RU2770481C1 - Method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria bacillus subtilis mg-8 vkpm b-12476 and its use as a prophylactic against diseases of poultry - Google Patents

Method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria bacillus subtilis mg-8 vkpm b-12476 and its use as a prophylactic against diseases of poultry Download PDF

Info

Publication number
RU2770481C1
RU2770481C1 RU2021118611A RU2021118611A RU2770481C1 RU 2770481 C1 RU2770481 C1 RU 2770481C1 RU 2021118611 A RU2021118611 A RU 2021118611A RU 2021118611 A RU2021118611 A RU 2021118611A RU 2770481 C1 RU2770481 C1 RU 2770481C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lipopeptides
vkpm
subtilis
strain
bacteria
Prior art date
Application number
RU2021118611A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Гузель Фанисовна Лутфуллина
Original Assignee
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (ФГАОУ ВО КФУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (ФГАОУ ВО КФУ) filed Critical федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (ФГАОУ ВО КФУ)
Priority to RU2021118611A priority Critical patent/RU2770481C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2770481C1 publication Critical patent/RU2770481C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: present invention relates to the field of biotechnology. The essence is a method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 RNCIM B-12476, which consists in taking mannitol 26.2 g/l, soy flour 21.9 g/l, NaNO3 3.1 g/l, MnSO4 x 4H2O 0.2 g/l at pH 7.5, autoclaved at 121°C and 1 atm, while creating a nutrient medium; next, the culture of B. subtilis MG-8 RNCIM B-12476 is seeded on the nutrient medium, with a 2% concentration of strain cells in the nutrient medium; next, strain cells are cultured in a thermostat-shaker at a temperature from + 37°C to + 42°C and a swing intensity of 200 rpm for 96 hours, the biomass of cells of the strain-producer of bacteria B. subtilis MG-8 RNCIM B-12476 is obtained; then the cells of the strain B. subtilis MG-8 RNCIM B-12476 are removed from the obtained cell biomass, a cell-free culture fluid is obtained; then the target product of lipopeptides is isolated from the cell-free culture fluid by acid deposition; next, drying and sterilization of the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 RNCIM B-12476 is performed; then the packaging of the target product and storage of the resulting dry fraction of lipopeptides are performed before its intended use. A method for using the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 RNCIM B-12476 according to point 1 as a prophylactic against diseases of farm birds, consisting in the fact that the dried total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 RNCIM B-12476 is introduced into a complete compound feed in an amount of 10 to 50 mg per 1 kg feed, depending on the age of farm birds during the fattening period, is mixed, and birds are fed.
EFFECT: invention can be used in biotechnologies for the production of biological products for use in agriculture for the prevention of bird diseases, which is especially important when birds are kept crowded at poultry farms.
2 cl, 6 ex, 3 dwg

Description

Предлагаемое изобретение относится к разделу органической химии, к пептидам, обладающим антимикробной активностью. Может быть использовано в биотехнологиях производства биопрепаратов для применения в сельском хозяйстве для профилактики заболевания птиц, что особенно актуально при скученном содержании птиц в условиях птицефабрик.The present invention relates to the section of organic chemistry, to peptides with antimicrobial activity. It can be used in biotechnologies for the production of biological products for use in agriculture for the prevention of bird diseases, which is especially important when birds are crowded in poultry farms.

Бактерии рода Bacillus являются продуцентами 66 различных антимикробных пептидов (АМП), некоторые из которых были выделены, очищены и нашли широкое применение в промышленности. Высокую антагонистическую активность Bacillus в отношении различных патогенов связывают со способностью синтезировать широкий спектр нерибосомальных АМП, таких как липопептиды сурфактин, итурин, фенгицин, полимиксин, курстакин, активность которых опосредуется разрушением бактериальных мембран, что при длительном временном интервале приводит к развитию резистентности к липопептидам сходным по действию с действием традиционых антибиотиков [N. Larsen, L. Thorsen, E. N. Kpikpi, et al., Appl. Microb. and Biotech. 98 (2014)]. Известно [N.V. Feoktistova, A.M. Mardanova, G.F. Hadieva, M.R. Sharipova, Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 159 (2017)], например, таких как липопептиды семейств фенгицина, сурфактина и итурина проявляют антимикробную активность в отношении патогенных, условно-патогенных и фитопатогенных бактерий и микромицетов, а также перспективны как биологические поверхностно-активные вещества. При этом недостаточно изучено влияние антимикробных липопептидов на животных моделях.Bacteria of the genus Bacillus are producers of 66 different antimicrobial peptides (AMPs), some of which have been isolated, purified and widely used in industry. The high antagonistic activity of Bacillus against various pathogens is associated with the ability to synthesize a wide range of nonribosomal AMPs, such as lipopeptides surfactin, iturin, fengycin, polymyxin, kurstakin, whose activity is mediated by the destruction of bacterial membranes, which, over a long time interval, leads to the development of resistance to lipopeptides similar in action with the action of traditional antibiotics [N. Larsen, L. Thorsen, EN Kpikpi, et al., Appl. Microb. and Biotech. 98 (2014)]. Known [NV Feoktistova, AM Mardanova, GF Hadieva, MR Sharipova, Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 159 (2017)], for example, such as lipopeptides of the fengycin, surfactin and iturin families exhibit antimicrobial activity against pathogenic, opportunistic and phytopathogenic bacteria and micromycetes, and are also promising as biological surfactants. At the same time, the effect of antimicrobial lipopeptides in animal models has not been sufficiently studied.

