RU2771933C1

RU2771933C1 - Method for identifying chromosomal abnormalities by the fish method in multiple myeloma

Info

Publication number: RU2771933C1
Application number: RU2021106775A
Authority: RU
Inventors: Юлия Сергеевна Лаптева; Ваник Абрамович Овсепян
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2022-05-13

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely, to hematology, and pertains to identifying chromosomal abnormalities in multiple myeloma. The method consists in preparing a preparation for a FISH test from bone marrow aspirate with a low content of tumour plasma cells, conducting a FISH test of interphase nuclei with a diameter of no less than 9 mcm in the preparation for the presence of chromosomal abnormalities, and calculating the percentage of chromosomal abnormalities.

EFFECT: increase in the informative value of determining chromosomal abnormalities by the FISH method in bone marrow aspirate with a low content of tumour plasma cells in multiple myeloma.

1 cl, 3 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и предназначено для диагностики хромосомных аномалий в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клетках при множественной миеломе (ММ).The invention relates to medicine, namely to hematology, and is intended for the diagnosis of chromosomal abnormalities in bone marrow aspirate with a low content of tumor plasma cells in multiple myeloma (MM).

ММ или плазмоклеточная миелома (в редакции ВОЗ 2017 г.) - это В-клеточная злокачественная опухоль, морфологическим субстратом которой являются плазматические клетки (ПК), продуцирующие моноклональный иммуноглобулин (Менделеева Л.П., Вотякова О.М., Рехтина И.Г. Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению злокачественных лимфопролиферативных заболеваний / под ред. И.В. Поддубной, В.Г. Савченко. - М., 2018. - С. 213-241). Заболеваемость ММ составляет приблизительно 1% среди всех злокачественных опухолей и до 10-15% всех опухолей кроветворной и лимфоидной тканей. Заболевают преимущественно люди старшей возрастной группы (Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018). За последнее десятилетие накоплен большой объем данных, указывающих на значительные различия в клинических проявлениях, прогнозе и ответе на терапию у пациентов ММ с различными цитогенетическими подтипами, что привело к значительному пересмотру клинического, прогностического и терапевтического значения генетических аномалий при ММ. В результате систематизации этих данных Международная рабочая группа по миеломе (International Myeloma Working Group, IMWG) предложила классификацию MM, выделив несколько неперекрывающихся молекулярных подтипов, определенных на основе конкретных цитогенетических аномалиий (Fonseca R. International Myeloma Working Group molecular classification of multiple myeloma: spotlight review / R. Fonseca, P.L. Bergsagel [et al.] // Leukemia. - 2009. - Vol. 23(12). - № 2210-21). В дальнейшем эта классификация была усовершенствована и включена в системы стратификации риска. При ММ выделяют первичные и вторичные цитогенетические аномалии. Большинство первичных цитогенетических аномалий у пациентов с ММ являются транслокациями либо трисомиями.MM or plasma cell myeloma (as revised by WHO 2017) is a B-cell malignant tumor, the morphological substrate of which is plasma cells (PCs) that produce monoclonal immunoglobulin (Mendeleeva L.P., Votyakova O.M., Rekhtina I.G. Russian clinical guidelines for the diagnosis and treatment of malignant lymphoproliferative diseases / edited by I. V. Poddubnaya, V. G. Savchenko - M., 2018. - P. 213-241). The incidence of MM is approximately 1% of all malignant tumors and up to 10-15% of all tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. Mostly people of the older age group get sick (Malignant neoplasms in Russia in 2017 (morbidity and mortality) / edited by A.D. Kaprin, V.V. Starinsky, G.V. Petrova. - M .: P. A. Herzen - branch of the Federal State Budgetary Institution "NMITs Radiology" of the Ministry of Health of Russia, 2018). Over the past decade, a large amount of data has been accumulated indicating significant differences in clinical manifestations, prognosis, and response to therapy in MM patients with various cytogenetic subtypes, which has led to a significant revision of the clinical, prognostic, and therapeutic significance of genetic abnormalities in MM. Fonseca R. International Myeloma Working Group molecular classification of multiple myeloma: spotlight review / R. Fonseca, P. L. Bergsagel [et al.] // Leukemia - 2009. - Vol. 23(12) - No. 2210-21). Later this classification was improved and included in risk stratification systems. In MM, primary and secondary cytogenetic abnormalities are distinguished. Most primary cytogenetic abnormalities in patients with MM are either translocations or trisomies.

