RU2773707C2 - Doxorubicin-gold nanoconjugates with directional influence for tumor therapy - Google Patents
Doxorubicin-gold nanoconjugates with directional influence for tumor therapy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2773707C2 RU2773707C2 RU2019125167A RU2019125167A RU2773707C2 RU 2773707 C2 RU2773707 C2 RU 2773707C2 RU 2019125167 A RU2019125167 A RU 2019125167A RU 2019125167 A RU2019125167 A RU 2019125167A RU 2773707 C2 RU2773707 C2 RU 2773707C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoconjugate
- cancer
- dtdtpa
- doxorubicin
- gold
- Prior art date
Links
- 239000002836 nanoconjugate Substances 0.000 title claims abstract description 117
- 239000010931 gold Substances 0.000 title claims abstract description 71
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 56
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims 3
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N ADRIAMYCIN Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims abstract description 75
- 229960004679 Doxorubicin Drugs 0.000 claims abstract description 75
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 70
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 67
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N Bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 claims abstract description 49
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 28
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 claims abstract description 28
- AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N Lipoic acid Chemical group OC(=O)CCCC[C@@H]1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims abstract description 27
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960003330 Pentetic Acid Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 23
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 22
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 claims description 20
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 206010000880 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000007046 Leukemia, Myeloid, Acute Diseases 0.000 claims description 6
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 6
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 6
- 201000005510 acute lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000002154 Non-Small-Cell Lung Carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 108009000071 Non-small cell lung cancer Proteins 0.000 claims description 4
- 208000008443 Pancreatic Carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001268 conjugating Effects 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010020243 Hodgkin's disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029592 Non-Hodgkin's lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008732 Thymoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047802 Waldenstrom's macroglobulinaemias Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008383 Wilms Tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000564 macroglobulinemia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009251 multiple myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims 1
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 35
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 29
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N Gastrin-ReleasingPeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 22
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 10
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 10
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 238000000026 X-ray photoelectron spectrum Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000004833 X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091006822 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 4
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 3
- 208000000587 Small Cell Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 3
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 Acetic Acid Drugs 0.000 description 2
- 102000036857 Bombesin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073466 Bombesin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 2
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CHPZKNULDCNCBW-UHFFFAOYSA-N Gallium nitrate Chemical compound [Ga+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O CHPZKNULDCNCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000006743 Hodgkin's lymphoma Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002307 Prostate Anatomy 0.000 description 2
- 239000007759 RPMI Media 1640 Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M Sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium;hexafluorophosphate Chemical compound F[P-](F)(F)(F)(F)F.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001808 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atoms Chemical group 0.000 description 2
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethanethiol;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCCS OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000269328 Amphibia Species 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000036880 Cls Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229960001031 Glucose Drugs 0.000 description 1
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001125831 Istiophoridae Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N N'-amino-N-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- IDIDJDIHTAOVLG-VKHMYHEASA-N S-methyl-L-cysteine Chemical compound CSC[C@H](N)C(O)=O IDIDJDIHTAOVLG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 Sodium Pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 206010044412 Transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003932 Urinary Bladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 108091008116 antibody drug conjugates Proteins 0.000 description 1
- 238000005311 autocorrelation function Methods 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceuticals Drugs 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001722 carbon compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940044658 gallium nitrate Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N lipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229960001913 mecysteine Drugs 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000001846 repelling Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 231100000197 serious side effect Toxicity 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- SDKPSXWGRWWLKR-UHFFFAOYSA-N sodium;9,10-dioxoanthracene-1-sulfonic acid Chemical compound [Na+].O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2S(=O)(=O)O SDKPSXWGRWWLKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 150000003463 sulfur Chemical class 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION
[0001] Настоящее изобретение относится к наноконъюгатам доксорубицин-золото, которые можно применять для лечения рака. Настоящее изобретение также относится к способам получения и применения наноконъюгатов.[0001] The present invention relates to doxorubicin-gold nanoconjugates that can be used to treat cancer. The present invention also relates to methods for the preparation and use of nanoconjugates.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
[0002] Доксорубицин (DOX) представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, в настоящее время применяемое в клинической практике для лечения нескольких видов опухолей, включая рак молочной железы, рак яичника, рак печени, рак почки и т.д.[0002] Doxorubicin (DOX) is a chemotherapeutic drug currently used in clinical practice for the treatment of several types of tumors, including breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, kidney cancer, etc.
Одним из серьезных побочных эффектов доксорубицина является его кардиотоксичность. Кардиотоксичность можно свести к минимуму путем направленного введения препарата или путем снижения его концентрации. Однако при уменьшении количества вводимого препарата соответственно снижается его цитотоксичность и эффективность. Для направленной доставки были разработаны конъюгаты антител с лекарственными средствами, но все еще существует необходимость в разработке несущей системы для доставки доксорубицина, которая обладала бы низкой кардиотоксичностью и/или высокой эффективностью.One of the serious side effects of doxorubicin is its cardiotoxicity. Cardiotoxicity can be minimized by targeted administration of the drug or by reducing its concentration. However, with a decrease in the amount of the administered drug, its cytotoxicity and effectiveness decrease accordingly. Antibody drug conjugates have been developed for targeted delivery, but there is still a need to develop a carrier system for doxorubicin delivery that has low cardiotoxicity and/or high efficacy.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
[0003] В настоящем изобретении предложены наноконъюгаты золота для направленной доставки доксорубицина. В настоящем изобретении предложен наноконъюгат, содержащий: наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA), пептид с концевой тиоктовой кислотой и доксорубицин, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, пептид с концевой тиоктовой кислотой связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA.[0003] The present invention provides gold nanoconjugates for targeted delivery of doxorubicin. The present invention proposes a nanoconjugate containing: a gold nanoparticle (AuNP), dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA), a thioctic acid-terminated peptide and doxorubicin, where DTDTPA is directly linked to the surface of the gold nanoparticle via at least one Au-S bond, a peptide with a terminal thioctic acid is bonded directly to the surface of the gold nanoparticle via at least one Au-S bond, while doxorubicin is bonded to DTDTPA.
[0004] В некоторых вариантах осуществления пептид с концевой тиоктовой кислотой представляет собой бомбезин с тиоктовой кислотой. В некоторых вариантах осуществления бомбезин с тиоктовой кислотой имеет последовательность: липоевая кислота-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2.[0004] In some embodiments, the thioctic acid-terminated peptide is thioctic acid bombesin. In some embodiments, thioctic acid bombesin has the sequence: lipoic acid-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH 2 .
[0005] В некоторых вариантах осуществления доксорубицин связан с DTDTPA посредством амидной связи.[0005] In some embodiments, doxorubicin is linked to DTDTPA via an amide bond.
[0006] В настоящем изобретении также предложен способ получения наноконъюгата, описанного в настоящем документе, который включает конъюгацию наночастицы AuNP-DTDTPA с пептидом с концевой тиоктовой кислотой, причем золото в виде наночастицы золота и пептид с концевой тиоктовой кислотой присутствуют в стехиометрическом соотношении от около 1:0,5 до около 1:4. В некоторых вариантах осуществления золото в виде наночастицы золота и пептид с концевой тиоктовой кислотой присутствуют в стехиометрическом соотношении около 1:2.[0006] The present invention also provides a method for preparing the nanoconjugate described herein, which comprises conjugating an AuNP-DTDTPA nanoparticle to a thioctic acid-terminated peptide, wherein the gold in the form of the gold nanoparticle and the thioctic acid-terminated peptide are present in a stoichiometric ratio of from about 1 :0.5 to about 1:4. In some embodiments, the gold nanoparticle gold and the thioctic acid terminated peptide are present in a stoichiometric ratio of about 1:2.
[0007] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 1% до около 40% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 20% до около 30% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата.[0007] In some embodiments, the nanoconjugate described herein contains from about 1% to about 40% thioctic acid terminated peptide by weight of the nanoconjugate. In some embodiments, the nanoconjugate described herein contains from about 20% to about 30% thioctic acid terminated peptide by weight of the nanoconjugate.
[0008] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 0,01% до около 0,05% доксорубицина по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит около 0,03% доксорубицина по массе наноконъюгата.[0008] In some embodiments, the nanoconjugate described herein contains from about 0.01% to about 0.05% doxorubicin by weight of the nanoconjugate. In some embodiments, the nanoconjugate described herein contains about 0.03% doxorubicin by weight of the nanoconjugate.
[0009] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр от около 110 нм до около 140 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS). В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр от около 120 нм до около 130 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS).[0009] In some embodiments, the nanoconjugate has a hydrodynamic diameter of about 110 nm to about 140 nm as measured by dynamic light scattering (DLS). In some embodiments, the nanoconjugate has a hydrodynamic diameter of about 120 nm to about 130 nm as measured by dynamic light scattering (DLS).
[0010] В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата находится в диапазоне от около -15 мВ до около -30 мВ. В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата находится в диапазоне от около -20 мВ до около -25 мВ.[0010] In some embodiments, the implementation of the value of the zeta potential of the nanoconjugate is in the range from about -15 mV to about -30 mV. In some embodiments, the implementation of the value of the zeta potential of the nanoconjugate is in the range from about -20 mV to about -25 mV.
[0011] В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая наноконъюгат, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.[0011] The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the nanoconjugate described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0012] В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества наноконъюгата, описанного в настоящем документе.[0012] The present invention further provides a method for treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the nanoconjugate described herein.
[0013] В некоторых вариантах осуществления вид рака выбран из группы, состоящей из острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), остеосаркомы, рака молочной железы, рака эндометрия, рака желудка, рака головы и шеи, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака печени, рака почки, множественной миеломы, нейробластомы, рака яичника, рака легкого, саркомы мягких тканей, тимом, рака щитовидной железы, рака мочевого пузыря, саркомы матки, рака предстательной железы, рака толстой кишки, рака яичника, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, опухоли Вильмса и макроглобулинемии Вальденстрема.[0013] In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), osteosarcoma, breast cancer, endometrial cancer, gastric cancer, head and neck cancer, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, liver cancer, kidney cancer, multiple myeloma, neuroblastoma, ovarian cancer, lung cancer, soft tissue sarcoma, thymoma, thyroid cancer, bladder cancer, uterine sarcoma, prostate cancer, colon cancer, ovarian cancer, non-small cell lung cancer , pancreatic cancer, Wilms' tumor and Waldenström's macroglobulinemia.
[0014] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат вводят субъекту путем инъекции.[0014] In some embodiments, the implementation of the nanoconjugate is administered to the subject by injection.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
[0015] Ниже приводится краткое описание графических материалов, которые представлены для целей иллюстрации примеров осуществления, описанных в настоящем документе, а не для целей их ограничения.[0015] The following is a brief description of the drawings, which are presented for the purpose of illustrating the exemplary embodiments described herein, and not for the purpose of limiting them.
[0016] На ФИГ. 1 показан синтез BBN-AuNP-DTDTPA-DOX (NP2-DOX).[0016] FIG. 1 shows the synthesis of BBN-AuNP-DTDTPA-DOX (NP2-DOX).
[0017] На ФИГ. 2 показана схематическая структура BBN-AuNP-DTDTPA-DOX (NP2-DOX).[0017] FIG. 2 shows the schematic structure of BBN-AuNP-DTDTPA-DOX (NP2-DOX).
[0018] На ФИГ. 3 показан график титрования бомбезина с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) с помощью [AuNP(DTDTPA)] для определения количества TA-BBN, образовавшего конъюгат с [AuNP(DTDTPA)], по результатам измерения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В скобках представлены стехиометрические соотношения Au: BBN.[0018] FIG. 3 shows a plot of titration of thioctic acid terminated bombesin (TA-BBN) with [AuNP(DTDTPA)] to determine the amount of TA-BBN conjugated with [AuNP(DTDTPA)] as measured by high performance liquid chromatography (HPLC). . The stoichiometric ratios of Au:BBN are shown in parentheses.
[0019] На ФИГ. 4А и 4В показаны изображения наноконъюгатов NP1 и NP2 соответственно, полученные с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ). На ФИГ. 3С показан спектр поглощения в УФ-видимой области для наноконъюгатов NP1 и NP2.[0019] FIG. 4A and 4B show transmission electron microscope (TEM) images of NP1 and NP2 nanoconjugates, respectively. FIG. 3C shows the UV-Vis absorption spectrum for the NP1 and NP2 nanoconjugates.
[0020] На ФИГ. 5А показан спектр, полученный методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС), для наноконъюгата NP2. На ФИГ. 5В показан спектр РФЭС высокого разрешения для области C1s наноконъюгата NP2.[0020] FIG. 5A shows an X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spectrum for the NP2 nanoconjugate. FIG. 5B shows the high resolution XPS spectrum for the C1s region of the NP2 nanoconjugate.
[0021] На ФИГ. 6А показан спектр РФЭС высокого разрешения для области S2p наноконструкции NP2. На ФИГ. 6В показан спектр РФЭС высокого разрешения для области Au4f наноконструкции NP2.[0021] FIG. 6A shows the high resolution XPS spectrum for the S2p region of the NP2 nanostructure. FIG. 6B shows the high resolution XPS spectrum for the Au4f region of the NP2 nanostructure.
[0022] На ФИГ. 7 показан спектр флуоресценции доксорубицина при длине волны возбуждения 580 нм и длине волны излучения 590 нм.[0022] FIG. 7 shows the fluorescence spectrum of doxorubicin at an excitation wavelength of 580 nm and an emission wavelength of 590 nm.
[0023] На ФИГ. 8 показана оценка нагрузки наноконъюгатов NP1 и NP2 доксорубицином по результатам флуоресцентной спектроскопии.[0023] FIG. 8 shows the loading of NP1 and NP2 nanoconjugates with doxorubicin according to the results of fluorescence spectroscopy.
