RU2774032C1

RU2774032C1 - Method for increasing the effectiveness of ionizing radiation on melanoma

Info

Publication number: RU2774032C1
Application number: RU2021135499A
Authority: RU
Inventors: Ирина Александровна Замулаева; Алла Владимировна Борейко; Александр Николаевич Бугай; Андрей Дмитриевич Каприн; Сергей Николаевич Корякин; Евгений Александрович Красавин; Ольга Николаевна Матчук; Вера Алексеевна Мосина; Елена Ивановна Селиванова; Владимир Николаевич Чаусов
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2022-06-14

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, in particular to oncology and radiology, and can be used to increase the effectiveness of ionizing radiation on melanoma. The method includes the action of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (AraC) on cells and subsequent irradiation with a beam of protons or γ-quanta. AraC is administered in vivo intravenously at the rate of 125 mg/kg 1 hour before local irradiation of melanoma at a dose of 10 Gy.

EFFECT: use of the invention makes it possible to increase the effectiveness of ionizing radiation on melanoma by increasing the number of double-strand breaks (DR) of DNA.

1 cl, 8 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и радиологии, и может быть использовано для повышения эффективности лучевой терапии меланомы.The invention relates to medicine, in particular to oncology and radiology, and can be used to increase the effectiveness of radiation therapy for melanoma.

В индустриально развитых странах более 50% онкологических больных получают лучевую терапию в виде основного, адъювантного, неоадъювантного и паллиативного лечения. Со временем роль ионизирующих излучений в лечении злокачественных новообразований (ЗНО) не только не уменьшается, но даже возрастает, что, с одной стороны, связано с постоянным совершенствованием существующих и внедрением новых методов лучевого лечения (адронная, бинарная, тканевая, фотодинамическая терапия и др.), а, с другой стороны, обусловлено органосохраняющей направленностью лучевого воздействия на пораженный орган, позволяющей достичь выздоровления на фоне хорошей социальной и семейной реабилитации. Вместе с тем следует признать, что у части больных не удается добиться удовлетворительного клинического эффекта из-за высокой радиорезистентности ЗНО. In industrialized countries, more than 50% of cancer patients receive radiation therapy in the form of basic, adjuvant, neoadjuvant and palliative treatment. Over time, the role of ionizing radiation in the treatment of malignant neoplasms (MNT) not only does not decrease, but even increases, which, on the one hand, is associated with the constant improvement of existing and the introduction of new methods of radiation treatment (hadron, binary, tissue, photodynamic therapy, etc.). ), and, on the other hand, is due to the organ-preserving direction of the radiation exposure to the affected organ, which makes it possible to achieve recovery against the background of good social and family rehabilitation. At the same time, it should be recognized that in some patients it is not possible to achieve a satisfactory clinical effect due to the high radioresistance of MN.

Как известно, меланома кожи является одной из самых агрессивных опухолей и характеризуется ранним метастазированием. Основным методом лечения меланомы является хирургический, по показаниям дополняющийся системной терапией. As you know, melanoma of the skin is one of the most aggressive tumors and is characterized by early metastasis. The main method of treatment of melanoma is surgical, supplemented by systemic therapy according to indications.

Однако в случаях невозможности хирургического иссечения первичной опухоли локальная лучевая терапия является рекомендованным методом лечения первичной меланомы кожи (Клинические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации «Меланома кожи и слизистых оболочек», Версия 1.2019; Строяковский Д.Л., Абрамов М.Е., Демидов Л.В., Новик А.В., Орлова К.В., Проценко С.А, Самойленко И.В., Трофимова О.П., Харкевич Г.Ю., Юрченков А.Н. Практические рекомендации по лекарственному лечению меланомы кожи // Злокачественные опухоли. 2019. Том 9. № 3s2. С. 243-258). Кроме того, в исследованиях последних лет продемонстрирована целесообразность проведения лучевой терапии после радикальной лимфаденэктомии в адъювантном режиме (с использованием противоопухолевых препаратов) при высоком риске регионарного рецидива. Поэтому совершенствование лучевой терапии меланомы (как и других ЗНО) является актуальной проблемой радиационной онкологии. Ряд специалистов в этой области полагает, что в целом, современные методики радиотерапии вплотную приблизились к потолку возможностей компьютерного и технологического обеспечения. Перспективы дальнейшего повышения эффективности лучевой терапии могут быть связаны, прежде всего, с разработкой новых радимодификаторов, сенсибилизирующих опухолевые клетки или защищающих нормальные от радиационных повреждений.However, in cases where it is impossible to surgically excise the primary tumor, local radiation therapy is the recommended treatment for primary skin melanoma (Clinical recommendations of the Ministry of Health of the Russian Federation "Melanoma of the skin and mucous membranes", Version 1.2019; Stroyakovsky D.L., Abramov M.E., Demidov L. .V., Novik A.V., Orlova K.V., Protsenko S.A., Samoilenko I.V., Trofimova O.P., Kharkevich G.Yu., Yurchenkov A.N. Practical recommendations for the drug treatment of melanoma skin // Malignant tumors, 2019, Volume 9, No. 3s2, pp. 243-258). In addition, recent studies have demonstrated the advisability of radiotherapy after radical lymphadenectomy in the adjuvant mode (using antitumor drugs) with a high risk of regional recurrence. Therefore, the improvement of radiation therapy for melanoma (as well as other malignancies) is an urgent problem in radiation oncology. A number of specialists in this field believe that, in general, modern methods of radiotherapy have come close to the ceiling of the possibilities of computer and technological support. Prospects for a further increase in the effectiveness of radiation therapy may be associated primarily with the development of new radiomodifiers that sensitize tumor cells or protect normal cells from radiation damage.