Первичные транслокации у пациентов с ММ обычно включают локус гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) на хромосоме 14 и один из нескольких партнерских хромосом. Пять партнерских хромосом, наиболее часто встречающихся у пациентов с ММ, представляют собой хромосомы 4, 6, 11, 14 и 20. Первичные трисомии обычно включают нечетные хромосомы 5, 7, 9, 11, 13 и 15, приводящие к гипердиплоидному кариотипу. Первичные цитогенетические аномалии обнаруживаются почти у всей популяции клональных клеток в пределах клинического образца. Напротив, вторичные цитогенетические аномалии обычно субклональные.Primary translocations in patients with MM usually involve the immunoglobulin heavy chain (IgH) gene locus on chromosome 14 and one of several partner chromosomes. The five partner chromosomes most commonly found in MM patients are chromosomes 4, 6, 11, 14, and 20. Primary trisomies usually include odd chromosomes 5, 7, 9, 11, 13, and 15, resulting in a hyperdiploid karyotype. Primary cytogenetic abnormalities are found in almost the entire population of clonal cells within a clinical sample. In contrast, secondary cytogenetic abnormalities are usually subclonal.

Классическим способом, позволяющим выявлять хромосомные аномалии, является стандартное цитогенетическое исследование, которое основано на структурном и количественном анализе всех хромосом клетки (кариотип), дифференциально окрашенных в результате обработки трипсином с последующей окраской красителем Гимзы или Райта. (Seabright, М. A rapid banding technique for human chromosomes / M. Seabright // Lancet. - 1971. - Vol. 2. - № 7731. - P. 971-972). Данный методический подход имеет 2 существенных недостатка. Один из них связан с низкой информативностью цитогенетического исследования плазматических клеток ввиду их низкой митотической активности и часто незначительного содержания в аспирате костного мозга. Так, согласно литературным данным с использованием стандартного цитогенетического исследования нарушения кариотипа выявляются у 30-50% больных ММ (Бессмельцев, С.С. Множественная миелома (Патогенез, клиника, диагностика, дифференциальный диагноз). Часть 1 / С.С. Бессемельцев // Клиническая онкогематология. - 2013. - Т. 6, № 3. - С. 237-259). Второй существенный недостаток указанного метода заключается в его недостаточно высокой разрешающей способности идентифицировать структурные перестройки хромосом. Разрешающая способность светового микроскопа позволяет идентификацию только хромосомных изменений размером не менее 4 Mb (Czepulkowski В. Analyzing Chromosomes / В. Czepulkowski. - Oxford: BIOS Scientific Publishers Limited, 2001. - p. 162-182). При этом низкокачественные хромосомные препараты значительно снижают разрешающую способность стандартного цитогенетического метода выявлять небольшие делеции или дупликации. Проблемы возникают также при перестройках хромосом. Перестроенные сегменты не всегда возможно идентифицировать по картине G-бэндинга. Особенно часто с такими проблемами приходится сталкиваться при идентификации небольших дополнительных маркерных хромосом. К числу критических перестроек относятся также такие прогностически значимые при ММ транслокации, как t(4;14) (p16.3;q32) и t(14;16)(q32;q23).The classic way to detect chromosomal abnormalities is a standard cytogenetic study, which is based on the structural and quantitative analysis of all cell chromosomes (karyotype), differentially stained as a result of trypsin treatment followed by Giemsa or Wright staining. (Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes / M. Seabright // Lancet. - 1971. - Vol. 2. - No. 7731. - P. 971-972). This methodological approach has 2 significant drawbacks. One of them is associated with the low information content of the cytogenetic study of plasma cells due to their low mitotic activity and often insignificant content in the bone marrow aspirate. So, according to the literature data, using a standard cytogenetic study, karyotype disorders are detected in 30-50% of patients with MM (Bessmeltsev, S.S. Multiple myeloma (Pathogenesis, clinic, diagnosis, differential diagnosis). Part 1 / S.S. Bessemeltsev // Clinical oncohematology. - 2013. - V. 6, No. 3. - S. 237-259). The second significant drawback of this method is its insufficiently high resolution to identify structural rearrangements of chromosomes. The resolution of the light microscope allows the identification of only chromosomal changes of at least 4 Mb in size (Czepulkowski B. Analyzing Chromosomes / B. Czepulkowski. - Oxford: BIOS Scientific Publishers Limited, 2001. - p. 162-182). At the same time, low-quality chromosomal preparations significantly reduce the resolution of the standard cytogenetic method to detect small deletions or duplications. Problems also arise during rearrangements of chromosomes. Rearranged segments are not always possible to identify from the G-banding pattern. Especially often such problems are encountered when identifying small additional marker chromosomes. Critical rearrangements also include such prognostically significant translocations in MM as t(4;14) (p16.3;q32) and t(14;16)(q32;q23).