Далее заявителем приведены термины и определения, использованные в заявочных материалах.Further, the applicant gives the terms and definitions used in the application materials.

Антагонистическая активность бактерий определяет выживание микроорганизмов при их взаимодействии в бактериальных ассоциациях, которые являются частью ассоциативного симбиоза - многокомпонентной системы, где, кроме хозяина и доминантного микросимбионта, участвуют ассоциативные симбионты, выполняющие функцию формирования и обеспечении стабильности и продуктивности симбиоза [О.В. Бухарин и др. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург: УрО РАН, (2007), 264 с.]. The antagonistic activity of bacteria determines the survival of microorganisms during their interaction in bacterial associations, which are part of an associative symbiosis - a multicomponent system where, in addition to the host and the dominant microsymbiont, associative symbionts participate, performing the function of forming and ensuring the stability and productivity of the symbiosis [O.V. Bukharin and others. Associative symbiosis. Ekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, (2007), 264 p.].

Антагонизм микроорганизмов - тип несимбиотических взаимоотношений микроорганизмов, при котором один штамм полностью подавляет или замедляет рост другого [Антагонизм // Биологический энциклопедический словарь / глав. ред. М.С. Гиляров. - М.: Советская энциклопедия, (1986) - С. 28]. Antagonism of microorganisms is a type of non-symbiotic relationship between microorganisms, in which one strain completely suppresses or slows down the growth of another [Antagonism // Biological Encyclopedic Dictionary / chapters. ed. M.S. Gilyarov. - M.: Soviet Encyclopedia, (1986) - S. 28].

Диаметр зоны задержки (торможения) роста микроорганизма [см] - учитывают по полному подавлению роста микроорганизмов определяемому визуально. Диаметр зоны измеряют с точностью до 1 мм при помощи линейки [О.В. Носкова. Методическая разработка составлена на основании рабочей программы по учебной дисцыплине «Основы микробиологии иммунологии». Читинский медицинский колледж. Чита (2018)]. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к исследуемому липопептиду [В.В. Лысак, Р.А. Желдакова. Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям и контроль самостоятельной работы студентов / Авт. - сост. В.В. Лысак, Р.А. Желдакова. - Мн.: БГУ, (2002). - 100 с.]. The diameter of the zone of delay (inhibition) of the growth of a microorganism [cm] - is taken into account by the complete suppression of the growth of microorganisms, determined visually. The zone diameter is measured with an accuracy of 1 mm using a ruler [O.V. Noskov. The methodological development was compiled on the basis of the work program for the academic discipline "Fundamentals of Microbiology and Immunology". Chita Medical College. Chita (2018)]. The diameter of the zone of growth inhibition corresponds to the degree of sensitivity of the studied microorganism to the studied lipopeptide [V.V. Lysak, R.A. Zheldakov. Microbiology: guidelines for laboratory studies and control of students' independent work / Ed. - comp. V.V. Lysak, R.A. Zheldakov. - Minsk: BGU, (2002). - 100 s.].