В последние десятилетия разработано множество способов повышения радиочувствительности опухолевых клеток и тканей с помощью малых молекул, макромолекул и наночастиц, реализующих эффекты радиосенсибилизации на основе различных механизмов действия и обладающих своими достоинствами и недостатками, которые делают необходимым поиск новых способов радиосенсибилизации (Wang H., Mu X., He H., Zhang X.-D. Cancer Radiosensitizers // Trends Pharmacol. Sci., 2018, Vol. 39. № 1. P. 24-48).In recent decades, many methods have been developed to increase the radiosensitivity of tumor cells and tissues using small molecules, macromolecules and nanoparticles, which realize the effects of radiosensitization based on various mechanisms of action and have their own advantages and disadvantages, which make it necessary to search for new methods of radiosensitization (Wang H., Mu X ., He H., Zhang X.-D. Cancer Radiosensitizers // Trends Pharmacol. Sci., 2018, Vol. 39. No. 1. P. 24-48).

Среди известных радиосенсибилизаторов заметное место занимают галогенированные аналоги пиримидиновых оснований и нуклеозидов, например, 5-фторурацил, 5-фтордезоксиуридин, бромдезоксиуридин, иоддезоксиуридин, 2’2-дифтордезоксицитидин (гемцитабин) и др. Такие химические соединения или их метаболиты нарушают репликацию ДНК или встраиваются в новосинтезированную ДНК, что при последующем облучении приводит к подавлению репарации повреждений этой молекулы. В итоге, в клетках сохраняется больше радиационно-индуцированных повреждений ДНК, чем в отсутствие таких соединений, а клеточная гибель повышается. Со временем после комбинированного действия таких соединений и ионизирующего излучения количество повреждений ДНК постепенно снижается, хотя и в меньшей степени, чем после одиночного облучения. Among the known radiosensitizers, a prominent place is occupied by halogenated analogues of pyrimidine bases and nucleosides, for example, 5-fluorouracil, 5-fluorodeoxyuridine, bromodeoxyuridine, iododeoxyuridine, 2'2-difluorodeoxycytidine (gemcitabine), etc. Such chemical compounds or their metabolites disrupt DNA replication or are incorporated into newly synthesized DNA, which, upon subsequent irradiation, leads to suppression of the repair of damage to this molecule. As a result, more radiation-induced DNA damage persists in cells than in the absence of such compounds, and cell death increases. Over time, after the combined action of such compounds and ionizing radiation, the amount of DNA damage gradually decreases, although to a lesser extent than after a single exposure.

