцисты, а затем имплантируют суррогатной матери для получения потомства F0. Крысы, несущие генетически модифицированный геномный локус, могут быть идентифицированы с помощью анализа модификации аллеля (МОА), как описано в данном документе. Полученное в результате из генетически модифицированных крысиных ЭС клеток потомство F0 скрещивают с крысой дикого типа с получением потомства поколения F1. После генотипирования с использованием специфических праймеров и/или зондов, F1 крыс, гетерозиготных по генетически модифицированному геномному локусу, скрещивают друг с другом, чтобы получить крысу, гомозиготную по генетически модифицированному геномному локусу.Rat embryos containing genetically modified rat ES cells are incubated to the blastocyst stage and then implanted into a surrogate mother to produce F0 offspring. Rats carrying a genetically modified genomic locus can be identified using an allele modification assay (MOA) as described herein. The resulting F0 progeny from genetically modified rat ES cells are crossed with a wild-type rat to produce F1 generation progeny. After genotyping using specific primers and/or probes, F1 rats heterozygous for the genetically modified genomic locus are bred with each other to obtain a rat homozygous for the genetically modified genomic locus.
Дополнительно представлен эмбрион крысы F0, содержащий внутреннюю клеточную массу, содержащую по меньшей мере одну гетерологичную стволовую клетку, включающую любую из крысиных ЭС клеток, представленных в данном документе. В других вариантах реализации изобретения представлено потомство крысиного эмбриона F0, в котором по меньшей мере 50%, 60%, 70% или больше потомства F0 получено от генетически модифицированной крысиной ЭС клетки, как описано в настоящем документе.Additionally, an F0 rat embryo is provided containing an inner cell mass containing at least one heterologous stem cell, including any of the rat ES cells provided herein. In other embodiments, an F0 rat embryo progeny is provided in which at least 50%, 60%, 70% or more of the F0 progeny is derived from a genetically modified rat ES cell as described herein.
В одном аспекте предложен способ получения крысиной ЭС клетки, включая получение крысиной клетки из эмбриона крысы на стадии морулы, эмбриона крысы на стадии бластоцисты или эмбриона крысы на стадии развития между эмбрионом на стадии морулы и эмбрионом на стадии бластоцисты, и культивирование крысиной клетки из крысиного эмбриона в условиях, достаточных для сохранения плюрипотентности и/или тотипотентности. В одном варианте реализации изобретения условия, достаточные для сохранения плюрипотентности и/или тотипотентности, включают среду 2i.In one aspect, a method for producing a rat ES cell is provided, including obtaining a rat cell from a rat morula embryo, a rat blastocyst embryo, or a developmental rat embryo between a morula embryo and a blastocyst embryo, and culturing the rat cell from the rat embryo. under conditions sufficient to maintain pluripotency and/or totipotency. In one embodiment of the invention, conditions sufficient to maintain pluripotency and/or totipotency include medium 2i.
В одном аспекте предложен способ получения генетически модифицированной крысы, включающий стадию модификации генома крысиной ЭС клетки последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, с образованием модифицированной крысиной ЭС клетки, и использование модифицированной крысиной ЭС клетки в качестве донорской крысиной ЭС клетки, объединение донорской крысиной ЭС клетки с крысиным эмбрионом-хозяином, культивирование донорской ЭС клетки и крысиного эмбриона-хозяина и использование культивированного эмбриона-хозяина с получением генетически модифицированной крысы.In one aspect, a method is provided for producing a genetically modified rat, comprising the step of modifying the genome of a rat ES cell with a nucleic acid sequence of interest to form a modified rat ES cell, and using the modified rat ES cell as a donor rat ES cell, combining the donor rat ES cell with rat embryo host, culturing the donor ES cell and the rat embryo host, and using the cultured host embryo to obtain a genetically modified rat.
В одном аспекте предложен способ получения генетически модифицированного потомства крыс F1, включающий стадию модификации генома крысиной ЭС клетки последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, с образованием модифицированной крысиной ЭС клетки, и использование модифицированной крысиной ЭС клетки в качестве донорской крысиной ЭС клетки, объединение донорской крысиной ЭС клетки с крысиным эмбрионом-хозяином, культивирование донорской ЭС клетки и крысиного эмбриона-хозяина и использование культивированного эмбриона-хозяина с получением генетически модифицированной крысы, причем около 3%, около 10% или больше, или около 63% или больше получено из генетически модифицированной донорской крысиной ЭС клетки.In one aspect, a method is provided for producing genetically modified progeny of F1 rats, comprising the step of modifying the genome of a rat ES cell with a nucleic acid sequence of interest to form a modified rat ES cell, and using the modified rat ES cell as a donor rat ES cell, pooling the donor rat ES cells with a rat embryonic host, culturing the donor ES cell and the rat embryonic host, and using the cultured host embryo to produce a genetically modified rat, wherein about 3%, about 10% or more, or about 63% or more are derived from the genetically modified donor rat ES cells.
В одном варианте реализации изобретения культивированный эмбрион-хозяин имплантируют суррогатной матери-крысе, и происходит развитие плода из культурального эмбриона-хозяина в организме суррогатной матери.In one embodiment, the cultured host embryo is implanted in a rat surrogate mother and the cultured host embryo develops in the surrogate mother's body.
В одном аспекте предложен способ передачи с высокой частотой генетической модификации из крысиной плюрипотентной клетки крысиному потомству, включающий генетическую модификацию плюрипотентной крысиной клетки последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, в бактериальной искусственной хромосоме с образованием генетически модифицированной крысиной плюрипотентной клетки, и использование генетически модифицированной крысиной плюрипотентной клетки с крысиным эмбрионом-хозяином в организме суррогатной матери для создания потомства, содержащего генетическую модификацию, и, необязательно, разведение потомства.In one aspect, a method is provided for transferring a genetically modified rat pluripotent cell to rat progeny at a high frequency, comprising genetically modifying a rat pluripotent cell with a nucleic acid sequence of interest on a bacterial artificial chromosome to form a genetically modified rat pluripotent cell, and using the genetically modified rat pluripotent cell with a rat embryo host in the body of a surrogate mother to create offspring containing the genetic modification, and optionally breeding offspring.
В одном аспекте предложен способ получения крысиной ЭС клетки, причем этот способ включает культивирование замороженного эмбриона на стадии 8 клеток до стадии бластоцисты и получение из культивированной бластоцисты крысиной клетки, культивирование крысиной клетки в условиях, достаточных для сохранения плюрипотентности и/или тотипотентности.In one aspect, a method for producing a rat ES cell is provided, the method comprising culturing a frozen 8 cell stage embryo to a blastocyst stage and obtaining a rat cell from a cultured blastocyst, culturing the rat cell under conditions sufficient to maintain pluripotency and/or totipotency.