Коэффициент конверсии корма - отношение количества затраченного корма к единице полученной продукции (например, к 1 кг привеса, 1 л молока и т.д.). Таким образом, чем больше коэффициент конверсии, тем больше корма необходимо затратить на производство животноводческой продукции. Более низкий коэффициент конверсии свидетельствует о высоком качестве используемых кормов. Коэффициент конверсии кормов зависит от двух основных физиологических процессов в организме животных: усвояемости питательных веществ и их переваримости. Эти процессы находятся под влиянием ряда факторов, которые объединены в 2 группы. Первая обусловлена факторами, связанными с кормом: структура рациона и свойства кормов (полноценность рациона, набор кормов, их качество, использование балансирующих добавок и др.), ко второй же относят особенности пищеварения животных [https://fermer.ru/forum/574/konversiya-korma-297708]. Feed conversion ratio - the ratio of the amount of feed consumed to a unit of product received (for example, to 1 kg of weight gain, 1 liter of milk, etc.). Thus, the higher the conversion rate, the more feed must be spent on the production of livestock products. A lower conversion rate indicates the high quality of the feed used. The feed conversion rate depends on two main physiological processes in the animal body: the digestibility of nutrients and their digestibility. These processes are influenced by a number of factors, which are grouped into 2 groups. The first is due to factors related to the feed: the structure of the diet and the properties of the feed (the value of the diet, the set of feeds, their quality, the use of balancing additives, etc.), while the second includes the features of animal digestion [https://fermer.ru/forum/574 /konversiya-korma-297708].

Липопептид - молекула липида, ковалентно связанного с пептидом, бактериальный липопротеин. Бактерии синтезируют большое количество липопептидов, некоторые из которых являются естественными антибиотиками [https://ru.wikipedia.org/wiki/Липопептиды]. Lipopeptide - a lipid molecule covalently linked to a peptide, a bacterial lipoprotein. Bacteria synthesize a large number of lipopeptides, some of which are natural antibiotics [https://ru.wikipedia.org/wiki/Lipopeptides].

Из исследованного уровня техники заявителем выявлены аналоги предполагаемого изобретения. При описании аналогов использована терминология их (аналогов) описаний. From the studied prior art, the applicant identified analogues of the proposed invention. When describing analogues, the terminology of their (analogues) descriptions is used.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлена группа изобретений по патенту RU 2553547 «Штамм Bacillus subtilis, вырабатывающий пептид с противомикробной активностью, и способ ингибирования нежелательных микроорганизмов в материале с использованием штамма». Сущностью известного технического решения является Штамм Bacillus subtilis Maseca-1, вырабатывающий пептид, имеющий противомикробную активность против Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus, депонированный в Американской Коллекции Типовых Культур (далее по тексту - АТСС) под номером РТА-8831. При этом следует акцентировать внимание на том, что штамм Bacillus subtilis Maseca-1, вырабатывающий пептид, имеет противомикробную активность против Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus. From the studied prior art, the applicant identified a group of inventions according to patent RU 2553547 " Bacillus subtilis strain producing a peptide with antimicrobial activity, and a method for inhibiting unwanted microorganisms in a material using a strain." The essence of the known technical solution is the Bacillus subtilis Maseca-1 strain, which produces a peptide having antimicrobial activity against Micrococcus luteus , Bacillus cereus and Aspergillus flavus , deposited in the American Type Culture Collection (hereinafter referred to as ATCC) under the number PTA-8831. At the same time, it should be emphasized that the strain of Bacillus subtilis Maseca-1, which produces the peptide, has antimicrobial activity against Micrococcus luteus, Bacillus cereus and Aspergillus flavus .

Штамм Bacillus subtilis Maseca-1 был депонирован в международном депозитории, в условиях, которые гарантируют, что доступ к культуре был доступен в ходе рассмотрения данной патентной заявки кому-либо, определенному Комиссаром по Патентам и Торговым Знакам, уполномоченным для этой цели согласно 37 C.F.R. 1.14 и 35 U.S.C. 122. Штамм Bacillus Maseca-1, раскрытый в данном описании, был депонирован в АТСС, 10801 University Blvd., Манассас, Виргиния, 20110 США, как РТА-8831. Депозит был получен АТСС 12 декабря 2007 года и ему Международным Депозитарным Органом был присвоен учетный номер РТА-8831. The strain of Bacillus subtilis Maseca-1 has been deposited with an international depository, under conditions which ensure that access to the culture is available during the course of this patent application to someone designated by the Commissioner for Patents and Trademarks authorized for that purpose under 37 CFR 1.14 and 35 USC 122. The Bacillus Maseca-1 strain disclosed herein has been deposited with ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110 USA as PTA-8831. The deposit was received by ATCC on December 12, 2007 and was assigned the account number PTA-8831 by the International Depository Authority.