Снижение количества повреждений ДНК после комбинированного действия вышеупомянутых радиосенсибилизаторов и ионизирующего излучения является недостатком этих способов радиосенсибилизации, что, по-видимому, в конечном итоге определяет их относительно невысокую эффективность и приводит к необходимости применения и других противоопухолевых препаратов в комплексе с радиосенсибилизаторами и облучением (Hennequin C., Guillerm S., Quero L. Combination of chemotherapy and radiotherapy: A thirty years evolution // Cancer/Radiothérapie, 2019. Vol. 23. № 6-7. P. 662-665; Suker M., Beumer B.R., Sadot E., Marthey L., Faris J.E., Mellon E.A., El-Rayes B.F., Wang-Gillam A., Lacy J., Hosein P.J., Moorcraft S.Y., Conroy T., Hohla F., Allen P., Taieb J., Hong T.S., Shridhar R., Chau I., van Eijck C.H., Koerkamp B.G. FOLFIRINOX for locally advanced pancreatic cancer: a systematic review and patient-level meta-analysis // Lancet Oncol., 2016, Vol. 17. № 6. P. 801-810. Clifford R., Govindarajah N., Parsons J.L., Gollins S., West N.P., Vimalachandran D. Systematic review of treatment intensification using novel agents for chemoradiotherapy in rectal cancer // Br. J. Surg., 2018. Vol. 105. № 12. P. 1553-1572).The decrease in the amount of DNA damage after the combined action of the aforementioned radiosensitizers and ionizing radiation is a disadvantage of these methods of radiosensitization, which, apparently, ultimately determines their relatively low efficiency and leads to the need for the use of other antitumor drugs in combination with radiosensitizers and radiation (Hennequin C ., Guillerm S., Quero L. Combination of chemotherapy and radiotherapy: A thirty years evolution // Cancer/Radiothérapie, 2019, Vol. E., Marthey L., Faris J.E., Mellon E.A., El-Rayes B.F., Wang-Gillam A., Lacy J., Hosein P.J., Moorcraft S.Y., Conroy T., Hohla F., Allen P., Taieb J., Hong T.S., Shridhar R., Chau I., van Eijck C.H., Koerkamp B.G. FOLFIRINOX for locally advanced pancreatic cancer: a systematic review and patient-level meta-analysis // Lancet Oncol., 2016, Vol. 17. No. 6. P 801-810 Clifford R., Govindarajah N., Parsons J.L., Gollins S., West N.P., Vimalachandran D. Systematic review of treatment intensification using novel agents for chemoradiotherapy in rectal cancer // Br. J. Surg., 2018. Vol. 105. No. 12. P. 1553-1572).

Этот подход позволяет повысить эффективность лечения ЗНО, но увеличивает его токсичность в отношении нормальных тканей и стоимость. Поэтому поиск новых эффективных способов радиосенсибилизации ЗНО с целью повышения эффективности лучевой терапии не теряет своей актуальности до сих пор.This approach improves the effectiveness of cancer treatment, but increases its toxicity to normal tissues and costs. Therefore, the search for new effective methods of radiosensitization of malignant neoplasms in order to increase the effectiveness of radiation therapy does not lose its relevance until now.

Известно, что наиболее тяжелыми нарушениями, приводящими к клеточной гибели под влиянием ионизирующих излучений, являются двунитевые разрывы (ДР) ДНК. Поэтому повышение количества радиационно-индуцированных ДР является привлекательным подходом к радиосенсибилизации ЗНО и, в конечном итоге, к повышению эффективности лучевой терапии.It is known that the most severe disorders leading to cell death under the influence of ionizing radiation are double-strand breaks (DR) of DNA. Therefore, an increase in the number of radiation-induced DR is an attractive approach to radiosensitization of malignant neoplasms and, ultimately, to an increase in the effectiveness of radiation therapy.

Прототипом настоящего изобретения является способ повышения частоты образования ДР ДНК в клетках человека при применении перед облучением комбинации из официнальных препаратов 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (АраЦ) и гидроксимочевины (RU 2699670 С1). АраЦ (химическое название 4-Амино-1-бета-В-арабинофуранозил-2(1Н)-пиримидинон) является синтетическим нуклеозидом, содержащим арабинозу в углеводной части молекулы. АраЦ (торговые названия цитозар, алексан, цитарабин, цитостадин, цитарабин-ЛЭНС, цитастадин, цитозар НоваМедика) используется в клинике при лечении острых и хронических лейкозов. В присутствии АраЦ и гидроксимочевины происходит ингибирование репарации радиационных повреждений ДНК и, более того, осуществляется трансформация однонитевых разрывов ДНК в двунитевые разрывы в условиях in vitro. Важно, что количество ДР ДНК не только не уменьшается, но даже увеличивается со временем после указанного комбинированного воздействия. Изобретение позволяет повысить эффективность радиационного воздействия на опухолевые клетки по критерию количества ДР ДНК in vitro и уменьшить локальную дозу облучения.The prototype of the present invention is a method for increasing the frequency of DNA DSB formation in human cells when using a combination of official preparations of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (AraC) and hydroxyurea (RU 2699670 C1) before irradiation. AraC (chemical name 4-Amino-1-beta-B-arabinofuranosyl-2(1H)-pyrimidinone) is a synthetic nucleoside containing arabinose in the carbohydrate portion of the molecule. AraC (trade names cytosar, alexan, cytarabine, cytostadin, cytarabine-LANS, cytastadin, cytosar NovaMedica) is used in the clinic in the treatment of acute and chronic leukemia. In the presence of AraC and hydroxyurea, DNA radiation damage repair is inhibited and, moreover, DNA single-strand breaks are transformed into double-strand breaks under in vitro conditions. It is important that the number of DNA DSBs not only does not decrease, but even increases with time after the indicated combined exposure. EFFECT: invention makes it possible to increase the efficiency of radiation exposure to tumor cells in terms of the number of DNA DSBs in vitro and to reduce the local radiation dose.

