RU2771781C1 - Nanovesicles produced from bacteria of the genus sphingomonas and application thereof - Google Patents
Nanovesicles produced from bacteria of the genus sphingomonas and application thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2771781C1 RU2771781C1 RU2021104795A RU2021104795A RU2771781C1 RU 2771781 C1 RU2771781 C1 RU 2771781C1 RU 2021104795 A RU2021104795 A RU 2021104795A RU 2021104795 A RU2021104795 A RU 2021104795A RU 2771781 C1 RU2771781 C1 RU 2771781C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vesicles
- sphingomonas
- bacteria
- composition
- derived
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 140
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 title claims abstract description 84
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 69
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 208000010125 Myocardial Infarction Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 206010038435 Renal failure Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 201000002055 autistic disease Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 201000004044 liver cirrhosis Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 206010057668 Cognitive disease Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 206010019641 Hepatic cirrhosis Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000736110 Sphingomonas paucimobilis Species 0.000 claims description 41
- 241000344853 Sphingomonas koreensis Species 0.000 claims description 18
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 16
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 15
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 claims description 13
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 13
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 12
- 230000002829 reduced Effects 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 230000019771 cognition Effects 0.000 claims 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 claims 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 44
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 44
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 34
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 25
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 24
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 22
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 21
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 15
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 13
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 12
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 12
- 229940100601 Interleukin-6 Drugs 0.000 description 12
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 12
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 12
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 description 12
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 11
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 208000008581 Brain Disease Diseases 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 229920001670 16S ribosomal RNA Polymers 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 7
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 6
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 5
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 5
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- -1 monosaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 4
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 4
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 4
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 239000000686 essence Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-Aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010001897 Alzheimer's disease Diseases 0.000 description 3
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 3
- 210000004969 Inflammatory Cells Anatomy 0.000 description 3
- 210000002784 Stomach Anatomy 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 3
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- 210000000577 Adipose Tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 2
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000008787 Cardiovascular Disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- MEZZCSHVIGVWFI-UHFFFAOYSA-N Dioxybenzone Chemical compound OC1=CC(OC)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1O MEZZCSHVIGVWFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 230000036826 Excretion Effects 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N Fructose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002216 Heart Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 2
- 210000004347 Intestinal Mucosa Anatomy 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 2
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 2
- DXGLGDHPHMLXJC-UHFFFAOYSA-N Oxybenzone Chemical compound OC1=CC(OC)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 DXGLGDHPHMLXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 2
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 239000003212 astringent agent Substances 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229960001173 oxybenzone Drugs 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- WHQOKFZWSDOTQP-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropyl 4-aminobenzoate Chemical compound NC1=CC=C(C(=O)OCC(O)CO)C=C1 WHQOKFZWSDOTQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCPKSFINULVDNX-UHFFFAOYSA-N 2-(benzotriazol-2-yl)-4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C(N2N=C3C=CC=CC3=N2)=C1 MCPKSFINULVDNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYYHDKOVFSVWON-UHFFFAOYSA-N 2-butyl-2-methoxy-1,3-diphenylpropane-1,3-dione Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)C(OC)(CCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1 TYYHDKOVFSVWON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGUMTYWKIBJSTN-UHFFFAOYSA-N 2-ethylhexyl 4-[[4,6-bis[4-(2-ethylhexoxycarbonyl)anilino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]benzoate Chemical compound C1=CC(C(=O)OCC(CC)CCCC)=CC=C1NC1=NC(NC=2C=CC(=CC=2)C(=O)OCC(CC)CCCC)=NC(NC=2C=CC(=CC=2)C(=O)OCC(CC)CCCC)=N1 JGUMTYWKIBJSTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1H-indole-4,6-dicarboximidamide Chemical compound N1C2=CC(C(=N)N)=CC(C(N)=N)=C2C=C1C1=CC=CC=C1 BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMKKFLSUPRUBOO-IUPFWZBJSA-N 3,4-dihydroxy-5-[3,4,5-tris[[(Z)-octadec-9-enoyl]oxy]benzoyl]oxybenzoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC1=C(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)C(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(O)=O)O)=C1 HMKKFLSUPRUBOO-IUPFWZBJSA-N 0.000 description 1
- AICYRZRYRROYFV-UHFFFAOYSA-N 4-[1-(2H-benzotriazol-4-yloxy)-2,3,4,5-tetramethyl-6-pent-1-en-2-ylcyclohexa-2,4-dien-1-yl]-2H-benzotriazole Chemical compound CCCC(=C)C1C(C)=C(C)C(C)=C(C)C1(C=1C=2N=NNC=2C=CC=1)OC1=CC=CC2=C1N=NN2 AICYRZRYRROYFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N Aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 229960003438 Aspartame Drugs 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- XVAMCHGMPYWHNL-UHFFFAOYSA-N Bemotrizinol Chemical compound OC1=CC(OCC(CC)CCCC)=CC=C1C1=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(OCC(CC)CCCC)=CC=2)O)=N1 XVAMCHGMPYWHNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- CMDKPGRTAQVGFQ-RMKNXTFCSA-N Cinoxate Chemical compound CCOCCOC(=O)\C=C\C1=CC=C(OC)C=C1 CMDKPGRTAQVGFQ-RMKNXTFCSA-N 0.000 description 1
- 230000037250 Clearance Effects 0.000 description 1
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N D-Threitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N DATI Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- AKNXMRHLLPIDLY-UHFFFAOYSA-N Diethylamino hydroxybenzoyl hexyl benzoate Chemical compound CCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)C1=CC=CC(N(CC)CC)=C1O AKNXMRHLLPIDLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N Dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940120503 Dihydroxyacetone Drugs 0.000 description 1
- HUVYTMDMDZRHBN-UHFFFAOYSA-N Drometrizole trisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(O[Si](C)(C)C)CC(C)CC1=CC(C)=CC(N2N=C3C=CC=CC3=N2)=C1O HUVYTMDMDZRHBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- 229940009714 Erythritol Drugs 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N Erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 239000001512 FEMA 4601 Substances 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- LPLVUJXQOOQHMX-MYOOOWEVSA-N Glycyrrhizic acid Natural products O=C(O)[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(=O)O)O2)[C@@H](O[C@@H]2C(C)(C)[C@H]3[C@@](C)([C@H]4C(=O)C=C5[C@](C)([C@]4(C)CC3)CC[C@]3(C)[C@H]5C[C@](C(=O)O)(C)CC3)CC2)O1 LPLVUJXQOOQHMX-MYOOOWEVSA-N 0.000 description 1
- 239000004378 Glycyrrhizin Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 210000001365 Lymphatic Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 1
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000040340 Oat mosaic virus Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- FMJSMJQBSVNSBF-UHFFFAOYSA-N Octocrylene Chemical group C=1C=CC=CC=1C(=C(C#N)C(=O)OCC(CC)CCCC)C1=CC=CC=C1 FMJSMJQBSVNSBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003463 Organelles Anatomy 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N Rebaudioside A Natural products O=C(O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N Saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 Saccharin Drugs 0.000 description 1
- 240000001132 Stevia rebaudiana Species 0.000 description 1
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N Stevioside A3 Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- CXVGEDCSTKKODG-UHFFFAOYSA-N Sulisobenzone Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C(OC)=CC(O)=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 CXVGEDCSTKKODG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000030429 T-helper 17 type immune response Effects 0.000 description 1
- 229960000716 TONICS Drugs 0.000 description 1
- 108060008443 TPPP Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003932 Urinary Bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 Urinary Tract Anatomy 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229960002675 Xylitol Drugs 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N Xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000005794 allergic hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 229960005193 avobenzone Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- YEAYGXLRPMKZBP-KQGICBIGSA-N bis(2-hydroxyethyl)azanium;(E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OCCNCCO.COC1=CC=C(\C=C\C(O)=O)C=C1 YEAYGXLRPMKZBP-KQGICBIGSA-N 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000014171 carbonated beverage Nutrition 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 229960001063 cinoxate Drugs 0.000 description 1
- 230000035512 clearance Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressed Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229960001630 diethylamino hydroxybenzoyl hexyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229960004960 dioxybenzone Drugs 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 229960000979 drometrizole Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBZHHQOZZQEZNJ-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-[bis(2-hydroxypropyl)amino]benzoate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N(CC(C)O)CC(C)O)C=C1 CBZHHQOZZQEZNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001997 free-flow electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 229960004949 glycyrrhizic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019410 glycyrrhizin Nutrition 0.000 description 1
- LPLVUJXQOOQHMX-QWBHMCJMSA-N glycyrrhizinic acid Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]1O[C@@H]1C([C@H]2[C@]([C@@H]3[C@@]([C@@]4(CC[C@@]5(C)CC[C@@](C)(C[C@H]5C4=CC3=O)C(O)=O)C)(C)CC2)(C)CC1)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LPLVUJXQOOQHMX-QWBHMCJMSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000009673 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cells Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 229960000601 octocrylene Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 235000019203 rebaudioside A Nutrition 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N sulfonic acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000368 sulisobenzone Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000892 thaumatin Substances 0.000 description 1
- 235000010436 thaumatin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000001256 tonic Effects 0.000 description 1
- 235000015961 tonic Nutrition 0.000 description 1
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002485 urinary Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Данное изобретение относится к нановезикулам, полученным из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, и к их применению, говоря конкретнее, к способу диагностирования цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма, атопического дерматита и др. с использованием нановезикул, полученных из бактерий принадлежащих к роду Sphingomonas, к композиции для предотвращения, ослабления или лечения указанных заболеваний, содержащей указанные везикулы, к композиции для доставки лекарственного средства с целью лечения заболеваний головного мозга, содержащей указанные везикулы, и др.This invention relates to nanovesicles obtained from bacteria belonging to the genus Sphingomonas and their use, more specifically, to a method for diagnosing liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia , depression, autism, atopic dermatitis, etc. using nanovesicles obtained from bacteria belonging to the genus Sphingomonas, to a composition for preventing, alleviating or treating these diseases, containing these vesicles, to a composition for drug delivery to treat brain diseases, containing these vesicles, etc.
Данной заявкой испрашивается приоритет и преимущества на основании патентных заявок Кореи NO: 10-2018-0158623 и 10-2019-0132138, поданными в Корейсккое ведомство интеллектуальной собственности 10 декабря 2018 г. и 23 октября 2019 г. соответственно, содержание описания и иллюстраций которых полностью включается в настоящую заявку. This application claims priority and benefit from Korean Patent Applications NO: 10-2018-0158623 and 10-2019-0132138 filed with the Korean Intellectual Property Office on December 10, 2018 and October 23, 2019, respectively, the contents of which are described and illustrated in full included in this application.
Уровень техникиState of the art
С начала XXI в. острые инфекционные заболевания, в прошлом считавшиеся эпидемическими, становятся все менее важными, тогда как хронические заболевания, которые сопровождаются нарушениями деятельности иммунной системы, обусловленными утратой гармоничных отношений между человеческим организмом и его микробиомом, выдвинулись на первый план, определяя качество и продолжительность жизни людей. Такие трудноподдающиеся в 21 веке хронические болезни, как рак, сердечно-сосудистые, аллергические (в том числе затрагивающие легкие), метаболические и психоневрологические заболевания, влияя на качество и продолжительность жизни людей, создают огромные проблемы и важнейшие задачи для общественного здоровья в стране.Since the beginning of the XXI century. acute infectious diseases, which in the past were considered epidemics, are becoming less important, while chronic diseases, which are accompanied by disorders of the immune system due to the loss of a harmonious relationship between the human body and its microbiome, have come to the fore, determining the quality and duration of people's lives. Chronic diseases such as cancer, cardiovascular diseases, allergic diseases (including those affecting the lungs), metabolic and neuropsychiatric diseases, which are difficult to cope with in the 21st century, create huge problems and major tasks for public health in the country, affecting the quality and life expectancy of people.
Известно, что с человеческим организмом сосуществует множество микроорганизмов: их численность оценивается в 100 триллионов, что в 10 раз превышает количество клеток в организме человека, а количество генов, принадлежащих этим микроорганизмам, превышает количество человеческих генов более чем в 100 раз. Термин «микробиота», или «микробиом» относится к сообществу микроорганизмов, включая бактерий, архей и эукариотические микроорганизмы, населяющих данное местообитание.It is known that many microorganisms coexist with the human body: their number is estimated at 100 trillion, which is 10 times the number of cells in the human body, and the number of genes belonging to these microorganisms exceeds the number of human genes by more than 100 times. The term "microbiota" or "microbiome" refers to the community of microorganisms, including bacteria, archaea, and eukaryotic microorganisms, that inhabit a given habitat.