Bacillus subtilis Maseca-1 представлен в форме вегетативных клеток, спор или их комбинацией и раскрыт способ ингибирования нежелательных микроорганизмов Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus в материале, содержащем или подвергнутом действию микроорганизмов, который включает воздействие на не идентифицированный в описании по изобретению материал эффективного количества штамма Bacillus subtilis Maseca-1, который является испеченным пищевым продуктом. Bacillus subtilis Maseca-1 is presented in the form of vegetative cells, spores, or a combination thereof, and disclosed is a method for inhibiting undesirable microorganisms Micrococcus luteus, Bacillus cereus and Aspergillus flavus in a material containing or exposed to microorganisms, which includes exposing a material not identified in the description of the invention to an effective the amount of Bacillus subtilis Maseca-1 strain, which is a baked food product.

Недостатком известного технического решения является отсутствие антибактериальной активности продуцируемых штаммом Bacillus subtilis Maseca-1 пептидов в отношении вредоносных условно-патогенных грамположительных бактерий Sarcina sp., Enterococcus faecalis, Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Streptococcus agalactiae. Кроме того, продуцируемые штаммом Bacillus subtilis Maseca-1 пептиды не применимы против вредоносных условно-патогенных грамотрицательных бактерий Serratia marcescens, Enterobacter ludwigii и микромицетов Fusarium sp. и Alternaria sp., вызывающих болезни животных и птиц, например - некротический энтерит птиц. Таким образом, приведенные недостатки существенно ограничивают область применения технического решения по патенту RU 2553547 в области сельского хозяйства, в частности - в птицеводстве.The disadvantage of the known technical solution islack of antibacterial activity produced by the strainBacillus subtilis Maseca-1 peptides against harmful opportunistic pathogensgram-positivebacteriaSarcinasp., Enterococcus faecalis, Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Streptococcus agalactiae.Besides, produced by the strainBacillus subtilisMaseca-1 peptides are not applicable against harmful opportunisticGram-negative bacteriaSerratia marcescens, Enterobacter ludwigiiand micromycetesFusarium sp. andAlternaria sp., causing diseases of animals and birds, for example - necrotizing enteritis of birds. Thus, these shortcomings significantly limit the scope of the technical solution according to patent RU 2553547 in the field of agriculture, in particular in poultry farming.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлена группа изобретений по патенту RU 2117672 «Липопептиды, способ получения, лекарственное средство и штамм Actinoplanes sp. DSM 7358 в качестве продуцента липопептидов». Сущностью известного технического решения является липопептиды общей формулы From the studied prior art, the applicant identified a group of inventions according to patent RU 2117672 “Lipopeptides, production method, drug and strain of Actinoplanes sp. DSM 7358 as a producer of lipopeptides". The essence of the known technical solution is lipopeptides of the general formula

Figure 00000001
разновидности которого различаются длиной цепи атомов углерода, а способ получения липопептидов заключается в том, что культивируют продуцента Actinoplanes sp. DSM 7358 в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные вещества в аэробных условиях с последующим выделением по методу кислотного осаждения целевого продукта и его очисткой по различным технологиям: хроматографией на ионообменных смолах, или хроматографией на гидрофобной матрице. Выделенный целевой продукт отличается антибиотической активностью против устойчивых к гликопептидам грамположительных бактерий.
Figure 00000001
varieties of which differ in the length of the chain of carbon atoms, and the method of obtaining lipopeptides is that the producer is cultivated Actinoplanes sp. DSM 7358 in a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and minerals under aerobic conditions, followed by isolation of the target product by acid precipitation and its purification using various technologies: chromatography on ion-exchange resins, or chromatography on a hydrophobic matrix. The isolated target product is characterized by antibiotic activity against glycopeptide-resistant Gram -positive bacteria.

Недостатком известного технического решения является узкий спектр действия, а именно - отсутствие антибактериальной активности продуцируемых Actinoplanes sp. DSM 7358 липопептидов в отношении условно-патогенных грамотрицательных бактерий, вызывающих болезни животных, например - диарею, иные кишечные инфекции.The disadvantage of the known technical solution is a narrow spectrum of action, namely, the lack of antibacterial activity produced by Actinoplanes sp. DSM 7358 lipopeptides against opportunistic gram -negative bacteria that cause animal diseases, such as diarrhea and other intestinal infections.

Недостатки известного технического решения существенно ограничивают область применения известного технического решения по патенту RU 2117672 в области сельского хозяйства, в частности - в птицеводстве.The disadvantages of the known technical solution significantly limit the scope of the known technical solution according to patent RU 2117672 in the field of agriculture, in particular in poultry farming.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлены изобретения по патенту RU 2663720 «Пробиотик на основе штамма бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 и способ применения пробиотика для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птиц».From the studied level of technology, the applicant identified inventions according to patent RU 2663720 "Probiotic based on the bacterial strain Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 and a method of using a probiotic for the prevention of gastrointestinal diseases in farm animals and birds."