V. Варианты, фрагменты и идентичность последовательностейV. Variants, fragments and sequence identities
Активные варианты и фрагменты описанного полипептида LIF, в частности мышиного полипептида LIF, представлены в данном документе. Термин «варианты» относятся к по существу сходным последовательностям. Используемый в данном документе термин «вариант полипептида» означает полипептид, полученный из нативного белка путем делеции (так называемого усечения) одной или больше аминокислот в N-концевом и/или С-концевом участке нативного белка; делеции и/или добавления одной или больше аминокислот в одном или больше внутренних сайтов в нативном белке, или замены одной или больше аминокислот в одном или больше сайтах нативного белка. Варианты полипептидов продолжают обладать желаемой биологической активностью нативного полипептида, то есть они ингибируют дифференциацию крысиных и/или мышиных эмбриональных стволовых клеток и вносят вклад в самообновление стволовых клеток. Вариант полипептида, описанный в данном документе (т.е. SEQ ID NO: 1 или с номером доступа SwissProt Р09056), как правило, будет иметь по меньшей мере около 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентичности последовательности с эталонной последовательностью.Active variants and fragments of the described LIF polypeptide, in particular the murine LIF polypeptide, are provided herein. The term "variants" refers to essentially similar sequences. As used herein, the term "polypeptide variant" means a polypeptide derived from a native protein by deletion (so-called truncation) of one or more amino acids at the N-terminal and/or C-terminus of the native protein; deletions and/or additions of one or more amino acids at one or more internal sites in the native protein, or substitutions of one or more amino acids at one or more sites of the native protein. The polypeptide variants continue to have the desired biological activity of the native polypeptide, ie they inhibit the differentiation of rat and/or mouse embryonic stem cells and contribute to the self-renewal of the stem cells. The polypeptide variant described herein (i.e., SEQ ID NO: 1 or SwissProt accession number P09056) will typically have at least about 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence identity with the reference sequence.
Термин «фрагмент» относится к части аминокислоты, содержащей специфическое количество смежных аминокислот. В конкретных вариантах реализации изобретения фрагмент полипептида, описанного в данном документе, может сохранять биологическую активность полноразмерного полипептида и, следовательно, ингибировать дифференциацию крысиных и/или мышиных эмбриональных стволовых клеток и вносить вклад в самообновление стволовых клеток. Фрагменты полипептида, описанные в настоящем документе (т.е. SEQ ID NO: 1 или номер доступа SwissProt No. Р09056), могут содержать по меньшей мере 10, 15, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,170, 180, 190,200 смежных аминокислот, или вплоть до общего числа аминокислот, присутствующих в полноразмерном белке.The term "fragment" refers to a portion of an amino acid containing a specific number of contiguous amino acids. In specific embodiments, a fragment of a polypeptide described herein may retain the biological activity of the full-length polypeptide and therefore inhibit rat and/or mouse embryonic stem cell differentiation and contribute to stem cell self-renewal. The polypeptide fragments described herein (i.e. SEQ ID NO: 1 or SwissProt Accession No. P09056) may contain at least 10, 15, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100 , 110, 120, 130, 140, 150, 160,170, 180, 190,200 contiguous amino acids, or up to the total number of amino acids present in a complete protein.
Используемый в данном документе термин «идентичность последовательностей» или «идентичность» в контексте двух полинуклеотидов или полипептидных последовательностей ссылается на остатки в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия в определенном окне сравнения. При использовании процента идентичности последовательностей со ссылкой на белки следует понимать, что положения неидентичных остатков часто отличаются консервативными аминокислотными заменами, при которых аминокислотные остатки замещены другими аминокислотными остатками со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью) и, следовательно, не изменяют функциональные свойства молекулы. В тех случаях, когда последовательности отличаются консервативными заменами, процент идентичности последовательностей может быть скорректирован в сторону повышения для коррекции консервативной природы замены. О последовательностях, которые различаются такими консервативными заменами, говорят, что они имеют «сходство последовательностей» или «сходство». Способы осуществления этой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. Обычно они включают в себя учет консервативной замены как частичного, а не полного несоответствия, увеличивая, таким образом, процент идентичности последовательностей. Следовательно, например, если идентичная аминокислота имеет коэффициент 1, а неконсервативное замещение имеет коэффициент нуль, консервативное замещение имеет коэффициент между нулем и 1. Подсчет консервативных замещений проводится, например, в соответствии с алгоритмом программы PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).As used herein, the term "sequence identity" or "identity" in the context of two polynucleotides or polypeptide sequences refers to residues in two sequences that are the same when aligned for maximum match within a defined comparison window. When using percent sequence identity with reference to proteins, it should be understood that the positions of non-identical residues often differ by conservative amino acid substitutions, in which amino acid residues are replaced by other amino acid residues with similar chemical properties (for example, charge or hydrophobicity) and, therefore, do not change the functional properties of the molecule. . Where sequences differ by conservative substitutions, the percent sequence identity may be adjusted upward to correct for the conservative nature of the substitution. Sequences that differ by such conservative substitutions are said to have "sequence similarity" or "similarity". Methods for making this adjustment are well known to those skilled in the art. They usually include accounting for conservative substitution as a partial rather than a complete mismatch, thus increasing the percentage of sequence identity. Therefore, for example, if an identical amino acid has a factor of 1 and a non-conservative substitution has a factor of zero, a conservative substitution has a factor between zero and 1. Conservative substitutions are counted, for example, according to the algorithm of the PC/GENE program (Intelligenetics, Mountain View, California) .
В данном документе термин «процент идентичности последовательностей» означает величину, определенную путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей через окно сравнения, причем часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (например, гэпы) в сравнении с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки присутствуют в обеих последовательностях, для получения числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнивания и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей.As used herein, the term "percent sequence identity" means a value determined by comparing two optimally aligned sequences across a comparison window, wherein the portion of the polynucleotide sequence in the comparison window may contain additions or deletions (e.g., gaps) compared to a reference sequence (which contains no additions). or deletions) to optimally align the two sequences. The percentage is calculated by determining the number of positions at which identical nucleic acid bases or amino acid residues are present in both sequences to obtain the number of matching positions, dividing the number of matching positions by the total number of positions in the comparison window, and multiplying the result by 100 to obtain percent sequence identity.
Если не указано иное, значения идентичности/схожести последовательностей, представленных в данном документе, относятся к значению, полученному с использованием программного обеспечения GAP версии 10 с использованием следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с применением значений веса ГЭП 50 и веса длины 3, и матрицы подсчета nwsgapdna.cmp; % идентичности или % сходства для аминокислотной последовательности с применением значений веса ГЭП 8 и веса длины 2 и матрицы подсчета BLOSUM62 или эквивалентной программы. Под «эквивалентной программой» подразумевают любую программу сравнения последовательностей, которая для любых двух рассматриваемых последовательностей производит выравнивание, имеющее идентичные совпадения нуклеотидных или аминокислотных остатков и идентичный процент идентичности последовательностей по сравнению с соответствующим выравниванием, произведенным посредством программы GAP версии 10.Unless otherwise noted, the sequence identity/similarity values presented herein refer to the value obtained using the
Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения.The following examples are intended to illustrate and not to limit the scope of the invention.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1: Деривация крысиных ЭС клеток.Example 1: Derivation of rat ES cells.
Характеристика кЭСК. Как показано на ФИГ. 1, кЭСК растут в виде компактных сферических колоний, которые обычно не прикреплены и плавают в чашке для культивирования (крупный план на ФИГ. 4). В, С, F, G: кЭСК экспрессируют маркеры плюрипотентности, включая Oct-4 (ФИГ. 2А) и Sox2 (ФИГ. 2В) и экспрессируют высокие уровни щелочной фосфатазы (ФИГ. 3, левая панель). Кариотип для линии DA.2B представляет собой 42X,Y (ФИГ. 3, правая панель). кЭСК часто становятся тетраплоидными; таким образом, проводят предварительный скрининг линий путем подсчета препаратов метафазных хромосом; линии в основном с нормальным количеством затем формально кариотипируют.Characteristics of qESC. As shown in FIG. 1, kESCs grow as compact spherical colonies that are usually not attached and float in the culture dish (close-up of FIG. 4). B, C, F, G: hESCs express pluripotency markers including Oct-4 (FIG. 2A) and Sox2 (FIG. 2B) and express high levels of alkaline phosphatase (FIG. 3, left panel). The karyotype for the DA.2B line is 42X,Y (FIG. 3, right panel). nESCs often become tetraploid; thus, preliminary screening of lines is carried out by counting preparations of metaphase chromosomes; lines with mostly normal numbers are then formally karyotyped.