Недостатком этого способа является отсутствие информации о кинетике формирования и элиминации ДР ДНК в клетках ЗНО после комбинированного воздействия in vivo, а также отсутствие данных об влиянии такого воздействия на размер опухолевого очага. Вместе с тем, радиационный ответ опухолевых клеток в условиях влияния радиомодификаторов in vitro и in vivo может существенно различаться, учитывая влияние в последнем случае многочисленных факторов микроокружения: физических (давление кислорода), химических (pH тканевой среды), гуморальных (сигнальные молекулы TGF-b1, FGF, IL-6, HIF и др.), клеточных (взаимодействие со стромальными клетками, включая эндотелиальные, иммунные клетки, опухоль-ассоциированные макрофаги, фибробласты, нормальные стволовые клетки и др.).The disadvantage of this method is the lack of information on the kinetics of the formation and elimination of DNA DSBs in cancer cells after combined exposure in vivo, as well as the lack of data on the effect of such exposure on the size of the tumor focus. At the same time, the radiation response of tumor cells under the influence of radiomodifiers in vitro and in vivo can differ significantly, taking into account the influence of numerous microenvironmental factors in the latter case: physical (oxygen pressure), chemical (pH of the tissue medium), humoral (signaling molecules TGF-b1 , FGF, IL-6, HIF, etc.), cellular (interaction with stromal cells, including endothelial, immune cells, tumor-associated macrophages, fibroblasts, normal stem cells, etc.).

Технический результат заявляемого изобретения заключается в повышении эффективности действия ионизирующих излучений на меланому за счет увеличения количества ДР ДНК. The technical result of the claimed invention is to increase the effectiveness of ionizing radiation on melanoma by increasing the amount of DNA DSBs.

Технический результат достигается тем, что так же как и в известном способе клетки подвергают воздействию АраЦ, а затем облучают пучком протонов или γ-квантов.The technical result is achieved by the fact that, as in the known method, the cells are exposed to AraC, and then irradiated with a beam of protons or γ-quanta.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что АраЦ вводят in vivo внутривенно из расчета 125 мг/кг за 1 час до локального облучения меланомы в дозе 10 Гр.The peculiarity of the proposed method lies in the fact that AraC is administered in vivo intravenously at the rate of 125 mg/kg 1 hour before local irradiation of melanoma at a dose of 10 Gy.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:The invention is illustrated by a detailed description, examples and illustrations, which show:

Фиг. 1. Двунитевые разрывы ДНК в клетках меланомы линии В16 через 2 суток после локального облучения опухолевого очага пучком протонов в дозе 10 Гр или комбинированного воздействия АраЦ и протонного излучения в той же дозе. По оси ординат: средние значения момента хвоста ± SD.Fig. Fig. 1. DNA double-strand breaks in B16 melanoma cells 2 days after local irradiation of the tumor focus with a proton beam at a dose of 10 Gy or combined exposure to AraC and proton radiation at the same dose. Y-axis: mean tail moment ± SD.

# p<0,001 по сравнению с группой «Контроль»# p<0.001 compared to the Control group

* p<0,001 по сравнению с группой «Облучение (протоны)»* p<0.001 compared to the "Irradiation (protons)" group

Фиг. 2. Двунитевые разрывы ДНК в клетках меланомы линии В16 через 9 суток после локального облучения опухолевого очага пучком протонов в дозе 10 Гр или комбинированного воздействия АраЦ и протонного излучения в той же дозе. По оси ординат: средние значения момента хвоста ± SD.Fig. Fig. 2. DNA double-strand breaks in B16 melanoma cells 9 days after local irradiation of the tumor focus with a proton beam at a dose of 10 Gy or combined exposure to AraC and proton radiation at the same dose. Y-axis: mean tail moment ± SD.

Фиг. 3. Изменение размеров первичного очага меланомы линии В16 в группе контрольных животных и в разные сроки после облучения протонами или комбинированного действия АраЦ и протонного излучения в дозе 10 Гр.Fig. Fig. 3. Change in the size of the primary focus of B16 melanoma in the group of control animals and at different times after proton irradiation or the combined action of AraC and proton radiation at a dose of 10 Gy.

Фиг. 4. Изменение размеров первичного очага меланомы В16 в разные сроки после облучения протонами или комбинированного действия АраЦ и протонного излучения в дозе 10 Гр.Fig. Fig. 4. Change in the size of the primary focus of B16 melanoma at different times after exposure to protons or combined action of AraC and proton radiation at a dose of 10 Gy.