Сущностью известного технического решения является пробиотик на основе бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12476, устойчивый к антибиотикам и обладающий широким спектром антагонистического воздействия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, микромицетов. Способ применения пробиотика для животных заключается в получении биомассы, содержащей бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 и продукты их метаболизма, смешивании биомассы с полнорационным комбикормом в соотношении 1,0±0,3 л культуральной жидкости на 100 кг комбикорма, скармливании этого комбикорма в количестве 0,1-1,0% от живой массы животного в течение 7-10 сут с последующим перерывом в 15-25 сут и ежемесячным повторением этого курса профилактики в течение всего периода содержания животных, способ применения пробиотика для сельскохозяйственных птиц заключается в получении биомассы, содержащей бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 и продукты их метаболизма, смешивании биомассы с полнорационным комбикормом в соотношении 1,0±0,5 л культуральной жидкости на 100 кг комбикорма, скармливании этого комбикорма в количестве 1,0-2,0% от живой массы птицы в течение всего периода содержания птицы.The essence of the known technical solution is a probiotic based on a bacterium of the genus Bacillus of the species Bacillus subtilis strain MG-8 VKPM B-12476, deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms under the number VKPM B-12476, resistant to antibiotics and having a wide range of antagonistic effects against pathogenic and conditionally -pathogenic bacteria, micromycetes. The method of using the probiotic for animals consists in obtaining a biomass containing bacteria of the genus Bacillus of the species Bacillus subtilis of the strain MG-8 VKPM B-12476 and their metabolic products, mixing the biomass with a complete feed in the ratio of 1.0 ± 0.3 l of culture fluid per 100 kg compound feed, feeding this compound feed in an amount of 0.1-1.0% of the live weight of the animal for 7-10 days, followed by a break of 15-25 days and a monthly repetition of this course of prevention throughout the entire period of keeping animals, the method of using a probiotic for poultry is to obtain biomass containing bacteria of the genus Bacillus species Bacillus subtilis strain MG-8 VKPM B-12476 and products of their metabolism, mixing biomass with complete feed in the ratio of 1.0 ± 0.5 l of culture fluid per 100 kg of feed, feeding this compound feed in the amount of 1.0-2.0% of the live weight of the bird during the entire period of keeping the bird.

Недостатком известного технического решения является кратковременность срока хранения пробиотика на основе живой культуры бактерии рода Bacillus вида B. subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 и сложность соблюдения условий хранения, а именно - потребность применения холодильников и соблюдения стабильной температуры хранения, кратковременность сохранения эффективности пробиотика после вскрытия упаковки. Недостаток известного технического решения существенно ограничивает область применения пробиотика по патенту RU 2663720 на основе живой культуры в сельском хозяйстве, в частности - в птицеводстве.The disadvantage of the known technical solution is the short shelf life of the probiotic based on a live culture of bacteria of the genusbacillus kindB. subtilis strain MG-8 VKPM B-12476 and the difficulty of observing storage conditions, namely, the need to use refrigerators and maintain a stable storage temperature, the short duration of maintaining the effectiveness of the probiotic after opening the package. The disadvantage of the known technical solution significantly limits the scope of the probiotic according to patent RU 2663720 based on live culture in agriculture, in particular in poultry farming.