Бактерии – как сосуществующие с человеческим организмом, так и живущие в окружающей среде, выделяют везикулы размерами порядка нанометров, которые служат для обмена информацией в виде генов, низкомолекулярных соединений, белков и других материальных носителей с другими клетками. В человеческом организме слизистые оболочки образуют физический барьер, через который не могут проникнуть частицы с размерами не менее 200 нм, так что бактерии, живущие на слизистой оболочке, не проходят сквозь нее. Но происходящие из бактерий везикулы имеют размеры не более 100 нм и поглощаются тканями организма относительно, легко проникая через слизистую оболочку сквозь слои эпителиальных клеток. Везикулы, выделяемые бактериями локально, поглощаются эпителиальными клетками слизистой оболочки и вызывают местную воспалительную реакцию; везикулы, прошедшие сквозь эпителиальные клетки поглощаются системно: они попадают в лимфатические сосуды и таким образом достигают тех или иных органов, в которых, соответственно, развиваются иммунологическая и воспалительная реакции. Например, везикулы из патогенных грамотрицательных бактерий, например, Escherichia coli, вызывают локально воспалительную реакцию и рак и способствуют системным воспалительным реакциям и свертываемости крови через воспалительные реакции эндотелиальных клеток сосудов при всасывании через кровеносные сосуды. Кроме того, такие везикулы поглощаются мышечными клетками, на которые влияет инсулин, что ведет к резистентности к инсулину и диабету. В противоположность эффектам везикул патогенных бактерий, аналогичные продукты полезных бактерий противодействуют заболеваниям, регулируя иммунологические функции и нивелируя метаболические нарушения, вызванные везикулами патогенных бактерий. Bacteria, both coexisting with the human body and living in the environment, emit vesicles with sizes of the order of nanometers, which serve to exchange information in the form of genes, low molecular weight compounds, proteins and other material carriers with other cells. In the human body, mucous membranes form a physical barrier that particles larger than 200 nm cannot penetrate, so that bacteria living on the mucous membrane cannot pass through it. But vesicles originating from bacteria have dimensions of no more than 100 nm and are relatively absorbed by body tissues, easily penetrating through the mucous membrane through the layers of epithelial cells. Vesicles secreted locally by bacteria are taken up by mucosal epithelial cells and cause a local inflammatory response; vesicles that have passed through the epithelial cells are absorbed systemically: they enter the lymphatic vessels and thus reach certain organs, in which, respectively, immunological and inflammatory reactions develop. For example, vesicles from pathogenic Gram-negative bacteria, eg, Escherichia coli, cause a local inflammatory response and cancer, and promote systemic inflammatory responses and blood clotting through vascular endothelial cell inflammatory responses when absorbed through the blood vessels. In addition, such vesicles are taken up by muscle cells that are affected by insulin, leading to insulin resistance and diabetes. In contrast to the effects of pathogenic bacterial vesicles, similar products of beneficial bacteria counteract disease by regulating immunological functions and counteracting the metabolic disturbances caused by pathogenic bacterial vesicles.
На такие факторы, как бактериальные везикулы, возникает иммунные реакции с участием Th17, отличающиеся секрецией цитокина интерлейкина (здесь и далее IL)-7, и IL-6 секретируется эпителиальными клетками и клетками иммунной системы, когда подвергаются воздействию происходящих из бактерий везикул тем самым вызывая иммунный ответ, опосредованный Th17. Воспалительная реакция, обусловленная иммунным ответом Th17, характеризуется инфильтрацией нейтрофилов, и при этом клетки воспаления – нейтрофилы и макрофаги - выделяют фактор некроза опухолей (здесь и далее TNF-α), который играет важную роль в воспалении и онкогенезе. To factors such as bacterial vesicles, immune responses involving Th17 occur, characterized by the secretion of the cytokine interleukin (hereinafter IL)-7, and IL-6 is secreted by epithelial cells and cells of the immune system when exposed to bacterial-derived vesicles thereby causing Th17 mediated immune response. The inflammatory response mediated by the Th17 immune response is characterized by neutrophil infiltration, and inflammatory cells, neutrophils and macrophages, secrete tumor necrosis factor (hereinafter TNF-α), which plays an important role in inflammation and tumorigenesis.
Бактерии, принадлежащие роду Sphingomonas, являются анаэробными грам-отрицательными бактериями, широко распространенными в природе – они обитают, например, в воде, почве, корнях растений и др. У подавляющего большинства грамотрицательных бактерий во внешней клеточной мембране имеются липополисахариды (LPS), а в роде Sphingomonas вместо липополисахаридов в наружной мембране присутствуют гликосфинголипиды (GSL). Известны 20 видов рода Sphingomonas; в их числе Sphingomonas paucimobilis, которые, как сообщалось, оказываются возбудителями внутрибольничных инфекций у человека. Однако до сих пор не было сообщений о том, что везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, включая названный выше вид, применимы для диагностики и лечения таких неизлечимых болезней, как некоторые рак, сердечно-сосудистое заболевание и атопический дерматит. Bacteria belonging to the genus Sphingomonas are anaerobic gram-negative bacteria that are widely distributed in nature - they live, for example, in water, soil, plant roots, etc. The vast majority of gram-negative bacteria have lipopolysaccharides (LPS) in the outer cell membrane, and in In the genus Sphingomonas, glycosphingolipids (GSLs) are present in the outer membrane instead of lipopolysaccharides. 20 species of the genus Sphingomonas are known; these include Sphingomonas paucimobilis, which have been reported to cause nosocomial infections in humans. However, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas, including the aforementioned species, have not been reported so far to be useful in the diagnosis and treatment of incurable diseases such as certain cancers, cardiovascular disease, and atopic dermatitis.
Таким образом, данное изобретение демонстрирует, что диагностирование заболеваний, а именно: цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита - возможно путем установления факта пониженного по сравнению со здоровыми людьми содержания везикул бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, в клинических образцах больных с указанными заболеваниями. Также авторами данного изобретения в результате выделения везикул из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas бактерий, таких, как Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, показано, что эти везикулы можно использовать в качестве композиции для профилактики или лечения таких заболеваний, как цирроз печени, рака печени, инфаркт миокарда, почечная недостаточность, диабет, опухоли головного мозга, умеренные нарушения когнитивных функций, деменция, депрессия, аутизм и атопический дерматит. Также было показано, что при пероральном приеме указанных везикул лекарственный препарат попадает в головной мозг.Thus, the present invention demonstrates that the diagnosis of diseases, namely: cirrhosis of the liver, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis is possible by establishing the fact reduced content of vesicles of bacteria belonging to the genus Sphingomonas in comparison with healthy people in clinical samples of patients with these diseases. Also, by isolating vesicles from bacteria belonging to the genus Sphingomonas bacteria, such as Sphingomonas paucimobilis and Sphingomonas koreensis, the present inventors have shown that these vesicles can be used as a composition for the prevention or treatment of diseases such as liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis. It has also been shown that when these vesicles are taken orally, the drug enters the brain.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Техническая задачаTechnical task
Обратившись к описанным выше проблемам, авторы данного изобретения в результате интенсивных исследований путем метагеномного анализа показали, что содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, в образцах материала, полученного от больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом значительно ниже, чем у здоровых людей. Также было показано, что обработка макрофагов выделенными везикулами из Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, которые представляют собой бактерии, принадлежащие роду Sphingomonas, значительно подавляет секрецию интерлейкина -6 (IL-6) и альфа-фактора некроза опухолей TNF-α этими клетками, вызванную патогенными везикулами; тем самым дополняя данное изобретение, основанное на этих фактах.Turning to the above problems, the inventors of the present invention, as a result of intensive studies by metagenomic analysis, showed that the content of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas in samples of material obtained from patients with cirrhosis of the liver, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis are significantly lower than in healthy people. It has also been shown that treatment of macrophages with isolated vesicles from Sphingomonas paucimobilis and Sphingomonas koreensis, which are bacteria belonging to the genus Sphingomonas, significantly inhibits the secretion of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha TNF-α by these cells, caused by pathogenic vesicles; thereby complementing the present invention based on these facts.
Таким образом, объектом данного изобретения является способ диагностирования одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, или способ обеспечения информации для установления диагноза.Thus, an object of this invention is a method for diagnosing one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis, or a method of providing information for diagnosis.
Также другим объектом данного изобретения является композиция для предотвращения, облегчения или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, содержащую в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.Also another object of this invention is a composition for the prevention, alleviation or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression , autism and atopic dermatitis, containing as an active ingredient vesicles originating from bacteria belonging to the genus Sphingomonas.
Кроме того, еще одним объектом данного изобретения является композиция для доставки лекарственного агента с целью лечения заболевания головного мозга, содержащую в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.In addition, another object of the present invention is a drug delivery composition for the treatment of a brain disease, containing as an active ingredient vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas.
Но техническая задача данного изобретения не ограничивается указанными выше проблемами – другие проблемы, не упомянутые в настоящем документе, но решаемые при помощи данного изобретения, должны быть ясны специалистам в данной области техники из следующего описания. But the technical problem of this invention is not limited to the above problems - other problems not mentioned in this document, but solved by this invention, should be clear to experts in the art from the following description.
Решение технической задачиSolving a technical problem
Для достижения целей данного изобретения, указанных выше, предлагается способ обеспечения информации для диагностирования одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, который включает следующие этапы:To achieve the objectives of the present invention as stated above, there is provided a method for providing information for diagnosing one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia. , depression, autism and atopic dermatitis, which includes the following stages:
(a) выделение ДНК из везикул, полученных из образцов здорового индивида и субъекта;(a) isolation of DNA from vesicles obtained from samples of a healthy individual and subject;
(b) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР ) с выделенной ДНК и парой праймеров, полученных на основе последовательности гена, имеющейся в 16S рДНК, для получения продуктов полимеразной цепной реакции; и (b) performing a polymerase chain reaction (PCR) with the isolated DNA and a pair of primers derived from the gene sequence present in the 16S rDNA to obtain polymerase chain reaction products; and
(c) идентификацию случая, в котором содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, ниже, чем в образце, взятом у здорового индивида, как случая одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, путем количественного анализа продуктов полимеразной цепной реакции.(c) identifying a case in which the content of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas is lower than in a sample taken from a healthy individual as a case of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, infarction myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, moderate cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis, by quantitative analysis of polymerase chain reaction products.
Также данным изобретением предлагается способ диагностирования одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, который включает следующие этапы:The present invention also provides a method for diagnosing one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis, which includes the following steps:
(a) выделение ДНК из везикул, полученных из образцов здорового индивида и субъекта;(a) isolation of DNA from vesicles obtained from samples of a healthy individual and subject;
(b) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР ) с выделенной ДНК и парой праймеров, полученных на основе последовательности гена, имеющейся в 16S рДНК, для получения продуктов полимеразной цепной реакции; и (b) performing a polymerase chain reaction (PCR) with the isolated DNA and a pair of primers derived from the gene sequence present in the 16S rDNA to obtain polymerase chain reaction products; and
(c) идентификация случая, в котором содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, ниже, чем в образце, взятом у здорового индивида, как случая одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, путем количественного анализа продуктов полимеразной цепной реакции.(c) identifying a case in which the content of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas is lower than in a sample taken from a healthy individual as a case of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, infarction myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, moderate cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis, by quantitative analysis of polymerase chain reaction products.
В одном из типичных воплощений данного изобретения образцом на этапе (а) служит кровь или моча;In one exemplary embodiment of the present invention, the sample in step (a) is blood or urine;
В другом воплощении данного изобретения парой праймеров на этапе (b) является пара праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе как последовательности SEQ ID NO: 1 и 2.In another embodiment of the present invention, the primer pair in step (b) is a primer pair comprising the nucleotide sequences set forth herein as SEQ ID NOs: 1 and 2.
Также данным изобретением предлагается композиция для предотвращения, ослабления или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, которая содержит в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.The invention also provides a composition for the prevention, amelioration or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis, which contains, as an active ingredient, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas.
Эта композиция может представлять собой фармацевтическую, пищевую и косметическую композицию. This composition may be a pharmaceutical, nutritional and cosmetic composition.
Также данным изобретением предлагается способ профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, который включает этап введения субъекту композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.The present invention also provides a method for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis. which includes the step of administering to the subject a composition containing, as an active ingredient, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas.
Также данным изобретением предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.The invention also provides the use of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, moderate cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis.
Также данным изобретением предлагается применение композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.The present invention also provides the use of a composition containing as an active ingredient vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis.