Отмеченных недостатков лишен другой способ обнаружения хромосомных аномалий - метод флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH). В основе метода FISH лежит гибридизация in situ между созданным по специальным технологиям ДНК-зондом (нуклеотидная последовательность ограниченного размера) и комплементарным ему участком ДНК мишени в препаратах фиксированных метафазных и интерфазных клеток. Визуализация ДНК-зондов, гибридизованных с соответствующим участком ДНК мишени, осуществляют с помощью простого люминесцентного микроскопа, оснащенного фильтрами, адекватными для оценки соответствующих ДНК-зондов. Клинико-диагностические исследования при ММ обычно проводят с помощью стандартизованных коммерческих ДНК-зондов и в соответствии с протоколами, рекомендуемых фирмами-производителями этих зондов, применяя интерфазный вариант FISH. Интерфазная FISH не зависит от пролиферации клеток, но ее чувствительность обнаружения ограничена процентным содержанием ПК в цельном костном мозге. Поликлональные ПК обычно составляют от 0,2% до 2,2% (в среднем 1,8%) костного мозга (Jandl, J.H. Blood: Textbook of Hematology / J.H. Jandl. - New York: Little, Brown, 1996. - p. 47). Хотя этот процент может увеличиваться у пациентов с ММ, концентрация моноклонального ПК может быть близка к этому низкому уровню в начале заболевания или после лечения. В случаях низкой моноклональной опухолевой нагрузки ПК аномальные клетки могут быть слишком редкими для обнаружения во время анализа, что приводит к ложноотрицательному результату, т.е. результату оценки FISH, который находится ниже установленных в лаборатории пороговых значений определения хромосомных аномалий. Обычно низкая медианная доля плазматических клеток в аспиратах костного мозга, составляющая от 1 до 20% по данным InterGroupe Francophone du Myelome (IFM), LLR UK Myeloma Forum Cytogenetic Database и Nordic Myeloma Study Group (NMSG) указывает на то, что методика FISH не может выполняться напрямую как при других гематологических злокачественных новообразованиях. Согласно Европейской сети по миеломе FISH-исследование в таких случаях необходимо проводить на селектированных ПК (Ross F.M. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders / F.M. Ross, H. Avet-Loiseau [et al.] // Haematologica. - 2012. - Vol 97(8). - p. 1272-1277). Известен способ определения хромосомных аномалий методом интерфазной FISH после предварительной иммуномагнитной сепарации ПК. Эти клетки метятся с помощью магнитных наночастиц, которые конъюгированы с высокоспецифичными антителами к CD 138. При нанесении суспензии меченых клеток на колонку, помещенную в магнитное поле сепаратора, на колонке фиксируются клетки даже с минимальным количеством наночастиц на их поверхности. Затем элюируются сепарированные плазматические клетки. Процедуры, связанные с приготовлением препаратов для FISH-исследования проводятся стандартно с той лишь разницей, что фиксированный в растворе Карнуа (смесь метанол / уксусная кислота в соотношении 3:1) осадок, полученный на последнем этапе, ресуспендируется в фиксирующем растворе и центрифугируется. Последующие процедуры, связанные с предобработкой предметных стекол с фиксированным образцом к этапу денатурации / гибридизации ДНК-зонда и ДНК-мишени, проводятся согласно протоколу производителя. Контрастное окрашивание процессированных ядер и их анализ под люминесцентным микроскопом осуществляются стандартно. Значительно повышая чувствительность определения хромосомных аномалий при ММ, данный методический подход позволяет анализировать аспираты костного мозга с низким (не более 20%) содержанием плазматических клеток. К существенным недостаткам приведенного подхода относятся значительная потеря клеток в процессе очистки ПК, уменьшение их выхода при иммуномагнитной сепарации с увеличением возраста образца, что препятствует возможности выполнять дополнительные тесты в более позднее время и благодаря этому получать уточненные результаты FISH. Кроме того, данный подход нуждается в дополнительном оборудовании и дорогостоящих расходных материалах (дополнительно 35-40 долларов за каждую процедуру сепарации ПК).The noted shortcomings are devoid of another method for detecting chromosomal abnormalities - the method of fluorescence in situ hybridization (fluorescence in situ hybridization, FISH). The FISH method is based on in situ hybridization between a DNA probe created using special technologies (a nucleotide sequence of a limited size) and its complementary target DNA region in preparations of fixed metaphase and interphase cells. Visualization of DNA probes hybridized to the respective target DNA region is performed using a simple fluorescent microscope equipped with filters adequate to evaluate the respective DNA probes. Clinical diagnostic studies in MM are usually carried out using standardized commercial DNA probes and in accordance with the protocols recommended by the manufacturers of these probes, using the interphase FISH variant. Interphase FISH is independent of cell proliferation, but its detection sensitivity is limited by the percentage of PK in whole marrow. Polyclonal PCs typically make up 0.2% to 2.2% (mean 1.8%) of the bone marrow (Jandl, J.H. Blood: Textbook of Hematology / J.H. Jandl. - New York: Little, Brown, 1996. - p. 47). Although this percentage may increase in patients with MM, the concentration of monoclonal PK may be close to this low level at the onset of the disease or after treatment. In cases of low monoclonal PC tumor burden, abnormal cells may be too rare to detect during analysis, resulting in a false negative result, i.e. a FISH score that is below the laboratory's established thresholds for detecting chromosomal abnormalities. The generally low median proportion of plasma cells in bone marrow aspirates of 1% to 20% according to InterGroupe Francophone du Myelome (IFM), LLR UK Myeloma Forum Cytogenetic Database and Nordic Myeloma Study Group (NMSG) indicates that the FISH technique cannot performed directly as in other hematological malignancies. According to the European Myeloma Network, a FISH study in such cases should be carried out on selected PCs (Ross F.M. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders / F.M. Ross, H. Avet-Loiseau [et al.] // Haematologica 2012 Vol 97(8) pp 1272-1277). A known method for determining chromosomal abnormalities by interphase FISH after preliminary immunomagnetic separation of PC. These cells are labeled using magnetic nanoparticles, which are conjugated with highly specific antibodies to CD 138. When a suspension of labeled cells is applied to a column placed in a magnetic field of a separator, cells are fixed on the column even with a minimum amount of nanoparticles on their surface. The separated plasma cells are then eluted. The procedures associated with the preparation of preparations for FISH studies are carried out as standard, with the only difference being that the precipitate obtained at the last stage, fixed in Carnoy's solution (a mixture of methanol / acetic acid in a ratio of 3: 1), is resuspended in a fixing solution and centrifuged. Subsequent procedures related to the pretreatment of slides with a fixed sample to the stage of denaturation / hybridization of the DNA probe and DNA target are carried out according to the manufacturer's protocol. Contrast staining of processed nuclei and their analysis under a fluorescent microscope are carried out as standard. Significantly increasing the sensitivity of the detection of chromosomal abnormalities in MM, this methodological approach makes it possible to analyze bone marrow aspirates with a low (no more than 20%) content of plasma cells. Significant disadvantages of this approach include a significant loss of cells during the purification of PC, a decrease in their yield during immunomagnetic separation with an increase in the age of the sample, which prevents the possibility of performing additional tests at a later time and, due to this, obtaining refined FISH results. In addition, this approach requires additional equipment and expensive consumables (an additional $35-40 for each PC separation procedure).