Наиболее близким по совокупности совпадающих признаков и техническому результату к заявленному техническому решению, выбранный в качестве прототипа, является известный липопептидный препарат «CUBICIN®» (Cubist Pharmaceuticals, Inc., Lexington, MA) по патенту RU 2607526 «Липопептидные композиции и родственные способы». Сущностью известного технического решения является твердая фармацевтическая композиция антибиотика даптомицина для лечения бактериальной инфекции, где указанную композицию получают путем лиофилизации или распылительной сушки водного раствора даптомицина, содержащего даптомицин и по меньшей мере один эксципиент, выбранный из сахарозы или трегалозы, где молярное отношение даптомицина к эксципиенту составляет от 1:1,12 до 1:21,32. Фармацевтические композиции даптомицина различаются способами получения, используемыми буферными агентами (двухосновной фосфат натрия, цитрат натрия, бикарбонат натрия, моногидрохлорид гистидина, трис(гидроксиметил)аминометана, малеата или их комбинации), разбавителями (стерильная вода, стерильный хлорид натрия, бактериостатическая вода), рН водного раствора от 6.5 до 7.5, технологиями лиофилизации. Прототип на основе циклического липопептидного антибиотика даптомицина предназначен для лечения сложных инфекций кожи и структуры кожи и бактериемии, включая бактериемию с подозреваемым или доказанным инфекционным эндокардитом. Даптомицин для инъекции вводят внутривенно для лечения обозначенных инфекций, вызванных чувствительными штаммами многочисленных грамположительных микроорганизмов, включая метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA).The closest in terms of the combination of matching features and technical result to the claimed technical solution, selected as a prototype, is the well-known lipopeptide drug "CUBICIN®" (Cubist Pharmaceuticals, Inc., Lexington, MA) according to patent RU 2607526 "Lipopeptide compositions and related methods". The essence of the known technical solution is a solid pharmaceutical composition of the antibiotic daptomycin for the treatment of a bacterial infection, where the specified composition is obtained by lyophilization or spray drying of an aqueous solution of daptomycin containing daptomycin and at least one excipient selected from sucrose or trehalose, where the molar ratio of daptomycin to the excipient is from 1:1.12 to 1:21.32. Pharmaceutical compositions of daptomycin differ in the preparation methods used, buffering agents (dibasic sodium phosphate, sodium citrate, sodium bicarbonate, histidine monohydrochloride, tris(hydroxymethyl)aminomethane, maleate, or combinations thereof), diluents (sterile water, sterile sodium chloride, bacteriostatic water), pH aqueous solution from 6.5 to 7.5, lyophilization technologies. The prototype cyclic lipopeptide antibiotic daptomycin is indicated for the treatment of complex infections of the skin and skin structure and bacteremia, including bacteremia with suspected or proven infective endocarditis. Daptomycin for injection is administered intravenously to treat designated infections caused by susceptible strains of numerous Gram-positive organisms, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).

Недостатком прототипа является: The disadvantage of the prototype is:

1 - узкий спектр полезного действия антибиотика даптомицина,1 - narrow spectrum of useful action of the antibiotic daptomycin,

2 - низкая результативность, т.е. низкая эффективность использования по назначению, ограниченная инфекциями кожи, структуры кожи, бактериемией, 2 - low performance, i.e. low efficacy of intended use, limited to infections of the skin, skin structure, bacteremia,

3 - сложность способа использования для массового применения (инъекция),3 - the complexity of the method of use for mass use (injection),

4 - неприменимость против наиболее распространённых в животноводстве кишечных болезней - диареи, энтерита, кокцидозов, 4 - inapplicability against the most common intestinal diseases in animal husbandry - diarrhea, enteritis, coccidosis,

5 - не проявляет активности в отношении грамотрицательных условно-патогенных бактерий и мицелиальных грибов (далее по тексту - микромицетов) - возбудителей микотоксикозов, 5 - does not show activity against gram-negative opportunistic bacteria and filamentous fungi (hereinafter referred to as micromycetes) - pathogens of mycotoxicosis,

6 - антибактериальная активность ограничивается ингибированием роста грамположительных микроорганизмов, включая метициллин-резистентный Staphylococcus aureus, 6 - antibacterial activity is limited to inhibition of growth of gram-positive microorganisms, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus,

7 - не влияет на суточный привес цыплят-бройлеров, 7 - does not affect the daily weight gain of broiler chickens,

8 - не влияет на усвояемость корма цыплят-бройлеров.8 - does not affect the digestibility of feed for broiler chickens.

Таким образом, недостатки прототипа (по патенту RU 2607526) существенно ограничивают область его применения в сельском хозяйстве, например, в птицеводстве.Thus, the disadvantages of the prototype (according to patent RU 2607526) significantly limit its scope in agriculture, for example, in poultry farming.

Целью и заявленным техническим результатом предполагаемого изобретения является разработка способа получения и использования профилактического средства на основе суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, обладающего широким спектром антимикробного воздействия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий с грамположительным и грамотрицательным морфотипом, микромицетов - возбудителей микотоксикозов, используемого для профилактики болезней сельскохозяйственных птиц. The purpose and claimed technical result of the proposed invention is the development of a method for obtaining and using a prophylactic agent based on the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476, which has a wide range of antimicrobial effects against pathogenic and opportunistic bacteria with gram-positive and gram-negative morphotype, micromycetes - pathogens of mycotoxicoses, used for the prevention of diseases of poultry.