[0024] На ФИГ. 9 показан спектр флуоресценции наноконъюгатов NP1 и NP1-DOX.[0024] FIG. 9 shows the fluorescence spectrum of the NP1 and NP1-DOX nanoconjugates.
[0025] На ФИГ. 10 показан спектр флуоресценции наноконъюгатов NP2 и NP2-DOX.[0025] FIG. 10 shows the fluorescence spectrum of NP2 and NP2-DOX nanoconjugates.
[0026] На ФИГ. 11 показан спектр поглощения в УФ-видимой области для NP1, NP2, NP1-DOX и NP2-DOX.[0026] FIG. 11 shows the absorption spectrum in the UV-visible region for NP1, NP2, NP1-DOX and NP2-DOX.
[0027] На ФИГ. 12А и 12В показаны исследования стабильности наноконъюгатов NP1 и NP2 in vitro по результатам абсорбционной спектроскопии в УФ-видимой области. На ФИГ. 12С и 12D показаны исследования стабильности наноконъюгатов NP1 и NP2 in vitro по результатам измерения гидродинамического размера. На ФИГ. 12Е и 12F представлены исследования стабильности наноконъюгатов NP1 и NP2 in vitro по результатам определения дзета-потенциала при инкубации в различных биологически значимых растворах.[0027] FIG. 12A and 12B show in vitro stability studies of NP1 and NP2 nanoconjugates by UV-visible absorption spectroscopy. FIG. 12C and 12D show in vitro stability studies of NP1 and NP2 nanoconjugates as measured by hydrodynamic size. FIG. 12E and 12F are in vitro stability studies of NP1 and NP2 nanoconjugates based on zeta potential determinations when incubated in various biologically significant solutions.
[0028] На ФИГ. 13 показаны значения концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) для наноконъюгата NP2 с различными стехиометрическими соотношениями Au: BBN (1:0,4; 1:2; 1:4) в отношении 125I-BBN в клетках опухоли предстательной железы РС-3, экспрессирующих рецепторы GRP.[0028] FIG. 13 shows half-maximal inhibition concentration (IC 50 ) values for NP2 nanoconjugate with various Au:BBN stoichiometric ratios (1:0.4; 1:2; 1:4) against 125I-BBN in PC-3 prostate tumor cells expressing GRP receptors.
[0029] На ФИГ. 14 показана цитотоксичность доксорубицина in vitro, вводимого отдельно либо в виде NP1-DOX и NP2-DOX, в отношении клеток рака молочной железы человека MDА-МВ-231, не экспрессирующих GRP.[0029] FIG. 14 shows the in vitro cytotoxicity of doxorubicin administered alone or as NP1-DOX and NP2-DOX against human breast cancer cells MDA-MB-231 not expressing GRP.
[0030] На ФИГ. 15 сравнивается воздействие NP1-DOX, NP2-DOX и доксорубицина, вводимого отдельно, на клетки рака молочной железы человека, не экспрессирующие GRP.[0030] FIG. 15 compares the effects of NP1-DOX, NP2-DOX, and doxorubicin administered alone on human breast cancer cells that do not express GRP.
[0031] На ФИГ. 16 показана цитотоксичность доксорубицина in vitro, вводимого отдельно, а также в виде NP1-DOX и NP2-DOX, в отношении клеток рака предстательной железы человека РС3, экспрессирующих GRP.[0031] FIG. 16 shows the in vitro cytotoxicity of doxorubicin administered alone and as NP1-DOX and NP2-DOX against GRP-expressing PC3 human prostate cancer cells.
[0032] На ФИГ. 17 сравнивается воздействие NP1-DOX, NP2-DOX и доксорубицина, вводимого отдельно, на клетки рака предстательной железы человека, экспрессирующие GRP.[0032] FIG. 17 compares the effects of NP1-DOX, NP2-DOX, and doxorubicin administered alone on GRP-expressing human prostate cancer cells.
[0033] На ФИГ. 18 сравниваются значения IC50 для доксорубицина, вводимого в виде наноконъюгатов (NP1-DOX и NP2-DOX), и доксорубицина, вводимого отдельно, в отношении раковых клеток человека (РС3), экспрессирующих GRP.[0033] FIG. 18 compares the IC 50 values for doxorubicin administered as nanoconjugates (NP1-DOX and NP2-DOX) and doxorubicin administered alone against human cancer cells (PC3) expressing GRP.
[0034] На ФИГ. 19 сравниваются значения IC50 для доксорубицина в виде наноконъюгатов (NP1-DOX и NP2-DOX) и доксорубицина, вводимого отдельно, в отношении раковых клеток человека (MDA-MB-231), не экспрессирующих GRP.[0034] FIG. 19 compares the IC 50 values for doxorubicin nanoconjugates (NP1-DOX and NP2-DOX) and doxorubicin administered alone against human cancer cells (MDA-MB-231) not expressing GRP.
[0035] На ФИГ. 20 сравниваются различия в гибели клеток (в процентах), вызываемой NP1-DOX и NP2-DOX в отношении раковых клеток человека, экспрессирующих GRP (РС3) и не экспрессирующих GRP (MDA-MB-231).[0035] FIG. 20 compares the differences in cell death (in percent) caused by NP1-DOX and NP2-DOX in relation to human cancer cells expressing GRP (PC3) and not expressing GRP (MDA-MB-231).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION
[0036] Рецепторы гастринвысвобождающего пептида (GRP) сверхэкспрессируются в различных раковых клетках человека, таких как клетки рака молочной железы, рака предстательной железы, рака толстой кишки и других видов рака. Известно, что пептид бомбезин и его аналоги нацелены на рецепторы GRP. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена многокомпонентная система доставки наночастиц (наноконъюгат), содержащая наночастицы золота (AuNP), нацеливающий агент (например, бомбезин [BBN]) и доксорубицин (DOX) в качестве противоракового терапевтического агента. Наночастицы золота стабилизированы дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTDTPA) и могут иметь многослойную структуру. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления наноконъюгат может представлять собой BBN-AuNP(DTDTPA)-DOX. По результатам анализов цитотоксичности in vitro, проводимых с использованием клеток рака молочной железы, неожиданно было обнаружено, что BBN-AuNP(DTDTPA)-DOX является намного более эффективным по сравнению с доксорубицином.[0036] Gastrin-releasing peptide (GRP) receptors are overexpressed in various human cancer cells such as breast cancer, prostate cancer, colon cancer and other cancers. Bombesin peptide and its analogs are known to target GRP receptors. In some embodiments, the present invention provides a multicomponent nanoparticle delivery system (nanoconjugate) comprising gold nanoparticles (AuNP), a targeting agent (e.g., bombesin [BBN]), and doxorubicin (DOX) as an anti-cancer therapeutic agent. Gold nanoparticles are stabilized with dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA) and can have a multilayer structure. Thus, in some embodiments, the nanoconjugate may be BBN-AuNP(DTDTPA)-DOX. Surprisingly, BBN-AuNP(DTDTPA)-DOX was found to be much more effective than doxorubicin in in vitro cytotoxicity assays using breast cancer cells.
[0037] Из приведенного в данном документе описания специалистам в данной области будет очевидно, что возможны различные примеры и варианты осуществления объекта изобретения, описанного в настоящем документе. В настоящем описании каждая из фраз и ссылка на «некоторые варианты осуществления», «определенные варианты осуществления» и аналогичные фразы означает, что данные варианты осуществления являются не имеющими ограничительного характера примерами объекта изобретения, и что не исключены альтернативные варианты осуществления.[0037] It will be apparent to those skilled in the art from the description provided herein that various examples and embodiments of the subject matter described herein are possible. In the present description, each of the phrases and reference to "certain embodiments", "certain embodiments", and similar phrases means that these embodiments are non-limiting examples of the subject matter of the invention, and that alternative embodiments are not excluded.
[0038] Существительные в единственном числе использованы в настоящем документе для обозначения одного или более одного (т.е. по меньшей мере одного) из грамматических объектов публикации. Например, «элемент» означает один элемент или более одного элемента. Термин «или» означает «и/или». Термины «содержащий», «имеющий», «включающий в себя» и «охватывающий» следует понимать как неограничивающие термины (т.е. они означают «включающий в себя без ограничений»).[0038] Singular nouns are used herein to refer to one or more than one (ie, at least one) of the grammatical objects of the publication. For example, "element" means one element or more than one element. The term "or" means "and/or". The terms "comprising", "having", "including" and "covering" should be understood as non-limiting terms (ie, they mean "including without limitation").
[0039] Термин «содержащий» использован в смысле, согласующемся с его неограничивающим значением, другими словами, означающем, что данный продукт или способ может также необязательно иметь дополнительные признаки или элементы, помимо указанных явным образом. Следует понимать, что везде, где варианты осуществления описаны с использованием формулировки «содержащий», также предусмотрены и включены в объем настоящего изобретения иные аналогичные варианты осуществления, описанные с использованием терминов «состоящий из» и/или «состоящий по существу из».[0039] The term "comprising" is used in a sense consistent with its non-limiting meaning, in other words, meaning that a given product or method may also optionally have additional features or elements in addition to those explicitly indicated. It should be understood that wherever embodiments are described using the wording "comprising", other similar embodiments described using the terms "consisting of" and/or "consisting essentially of" are also contemplated and included within the scope of the present invention.
[0040] Используемый в настоящем документе термин «около» означает ±10% от указанного значения. Только в качестве примера композиция, содержащая «около 30 масс. %» соединения может включать от 27 масс. % соединения до 33 масс. % соединения включительно.[0040] As used herein, the term "about" means ±10% of the specified value. By way of example only, a composition containing "about 30 wt. %" of the compound may include from 27 wt. % compound up to 33 wt. % connection inclusive.
[0041] Используемый в настоящем документе термин «наноконъюгат» относится к наноматериалу, содержащему наночастицу золота и другие компоненты, такие как стабилизирующий агент, нацеливающий агент и терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующий агент и нацеливающий агент могут быть связаны непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством одной или более ковалентных или нековалентных связей. Некоторые компоненты, такие как терапевтический агент, могут быть связаны с наночастицей золота через другой компонент, такой как стабилизирующий агент.[0041] As used herein, the term "nanoconjugate" refers to a nanomaterial containing a gold nanoparticle and other components such as a stabilizing agent, a targeting agent, and a therapeutic agent. In some embodiments, the implementation of the stabilizing agent and targeting agent can be associated directly with the surface of the gold nanoparticle through one or more covalent or non-covalent bonds. Some components, such as a therapeutic agent, may be associated with the gold nanoparticle through another component, such as a stabilizing agent.
[0042] Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, эффективное при введении пациенту для обеспечения предполагаемого терапевтического эффекта. Количество, которое является «эффективным», может быть отличаться среди разных субъектов, в зависимости от возраста и общего состояния здоровья субъекта и т.п.[0042] As used herein, the term "therapeutically effective amount" means an amount effective when administered to a patient to provide the intended therapeutic effect. The amount that is "effective" may differ among different subjects, depending on the age and general health of the subject, and the like.
[0043] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен наноконъюгат, содержащий: наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA), пептид с концевой тиоктовой кислотой и доксорубицин, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, пептид с концевой тиоктовой кислотой связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA.[0043] In some embodiments, the present invention provides a nanoconjugate comprising: a gold nanoparticle (AuNP), dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA), a thioctic acid-terminated peptide, and doxorubicin, wherein the DTDTPA is bonded directly to the surface of the gold nanoparticle via at least one bond Au-S, the thioctic acid-terminated peptide is linked directly to the surface of the gold nanoparticle via at least one Au-S bond, and doxorubicin is linked to DTDTPA.
[0044] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, по существу состоит из: наночастицы золота (AuNP), дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTDTPA), пептида с концевой тиоктовой кислотой и доксорубицина, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, пептид с концевой тиоктовой кислотой связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA.[0044] In some embodiments, the nanoconjugate described herein essentially consists of: a gold nanoparticle (AuNP), a dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA), a thioctic acid terminated peptide, and doxorubicin, where the DTDTPA is bonded directly to the surface of the gold nanoparticle via a at least one Au-S bond, the thioctic acid-terminated peptide is bonded directly to the surface of the gold nanoparticle via at least one Au-S bond, and doxorubicin is bonded to DTDTPA.
[0045] В данной области известны наночастицы золота, стабилизированные DTDTPA, т.е. AuNP-DTDTPA. Например, в WO 2015/103028 и у Debouttiere et al., Advan. Funt. Mater. 2006, 16:2330-39 описано получение и применение AuNP-DTDTPA, и оба источника в полном объеме включены в настоящий документ путем ссылки. Химическая структура DTDTPA показана ниже. Молекулы DTDTPA могут быть связаны с поверхностью наночастицы золота посредством одной или двух связей Au-S.[0045] Gold nanoparticles stabilized with DTDTPA are known in the art, i. e. AuNP-DTDTPA. For example, in WO 2015/103028 and Debouttiere et al., Advan. fun. mater. 2006, 16:2330-39 describes the preparation and use of AuNP-DTDTPA, and both references are incorporated herein by reference in their entirety. The chemical structure of DTDTPA is shown below. DTDTPA molecules can be bound to the gold nanoparticle surface via one or two Au-S bonds.