* p<0,05 по сравнению с группой «Облучение (протоны)»* p<0.05 compared to the "Irradiation (protons)" group

Фиг. 5. Торможение роста опухолей в группе комбинированного действия АраЦ и протонного излучения в разные сроки после облучения по сравнению с одиночным действием протонного излучения в дозе 10 Гр.Fig. Fig. 5. Inhibition of tumor growth in the group of combined action of AraC and proton radiation at different times after irradiation compared with a single action of proton radiation at a dose of 10 Gy.

Фиг. 6. Изменение размеров первичного очага меланомы линии В16 в группе контрольных животных и в разные сроки после γ-облучения или комбинированного действия АраЦ и γ-излучения в дозе 10 Гр.Fig. Fig. 6. Change in the size of the primary focus of melanoma line B16 in the group of control animals and at different times after γ-irradiation or combined action of AraC and γ-radiation at a dose of 10 Gy.

Фиг. 7. Изменение размеров первичного очага меланомы В16 в разные сроки после γ-облучения или комбинированного действия АраЦ и γ-излучения в дозе 10 Гр.Fig. Fig. 7. Change in the size of the primary focus of B16 melanoma at different times after γ-irradiation or combined action of AraC and γ-radiation at a dose of 10 Gy.

* p<0,05 по сравнению с группой «Облучение (γ-кванты)»* p<0.05 compared to the group "Irradiation (γ-quanta)"

Фиг. 8. Торможение роста опухолей в группе комбинированного действия АраЦ и γ-излучения в разные сроки после облучения по сравнению с одиночным действием γ-излучения в дозе 10 Гр.Fig. Fig. 8. Inhibition of tumor growth in the group of combined action of AraC and γ-radiation at different times after irradiation compared with a single action of γ-radiation at a dose of 10 Gy.

Способ осуществляют следующим образом.The method is carried out as follows.

Клетки мышиной меланомы линии В16, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), культивируют в полной питательной среде DMEM (ПанЭко, РФ), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) (Gibco, США), пенициллин (50 ед/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) и глютамин (292 мкг/мл), в CO₂ инкубаторе (NuAire, США) в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO₂ при температуре +37°С. Для трансплантации используют опухолевые клетки в логарифмической стадии роста. B16 mouse melanoma cells obtained from the Russian collection of cell cultures (Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg) are cultivated in a complete DMEM nutrient medium (PanEco, RF) containing 10% fetal bovine serum (BSS) (Gibco, USA) , penicillin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml) and glutamine (292 µg/ml) in a CO ₂ incubator (NuAire, USA) in a humidified atmosphere with 5% CO ₂ at +37°C. For transplantation, tumor cells in the logarithmic growth stage are used.

Клетки снимают с подложки в среду DMEM в концентрации 2,0⋅10⁶кл/мл, затем вводят внутримышечно по 200 тыс. клеток в заднюю правую лапу мышей линии С57Bl/6j в возрасте 1,5-2,0 мес с массой тела 20 г (Питомник лабораторных животных «Андреевка» - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства России). Через 9 суток после трансплантации опухолевых клеток начинают проводить визуальный контроль первичного очага меланомы. Формируют группы животных с одинаковым средним размером опухолевого очага: 1) контроль (интактные животные-опухоленосители); 2) облучение (протоны или γ-кванты); 3) АраЦ+Облучение. The cells are removed from the substrate into the DMEM medium at a concentration of 2.0⋅10 ⁶ cells/ml, then 200 thousand cells are injected intramuscularly into the hind right paw of C57Bl/6j mice aged 1.5-2.0 months weighing 20 d (Nursery of laboratory animals "Andreevka" - a branch of the Federal State Budgetary Institution of Science "Scientific Center for Biomedical Technologies" of the Federal Medical and Biological Agency of Russia). Nine days after tumor cell transplantation, visual control of the primary focus of melanoma begins. Groups of animals with the same average size of the tumor focus are formed: 1) control (intact tumor-bearing animals); 2) irradiation (protons or γ-quanta); 3) Aratz + Irradiation.

Введение АраЦ и облучение производят на 12 сутки после введения опухолевых клеток, когда опухоли визуализируются макроскопически. За 1 час перед облучением выполняют введение АраЦ (2,5 мг/мышь; 125 мг/кг) в хвостовую вену мышей. The introduction of AraC and irradiation is carried out on the 12th day after the introduction of tumor cells, when the tumors are visualized macroscopically. One hour before irradiation, AraC (2.5 mg/mouse; 125 mg/kg) was injected into the tail vein of mice.