Кроме того, данным изобретением предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, для изготовления лекарственного средства, используемого для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.In addition, the present invention provides the use of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas for the manufacture of a medicament used in the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure. , diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis.
Также данным изобретением предлагается композиция носителя лекарственного вещества, доставляющая лекарственное вещество в головной мозг (или композиция для доставки лекарственного вещества с целью лечения заболевания головного мозга), которая содержит в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.The present invention also provides a drug carrier composition for delivering a drug to the brain (or a drug delivery composition for the treatment of a brain disease) which contains as an active ingredient vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas.
Также данным изобретением предлагается способ доставки лекарственного вещества для лечения заболевания головного мозга, который включает введение индивиду композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, которые несут лекарственное вещество для лечения данного заболевания головного мозга. The present invention also provides a method for delivering a drug for the treatment of a brain disease, which comprises administering to an individual a composition containing, as an active ingredient, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas that carry a drug for the treatment of the brain disease.
В дополнение к указанному данным изобретением предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для доставки лекарственного вещества с целью лечения заболевания головного мозга.In addition to this, the present invention proposes the use of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas for drug delivery for the treatment of brain disease.
В типичном воплощении данного изобретения указанные везикулы имеют диаметр в среднем 10 - 200 нм.In a typical embodiment of the present invention, said vesicles have an average diameter of 10-200 nm.
В другом типичном воплощении данного изобретения выделение указанных везикул из клеток бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, происходит естественным или искусственным путем.In another exemplary embodiment of the present invention, the isolation of said vesicles from bacterial cells belonging to the genus Sphingomonas occurs naturally or artificially.
В еще одном типичном воплощении данного изобретения выделение указанных везикул из клеток бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, осуществляется таким способом, как тепловая обработка бактерий и воздействие на них давлением.In another exemplary embodiment of the present invention, the isolation of said vesicles from bacterial cells belonging to the genus Sphingomonas is carried out in a manner such as heat treatment of the bacteria and exposure to pressure.
В еще одном типичном воплощении данного изобретения везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, могут быть секретированы Sphingomonas paucimobilis.In yet another exemplary embodiment of the present invention, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas can be secreted by Sphingomonas paucimobilis.
В еще одном типичном воплощении данного изобретения везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, могут быть секретированы Sphingomonas koreensis.In yet another exemplary embodiment of the present invention, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas can be secreted by Sphingomonas koreensis.
Польза данного изобретенияBenefits of this invention
Авторы данного изобретения показали, что в организме-хозяине всасываются не бактерии, а происходящие из них везикулы, которые проникают через эпителиальные клетки, распространяются кровотоком по всему телу и выделяются из него через почки, печень и легкие, и показали путем метагеномного анализа везикул, происходящих из бактерий, присутствующих в крови, что значительно снижено содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, в крови и моче больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом по сравнению со здоровыми индивидами. Также было обнаружено, что, если культивировать ex vivo бактерии, принадлежащих роду Sphingomonas, а именно Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, и выделить их везикулы и добавить эти везикулы к клеткам воспаления ex vivo, то секреция медиаторов воспаления, вызываемая патогенными везикулами, значительно подавляется. Также было обнаружено, что везикулы Sphingomonas paucimobilis, будучи введены в организм перорально, попадают в головной мозг. Следовательно, везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, по данному изобретению можно использовать как средство для диагностирования цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита и как композицию для предотвращения, ослабления или лечения этих заболеваний, например, в виде косметического продукта, пищевого продукта или лекарственного препарата, а также везикулы по данному изобретению, как ожидается, можно использовать в качестве носителя лекарственного вещества для доставки его в головной мозг.The inventors of the present invention showed that it is not bacteria that are absorbed in the host organism, but vesicles derived from them, which penetrate through epithelial cells, are distributed by the bloodstream throughout the body and are excreted from it through the kidneys, liver and lungs, and showed by metagenomic analysis of vesicles originating from bacteria present in the blood, which significantly reduced the content of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas in the blood and urine of patients with liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, moderate cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis compared with healthy individuals. It has also been found that if bacteria belonging to the genus Sphingomonas, namely Sphingomonas paucimobilis and Sphingomonas koreensis, are cultivated ex vivo and their vesicles are isolated and these vesicles are added to ex vivo inflammatory cells, the secretion of inflammatory mediators caused by pathogenic vesicles is significantly suppressed. It has also been found that Sphingomonas paucimobilis vesicles, when administered orally, enter the brain. Therefore, the vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas of the present invention can be used as a diagnostic tool for liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis and as a composition for the prevention, amelioration or treatment of these diseases, for example, in the form of a cosmetic product, food product or drug, as well as vesicles according to this invention, it is expected to be used as a drug carrier for delivery to the brain .
Описание иллюстрацийDescription of illustrations
На фиг. 1A представлена серия фотографий, демонстрирующих изменение распределения в теле мыши бактерий и везикул, происходящих из бактерий, (EV) с течением времени после их перорального введения, и на фиг. 1B показан результат оценки in vivo профиля распределения бактерий и везикул, собранных из крови, почек, печени и различных органов через 12 часов после перорального введения бактерий и везикул.In FIG. 1A is a series of photographs showing changes in the distribution of bacteria and bacterial-derived vesicles (EV) in the mouse body over time after oral administration, and FIG. 1B shows the result of in vivo evaluation of the distribution profile of bacteria and vesicles collected from blood, kidney, liver and various organs 12 hours after oral administration of bacteria and vesicles.
На фиг. 2 представлен результат оценки относительно того, инфильтруются ли бактерии и везикулы, происходящие из бактерий, в эпителиальных клетках слизистой оболочки кишечника после введения бактерий и бактериальных везикул в кишечник мыши (Lu – просвет кишки, LP – собственная пластинка слизистой оболочки).In FIG. 2 shows the result of evaluation as to whether bacteria and vesicles derived from bacteria are infiltrated in the epithelial cells of the intestinal mucosa after the introduction of bacteria and bacterial vesicles into the mouse intestine (Lu - gut lumen, LP - lamina propria).
На фиг. 3 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с циррозом печени, больных раком печени и здоровых индивидов.In FIG. 3 shows the result of comparing the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of blood-borne vesicles derived from bacteria in cirrhotic patients, liver cancer patients and healthy individuals.
На фиг. 4 представлен результат сравнения распределения везикул бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с инфарктом миокарда и здоровых индивидов.In FIG. 4 shows the result of a comparison of the distribution of vesicles of bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of blood-borne vesicles derived from bacteria in patients with myocardial infarction and healthy individuals.
На фиг. 5 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с почечной недостаточностью и у здоровых индивидов.In FIG. 5 shows the result of comparing the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of blood-borne vesicles derived from bacteria in patients with renal insufficiency and in healthy individuals.
На фиг. 6 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с диабетом и у здоровых индивидов.In FIG. 6 shows the result of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of blood-borne vesicles derived from bacteria in diabetic patients and in healthy individuals.
На фиг. 7 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с опухолями мозга и у здоровых индивидов.In FIG. 7 shows the result of comparing the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of blood-borne vesicles derived from bacteria in patients with brain tumors and in healthy individuals.
На фиг. 8 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с умеренными нарушениями когнитивных функций, у больных с деменцией при болезни Альцгеймера и у здоровых индивидов.In FIG. 8 shows the result of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of blood-borne vesicles derived from bacteria in patients with moderate cognitive impairment, in patients with Alzheimer's dementia, and in healthy individuals.
На фиг. 9 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с депрессией и у здоровых индивидов.In FIG. 9 shows the result of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of blood-borne vesicles derived from bacteria in depressed patients and healthy individuals.
На фиг. 10 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в моче везикул, происходящих из бактерий, у больных с аутизмом и у здоровых индивидов.In FIG. 10 shows the result of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of urinary vesicles derived from bacteria in autistic patients and healthy individuals.
На фиг. 11 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови и моче везикул, происходящих из бактерий, у больных с атопическим дерматитом и у здоровых индивидов.In FIG. 11 shows the result of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas after metagenomic analysis of vesicles derived from bacteria present in blood and urine in patients with atopic dermatitis and in healthy individuals.
На фиг. 12 представлен результат оценки апоптоза после обработки макрофагов (клеток Raw264.7) везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, чтобы оценить апоптический эффект везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis (EV, внеклеточная везикула).In FIG. 12 shows the result of apoptosis evaluation after treatment of macrophages (Raw264.7 cells) with vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis to evaluate the apoptotic effect of vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis (EV, extracellular vesicle).
На фиг. 13A и 13B представлен результат сравнения уровней секреции медиаторов воспаления, вызванной EV E. coli, которые являются патогенными везикулами, путем обработки макрофагов (клеток Raw264.7) везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, чтобы оценить эффект везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, на индукцию воспаления, фиг. 13А сравнивает уровни секреции IL-6, а на фиг. 13В сравнивает уровни секреции TNF-α (EV: внеклеточная везикула).In FIG. 13A and 13B show the result of comparing levels of secretion of inflammatory mediators induced by E. coli EV, which are pathogenic vesicles, by treating macrophages (Raw264.7 cells) with Sphingomonas paucimobilis-derived vesicles to evaluate the effect of Sphingomonas paucimobilis-derived vesicles on the induction inflammation, Fig. 13A compares IL-6 secretion levels and FIG. 13B compares TNF-α (EV: extracellular vesicle) secretion levels.
На фиг. 14A и 14B представлен результат оценки эффекта E. coli EV на секрецию воспалительных медиаторов после предварительной обработки везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, произведенной до обработки E. coli EV, которые являются патогенными, чтобы оценить противовоспалительный эффект везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, фиг. 14А сравнивает уровни секреции IL-6, фиг. 14В сравнивает уровни секреции TNF-α (SPC101, Sphingomonas paucimobilis EV; EV, внеклеточная везикула).In FIG. 14A and 14B show the result of evaluating the effect of E. coli EV on the secretion of inflammatory mediators after pretreatment with Sphingomonas paucimobilis derived vesicles performed prior to treatment with E. coli EV which are pathogenic to evaluate the anti-inflammatory effect of Sphingomonas paucimobilis derived vesicles, FIG. 14A compares IL-6 secretion levels, FIG. 14B compares secretion levels of TNF-α (SPC101, Sphingomonas paucimobilis EV; EV, extracellular vesicle).
На фиг. 15A и 15B представлен результат оценки эффекта E. coli EV на секрецию воспалительных медиаторов после предварительной обработки везикулами, происходящими из Sphingomonas koreensi, произведенной до обработки E. coli EV, которые являются патогенными, чтобы оценить противовоспалительный эффект везикул, происходящих из Sphingomonas koreensis, фиг. 15А сравнивает уровни секреции IL-6, 15В сравнивает уровни секреции TNF-α (SPC102, Sphingomonas koreensis EV; EV, внеклеточная везикула).In FIG. 15A and 15B show the result of evaluating the effect of E. coli EV on the secretion of inflammatory mediators after pre-treatment with Sphingomonas koreensi-derived vesicles before treatment with E. coli EV that are pathogenic to evaluate the anti-inflammatory effect of Sphingomonas koreensis-derived vesicles, FIG. 15A compares IL-6 secretion levels, 15B compares TNF-α secretion levels (SPC102, Sphingomonas koreensis EV; EV, extracellular vesicle).
На фиг. 16 представлена серия фотографий, демонстрирующая профиль распределения везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, с течением времени после их перорального введения мышам.In FIG. 16 is a series of photographs showing the distribution profile of Sphingomonas paucimobilis-derived vesicles over time following their oral administration to mice.
На фиг. 17 представлена серия фотографий, демонстрирующая профиль распределения везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, в ткани головного с течением времени после их перорального введения мышам.In FIG. 17 is a series of photographs showing the distribution profile of Sphingomonas paucimobilis-derived vesicles in brain tissue over time after oral administration to mice.
Воплощения изобретенияEmbodiments of the invention
Данное изобретение относится к везикулам, происходящим из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, и к их применению. This invention relates to vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas and their use.
Авторы настоящего изобретения за счет метагеномного анализа подтвердили, что содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, было значительно уменьшено в образцах, полученных от больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом по сравнению с образцами, полученным от здоровых индивидов, тем самым завершив основанное на этом настоящее изобретение.The present inventors confirmed by metagenomic analysis that the content of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas was significantly reduced in samples obtained from patients with liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, moderate cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis compared to samples obtained from healthy individuals, thereby completing the present invention based on this.