Известен еще один способ идентификации хромосомных аномалий методом интерфазной FISH при низком содержании ПК у больных ММ. Данный способ основан на анализе ПК, селектированных в костном мозге путем сопутствующего FISH-анализу иммунофенотипирования цитоплазматических иммуноглобулиновых легких цепей типа к или X с помощью антител, меченных флуорохромом. Комбинированное применение FISH и указанного иммунофенотипирования, обозначаемое как clg-FISH, повышает чувствительность определения хромосомных аномлий, сопоставимую с FISH-анализом после предварительной иммуномагнитной очистки ПК. Вместе с тем по сравнению со стандартным FISH-тестированием методический подход, основанный на clg-FISH, имеет ряд недостатков, связанных с трудоемкостью определения хромосомных аномалий с помощью данного подхода, дополнительными финансовыми затратами, вызванными закупкой дорогостоящих меченных флуорохромом антител к иммуноглобулиновым легким цепям, неинформативностью подхода в случаях непродуцирующей миеломы (без синтеза clg), сложностью выявления ПК, несущих t(11;14) с лимфоплазмоцитарной морфологической картиной.There is another method for identifying chromosomal abnormalities by interphase FISH with a low content of PC in patients with MM. This method is based on the analysis of PK selected in the bone marrow by concomitant FISH analysis of immunophenotyping of cytoplasmic immunoglobulin light chains of type K or X with antibodies labeled with fluorochrome. The combined use of FISH and the indicated immunophenotyping, referred to as clg-FISH, increases the sensitivity of the detection of chromosomal abnormalities, comparable to FISH analysis after preliminary immunomagnetic purification of PC. At the same time, compared with standard FISH testing, the methodological approach based on clg-FISH has a number of disadvantages associated with the complexity of determining chromosomal abnormalities using this approach, additional financial costs caused by the purchase of expensive fluorochrome-labeled antibodies to immunoglobulin light chains, lack of information approach in cases of non-producing myeloma (without clg synthesis), the difficulty of identifying PCs carrying t (11; 14) with a lymphoplasmacytic morphological picture.