[0046] Без ограничения теорией считается, что петли DTDTPA, окружающие поверхность AuNP, могут содержать одну, две, три, четыре, пять или более молекул DTDTPA. Например, в некоторых вариантах осуществления также без ограничения конкретной теорией считается, что обе тиольные группы данной молекулы DTDTPA могут одновременно образовывать связь Au-S с поверхностью AuNP, таким образом формируя петлю с одной молекулой DTDTPA. В другом варианте осуществления одна тиольная группа данной молекулы DTDTPA может образовывать связь Au-S с поверхностью AuNP, тогда как вторая тиольная группа может образовывать межмолекулярный дисульфидный мостик (S-S) со второй молекулой DTDTPA. Вторая молекула DTDTPA может быть либо связана с еще одной молекулой DTDTPA посредством дисульфидного мостика, либо может быть связана с поверхностью AuNP посредством связи Au-S, таким образом формируя петлю, состоящую из двух или более молекул DTDTPA. В зависимости от того, как молекулы DTDTPA выстраиваются, стабилизированные наночастицы могут содержать многослойную органическую оболочку из молекул пентауксусной кислоты на поверхности частиц AuNP. См. Debouttiere et al., Advan. Funt. Mater. 2006, 16:2330-39; и Фиг. 2.[0046] Without being limited by theory, it is believed that the DTDTPA loops surrounding the AuNP surface may contain one, two, three, four, five or more DTDTPA molecules. For example, in some embodiments, also without being bound by a particular theory, it is believed that both thiol groups of a given DTDTPA molecule can simultaneously form an Au-S bond to the AuNP surface, thus forming a loop with one DTDTPA molecule. In another embodiment, one thiol group of a given DTDTPA molecule may form an Au-S bond to the AuNP surface, while a second thiol group may form an intermolecular disulfide bridge (S-S) with a second DTDTPA molecule. The second DTDTPA molecule can either be linked to another DTDTPA molecule via a disulfide bridge, or can be linked to the AuNP surface via an Au-S bond, thus forming a loop of two or more DTDTPA molecules. Depending on how the DTDTPA molecules align, the stabilized nanoparticles may contain a multilayer organic shell of pentaacetic acid molecules on the surface of the AuNP particles. See Debouttiere et al., Advan. fun. mater. 2006, 16:2330-39; and Fig. 2.
[0047] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 10% до около 60% DTDTPA по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 10%, около 15%, около 20%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 41%, около 42%, около 43%, около 44%, около 45%, около 46%, около 47%, около 48%, около 49%, около 50%, около 51%, около 52%, около 53%, около 54%, около 55%, около 60% DTDTPA по массе наноконъюгата, например около 45%, или количество в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около 30% до около 60% или от около 40% до около 50%. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 45% DTDTPA по массе наноконъюгата.[0047] In some embodiments, the nanoconjugate described herein contains from about 10% to about 60% DTDTPA by weight of the nanoconjugate. In some embodiments, the nanoconjugate contains about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 41%, about 42%, about 43%, about 44%, about 45%, about 46%, about 47%, about 48%, about 49%, about 50%, about 51%, about 52%, about 53%, about 54%, about 55%, about 60% DTDTPA by weight nanoconjugate, such as about 45%, or an amount between any two of the above values, such as from about 30% to about 60%, or from about 40% to about 50%. In some embodiments, the nanoconjugate contains about 45% DTDTPA by weight of the nanoconjugate.
[0048] В типичном варианте осуществления, и как пояснено выше, наноконъюгат, описанный в настоящем документе, может содержать пептид с концевой тиоктовой кислотой в качестве нацеливающего агента. В определенных вариантах осуществления нацеливающий пептид может представлять собой пептид бомбезин. Пептид бомбезин можно использовать для функционализации наноматериалов золота для нацеливания на определенные опухолевые клетки. См. Chanda et al., Nano Lett. 2009, 9(5): 1798-1805; Chanda et al. PNAS 2010, 107(19): 8760-8765; Suresh et al., Bioconjuate Chem. 2014, 25, 1565-1579; и Silva et al., Bioconjuate Chem. 2016, 27, 1153-1164. Каждый из этих источников в полном объеме включен в настоящий документ путем ссылки. Пептид бомбезин, состоящий из 14 аминокислот и выделенный из кожи земноводных рода жерлянки, и соответствующие гастринвысвобождающие пептиды (GRP) проявляют усиленный ответ в различных опухолевых тканях, например в тканях мелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы и рака толстой кишки. Сообщалось, что аналоги бомбезина с модифицированными структурами проявляли схожую или даже более высокую аффинность к рецепторам GRP. См., например, Chanda et al., Nano Lett. 2009, 9(5): 1798-1805 и приведенные в этой публикации ссылки. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в качестве нацеливающего агента использовали усеченный аналог бомбезина (BBN), состоящий из семи аминокислот, который показан на Фиг. 1.[0048] In a typical embodiment, and as explained above, the nanoconjugate described herein may contain a thioctic acid-terminated peptide as a targeting agent. In certain embodiments, the targeting peptide may be a bombesin peptide. The bombesin peptide can be used to functionalize gold nanomaterials to target specific tumor cells. See Chanda et al., Nano Lett. 2009, 9(5): 1798-1805; Chanda et al. PNAS 2010, 107(19): 8760-8765; Suresh et al., Bioconjuate Chem. 2014, 25, 1565-1579; and Silva et al., Bioconjuate Chem. 2016, 27, 1153-1164. Each of these sources is incorporated herein by reference in its entirety. The 14 amino acid bombesin peptide isolated from the skin of amphibians of the toad genus and the corresponding gastrin-releasing peptides (GRPs) exhibit an enhanced response in various tumor tissues, eg small cell lung cancer, breast cancer and colon cancer. Bombesin analogues with modified structures have been reported to exhibit similar or even higher affinity for GRP receptors. See, for example, Chanda et al., Nano Lett. 2009, 9(5): 1798-1805 and references cited in this publication. In some embodiments described herein, a seven amino acid truncated bombesin analogue (BBN) as shown in FIG. one.
[0049] В некоторых вариантах осуществления пептид с концевой тиоктовой кислотой может представлять собой бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN, в настоящем документе также называемый BBN), который имеет последовательность: липоевая кислота-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2.[0049] In some embodiments, the thioctic acid-terminated peptide may be thioctic-terminated bombesin (TA-BBN, also referred to herein as BBN), which has the sequence: lipoic acid-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-Met-NH2.
[0050] В некоторых вариантах осуществления пептид с концевой тиоктовой кислотой (например, TA-BBN) может быть связан с поверхностью наночастицы золота посредством одной или двух связей Au-S.[0050] In some embodiments, a thioctic acid-terminated peptide (eg, TA-BBN) can be linked to the surface of the gold nanoparticle via one or two Au-S bonds.
[0051] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 1% до около 40% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 1%, около 5%, около 10%, около 11%, около 12%, около 13%, около 14%, около 15%, около 16%, около 17%, около 18%, около 19%, около 20%, около 21%, около 22%, около 23%, около 24%, около 25%, около 26%, около 27%, около 28%, около 29%, около 30%, около 35% или около 40% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата, например около 20% или около 25%, или количество в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около 10% до около 30%, от около 20% до около 30% или от около 15% до около 25%. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 20% или около 25% пептида с концевой тиоктовой кислотой по массе наноконъюгата.[0051] In some embodiments, the nanoconjugate described herein contains from about 1% to about 40% thioctic acid terminated peptide by weight of the nanoconjugate. In some embodiments, the nanoconjugate contains about 1%, about 5%, about 10%, about 11%, about 12%, about 13%, about 14%, about 15%, about 16%, about 17%, about 18%, about 19%, about 20%, about 21%, about 22%, about 23%, about 24%, about 25%, about 26%, about 27%, about 28%, about 29%, about 30%, about 35 % or about 40% of the thioctic acid terminated peptide by weight of the nanoconjugate, e.g., about 20% or about 25%, or an amount between any two of the above, e.g., about 10% to about 30%, about 20% to about 30% or from about 15% to about 25%. In some embodiments, the nanoconjugate contains about 20% or about 25% thioctic acid terminated peptide by weight of the nanoconjugate.
[0052] В некоторых вариантах осуществления конструкцию AuNP-DTDTPA-BBN, которая впоследствии может быть связана с доксорубицином, можно получать способом, включающим конъюгацию наночастицы AuNP-DTDTPA с пептидом с концевой тиоктовой кислотой, причем золото в виде наночастицы золота и пептид с концевой тиоктовой кислотой могут присутствовать в реакции конъюгации в стехиометрическом соотношении от около 1:0,5 до около 1:4. Используемый в настоящем документе термин «стехиометрическое соотношение» относится к молярному соотношению.[0052] In some embodiments, the AuNP-DTDTPA-BBN construct, which can subsequently be linked to doxorubicin, can be prepared by a method comprising conjugating an AuNP-DTDTPA nanoparticle to a thioctic acid-terminated peptide, wherein the gold is in the form of the gold nanoparticle and the thioctic-terminated peptide acid may be present in the conjugation reaction in a stoichiometric ratio of from about 1:0.5 to about 1:4. As used herein, the term "stoichiometric ratio" refers to the molar ratio.
[0053] В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение золота в виде наночастицы золота и пептида с концевой тиоктовой кислотой, используемых в реакции конъюгации, может составлять около 1:0,75, около 1:1, около 1:1,5, около 1:2, около 1:2,5, около 1:3, около 1:3,5 или около 1:4, например около 1:2, или находиться в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных соотношений, например от около 1:1 до около 1:4, от около 1:1 до около 1:3, от около 1:1 до около 1:2, от около 1:1,5 до около 1:4, от около 1:1,5 до около 1:3, от около 1:1,5 до около 1:2,5 или от около 1:1,5 до около 1:2.[0053] In some embodiments, the stoichiometric ratio of the gold nanoparticle gold to the thioctic acid terminated peptide used in the conjugation reaction may be about 1:0.75, about 1:1, about 1:1.5, about 1: 2, about 1:2.5, about 1:3, about 1:3.5, or about 1:4, such as about 1:2, or between any two of the above ratios, such as about 1:1 to about 1:4, about 1:1 to about 1:3, about 1:1 to about 1:2, about 1:1.5 to about 1:4, about 1:1.5 to about 1 :3, about 1:1.5 to about 1:2.5, or about 1:1.5 to about 1:2.
[0054] В некоторых вариантах осуществления соотношение пептида с концевой тиоктовой кислотой, используемого в реакции конъюгации, и золота в виде наночастицы золота составляет по меньшей мере около 1:1,5, по меньшей мере около 1:2, по меньшей мере около 1:2,5 или по меньшей мере около 1:3.[0054] In some embodiments, the ratio of the thioctic acid terminated peptide used in the conjugation reaction to gold in the form of gold nanoparticles is at least about 1:1.5, at least about 1:2, at least about 1: 2.5 or at least about 1:3.
[0055] В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение золота в виде наночастицы золота и пептида с концевой тиоктовой кислотой, используемого в реакции конъюгации, составляет около 1:2.[0055] In some embodiments, the implementation of the stoichiometric ratio of gold in the form of gold nanoparticles and peptide with terminal thioctic acid used in the conjugation reaction is about 1:2.
[0056] Как правило, доксорубицин в наноконъюгате связан с DTDTPA посредством амидной связи, образованной между карбоксилатной группой DTDTPA и аминогруппой доксорубицина.[0056] Typically, doxorubicin in the nanoconjugate is linked to DTDTPA via an amide bond formed between the carboxylate group of DTDTPA and the amino group of doxorubicin.
[0057] В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, содержит от около 0,01% до около 0,05% доксорубицина по массе наноконъюгата. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат может содержать около 0,01%, около 0,015%, около 0,02%, около 0,025%, около 0,03%, около 0,035%, около 0,04%, около 0,045% или около 0,05% доксорубицина по массе наноконъюгата, например около 0,03%, или количество в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около 0,01% до около 0,04%, от около 0,01% до около 0,03%, от около 0,02% до около 0,05%, от около 0,02% до около 0,04%, от около 0,02% до около 0,03% или от около 0,025% до 0,035%. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат содержит около 0,03% доксорубицина по массе наноконъюгата.[0057] In some embodiments, the nanoconjugate described herein contains from about 0.01% to about 0.05% doxorubicin by weight of the nanoconjugate. In some embodiments, the nanoconjugate may contain about 0.01%, about 0.015%, about 0.02%, about 0.025%, about 0.03%, about 0.035%, about 0.04%, about 0.045%, or about 0. 05% doxorubicin by weight of the nanoconjugate, such as about 0.03%, or an amount between any two of the above, such as about 0.01% to about 0.04%, about 0.01% to about 0.03 %, from about 0.02% to about 0.05%, from about 0.02% to about 0.04%, from about 0.02% to about 0.03%, or from about 0.025% to 0.035%. In some embodiments, the nanoconjugate contains about 0.03% doxorubicin by weight of the nanoconjugate.
[0058] Наноконъюгаты можно охарактеризовать по их гидродинамическому диаметру (т.е. гидродинамическому размеру). В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, имеет гидродинамический диаметр от около 100 нм до около 150 нм или от около 110 нм до около 140 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS). В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр около 100 нм, около 110 нм, около 115 нм, около 120 нм, около 125 нм, около 130 нм, около 135 нм, около 140 нм или около 145 нм или около 150 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS), например около 125 нм или размер в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около 120 нм до около 125 нм, от около 120 нм до около 130 нм или от около 125 нм до около 130 нм. В некоторых вариантах осуществления наноконъюгат имеет гидродинамический диаметр около 125 нм при измерении путем динамического светорассеяния (DLS).[0058] Nanoconjugates can be characterized by their hydrodynamic diameter (ie, hydrodynamic size). In some embodiments, the nanoconjugate described herein has a hydrodynamic diameter of about 100 nm to about 150 nm, or about 110 nm to about 140 nm as measured by dynamic light scattering (DLS). In some embodiments, the nanoconjugate has a hydrodynamic diameter of about 100 nm, about 110 nm, about 115 nm, about 120 nm, about 125 nm, about 130 nm, about 135 nm, about 140 nm, or about 145 nm, or about 150 nm as measured by dynamic light scattering (DLS), such as about 125 nm, or a size between any two of the above, such as about 120 nm to about 125 nm, about 120 nm to about 130 nm, or about 125 nm to about 130 nm. In some embodiments, the nanoconjugate has a hydrodynamic diameter of about 125 nm as measured by dynamic light scattering (DLS).
