RU2770691C2 - DNA APTAMERS TO HUMAN PrimPol PRIMASE AND DNA POLYMERASE - Google Patents
DNA APTAMERS TO HUMAN PrimPol PRIMASE AND DNA POLYMERASE Download PDFInfo
- Publication number
- RU2770691C2 RU2770691C2 RU2020100476A RU2020100476A RU2770691C2 RU 2770691 C2 RU2770691 C2 RU 2770691C2 RU 2020100476 A RU2020100476 A RU 2020100476A RU 2020100476 A RU2020100476 A RU 2020100476A RU 2770691 C2 RU2770691 C2 RU 2770691C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- primpol
- aptamers
- human
- aptamer
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, а конкретно, к ДНК-аптамерам к праймазе и ДНК-полимеразе PrimPol человека и способу применения ДНК-аптамеров для ингибирования активности PrimPol. ДНК-аптамеры настоящего изобретения могут иметь биологическое и терапевтическое применение. ДНК-аптамеры могут быть использованы в качестве ингибитора PrimPol человека, средства связывания и детекции PrimPol в научных исследованиях, а также ингибирования активности в клетках человека с целью повышения эффективности препаратов химиотерапии.The present invention relates to molecular biology and medicine, and specifically to DNA aptamers to human Primase and DNA polymerase PrimPol and a method of using DNA aptamers to inhibit PrimPol activity. The DNA aptamers of the present invention may have biological and therapeutic applications. DNA aptamers can be used as an inhibitor of human PrimPol, a means of binding and detecting PrimPol in scientific research, as well as inhibition of activity in human cells in order to increase the effectiveness of chemotherapy drugs.
Действие большинства химиотерапевтических препаратов основано на блокировании репликации быстро делящихся опухолевых клеток с помощью повреждения ДНК. Механизмы удаления повреждений ДНК в ходе репарации и механизмы, обеспечивающие толерантность клеток к повреждениям ДНК, снижают терапевтический эффект химиотерапии. К механизмам толерантности к повреждениям ДНК относят транслезионный синтез (или «синтез через поврежденные участки») и механизм реинициации репликации после поврежденного участка с помощью праймазы и ДНК-полимеразы PrimPol.The action of most chemotherapy drugs is based on blocking the replication of rapidly dividing tumor cells using DNA damage. The mechanisms of DNA damage removal during repair and the mechanisms that ensure cell tolerance to DNA damage reduce the therapeutic effect of chemotherapy. The mechanisms of tolerance to DNA damage include translesional synthesis (or "synthesis through damaged areas") and the mechanism of reinitiation of replication after the damaged site using primase and PrimPol DNA polymerase.
В последние годы началась разработка ингибиторов транслезионных ДНК-полимераз человека. К настоящему моменту получены ингибиторы на основе низкомолекулярных соединений для Rev1 [Sail V. et al, ACS Chem Biol 2017, 12:1903-1912] и ДНК-полимеразы эта [Zafar MK. et al. Biochemistry 2018, 57, 1262-1273], и на основе рибозимов и РНК-аптамеров к Rev1 [Dumstorf C.A. et al, Mol. Cancer Res. 2009, 7, 247-254], ДНК-полимеразе бета [Gening L.. et al, Nucleic Acids Res 2006, 34:2579-86] и ДНК-полимеразе йота [Lakhin A.V. et al, Nucleic Acid Ther. 2012, 22: 49-57].In recent years, the development of inhibitors of human translesional DNA polymerases has begun. To date, inhibitors based on small molecular weight compounds for Rev1 [Sail V. et al, ACS Chem Biol 2017, 12:1903-1912] and this DNA polymerase [Zafar MK. et al. Biochemistry 2018, 57, 1262-1273], and based on ribozymes and RNA aptamers to Rev1 [Dumstorf C.A. et al, Mol. Cancer Res. 2009, 7, 247-254], beta DNA polymerase [Gening L.. et al, Nucleic Acids Res 2006, 34:2579-86] and iota DNA polymerase [Lakhin A.V. et al, Nucleic Acid Ther. 2012, 22: 49-57].
Праймаза и ДНК-полимераза PrimPol (“Prim” - primase, “Pol” - polymerase) относится к суперсемейству архео-эукариотических праймаз и была впервые описана в 2013 году. PrimPol участвует как в репликации геномной, так и митохондриальной ДНК. In vitro PrimPol человека осуществлять репликацию на ДНК-матрицах с некоторыми повреждениями [. et al, Mol. Cell 2013, 52:541; Makarova A.V. et. al., DNA Repair 2018, 70:18-24]. В отличие от большинства других известных праймаз, которые синтезируют только РНК-праймеры, уникальной особенностью PrimPol является способность использовать дезоксирибонуклеотидтрифосфаты в реакции синтеза ДНК de novo [. et al, Mol. Cell 2013, 52:541].Primase and DNA polymerase PrimPol (“Prim” - primase, “Pol” - polymerase) belongs to the superfamily of archaeo-eukaryotic primases and was first described in 2013. PrimPol is involved in both genomic and mitochondrial DNA replication. In vitro human PrimPol replicate on DNA templates with some damage [ . et al, Mol. Cell 2013, 52:541; Makarova A. V. et. al., DNA Repair 2018, 70:18-24]. Unlike most other known primases, which synthesize only RNA primers, the unique feature of PrimPol is the ability to use deoxyribonucleotide triphosphates in the de novo DNA synthesis reaction [ . et al, Mol. Cell 2013, 52:541].