Выполняют локальное облучение опухолевого очага в дозе 10 Гр: Perform local irradiation of the tumor focus at a dose of 10 Gy:

1) пучком протонов в модифицированном пике Брэгга (комплекс протонной терапии «Прометеус», МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России). Диапазон энергий в модифицированном пике - от 33 до 56 МэВ, размер модифицированного пика - 20 мм. Длительность синхротронного импульса - 250 мс, пауза между импульсами - 1,3 с; 1) a proton beam in a modified Bragg peak (proton therapy complex "Prometheus", MRRC named after A.F. Tsyb - branch of the Federal State Budgetary Institution "National Medical Research Center for Radiology" of the Ministry of Health of Russia). The energy range in the modified peak is from 33 to 56 MeV, the size of the modified peak is 20 mm. Synchrotron pulse duration - 250 ms, pause between pulses - 1.3 s;

2) или пучком γ-квантов от источника ⁶⁰Co со средней энергией излучения 1,25 МэВ и начальной активностью 1,48⋅10¹⁴ Бк («Луч-1», Россия).2) or a beam of γ-quanta from a ⁶⁰ Co source with an average radiation energy of 1.25 MeV and an initial activity of 1.48⋅10 ¹⁴ Bq (Luch-1, Russia).

Далее оценивают эффекты комбинированного действия АраЦ и ионизирующих излучений (протонов или γ-квантов) в сравнении с соответствующим одиночным радиационным воздействием и контролем. При этом используют критерии: Next, the effects of the combined action of AraC and ionizing radiation (protons or γ-quanta) are evaluated in comparison with the corresponding single radiation exposure and control. The following criteria are used:

А) Количество ДР ДНК в клетках опухолей через 2 и 9 суток после комбинированного воздействия и одиночного облучения, а также в клетках контрольных опухолей в тех же временных точках. В указанные сроки забирают аутопсийный материал опухолевой ткани, который подвергают ферментативной дезагрегации в среде DMEM (Панэко, Россия), содержащей коллагеназу (1 мг/мл, Sigma, США) и ДНКазу (0.02%, Sigma, США), в течение 1 часа при +37°С и постоянном перемешивании. Полученную суспензию клеток фильтруют через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40 мкм и определяют концентрацию ядросодержащих клеток с помощью камеры Горяева, после чего отбирают аликвоты по 2,5⋅10⁵ клеток для последующего исследования ДР ДНК. A) The amount of DNA DSBs in tumor cells 2 and 9 days after combined exposure and single irradiation, as well as in control tumor cells at the same time points. The autopsy material of the tumor tissue is taken at the specified time, which is subjected to enzymatic disaggregation in DMEM medium (Paneko, Russia) containing collagenase (1 mg/ml, Sigma, USA) and DNase (0.02%, Sigma, USA) for 1 hour at +37°C and constant stirring. The resulting cell suspension is filtered through a nylon filter with a pore diameter of 40 μm and the concentration of nucleated cells is determined using a Goryaev camera, after which aliquots of 2.5×10 ⁵ cells are taken for subsequent DNA DBS analysis.

Для оценки степени поврежденности ДНК и изучения процесса репарации используют нейтральную версию метода ДНК-комет, позволяющую оценивать степень поврежденности ДНК и изучать процесс репарации ДНК на уровне одиночных клеток. В основе метода лежит проведение гель-электрофореза единичных лизированных клеток. При этом под воздействием электрического поля молекулы ДНК выпетливаются в порах геля, а поврежденную ДНК визуализируют посредством окрашивания флуоресцентным красителем, после чего образцы изучают микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК, что приводит к ее релаксации, формируются фрагменты ДНК. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, формируя электрофоретический след, визуально напоминающий хвост кометы. С использованием компьютерных программных средств обработки изображений рассчитывают момент хвоста - произведение длины хвоста на процентное содержание ДНК в хвосте.To assess the degree of DNA damage and study the repair process, a neutral version of the DNA comet method is used, which makes it possible to assess the degree of DNA damage and study the process of DNA repair at the level of single cells. The method is based on gel electrophoresis of single lysed cells. In this case, under the influence of an electric field, DNA molecules loop out in the pores of the gel, and damaged DNA is visualized by staining with a fluorescent dye, after which the samples are examined microscopically. In the presence of DNA breaks, the structural organization of chromatin is disrupted and DNA supercoiling is lost, which leads to its relaxation, and DNA fragments are formed. In an electric field, relaxed loops and DNA fragments are pulled towards the anode, forming an electrophoretic trace that visually resembles a comet's tail. The tail moment, the product of the length of the tail and the percentage of DNA in the tail, is calculated using image processing software.