[0059] Наноконъюгаты также можно охарактеризовать по их дзета-потенциалу. В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата, описанного в настоящем документе, находится в диапазоне от около -15 мВ до около -30 мВ. В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата составляет около -15 мВ, около -16 мВ, около -17 мВ, около -18 мВ, около -19 мВ, около -20 мВ, около -21 мВ, около -22 мВ, около -23 мВ, около -24 мВ, около -25 мВ, около -26 мВ, около -27 мВ, около -28 мВ, около -29 мВ или около -30 мВ, например около -23 мВ, или находится в диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от около -15 мВ до около -25 мВ, от около -20 мВ до около -25 мВ или от около -20 мВ до около -30 мВ. В некоторых вариантах осуществления значение дзета-потенциала наноконъюгата составляет от около -20 мВ до около -25 мВ.[0059] Nanoconjugates can also be characterized by their zeta potential. In some embodiments, the implementation of the value of the zeta potential of the nanoconjugate described in this document is in the range from about -15 mV to about -30 mV. In some embodiments, the nanoconjugate zeta potential value is about -15 mV, about -16 mV, about -17 mV, about -18 mV, about -19 mV, about -20 mV, about -21 mV, about -22 mV, about -23 mV, about -24 mV, about -25 mV, about -26 mV, about -27 mV, about -28 mV, about -29 mV or about -30 mV, for example about -23 mV, or is in the range between any two of the above values, for example, from about -15 mV to about -25 mV, from about -20 mV to about -25 mV, or from about -20 mV to about -30 mV. In some embodiments, the implementation of the value of the zeta potential of the nanoconjugate is from about -20 mV to about -25 mV.
[0060] В одном варианте осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, по существу состоит из наночастицы золота (AuNP), дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTDTPA), пептида бомбезина с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) и доксорубицина, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, TA-BBN связан непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA; причем предшественник наноконъюгата AuNP-DTDTPA-BBN получают способом, включающим конъюгацию наночастиц AuNP-DTDTPA с TA-BBN, причем золото в виде наночастицы золота и пептид бомбезин с концевой тиоктовой кислотой присутствуют в реакции конъюгации в стехиометрическом соотношении около 1:2.[0060] In one embodiment, the nanoconjugate described herein essentially consists of a gold nanoparticle (AuNP), dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA), a thioctic acid terminated bombesin peptide (TA-BBN), and doxorubicin, where DTDTPA is linked directly to the surface of the gold nanoparticle via at least one Au-S bond, TA-BBN is bonded directly to the surface of the gold nanoparticle via at least one Au-S bond, and doxorubicin is bonded to DTDTPA; moreover, the AuNP-DTDTPA-BBN nanoconjugate precursor is obtained by a method including the conjugation of AuNP-DTDTPA nanoparticles with TA-BBN, wherein gold in the form of gold nanoparticles and bombesin peptide with terminal thioctic acid are present in the conjugation reaction in a stoichiometric ratio of about 1:2.
[0061] В некоторых вариантах осуществления описанный выше наноконъюгат может содержать наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA), пептид бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) и доксорубицин, причем наноконъюгат содержит от около 15% до около 25% TA-BBN, от около 25% до около 35% DTDTPA и от около 0,01% до около 0,05% доксорубицина по массе наноконъюгата.[0061] In some embodiments, the nanoconjugate described above may comprise a gold nanoparticle (AuNP), dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA), thioctic acid terminated bombesin peptide (TA-BBN), and doxorubicin, wherein the nanoconjugate contains from about 15% to about 25% TA-BBN, about 25% to about 35% DTDTPA, and about 0.01% to about 0.05% doxorubicin by weight of the nanoconjugate.
[0062] В другом варианте осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, может содержать наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA), пептид бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) и доксорубицин, причем наноконъюгат содержит около 20% TA-BBN, около 30% DTDTPA и около 0,03% доксорубицина по массе наноконъюгата.[0062] In another embodiment, the nanoconjugate described herein may comprise gold nanoparticle (AuNP), dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA), thioctic acid terminated bombesin peptide (TA-BBN), and doxorubicin, wherein the nanoconjugate contains about 20% TA -BBN, about 30% DTDTPA and about 0.03% doxorubicin by weight of the nanoconjugate.
[0063] Хотя в наноконъюгатах, описанных в настоящем документе, как правило, присутствует нацеливающий пептид, в некоторых вариантах осуществления наноконъюгат, описанный в настоящем документе, не содержит пептида с концевой тиоктовой кислотой. Например, в некоторых вариантах осуществления наноконъюга содержит наночастицу золота (AuNP), дитиолированную диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTDTPA) и доксорубицин, где DTDTPA связана непосредственно с поверхностью наночастицы золота посредством по меньшей мере одной связи Au-S, а доксорубицин связан с DTDTPA, как описано в других местах настоящего документа. В настоящем документе эта конструкция называется AuNP(DTDTPA)-DOX.[0063] While a targeting peptide is typically present in the nanoconjugates described herein, in some embodiments, the nanoconjugate described herein does not contain a thioctic acid-terminated peptide. For example, in some embodiments, the nanoconjugation comprises a gold nanoparticle (AuNP), dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA) and doxorubicin, where DTDTPA is bonded directly to the surface of the gold nanoparticle via at least one Au-S bond and doxorubicin is bonded to DTDTPA as described in elsewhere in this document. This construct is referred to herein as AuNP(DTDTPA)-DOX.
[0064] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ получения наноконъюгата, описанного в настоящем документе, включающий связывание доксорубицина с наночастицей, функционализированной DTDTPA. В некоторых вариантах осуществления способ включает (1) конъюгацию AuNP-DTDTPA с пептидом с концевой тиоктовой кислотой (например, TA-BBN) с получением конъюгата; и (2) связывание конъюгата с доксорубицином с получением наноконъюгата.[0064] In some embodiments, the implementation of the present invention provides a method for obtaining nanoconjugate described in this document, including the binding of doxorubicin to a nanoparticle functionalized with DTDTPA. In some embodiments, the method comprises (1) conjugating AuNP-DTDTPA with a thioctic acid-terminated peptide (eg, TA-BBN) to form a conjugate; and (2) linking the doxorubicin conjugate to form the nanoconjugate.
[0065] В некоторых вариантах осуществления на этапе связывания между карбоксильной группой DTDTPA и аминогруппой DOX образуется амидная связь. В некоторых вариантах осуществления этап связывания осуществляют с использованием активирующего агента, такого как EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) и сульфо-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид).[0065] In some embodiments, an amide bond is formed between the carboxyl group of DTDTPA and the amino group of DOX during the coupling step. In some embodiments, the coupling step is carried out using an activating agent such as EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) and sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide).
[0066] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая наноконъюгат, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.[0066] In some embodiments, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the nanoconjugate described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0067] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также предложен способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества наноконъюгата, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.[0067] In some embodiments, the present invention also provides a method of treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the nanoconjugate described herein. In some embodiments, the subject is a human.
[0068] В некоторых вариантах осуществления вид рака, подлежащий лечению, может быть выбран из группы, состоящей из острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), остеосаркомы, рака молочной железы, рака эндометрия, рака желудка, рака головы и шеи, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака печени, рака почки, множественной миеломы, нейробластомы, рака яичника, рака легкого (например, мелкоклеточного рака легкого и немелкоклеточного рака легкого), саркомы мягких тканей, тимом, рака щитовидной железы, рака мочевого пузыря (например, переходно-клеточного рака мочевого пузыря), саркомы матки, рака предстательной железы, рака толстой кишки, рака яичника, рака поджелудочной железы, опухоли Вильмса и макроглобулинемии Вальденстрема.[0068] In some embodiments, the type of cancer to be treated may be selected from the group consisting of acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), osteosarcoma, breast cancer, endometrial cancer, gastric cancer, head cancer, and neck, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, liver cancer, kidney cancer, multiple myeloma, neuroblastoma, ovarian cancer, lung cancer (eg, small cell lung cancer and non-small cell lung cancer), soft tissue sarcoma, thymoma, thyroid cancer, bladder cancer ( for example, transitional cell carcinoma of the bladder), uterine sarcoma, prostate cancer, colon cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, Wilms' tumor, and Waldenström's macroglobulinemia.
[0069] В некоторых вариантах осуществления вид рака, подлежащий лечению в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, связан со сверхэкспрессией GRP. В некоторых вариантах осуществления рак, связанный со сверхэкспрессией GRP, может представлять собой мелкоклеточный рак легкого, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, немелкоклеточный рак легкого или рак поджелудочной железы.[0069] In some embodiments, the cancer being treated according to the methods described herein is associated with overexpression of GRP. In some embodiments, the cancer associated with GRP overexpression can be small cell lung cancer, prostate cancer, breast cancer, colon cancer, ovarian cancer, non-small cell lung cancer, or pancreatic cancer.
[0070] Наноконъюгат или фармацевтическую композицию, описанные в настоящем документе, можно вводить субъекту различными способами, известными специалистам в данной области. Например, наноконъюгат или фармацевтическую композицию настоящего изобретения, можно вводить путем инъекции или перорального введения.[0070] The nanoconjugate or pharmaceutical composition described herein can be administered to a subject in a variety of ways known to those skilled in the art. For example, the nanoconjugate or pharmaceutical composition of the present invention may be administered by injection or oral administration.
[0071] Следующие примеры являются лишь иллюстративными примерами композиций и способов, описанных в настоящем документе, и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.[0071] The following examples are merely illustrative examples of the compositions and methods described herein and should not be construed as limiting the scope of the present invention.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
[0072] Основные способы. Материалы, используемые для синтеза наночастиц золота (AuNP), получали у стандартных поставщиков. Тригидрат золотохлористоводородной кислоты (HAuCl4⋅3H2O), боргидрид натрия (NaBH4), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPА), уксусный ангидрид, безводный пиридин, гидрохлорид 2-аминоэтантиола, триэтиламин, ледяную уксусную кислоту (СН3СООН), нитрат галлия (Ga(NO3)3), гидроксид натрия (NaOH), хлороводородную кислоту (НСl), метанол (МеОН), диэтиловый простой эфир (Et2O), хлорид натрия (NaCl), диметилформамид (DMF) и диметилсульфоксид (DMSO) приобретали у компании Aldrich и использовали в полученном виде. Для получения водных растворов и для промывки наночастиц золота использовали (деионизированную) воду Milli-Q (ρ>18 MΩ). Набор для анализа пролиферации клеток МТТ приобретали у компании Promega Corporation, США.[0072] Basic methods. The materials used for the synthesis of gold nanoparticles (AuNP) were obtained from standard suppliers. Acetic anhydride, anhydrous pyridine, 2 -aminoethanethiol hydrochloride, triethylamine, glacial acetic acid (CH 3 COOH ) , gallium nitrate ( Ga(NO 3 ) 3 ), sodium hydroxide (NaOH), hydrochloric acid (HCl), methanol (MeOH), diethyl ether (Et 2 O), sodium chloride (NaCl), dimethylformamide (DMF), and dimethyl sulfoxide (DMSO) were purchased from Aldrich and used as received. Milli-Q (deionized) water (ρ>18 MΩ) was used to obtain aqueous solutions and to wash the gold nanoparticles. The MTT cell proliferation assay kit was purchased from Promega Corporation, USA.
[0073] Спектроскопия в УФ-видимой области. Спектры поглощения в УФ-видимой области регистрировали при комнатной температуре с использованием спектрофотометра Cytation 3 (Biotek) в одноразовом 96-луночном планшете с регулировкой длины пути.[0073] Spectroscopy in the UV-visible region. Absorption spectra in the UV-visible region were recorded at room temperature using a Cytation 3 spectrophotometer (Biotek) in a disposable 96-well plate with adjustable path length.
[0074] Электронная микроскопия. Изображения получали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ) JEOL 1400 производства компании JEOL LTD., г. Токио, Япония. Образцы для ТЕМ получали путем помещения 5 мкл раствора наночастиц золота на медную сетку 300 меш с углеродным покрытием. Избыток раствора осторожно удаляли и сетку оставляли для высыхания в течение дополнительных пяти минут. Средний размер и распределение наночастиц по размерам определяли путем обработки изображений ТЕМ в графическом редакторе Adobe Photoshop с программным модулем Fovea.[0074] Electron microscopy. Images were obtained using a JEOL 1400 transmission electron microscope (TEM) manufactured by JEOL LTD., Tokyo, Japan. TEM samples were prepared by placing 5 μl of gold nanoparticle solution on a carbon-coated 300 mesh copper grid. The excess solution was carefully removed and the grid was left to dry for an additional five minutes. The average size and size distribution of nanoparticles were determined by processing TEM images in the Adobe Photoshop graphics editor with the Fovea software module.