Таким образом, данным изобретением предлагается способ диагностирования одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, или способ обеспечения информации для установления диагноза, который включает следующие этапы:Thus, the present invention provides a method for diagnosing one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis. , or a method of providing information for establishing a diagnosis, which includes the following steps:
(a) выделение ДНК из везикул, полученных из образцов здорового индивида и субъекта;(a) isolation of DNA from vesicles obtained from samples of a healthy individual and subject;
(b) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР ) с выделенной ДНК и парой праймеров, полученных на основе последовательности гена, имеющейся в 16S рДНК, для получения продуктов полимеразной цепной реакции; и (b) performing a polymerase chain reaction (PCR) with the isolated DNA and a pair of primers derived from the gene sequence present in the 16S rDNA to obtain polymerase chain reaction products; and
(c) идентификация случая, в котором содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, ниже, чем у здорового индивида, как случая одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, путем количественного анализа продуктов полимеразной цепной реакции.(c) identifying a case in which the content of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas is lower than that of a healthy individual as a case of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure , diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis, by quantitative analysis of polymerase chain reaction products.
В настоящем документе термин «диагноз» относится к определению состояния или заболевания у данного индивида во всех отношениях, в широком смысле. В это определение входят сущность заболевания, его этиология, патогенез, степень тяжести, специфика и конкретная клиническая картина, наличие/отсутствие осложнений, прогноз и проч. Диагноз по данному изобретению означает установление того, является ли заболевание у данного индивида циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом или атопическим дерматитом, какова выраженность заболевания и проч. As used herein, the term "diagnosis" refers to the definition of a condition or disease in a given individual in all respects, in a broad sense. This definition includes the essence of the disease, its etiology, pathogenesis, severity, specificity and specific clinical picture, the presence / absence of complications, prognosis, etc. Diagnosis according to the invention means establishing whether the disease in a given individual is cirrhosis of the liver, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism or atopic dermatitis, what is the severity of the disease and other
Термин «нановезикула» или «везикула» в настоящем документе относится к структуре, состоящей из мембранного образования с нанометровыми размерами, которая секретируется различными бактериями. Везикулы, происходящие из грамотрицательных бактерий, или везикулы, образующиеся из наружной клеточной мембраны (OMV) содержат эндотоксины (липополисахариды) или гликосфинголипиды, токсичные белки и бактериальные нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), а везикулы, происходящие из грамположительных бактерий, помимо белков и нуклеиновых кислот содержат также пептидогликаны или липотейхоевые кислоты, являющиеся компонентами клеточной стенки бактерий. В контексте данного изобретения нановезикулы/везикулы секретируются естественным путем бактериями, принадлежащими к роду Sphingomonas, или образуются искусственным путем в результате тепловой обработки бактерий, или воздействия на них давлением, или иных воздействий и имеют размеры от 10 нм до 200 нм. The term "nanovesicle" or "vesicle" as used herein refers to a nanometer-sized membrane-like structure secreted by various bacteria. Gram-negative bacteria-derived vesicles or outer cell membrane (OMV)-derived vesicles contain endotoxins (lipopolysaccharides) or glycosphingolipids, toxic proteins, and bacterial nucleic acids (DNA and RNA), while Gram-positive bacterial-derived vesicles contain, in addition to proteins and nucleic acids. acids also contain peptidoglycans or lipoteichoic acids, which are components of the bacterial cell wall. In the context of the present invention, nanovesicles/vesicles are naturally secreted by bacteria belonging to the genus Sphingomonas or are artificially formed as a result of heat treatment of bacteria or exposure to pressure or other influences and have sizes from 10 nm to 200 nm.
Термин «метагеном» в настоящем документе относится также к микробиому и подразумевает совокупность геномов микроорганизмов, включая вирусы, бактерии, грибки и др., выделенные из области, например из почвы или кишечника животного, и, как правило, употребляется для геномной характеристики, позволяющей идентифицировать большое множество микроорганизмов одновременно с помощью секвенатора для анализа некультивируемых микроорганизмов. В частности, термин «метагеном» относится не к геному одного отдельно взятого вида, а к смешанному геному всех видов, обитающих в некоторой единице окружающей среды. О метагеноме говорят тогда, когда вид рассматривается в процессе развития, как это делается в тех областях биологии, название которых оканчивается на «-омика» (например, протеомика), то есть полная характеристика вида включает как его функциональную роль, так и взаимодействие с другими видами. Методологически метагеном является объектом исследования, дающего информацию о всех видах в данной единице окружающей среды, их взаимодействиях и метаболизме посредством анализа ДНК и РНК независимо от их видовой принадлежности с помощью методов быстрого секвенирования нуклеотидных последовательностей.The term "metagenome" in this document also refers to the microbiome and means the totality of genomes of microorganisms, including viruses, bacteria, fungi, etc., isolated from a region, for example, from soil or the intestines of an animal, and, as a rule, is used for genomic characterization, allowing identification a large number of microorganisms at the same time using a sequencer for the analysis of non-culturable microorganisms. In particular, the term "metagenome" refers not to the genome of one single species, but to the mixed genome of all species living in some unit of the environment. The metagenome is spoken of when a species is considered in the process of development, as is done in those areas of biology whose name ends in “-omics” (for example, proteomics), that is, a complete characterization of a species includes both its functional role and interaction with others. types. Methodologically, the metagenome is an object of study that provides information about all species in a given environmental unit, their interactions and metabolism through the analysis of DNA and RNA, regardless of their species, using rapid nucleotide sequence sequencing methods.
Везикулы можно выделить из культуральной среды, которая содержит бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, применяя один или более методов, выбираемых из группы, состоящей из центрифугирования, ультра- и высокоскоростного центрифугирования, воздействия высоким давлением, экструдирования, воздействия ультразвуком, лизиса клеток, гомогенизации, лиофилизации, электропорации, механического разрушения, химической обработки, фильтрации через фильтры/мембраны, гель-фильтрационной хроматографии, электрофореза в свободном потоке и капиллярного электрофореза. Кроме того, для удаления загрязнений и концентрирования полученных везикул можно дополнительно применять такой метод, как промывание.Vesicles can be isolated from a culture medium that contains bacteria belonging to the genus Sphingomonas using one or more methods selected from the group consisting of centrifugation, ultra- and high-speed centrifugation, high pressure, extrusion, sonication, cell lysis, homogenization, lyophilization , electroporation, mechanical disruption, chemical processing, filter/membrane filtration, size exclusion chromatography, free flow electrophoresis, and capillary electrophoresis. In addition, a method such as washing can be additionally used to remove contaminants and concentrate the resulting vesicles.
Согласно данному изобретению образцом на этапе (а) может быть кровь или моча, но не ограничиваются ими.According to this invention, the sample in step (a) may be blood or urine, but are not limited to them.
Согласно данному изобретению парой праймеров на этапе (b) может быть пара праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе как SEQ ID No 1 и 2, но не ограничиваются ими.According to this invention, the primer pair in step (b) may be a pair of primers containing the nucleotide sequences presented herein as SEQ ID Nos. 1 and 2, but are not limited to them.
В другом аспекте данного изобретения предлагается композиция для предотвращения, ослабления или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, которая содержит в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.In another aspect of the present invention, there is provided a composition for the prevention, amelioration or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression , autism and atopic dermatitis, which contains as an active ingredient vesicles originating from bacteria belonging to the genus Sphingomonas.
Эта композиция представляет собой фармацевтическую, пищевую или косметическую композицию.This composition is a pharmaceutical, food or cosmetic composition.
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, который включает этап введения индивиду композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas.In another aspect of the present invention, there is provided a method for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis, which includes the step of administering to the individual a composition containing, as an active ingredient, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.In another aspect of the present invention, the use of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas is provided for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, moderate cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.In another aspect of the present invention, the use of a composition comprising, as an active ingredient, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas is provided for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure. , diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для изготовления лекарственного средства, используемого при одном или более заболеваниях, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.In another aspect of the present invention, the use of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas is provided for the manufacture of a medicament for use in one or more diseases selected from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, tumors. brain, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis.
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ доставки лекарственного вещества для лечения заболевания головного мозга, который включает введение индивиду композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, которые несут лекарственное вещество для лечения данного заболевания головного мозга. In another aspect of the present invention, there is provided a method for delivering a drug for the treatment of a brain disease, which comprises administering to an individual a composition comprising, as an active ingredient, vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas that carry a drug for the treatment of the brain disease.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для доставки лекарственного вещества с целью лечения заболевания головного мозга.In another aspect of the present invention, the use of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas is provided for the delivery of a drug for the treatment of a brain disease.
Термин «предотвращение» в настоящем документе относится ко всем мероприятиям, подавляющим цирроз печени, рак печени, инфаркт миокарда, почечную недостаточность, диабет, опухоли головного мозга, умеренные нарушения когнитивных функций, деменцию, депрессию, аутизм, атопический дерматит и др., или задерживающим возникновение этих заболеваний путем введения в организм композиции по данному изобретению. The term "prevention" in this document refers to all interventions that suppress liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, atopic dermatitis, etc., or delay the occurrence of these diseases by introducing the composition of this invention into the body.
Термин «лечение» в настоящем документе относится ко всем мероприятиям, ослабляющим или изменяющим в положительную сторону симптомы цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма, атопического дерматита и др., путем введения в организм композиции по данному изобретению. The term "treatment" in this document refers to all interventions that relieve or improve the symptoms of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, atopic dermatitis and others, by introducing the composition of this invention into the body.
Термин «ослабление» в настоящем документе применительно к заболеваниям относится ко всем мероприятиям, которые по меньшей мере снижают значения показателей, связанных с подлежащим лечению состоянием, например, снижают выраженность/степень тяжести симптомов. The term "attenuation" as used herein in relation to diseases refers to all activities that at least reduce the values of indicators associated with the condition being treated, for example, reduce the severity/severity of symptoms.
Термин «носитель лекарственного вещества» в настоящем документе относится ко всем средствам или действиям, которые служат для загрузки и доставки лекарственного вещества в составе композиции по данному изобретению, чтобы оно попало в определенный орган, ткань, клетку или клеточную органеллу.The term "drug carrier" as used herein refers to all means or activities that serve to load and deliver the drug in a composition of this invention to a specific organ, tissue, cell, or cell organelle.
В одном из воплощений данного изобретения мышам вводили перорально бактерии и бактериальные везикулы и наблюдали in vivo за профилями всасывания, распределения в организме и выведения из него бактерий и везикул, в результате чего было показано, что в то время как бактерии не проникают через слизистую оболочку кишечника, происходящие из бактерий везикулы всасываются за пять минут после перорального введения, распределяются с кровотоком по всему организму и выводятся из него через почки, печень и др. (см. пример 1).In one embodiment of the present invention, bacteria and bacterial vesicles were administered orally to mice and the absorption, distribution and excretion profiles of the bacteria and vesicles were observed in vivo, showing that while bacteria do not penetrate the intestinal mucosa , originating from bacteria, vesicles are absorbed within five minutes after oral administration, distributed with the bloodstream throughout the body and excreted from it through the kidneys, liver, etc. (see example 1).
В другом типичном воплощении данного изобретения определяли, проникают ли бактериальные клетки и везикулы, введенные прямо в кишечник, через защитную мембрану слизистой, и было установлено, что бактериальным клеткам не удается преодолеть защитную мембрану слизистой, тогда как везикулы, происходящие из бактерий, проникают через нее (см. Пример 2).In another exemplary embodiment of the present invention, it was determined whether bacterial cells and vesicles injected directly into the intestine penetrate the mucosal protective membrane, and it was found that the bacterial cells fail to overcome the protective mucosal membrane, while vesicles derived from bacteria penetrate through it. (see Example 2).
В еще одном типичном воплощении данного изобретения проводили метагеномный анализ бактерий, используя везикулы, выделенные из крови или мочи больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом и здоровых индивидов, соответствующих больным по возрасту и полу. В итоге было показано, что содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, в клинических образцах, взятых у больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом, значительно ниже, чем в образцах от здоровых индивидов (см. Примеры 4 - 12).In another exemplary embodiment of the present invention, a metagenomic analysis of bacteria was performed using vesicles isolated from the blood or urine of patients with liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism. and atopic dermatitis and healthy individuals corresponding to patients by age and sex. As a result, it was shown that the content of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas in clinical samples taken from patients with liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, moderate cognitive impairment, dementia, depression, autism and atopic dermatitis, significantly lower than in samples from healthy individuals (see Examples 4 - 12).