Бластоцисты ACI собирают от коммерчески приобретенных самок с суперовуляцией; культивируют бласты DA от коммерчески приобретенных замороженных 8-клеточных эмбрионов. Блестящую оболочку яйцеклетки удаляют с использованием кислоты Тироде, и бласты высевают на митотически инактивированные МЭФ. Разрастания собирают и выращивают с использованием стандартных способов. Все бласты высевают, культивируют и выращивают с использованием среды 2i (публикация Li et al. (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell 135:1299-1310; включена в данный документ посредством ссылки).ACI blastocysts are harvested from commercially purchased superovulating females; cultured DA blasts from commercially purchased frozen 8-cell embryos. The zona pellucida is removed using Tyrode's acid, and the blasts are plated on mitotically inactivated MEFs. The outgrowths are harvested and grown using standard methods. All blasts are seeded, cultured and grown using 2i medium (Li et al. (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell 135:1299-1310; incorporated herein by reference).
Пример 2: Получение крысExample 2: Obtaining rats
Химерных крыс получали посредством инъекции бластоцисты и трансмиссии генома кЭСК через зародышевую линию. Химеры, полученные с помощью микроинъекции бластоцисты с использованием родительской кЭСК ACI.G1, показаны на ФИГ. 5. Детеныши агути F1 из помета с альбиносами, произведенными от химеры ACI/SD, помеченной звездочкой (*) на ФИГ. 5, показаны на ФИГ. 6.Chimeric rats were obtained by injection of a blastocyst and transmission of the hESC genome through the germline. Chimeras obtained by blastocyst microinjection using ACI.G1 parental ESSCs are shown in FIG. 5. F1 agouti pups from an albino litter derived from the ACI/SD chimera marked with an asterisk (*) in FIG. 5 are shown in FIG. 6.
Трансмиссия через зародышевую линию родительской кЭСК. Три линии эуплоидной кЭСК оценивали на плюрипотентность путем микроинъекции в бластоцист альбиносов SD. Химеры были идентифицированы по окрасу покрова агути, указывающему на вклад кЭСК. В каждой линии большинство химер передало геном кЭСК потомству F1 (Таблица 4).Transmission through the germline of the parent hESC. Three euploid hESC lines were assessed for pluripotency by microinjection into SD albino blastocysts. Chimeras were identified by the color of the agouti coat, indicating the contribution of eSCs. In each line, the majority of chimeras passed on the genome of kESCs to F1 progeny (Table 4).
Пример 3: нацеливание кЭСК: Локус Rosa 26 крыс.Example 3 Targeting sESCs: Locus Rosa 26 rats.
Локус rRosa26 находится между генами Setd5 и Thumpd3, как и у мыши, на том же расстоянии. Локус rRosa 26 (ФИГ. 7, панель В) отличается от локуса mRosa 26 (ФИГ. 7, панель А). Транскрипты mRosa26 состоят из 2 или 3 экзонов. Крысиный локус содержит 2-й экзон 1 (Exlb) в дополнение к гомологичному экзону мышиного экзона 1 (Exla). У крыс не был выявлен 3-й экзон. Нацеливание на аллель rRosa26 показано на ФИГ. 7, панель С, где группы гомологии по 5 тысяч оснований каждая клонировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК от кЭСК DA. Целевой аллель содержит кассету SA-lacZ-hUB-neo, замещающую делецию 117 п.о. в интроне rRosa26.The rRosa26 locus is located between the Setd5 and Thumpd3 genes, as in mice, at the same distance. The rRosa 26 locus (FIG. 7, panel B) differs from the mRosa 26 locus (FIG. 7, panel A). mRosa26 transcripts consist of 2 or 3 exons. The rat locus contains the 2nd exon 1 (Exlb) in addition to the homologous exon of the mouse exon 1 (Exla). Exon 3 was not detected in rats. Targeting the rRosa26 allele is shown in FIG. 7, panel C, where homology groups of 5 kb each were cloned by PCR using genomic DNA from DA hESCs. The target allele contains the SA-lacZ-hUB-neo cassette replacing the 117 bp deletion. in the rRosa26 intron.
Определяли целевую эффективность локуса rRosa 26 (Таблица 5). Линеаризованный вектор вводили с помощью электропорации в кЭСК линии DA или ACI, и трансфицированные колонии культивировали в среде 2i с добавлением G418, с использованием стандартных способов. Отдельные колонии собирали и подвергали скринингу с использованием анализа утраты аллеля (Loss of Allele, LOA) (публикация Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21:652-660, включена в данный документ посредством ссылки).The target efficacy of the rRosa 26 locus was determined (Table 5). The linearized vector was electroporated into DA or ACI hESCs and the transfected colonies were cultured in 2i medium supplemented with G418 using standard methods. Individual colonies were harvested and screened using Loss of Allele (LOA) analysis (Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 :652-660, incorporated herein by reference).
Получение химеры и трансмиссия через зародышевую линию и с использованием целевой Rosa26 кЭСК. Вновь подтвержденные целевые клоны rRosa26 вводили путем микроинъекции в бластоцисты SD, которые затем переносили самкам-реципиентам DS с ложной беременностью, с использованием стандартных способов. Химеры были идентифицированы по окрасу покрова; самцов химер F0 скрещивали с самками SD. Зародышевую линию (агути) F1 детенышей генотипировали на наличие целевого аллеля Rosa26; девять из 22 детенышей агути генотипировали как гетерозиготных по локусу Rosa26 (Таблица 6).Obtaining a chimera and transmission through the germline and using the target Rosa26 kESCs. Newly validated target rRosa26 clones were microinjected into SD blastocysts, which were then transferred to female DS recipients with pseudopregnancy using standard methods. Chimeras were identified by the color of the cover; F0 male chimeras were crossed with SD females. The germline (agouti) F1 pups were genotyped for the target Rosa26 allele; nine of 22 agouti pups were genotyped as heterozygous for the Rosa26 locus (Table 6).
Пример 3: Деривация крысиных эмбриональных стволовых клеток.Example 3: Derivation of Rat Embryonic Stem Cells.
Протокол суперовуляции для крысRat Superovulation Protocol
День 0: вводят инъекцию сыворотки беременной кобылы: ИП, 20 Ед (0,4 мл). День 1: действий не проводятDay 0: Inject pregnant mare serum: PI, 20 U (0.4 ml). Day 1: no action
День 2: (через 46 часов): вводят инъекцию hCG, ИП, 50 Ед (1 мл). - проводят спаривания самок по одной.Day 2: (after 46 hours): Injection of hCG, PI, 50 U (1 ml). - conduct mating females one at a time.
День 3: проверяют наличие копулятивных пробок. У самок имеются копулятивные пробки. Это день 0,5.Day 3: Check for copulatory plugs. Females have copulatory plugs. This is day 0.5.
День 6 (е3.5): Подвергают эвтаназии самок и вымывают эмбрионы.Day 6 (e3.5): Euthanize the females and wash the embryos.
Протокол деривации ЭС клеток (супер овуляция)ES Cell Derivation Protocol (Super Ovulation)
День 0:Day 0:
1) Подвергают эвтаназии самок крыс с использованием СО2.1) Subjected to euthanasia of female rats using CO 2 .