[0075] Динамическое светорассеяние (DLS) и анализ дзета-потенциала. Измерения DLS проводили с помощью анализатора Malvern Zetasizer Nano ZS (от компании Malvern instruments, г. Мальверн, США), оснащенного гелий-неоновым лазером с длиной волны 633 нм и работающего под углом 173°. Для сбора и анализа данных использовали программное обеспечение Dispersion Technology Software (DTS) версии 5.10 от компании Malvern. 600 мкл каждого образца измеряли в одноразовых низкообъемных полумикрокюветах (Fisher Scientific, США) с длиной пути 10 мм. Измерения проводили в трех повторах в положении 4,65 мм от стенки кюветы с использованием автоматического аттенюатора. Для каждого образца проводили серию из 15 анализов по 10 секунд. Для всех образцов наночастиц рассчитывали автокорреляционную функцию с использованием «режима общего назначения» и по ней определяли распределение по размерам, средний диаметр Z и коэффициент полидисперсности (PDI). Применяли установленные по умолчанию значения коэффициента фильтрации (50%), а также нижнего (0,05) и верхнего (0,01) порогов. Измерения дзета-потенциала проводили в трех повторах с использованием воды в качестве диспергирующего вещества и модели Хюккеля. Для каждого образца проводили серию из 20 анализов в режиме автоматического анализа.[0075] Dynamic light scattering (DLS) and zeta potential analysis. DLS measurements were performed using a Malvern Zetasizer Nano ZS analyzer (Malvern instruments, Malvern, USA) equipped with a 633 nm HeNe laser operating at an angle of 173°. Dispersion Technology Software (DTS) version 5.10 from Malvern was used for data collection and analysis. 600 μl of each sample was measured in disposable low-volume semi-micro cuvettes (Fisher Scientific, USA) with a path length of 10 mm. The measurements were carried out in triplicate at a position of 4.65 mm from the cell wall using an automatic attenuator. For each sample, a series of 15 analyzes was performed for 10 seconds. For all samples of nanoparticles, the autocorrelation function was calculated using the "general purpose mode" and the size distribution, the average diameter Z and the coefficient of polydispersity (PDI) were determined from it. The default values of the filtration coefficient (50%), as well as the lower (0.05) and upper (0.01) thresholds were used. Zeta potential measurements were performed in triplicate using water as a dispersant and the Hückel model. For each sample, a series of 20 analyzes was performed in automatic analysis mode.
[0076] Анализ с отслеживанием наночастиц. Гидродинамические диаметры наночастиц AuNP измеряли с помощью системы NanoSight LM10-HSGFT в конфигурации, включающей терморегулируемую смотровую камеру для образцов LM14G, оборудованную лазером с длиной волны 532 нм (в зеленой области спектра) (от компании NanoSight Limited, г. Эймсбери, Великобритания). Видеозапись траектории наночастиц AuNP на основе рэлеевского рассеяния вели с помощью монохромной видеокамеры Marlin на основе приборов с зарядовой связью (ПЗС) (от компании Allied Vision Technologies, Германия). Образцы вводили в смотровую камеру с помощью шприца на 1 мл (от компании Becton Dickinson, штат Нью-Джерси, США) и поддерживали постоянную температуру 22°С. Для сбора и анализа данных по образцам использовали программу NanoSight 2.2. Каждое измерение размера было основано на 30-секундной видеозаписи, а средний гидродинамический диаметр рассчитывался по уравнению Эйнштейна - Стокса. Как отмечено ниже, перед анализом с отслеживанием наночастиц (NTA) образцы разбавляли в 30 раз относительно концентрации исходного раствора AuNP. Кратность разведения выбирали таким образом, чтобы в 30-секундной видеозаписи отслеживалось ~900 частиц. Такие условия позволили получить репрезентативную выборку для всего образца - это подтверждается тем фактом, что распределение наночастиц по размерам не изменилось с увеличением продолжительности видеозаписей, в которых было проанализировано существенно больше наночастиц. Для каждого образца проводили три измерения, чтобы получить средний размер и среднеквадратичное отклонение.[0076] Nanoparticle tracking analysis. The hydrodynamic diameters of the AuNPs were measured using a NanoSight LM10-HSGFT system in a configuration including a temperature controlled LM14G sample viewing chamber equipped with a 532 nm (green) laser (from NanoSight Limited, Amesbury, UK). The Rayleigh scattering based AuNP trajectory was video recorded using a Marlin monochrome CCD camera (from Allied Vision Technologies, Germany). Samples were introduced into the viewing chamber using a 1 ml syringe (Becton Dickinson, NJ, USA) and maintained at a constant temperature of 22°C. NanoSight 2.2 software was used to collect and analyze data on samples. Each size measurement was based on a 30-second videotape, and the mean hydrodynamic diameter was calculated using the Einstein-Stokes equation. As noted below, prior to nanoparticle tracking (NTA) analysis, the samples were diluted 30-fold relative to the concentration of the original AuNP solution. The dilution ratio was chosen so that ~900 particles were tracked in a 30-s video recording. Such conditions made it possible to obtain a representative sample for the entire sample - this is confirmed by the fact that the size distribution of nanoparticles did not change with the increase in the duration of the videos, in which significantly more nanoparticles were analyzed. Three measurements were taken for each sample to obtain the mean size and standard deviation.
[0077] Клеточная культура. Клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 и карциномы молочной железы человека MDA-MB231 (Американская коллекция типовых культур [АТСС], США) выращивали в среде RPMI 1640 (приобретенной у компании Gibco BRL, г. Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) с добавлением 4,5 г/л D-глюкозы, 25 мМ Hepes, 0,11 г/л пирувата натрия, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 2 мМ L-глутамина, 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (от компании Atlanta Biologicals, США) и 1% раствора антибиотиков пенициллина/стрептомицина. Клетки культивировали в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% СО2, при 37°С (от компании Thermo Scientific, США) с заменой среды через день. Формировали монослои клеток, после слияния из колб с клеточными культурами и трипсином-ЭДТА (от компании Invitrogen) собирали клетки и дополнительно высевали их отдельно.[0077] Cell culture. PC-3 human prostate carcinoma and MDA-MB231 human breast carcinoma cells (American Type Culture Collection [ATCC], USA) were grown in RPMI 1640 medium (purchased from Gibco BRL, Grand Island, NY) supplemented with 4.5 g/l D-glucose, 25 mM Hepes, 0.11 g/l sodium pyruvate, 1.5 g/l sodium bicarbonate, 2 mM L-glutamine, 10% heat-inactivated fetal bovine serum (from Atlanta Biologicals, USA) and 1% penicillin/streptomycin antibiotic solution. Cells were cultured in a humidified atmosphere of 95% air and 5% CO 2 at 37°C (from Thermo Scientific, USA) with medium change every other day. Cell monolayers were formed, after fusion, cells were harvested from flasks with cell cultures and trypsin-EDTA (from Invitrogen) and additionally seeded separately.
[0078] Измерения IС50. Для конъюгатов определяли аффинность связывания с рецепторами посредством анализа конкурентного связывания с клетками, проводимого на клеточных культурах РС-3 с использованием 125I-Tyr4-бомбезина в качестве GRP-специфического меченного радиоизотопом лиганда. Приблизительно 30000 клеток инкубировали при 37°С в течение 40 минут в атмосфере с 5% СО2 при 20000 импульсов/мин 125I-Tyr4-бомбезина (2200 Ки/ммоль) и увеличении концентрации исследуемого конъюгата. После инкубации реакционную среду отсасывали и клетки трижды промывали холодным модифицированным буфером RPMI 1640. Связанную с клетками радиоактивность определяли путем подсчета с помощью счетчика гамма-частиц Packard Riastar. Значения IC50 рассчитывали с использованием программного обеспечения для построения графиков Graph Fit 4.0. Строили график зависимости % 125I-Tyr4-бомбезина, связанного с клетками, от концентрации исследуемого конъюгата, чтобы определить его показатель IC50.[0078] IC 50 measurements. For the conjugates, receptor binding affinity was determined by a competitive cell binding assay performed on PC-3 cell cultures using 125 I-Tyr4-bombesin as the GRP-specific radiolabeled ligand. Approximately 30,000 cells were incubated at 37° C. for 40 minutes in a 5% CO 2 atmosphere at 20,000 pulses/min of 125 I-Tyr4-bombesin (2200 Ci/mmol) and increasing the concentration of the test conjugate. After incubation, the reaction medium was aspirated and the cells were washed three times with cold modified RPMI 1640 buffer. Cell-bound radioactivity was determined by counting with a Packard Riastar gamma counter. IC 50 values were calculated using Graph Fit 4.0 charting software. % 125 I-Tyr4-bombesin bound to cells was plotted against concentration of test conjugate to determine its IC 50 value.
[0079] Анализ цитотоксичности in vitro. Оценку цитотоксичности NP1-DOX и NP2-DOX in vitro с использованием соответствующих контролен, таких как NP1, NP2 и свободный доксорубицин, проводили на раковых клетках, экспрессирующих и не экспрессирующих GRP - РС3 и MDA-MB-231 соответственно. Оценку цитотоксичности проводили в трех повторах, следуя протоколу в соответствии с описанием производителя. Вкратце, 1×105 мл-1 клеток, находящихся в фазе экспоненциального роста, помещали в плоскодонный 96-луночный планшет с полистирольным покрытием и инкубировали в течение 12 часов в инкубаторе СО2 при 5% СО2 и 37°С. Готовили серию растворов NP1-DOX и NP2-DOX в среде в диапазоне концентраций от 0 до 10 мкг/мл (0; 0,31; 0,625; 1,25; 2,5; 5,0 и 10 мкг/мл). Раствор каждой концентрации добавляли в планшет в четырех повторах. Через 24 часа инкубации добавляли 10 мкл на лунку МТТ (в полученном от производителя виде, от компании Promega Corporation, США) и выдерживали в течение 4 часов, а затем образованные таким образом кристаллы формазана растворяли в 100 мкл детергентсодержащего/солюбилизирующего буфера. Планшеты выдерживали в течение 2 часов в темноте при 25°С, чтобы растворились все кристаллы, и измеряли интенсивность проявившегося окрашивания с помощью микропланшет-ридера (от компаний Epoch, Biotek, США), работающего на длине волны 570 нм. В качестве холостых проб использовали лунки с полноценной средой, наночастицами и МТТ, но без клеток. Необработанные клетки считали на 100% жизнеспособными.[0079] In vitro cytotoxicity assay. Evaluation of cytotoxicity of NP1-DOX and NP2-DOX in vitro using appropriate controls such as NP1, NP2 and free doxorubicin was performed on cancer cells expressing and not expressing GRP - PC3 and MDA-MB-231, respectively. The evaluation of cytotoxicity was performed in triplicate, following the protocol in accordance with the manufacturer's description. Briefly, 1×10 5 ml -1 cells in the exponential growth phase were placed in a flat-bottomed 96-well polystyrene-coated plate and incubated for 12 hours in a CO 2 incubator at 5% CO 2 and 37°C. A series of solutions of NP1-DOX and NP2-DOX were prepared in the medium in the concentration range from 0 to 10 µg/ml (0; 0.31; 0.625; 1.25; 2.5; 5.0 and 10 µg/ml). A solution of each concentration was added to the plate in four repetitions. After 24 hours of incubation, 10 μl per well of MTT (as obtained from the manufacturer, from Promega Corporation, USA) was added and kept for 4 hours, and then the formazan crystals thus formed were dissolved in 100 μl of detergent-containing/solubilizing buffer. The plates were kept for 2 hours in the dark at 25°C to dissolve all the crystals, and the intensity of the developed coloration was measured using a microplate reader (from Epoch, Biotek, USA) operating at a wavelength of 570 nm. Wells with complete medium, nanoparticles, and MTT, but without cells, were used as blank samples. Untreated cells were considered 100% viable.
[0080] Исследования стабильности in vitro. Исследования стабильности in vitro проводили путем инкубации растворов NP1 и NP2 в условиях с различными уровнями рН: 2, 5, 7, 10 и 12 в течение 24-часового периода. Стабильность обоих наноконъюгатов также проверяли путем провокационного введения в водные растворы NP1 и NP2 (0,5 мл) по 0,5 мл каждого из растворов 0,2 М цистеина, 0,2 М гистидина, 0,2 М человеческого сывороточного альбумина (HSA) и 10% солевого раствора. Для оценки стабильности проводили измерения поглощения в УФ-видимой области, гидродинамического радиуса и дзета-потенциала в период от 0 часов до 96 часов (0, 1, 24, 48, 72 и 96 часов). Пренебрежимо малое изменение полосы плазмонного поглощения NP1 и NP2 в УФ-видимой области подтвердило сохранение стабильности композиции наночастиц во всех провокационных растворах, за исключением цистеинового. Обработанные растворы не показали какого-либо заметного изменения гидродинамических радиусов, что подтверждает стабильность этих конъюгатов.[0080] In vitro stability studies. In vitro stability studies were performed by incubating NP1 and NP2 solutions under conditions with different pH levels: 2, 5, 7, 10 and 12 over a 24 hour period. The stability of both nanoconjugates was also tested by provocative introduction into aqueous solutions of NP1 and NP2 (0.5 ml), 0.5 ml of each solution of 0.2 M cysteine, 0.2 M histidine, 0.2 M human serum albumin (HSA) and 10% saline. To assess stability, UV-visible absorbance, hydrodynamic radius and zeta potential were measured from 0 hours to 96 hours (0, 1, 24, 48, 72 and 96 hours). A negligibly small change in the NP1 and NP2 plasmon absorption bands in the UV-visible region confirmed the stability of the nanoparticle composition in all provocative solutions, except for cysteine. The treated solutions did not show any noticeable change in hydrodynamic radii, confirming the stability of these conjugates.
Пример 1Example 1
Синтез и определение характеристик конъюгатов BBN-AuNP-DTDTPASynthesis and Characterization of BBN-AuNP-DTDTPA Conjugates
[0081] Для конъюгации нацеливающего пептида (бомбезина [BBN]) и химиотерапевтического препарата (DOX) на поверхности наночастицы использовали наночастицы золота (AuNP-DTDTPA; NP1), функционализированные дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTDTPA), в качестве предшественника. См. Фиг. 1.[0081] For conjugation of the targeting peptide (bombesin [BBN]) and the chemotherapy drug (DOX) on the surface of the nanoparticle, gold nanoparticles (AuNP-DTDTPA; NP1) functionalized with dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA) were used as a precursor. See FIG. one.