В еще одном типичном воплощении данного изобретения оценивали влияние везикул, секретируемых бактериями Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, на индукцию воспаления путем культивировали штаммов, и результатом сравнения уровней секреции медиаторов воспаления после обработки макрофагов указанными везикулами, происходящими из бактерий, в различных концентрациях и везикулами, происходящими из Escherichia coli, являющимися патогенными, была значительно уменьшенная секреция медиаторов воспаления, подлежащих секреции, вызванная везикулами, происходящими из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, по сравнению с секрецией IL-6 и TNF-α в случае везикул, происходящих из E. coli (см. пример 14).In yet another exemplary embodiment of the present invention, the effect of vesicles secreted by the bacteria Sphingomonas paucimobilis and Sphingomonas koreensis on the induction of inflammation was evaluated by cultured strains, and by comparing the secretion levels of inflammatory mediators after treatment of macrophages with said bacterial-derived vesicles at different concentrations and with vesicles derived from from Escherichia coli, which are pathogenic, there was a significantly reduced secretion of inflammatory mediators to be secreted by vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas compared to the secretion of IL-6 and TNF-α in the case of vesicles derived from E. coli (see example 14).
В еще одном типичном воплощении данного изобретения определяли противовоспалительный эффект везикул, происходящих из бактерий Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, и было показано, что если макрофаги обрабатывают везикулами Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis в различных концентрациях до обработки их везикулами, происходящими из E. coli, которые являются патогенными, то эффективно подавляется секреция IL-6 и TNF-α, вызываемая индуцирующими воспалительную реакцию везикулами, происходящими из E. coli (см. примеры 15 и 16).In another exemplary embodiment of the present invention, the anti-inflammatory effect of Sphingomonas paucimobilis and Sphingomonas koreensis-derived vesicles was determined, and it was shown that if macrophages were treated with Sphingomonas paucimobilis and Sphingomonas koreensis vesicles at various concentrations before being treated with E. coli-derived vesicles, which are pathogenic, the secretion of IL-6 and TNF-α caused by inflammatory response-inducing vesicles derived from E. coli is effectively suppressed (see examples 15 and 16).
В еще одном типичном воплощении данного изобретения было показано, что при пероральном введении везикул, происходящих из бактерий Sphingomonas paucimobilis, они через 1 час после введения распределяются в желудке, через 3 часа после введения – по тонкому кишечнику и толстой кишке, причем было показано, что указанное распределение в этих органах поддерживалось до 72 часов. Также было показано, что везикулы, происходящие из Sphingomonas paucimobilis, несущие флуоресцентную метку, по истечении 3 часов специфично перемещаются в головной мозг, и содержание их там нарастает до 32-го часа, а затем постепенно снижается до окончания 72-го часа (см. пример 17).In another exemplary embodiment of the present invention, vesicles derived from the bacteria Sphingomonas paucimobilis have been shown to be distributed orally in the
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Этот фармацевтически приемлемый носитель является таким, который обычно применяют в лекарственных препаратах, и включает, не ограничиваясь перечисленным, физиологический раствор, стерильную воду, раствор Рингера, забуференный солевой раствор, циклодекстрин, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этиловый спирт, липосомы и проч., и при необходимости может также включать другие обычно используемые дополнительные компоненты, например, антиоксиданты и буфер. Кроме того, композиция может быть включена в состав препарата для введения путем инъекций, например, водный раствор, суспензию и эмульсию, пилюли, капсулы, гранулы или таблетки, для чего в нее добавляют дополнительно разбавитель, диспергирующий агент, поверхностно-активное вещество, связующий агент, агент, улучшающий скольжение, и проч. Что касается пригодных фармацевтически приемлемых носителей и составов, то каждый такой ингредиент вводят в состав композиции по данному изобретению предпочтительно методами, описанными в ремингтоновских фармацевтических руководствах. Лекарственная форма и состав композиции по данному изобретению как-либо конкретно не ограничены; она может представлять собой препарат для инъекций, для ингаляций, для наружного применения, для перорального приема и др. The pharmaceutical composition of this invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier. This pharmaceutically acceptable carrier is one that is commonly used in drug formulations and includes, but is not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerin, ethyl alcohol, liposomes, and the like. ., and if necessary, may also include other commonly used additional components, such as antioxidants and a buffer. In addition, the composition can be included in the preparation for injection, for example, an aqueous solution, suspension and emulsion, pills, capsules, granules or tablets, for which an additional diluent, dispersing agent, surfactant, binding agent is added to it. , a slip agent, and the like. With regard to suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations, each such ingredient is incorporated into the composition of this invention, preferably by the methods described in the Remington Pharmaceutical Guidelines. Dosage form and composition of the composition according to this invention is not particularly limited; it may be an injection, inhalation, topical, oral, etc.
Фармацевтическую композицию по данному изобретению могут вводить перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, интрадермально) соответственно избранному пути и способу введения, а вводимая доза может варьироваться в зависимости от состояния пациента, его массы тела, степени тяжести заболевания, лекарственной формы композиции, пути и режима введения, и может быть адекватно подобрана специалистом в данной области техники.The pharmaceutical composition of this invention may be administered orally or parenterally (e.g., intravenously, subcutaneously, intradermally) according to the chosen route and method of administration, and the dose administered may vary depending on the condition of the patient, his body weight, severity of the disease, dosage form of the composition, route and mode of administration, and can be adequately selected by a person skilled in the art.
Фармацевтическую композицию по данному изобретению вводят индивиду в фармацевтически эффективном количестве. Согласно данному изобретению термин «фармацевтически эффективное количество» относится к такому количеству композиции, которое достаточно для лечения заболеваний с разумным соотношением риск/польза, используемым при медикаментозном лечении; уровень эффективной дозировки определяют в зависимости от таких факторов, как характер данного заболевания, наличие других заболеваний у данного индивида, степень тяжести заболевания, активность лекарственного препарата, чувствительность индивида к лекарственному препарату, время и путь введения, скорость выведения препарата из организма, продолжительность лечения, принимаемые данным индивидом другие лекарственные препараты, и иных факторов, известных в других областях медицины. Композицию по данному изобретению вводят пациенту как отдельный терапевтический агент или в комбинации с другими терапевтическими агентами, одновременно или последовательно с этими другими препаратами в родственной области в виде единичной дозы или множества доз. Важно вводить композицию по данному изобретению в минимально возможном количестве, которое обеспечит максимально возможный эффект без каких-либо побочных явлений и с учетом указанных выше факторов, что без труда может определить рядовой специалист в данной области техники.The pharmaceutical composition of this invention is administered to an individual in a pharmaceutically effective amount. According to this invention, the term "pharmaceutically effective amount" refers to that amount of the composition, which is sufficient to treat diseases with a reasonable ratio of risk/benefit, used in medical treatment; the level of effective dosage is determined depending on factors such as the nature of the disease, the presence of other diseases in the individual, the severity of the disease, the activity of the drug, the sensitivity of the individual to the drug, the time and route of administration, the rate of excretion of the drug from the body, the duration of treatment, other drugs taken by this individual, and other factors known in other fields of medicine. The composition of this invention is administered to the patient as a single therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, simultaneously or sequentially with these other drugs in the related field in the form of a single dose or multiple doses. It is important to administer the composition of this invention in the smallest possible amount that will provide the maximum possible effect without any side effects and taking into account the above factors, which can be easily determined by one of ordinary skill in the art.
В частности, эффективное количество фармацевтической композиции по данному изобретению варьирует в зависимости от возраста, пола и массы тела индивида; оно может быть больше или меньше в зависимости от пути введения в организм, степени тучности индивида, его пола, массы тела, возраста и проч.In particular, the effective amount of the pharmaceutical composition according to this invention varies depending on the age, sex and body weight of the individual; it can be more or less depending on the route of administration into the body, the degree of obesity of the individual, his sex, body weight, age, and so on.
Пищевая композиция по данному изобретению включает функциональный оздоровительный продукт для питания. Пищевая композиция по данному изобретению используется путем добавления активного ингредиента к пищевому продукту или вместе с другими пищевыми продуктами или пищевыми ингредиентами; ее адекватное использование достигается обычными способами. Количество активного ингредиента, смешиваемого с пищевым продуктом, определяют в зависимости от целей применения – для предотвращения или для ослабления заболевания. Как правило, при изготовлении пищевого продукта, включая напитки, композицию по данному изобретению добавляют в него в количестве 15% (масса/масса) или меньше, предпочтительно 10% (масса/масса) или меньше относительно массы исходных материалов. Однако в случаях длительного приема в оздоровительных и гигиенических целях или для поддержания здорового состояния индивида это количество может быть меньше указанного.The food composition according to the present invention includes a functional health product for nutrition. The food composition of this invention is used by adding the active ingredient to a food product or together with other food products or food ingredients; its adequate use is achieved by conventional means. The amount of active ingredient mixed with the food product is determined depending on the purpose of application - to prevent or to reduce the disease. Typically, in the manufacture of a food product, including beverages, the composition of this invention is added to it in an amount of 15% (w/w) or less, preferably 10% (w/w) or less, relative to the weight of the starting materials. However, in cases of long-term use for recreational and hygienic purposes or to maintain the healthy state of the individual, this amount may be less than indicated.
Другие ингредиенты особо не ограничиваются, за тем исключением, что пищевая композиция по данному изобретению содержит в качестве основного компонента активный ингредиент в указанном относительном количестве, а также в качестве дополнительных ингредиентов различные ароматизирующие агенты, природные углеводы и прочие обычные компоненты напитков. Примеры упомянутых природных углеводов включают обычные сахара, например, моносахариды, например, глюкозу, фруктозу и др., дисахариды, например, мальтозу, сахарозу и др., полисахариды, например, декстрин, циклодекстрин и др., сахарные спирты, например, ксилит, сорбит, эритрит. Из числа агентов, придающих вкус и/или аромат, помимо описанных выше в композиции по данному изобретению предпочтительно использовать природные агенты (тауматин, экстракт стевии (например ребаудиозид А, глицирризин и др.) и синтетические (сахарин, аспартам и др). Относительное количество природных углеводов в композиции по данному изобретению может определить по своему выбору рядовой специалист в данной области техники.The other ingredients are not particularly limited, except that the food composition of the present invention contains the active ingredient in the specified relative amount as the main component, and various flavoring agents, natural carbohydrates, and other common beverage components as additional ingredients. Examples of natural carbohydrates mentioned include common sugars, such as monosaccharides, such as glucose, fructose, etc., disaccharides, such as maltose, sucrose, etc., polysaccharides, such as dextrin, cyclodextrin, etc., sugar alcohols, such as xylitol, sorbitol, erythritol. Of the agents that impart taste and/or aroma, in addition to those described above in the composition of this invention, it is preferable to use natural agents (thaumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic (saccharin, aspartame, etc.). natural carbohydrates in the composition of this invention can be determined by choice of an ordinary person skilled in the art.
Пищевая композиция по данному изобретению может дополнительно содержать различные питательные вещества, витамины и минеральные вещества (электролиты), природные и синтетические ароматизирующие агенты, красители и наполнители (сыр, шоколад и др.), пектиновые кислоты и их соли, альгиновые кислоты и их соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, агенты для подведения рН, стабилизирующие агенты, консерванты, глицерин, спирты, карбонизаторы (в газированных напитках) и др. Эти ингредиенты используются как по отдельности, так и в сочетаниях. Относительное количество таких добавок в композиции может подобрать рядовой специалист в данной области техники. The food composition according to this invention may additionally contain various nutrients, vitamins and minerals (electrolytes), natural and synthetic flavoring agents, dyes and fillers (cheese, chocolate, etc.), pectin acids and their salts, alginic acids and their salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjustment agents, stabilizing agents, preservatives, glycerin, alcohols, carbonizers (in carbonated drinks), etc. These ingredients are used either alone or in combination. The relative amount of such additives in the composition can be adjusted by one of ordinary skill in the art.
Косметическая композиция по данному изобретению может включать не только везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, но также ингредиенты, обычно используемые в косметических композициях, например такие привычные в косметике дополнительные компоненты, как антиоксиданты, стабилизирующие агенты, солюбилизирующие агенты, витамины, пигменты, продукты растительного происхождения и носители. The cosmetic composition of the present invention may include not only vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas, but also ingredients commonly used in cosmetic compositions, such as additives commonly used in cosmetics, such as antioxidants, stabilizing agents, solubilizing agents, vitamins, pigments, herbal products and carriers.