В качестве прототипа изобретения выбран стандартный способ определения хромосомных аномалий методом интерфазной FISH, основанный на рутинном приготовлении препаратов для FISH-исследования и анализе флуоресцентных гибридизационных сигналов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа со специальными фильтрами, оснащенного камерой с устройством с зарядовой связью (CCD), позволяющую создавать цифровые изображения даже при слабом флуоресцентом гибридизационном сигнале, и компьютерного программоного обеспечения для анализа изображений (Swansbury J. Fluorescence in situ hybridization methods and troubleshooting applied to fixed cell suspensions / J. Swansbury, T. Min [et al.] // Methods Mol Biol. - 2011. - Vol 730. - p. 13-31). Как уже отмечалось выше, основным недостатком указанного способа является неспособность выявления хромосомных аномалий при низком содержании опухолевых плазматических клеток при ММ.As a prototype of the invention, a standard method for determining chromosomal abnormalities by interphase FISH was chosen, based on the routine preparation of preparations for FISH research and analysis of fluorescent hybridization signals using an epifluorescence microscope with special filters equipped with a charge-coupled device (CCD) camera, which allows creating digital images even with a weak fluorescent hybridization signal, and computer software for image analysis (Swansbury J. Fluorescence in situ hybridization methods and troubleshooting applied to fixed cell suspensions / J. Swansbury, T. Min [et al.] // Methods Mol Biol. - 2011. - Vol 730. - p. 13-31). As noted above, the main disadvantage of this method is the inability to detect chromosomal abnormalities with a low content of tumor plasma cells in MM.

В связи с вышеизложенным, технической задачей предлагаемого изобретения является разработка простого и экономичного способа определения хромосомных аномалий методом FISH в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток при ММ.In connection with the foregoing, the technical objective of the present invention is to develop a simple and economical method for determining chromosomal abnormalities by FISH in a bone marrow aspirate with a low content of tumor plasma cells in MM.

Технический результат заключается в повышении информативности определения хромосомных аномалий методом FISH в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток при ММ.The technical result is to increase the information content of the determination of chromosomal abnormalities by the FISH method in bone marrow aspirate with a low content of tumor plasma cells in MM.

Указанный технический результат достигается разработанным способом, включающим в себя:The specified technical result is achieved by the developed method, including:

- приготовление препарата для FISH-исследования из аспирата костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток,- preparation of a preparation for FISH-study from a bone marrow aspirate with a low content of tumor plasma cells,

- избирательный FISH-анализ ядер с диаметром не менее 9 мкм в препарате на наличие хромосомных аномалий.- selective FISH analysis of nuclei with a diameter of at least 9 μm in the preparation for the presence of chromosomal abnormalities.

Сущность предложенного изобретения заключается в том, что избирательный FISH-анализ относительно мономорфных по размерам интерфазных ядер с диаметром не менее 9 мкм позволяет многократно увеличить чувствительность обнаружения целевых цитогенетических аномалий по сравнению с неизбирательной оценкой исходного гетерогенного препарата методом сплошного просмотра. При этом в основе наблюдаемой разной частоты встречаемости целевых FISH-маркеров в различных по размерам популяциях интерфазных ядер могут лежать как клонально-генетические причины, так и технологические, связанные с разведением аспирата костного мозга периферической кровью в процессе его забора.The essence of the proposed invention lies in the fact that selective FISH analysis of relatively monomorphic in size interphase nuclei with a diameter of at least 9 μm makes it possible to multiply the sensitivity of detecting target cytogenetic anomalies compared to non-selective evaluation of the initial heterogeneous preparation by the continuous scan method. At the same time, the observed different frequency of occurrence of target FISH markers in populations of interphase nuclei of different sizes can be based on both clonal genetic reasons and technological ones associated with the dilution of bone marrow aspirate with peripheral blood during its sampling.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России.The claimed invention was developed in the laboratory of pathomorphology of the FGBUN KNIIG and PC FMBA of Russia.

Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.