[0082] Первый этап заключался в конъюгации нацеливающего пептида с NP1. Для конъюгации пептида с NP1 через образование связи золото-тиол использовали бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN). Использовали три различных стехиометрических соотношения AuNP : BBN (1:0,5, 1:2 и 1:4). Избыток непрореагировавшего BBN удаляли путем многократной промывки и выделяли BBN-AuNP-DTDTPA (NP2) в виде гранул чистых наночастиц. Для количественного определения TA-BBN, связанного с NP2, проводили ВЭЖХ-анализ растворов супернатанта, полученных после конъюгации TA-BBN с NP1. Стандартную калибровочную кривую строили с использованием различных концентраций TA-BBN, а площадь под кривой (AUC) для известных концентраций TA-BBN, использованного в реакциях, определяли посредством ВЭЖХ. Полученные значения AUC в супернатантах сопоставляли с известными концентрациями TA-BBNC, чтобы определить количество TA-BBN, конъюгированного на поверхности NP2 (Фиг. 3). В результате конъюгации конструкции AuDTDTPA с TA-BBN в соотношении 1:2 (Au : TA-BBN) в конструкцию было встроено около 0,26 мг TA-BBN на 1 мг AuDTDTPA. См. Фиг. 3. NP2, полученный с использованием соотношения 1:2, показал исключительную стабильность и поэтому был выбран для дополнительных исследований.[0082] The first step was to conjugate the targeting peptide to NP1. Thioctic acid terminated bombesin (TA-BBN) was used to conjugate the peptide to NP1 via gold-thiol bond formation. Three different stoichiometric ratios of AuNP : BBN were used (1:0.5, 1:2 and 1:4). Excess unreacted BBN was removed by repeated washing and BBN-AuNP-DTDTPA (NP2) was isolated as pure nanoparticle beads. To quantify TA-BBN bound to NP2, HPLC analysis of supernatant solutions obtained after conjugation of TA-BBN with NP1 was performed. A standard calibration curve was built using various concentrations of TA-BBN, and the area under the curve (AUC) for known concentrations of TA-BBN used in the reactions was determined by HPLC. The obtained AUC values in the supernatants were compared with the known concentrations of TA-BBNC to determine the amount of TA-BBN conjugated on the surface of NP2 (Fig. 3). Conjugation of the AuDTDTPA construct to TA-BBN in a 1:2 ratio (Au : TA-BBN) introduced about 0.26 mg TA-BBN per mg AuDTDTPA into the construct. See FIG. 3. NP2, made using a 1:2 ratio, showed exceptional stability and was therefore selected for additional studies.
[0083] Определение подробных характеристик наноконъюгатов проводили посредством анализа изображений, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ), абсорбционной спектроскопии в УФ-видимой области, динамического светорассеяния (DLS) и измерений дзета-потенциала. Изображения ТЕМ показали равномерное распределение наноконъюгатов по размерам в диапазоне 3-5 нм (Фиг. 4А и 4В). Спектр поглощения в УФ-видимой области для NP2 не отличался от такового для NP1 после конъюгации с BBN. (Фиг. 4С). Гидродинамический диаметр NP2 на 20 нм отличался от гидродинамического диаметра NP1 после конъюгации с BBN (1:2, Au : BBN). Изменение дзета-потенциала было пренебрежимо малым (~3 единицы) у NP2 по сравнению c NP1. Средний размер частиц, определенный с помощью анализа с отслеживанием наночастиц (NTA) хорошо коррелировал с результатами измерений динамического светорассеяния. Физико-химические свойства конъюгатов NP1 и NP2 в сводном виде представлены в таблице 1.[0083] The determination of the detailed characteristics of the nanoconjugates was carried out by analyzing images obtained using a transmission electron microscope (TEM), absorption spectroscopy in the UV-visible region, dynamic light scattering (DLS) and zeta potential measurements. TEM images showed a uniform size distribution of the nanoconjugates in the 3-5 nm range (FIGS. 4A and 4B). The absorption spectrum in the UV-visible region for NP2 did not differ from that for NP1 after conjugation with BBN. (Fig. 4C). The hydrodynamic diameter of NP2 differed by 20 nm from the hydrodynamic diameter of NP1 after conjugation with BBN (1:2, Au : BBN). The change in zeta potential was negligible (~3 units) for NP2 compared to NP1. The average particle size determined by nanoparticle tracking analysis (NTA) correlated well with dynamic light scattering measurements. The physicochemical properties of the NP1 and NP2 conjugates are summarized in Table 1.
Пример 2Example 2
Анализ методом РФЭСXPS analysis
[0084] Для понимания природы связей и химических взаимодействий между AuNP-DTDTPA и TA-BBN провели подробный анализ методом РФЭС. На спектре РФЭС для NP2 присутствуют характерные пики С, N, О, S и Au (Фиг. 5А). На спектре РФЭС высокого разрешения для области Cls присутствуют различные области С-С, С-Н, С-О, C-N, O-С=O, N-C=O, как и следовало ожидать от конъюгированного пептида TA-BBN (Фиг. 5В). Относительные элементные составы и соотнесение пиков с разновидностями углерода в NP2 показаны в таблицах 2 и 3 соответственно.[0084] To understand the nature of bonds and chemical interactions between AuNP-DTDTPA and TA-BBN, a detailed XPS analysis was performed. The XPS spectrum for NP2 has characteristic peaks of C, N, O, S, and Au (Fig. 5A). In the high resolution XPS spectrum for the Cls region, there are various C-C, C-H, C-O, C-N, O-C=O, N-C=O regions, as expected from the conjugated TA-BBN peptide (Fig. 5B) . Relative elemental compositions and correlation of peaks with carbon species in NP2 are shown in Tables 2 and 3, respectively.
[0085] Анализ спектра РФЭС высокого разрешения для области S 2р указывает на наличие двух различных разновидностей S (разновидность 1 и разновидность 1), сигнал каждой из которых расщепляется, образуя дублетный пик. Разновидность 1 проявляется двумя четко выраженными пиками серы при 162,3 и 163,5 эВ, которые относятся к связи Au-S DTDTPA. Дублетный пик серы, S 2p3/2 и S 2p1/2 с величиной взаимодействия [величиной спин-орбитального расщепления] 1,2 эВ, подтверждает адсорбцию тиолов на поверхности золота. Значения энергии связи и величины взаимодействия хорошо коррелируют с данными, приведенными в научной литературе в отношении NP1; однако после конъюгации с BBN пики смещаются в область немного более высокой энергии связи (0,5 эВ). Кроме того, два четко выраженных пика серы для разновидности 2 (при 163,2 и 164,4 эВ), находящиеся в соотношении 2:1, соответствуют связи Au-S (сера, соединенная координационной связью с AuNP) и связи S-CH3 (сера, присутствующая в аминокислоте метилцистеине, входящей в основную цепь пептида BBN) соответственно. Каждый класс пиков серы дополнительно расщеплялся, образуя дублет S 2р3/2 и S 2р1/2 с величиной взаимодействия 1,2 эВ, что подтверждает конъюгацию BBN с AuNP, как сообщалось в научной литературе. Такое присутствие дублета с эквивалентной площадью при более высокой энергии связи свидетельствует о том, что оба атома серы в TA-BBN образовали связь Au-S на поверхности AuNP. После конъюгации с BBN значения энергии связи смещаются в область более низкой энергии по сравнению со значениями для AuNP-BBN, приведенными в научной литературе. Это может быть обусловлено различием в размере ядер наночастиц, которые были использованы для конъюгации с BBN. Энергии элементарной S и некоторых органических форм S находятся в диапазоне 162-164 эВ (Фиг. 6А). Поскольку в области более высокой энергии спектра отсутствуют дополнительные пики, соответствующие окисленной сере, эти измерения согласуются с выводом, что BBN-AuNP-DTDTPA (NP2) является эксклюзивным продуктом, образующимся во время реакции наноконъюгации.[0085] Analysis of the high-resolution XPS spectrum for the
[0086] В области 4f спектра выявлены два различных сигнала золота со значениями энергии 83,6, 84,3 и 87,2, 88,0 эВ для Au 4f7/2 и Au 4f5/2 соответственно, которые относятся к атому золота Au(0) в ядре и к золоту на поверхности, частично обладающему [ионным] характером Au(I) (Фиг. 6В). На основании различных недавних исследований существует распространенное мнение, что дисульфид в тиоктовой кислоте присоединяется, окисляясь, к наночастицам AuNP, в результате чего золото на поверхности наночастицы частично приобретает характер Au(I). Сигналы, соответствующие энергиям связи 84,3 и 88 эВ для пиков Au в области 4f, аналогичны таковым у наночастиц AuNP, конъюгированных с пептидами, о которых сообщается в научной литературе, что указывает на наличие связи Au с атомом S в DTDTPA и TA-BBN. В подтверждение этого факта в спектре РФЭС были отмечены две различные степени окисления золота, соответствующие атому золота в ядре и атому золота на поверхности. Результаты различных исследований РФЭС, проведенных на наночастицах золота, подтверждают аналогичные выводы. Приведенные выше наблюдения четко доказывают факт связывания TA-BBN в наноконъюгате NP2.[0086] In the 4f region of the spectrum, two different gold signals were detected with energy values of 83.6, 84.3 and 87.2, 88.0 eV for
Пример 3Example 3
Синтез и определение характеристик конъюгатов BBN-AuNP-DTDTPA-DOXSynthesis and Characterization of BBN-AuNP-DTDTPA-DOX Conjugates
[0087] Карбоксильные группы DTDTPA на поверхности наночастиц AuNP доступны для дополнительной функционализации. Эти карбоксильные группы использовали для конъюгации доксорубицина. Для конъюгации аминогруппы DOX с карбоксильными группами DTDTPA использовали традиционную реакцию ЕDС/сульфо-NHS, чтобы получить AuNP-DTDTPA-доксорубицин ненаправленного действия (NP1-DOX) и BBN-AuNP-DTDTPA-DOX направленного действия (NP2-DOX).[0087] The DTDTPA carboxyl groups on the surface of the AuNP nanoparticles are available for additional functionalization. These carboxyl groups were used to conjugate doxorubicin. The conventional EDC/sulfo-NHS reaction was used to conjugate the amino group of DOX to the carboxyl groups of DTDTPA to give non-targeted AuNP-DTDTPA-doxorubicin (NP1-DOX) and directional BBN-AuNP-DTDTPA-DOX (NP2-DOX).
[0088] Нагрузку NP1 и NP2 доксорубицином оценивали посредством флуоресцентной спектроскопии. При длине волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 590 нм доксорубицин демонстрирует характерный флуоресцентный сигнал на 600 нм (Фиг. 7). Выполняли серийные разведения DOX и строили стандартную калибровочную кривую для регистрации значений интенсивности флуоресценции (Фиг. 8). Регистрировали значения интенсивности флуоресценции и сопоставляли их со стандартной калибровочной кривой для определения количества доксорубицина, конъюгированного с наночастицами AuNP. Измерения флуоресценции показали, что доксорубицин был конъюгирован в количестве 0,53 мкг и 0,3 мкг на мг AuNP-DTDTPA и BBN-AuNP-DTDTPA соответственно. Дополнительно выполняли серийные разведения NP1-DOX и NP2-DOX и регистрировали значения интенсивности флуоресценции. Изменение интенсивности флуоресценции было пропорциональным и постоянным, что подтверждает конъюгацию DOX с NP1 и NP2. Измерение флуоресценции также указывает на то, что после конъюгации с наночастицами AuNP величина флуоресценции доксорубицина остается неизменной (Фиг. 9 и 10). Спектры в УФ-видимой области для NP1-DOX, NP2-DOX и соответствующих им контролей показаны на Фиг. 11. Наблюдалось изменение гидродинамического диаметра на 10-20 нм после конъюгации DOX как с NP1, так и с NP2. После конъюгации с DOX дзета-потенциал сместился ближе к области положительных значений. Изменение отрицательного значения дзета-потенциала с -72 и -69 мВ для NP1 и NP2 соответственно на -23 мВ указывает на то, что частицы отталкиваются друг от друга и что тенденция к агрегированию частиц отсутствует. Физико-химические свойства конъюгатов NP1-DOX и NP2-DOX в сводном виде представлены в таблице 1.[0088] The loading of NP1 and NP2 with doxorubicin was assessed by fluorescence spectroscopy. At an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 590 nm, doxorubicin exhibits a characteristic fluorescent signal at 600 nm (FIG. 7). Serial dilutions of DOX were performed and a standard calibration curve was generated to record fluorescence intensity values (FIG. 8). Fluorescence intensity values were recorded and compared with a standard calibration curve to determine the amount of doxorubicin conjugated with AuNP nanoparticles. Fluorescence measurements indicated that doxorubicin was conjugated at 0.53 μg and 0.3 μg per mg of AuNP-DTDTPA and BBN-AuNP-DTDTPA, respectively. Additionally, serial dilutions of NP1-DOX and NP2-DOX were performed and fluorescence intensity values were recorded. The change in fluorescence intensity was proportional and constant, which confirms the conjugation of DOX with NP1 and NP2. The fluorescence measurement also indicates that after conjugation with the AuNP nanoparticles, the fluorescence value of doxorubicin remains unchanged (FIGS. 9 and 10). The UV-visible spectra for NP1-DOX, NP2-DOX and their respective controls are shown in FIG. 11. A 10-20 nm change in hydrodynamic diameter was observed after DOX conjugation with both NP1 and NP2. After conjugation with DOX, the zeta potential shifted closer to the region of positive values. A change in the negative zeta potential from -72 and -69 mV for NP1 and NP2, respectively, to -23 mV indicates that the particles are repelling each other and that there is no tendency for particles to aggregate. The physicochemical properties of the NP1-DOX and NP2-DOX conjugates are summarized in Table 1.