Дополнительно композиция по данному изобретению может включать помимо везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, смесь органических веществ, защищающих от ультрафиолетового излучения, которые используются в тех пределах, в которых из-за взаимодействия с везикулами, происходящими из бактерий, не ухудшается защита кожи. Органические вещества, защищающие от ультрафиолетового излучения, в композиции по данному изобретению могут быть представлены одним или более агентам, выбираемыми из группы, состоящей из глицерил PABA, дрометризол-трисилоксана, дрометризола, дигаллоилтриолеата, дифенила натрия, дибензимидазол-тетрасульфоната, диэтилгексилбутамидотриазона, диэтиламиногидроксибензоилгексилбензоата, диэтаноламинметоксициннамата, смеси лавсона и дигидроксиацетона, метилен-бис-бензотриазолилтетраметилбутилфенола, 4-метилбензилидена камфоры, метилантранилата, бензофенона-3 (оксибензона), бензофенона-4, бензофенона-8 (диоксибензона), бутилметоксидибензоилметана, бис-этилгексилоксифенолметоксифенилтриазина, циноксата, этилдигидроксипропил PABA, октокрилена, этилгексилдиметил PABA, эилгексилметоксициннамата, этилгексисалицилата, этилгексилтриазона, изоамил-пара-метоксициннамата, полисиликона-15 (диметикодиэтилбензальмалоната), терефталилиден-дикамфора-сульфоновой кислоты (экамсула) и ее солей, триэтаноламина салицилата и пара-аминобензойной кислоты (PABA).Additionally, the composition according to the invention may include, in addition to vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas, a mixture of organic substances that protect against ultraviolet radiation, which are used to the extent that due to interaction with vesicles derived from bacteria, skin protection is not impaired. . The organic ultraviolet protectants in the composition of this invention may be represented by one or more agents selected from the group consisting of glyceryl PABA, drometrizole trisiloxane, drometrizole, digalloyl trioleate, sodium diphenyl, dibenzimidazole tetrasulfonate, diethylhexylbutamidotriazone, diethylaminohydroxybenzoylhexylbenzoate, diethanolaminemethoxycinnamate , mixtures of lawson and dihydroxyacetone, methylene-bis-benzotriazolyltetramethylbutylphenol, camphor 4-methylbenzylidene, methylanthranilate, benzophenone-3 (oxybenzone), benzophenone-4, benzophenone-8 (dioxybenzone), butylmethoxydibenzoylmethane, bis-ethylhexyloxyphenolmethoxyphenyltriazine, cinoxate, ethyldihydroxypropyl PABA, octocrylene, ethylhexyldimethyl PABA, eylhexylmethoxycinnamate, ethylhexysalicylate, ethylhexyltriazone, isoamyl para-methoxycinnamate, polysilicon-15 (dimethicodiethylbenzalmalonate), terephthalilidene dicamphor sulfonic acid (ecamsula) and its salts, triethanolamine ca licylate and para-aminobenzoic acid (PABA).
Примеры продуктов, в которые можно добавлять косметическую композицию по данному изобретению, включают такие косметические средства, как вяжущие средства, мягчительные средства для кожи, питательные тоники, различные кремы, эссенции, маски, тональные кремы, очищающие средства, в том числе, очищающие средства для лица, мыло, средства ухода, косметическая жидкость и проч. В частности, продукты, содержащие косметическую композицию по данному изобретению, включают лосьоны для кожи, мягчительные средства для кожи, тоники для кожи, вяжущие средства, лосьоны, косметическое молочко, увлажняющие лосьоны, питательные лосьоны, массажные кремы, питательные кремы, увлажняющие кремы, кремы для рук, эссенции, питательные эссенции, маски, мыло, шампуни, очищающую пену, очищающие лосьоны, очищающие кремы, лосьоны для тела, очищающие средства для детей, эмульсии, губную помаду, основы для макияжа, тональные кремы, компактную пудру, рассыпную пудру, тени для век и проч.Examples of products to which the cosmetic composition of this invention can be added include cosmetics such as astringents, skin emollients, nourishing toners, various creams, essences, masks, foundations, cleansers, including cleansers for face, soap, care products, cosmetic liquid, etc. In particular, products containing the cosmetic composition of this invention include skin lotions, skin emollients, skin tonics, astringents, lotions, cosmetic milks, moisturizing lotions, nourishing lotions, massage creams, nourishing creams, moisturizers, creams for hands, essences, nourishing essences, masks, soaps, shampoos, cleansing foam, cleansing lotions, cleansing creams, body lotions, cleansers for children, emulsions, lipstick, makeup bases, foundations, compact powder, loose powder, eye shadow, etc.
Далее в настоящем документе приводятся предпочтительные примеры, разъясняющие данное изобретение. Однако приведенные далее примеры служат лишь для облегчения понимания данного изобретения, и содержание настоящего изобретения не ограничивается представленными далее примерами. Further in this document are preferred examples that explain the present invention. However, the following examples serve only to facilitate understanding of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
ПримерыExamples
Пример 1. Анализ всасывания, распределения и выведения бактерий и происходящих из бактерий везикул in vivoExample 1 In Vivo Uptake, Distribution and Clearance Assay of Bacteria and Bacteria-Derived Vesicles
Чтобы определить, всасываются ли бактерии и происходящие из бактений везикулы в желудочно-кишечном тракте и попадают ли оттуда в кровь, был проведен следующий эксперимент. Мышам вводили через рот в желудок флуоресцентно меченные бактериальные клетки и везикулы, происходящие из бактерий, в дозе 50 мкг; через 0 минут, 5 минут, 3 часа, 6 часов и 12 часов измеряли флуоресценцию. Как можно видеть на изображения всего тела мыши, показанного на фиг. 1А, бактерии не проникали из пищеварительного тракта в кровоток, тогда как везикулы, происходящие из бактерий, всасывались и попадали в кровь через 5 минут после введения; через 3 часа после введения наблюдалась отчетливая флуоресценция в мочевом пузыре, откуда следует, что везикулы выводились из организма через мочевые пути. Также видно, что везикулы находились в организме вплоть до 12 часов после введения (смотри на фиг. 1А). In order to determine whether bacteria and vesicles derived from bacteria are absorbed in the gastrointestinal tract and whether they enter the blood from there, the following experiment was carried out. Mice were injected orally into the stomach with fluorescently labeled bacterial cells and vesicles derived from bacteria at a dose of 50 μg; fluorescence was measured at 0 minutes, 5 minutes, 3 hours, 6 hours and 12 hours. As can be seen from the images of the entire body of the mouse shown in FIG. 1A, bacteria did not enter the bloodstream from the digestive tract, while vesicles derived from bacteria were absorbed and entered the blood 5 minutes after administration; 3 hours after injection, a distinct fluorescence was observed in the bladder, which implies that the vesicles were excreted from the body through the urinary tract. It is also seen that the vesicles were in the body up to 12 hours after injection (see Fig. 1A).
Чтобы выяснить распределение бактерий и происходящих из бактерий везикул из кровотока по различным органам, мышам вводили флуоресцентно меченные бактериальные клетки и везикулы, происходящие из бактерий в дозе 50 мкг, как описано выше, и через 12 часов после введения брали у них кровь, извлекали сердце, легкие, печень, почки, селезенку, жировую ткань и мышцы. Из результатов измеренной флуоресценции можно видеть, что везикулы, происходящие из бактерий, присутствовали в крови, сердце, легких, печени, селезенке, жировой ткани, мышцах и почках, а бактерии не были абсорбированы (смотри фиг.1В).To ascertain the distribution of bacteria and bacterial-derived vesicles from the bloodstream to various organs, mice were injected with fluorescently labeled bacterial cells and bacterial-derived vesicles at a dose of 50 µg as described above, and 12 hours after administration, blood was taken from them, the heart was removed, lungs, liver, kidneys, spleen, adipose tissue and muscles. From the results of the measured fluorescence, it can be seen that vesicles originating from bacteria were present in the blood, heart, lungs, liver, spleen, adipose tissue, muscles and kidneys, and the bacteria were not absorbed (see FIG. 1B).
Пример 2. Оценка того, проникают ли бактерии и происходящие из бактерий везикулы через защитный барьер слизистой оболочки кишечникаExample 2 Assessing Whether Bacteria and Bacteria-Derived Vesicles Penetrate the Intestinal Mucosal Protective Barrier
Чтобы определить, проникают ли бактерии и происходящие из бактерий везикулы сквозь защитную мембрану слизистой в ткани, после введения непосредственно в кишечники бактерий и везикул, происходящих из бактерий оценивали иммуногистохимическим методом инфильтрацию в ткани кишечника сквозь защитную мембрану слизистой. Для определения присутствия бактерий и везикул в тканях слизистой получали и использовали направленные против бактерий и везикул антитела, конъюгированные с зеленым флуоресцентным белком (GFP), и после окрашивания 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) изучали под микроскопом. In order to determine whether bacteria and bacterial-derived vesicles penetrate the mucosal protective membrane into tissues, after direct injection of bacteria and bacterial-derived vesicles into the intestines, infiltration into the intestinal tissue through the mucosal protective membrane was evaluated by immunohistochemistry. To determine the presence of bacteria and vesicles in mucosal tissues, antibodies directed against bacteria and vesicles conjugated with green fluorescent protein (GFP) were prepared and used and, after staining with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), were examined under a microscope.
Полученные результаты подтвердили, что бактерии не преодолевают защитную мембрану слизистой, в то время как везикулы, происходящие из бактерий, проникали через слизистую в ткани кишечника (смотри фиг.2).The results obtained confirmed that the bacteria did not penetrate the protective mucosal membrane, while the vesicles originating from the bacteria penetrated the mucosa into the intestinal tissues (see FIG. 2).
Пример 3. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, в клинических образцахExample 3 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria in Clinical Specimens
После помещения крови или мочи в пробирку объемом 10 мл и осаждения суспендированного материала путем центрифугирования (3,500 x g, 10 min, 4°C), только супернатант помещали в новую пробирку объемом 10 мл. После удаления бактерий и примесей с помощью фильтра на 0,22 мкм, их помещали в пробирку Centriprep (фильтр для центрифугирования на 50 кДа) и центрифугировали при 1500 х g и температуре 4°С в течение 15 минут, причем материал мельче 50 кДа отбрасывали, а остаток концентрировали до объема 10 мл. После повторного удаления бактерий и примесей с помощью фильтра на 0,22 мкм супернатант удаляли ультрацентрифугированием при 150 000 х g и температуре 4°C в течение 3 часов, используя ротор Type 90Ti, а собранный осадок растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS).After placing the blood or urine in a 10 ml tube and settling the suspended material by centrifugation (3,500 x g, 10 min, 4°C), only the supernatant was placed in a new 10 ml tube. After removing bacteria and impurities with a 0.22 µm filter, they were placed in a Centriprep tube (50 kDa centrifuge filter) and centrifuged at 1500 xg and 4°C for 15 minutes, with material smaller than 50 kDa discarded, and the residue was concentrated to a volume of 10 ml. After repeated removal of bacteria and impurities with a 0.22 µm filter, the supernatant was removed by ultracentrifugation at 150,000 xg and 4°C for 3 hours using a Type 90Ti rotor and the collected pellet was dissolved in phosphate buffered saline (PBS).
Внутреннюю ДНК экстрагировали из липидного окружения путем кипячения 100 мкл везикул, полученных методом, описанным выше, при 100°C и затем охлаждали на льду в течение 5 минут. А затем, чтобы удалить оставшийся суспендированный материал, ДНК центрифугировали при 10 000 х g и температуре 4°C в течение 30 минут, и собирали полученный супернатант. А количество ДНК определяли с помощью Nanodrop. Затем, чтобы определить, присутствует ли бактериальная ДНК в экстрагированной ДНК, проводили ПЦР с праймерами к 16S рДНК, представленными в таблице 1 ниже, и было показано, что в экстрагированных генах присутствуют гены, происходящие из бактерий. The internal DNA was extracted from the lipid environment by boiling 100 μl of the vesicles obtained by the method described above at 100° C. and then cooling on ice for 5 minutes. And then, to remove the remaining suspended material, the DNA was centrifuged at 10,000 xg and 4°C for 30 minutes, and the obtained supernatant was collected. And the amount of DNA was determined using Nanodrop. Then, in order to determine whether bacterial DNA was present in the extracted DNA, PCR was performed with the 16S rDNA primers shown in Table 1 below, and genes derived from bacteria were shown to be present in the extracted genes.