Переносят 1 мл костного мозга в центрифужную пробирку, доводят объем средой RPMI-1640 до 10 мл. Центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Удаляют большую часть супернатанта, оставив его примерно 1,0 мл в пробирке. Суспендируют осадок и добавляют 9 мл нагретого до 37°С гипотонического (0,075 М) раствора KCl, клетки инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Далее добавляют 0,5 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1), перемешивают пипетированием и центрифугируют суспензию при 1000 об/мин в течение 10 минут. Удаляют большую часть супернатанта, оставив его примерно 0,5 мл в пробирке. Тщательно суспендируют осадок, добавляют по каплям при перемешивании 9-10 мл фиксатора и выдерживают суспензию в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, осадок суспендируют в 5 мл фиксатора и выдерживают в течение 10 минут при комнатной температуре. После проводят центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Ресуспендирование клеток в фиксаторе с последующим их центрифугированием повторяют еще 2 раза, затем суспендируют осадок в 0,1-0,4 мл свежего фиксатора.Transfer 1 ml of bone marrow into a centrifuge tube, adjust the volume with RPMI-1640 medium to 10 ml. Centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Remove most of the supernatant, leaving approximately 1.0 ml in the tube. Suspend the precipitate and add 9 ml of hypotonic (0.075 M) KCl solution heated to 37°C, cells are incubated for 30 minutes at 37°C. Next, add 0.5 ml of freshly prepared fixative (a mixture of methanol and acetic acid in a ratio of 3:1), mix by pipetting and centrifuge the suspension at 1000 rpm for 10 minutes. Remove most of the supernatant, leaving approximately 0.5 ml in the tube. The precipitate is carefully suspended, 9-10 ml of fixative are added dropwise with stirring, and the suspension is kept for 20 minutes at room temperature. Then centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes, the precipitate is suspended in 5 ml of fixative and incubated for 10 minutes at room temperature. After centrifugation is carried out at 1000 rpm for 10 minutes at room temperature. Resuspension of the cells in the fixative followed by their centrifugation is repeated 2 more times, then the pellet is suspended in 0.1-0.4 ml of fresh fixative.

Раскапывают суспензию фиксированных клеток на чистое предметное стекло, добавляют 3-4 капли свежего фиксатора и дают сохнуть на воздухе. После с помощью фазово-контрастной микроскопии оценивают качество приготовленного препарата. Фиксированные клетки (ядра) должны быть распределены равномерно, без наложений друг на друга (при большой плотности клеточного материала на стекле гибридизация может быть неэффективной и/или может наблюдаться интенсивный фон вследствие неспецифического связывания ДНК-зонда). Перед проведением процедур, связанных непосредственно с FISH, выдерживают стекла в течение часа в термостате при 37°С.Dispense the fixed cell suspension onto a clean glass slide, add 3-4 drops of fresh fixative and allow to air dry. After using phase-contrast microscopy, the quality of the prepared preparation is assessed. Fixed cells (nuclei) should be distributed evenly, without overlapping each other (at a high density of cellular material on the glass, hybridization may be ineffective and/or an intense background may be observed due to non-specific binding of the DNA probe). Before carrying out procedures related directly to FISH, keep the glass for an hour in a thermostat at 37°C.

Для надежного обеспечения высококачественных FISH-сигналов применяется следующая предварительная обработка свежеприготовленных препаратов фиксированных клеток. Инкубируют препарат в течение 15 минут при 37°С в 2xSSC / 0,5% Igepal (рН=7,0±0,01). Проводят дегидратацию препарата в батарее восходящих 70%, 85% и 96% растворов этилового спирта по 1 минуте в каждом; высушивают препарат на воздухе при комнатной температуре. Далее наносят готовый ДНК-зонд, закрывают покровным стеклом (диаметр 10 мм), края герметизируют резиновым клеем. Препарат помещают в гибридайзер. Согласно протоколу производителя ДНК-зондов, режим денатурации проводится при 75°С в течение 5-10 минут, гибридизация осуществляется при 37°С не менее 12 часов.To reliably provide high quality FISH signals, the following pretreatment of freshly prepared fixed cell preparations is applied. The preparation is incubated for 15 minutes at 37°C in 2xSSC/0.5% Igepal (pH=7.0±0.01). The drug is dehydrated in a battery of ascending 70%, 85% and 96% ethanol solutions for 1 minute each; dry the preparation in air at room temperature. Next, the finished DNA probe is applied, covered with a cover slip (diameter 10 mm), the edges are sealed with rubber glue. The drug is placed in a hybridizer. According to the DNA probe manufacturer's protocol, denaturation is carried out at 75°C for 5-10 minutes, hybridization is carried out at 37°C for at least 12 hours.