PrimPol может запускать остановившуюся репликативную вилку, осуществляя синтез ДНК напротив поврежденного участка, или инициировать синтез ДНК после повреждения de novo. Исследования с использованием вариантов PrimPol, лишенных праймазной активности, показали, что основным механизмом репликации с участием PrimPol является репрайминг после поврежденных участков. PrimPol осуществляет репрайминг при репликации ДНК, содержащей АП-сайты, фотопродукты, G-квадруплексы и цисплатиновые сшивки [Schiavone D et al, Mol. Cell 2016, 61:161; . et al, Struct Mol Biol 2013, 20: 1383-1389; Pilzecker B. et al, Nucleic Acids Res. 2016, 44: 4734-4744; Kobayashi K. et al, Cell Cycle 2016, 15: 1997-2008]. При репликации геномной и митохондриальной ДНК PrimPol необходима также для преодоления блоков репликации, вызванных включением нуклеотидных аналогов, терминирующих синтез ДНК, или резким падением концентрации нуклеотидов в клетке [. et al, Struct Mol Biol 2013, 20: 1383-1389; Kobayashi K. et al, Cell Cycle 2016, 15: 1997-2008; Wan L. et al, EMBO Rep 2013, 14: 1104-1112]. Таким образом, PrimPol выполняет функцию универсального белка, возобновляющего репликацию, остановки которой вызваны широким спектром ДНК-повреждающих агентов (или другими причинами). Ожидается, что ингибирование активности PrimPol позволит сенсибилизировать опухолевые клетки к ДНК-повреждающим агентам и повысит эффективность препаратов химиотерапии.PrimPol can start a stalled replication fork by performing DNA synthesis opposite the damaged site, or initiate DNA synthesis after de novo damage. Studies using PrimPol variants lacking primase activity have shown that the main mechanism of replication involving PrimPol is repriming after damaged sites. PrimPol performs repriming during DNA replication containing AP sites, photoproducts, G-quadruplexes and cisplatin crosslinks [Schiavone D et al, Mol. Cell 2016, 61:161; . et al, Struct Mol Biol 2013, 20: 1383-1389; Pilzecker B. et al, Nucleic Acids Res. 2016, 44: 4734-4744; Kobayashi K. et al, Cell Cycle 2016, 15: 1997-2008]. During the replication of genomic and mitochondrial DNA, PrimPol is also necessary to overcome replication blocks caused by the inclusion of nucleotide analogs that terminate DNA synthesis, or a sharp drop in the concentration of nucleotides in the cell [ . et al, Struct Mol Biol 2013, 20: 1383-1389; Kobayashi K. et al, Cell Cycle 2016, 15: 1997-2008; Wan L. et al, EMBO Rep 2013, 14: 1104-1112]. Thus, PrimPol performs the function of a universal protein that resumes replication, the stops of which are caused by a wide range of DNA-damaging agents (or other reasons). It is expected that inhibition of PrimPol activity will make it possible to sensitize tumor cells to DNA-damaging agents and increase the effectiveness of chemotherapy drugs.
PrimPol является новой мишенью для создания лекарственных средств борьбы с химиотерапевтической резистентностью на основе ингибиторов ДНК-синтетической активности. Одним из новых подходов к разработке ингибиторов ДНК-полимераз является создание аптамеров. В предлагаемом изобретении задача ингибирования PrimPol решается путем применения ДНК-аптамеров. Проведенный патентный поиск не выявил источников информации о применении аптамеров в качестве ингибиторов PrimPol человека, а также информации о получении других ингибиторов PrimPol.PrimPol is a new target for the creation of drugs to combat chemotherapeutic resistance based on inhibitors of DNA synthetic activity. One of the new approaches to the development of DNA polymerase inhibitors is the creation of aptamers. In the present invention, the problem of PrimPol inhibition is solved by using DNA aptamers. The conducted patent search did not reveal sources of information on the use of aptamers as inhibitors of human PrimPol, as well as information on the preparation of other PrimPol inhibitors.