2) Протирают вентральную часть живота 70% этанола; с помощью ножниц вскрывают брюшную стенку с экспонированием внутренних органов.2) Wipe the ventral abdomen with 70% ethanol; using scissors, the abdominal wall is opened with exposure of the internal organs.
3) Отсекают маточные трубы и рога матки и помещают их в чашку с культурой ткани, содержащую теплую среду N2B27. Отмывают кровь максимально, насколько это возможно, и переносят в новую чашку с N2B27.3) Cut off the fallopian tubes and uterine horns and place them in a tissue culture dish containing warm N2B27 medium. Wash the blood as much as possible and transfer it to a new dish with N2B27.
4) Используя шприц на 1 мл и тупую иглу калибра 27G, промывают средой рога матки и маточные трубы, чтобы извлечь бластоцисты в среду.4) Using a 1 ml syringe and a 27G blunt needle, flush the uterine horns and fallopian tubes with medium to remove the blastocysts into the medium.
5) Бластоцисты собирают ротовой пипеткой и переносят на чашку для культивирования эмбриона, содержащую KSOM+2i (1 мкМ PD0325901, 3 мкМ CHIR99021). KSOM представляет собой культуральную среду, производимую компанией Millipore. Номер по каталогу MR-106-D.5) Blastocysts are harvested with a mouth pipette and transferred to an embryo culture dish containing KSOM+2i (1 μM PD0325901, 3 μM CHIR99021). KSOM is a culture medium manufactured by Millipore. Part number MR-106-D.
6) Культивирование проводят в течение ночи при температуре 37°С; 7,5% СО2.6) Cultivation is carried out overnight at a temperature of 37°C; 7.5% CO 2 .
Протокол деривации ЭС клеток (замороженные эмбрионы)ES cell derivation protocol (frozen embryos)
День 0:Day 0:
1) Оттаивают замороженные 8-клеточные эмбрионы (приобретенные из коммерческих источников) в среде М2. Культивирование проводят в течение 10 минут при комнатной температуре.1) Thaw frozen 8-cell embryos (purchased from commercial sources) in M2 medium. Cultivation is carried out for 10 minutes at room temperature.
2) Переносят в KSOM+2i и культивируют в течение ночи.2) Transfer to KSOM+2i and culture overnight.
Протокол деривации ЭС клеток (аналогичен для обоих)Protocol for derivation of ES cells (similar for both)
День 1:Day 1:
1) Переносят эмбрионы с наличием полости в среду 2i и культивируют в течение ночи.1) Transfer the cavity-embryos to medium 2i and culture overnight.
2) Культивирование эмбрионов без сформированной полости продолжают в среде KSOM+2i.2) Cultivation of embryos without formed cavity is continued in KSOM+2i medium.
День 2:Day 2:
1) Все оставшиеся эмбрионы переносят в среду 2i (независимо от того, произошло ли образование в них полости).1) All remaining embryos are transferred to medium 2i (regardless of whether or not cavity formation has occurred).
2) Культивирование проводят в течение ночи; продолжают культивирование ранних эмбрионов в среде 2i.2) Cultivation is carried out during the night; continue culturing early embryos in medium 2i.
День 3:Day 3:
1) Перенесенные эмбрионы обрабатывают 30 60 секунд кислотой Тироде для удаления блестящей оболочки яйцеклетки.1) Transferred embryos are treated with Tyrode's acid for 30-60 seconds to remove the zona pellucida.
2) Эмбрионы промывают 3 раза в среде 2i для удаления кислоты Тироде.2) Embryos are washed 3 times in medium 2i to remove Tyrode's acid.
3) Каждый эмбрион депонируют в отдельной лунке 96-луночного питающего планшета (лунка содержит монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ).3) Each embryo is deposited in a separate well of a 96-well feeding plate (the well contains a monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEF).
4) Культивирование проводят в течение ночи в среде 2i.4) Cultivation is carried out overnight in medium 2i.
День 4-5:Day 4-5:
1) Высеянные эмбрионы наблюдают на наличие разрастания (аморфная недифференцированная масса клеток). Разрастания готовы для переноса, когда их размер увеличивается в два раза по сравнению с размером высеянного эмбриона.1) Seeded embryos are observed for the presence of growth (amorphous undifferentiated mass of cells). Sprouts are ready for transfer when they double in size compared to the seeded embryo.
2) Каждый день истощенную среду удаляют микропипеткой и заменяют свежей средой 2i.2) Every day, depleted medium is removed with a micropipette and replaced with fresh medium 2i.
3) Переносят разрастания в новые питающие лунки:3) Transfer growths to new feeding wells:
a. Удаляют истощенную среду, и лунки аккуратно промывают ФСБ.a. The depleted medium is removed and the wells are gently washed with PBS.
b. Удаляют ФСБ и добавляют 30 мкл 0,05% трипсина; инкубируют в течение 10 минут.b. Remove the PBS and add 30 μl of 0.05% trypsin; incubated for 10 minutes.
c. Реакцию с трипсином останавливают добавлением 30 мкл среды 2i и 10% ФБС.c. The trypsin reaction is stopped by adding 30 μl of medium 2i and 10% FBS.
d Клетки осторожно диссоциируют микропипеткой, и все содержимое лунки переносят в новую лунку в 24-луночный фидерный планшет. Это называют «пересев 1» (Р1).d The cells are gently dissociated with a micropipette and the entire contents of the well are transferred to a new well in a 24-well feeder plate. This is called "reseeding 1" (P1).
е. Культивирование проводят в течение ночи в среде 2i.e. Cultivation is carried out overnight in medium 2i.
День 5-8: (выбор времени зависит от того, как быстро растет каждая линия)Day 5-8: (timing depends on how fast each line grows)
1) Среду меняют каждый день (среда 2i) и наблюдают на наличие колоний, имеющих морфологию ЭСК.1) The medium is changed every day (medium 2i) and observed for the presence of colonies having ESC morphology.
2) После того, как появляются такие колонии, культивирование продолжают до достижения ~50% слияния.2) Once such colonies appear, continue culturing until ~50% confluence is reached.
3) Колонии подвергают воздействию трипсина и пересевают как раньше; высевают на питающие планшеты, 1 лунка на линию, в 6-луночную чашку. Это называют «пересев 2» (Р2).3) Colonies are exposed to trypsin and subcultured as before; plated on nutrient plates, 1 well per line, in a 6-well dish. This is called "reseeding 2" (P2).
Продолжение:Continuation:
1) Питание и наблюдение за каждой линией продолжают до тех пор, пока не произойдет около 50% слияния.1) Feeding and observation of each line is continued until about 50% confluence occurs.
2) Клетки, как обычно, обрабатывают трипсином.2) Cells are trypsinized as usual.
3) Реакцию с трипсином останавливают добавлением среды 2i и 10% ФБС; клетки осаждают центрифугированием (5 минут, 1200 оборотов в минуту в настольной центрифуге Beckman-Coulter).3) The reaction with trypsin is stopped by adding medium 2i and 10% FBS; cells are pelleted by centrifugation (5 minutes, 1200 rpm in a Beckman-Coulter benchtop centrifuge).
4) Аспирируют супернатант, и осторожно ре суспендируют клетки в 400 мкл среды для замораживания (70% 2i, 20% ФБС, 10% ДМСО).4) Aspirate the supernatant and carefully resuspend the cells in 400 µl of freezing medium (70% 2i, 20% PBS, 10% DMSO).