После завершения гибридизации с целью удаления избытка ДНК-зонда препарат обрабатывают следующим образом. Готовят раствор Wash Buffer I (0,4 х SSC / 0,3% Igepal) и нагревают его до температуры 72°С (±1°С) в водяной бане. Удаляют клей с предметных стекол, выдерживают препараты в растворе Wash Buffer II (2 х SSC / 0,1% Igepal) при комнатной температуре в течение 2 минут, затем убирают покровные стекла. Препараты помещают на 2 минуты в раствор Wash Buffer I при температуре 72°С (±1°С), далее - выдерживают в растворе Wash Buffer II при комнатной температуре в течение 1 минуты. Проводят дегидратацию препарата в батарее восходящих 70%, 85% и 96% растворов этилового спирта по 1 минуте в каждом. Высушивают препарат при комнатной температуре в темноте. Для визуализации клеточных ядер на препарат наносят раствор DAPI в концентрации 1 мкг/мл, затем исследуемую зону накрывают покровным стеклом.After hybridization is completed, the preparation is processed as follows to remove excess DNA probe. Prepare a solution of Wash Buffer I (0.4 x SSC / 0.3% Igepal) and heat it to 72°C (±1°C) in a water bath. Remove adhesive from slides, incubate slides in Wash Buffer II (2 x SSC / 0.1% Igepal) at room temperature for 2 minutes, then remove coverslips. The preparations are placed for 2 minutes in Wash Buffer I at 72°C (±1°C), then kept in Wash Buffer II at room temperature for 1 minute. The drug is dehydrated in a battery of ascending 70%, 85% and 96% ethanol solutions for 1 minute each. Dry the preparation at room temperature in the dark. To visualize the cell nuclei, a DAPI solution at a concentration of 1 μg/ml is applied to the preparation, then the area under study is covered with a cover slip.

Анализ препаратов осуществляют с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием компьютерных программ обработки изображений. Получают фотографии интерфазных ядер клеток костного мозга с четкими сигналами в FISH-препарате. Фотографии загружают в программу обработки изображений и измеряют диаметры ядер всех клеток в поле зрения. Изображения препарата с измеренными диаметрами ядер используют для избирательного FISH-анализа. Проводят подсчет процента хромосомной аномалии только в тех ядрах, которые имеют диаметр ≥ 9 мкм.Analysis of the preparations is carried out using a fluorescence microscope using computer programs for image processing. Get photos of interphase nuclei of bone marrow cells with clear signals in the FISH preparation. The photographs are loaded into an image processing program and the diameters of the nuclei of all cells in the field of view are measured. Images of the slide with measured nuclear diameters are used for selective FISH analysis. Carry out the calculation of the percentage of chromosomal abnormality only in those nuclei that have a diameter of ≥ 9 μm.

Критерий предложенного способа оценки интерфазных ядер был разработан на основании данных FISH-анализа более 12 000 ядер у 50 больных с ММ (34 пациента - с впервые выявленной ММ, 16 - на стадии мониторинга). Исследовались 50 FISH-образцов со следующими генетическими аномалиями: t(4;14), t(14;16), t(11;14), amplq21, del(13)(ql4), del(17)(p13). Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность применения способа избирательной FISH-диагностики хромосомных аномалий у больных ММ при низком содержании опухолевых клеток в аспирате костного мозга.The criterion for the proposed method for assessing interphase nuclei was developed on the basis of FISH analysis of more than 12,000 nuclei in 50 patients with MM (34 patients with newly diagnosed MM, 16 at the monitoring stage). We studied 50 FISH samples with the following genetic abnormalities: t(4;14), t(14;16), t(11;14), amplq21, del(13)(ql4), del(17)(p13). The results of the studies are presented in examples confirming the possibility of using the method of selective FISH diagnostics of chromosomal abnormalities in patients with MM with a low content of tumor cells in the bone marrow aspirate.

Пример 1. Больная В., 55 лет. Поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 12.05.2020. Установлен диагноз «Множественная миелома». Пациентке проведена пункция костного мозга, аспират которого имел низкую долю плазматических клеток по результатам миелограммы - 12,4% (менее 20%). Аспират костного мозга обработан в соответствии со стандартной методикой, получен препарат для FISH-исследования. В результате FISH-анализа 200 интерфазных ядер клеток костного мозга стандартным способом, выявлено 11 ядер (5,5%), имеющих хромосомную аномалию - амплификацию локуса lq21. Полученный результат не превышает порог чувствительности зонда (10%). Для регистрации хромосомной аномалии был применен способ избирательного FISH-анализа. Проанализировано 200 ядер с диаметром ≥ 9 мкм. В 30 ядрах (15%) выявлена амплификация локуса lq21.Example 1. Patient V., 55 years old. She was admitted to the hematology department of the FGBUN KNIIG and the PC of the FMBA of Russia on May 12, 2020. A diagnosis of multiple myeloma was made. The patient underwent a bone marrow puncture, the aspirate of which had a low proportion of plasma cells according to the results of the myelogram - 12.4% (less than 20%). The bone marrow aspirate was processed in accordance with the standard method, and a preparation for FISH study was obtained. As a result of FISH analysis of 200 interphase nuclei of bone marrow cells by the standard method, 11 nuclei (5.5%) were identified with a chromosomal anomaly - amplification of the lq21 locus. The result obtained does not exceed the sensitivity threshold of the probe (10%). To register a chromosomal anomaly, a method of selective FISH analysis was used. 200 nuclei with a diameter ≥ 9 µm were analyzed. In 30 nuclei (15%), amplification of the lq21 locus was detected.