Специфичные взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами лежат в основе многих клеточных биохимических процессов. Большое комбинаторное разнообразие нуклеиновых кислот и их способность формировать самые разные вторичные и третичные структуры делают возможным направленный поиск последовательностей нуклеиновых кислот, которые обладают способностью взаимодействовать с определенными белками. Такие небольшие олигонуклеотидные молекулы нуклеиновых кислот, образующие прочные комплексы с определенными молекулами-мишенями, были названы аптамерами. Аптамеры к белкам часто связываются в функционально важных участках молекулы и являются ингибиторами активности белков-мишеней. Аптамеры могут содержать одноцепочечные, двухцепочечные или трехцепочечные области.Specific interactions between proteins and nucleic acids underlie many cellular biochemical processes. The large combinatorial diversity of nucleic acids and their ability to form a variety of secondary and tertiary structures make it possible to target the search for nucleic acid sequences that have the ability to interact with certain proteins. Such small oligonucleotide nucleic acid molecules that form strong complexes with certain target molecules have been called aptamers. Aptamers to proteins often bind in functionally important regions of the molecule and act as inhibitors of the activity of target proteins. Aptamers may contain single-stranded, double-stranded or triple-stranded regions.
Аптамеры получают методом систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX - «Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment») с помощью селекции из больших библиотек случайных последовательностей (комбинаторные ДНК и РНК-библиотеки), используя их способность специфически связываться с соответствующими иммобилизованными белками-лагандами. В результате нескольких раундов отбора аптамеров к иммобилизованной на аффинной смоле белка-мишени происходит постепенное обогащение библиотеки случайных последовательностей нуклеиновых кислот последовательностями, которые обладают высоким сродством. После идентификации аптамер можно получить или синтезировать по любому известному методу, включая химические методы синтеза и ферментативные методы синтеза.Aptamers are obtained by the method of systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX - "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment") using selection from large libraries of random sequences (combinatorial DNA and RNA libraries), using their ability to specifically bind to the corresponding immobilized ligand proteins. As a result of several rounds of selection of aptamers to the target protein immobilized on the affinity resin, the library of random nucleic acid sequences is gradually enriched with sequences that have a high affinity. Once identified, the aptamer can be prepared or synthesized by any known method, including chemical synthesis methods and enzymatic synthesis methods.
По своей специфичности и высокой аффинности аптамеры, как правило, не уступают антителам, а по ряду показателей обладают преимуществом перед антителами. Аптамеры обладают низкой иммуногенностью и токсичностью, лучшей способностью проникать через биологические мембраны. Аптамеры, специфически распознающие определенные типы рецепторов, могут проникать через гематоэнцефалический барьер [Monaco I. et al, J. Med. Chem. 2017, 60: 4510-4516] и могут служить в качестве средств доставки терапевтических прапаратов. Важным преимуществом является доступность химического или ферментативного синтеза аптамеров в больших количествах и простота химической модификации нуклеиновых кислот.In terms of their specificity and high affinity, aptamers, as a rule, are not inferior to antibodies, and in a number of indicators they have an advantage over antibodies. Aptamers have low immunogenicity and toxicity, better ability to penetrate biological membranes. Aptamers that specifically recognize certain types of receptors can cross the blood-brain barrier [Monaco I. et al, J. Med. Chem. 2017, 60: 4510-4516] and can serve as delivery vehicles for therapeutic drugs. An important advantage is the availability of chemical or enzymatic synthesis of aptamers in large quantities and the ease of chemical modification of nucleic acids.
На основе аптамеров разрабатывается новые препараты для лечения разных заболеваний. Некоторые лекарства на основе РНК- и ДНК-аптамеров находятся на стадии клинических испытаний или поступили на фармацевтический рынок. Аптамеры-ингибиторы были получены к некоторым РНК- и ДНК-полимеразам: РНК-полимеразе вируса гриппа [Yuan S. et. al., Antimicrob. Agents Chemother. 2015, 59:4082-4093], РНК-полимеразе энтеровируса везикулярного стоматита [Forrest S. et. al., J. Gen. Virol. 2014, 95:2649-2657], обратной транскриптазе вируса иммунодефицита человека [Shiang Nanoscale 2013, 5:2756-2764], ДНК-полимеразам бета [Gening L.. et al, Nucleic Acids Res 2006, 34:2579-86] и йота [Lakhin A.V. et al, Nucleic Acid Ther. 2012, 22: 49-57] человека. Основным механизмом ингибирования биохимической активности РНК-полимераз и ДНК-полимераз аптамерами, предположительно, является их связывание с активным центром фермента и конкуренция аптамеров за связывание с дезоксирибонуклеотидтрифосфатами. Константы диссоциации комплексов аптамеров с белками, как правило, лежат в области нано- и пикомолярных значений.Based on aptamers, new drugs are being developed for the treatment of various diseases. Some drugs based on RNA and DNA aptamers are at the stage of clinical trials or entered the pharmaceutical market. Inhibitor aptamers have been obtained for some RNA and DNA polymerases: influenza virus RNA polymerase [Yuan S. et. al., Antimicrob. Agents Chemother. 2015, 59:4082-4093], enterovirus vesicular stomatitis RNA polymerase [Forrest S. et. al., J. Gen. Virol. 2014, 95:2649-2657], human immunodeficiency virus reverse transcriptase [Shiang Nanoscale 2013, 5:2756-2764], DNA polymerase beta [Gening L.. et al, Nucleic Acids Res 2006, 34:2579-86], and iota [Lakhin A.V. et al, Nucleic Acid Ther. 2012, 22: 49-57] of a person. The main mechanism of inhibition of the biochemical activity of RNA polymerases and DNA polymerases by aptamers is presumably their binding to the active site of the enzyme and competition of aptamers for binding to deoxyribonucleotide triphosphates. The dissociation constants of complexes of aptamers with proteins, as a rule, lie in the range of nano- and picomolar values.