5) Клетки распределяют в 2 флакона и замораживают при температуре -80°. Это называют «пересев 3» (Р3).5) Cells are dispensed into 2 vials and frozen at -80°. This is called "reseeding 3" (P3).
6) Для длительного хранения флаконы переносят на хранение в жидкий N2.6) For long-term storage, the vials are transferred to storage in liquid N 2 .
Среду 2i готовят так, как показано ниже в Таблице 7.Medium 2i is prepared as shown in Table 7 below.
Материалы: Гонадотропин сыворотки беременной кобылы (PMSG)Materials: Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)
Хорионический гонадотропин человека из мочи беременной женщины (HCG)Human chorionic gonadotropin from the urine of a pregnant woman (HCG)
Самки крыс (в возрасте 5-12 недель)Female rats (aged 5-12 weeks)
Самцы крыс (в возрасте от 12 недель до 8 месяцев), один на клеткуMale rats (
Шприцы/иглыSyringes/needles
Виварий с осветлением с 6:00 до 18:00Vivarium with lighting from 6:00 to 18:00
Процедура:Procedure:
День 1: 8:00-10:00 утраDay 1: 8:00-10:00 am
Введение самкам инъекций 20 ME PMSG (0,4 мл), ИПAdministration to females of injections of 20 IU PMSG (0.4 ml), IP
Утилизация неиспользованного PMSG.Disposal of unused PMSG.
День 3: 8:00-10:00 утра (через 48 часов после инъекции PMSG)Day 3: 8:00-10:00 am (48 hours after PMSG injection)
Введение самкам инъекций 50 ME HCG (1 мл), ИПAdministering to females injections of 50 IU HCG (1 ml), PI
Размещение одной самки на одного самца в клетке для спаривания.Placing one female per male in a mating cage.
Утилизация неиспользованного HCG.Dispose of unused HCG.
День 4: 8:00-10:00 утра (через 24 часа после инъекции HCG)Day 4: 8:00-10:00 am (24 hours after HCG injection)
Проверяют наличие копулятивных пробок у самок.Check for copulatory plugs in females.
Поставщики гормоновHormone Suppliers
PMSG: Sigma #G-4877 (1000 ME). Ресуспендируют в ФСБ до конечной [] 50 МЕ/мл. Хранят при температуре -20° в аликвотах по 1 мл.PMSG: Sigma #G-4877 (1000 ME). Resuspend in PBS to a final []50 IU/mL. Store at -20°C in 1 ml aliquots.
HCG: Sigma #CG-5 (5000 ME). Ресуспендируют в ФСБ до конечной [] 50 МЕ/мл. Хранят при температуре -20° в аликвотах по 1 мл.HCG: Sigma #CG-5 (5000 I.U.). Resuspend in PBS to a final []50 IU/mL. Store at -20°C in 1 ml aliquots.
Пример 4: Кариотипирование линий крысиных эмбриональных стволовых клеток.Example 4: Karyotyping of Rat Embryonic Stem Cell Lines.
Линию крысиных ЭС клеток, полученную в настоящем изобретении, кариотипировали, результаты приведены в Таблицах 8-11.The rat ES cell line obtained in the present invention was karyotyped, the results are shown in Tables 8-11.
Пример 5: Электропорания вектора в эмбриональную стволовую клетку крысыExample 5 Electroporation of a Vector into a Rat Embryonic Stem Cell
1. Пересевают крысиные ЭС клетки за 24-48 часов до электропорации.1. Reseeded rat ES cells 24-48 hours prior to electroporation.
2. Производят замену среды на RVG2i+ROCKi (10 мкМ Y-27632) за 24 часа до электропорации.2. Change medium to RVG2i+ROCKi (10 μM Y-27632) 24 hours prior to electroporation.
3. Производят замену среды за 30 минут до обработки трипсином.3. Change medium 30 minutes prior to trypsin treatment.
4. Делят на аликвоты ДНК для электропорации.4. Aliquot the DNA for electroporation.
5. Дают возможность ДНК нагреться до КТ в течение >10 мин.5. Allow the DNA to warm up to RT for >10 min.
6. Нагревают ДНК в течение 5 минут при 62°С. Помещают ДНК на лед.6. Heat the DNA for 5 minutes at 62°C. Place the DNA on ice.
7. Проводят обработку клеток трипсином:7. Cells are treated with trypsin:
a. Собирают плавающие колонии. Промывают планшет, чтобы собрать максимально возможное количество плавающих колоний.a. Gather floating colonies. Wash the plate to collect as many floating colonies as possible.
b. Осаждают колонии: 3 минуты при 750 оборотах в минуту.b. Settle colonies: 3 minutes at 750 rpm.
c. Промывают осадок 1×5-10 мл ФСБ и снова центрифугируют/осаждают.c. Wash the pellet with 1 x 5-10 ml PBS and centrifuge/pelt again.
d Аспирируют супернатант; добавляют 500λ трипсина, 0,05%+1% куриной сыворотки.d Aspirate the supernatant; add 500λ trypsin, 0.05% + 1% chicken serum.
i. Не объединяйте более чем 1 10 см планшет с колониями на пробирку. Если в нижней части пробирки во время обработки трипсином упаковано слишком много колоний, они будут слипаться в комки и большинство клеток будет потеряно.i. Do not combine more than 1 10 cm colony plate per tube. If too many colonies are packed in the bottom of the tube during trypsinization, they will clump together and most of the cells will be lost.
e. 4 минуты при 37°. Пипетируют колонии несколько раз, чтобы свести к минимуму образование комков.e. 4 minutes at 37°. Pipette the colonies several times to minimize clumping.
f. Повторяют стадии 1-2 X: 4 минуты при 37°.f. Repeat steps 1-2 X: 4 minutes at 37°.
g. Реакцию с трипсином останавливают добавлением 500λ RVG2i+10% ФБС.g. The trypsin reaction is stopped by adding 500λ RVG2i+10% FBS.
8. Осаждают клетки: 5 минут при 1200 оборотах в минуту.8. Sediment the cells: 5 minutes at 1200 rpm.
9. Ре суспендируют клетки в 10 мл ФСБ. Подсчитывают две аликвоты по 20λ, чтобы определить общее число клеток.9. Resuspend cells in 10 ml PBS. Two aliquots of 20λ are counted to determine the total number of cells.
10. Осаждают клетки (5 мин./1200 оборотов в минуту); рассчитывают общее число клеток и общий объем ресуспендирования, чтобы достичь правильной концентрации клеток (целевое кол-во/75 мкл буфера ЕР).10. Sediment the cells (5 min/1200 rpm); calculate the total number of cells and the total volume of resuspension to achieve the correct concentration of cells (target number/75 μl of buffer EP).
11. Ресуспендируют в минимальном объеме буфера ЕР; измеряют общий объем и корректируют до целевого объема с помощью буфера ЕР. Буфер для электропорации приобретают у Millipore. Номер по каталогу ES-003-D. См., публикацию Valenzuela et al. (2003) Nature Biotechnology 21: 652-659, которая включена в данный документ посредством ссылки.11. Resuspend in a minimum volume of buffer EP; the total volume is measured and adjusted to the target volume with EP buffer. Electroporation buffer was purchased from Millipore. Part number ES-003-D. See Valenzuela et al. (2003) Nature Biotechnology 21: 652-659, which is incorporated herein by reference.