Таблица 1Table 1
ДНК, экстрагированную, способом, описанным выше, амплифицировали, используя праймеры к 16S рДНК, а затем секвенировали (секвенатор MiSeq производства Illumina), причем полученные данные выгружали в стандартный файл формата потоковой диаграммы (SFF), причем файл SFF конвертировали в файл для последовательностей (.fasta), а файл оценки качества прочитанных нуклеотидов конвертировали с помощью программы GS FLX (v2.9), а затем подтверждали достоверность прочтений и исключали ту часть, для которых средняя точность определения нуклеотида для окна (20 пар оснований) была меньше 99% (оценка качества Phred <20). Для анализа оперативных таксономических единиц (OTU) проводили кластеризацию соответственно сходству последовательностей с использованием алгоритма UCLUST в USEARCH, причем кластеризацию родов, семейств, порядков, классов и типов делали на основании сходства нуклеотидных последовательностей на 94%, 90%, 85%, 80% и 75% соответственно, классифицировали на уровне типа, класса, порядка, семейства и рода каждую OTU, и бактерии при сходстве последовательностей 97% или больше идентифицировали на уровне рода, используя базу данных последовательностей РНК 16S (108 453 последовательности) BLASTN и GreenGenes (QIIME). Пример 4. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, The DNA extracted by the method described above was amplified using 16S rDNA primers and then sequenced (Illumina's MiSeq sequencer) and the data obtained was uploaded to a standard flowchart format (SFF) file, the SFF file being converted to a sequence file ( .fasta), and the file for assessing the quality of the read nucleotides was converted using the GS FLX (v2.9) program, and then the reliability of the reads was confirmed and the part for which the average accuracy of the nucleotide determination for the window (20 base pairs) was less than 99% was excluded ( Phred quality score <20). For the analysis of operational taxonomic units (OTUs), clustering was performed according to sequence similarity using the UCLUST algorithm in USEARCH, and clustering of genera, families, orders, classes and types was done based on the similarity of nucleotide sequences by 94%, 90%, 85%, 80% and 75%, respectively, classified at type, class, order, family, and genus level of each OTU, and bacteria with sequence similarity of 97% or more were identified at genus level using the 16S RNA sequence database (108,453 sequences) of BLASTN and GreenGenes (QIIME) . Example 4 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria
в крови индивидов с заболеванием печениin the blood of individuals with liver disease
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 97 больных с циррозом печени, 76 больных с раком печени и 171 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с циррозом печени и раком печени значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 3).After a metagenomic analysis of the blood of 97 patients with cirrhosis of the liver, 76 patients with liver cancer and 171 healthy individuals, corresponding to the patients by age and sex, using the extraction of genes from vesicles present in the blood, the distribution of vesicles was evaluated using the method described in example 3. originating from bacteria belonging to the genus Sphingomonas. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the blood of patients with liver cirrhosis and liver cancer is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 3).
Пример 5. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, Example 5 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria
в крови индивидов с инфарктом миокардаin the blood of individuals with myocardial infarction
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 69 больных с инфарктом миокарда и 159 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных инфарктом миокарда значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 4).After using the method described in example 3, a metagenomic blood test of 69 patients with myocardial infarction and 159 healthy individuals corresponding to patients by age and sex, using gene extraction from vesicles present in the blood, the distribution of vesicles originating from bacteria belonging to genus Sphingomonas. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the blood of patients with myocardial infarction is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 4).
Пример 6. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, в крови индивидов с почечной недостаточностьюExample 6 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria in the Blood of Individuals with Renal Insufficiency
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 36 больных с почечной недостаточностью и 72 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с почечной недостаточностью значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 5).After using the method described in example 3, metagenomic analysis of blood of 36 patients with renal insufficiency and 72 healthy individuals corresponding to patients by age and sex, using gene extraction from vesicles present in the blood, the distribution of vesicles originating from bacteria belonging to genus Sphingomonas. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the blood of patients with renal insufficiency is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 5).
Пример 7. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий,Example 7 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria
в крови индивидов с диабетомin the blood of individuals with diabetes
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 81 больного с диабетом и 126 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с диабетом значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 6).After a metagenomic analysis of the blood of 81 patients with diabetes and 126 healthy individuals, corresponding to the patients by age and sex, using the method described in example 3, using gene extraction from vesicles present in the blood, the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the blood of patients with diabetes is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 6).
Пример 8. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, в крови индивидов с опухолями головного мозгаExample 8 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria in the Blood of Individuals with Brain Tumors
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 80 больных с опухолями головного мозга и 121 здорового индивида, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с опухолями головного мозга значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 7).After a metagenomic analysis of the blood of 80 patients with brain tumors and 121 healthy individuals, corresponding to patients by age and sex, using the method described in example 3, using gene extraction from vesicles present in the blood, the distribution of vesicles originating from bacteria, belonging to the genus Sphingomonas. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the blood of patients with brain tumors is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 7).
Пример 9. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, в крови индивидов с умеренными нарушениями когнитивных функций и деменциейExample 9 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria in the Blood of Individuals with Moderate Cognitive Impairment and Dementia
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 76 больных с умеренными нарушениями когнитивных функций, 70 больных с деменцией (болезнью Альцгеймера) и 146 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с умеренными нарушениями когнитивных функций и деменцией (болезнью Альцгеймера) значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 8).After using the method described in example 3, metagenomic analysis of blood of 76 patients with moderate cognitive impairment, 70 patients with dementia (Alzheimer's disease) and 146 healthy individuals, corresponding to patients by age and sex, using gene extraction from vesicles present in blood, the distribution of vesicles originating from bacteria belonging to the genus Sphingomonas was evaluated. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the blood of patients with moderate cognitive impairment and dementia (Alzheimer's disease) is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 8).
Пример 10. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, Example 10 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria
в крови индивидов с депрессиейin the blood of individuals with depression
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 70 больных с депрессией и 140 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с депрессией значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 9).After a metagenomic analysis of the blood of 70 patients with depression and 140 healthy individuals, corresponding to the patients by age and sex, using the method described in example 3, using gene extraction from vesicles present in the blood, the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the blood of patients with depression is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 9).
Пример 11. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий,Example 11 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria
в моче индивидов с аутизмомin the urine of individuals with autism
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа мочи 30 больных с аутизмом и 40 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в моче, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в моче больных с аутизмом значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 10).After using the method described in example 3, metagenomic analysis of urine of 30 patients with autism and 40 healthy individuals corresponding to patients by age and sex, using gene extraction from vesicles present in the urine, the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the urine of patients with autism is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 10).
Пример 12. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, Example 12 Metagenomic Analysis of Vesicles Derived from Bacteria
в крови и моче индивидов с атопическим дерматитомin the blood and urine of individuals with atopic dermatitis
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови и мочи от 61 больного с атопическим дерматитом и 52 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови и моче, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови и моче больных с атопическим дерматитом значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 11).After using the method described in example 3, metagenomic analysis of blood and urine from 61 patients with atopic dermatitis and 52 healthy individuals corresponding to patients by age and sex, using gene extraction from vesicles present in the blood and urine, the distribution of vesicles was evaluated, originating from bacteria belonging to the genus Sphingomonas. As a result, it was found that the content of vesicles originating from those belonging to the genus Sphingomonas in the blood and urine of patients with atopic dermatitis is significantly lower than in healthy individuals (see Fig. 11).
Пример 13. Выделение везикул из культуральной среды Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensisExample 13 Isolation of Vesicles from the Culture Medium of Sphingomonas paucimobilis and Sphingomonas koreensis
Исходя из описанных выше примеров, культивировали бактерии Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, а затем выделили из них везикулы и характеристики выделенных везикул изучили. Штаммы культивировали в среде де Мана, Рогоссы и Шарпе (MRS) в инкубаторе при температуре 37°C до оптической плотности при 600 нм (OD 600) 1,0-1,5, а затем субкультивировали в среде Лурия-Бертани (LB). Затем супернатант культуры, включавший штамм извлекали и центрифугировали при 10 000 х g и температуре 4°С в течение 20 минут, и затем штамм удаляли и фильтровали с помощью фильтра на 0,22 мкм. Профильтрованный супернатант концентрировали до объема 50 мл или меньше, используя микрофильтрацию с помощью насосной установки MasterFlex (Cole-Parmer; США) и кассетного мембранного фильтра Pellicon 2 с порогом отсечения 100 кДа (Merck Millipore; США). Сконцентрированный супернатант еще раз пропускали через фильтр на 0,22 мкм. Затем в полученном материале определяли содержание белка методом с бицинхиноновой кислотой (BCA), и последующие эксперименты проводили с полученными везикулами. Based on the examples described above, the bacteria Sphingomonas paucimobilis and Sphingomonas koreensis were cultured, and then vesicles were isolated from them, and the characteristics of the isolated vesicles were studied. The strains were cultured in De Man, Rogossa and Sharpe (MRS) medium in an incubator at 37°C to an optical density at 600 nm (OD 600) of 1.0-1.5, and then subcultured in Luria-Bertani (LB) medium. Then, the culture supernatant containing the strain was recovered and centrifuged at 10,000 xg and 4°C for 20 minutes, and then the strain was removed and filtered with a 0.22 μm filter. The filtered supernatant was concentrated to a volume of 50 ml or less using microfiltration with a MasterFlex pumping unit (Cole-Parmer; USA) and a 100 kDa
Пример 14. Индукция воспаления везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis Example 14 Induction of inflammation by vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis
Чтобы выяснить, как влияют везикулы, полученные из Sphingomonas paucimobilis (Sphingomonas paucimobilis EV, SPC101), на секрецию медиаторов воспаления (IL-6 и TNF-α) мышиными макрофагами линии Raw 264.7, эти клетки обрабатывали происходящими из Sphingomonas paucimobilis везикулами в различных концентрациях (0,1; 1 или 10 мкг/мл), после чего следовали апоптоз и ELISA.To investigate the effect of Sphingomonas paucimobilis-derived vesicles (Sphingomonas paucimobilis EV, SPC101) on the secretion of inflammatory mediators (IL-6 and TNF-α) by Raw 264.7 mouse macrophages, these cells were treated with Sphingomonas paucimobilis-derived vesicles at various concentrations ( 0.1; 1 or 10 μg/ml) followed by apoptosis and ELISA.
А именно, в лунки 48-луночного культурального планшета вносили по 5 x 104 клеток Raw 264.7 и обрабатывали везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, в различной концентрации, разведенными в бессывороточной среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), и обработанные клетки культивировали в течение 12 часов. Затем определяли апоптоз, используя EZ-CYTOX (Dogen, Корея), причем среду, в которой культивировались клетки, собирали в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали при 3,000 g в течение 5 минут, полученный супернатант извлекали и хранили при температуре -80°C, а затем проводили ELISA. Namely, 5 x 10 4 Raw 264.7 cells were added to the wells of a 48-well culture plate and treated with vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis at different concentrations, diluted in Serum-Free Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), and the treated cells were cultured in within 12 hours. Then apoptosis was determined using EZ-CYTOX (Dogen, Korea), and the medium in which the cells were cultured was collected in 1.5 ml tubes and centrifuged at 3,000 g for 5 minutes, the resulting supernatant was removed and stored at -80° C, followed by ELISA.
Для ELISA антитела для захвата разводили фосфатно-солевым раствором (PBS) и вносили аликвоты по 50 мкл в лунки 96-луночного полистиролового планшета соответственно рабочей концентрации и затем оставляли для протекания реакции на ночь при температуре 4°С. Затем промывали три раза по 100 мкл раствора PBSТ (PBS, содержащего 0,05% твин-20), и после этого вносили раствор RD (PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA)) аликвотами по 100 мкл, блокировали при комнатной температуре в течение 1 часа, и затем вносили образец и стандарт аликвотами по 50 мкл соответственно концентрации и оставляли для протекания реакции на 2 часа при комнатной температуре. Затем образец и контроль промывали раствором PBST три раза по 100 мкл, а затем антитела для обнаружения разводили раствором RD и вносили разбавленный раствор аликвотами по 50 мкл соответственно рабочей концентрации и оставляли для протекания реакции на 2 часа при комнатной температуре. Затем промывали образец и контроль раствором PBST три раза по 100 мкл, и после этого пероксидазу хрена, конъюгированную со стрептавидином (HRP) (R&D Systems, США) разводили раствором RD в соотношении 1/40, и разведенный раствор вносили аликвотами по 50 мкл и оставляли для протекания реакции на 20 минут при комнатной температуре.For ELISA, the capture antibodies were diluted with phosphate saline (PBS) and 50 μl aliquots were added to the wells of a 96-well polystyrene plate according to the working concentration and then left to react overnight at 4°C. Then washed three times with 100 µl of PBST solution (PBS containing 0.05% tween-20), and then added RD solution (PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA)) in 100 µl aliquots, blocked at room temperature for 1 hour, and then the sample and standard were added in aliquots of 50 μl, respectively, and left to react for 2 hours at room temperature. Then the sample and control were washed with PBST solution three times with 100 µl, and then antibodies for detection were diluted with RD solution and the diluted solution was added in aliquots of 50 µl corresponding to the working concentration and left for the reaction to proceed for 2 hours at room temperature. Then the sample and control were washed with PBST solution three times with 100 µl, and after that, horseradish peroxidase conjugated with streptavidin (HRP) (R&D Systems, USA) was diluted with RD solution in a ratio of 1/40, and the diluted solution was added in aliquots of 50 µl and left for the reaction to proceed for 20 minutes at room temperature.