При разработке настоящего изобретения в качестве белка-мишени использовали полноразмерную рекомбинантную PrimPol человека с аффинным GST-тагом, иммобилизованную на смоле с глутатион-сефарозой. Индивидуальные аптамеры были отобраны из комбинаторной одноцепочечной ДНК-библиотеки длиной 75 нуклеотидов, содержащей центральный рандомизированный участок, окруженный участками связывания праймеров (GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA и TTCGACATGAGGCCCGGATC), которые необходимы для амплификации библиотеки при проведении отбора. Одноцепочечную библиотеку ДНК инкубировали с PrimPol и не связавшиеся с белком-мишенью олигонуклеотиды смывали с аффинной смолы (перед связыванием с иммобилизованным ферментом смесь аптамеров предварительно инкубировали с пустым сорбентом, чтобы исключить отбор молекул, взаимодействующих с ним). Связанные с белком-мишенью молекулы ДНК элюировали и амплифицировали в ходе ПЦР. Амплифицированная двухцепочечная ДНК была затем использована для получения обогащенной библиотеки однонитевых олигонуклеотидов. Процедура отбора была проведена 12 раз.In the development of the present invention, a full-length recombinant human PrimPol with a GST affinity tag immobilized on a resin with glutathione sepharose was used as a target protein. Individual aptamers were selected from a combinatorial single-stranded DNA library 75 nucleotides long containing a central randomized region surrounded by primer binding sites (GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA and TTCGACATGAGGCCCGGATC), which are necessary for library amplification during selection. A single-stranded DNA library was incubated with PrimPol, and oligonucleotides that did not bind to the target protein were washed off the affinity resin (before binding to the immobilized enzyme, the aptamer mixture was preincubated with an empty sorbent to exclude the selection of molecules interacting with it). DNA molecules bound to the target protein were eluted and amplified during PCR. The amplified double stranded DNA was then used to generate an enriched library of single stranded oligonucleotides. The selection procedure was carried out 12 times.
Настоящее изобретение обеспечивают аптамеры, обладающие способностью специфически связываться с PrimPol и ингибировать ДНК-синтетическую активность фермента. "Специфичность связывания" аптамера к его мишени означает, что аптамер связывается со своей мишенью с намного более высокой степенью аффинности, чем когда он связывается с другими, нецелевыми, компонентами в смеси или образце. Ингибирующая активность против PrimPol человека означает ингибирование любой ДНК-синтетической активности, поскольку для включения нуклеотидов при синтезе динуклеотида de novo (праймазная активность) и продолжении синтеза от 3'-ОН группы (ДНК-полимеразная активность) ферментом используется один и тот же активный центр.The present invention provides aptamers that have the ability to specifically bind to PrimPol and inhibit the DNA-synthetic activity of the enzyme. "Binding specificity" of an aptamer to its target means that the aptamer binds to its target with a much higher degree of affinity than when it binds to other non-target components in the mixture or sample. Inhibitory activity against human PrimPol means inhibition of any DNA-synthetic activity, since the enzyme uses the same active site to turn on nucleotides during de novo dinucleotide synthesis (primase activity) and continuing synthesis from the 3'-OH group (DNA polymerase activity).
ДНК-аптамеры настоящего изобретения содержат центральный район с уникальной нуклеотидной последовательностью и 5'- и 3'-концевые последовательности. Центральная уникальная часть содержит мотив G-квадруплекса, представляющий собой последовательность ДНК с четырмя повторами гуанинов и способную образовывать структуру из четырех цепей, удерживаемую G-G-парными взаимодействиями. Такие структуры отличаются высокой стабильностью в растворе. Между повторами гуанинов находится одноцепочечная область, образующая петлю и, вероятно, участвующая в прямом связывании с PrimPol.The DNA aptamers of the present invention contain a central region with a unique nucleotide sequence and 5'- and 3'-terminal sequences. The central unique part contains the G-quadruplex motif, which is a DNA sequence with four guanine repeats and is capable of forming a four-strand structure held by G-G pair interactions. Such structures are highly stable in solution. Between the guanine repeats, there is a single-stranded region that forms a loop and is probably involved in direct binding to PrimPol.