12. Добавляют 75λ клеток к 50λ ДНК; переносят раствор 125λ клеток/ДНК в одну лунку 48-луночной кюветы ВТХ.12. Add 75λ cells to 50λ DNA; transfer the 125λ cell/DNA solution to one well of a 48-well BTX cuvette.
а. Наполняют пустые лунки в том же столбце 125λ буфера ЕР.a. Fill empty wells in the same column with 125λ of EP buffer.
13. Кювету подвергают воздействию одного импульса в электропораторе ВТХ:13. The cuvette is exposed to one pulse in the BTX electroporator:
а. Параметры: 400 В; Ω; 100 мкФ (параметры могут изменяться)a. Options: 400 V; Ω; 100 uF (parameters subject to change)
14. Помещают кювету на лед на 15 минут для восстановления.14. Place the cuvette on ice for 15 minutes to recover.
15. Отбирают клетки в 5 мл RVG2i+10 мкМ ROCKi.15. Select cells in 5 ml RVG2i + 10 μM ROCKi.
16. Добавляют к 15 см планшету с 20 мл RVG2i+10 мкМ ROCKi. Планшет содержит 2х neoR МЭФ (или другие МЭФ в зависимости от проекта). Селективный маркер neoR представляет собой ген неомицинфосфотрансферазы (neo), публикация Beck et at. (1982) Gene, 19: 327-36 или патент США №7205148 или 6596541, которые включены в данный документ посредством ссылки.16. Add to 15 cm plate with 20 ml RVG2i + 10 μM ROCKi. The tablet contains 2x neoR MEFs (or other MEFs depending on the project). The neoR selectable marker is the neomycin phosphotransferase (neo) gene published by Beck et at. (1982) Gene, 19: 327-36 or US Patent No. 7205148 or 6596541, which are incorporated herein by reference.
17. Инкубируют при 37°. Отбор начинают спустя 48 часов.17. Incubate at 37°. Selection starts after 48 hours.
Используемый ингибитор ROCK представлял собой Y-27632.The ROCK inhibitor used was Y-27632.
Пример 6: Отбор целевой генетической модификации в крысиной эмбриональной стволовой клеткеExample 6 Selection of a Targeted Genetic Modification in a Rat Embryonic Stem Cell
1. Пересевают клетки за 24-48 часов до электропорации.1. Cells are subcultured 24-48 hours prior to electroporation.
2. Производят замену среды на RVG2i+ROCKi (10 мкМ Y-27632) за 24 часа до электропорации.2. Change medium to RVG2i+ROCKi (10 μM Y-27632) 24 hours prior to electroporation.
3. Производят замену среды за 30 минут до обработки трипсином.3. Change medium 30 minutes prior to trypsin treatment.
4. Делят на аликвоты ДНК для электропорации.4. Aliquot the DNA for electroporation.
5. Дают возможность ДНК нагреться до КТ в течение >10 мин.5. Allow the DNA to warm up to RT for >10 min.
6. Нагревают ДНК в течение 5 минут при 62°С. Помещают ДНК на лед.6. Heat the DNA for 5 minutes at 62°C. Place the DNA on ice.
7. Проводят обработку клеток трипсином:7. Cells are treated with trypsin:
h. Собирают плавающие колонии. Промывают планшет, чтобы собрать максимально возможное количество плавающих колоний.h. Gather floating colonies. Wash the plate to collect as many floating colonies as possible.
i. Осаждают колонии: 3 минуты при 750 оборотах в минуту.i. Settle colonies: 3 minutes at 750 rpm.
j. Промывают осадок 1×5-10 мл ФСБ и снова центрифугируют/осаждают.j. Wash the pellet with 1 x 5-10 ml PBS and centrifuge/pelt again.
k. Аспирируют супернатант; добавляют 500λ трипсина, 0,05%+1% куриной сыворотки.k. Aspirate the supernatant; add 500λ trypsin, 0.05% + 1% chicken serum.
i. Не объединяйте более чем 1 10 см планшет с колониями на пробирку. Если в нижней части пробирки во время обработки трипсином упаковано слишком много колоний, они будут слипаться в комки и большинство клеток будет потеряно.i. Do not combine more than 1 10 cm colony plate per tube. If too many colonies are packed in the bottom of the tube during trypsinization, they will clump together and most of the cells will be lost.
1. 4 минуты при 37°. Пипетируют колонии несколько раз, чтобы свести к минимуму образование комков.1. 4 minutes at 37°. Pipette the colonies several times to minimize clumping.
m. Повторяют 1-2 раза: 4 минуты при 37°.m. Repeat 1-2 times: 4 minutes at 37°.
n. Реакцию с трипсином останавливают добавлением 500λ RVG2i+10% ФБС.n. The trypsin reaction is stopped by adding 500λ RVG2i+10% FBS.
8. Осаждают клетки: 5 минут при 1200 оборотах в минуту.8. Sediment the cells: 5 minutes at 1200 rpm.
9. Ресуспендируют клетки в 10 мл ФСБ. Подсчитывают две аликвоты по 20λ, чтобы определить общее число клеток.9. Resuspend cells in 10 ml PBS. Two aliquots of 20λ are counted to determine the total number of cells.
10. Осаждают клетки (5 мин./1200 оборотов в минуту); рассчитывают общее число клеток и общий объем ресуспендирования, чтобы достичь правильной концентрации клеток (целевое кол-во/75 мкл буфера ЕР).10. Sediment the cells (5 min/1200 rpm); calculate the total number of cells and the total volume of resuspension to achieve the correct concentration of cells (target number/75 μl of buffer EP).
11. Ресуспендируют в минимальном объеме буфера ЕР; измеряют общий объем и корректируют до целевого объема с помощью буфера ЕР.11. Resuspend in a minimum volume of buffer EP; the total volume is measured and adjusted to the target volume with EP buffer.
12. Добавляют 75λ клеток к 50λ ДНК; переносят раствор 125λ клеток/ДНК в одну лунку 48-луночной кюветы ВТХ.12. Add 75λ cells to 50λ DNA; transfer the 125λ cell/DNA solution to one well of a 48-well BTX cuvette.
а. Наполняют пустые лунки в том же столбце 125λ буфера ЕР.a. Fill empty wells in the same column with 125λ of EP buffer.
13. Кювету подвергают воздействию одного импульса в электропораторе ВТХ:13. The cuvette is exposed to one pulse in the BTX electroporator:
а. Параметры: 400 В; 400 В; Ω; 100 мкФ (параметры могут изменяться)a. Options: 400 V; 400 V; Ω; 100 uF (parameters subject to change)
14. Помещают кювету на лед на 15 минут для восстановления.14. Place the cuvette on ice for 15 minutes to recover.
15. Отбирают клетки в 5 мл RVG2i+10 мкМ ROCKi.15. Select cells in 5 ml RVG2i + 10 μM ROCKi.
16. Добавляют к 15 см планшету с 20 мл RVG2i+10 мкМ ROCKi. Планшет содержит 2х neoR МЭФ (или другие МЭФ в зависимости от проекта).16. Add to 15 cm plate with 20 ml RVG2i + 10 μM ROCKi. The tablet contains 2x neoR MEFs (or other MEFs depending on the project).
17. Инкубируют при 37°. Отбор начинают спустя 48 часов.17. Incubate at 37°. Selection starts after 48 hours.