Пример 2. Больная Г., 58 лет. Диагноз «Множественная миелома» установлен в 2013 г. В декабре 2019 г. - прогрессирование заболевания. Пациентке проведена пункция костного мозга. В миелограмме от 19.12.19 содержание плазматических клеток - 13,2%. Аспират костного мозга обработан в соответствии со стандартной методикой, получен препарат для FISH-исследования. В результате FISH-анализа 200 интерфазных ядер клеток костного мозга стандартным способом, выявлено 18 ядер (9,0%) с транслокацией t(11;14)(q13;q32). Полученный результат не превышает порог чувствительности зонда (10%). Был применен способ избирательного FISH-анализа. Проанализировано 200 ядер с диаметром ≥ 9 мкм, в 35 (17,5%) из них выявлена транслокация t(11;14)(q13;q32).Example 2. Patient G., 58 years old. The diagnosis of "Multiple myeloma" was established in 2013. In December 2019 - the progression of the disease. The patient underwent a bone marrow puncture. In the myelogram dated 12/19/19, the content of plasma cells is 13.2%. The bone marrow aspirate was processed in accordance with the standard method, and a preparation for FISH study was obtained. As a result of FISH analysis of 200 interphase nuclei of bone marrow cells by the standard method, 18 nuclei (9.0%) with translocation t(11;14)(q13;q32) were identified. The result obtained does not exceed the sensitivity threshold of the probe (10%). A method of selective FISH analysis was applied. We analyzed 200 nuclei with a diameter of ≥ 9 µm, and t(11;14)(q13;q32) translocation was detected in 35 (17.5%) of them.

Пример 3. Больной Ш., 65 лет. Поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 11.08.2020. Установлен диагноз «Множественная миелома». Пациенту проведена пункция костного мозга. По результатам миелограммы отмечено повышенное относительное число плазматических элементов (36,5%). Аспират костного мозга обработан в соответствии со стандартной методикой, получен препарат для FISH-анализа. В результате FISH-исследования 200 интерфазных ядер клеток костного стандартным способом, в 71 ядре (35,5%) выявлена делеция 13q14. В результате применения способа избирательного FISH-анализа делеция 13q14 выявлена 91 ядре (45,5%). Оба результата отражают наличие одной и той же перестройки, превышают порог чувствительности зонда (10%); проведение избирательного FISH-анализа в данном случае необязательно.Example 3. Patient Sh., 65 years old. Admitted to the hematology department of the FGBUN KNIIG and PC FMBA of Russia on 08/11/2020. A diagnosis of multiple myeloma was made. The patient underwent a bone marrow puncture. According to the results of the myelogram, an increased relative number of plasma elements (36.5%) was noted. The bone marrow aspirate was processed in accordance with the standard method, and a preparation for FISH analysis was obtained. As a result of a FISH study of 200 interphase nuclei of bone cells in a standard way, a 13q14 deletion was detected in 71 nuclei (35.5%). As a result of applying the selective FISH analysis method, the 13q14 deletion was detected in 91 nuclei (45.5%). Both results reflect the presence of the same rearrangement, exceed the sensitivity threshold of the probe (10%); selective FISH analysis is optional in this case.

Заявляемое изобретение дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности диагностировать хромосомные аномалии в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток. Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических отделениях, патоморфологических и молекулярно-генетических лабораториях.The claimed invention gives a positive result when used, which consists in the ability to diagnose chromosomal abnormalities in a bone marrow aspirate with a low content of tumor plasma cells. The proposed method is informative, can be used in hematology departments, pathological and molecular genetic laboratories.

Claims

A method for determining chromosomal abnormalities in multiple myeloma, which consists in preparing a preparation for FISH research from a bone marrow aspirate with a low content of tumor plasma cells, conducting a FISH analysis of interphase nuclei with a diameter of at least 9 μm in the preparation for the presence of chromosomal abnormalities, and calculating the percentage of chromosomal abnormalities .