Средство на основе липопептидов, получаемое заявленным способом, обеспечивает:The agent based on lipopeptides, obtained by the claimed method, provides:

1 - широкий спектр полезного действия суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476,1 - a wide range of beneficial effects of the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476,

2 - высокую результативность, т.е. высокую эффективность использования по назначению для профилактики кишечных инфекций,2 - high performance, i.e. high effectiveness of the intended use for the prevention of intestinal infections,

3 - легкость способа использования для массового применения (добавление в комбикорм), 3 - ease of use for mass use (adding to compound feed),

4 - применимость против наиболее распространённых в животноводстве кишечных болезней - диареи, энтерита, кокцидозов, 4 - applicability against the most common intestinal diseases in animal husbandry - diarrhea, enteritis, coccidosis,

5 - активность в отношении грамотрицательных условно-патогенных бактерий и микромицетов - возбудителей микотоксикозов, 5 - activity against gram-negative opportunistic bacteria and micromycetes - causative agents of mycotoxicosis,

6 - антибактериальную активность, которая не ограничивается ингибированием роста грамположительных микроорганизмов,6 - antibacterial activity, which is not limited to inhibition of the growth of gram-positive microorganisms,

7 - повышение среднесуточного привеса цыплят-бройлеров,7 - increase in the average daily weight gain of broiler chickens,

8 - повышение усвояемости корма цыплят-бройлеров. 8 - increasing the digestibility of feed for broiler chickens.

Сущностью заявленного технического решения является способ получения суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, заключающийся в том, что берут маннит - 26.2 г/л, соевую муку - 21.9 г/л, NaNO3 - 3.1 г/л, MnSO4 х 4H2O - 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду; далее выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, с получением 2%-й концентрации клеток штамма в питательной среде; далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере при температуре от + 37°С до + 42°C и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученной биомассы клеток, получают бесклеточную культуральную жидкость; далее выполняют выделение целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости методом кислотного осаждения; далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют фасовку целевого продукта и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его использования по назначению. Способ использования суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 по п.1 в качестве профилактического средства от болезней сельскохозяйственных птиц заключающийся в том, что вносят высушенную суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в полнорационный комбикорм в количестве от 10 до 50 мг на 1 кг корма в зависимости от возраста сельскохозяйственных птиц в течение периода откорма, перемешивают, проводят кормление птиц. The essence of the claimed technical solution is a method for obtaining a total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476, which consists in taking mannitol - 26.2 g/l, soy flour - 21.9 g/l, NaNO 3 - 3.1 g/l, MnSO 4 x 4H 2 O - 0.2 g/l at pH 7.5, autoclaved at 121°C and 1 atm, while creating a nutrient medium; then perform seeding on the nutrient medium culture B. subtilis MG-8 VKPM B-12476, obtaining a 2% concentration of cells of the strain in the nutrient medium; then the cells of the strain are cultivated in a thermostat-shaker at a temperature from + 37°C to + 42°C and a swing intensity of 200 rpm for 96 hours, a biomass of cells of the strain-producer of bacteria B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 is obtained ; then perform the removal of cells of the strain B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 from the obtained cell biomass, get a cell-free culture fluid; then perform the selection of the target product of lipopeptides from the cell-free culture fluid by acid precipitation; then perform drying and sterilization of the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476; then, the target product is packed and the resulting dry fraction of lipopeptides is stored until it is used for its intended purpose. The method of using the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 according to claim 1 as a prophylactic against diseases of poultry , which consists in the fact that the dried total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 is added to the complete mixed feed in an amount of 10 to 50 mg per 1 kg of feed, depending on the age of farm birds during the fattening period, mix, feed the birds.

Заявленное техническое решение поясняется Фиг.1 - Фиг.3. The claimed technical solution is illustrated in Fig.1 - Fig.3.

На Фиг. 1 приведена антагонистическая активность суммарной фракции липопептидов, выделенных на разных стадиях роста Bacillus subtilis MG-8 В-12476 (далее по тексту В. subtilis MG-8 В-12476) при температуре тела человека (+37°С) и птицы (+42°С) против микромицетов Fusarium sp. и Alternaria sp., где: On FIG. one the antagonistic activity of the total fraction of lipopeptides is given, isolated at different stages of growth bacillus subtilis MG-8 B-12476 (hereinafter referred to asB. subtilis MG-8 B-12476) at human body temperature (+37°С) and poultry (+42°С) against micromycetesFusariumsp. andAlternariasp., where:

Fusarium sp.1, Fusarium sp. 2, Alternaria sp. - рода микромицета, Fusarium sp.1, Fusarium sp. 2, Alternaria sp. - genus micromycete,

А - диаметр зоны ингибирования фракцией липопептидов роста микромицета Fusarium sp.1, [мм],A - diameter of the zone of inhibition by the fraction of lipopeptides of growth of the micromycete Fusarium sp.1, [mm],

B - диаметр зоны ингибирования фракцией липопептидов роста микромицета Fusarium sp. 2, [мм],B - diameter of the zone of inhibition by the lipopeptide fraction of the growth of micromycete Fusarium sp. 2, [mm],

C - диаметр зоны ингибирования фракцией липопептидов роста микромицета Alternaria sp., [мм]. C is the diameter of the zone of inhibition by the lipopeptide fraction of the growth of the micromycete Alternaria sp., [mm].