18. Протокол отбора с использованием G418 является следующим:18. The sampling protocol using G418 is as follows:
a. День 2 (2-й день после ЕР): инкубируют клетки в среде 2i с добавлением G418, 75 мкг/мл.a. Day 2 (2nd day after EP): cells are incubated in medium 2i supplemented with G418, 75 μg/ml.
b. День 3: инкубируют клетки в среде 2i без G418b. Day 3: Incubate cells in 2i medium without G418
c. День 4: инкубируют клетки в среде 2i с добавлением G418, 75 мкг/мл.c. Day 4: Incubate cells in medium 2i supplemented with G418, 75 µg/ml.
d. День 5: инкубируют клетки в среде 2i без G418d. Day 5: cells are incubated in medium 2i without G418
e. День 6: инкубируют клетки в среде 2i с добавлением G418, 75 мкг/мл.e. Day 6: Incubate cells in medium 2i supplemented with G418, 75 μg/ml.
f. День 7: инкубируют клетки в среде 2i без G418f. Day 7: cells are incubated in medium 2i without G418
g. День 8: инкубируют клетки в среде 2i с добавлением G418, 75 мкг/мл.g. Day 8: Incubate cells in medium 2i supplemented with G418, 75 μg/ml.
h. День 9: инкубируют клетки в среде 2i без G418h. Day 9: cells are incubated in medium 2i without G418
i. День 10: инкубируют клетки в среде 2i с добавлением G418, 75 мкг/мл.i. Day 10: Incubate cells in medium 2i supplemented with G418, 75 µg/ml.
j. День 11: инкубируют клетки в среде 2i без G418j. Day 11: Incubate cells in 2i medium without G418
k. День 12: выбирают колонии для роста и скрининга. Каждую колонию диссоциируют в 0,05% трипсине + 1% куриной сыворотке в течение 10 минут, после чего высевают в 1 лунку 96-луночного питающего планшета.k. Day 12: choose colonies for growth and screening. Each colony is dissociated in 0.05% trypsin + 1% chicken serum for 10 minutes and then seeded in 1 well of a 96-well feeding plate.
19. Выращивают колонии в течение 3 дней в среде 2i.19. Grow colonies for 3 days in medium 2i.
20. Пересевают клоны 1:1 в новые 96-луночные питающие планшеты.20. Subculture the clones 1:1 into new 96-well nutrient plates.
21. Выращивают клоны в течение 3 дней в среде 2i.21. Grow clones for 3 days in medium 2i.
22. Для каждого клона диссоциируют колонии в трипсине. Замораживают 2/3 каждого клона и хранят при температуре -80°; высевают оставшуюся 1/3 на ламининовые планшеты (96-луночные планшеты, покрытые 10 мкг/мл ламинина).22. For each clone, dissociate colonies in trypsin. Freeze 2/3 of each clone and store at -80°; seed the remaining 1/3 onto laminin plates (96-well plates coated with 10 μg/ml laminin).
23. После слияния на ламининовых планшетах, переносят в лабораторию для скрининга для генотипирования клонов.23. After fusion on laminin plates, transfer to a screening laboratory for clone genotyping.
Пример 7: Молекулярная сигнатура крысиных эмбриональных стволовых клетокExample 7 Molecular Signature of Rat Embryonic Stem Cells
Перечисленные в Таблице 13 гены экспрессировались на 20-кратно более высоких уровнях в крысиных ЭС клетках по сравнению с соответствующими генами в мышиных ЭС клетках. Перечисленные в Таблице 12 гены экспрессировались на 20-кратно более низких уровнях в крысиных ЭС клетках по сравнению с соответствующими генами в мышиных ЭС клетках.The genes listed in Table 13 were expressed at 20-fold higher levels in rat ES cells compared to the corresponding genes in mouse ES cells. The genes listed in Table 12 were expressed at 20-fold lower levels in rat ES cells compared to the corresponding genes in mouse ES cells.
Данные микроматрицы в Таблицах 12 и 13 получали следующим образом. Крысиные ЭС клетки (ACI.G2 и DA.2B) и мышиные ЭС клетки (F1H4) культивировали в среде 2i в течение трех пересевов до слияния. Клетки F1H4 культивировали на планшетах, покрытых желатином, при отсутствии питающего слоя. Мышиные ЭС клетки F1H4 получали из 129S6/SvEvTac и C57BL/6NTac гетерозиготных эмбрионов (см., например, патент США №7294754 и публикации Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, А.Т., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007), включенные в данный документ в полном объеме посредством ссылки).The microarray data in Tables 12 and 13 were prepared as follows. Rat ES cells (ACI.G2 and DA.2B) and mouse ES cells (F1H4) were cultured in medium 2i for three passages until confluence. F1H4 cells were cultured on gelatin-coated plates in the absence of a feeding layer. Mouse F1H4 ES cells were obtained from 129S6/SvEvTac and C57BL/6NTac heterozygous embryos (see, for example, US Pat. , L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007), incorporated herein in their entirety via link).
Следующий протокол использовали для приготовления образцов:The following protocol was used for sample preparation:
Материалы включали: реагент тризол; буфер для лизиса РНК (Zymo Kit); и пробирки Эппендорф объемом 1,5 мл.Materials included: reagent trizol; RNA lysis buffer (Zymo Kit); and Eppendorf tubes with a volume of 1.5 ml.
На этикетках пробирок Эппендорф объемом 1,5 мл указывали идентификатор образца. Клетки, выращенные на планшете, промывали 37С ФСБ. Удаляли ФСБ и добавляли 300 мкл тризола. Для разрушения клеток в тризоле использовали шпатель. Лизированные клетки собирали в тризол в пробирки Эппендорф объемом 1,5 мл. Клетки, выращенные в суспензии, промывали 37С ФСБ. Клетки собирали в пробирки объемом 1,5 мл, клетки центрифугировали, удаляли ФСБ и добавляли 300 мкл тризола. Клетки пипетировали вверх и вниз для разрушения клеток. Образцы сортировали для FACS с 101-105 клеток, объем концентрировали до менее чем 100 мкл. Добавляли 4 объема буфера для лизиса РНК и смешивали при помощи пипетирования. Например, к 80 мкл образца добавляли 320 мкл буфера для лизиса РНК. Образцы хранили при температуре -20°С.The 1.5 ml Eppendorf tubes were labeled with the sample identifier. The cells grown on the plate were washed with 37C PBS. PBS was removed and 300 µl of trizol was added. A spatula was used to destroy cells in Trizol. Lysed cells were collected in Trizol in 1.5 ml Eppendorf tubes. Cells grown in suspension were washed with 37C PBS. The cells were collected in 1.5 ml tubes, the cells were centrifuged, the PBS was removed, and 300 μl of Trizol was added. Cells were pipetted up and down to disrupt the cells. Samples were sorted for FACS from 10 1 -10 5 cells, the volume was concentrated to less than 100 μl. 4 volumes of RNA lysis buffer were added and mixed by pipetting. For example, 320 µl of RNA lysis buffer was added to 80 µl of sample. Samples were stored at -20°C.
РНК-секвенирование использовали для измерения уровня экспрессии мышиных и крысиных генов. Результаты секвенирования картировали относительно эталонного генома мыши и крысы при помощи программного обеспечения Tophat и RPKM (фрагменты на тысячу оснований экзона на миллион картированных остатков) и рассчитывали для мышиных и крысиных генов. Гены гомологии были выбраны на основе символа гена, а затем для сравнения уровня экспрессии гена между мышью и крысой использовали t-тест.RNA sequencing was used to measure the level of expression of mouse and rat genes. Sequencing results were mapped against a reference mouse and rat genome using Tophat software and RPKM (fragments per thousand exon bases per million mapped residues) and calculated for mouse and rat genes. Homology genes were selected based on the gene symbol and then a t-test was used to compare the level of gene expression between mouse and rat.
miR-632 находится в 10 наиболее экспрессируемых в ЭСК крысы, но они не экспрессировались в ЭС клетках мыши. Поэтому нет сравнительных данных для этих генов. На основании уровней экспрессии по сравнению с другими генами и их известной функции в эмбриональном развитии, экспрессию miR-632 использовали в качестве маркера для крысиных ЭС клеток.miR-632 is in the top 10 most expressed in rat ESCs, but they were not expressed in mouse ES cells. Therefore, there are no comparative data for these genes. Based on expression levels compared to other genes and their known function in embryonic development, miR-632 expression was used as a marker for rat ES cells.