Длина и состав аптамеров настоящего изобретения не ограничены. Уникальная центральная часть может быть использована как часть большей молекулы ДНК. ДНК-аптамеры могут содержать дополнительные вариативные районы, фланкирующие центральный район, где n представляет собой любое количество нуклеотидов приблизительно от 1 до 10, выбранных из a, c, t, g и не оказывающих неблагоприятного воздействия на свойства аптамера. 5'- и 3'-концевые последовательности могут быть модифицированы. Модификации могут быть направлены на защиту 5'- и 3'-концов от действия экзонуклеаз и включать ненуклеозидные линкеры, инвертированный dT, метиленовую групп между 4' и 2' положениями дезоксирибозы (закрытая ДНК), включать флуоресцентные вещества, радиоактивные изотопы, биотин и пептиды. Изобретение охватывает все модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в настоящее изобретение согласно его формуле.The length and composition of the aptamers of the present invention are not limited. The unique central part can be used as part of a larger DNA molecule. DNA aptamers may contain additional variable regions flanking the central region, where n is any number of nucleotides from about 1 to 10, selected from a, c, t, g, without adversely affecting the properties of the aptamer. The 5' and 3' end sequences can be modified. Modifications can be aimed at protecting the 5'- and 3'-ends from the action of exonucleases and include non-nucleoside linkers, inverted dT, a methylene group between the 4' and 2' positions of deoxyribose (closed DNA), include fluorescent substances, radioactive isotopes, biotin and peptides . The invention covers all modifications and equivalents that may be included in the present invention according to its claims.
Настоящее изобретение и вариант его реализации иллюстрируются приведенными ниже примерами. Доказательством достижимости технического результата в примере служит ингибирование полимеризации ДНК PrimPol in vitro с помощью ДНК-аптамеров.The present invention and a variant of its implementation are illustrated by the following examples. The proof of the feasibility of the technical result in the example is the inhibition of DNA polymerization PrimPol in vitro using DNA aptamers.
Пример 1 демонстрирует ингибирование ДНК-полимеразной активности PrimPol (фигура 1А). Одноцепочечный ДНК-аптамер или исходную библиотеку в концентрации 3 мкМ отжигали в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 30 мМ Хепес рН 7,4, 1 мМ ДТТ, нагреванием до 90°С и охлаждением до 24°С в течение 10 мин. Аптамер и контрольную библиотеку в концентрации 400 нМ или 200 нМ инкубировали с PrimPol человека в концентрации 200 нМ и олигонуклеотидным ДНК-субстратом с матричной ДНК длиной 55 нуклеотидов и 5'-32Р-меченым праймером длиной 22 нуклеотида в концентрации 30 нМ в буфере, содержащем 30 мМ Хепес рН 7,4, 8% глицерин, 10 мМ MgCl2,1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, при 22°С в течение 5 мин. Добавляли смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в концентрации 200 мкМ и инкубировали при 37°С 30 мин. Синтез ДНК останавливали на льду добавлением равного объема смеси формамида с 40 мМ ЭДТА и красителем бромфеноловым синим. 32Р-меченые продукты синтеза ДНК разделяли в денатурирующем 23 % полиакриламидном геле и детектировали с помощью радиографии. Сокращение длины синтезируемых молекул ДНК при инкубировании PrimPol с ДНК-аптамерами PP3 (описывается формулой 1) и PP13, PP16, PP18 (описываются формулой 2), но не библиотекой свидетельствует об падении ДНК-полимеразной активности PrimPol.Example 1 demonstrates the inhibition of the DNA polymerase activity of PrimPol (figure 1A). A single-stranded DNA aptamer or an initial library at a concentration of 3 μM was annealed in a buffer containing 100 mM NaCl, 50 mM KCl, 30 mM Hepes pH 7.4, 1 mM DTT, heated to 90°C and cooled to 24°C for 10 min. The aptamer and control library at 400 nM or 200 nM were incubated with 200 nM human PrimPol and oligonucleotide DNA substrate with a 55 bp template DNA and a 22 bp 5'- 32 P-labeled primer at 30 nM in buffer containing 30 mM Hepes pH 7.4, 8% glycerol, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA, at 22°C for 5 min. A mixture of deoxyribonucleotide triphosphates was added at a concentration of 200 μM and incubated at 37°C for 30 min. DNA synthesis was stopped on ice by adding an equal volume of a mixture of formamide with 40 mM EDTA and bromophenol blue dye. 32 P-labeled DNA synthesis products were separated in a denaturing 23% polyacrylamide gel and detected by radiography. The reduction in the length of synthesized DNA molecules upon incubation of PrimPol with DNA aptamers PP3 (described by formula 1) and PP13, PP16, PP18 (described by formula 2), but not by the library, indicates a decrease in PrimPol DNA polymerase activity.