Наконец, промывали образец и контроль раствором PBST три раза по 100 мкл, вносили 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (TMB) (SurModics, США) аликвотами по 50 мкл и оставляли на 5-20 минут для появления окраски, для прекращения реакции прибавляли серную кислоту (1M) аликвотами по 50 мкл, и измеряли поглощение на длине волны 450 нм с помощью микропланшетного ридера SpectraMax M3 (Molecular Devices, США).Finally, the sample and control were washed with PBST solution three times with 100 µl, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) (SurModics, USA) was added in 50 µl aliquots and left for 5-20 minutes for color to appear, for When the reaction was terminated, sulfuric acid (1M) was added in 50 μl aliquots, and absorbance was measured at a wavelength of 450 nm using a SpectraMax M3 microplate reader (Molecular Devices, USA).
Как можно видеть из результатов, представленных на фиг. 12, при обработке везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis (SPC 101), апоптоз не наблюдался. Далее, результатами оценки профиля секреции медиаторов воспаления в клетках воспаления было показано, что секреция макрофагами таких медиаторов воспаления, как интерлейкин-6 (фиг. 13А) и TNF-α (фиг.13В) при обработке везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis (SPC 101), было значительно слабее, чем при обработке везикулами, происходящими из E. coli (E. coli EV 1 мкг/мл), служившими положительным контролем (смотри фиг. 13A и 13B).As can be seen from the results shown in FIG. 12, when treated with vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis (SPC 101), no apoptosis was observed. Further, the results of profiling the secretion of inflammatory mediators in inflammatory cells showed that the secretion of inflammatory mediators such as interleukin-6 (Fig. 13A) and TNF-α (Fig. 13B) by macrophages when treated with vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis (SPC 101 ) was significantly weaker than when treated with E. coli derived vesicles (
Пример 15. Противовоспалительный эффект везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilisExample 15 Anti-Inflammatory Effect of Vesicles Derived from Sphingomonas paucimobilis
Чтобы оценить, исходя из результатов, полученных в Примере 14, противовоспалительное действие везикул из бактерий Sphingomonas paucimobilis, клетки мышиных линий макрофагов сначала обрабатывали везикулами, происходящими Sphingomonas paucimobilis (SPC 101), в различных концентрациях (0,1; 1 и 10 мкг/мл) в течение 12 часов, а затем эти клеточные линии были обработаны 1 мкг/мл везикул, происходящих из E.coli, которые представляют собой патогенный фактор, а затем через 12 часов измеряли секрецию цитокинов воспаления методом ELISA In order to evaluate, based on the results obtained in Example 14, the anti-inflammatory effect of vesicles from Sphingomonas paucimobilis bacteria, cells of mouse macrophage lines were first treated with vesicles originating from Sphingomonas paucimobilis (SPC 101) at various concentrations (0.1; 1 and 10 μg/ml ) for 12 hours, and then these cell lines were treated with 1 μg/ml of vesicles derived from E. coli, which is a pathogenic factor, and then after 12 hours, the secretion of inflammatory cytokines was measured by ELISA
Полученные результаты показали, что после обработки везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, секреция макрофагами IL-6 (На фиг. 14A) и TNF-α (На фиг. 14B), вызванная везикулами, происходящими из E. coli, значительно снижена (фиг 14A и 14B).The results showed that after treatment with Sphingomonas paucimobilis-derived vesicles, macrophage secretion of IL-6 (FIG. 14A) and TNF-α (FIG. 14B) induced by E. coli-derived vesicles was significantly reduced (FIG. 14A and 14B).
Пример 16. Противовоспалительный эффект везикул, происходящих из Sphingomonas koreensisExample 16 Anti-Inflammatory Effect of Vesicles Derived from Sphingomonas koreensis
Чтобы оценить, исходя из результатов, полученных в Примере 14, противовоспалительное действие везикул из других бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после обработки клеток мышиных линий макрофагов обрабатывали везикулами, происходящими из Sphingomonas koreensis (SPC 102), в различных концентрациях (0,1; 1 и 10 мкг/мл) в течение 12 часов, эти клеточные линии обрабатывали 1 мкг/мл везикул, происходящих из E.coli, которые представляют собой патогенный фактор, а затем через 12 часов измеряли секрецию цитокинов воспаления методом ELISA To assess, based on the results obtained in Example 14, the anti-inflammatory effect of vesicles from other bacteria belonging to the genus Sphingomonas, after treatment of cells of mouse macrophage lines, vesicles derived from Sphingomonas koreensis (SPC 102) were treated at various concentrations (0.1; 1 and 10 µg/mL) for 12 hours, these cell lines were treated with 1 µg/mL of E. coli derived vesicles, which are pathogenic factors, and then 12 hours later inflammatory cytokine secretion was measured by ELISA.
Полученные результаты показали, что после обработки везикулами, происходящими из Sphingomonas koreensis, секреция макрофагами IL-6 (фиг. 15A) и TNF-α (фиг. 15B), вызванная везикулами, происходящими из E. coli, значительно снижена (фиг. 15A и 15B).The results showed that after treatment with Sphingomonas koreensis-derived vesicles, macrophage secretion of IL-6 (Fig. 15A) and TNF-α (Fig. 15B) induced by E. coli-derived vesicles was significantly reduced (Fig. 15A and 15B).
Пример 17. Профиль распределение везикул, происходящих Sphingomonas paucimobilis Example 17 Distribution Profile of Vesicles Originating from Sphingomonas paucimobilis
Чтобы установить картину абсорбции и распределения в органах везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, с течением времени, был проведен следующий эксперимент. Вводили перорально 10 мкг флуоресцентно меченных везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, и через 1, 3, 6, 32, 48 и 72 часа, соответственно, после введения измеряли флуоресценцию. В результате измерения флуоресценции тела мыши было показано, что везикулы, происходящие из Sphingomonas paucimobilis, через 1 час после перорального введения распределяются в желудке и через 3 часа– в тонком кишечнике и толстой кишке, и было показано, что указанное распределение по органам сохраняется до 72 часов. (смотри фиг. 16).To establish the pattern of absorption and distribution in organs of vesicles originating from Sphingomonas paucimobilis over time, the following experiment was carried out. 10 μg of fluorescently labeled vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis were administered orally and fluorescence was measured at 1, 3, 6, 32, 48 and 72 hours, respectively, after administration. As a result of mouse body fluorescence measurements, vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis were shown to be distributed in the
Также было показано, что флуоресцентно меченные везикулы, происходящие из Sphingomonas paucimobilis, по истечении 3 часов после введения перемещаются специфически в головной мозг, и было показано, что степень распределения внеклеточных везикул, которые переместились в головной мозг увеличивалась вплоть до 32, а затем постепенно снижалась вплоть до 72-го часа (смотри фиг. 17).It has also been shown that fluorescently labeled vesicles derived from Sphingomonas paucimobilis migrate specifically to the brain after 3 hours of administration, and it has been shown that the degree of distribution of extracellular vesicles that have migrated to the brain increased up to 32 and then gradually decreased up to the 72nd hour (see Fig. 17).
Приведенное выше описание данного изобретения представлено в иллюстративных целях, и рядовым специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в настоящее изобретение можно с легкостью вносить изменения, получая другие конкретные воплощения, не отклоняясь от технического существа и существенных признаков настоящего изобретения. Таким образом, следует учитывать, что описанные выше примеры являются лишь иллюстрацией изобретения и не ограничивают его объем.The foregoing description of the present invention has been presented for illustrative purposes, and those of ordinary skill in the art should appreciate that the present invention can be readily modified to give other specific embodiments without deviating from the technical spirit and essential features of the present invention. Thus, it should be borne in mind that the examples described above are only illustrative of the invention and do not limit its scope.
Промышленная применимость изобретенияIndustrial applicability of the invention
Показано, что везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas по данному изобретению, in vivo проникают через эпителиальные клетки, распределяются с кровотоком по всему организму и выводятся из него через почки, печень и легкие, и было показано, что содержание этих везикул в крови или моче больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом значительно понижено, и секреция медиаторов воспаления, вызванная патогенными везикулами, может быть значительно подавлена благодаря везикулам, происходящим из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas. Следовательно, можно ожидать, что везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, по данному изобретению имеют высокую промышленную применимость, поскольку могут использоваться в способе диагностирования цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, а также в качестве композиции для предотвращения, ослабления или лечения указанных заболеваний, которая может быть представлена косметическим, пищевым или фармацевтическим продуктом, и еще могут быть эффективно использованы в качестве средства доставки лекарственных веществ в головной мозг.Vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas of the present invention have been shown to penetrate epithelial cells in vivo, are distributed in the bloodstream throughout the body and excreted from it through the kidneys, liver and lungs, and it has been shown that the content of these vesicles in the blood or urine of patients with liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis are significantly reduced, and the secretion of inflammatory mediators caused by pathogenic vesicles can be significantly suppressed by vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas. Therefore, the vesicles derived from bacteria belonging to the genus Sphingomonas of the present invention can be expected to have a high industrial applicability since they can be used in a method for diagnosing liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumors, mild disorders. cognitive functions, dementia, depression, autism and atopic dermatitis, as well as a composition for the prevention, amelioration or treatment of these diseases, which can be presented as a cosmetic, food or pharmaceutical product, and can still be effectively used as a drug delivery vehicle in brain.
Claims (10)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2018-0158623 | 2018-12-10 | ||
| KR10-2019-0132138 | 2019-10-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2771781C1 true RU2771781C1 (en) | 2022-05-12 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2727540C1 (en) * | 2019-11-22 | 2020-07-22 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Application of membrane vesicles of multipotent stromal cells induced by b cytochalasin, for restoration and increase of mitochondrial function |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2727540C1 (en) * | 2019-11-22 | 2020-07-22 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Application of membrane vesicles of multipotent stromal cells induced by b cytochalasin, for restoration and increase of mitochondrial function |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Gyorgy B. et al., Therapeutic applications of extracellular vesicles: clinical promise and open questions, Annual review of pharmacology and toxicology, 2015, Т. 55, С. 439-464. Khan M. A. et al., Liposomal formulation of glycosphingolipids from Sphingomonas paucimobilis induces antitumour immunity in mice, Journal of drug targeting, 2018, Т. 26, No. 8, С. 709-719. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102091514B1 (en) | Nanovesicles derived from Lactobacillus bacteria and Use thereof | |
| US11883440B2 (en) | Nanovesicle derived from Proteus genus bacteria, and use thereof | |
| KR102242196B1 (en) | Nanovesicles derived from Sphingomonas bacteria and Use thereof | |
| US10888591B2 (en) | Nano-vesicles derived from genus Micrococcus bacteria and use thereof | |
| RU2771781C1 (en) | Nanovesicles produced from bacteria of the genus sphingomonas and application thereof | |
| KR102122903B1 (en) | Nanovesicles derived from Blautia bacteria and Use thereof | |
| KR102223406B1 (en) | Nanovesicles derived from Corynebacterium bacteria and Use thereof | |
| KR102124794B1 (en) | Nanovesicles derived from Geobacillus bacteria and Use thereof | |
| KR102284589B1 (en) | Nanovesicles derived from Rhodococcus bacteria and Use thereof | |
| KR102286042B1 (en) | Nanovesicles derived from Deinococcus bacteria and Use thereof | |
| JP7186470B2 (en) | Nanovesicles derived from bacteria of the genus Corynebacterium and uses thereof | |
| KR102118993B1 (en) | Nanovesicles derived from Prevotella bacteria and Use thereof | |
| JP2022517962A (en) | Nanovesicles derived from Rhodococcus bacteria and their uses |