Также была разработана дополнительная молекулярная сигнатура с использованием маркеров/генов плюрипотентности крысиных ЭС клеток. В Таблице 15 представлен список генов и ранги их экспрессии из профилирования данных РНК. мРНК выделяли из крысиных ЭС клеток и уровень экспрессии различных маркеров плюрипотентности сравнивали друг с другом. Перечисленные «гены плюрипотентности» представляют собой гены, используемые другими группами (в основном у мыши, но также у крысы) в качестве маркеров ЭС клеток. Мезодермальный, энтодермальный и нейронный гены определяются аналогичным образом. Определение «ранг» относится к экспрессии в эксперименте, проведенном авторами изобретения: чем выше ранг (1 является самым высоким), тем выше экспрессия. Например, ранг Oct4's равный 13 означает, что из всех генов, которые анализировали, экспрессия этого гена была выше всех, кроме 12 генов. Фоновым в этом эксперименте был любой уровень экспрессии ниже 30; 6107 генов имели уровни экспрессии 30 или выше.An additional molecular signature was also developed using rat ES cell pluripotency markers/genes. Table 15 provides a list of genes and their expression ranks from RNA profiling data. mRNA was isolated from rat ES cells and the expression levels of various pluripotency markers were compared with each other. The "pluripotency genes" listed are genes used by other groups (mostly in the mouse, but also in the rat) as markers for ES cells. Mesodermal, endodermal and neuronal genes are defined in a similar way. The definition of "rank" refers to the expression in the experiment conducted by the inventors: the higher the rank (1 being the highest), the higher the expression. For example, an Oct4's rank of 13 means that of all the genes analyzed, the expression of this gene was higher than all but 12 genes. Background in this experiment was any expression level below 30; 6107 genes had expression levels of 30 or higher.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, указывают на уровень специалистов в области техники, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в настоящее описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана как включенная посредством ссылки. Если иное не очевидно из контекста, любой вариант реализации изобретения, аспект, стадия или особенность настоящего изобретения могут быть использованы в сочетании с любыми другими. Ссылка на диапазон включает любые целые числа в пределах диапазона, любой поддиапазон в пределах диапазона. Ссылка на множество диапазонов включает в себя композицию таких диапазонов.All publications and patent applications mentioned in the present description indicate the level of specialists in the field of technology to which this invention pertains. All publications and patent applications are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication or patent application were specifically and individually indicated as being incorporated by reference. Unless otherwise clear from the context, any embodiment, aspect, step or feature of the present invention may be used in conjunction with any others. A range reference includes any integers within the range, any subrange within the range. Reference to a plurality of ranges includes composition of such ranges.
--->--->
Перечень последовательностейSequence listing
<110> Lee, Jeffrey D.<110> Lee, Jeffrey D.
Auerbach, Wojtek Auerbach, Wojtek
Heslin, David Heslin, David
Frendewey, David Fredewey, David
Lai, Ka-Man Venus Lai, Ka-Man Venus
Valenzuela, David M. Valenzuela, David M.
<120> Генетическая модификация крыс<120> Genetic modification of rats
<130> 057766/441914<130> 057766/441914
<150> US 61/767,093 <150> US 61/767,093
<151> 2013-02-20 <151> 2013-02-20
<160> 1<160> 1
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1<210> 1
<211> 203<211> 203
<212> ФРТ<212> FRT
<213> Mus Musculus<213> Mus Musculus
<400> 1<400> 1
Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Val LeuMet Lys Val Leu Ala Ala Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
His Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val AsnHis Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn
20 25 30 20 25 30
Ala Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Gly Asn Leu Met Asn GlnAla Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Gly Asn Leu Met Asn Gln
35 40 45 35 40 45
Ile Lys Asn Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu PheIle Lys Asn Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe
50 55 60 50 55 60
Ile Ser Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val GluIle Ser Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Leu Cys Ala Pro Asn Met Thr Asp Phe Pro Ser Phe His Gly AsnLys Leu Cys Ala Pro Asn Met Thr Asp Phe Pro Ser Phe His Gly Asn
85 90 95 85 90 95
Gly Thr Glu Lys Thr Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Met Val Ala TyrGly Thr Glu Lys Thr Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Met Val Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Leu Ser Ala Ser Leu Thr Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Val Leu AsnLeu Ser Ala Ser Leu Thr Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Val Leu Asn
115 120 125 115 120 125
Pro Thr Ala Val Ser Leu Gln Val Lys Leu Asn Ala Thr Ile Asp ValPro Thr Ala Val Ser Leu Gln Val Lys Leu Asn Ala Thr Ile Asp Val
130 135 140 130 135 140
Met Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Asn Lys TyrMet Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Asn Lys Tyr
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Val Gly His Val Asp Val Pro Pro Val Pro Asp His Ser Asp LysArg Val Gly His Val Asp Val Pro Pro Val Pro Asp His Ser Asp Lys
165 170 175 165 170 175
Glu Ala Phe Gln Arg Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Thr TyrGlu Ala Phe Gln Arg Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Lys Gln Val Ile Ser Val Val Val Gln Ala PheLys Gln Val Ile Ser Val Val Val Gln Ala Phe
195 200 195 200
<---<---
Claims (94)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361767093P | 2013-02-20 | 2013-02-20 | |
| US61/767,093 | 2013-02-20 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015139350A Division RU2690352C2 (en) | 2013-02-20 | 2014-02-20 | Genetic modification of rats |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019114118A RU2019114118A (en) | 2019-05-31 |
| RU2019114118A3 RU2019114118A3 (en) | 2021-12-29 |
| RU2774076C2 true RU2774076C2 (en) | 2022-06-15 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997030151A1 (en) * | 1996-02-16 | 1997-08-21 | The University Of Edinburgh | Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation |
| US20120272349A1 (en) * | 2009-12-01 | 2012-10-25 | Ds Pharma Biomedical Co., Ltd. | Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997030151A1 (en) * | 1996-02-16 | 1997-08-21 | The University Of Edinburgh | Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation |
| US20120272349A1 (en) * | 2009-12-01 | 2012-10-25 | Ds Pharma Biomedical Co., Ltd. | Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PING L, et al. Germline Competent Embryonic Stem Cells Derived from Rat Blastocyst, Cell, 200, Vol. 135, N.7, pp.1299-1310. * |
| ВЕРХОВСКАЯ Л.З. и др. Действие алкоксизамещенных глицерина на морфофункциональные свойства перевиваемой культуры клеток, Криобиология. 1990; 1:30-33. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6758440B2 (en) | Genetic recombination in rats | |
| US11820997B2 (en) | Methods and compositions for the targeted modification of a genome | |
| AU2020233694A1 (en) | Targeted modification of rat genome | |
| EP3080279B1 (en) | Methods and compositions for the targeted modification of a genome | |
| RU2774076C2 (en) | Rat genetic modification | |
| NZ711775B2 (en) | Genetic modification of rats |