Пример 2 демонстрирует ингибирование праймазной активности PrimPol (фигура 1Б). Одноцепочечный ДНК-аптамер или исходную библиотеку в концентрации 3 мкМ отжигали в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 30 мМ Хепес рН 7,4, 1 мМ ДТТ, нагреванием до 90°С и охлаждением до 24°С в течение 10 мин. Аптамер и контрольную библиотеку в концентрации 400 нМ инкубировали с PrimPol человека в концентрации 200 нМ и олигонуклеотидным ДНК-субстратом с матричной ДНК длиной 55 нуклеотидов в концентрации 30 нМ в буфере, содержащем 30 мМ Хепес рН 7,4, 8% глицерин, 10 мМ MgCl2,1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, при 22°С в течение 5 мин. Добавляли смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в концентрации 200 мкМ, немеченый АТФ в концентрации 10 мкМ и [γ-32]Р-меченый АТФ в концентрации 20 нМ. Реакции инкубировали при 37°С 30 мин. Синтез ДНК останавливали на льду добавлением равного объема смеси формамида с 40 мМ ЭДТА и красителем бромфеноловым синим. 32Р-меченые продукты синтеза ДНК разделяли в денатурирующем 30 % полиакриламидном геле и детектировали с помощью радиографии. Падение количества синтезируемых ди-, три- и тетрануклеотидов и полноразмерных продуктов синтеза ДНК при инкубировании PrimPol с ДНК-аптамерами PP3 (описывается формулой 1) и PP13, PP16, PP18 (описываются формулой 2), но не библиотекой свидетельствует об падении праймазной активности PrimPol. Примеры 1 и 2 позволяют сделать вывод об ингибировании ДНК-синтетической способности PrimPol.Example 2 demonstrates the inhibition of primase activity of PrimPol (figure 1B). A single-stranded DNA aptamer or an initial library at a concentration of 3 μM was annealed in a buffer containing 100 mM NaCl, 50 mM KCl, 30 mM Hepes pH 7.4, 1 mM DTT, heated to 90°C and cooled to 24°C for 10 min. The 400 nM aptamer and control library were incubated with 200 nM human PrimPol and 30 nM oligonucleotide DNA substrate with 55 bp template DNA in buffer containing 30 mM Hepes pH 7.4, 8% glycerol, 10 mM MgCl 2.1 mM DTT, 100 µg/ml BSA, at 22°C for 5 min. A mixture of deoxyribonucleotide triphosphates at a concentration of 200 μM, unlabeled ATP at a concentration of 10 μM, and [γ-32] P-labeled ATP at a concentration of 20 nM were added. Reactions were incubated at 37°С for 30 min. DNA synthesis was stopped on ice by adding an equal volume of a mixture of formamide with 40 mM EDTA and bromophenol blue dye. 32 P-labeled products of DNA synthesis were separated in a denaturing 30% polyacrylamide gel and detected by radiography. A decrease in the amount of synthesized di-, tri-, and tetranucleotides and full-length DNA synthesis products upon incubation of PrimPol with DNA aptamers PP3 (described by formula 1) and PP13, PP16, PP18 (described by formula 2), but not by the library, indicates a decrease in PrimPol primase activity. Examples 1 and 2 lead to the conclusion about the inhibition of the DNA-synthetic ability of PrimPol.
Приведенные примеры не ограничивает других возможных вариантов реализации настоящего изобретения. Аптамеры настоящего изобретения могут обладать ингибиторными активностями и против молекул PrimPol, полученных из других видов млекопитающих. ДНК-аптамеры могут служить средством для связывания и детекции PrimPol человека. ДНК-аптамер может использоваться для создания аффинного хроматографического сорбента и очистки PrimPol с помощью данного сорбента. ДНК-аптамер может служить реактивом для детекции и оценки количества PrimPol в биологических образцах. Cпособность аптамера связываться с белком-мишенью с высокой специфичностью и высокой аффинностью может облегчить детекцию белка-мишени в исследуемом образце, позволяя определить отсутствие, присутствие и концентрацию молекул PrimPol. Таким образцом может быть любой материал, полученный от организма, в том числе культуры клеток, клеточные экстракты культур клеток и тканей, срезы тканей. Мечение ДНК-атамеров флуоресцентыми красителями или радиоактивными изотопами позволит повысить чувствительность способа детекции и/или сократить время анализа.The examples given do not limit other possible embodiments of the present invention. The aptamers of the present invention may also have inhibitory activities against PrimPol molecules derived from other mammalian species. DNA aptamers can serve as a means for binding and detecting human PrimPol. The DNA aptamer can be used to create an affinity chromatographic sorbent and purify PrimPol using this sorbent. The DNA aptamer can serve as a reagent for detecting and assessing the amount of PrimPol in biological samples. The ability of the aptamer to bind to the target protein with high specificity and high affinity can facilitate the detection of the target protein in the test sample, making it possible to determine the absence, presence and concentration of PrimPol molecules. Such a sample can be any material obtained from the body, including cell cultures, cell extracts of cell and tissue cultures, tissue sections. Labeling DNA atamers with fluorescent dyes or radioactive isotopes will increase the sensitivity of the detection method and/or reduce the analysis time.