Б) Ингибирование роста опухолей в течение 3-32 суток после комбинированного воздействия и одиночного облучения. Выполняют измерение размеров опухолевого очага с помощью штангенциркуля в двух взаимно перпендикулярных направлениях каждые 2-3 дня, начиная с момента облучения. Измерение размеров опухолевого очага заканчивают в момент начала гибели животных в каждой группе. Для каждой опухоли вычисляют средний диаметр и объем по формуле:B) Inhibition of tumor growth for 3-32 days after combined exposure and single irradiation. The size of the tumor focus is measured using a caliper in two mutually perpendicular directions every 2-3 days, starting from the moment of irradiation. Measurement of the size of the tumor focus is completed at the time of the onset of death of animals in each group. For each tumor, the average diameter and volume are calculated using the formula:

V=⅙ π D³, где V - объём опухолевого очага, D - средний диаметр опухоли.V=⅙ π D ³ , where V is the volume of the tumor focus, D is the average diameter of the tumor.

Данные объема используют для расчета процента торможения роста опухоли под влиянием комбинированного воздействия по сравнению с одиночным облучением (ТРО, %) по формуле:Volume data are used to calculate the percentage of tumor growth inhibition under the influence of combined exposure compared to single exposure (TPO, %) according to the formula:

ТРО, % = (V_{Облучение}- V_{АраЦ+Облучение}) / V_{Облучение} × 100.TPO, % = (V _Irradiation - V _{AraC + Irradiation} ) / V _Irradiation × 100.

Примеры повышения эффективности действия ионизирующих излучений на меланому.Examples of increasing the effectiveness of ionizing radiation on melanoma.

Пример 1. Повышение количества ДР ДНК в клетках меланомы через 2 и 9 суток после комбинированного действия АраЦ и протонного излученияExample 1. Increase in the amount of DNA DSBs in melanoma cells 2 and 9 days after the combined action of AraC and proton radiation

Установлено статистически значимое превышение количества ДР ДНК, которое оценивалось по значению момента хвоста, в клетках меланомы B16 в пострадиационный период при действии протонного излучения и его комбинированного применения с АраЦ по сравнению с контролем как на 2-е, так и на 9-е сутки (р<0,001) (Фиг. 1 и 2). На 2 сутки количество повреждений при комбинированном применении протонного излучения и АраЦ (группа «АраЦ+Облучение (протоны)») статистически значимо (р<0,001) ~ в 3 раза превышает количество ДР ДНК, оставшихся после облучения протонами без введения АраЦ (группа «Облучение (протоны)») (Фиг. 1). На 9 сутки (Фиг. 2) количество ДР ДНК в клетках меланомы при комбинированном применении протонного излучения и АраЦ (группа «АраЦ+Облучение (протоны)») также статистически значимо (р<0,001) превышает количество ДР ДНК, оставшихся после облучения протонами без введения АраЦ (группа «Облучение (протоны)»). И хотя количество повреждений после комбинированного воздействия протонного излучения и АраЦ превышает количество ДР ДНК после воздействия только протонов, это соотношение снижается до ~ 1,5 раз (Фиг. 2).A statistically significant excess of the amount of DNA DSBs, which was estimated by the value of the tail moment, was found in B16 melanoma cells in the post-radiation period under the action of proton radiation and its combined application with AraC compared to the control, both on the 2nd and 9th days ( p<0.001) (FIGS. 1 and 2). On day 2, the number of lesions in the combined use of proton radiation and AraC (group "AraC + Irradiation (protons)") is statistically significant (p<0.001) ~ 3 times higher than the number of DNA DSBs remaining after proton irradiation without the introduction of AraC (group "Irradiation (protons)") (Fig. 1). On the 9th day (Fig. 2), the amount of DNA DSBs in melanoma cells with the combined use of proton radiation and AraC (group "AraC + Irradiation (protons)") also statistically significantly (p<0.001) exceeds the number of DNA DSBs remaining after irradiation with protons without introduction of AraC (group "Irradiation (protons)"). And although the amount of damage after the combined exposure to proton radiation and AraC exceeds the amount of DNA DSBs after exposure to protons alone, this ratio decreases to ~ 1.5 times (Fig. 2).

Пример 2. Уменьшение объема первичного очага меланомы после комбинированного действия АраЦ и протонного излучения по сравнению с контролем и одиночным облучением пучком протоновExample 2. Reduction in the volume of the primary focus of melanoma after the combined action of AraC and proton radiation in comparison with the control and single irradiation with a proton beam