Пример 4Example 4
Исследования стабильности in vitroIn vitro stability studies
[0089] Стабильность конъюгатов NP1 и NP2 исследовали в различных биологически значимых растворах. Растворы NP1 и NP2 подвергали нагрузке в виде введения 0,9% NaCl, 0,5% цистеина, 0,2 М гистидина, 0,5% человеческого сывороточного альбумина (HSA) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Стабильность наноконъюгатов в различных временных точках анализировали с помощью трех методов: (i) мониторинга плазмонного резонанса с использованием спектроскопии в УФ-видимой области, (ii) оценки изменений гидродинамического диаметра и (iii) измерения электрофоретического заряда (дзета-потенциала). Изменение длины волны поверхностного плазмонного резонанса и ширины полосы плазмонного поглощения, а также измерение гидродинамического диаметра непосредственно связаны с пониманием агрегационного поведения наночастиц. Измерение дзета-потенциала является показателем сил отталкивания, присутствующих в водном растворе, и может быть использовано для прогнозирования долгосрочной стабильности дисперсий наночастиц in vitro / in vivo. Для наноконъюгатов, полученных при стехиометрических соотношениях Au : BBN, равных 1:2 и 1:4, проводили исследования стабильности. При использовании соотношения Au : BBN 1:4 была выявлена агрегация в течение 24-часового периода, тогда как при соотношении Au : BBN 1:2 оба конъюгата, NP1 и NP2, оставались стабильными в этих биологически значимых растворах. Пики поглощения в УФ-видимой области остаются неизменными, а изменения гидродинамического диаметра и дзета-потенциала минимальны, что подтверждает структурную целостность и надежность конъюгата (Фиг, 12). Однако в присутствии цистеина как для NP1, так и для NP2 наблюдалось увеличение гидродинамического размера со временем (в течение 24 ч) из-за взаимодействий золото-тиол, но это увеличение было незначительным. Данные исследований стабильности in vitro указывают на то, что NP1 и NP2 имеют оптимальную кинетическую стабильность для использования в последующих исследованиях нацеливания на рецепторы in vivo.[0089] The stability of the NP1 and NP2 conjugates was studied in various biologically significant solutions. Solutions NP1 and NP2 were loaded with 0.9% NaCl, 0.5% cysteine, 0.2 M histidine, 0.5% human serum albumin (HSA) and 0.5% bovine serum albumin (BSA). The stability of the nanoconjugates at various time points was analyzed using three methods: (i) plasmon resonance monitoring using UV-visible spectroscopy, (ii) assessment of hydrodynamic diameter changes, and (iii) electrophoretic charge (zeta potential) measurements. Changing the surface plasmon resonance wavelength and the plasmon absorption band width, as well as measuring the hydrodynamic diameter are directly related to understanding the aggregation behavior of nanoparticles. Zeta potential measurement is a measure of the repulsive forces present in an aqueous solution and can be used to predict the long-term stability of in vitro/in vivo nanoparticle dispersions. For nanoconjugates obtained at stoichiometric ratios of Au : BBN equal to 1:2 and 1:4, stability studies were performed. When using the Au : BBN ratio of 1:4, aggregation was detected over a 24-hour period, while at the Au : BBN ratio of 1:2, both conjugates, NP1 and NP2, remained stable in these biologically significant solutions. Absorption peaks in the UV-visible region remain unchanged, and changes in hydrodynamic diameter and zeta potential are minimal, which confirms the structural integrity and reliability of the conjugate (Fig. 12). However, in the presence of cysteine, both NP1 and NP2 showed an increase in hydrodynamic size over time (within 24 h) due to gold-thiol interactions, but this increase was not significant. Data from in vitro stability studies indicate that NP1 and NP2 have optimal kinetic stability for use in subsequent in vivo receptor targeting studies.
Пример 5Example 5
Исследования аффинности связывания NP2 с рецепторами in vitroIn Vitro Receptor Binding Affinity Studies of NP2
[0090] Клетки опухоли предстательной железы человека РС-3 экспрессируют на своей поверхности большое количество рецепторов GRP. Аффинность связывания NP2 оценивали путем проведения анализа конкурентного ингибирования и определения значений IC50. Использовали наночастицы, полученные при трех различных стехиометрических соотношениях Au : BBN (1:0,5; 1:2; 1:4). Построили сравнительный график значений IC50 для различных стехиометрических соотношений Au : BBN (1:0,5; 1:2; 1:4) (Фиг. 13). Значения IC50 конъюгата NP2 с различными соотношениями представлены в микрограммах, поскольку точно определить молекулярные массы наноконъюгатов не представляется возможным. Из данных видно, что у конъюгатов значения IC50 или аффинность связывания с клетками зависят от степени покрытия поверхности наночастиц AuNP пептидом TA-BBN. Например, конъюгат NP2 с соотношением Au : BBN=1:4, у которого на поверхности наночастиц AuNP больше молекул пептида TA-BBN, показал более низкое значение IC50 (или более высокую аффинность связывания с клетками) по сравнению с другими конъюгатами. Однако этот конъюгат является не очень стабильным и не использовался для клеточных исследований. Исследование конкурентного ингибирования подтверждает свойства нацеливания на рецепторы у NP2.[0090] PC-3 human prostate tumor cells express a large number of GRP receptors on their surface. NP2 binding affinity was assessed by performing a competitive inhibition assay and determining IC 50 values. We used nanoparticles obtained at three different stoichiometric ratios of Au : BBN (1:0.5; 1:2; 1:4). A comparative graph of IC 50 values for various Au:BBN stoichiometric ratios (1:0.5; 1:2; 1:4) was plotted (FIG. 13). The IC 50 values of the NP2 conjugate with various ratios are presented in micrograms, since it is not possible to accurately determine the molecular weights of the nanoconjugates. It can be seen from the data that the IC50 values of the conjugates or the affinity of binding to cells depend on the degree of coverage of the AuNP nanoparticle surface with the TA-BBN peptide. For example, the 1:4 Au : BBN NP2 conjugate, which has more TA-BBN peptide molecules on the surface of the AuNP nanoparticles, showed a lower IC 50 value (or higher cell binding affinity) compared to other conjugates. However, this conjugate is not very stable and has not been used for cellular studies. The competitive inhibition study confirms the receptor targeting properties of NP2.
Пример 6Example 6
Анализ цитотоксичности in vitro.In vitro cytotoxicity assay.
[0091] Цитотоксичность in vitro конъюгированных с доксорубицином наночастиц AuNP, NP1-DOX и NP2-DOX в отношении раковых клеток человека, экспрессирующих GRP и не экспрессирующих GRP, изучали посредством МТТ с использованием соответствующих контролей. Клетки рака предстательной железы человека (Рс3) имеют на своей поверхности большое количество рецепторов GRP. В частности, в научной литературе есть данные о том, что на поверхности клеток рака предстательной железы человека присутствует 44000 сайтов рецепторов бомбезина. В качестве раковых клеток, не экспрессирующих GRP, использовали клетки рака молочной железы человека (MDA-МВ231). Свободный доксорубицин показал значения IC50 9,5 мкг/мл в раковых клетках РС3 (Фиг. 14) и >10 мкг/мл в раковых клетках MDA-MB231 (Фиг. 16). Сравнительные диаграммы, демонстрирующие влияние NP1-DOX, NP2-DOX и DOX на цитотоксичность в отношении клеток, экспрессирующих GRP и не экспрессирующих GRP, показаны на Фиг. 15, 17 и 20. В отношении раковых клеток, не экспрессирующих GRP, NP1-DOX и NP2-DOX показали значения IС50 6 мкг/мл и 9 мкг/мл соответственно, тогда как в отношении клеток РС3 значения IC50 составили 10 мкг/мл и 5 мкг/мл соответственно (таблица 4). Следует отметить, что представленные здесь значения IC50 для NP1-DOX и NP2-DOX основаны на общей массе наноконъюгата, а количество DOX, встроенного в наноконъюгат, составляет 0,53 мкг/мл и 0,3 мкг/мл соответственно. Значения IC50 для наноконъюгатов в пересчете на доксорубицин, приведены в таблице 4 и на Фиг. 18 и 19.[0091] The in vitro cytotoxicity of doxorubicin-conjugated AuNP, NP1-DOX and NP2-DOX nanoparticles against GRP-expressing and non-GRP-expressing human cancer cells was studied by MTT using appropriate controls. Human prostate cancer cells (Pc3) have a large number of GRP receptors on their surface. In particular, there is evidence in the scientific literature that 44,000 bombesin receptor sites are present on the surface of human prostate cancer cells. Human breast cancer cells (MDA-MB231) were used as cancer cells not expressing GRP. Free doxorubicin showed IC 50 values of 9.5 μg/mL in PC3 cancer cells (FIG. 14) and >10 μg/mL in MDA-MB231 cancer cells (FIG. 16). Comparative charts showing the effect of NP1-DOX, NP2-DOX and DOX on cytotoxicity against GRP-expressing and non-GRP-expressing cells are shown in FIG. 15, 17, and 20. For non-GRP-expressing cancer cells, NP1-DOX and NP2-DOX showed IC 50 values of 6 μg/mL and 9 μg/mL, respectively, while for PC3 cells, IC 50 values were 10 μg/mL. ml and 5 µg/ml, respectively (table 4). It should be noted that the IC50 values presented here for NP1-DOX and NP2 -DOX are based on the total weight of the nanoconjugate, and the amount of DOX incorporated into the nanoconjugate is 0.53 µg/mL and 0.3 µg/mL, respectively. The IC 50 values for the nanoconjugates, based on doxorubicin, are shown in Table 4 and in FIG. 18 and 19.
[0092] Как видно из приведенного выше, конъюгированные с доксорубицином наночастицы AuNP проявили намного более сильную цитотоксичность, чем свободный доксорубицин. Например, по сравнению с цитотоксичностью свободного доксорубицина цитотоксичность NP2-DOX возросла в 3000 раз и в 6000 раз в отношении раковых клеток, не экспрессирующих GRP и экспрессирующих GRP соответственно.[0092] As can be seen from the above, doxorubicin-conjugated AuNP nanoparticles showed much stronger cytotoxicity than free doxorubicin. For example, compared to the cytotoxicity of free doxorubicin, the cytotoxicity of NP2-DOX increased 3000-fold and 6000-fold against non-GRP and GRP-expressing cancer cells, respectively.
Пример 7Example 7
Синтез AuNP-DTDTPASynthesis of AuNP-DTDTPA
[0093] Наночастицы AuNP, функционализированные дитиолированной диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTDTPA), получали по модифицированному протоколу, описанному в Brust et. al., J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1995, 1655-1656. Вкратце, 200 мг (0,507 ммоль) HAuCl4⋅3H2O растворяли в 120 мл метанола в круглодонной колбе емкостью 500 мл. В отдельной колбе растворяли 482 мг (0,943 ммоль) DTDTPA в 40 мл МеОН и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Этот раствор при непрерывном перемешивании добавляли в водный раствор соли золота с образованием раствора оранжевого цвета. К этой смеси добавляли 190 мг (5 ммоль) NaBH4, растворенного в 14 мл деионизированной воды, при энергичном перемешивании при комнатной температуре. Сразу после добавления NaBH4 раствор становился темно-коричневым с последующим появлением черных хлопьев. Полученную смесь оставляли для перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем добавляли 5 мл 1 М водного раствора НСl. Затем этот черный раствор наночастиц золота подвергали центрифугированию со скоростью 7000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант удаляли, и частицы дважды промывали 0,01 М НСl, используя такие же параметры центрифугирования, как указанные выше. Частицы дополнительно тщательно и последовательно промывали деионизированной водой, а затем диэтиловым простым эфиром. Полученный черный порошок AuNP-DTDTPA высушивали под вакуумом и хранили при -20°С. При необходимости частицы легко диспергировались в 0,01 М NaOH и оставались стабильными более месяца.[0093] AuNP nanoparticles functionalized with dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid (DTDTPA) were prepared according to a modified protocol described in Brust et. al., J. Chem. Soc, Chem. commun. 1995, 1655-1656. Briefly, 200 mg (0.507 mmol) HAuCl 4 ⋅3H 2 O was dissolved in 120 ml methanol in a 500 ml round bottom flask. In a separate flask, 482 mg (0.943 mmol) of DTDTPA were dissolved in 40 ml of MeOH and 2 ml of glacial acetic acid. This solution was added to an aqueous gold salt solution with continuous stirring to form an orange solution. To this mixture was added 190 mg (5 mmol) of NaBH 4 dissolved in 14 ml of deionized water with vigorous stirring at room temperature. Immediately after the addition of NaBH 4 the solution turned dark brown followed by the appearance of black flakes. The resulting mixture was left to stir for 1 hour at room temperature, and then added 5 ml of 1 M aqueous HCl solution. This black solution of gold nanoparticles was then subjected to centrifugation at 7000 rpm for 20 minutes. The supernatant was removed and the particles were washed twice with 0.01 M HCl using the same centrifugation parameters as above. The particles were additionally thoroughly and successively washed with deionized water and then with diethyl ether. The obtained black powder AuNP-DTDTPA was dried under vacuum and stored at -20°C. If necessary, the particles were easily dispersed in 0.01 M NaOH and remained stable for more than a month.