Стабилизированные ДНК-аптамеры со сходной нуклеотидной последовательностью и структурными мотивами центрального района могут быть использованы для ингибирования активности PrimPol в клетках человека с целью повышения эффективности препаратов химиотерапии. Доставка ДНК-аптамера в клетки может быть осуществлена с помощью известных методик трансфекции и доставки нуклеиновых кислот или с помощью слияния с аптамером, который служит средством доставки (химера из двух аптамеров).Stabilized DNA aptamers with a similar nucleotide sequence and structural motifs of the central region can be used to inhibit the activity of PrimPol in human cells in order to increase the effectiveness of chemotherapy drugs. Delivery of the DNA aptamer into cells can be accomplished using known transfection and nucleic acid delivery techniques, or by fusion with the aptamer that serves as the delivery vehicle (a chimera of two aptamers).
Фигура 1 показывает ингибирование ДНК-полимеразной (1А) и праймазной (1Б) активностей PrimPol человека ДНК-аптамерами in vitro. (1А). К 0,2 мкМ PrimPol добавляли 0,2 или 0,4 мкМ аптамера РР3 (описан формулой 1, дорожки 2,3), или одного из аптамеров PP13, PP16, PP18 (описываются формулой 2, дорожки 10-15), или одного из аптамеров РР6, РР8, РР10 (описываются формулами, отличными от формул 1 и 2 настоящего изобретения, дорожки 4-9). В качестве контролей добавляли исходную библиотеку (N, дорожки 18,19) или не добавляли ни ДНК-аптамеры, ни библиотеку (дорожка 1). (1Б). К 0,2 мкМ PrimPol добавляли 0,4 мкМ аптамера РР3 (описан формулой 1, дорожка 22), или одного из аптамеров PP13, PP16, PP18 (описываются формулой 2, дорожки 23-25). В качестве контролей добавляли исходную библиотеку (N, дорожка 26), не добавляли ни ДНК-аптамеры, ни библиотеку (дорожка 2) или не добавляли PrimPol (дорожка 1).Figure 1 shows the inhibition of DNA polymerase (1A) and primase (1B) activities of human PrimPol by DNA aptamers in vitro. (1A). To 0.2 μM PrimPol was added 0.2 or 0.4 μM of the PP3 aptamer (described by
--->--->
Нуклеотидные последовательностиNucleotide sequences
<110> Institute of Molecular Genetics of Russian Academy of Sciences<110> Institute of Molecular Genetics of Russian Academy of Sciences
<120> DNA aptamers to human primase and DNA polymerase PrimPol <120> DNA aptamers to human primase and DNA polymerase PrimPol
and method for inhibiting its activity and method for inhibiting its activity
<160> 2<160> 2
<210> 1<210> 1
<211> 77<211> 77
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence
<220> <220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> 24<222> 24
<223> Designed DNA aptamer to human PrimPol<223> Designed DNA aptamer to human PrimPol
<400> 1 <400> 1
gggagctcag aataaacgct caanctggtt tggtgagaga ggttgggttg agagtanttc 60gggagctcag aataaacgct caanctggtt tggtgagaga ggttgggttg agagtanttc 60
gacatgaggc ccggatc 77gacatgaggc ccggatc 77
<210> 2<210> 2
<211> 68<211> 68
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence
<220> <220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> 24<222> 24
<223> Designed DNA aptamer to human PrimPol<223> Designed DNA aptamer to human PrimPol
<400> 1<400> 1
gggagctcag aataaacgct caanctggtt ggtgcacgga ggatgggntt cgacatgagg 60gggagctcag aataaacgct caanctggtt ggtgcacggga ggatgggntt cgacatgagg 60
cccggatc 68ccggatc 68
<---<---
Claims (8)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020100476A RU2770691C2 (en) | 2020-01-13 | 2020-01-13 | DNA APTAMERS TO HUMAN PrimPol PRIMASE AND DNA POLYMERASE |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020100476A RU2770691C2 (en) | 2020-01-13 | 2020-01-13 | DNA APTAMERS TO HUMAN PrimPol PRIMASE AND DNA POLYMERASE |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020100476A RU2020100476A (en) | 2021-07-13 |
RU2020100476A3 RU2020100476A3 (en) | 2021-07-13 |
RU2770691C2 true RU2770691C2 (en) | 2022-04-21 |
Family
ID=77018931
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020100476A RU2770691C2 (en) | 2020-01-13 | 2020-01-13 | DNA APTAMERS TO HUMAN PrimPol PRIMASE AND DNA POLYMERASE |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2770691C2 (en) |