Установлено статистически значимое подавление роста меланомы линии В16 под влиянием протонного излучения или его комбинированного применения с АраЦ по сравнению с контролем, начиная с 9 суток после облучения (р<0,05) (Фиг.3). Различия в среднем объеме опухолей в группах «Облучение (протоны)» и «АраЦ+Облучение (протоны)» достигали статистической значимости (р<0,05), начиная с 18 суток после облучения, и продолжались до конца периода наблюдения (Фиг. 4). В эти сроки различия между указанными группами варьировали от 1,7 до 2,0 раз; соответственно, торможение роста опухолей в группе «АраЦ+Облучение (протоны)» по сравнению с группой «Облучение (протоны)» достигало 37-51% (Фиг. 5).A statistically significant suppression of the growth of B16 melanoma under the influence of proton radiation or its combined use with AraC was established compared with the control, starting from day 9 after irradiation (p<0.05) (Figure 3). Differences in the average volume of tumors in the groups "Irradiation (protons)" and "AraC+Irradiation (protons)" reached statistical significance (p<0.05), starting from 18 days after irradiation, and continued until the end of the observation period (Fig. 4 ). During these periods, the differences between these groups varied from 1.7 to 2.0 times; accordingly, inhibition of tumor growth in the "AraC+Irradiation (protons)" group compared to the "Irradiation (protons)" group reached 37-51% (Fig. 5).

Пример 3. Уменьшение объема первичного очага меланомы после комбинированного действия АраЦ и γ-излучения по сравнению с контролем и одиночным γ-облучениемExample 3. Reduction in the volume of the primary focus of melanoma after the combined action of AraC and γ-irradiation compared with the control and single γ-irradiation

Установлено статистически значимое подавление роста меланомы линии В16 под влиянием γ-излучения или его комбинированного применения с АраЦ по сравнению с контролем, начиная с 9 суток после облучения (p<0,05) (Фиг. 6). При этом наиболее значительное подавление роста опухолей обнаружено при комбинированном действии γ-излучения на фоне АраЦ. Различия в среднем объеме опухолей в группах «Облучение (γ-кванты)» и «АраЦ+Облучение (γ-кванты)» достигали статистической значимости, начиная с 12 суток после облучения, и продолжались до конца периода наблюдения (Фиг.7). В эти сроки различия между указанными группами варьировали от 1,2 до 1,3 раз; соответственно, торможение роста опухолей в группе «АраЦ+Облучение (γ-кванты)» по сравнению с группой «Облучение (γ-кванты)» составляло 12-22% (Фиг.8).A statistically significant suppression of the growth of melanoma line B16 under the influence of γ-radiation or its combined use with AraC was found compared with the control, starting from day 9 after irradiation (p<0.05) (Fig. 6). At the same time, the most significant suppression of tumor growth was found under the combined action of γ-radiation against the background of AraC. Differences in the average volume of tumors in the groups "Irradiation (γ-quanta)" and "AraC+Irradiation (γ-quanta)" reached statistical significance, starting from 12 days after irradiation, and continued until the end of the observation period (Fig.7). During these periods, the differences between these groups varied from 1.2 to 1.3 times; accordingly, inhibition of tumor growth in the group "AraC+Irradiation (γ-quanta)" compared with the group "Irradiation (γ-quanta)" was 12-22% (Fig.8).

Пример № 1 показывает, что при внутривенном введении АраЦ за 1 час до облучения меланомы пучком протонов происходит значительное пострадиационное повышение количества ДР ДНК, которые являются смертельно опасными для клеток. Важно, что повышенное количество ДР (по сравнению с таковым при действии протонного излучения) сохраняется в течение длительного времени после комбинированного воздействия, тем самым увеличивая его эффективность. Example No. 1 shows that intravenous administration of AraC 1 hour before melanoma irradiation with a proton beam results in a significant post-irradiation increase in the amount of DNA DSBs, which are deadly for cells. It is important that an increased amount of DR (compared to that under the action of proton radiation) persists for a long time after combined exposure, thereby increasing its effectiveness.

Примеры № 2 и № 3 доказывают, что новый способ, заключающийся во внутривенном введении АраЦ за 1 час до радиационного воздействия (пучком протонов или γ-квантов) на меланому, тормозит рост опухолей по сравнению как с интактным контролем, так и с одиночным радиационным воздействием.Examples No. 2 and No. 3 prove that the new method, which consists in intravenous administration of AraC 1 hour before radiation exposure (by a proton or γ-ray beam) to melanoma, inhibits tumor growth compared to both intact control and single radiation exposure. .

Изобретение позволяет повысить эффективность действия ионизирующих излучений на радиорезистентное ЗНО - меланому - и является основой для совершенствования лучевой терапии онкологических больных.EFFECT: invention makes it possible to increase the effectiveness of the action of ionizing radiation on a radioresistant malignant neoplasm - melanoma - and is the basis for improving radiation therapy for cancer patients.

Claims

A method for increasing the effectiveness of ionizing radiation on melanoma, including the effect of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (AraC) on cells and subsequent irradiation with a beam of protons or γ-quanta, characterized in that AraC is administered intravenously in vivo at the rate of 125 mg/kg per 1 hour before local irradiation of melanoma at a dose of 10 Gy.