Пример 8Example 8
Синтез пептида BBN с тиоктовой кислотойSynthesis of the BBN peptide with thioctic acid
[0094] BBN получали с помощью твердофазного синтеза пептидов, применяя методику защиты Fmoc-группой, а конечные пептиды очищали посредством ВЭЖХ. В качестве твердой подложки для синтеза использовали 4-гидроксиметилфеноксиацетил-4'-метилбензигидриламиновую смолу. Защищенные Fmoc-группой аминокислоты активировали с использованием одного эквивалента растворов 0,45 М HBTU/HOBt и двух эквивалентов N,N-диизопропилэтиламина. Аминокислоты освобождали от защитной Fmoc-группы с использованием пиперидина и связывали с использованием NMM⋅HBTU. После связывания в соответствующей последовательности всех аминокислот присоединяли тиоктовую кислоту (липоевую кислоту) с использованием DIC⋅HOBt. Отщепление пептида от смолы проводили с использованием TFA. На этом этапе отщепления также удаляли защитные группы боковой цепи аминокислоты. Пептид очищали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С18 с использованием градиента АВ, начиная с 0% В, где А представляет собой 0,1% TFA в воде, а В представляет собой 0,1% TFA в ацетонитриле. После очистки пептидную массу измеряли методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией или матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации, а степень чистоты определяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.[0094] BBN was prepared by solid phase peptide synthesis using the Fmoc group protection technique and the final peptides were purified by HPLC. 4-Hydroxymethylphenoxyacetyl-4'-methylbenzyhydrylamine resin was used as a solid support for the synthesis. Fmoc-protected amino acids were activated using one equivalent of 0.45 M HBTU/HOBt solutions and two equivalents of N,N-diisopropylethylamine. Amino acids were freed from the Fmoc protecting group using piperidine and linked using NMM⋅HBTU. After binding in the appropriate sequence of all amino acids, thioctic acid (lipoic acid) was attached using DIC⋅HOBt. Cleavage of the peptide from the resin was performed using TFA. This cleavage step also removed the amino acid side chain protecting groups. The peptide was purified by reverse phase HPLC on a C18 column using an AB gradient starting at 0% B where A is 0.1% TFA in water and B is 0.1% TFA in acetonitrile. After purification, the peptide mass was measured by liquid chromatography with mass spectrometry or matrix-assisted laser desorption/ionization, and the degree of purity was determined using reverse phase HPLC.
Пример 9Example 9
Синтез специфичных к рецептору бомбезина наноконъюгатов золота, стабилизированных DTDTPA (BBN-AuNP-DTDTPA)Synthesis of bombesin receptor-specific DTDTPA-stabilized gold nanoconjugates (BBN-AuNP-DTDTPA)
[0095] Бомбезин с концевой тиоктовой кислотой подвергали взаимодействию с наночастицами золота в стехиометрических соотношениях Au : BBN, равных 1:0,25, 1:0,5, 1:1, 1:2 и 1:4. Как правило, в стеклянной виале емкостью 20 мл готовили раствор AuNP-DTDTPA ([Au]=2,28 мкмоль) с использованием смеси воды и метанола (1:9) 0,01 М NaOH. Бомбезин с концевой тиоктовой кислотой (TA-BBN) в количествах 0,64 мг (0,57 мкмоль), 1,28 мг (1,14 мкмоль), 2,56 мг (2,27 мкмоль), 5,12 мг (4,54 мкмоль) и 10,24 мг (9,08 мкмоль) растворяли в 4 мл МеОН, а затем добавляли раствор наночастиц. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре, в результате чего наблюдалось образование темно-коричневого осадка. Смесь центрифугировали (9300 g, в течение 10 мин при 20°С) и удаляли супернатант. Осажденные наночастицы AuNP дважды промывали МеОН и трижды - водой. BBN-AuNP-DTDTPA высушивали при низком давлении и хранили при -20°С.[0095] Thioctic acid terminated bombesin was reacted with gold nanoparticles in Au:BBN stoichiometric ratios of 1:0.25, 1:0.5, 1:1, 1:2, and 1:4. Typically, a solution of AuNP-DTDTPA ([Au]=2.28 µmol) was prepared in a 20 ml glass vial using a mixture of water and methanol (1:9) 0.01 M NaOH. Thioctic acid-terminated bombesin (TA-BBN) at 0.64 mg (0.57 µmol), 1.28 mg (1.14 µmol), 2.56 mg (2.27 µmol), 5.12 mg ( 4.54 µmol) and 10.24 mg (9.08 µmol) were dissolved in 4 ml of MeOH, and then the nanoparticle solution was added. The reaction mixture was stirred for 2 hours at room temperature, resulting in the formation of a dark brown precipitate. The mixture was centrifuged (9300 g, for 10 min at 20°C) and the supernatant was removed. The precipitated AuNPs were washed twice with MeOH and three times with water. BBN-AuNP-DTDTPA was dried at low pressure and stored at -20°C.
Пример 10Example 10
Синтез AuNP-DTDTPA-доксорубицина и BBN-AuNP-DTDTPA-доксорубицинаSynthesis of AuNP-DTDTPA-doxorubicin and BBN-AuNP-DTDTPA-doxorubicin
[0096] Синтез конъюгированных с доксорубицином наночастиц золота с пептидом бомбезином и без него проводили в трех повторах. Наночастицы золота в количестве 0,5 мг суспендировали в 1X PBS путем ультразвуковой обработки. К 100 мкл этого раствора добавляли 2 мг гидрохлорида 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC) и 2 мг N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS) в 0,1 М буфера 2-(морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (рН 4,6). Поддерживали рН реакционной смеси на уровне 5,3-5,4 с помощью буфера MES. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при 37°С и 700 об/мин. Через 3 часа реакционную смесь центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин при 25°С. Для конъюгации с наночастицами использовали 0,7 мг доксорубицина для клинического применения. К раствору доксорубицина добавляли наночастицы с активированными карбоксильными группами и реакционную смесь встряхивали. Связывание проводили в течение ночи при 25°С и 750 об/мин. Реакционную смесь центрифугировали при 20000 g в течение 20 минут при 25°С, впоследствии гранулы дважды промывали 1X PBS и ресуспендировали в растворе 1X PBS. Для исследования эффективности конъюгации посредством флуоресцентной спектроскопии использовали как гранулы, так и супернатанты.[0096] Synthesis of doxorubicin-conjugated gold nanoparticles with and without bombesin peptide was performed in triplicate. Gold nanoparticles in an amount of 0.5 mg were suspended in 1X PBS by sonication. To 100 µl of this solution was added 2 mg of 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) and 2 mg of N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) in 0.1 M 2-(morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer ) (pH 4.6). The pH of the reaction mixture was maintained at 5.3-5.4 with MES buffer. The reaction mixture was stirred for 3 hours at 37°C and 700 rpm. After 3 hours the reaction mixture was centrifuged at 20,000 g for 20 min at 25°C. For conjugation with nanoparticles used 0.7 mg of doxorubicin for clinical use. Nanoparticles with activated carboxyl groups were added to the doxorubicin solution, and the reaction mixture was shaken. Binding was carried out overnight at 25° C. and 750 rpm. The reaction mixture was centrifuged at 20,000 g for 20 minutes at 25° C., subsequently the beads were washed twice with 1X PBS and resuspended in 1X PBS solution. Both beads and supernatants were used to study conjugation efficiency by fluorescence spectroscopy.
[0097] Все процитированные патенты, описания патентов и другие документы в полном объеме включены в настоящий документ путем ссылки. Однако, если термин в настоящем описании находится в противоречии или конфликте с термином из включенного посредством ссылки документа, термин из настоящего описания имеет приоритет над конфликтным термином из включенного посредством ссылки документа.[0097] All cited patents, patent specifications, and other documents are incorporated herein by reference in their entirety. However, if a term in this specification conflicts or conflicts with a term in a referenced document, the term in this specification takes precedence over the conflicting term in the referenced document.
[0098] Несмотря на то что были описаны конкретные варианты осуществления, возможно появление альтернативных вариантов, модификаций, вариаций, улучшений и существенных эквивалентов, которые в настоящее время являются или могут являться непредвиденными для заявителей или других специалистов в данной области. Соответственно считается, что прилагаемая формула изобретения в том виде, в котором она была подана, и в том виде, в котором она может быть изменена, охватывает все такие альтернативные варианты, модификации, вариации, улучшения и существенные эквиваленты.[0098] While specific embodiments have been described, there may be alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents that are currently or may be unforeseen by applicants or others skilled in the art. Accordingly, the appended claims, as filed and as may be modified, are deemed to cover all such alternatives, modifications, variations, improvements and substantial equivalents.
Claims (24)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762444114P | 2017-01-09 | 2017-01-09 | |
| US62/444,114 | 2017-01-09 | ||
| PCT/US2018/012882 WO2018129501A1 (en) | 2017-01-09 | 2018-01-09 | Targeted doxorubicin-gold nanoconjugates for tumor therapy |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019125167A RU2019125167A (en) | 2021-02-09 |
| RU2019125167A3 RU2019125167A3 (en) | 2021-09-13 |
| RU2773707C2 true RU2773707C2 (en) | 2022-06-08 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2804488C1 (en) * | 2022-11-28 | 2023-10-02 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Nanoagents for screening pathogenic strains of multidrug-resistant bacteria and method of preparation |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130022682A1 (en) * | 2011-07-20 | 2013-01-24 | Thomas Ming Hung Lee | Ultra-Stable Oligonucleotide-Gold And-Silver Nanoparticle Conjugates And Method Of Their Preparation |
| US20130138032A1 (en) * | 2010-04-15 | 2013-05-30 | Sungjee Kim | ANTICANCER AGENT DELIVERY SYSTEM USING pH-SENSITIVE METAL NANOPARTICLES |
| WO2015103028A1 (en) * | 2013-12-30 | 2015-07-09 | The Curators Of The University Of Missouri | Au multicomponent nanomaterials and synthesis methods |
| RU2568850C2 (en) * | 2009-07-08 | 2015-11-20 | ГР ИНТЕЛЛЕКЧУАЛ РЕЗЕРВ, ЭлЭлСи | New gold nanocrystals for medical treatment and processes for electrochemical production thereof |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2568850C2 (en) * | 2009-07-08 | 2015-11-20 | ГР ИНТЕЛЛЕКЧУАЛ РЕЗЕРВ, ЭлЭлСи | New gold nanocrystals for medical treatment and processes for electrochemical production thereof |
| US20130138032A1 (en) * | 2010-04-15 | 2013-05-30 | Sungjee Kim | ANTICANCER AGENT DELIVERY SYSTEM USING pH-SENSITIVE METAL NANOPARTICLES |
| US20130022682A1 (en) * | 2011-07-20 | 2013-01-24 | Thomas Ming Hung Lee | Ultra-Stable Oligonucleotide-Gold And-Silver Nanoparticle Conjugates And Method Of Their Preparation |
| WO2015103028A1 (en) * | 2013-12-30 | 2015-07-09 | The Curators Of The University Of Missouri | Au multicomponent nanomaterials and synthesis methods |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GU Y-J. et al. "Gold-doxorubicin nanoconjugates for overcoming multidrug resistance", Nanomedicine, 2012, v. 8 (2): 204-211. WOJCIK M. et al. "Enhancing anti-tumor efficacy of Doxorubicin by non-covalent conjugation to gold nanoparticles - in vitro studies on feline fibrosarcoma cell lines", PLoS One, 2015, v. 10(4): e0124955. DARAEE H. et al. "Application of gold nanoparticles in biomedical and drug delivery", Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, 2014, v. 44(1): 410-422. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2804488C1 (en) * | 2022-11-28 | 2023-10-02 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Nanoagents for screening pathogenic strains of multidrug-resistant bacteria and method of preparation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102568577B1 (en) | Targeted doxorubicin-gold nanoconjugates for tumor therapy | |
| Chen et al. | Multifunctional near-infrared-emitting nano-conjugates based on gold clusters for tumor imaging and therapy | |
| EP2210616A1 (en) | Multifunctional stealth nanoparticles for biomedical use | |
| Bai et al. | A simple and general method for preparing antibody-PEG-PLGA sub-micron particles using electrospray technique: An in vitro study of targeted delivery of cisplatin to ovarian cancer cells | |
| JP2018526432A (en) | Nanoparticle-based liver targeted therapy and imaging | |
| US20120107246A1 (en) | Methotrexate-modified nanoparticles and related methods | |
| WO2012106713A2 (en) | Targeted nanoparticle conjugates | |
| Pei et al. | Design of Janus-like PMMA-PEG-FA grafted fluorescent carbon dots and their nanoassemblies for leakage-free tumor theranostic application | |
| US10201622B2 (en) | Tumour-targeted theranostic | |
| EP2549925B1 (en) | Multimodal diagnostic technology for early stage cancer lesions | |
| Gao et al. | Dual-targeted enzyme-sensitive hyaluronic acid nanogels loading paclitaxel for the therapy of breast cancer | |
| Alea-Reyes et al. | Nanostructured materials for photodynamic therapy: synthesis, characterization and in vitro activity | |
| Jain et al. | pH dependent drug release from drug conjugated PEGylated CdSe/ZnS nanoparticles | |
| ES2505890T3 (en) | Conjugates comprising nanoparticles coated with platinum-containing compounds | |
| WO2018141940A1 (en) | Nanoparticle-based liver-targeting therapy | |
| JP2023153424A (en) | Methods of functionalizing nanoparticle | |
| Zayed et al. | Effect of chemical binding of doxorubicin hydrochloride to gold nanoparticles, versus electrostatic adsorption, on the in vitro drug release and cytotoxicity to breast cancer cells | |
| WO2017050979A1 (en) | Nanoparticles for diagnosis and drug delivery | |
| RU2773707C2 (en) | Doxorubicin-gold nanoconjugates with directional influence for tumor therapy | |
| Cheng et al. | Carbon nanomaterials for drug delivery | |
| Brazzale et al. | Durando, Gianni; Fantozzi, Roberto; Caliceti, Paolo; Salmaso, Stefano; Serpe, Loredana. Enhanced selective sonosensitizing efficacy of ultrasound-based anticancer treatment by targeted gold nanoparticles. NANOMEDICINE. None pp: 1-18. | |
| Xu | Development of protein-polymer bioconjugates for anticancer therapy | |
| Anaki et al. | Synthesis and characterization of antibody-conjugated gold nanoparticles for biological applications | |
| Galbiati | Investigating the biological activity of proteins immobilized on colloidal nanoparticles | |
| Soehnlen | Novel Nanomaterials for Tumor Targeted Imaging and Therapy |