-
2020
- 2020-01-13 RU RU2020100476A patent/RU2770691C2/en not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
GARCIA-GOMEZ S. ET AL. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Mol Cell. 2013 Nov 21;52(4):541-53. YOSHIMURA A. ET AL. WRNIP1 Controls the Amount of PrimPol. Biol Pharm Bull. 2019;42(5):764-769. * |
GENING L.V. ET AL. RNA aptamers selected against DNA polymerase β inhibit the polymerase activities of DNA polymerases β and κ, Nucleic Acids Research, Volume 34, Issue 9, 1 May 2006, Pages 2579-2586. * |
LAKHIN A.V. ET AL. Isolation and characterization of high affinity aptamers against DNA polymerase iota. Nucleic Acid Ther. 2012 Feb;22(1):49-57. * |
LAKHIN A.V. ET AL. Isolation and characterization of high affinity aptamers against DNA polymerase iota. Nucleic Acid Ther. 2012 Feb;22(1):49-57. GENING L.V. ET AL. RNA aptamers selected against DNA polymerase β inhibit the polymerase activities of DNA polymerases β and κ, Nucleic Acids Research, Volume 34, Issue 9, 1 May 2006, Pages 2579-2586. GARCIA-GOMEZ S. ET AL. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Mol Cell. 2013 Nov 21;52(4):541-53. YOSHIMURA A. ET AL. WRNIP1 Controls the Amount of PrimPol. Biol Pharm Bull. 2019;42(5):764-769. ЛАХИН А.В. И ДР. Аптамеры: проблемы, пути их решения и перспективы. Acta Naturae (русскоязычная версия), 2013, Т. 5, N 4 (19), С. 36-48. * |
ЛАХИН А.В. И ДР. Аптамеры: проблемы, пути их решения и перспективы. Acta Naturae (русскоязычная версия), 2013, Т. 5, N 4 (19), С. 36-48. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2020100476A (en) | 2021-07-13 |
RU2020100476A3 (en) | 2021-07-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3529135B2 (en) | How to cut a specific RNA strand | |
AU743469B2 (en) | Mirror-symmetrical selection and evolution of nucleic acids | |
JP5926242B2 (en) | Endoribonuclease composition and method of use thereof | |
ES2447419T3 (en) | Compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences | |
US7179894B2 (en) | Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers | |
Waters et al. | Transfer RNA in RNA tumor viruses | |
Kadonaga et al. | Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. | |
ES2629615T3 (en) | Modified L-Nucleic Acid | |
Kaplan et al. | In vitro synthesis of infectious poliovirus RNA. | |
Sentenac et al. | Initiation of chains by RNA polymerase and the effects of inhibitors studied by a direct filtration technique | |
JPH03505971A (en) | Methods for amplifying and detecting nucleic acid sequences | |
Burmeister et al. | 2-Deoxy purine, 2-O-methyl pyrimidine (dRmY) aptamers as candidate therapeutics | |
JP2005536193A (en) | Method for concentrating small amounts of polynucleotides | |
Kwon et al. | In vitro selection of RNA against kanamycin B | |
CN107760686B (en) | Aptamer of DKK-1 protein and application thereof | |
Mikami et al. | Synthesis, chirality-dependent conformational and biological properties of siRNAs containing 5′-(R)-and 5′-(S)-C-methyl-guanosine | |
Khan et al. | Aminoacylation of synthetic DNAs corresponding to Escherichia coli phenylalanine and lysine tRNAs | |
Frieden et al. | Tightening the belt on polymerases: evaluating the physical constraints on enzyme substrate size | |
RU2770691C2 (en) | DNA APTAMERS TO HUMAN PrimPol PRIMASE AND DNA POLYMERASE | |
Myers et al. | Mechanism of stimulation of T7 DNA polymerase by Escherichia coli single-stranded DNA binding protein (SSB). | |
RU2737285C1 (en) | Dna-aptamers to human dna eta polymerase | |
Makeyev et al. | Primer-independent RNA sequencing with bacteriophage phi6 RNA polymerase and chain terminators. | |
EP1026243B1 (en) | NUCLEIC ACID CAPABLE OF BINDING SPECIFICALLY TO Ras TARGET PROTEIN | |
Anthony et al. | In vitro synthesis of long DNA products in reactions with HIV-RT and nucleocapsid protein | |
KR20210090010A (en) | An L-DNA-binding natural protein and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20211115 |
|
FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20220203 |