На Фиг. 2 представлена Таблица 1, в которой приведена антибактериальная активность суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 в отношении непатогенных, патогенных и условно-патогенных бактерий Micrococcus luteus, Sarcina sp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Citrobacter freundii, Acinetobacter calcoaceticus, Serratia marcescens, Enterobacter ludwigii, где: On FIG. Table 2 shows the antibacterial activity of the total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides against non-pathogenic, pathogenic and conditionally pathogenic bacteria Micrococcus luteus, Sarcina sp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus , Bacillus pumilus, Citrobacter freundii, Acinetobacter calcoaceticus, Serratia marcescens, Enterobacter ludwigii , where:

T - продолжительность культивирования штамма Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 (часы) при естественной температуре тела птицы t = +42°С.T is the duration of cultivation of the strainBacillus subtilisMG-8 VKPM V-12476 (hours) at the natural body temperature of the bird t = +42°C.

На Фиг. 3 представлена Таблица 2, в которой приведены показатели роста цыплят-бройлеров кросса Кобб 500 с добавлением и без добавления в рацион заявленной суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476, где: On FIG. Table 3 shows Table 2, which shows the growth rates of broiler chickens of the Cobb 500 cross with and without the addition of the declared total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides to the diet, where:

№ 1 - контрольная группа, получала полнорационный комбикорм,No. 1 - control group, received a complete feed,

№ 2 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 10 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма,No. 2 - experimental group, received a complete mixed feed with the addition of 10 mg of the total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides per 1 kg of feed,

№ 3 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 30 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма,No. 3 - experimental group, received a complete mixed feed with the addition of 30 mg of the total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides per 1 kg of feed,

№ 4 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 50 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма.No. 4 - experimental group, received a complete mixed feed with the addition of 50 mg of the total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides per 1 kg of feed.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.Further, the applicant provides a description of the claimed technical solution.

Цели заявленного технического решения достигают разработкой способа получения и использования профилактического средства на основе суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476. The objectives of the claimed technical solution are achieved by developing a method for obtaining and using a prophylactic agent based on the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476.

Далее заявителем приведена общая последовательность действий заявленного способа получения суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476:Further, the applicant provides the general sequence of actions of the claimed method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 :

- берут известные как таковые реактивы маннит - 26.2 г/л, соевую муку - 21.9 г/л, NaNO3 - 3.1 г/л, MnSO4 х 4H2O - 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду,- take known as such reagents mannitol - 26.2 g/l, soy flour - 21.9 g/l, NaNO 3 - 3.1 g/l, MnSO 4 x 4H 2 O - 0.2 g/l at pH 7.5, autoclave at 121°C and 1 atm, while creating a nutrient medium,

- выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, с получением 2%-й концентрации клеток штамма в питательной среде, - perform seeding on the culture medium of B. subtilis MG-8 VKPM B-12476, obtaining a 2% concentration of cells of the strain in the nutrient medium,

- далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере при температуре от + 37°С до + 42°C и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476,- further, the cells of the strain are cultivated in a thermostat-shaker at a temperature from + 37°C to + 42°C and a swing intensity of 200 rpm for 96 hours, a biomass of cells of the strain-producer of bacteria B. subtilis MG-8 VKPM V- is obtained 12476,

- далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученного концентрата клеток, получают бесклеточную культуральную жидкость,- further, cells of the strain B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 are removed from the obtained cell concentrate, a cell-free culture liquid is obtained,

- далее выполняют выделение собственно целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости методом кислотного осаждения, - then, the actual target product of lipopeptides is isolated from the cell-free culture fluid by acid precipitation,

- далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, - further drying and sterilization of the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 is performed,

- далее выполняют фасовку целевого продукта и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его применения по назначению.- further, the target product is packed and the resulting dry fraction of lipopeptides is stored until it is used for its intended purpose.

После получения целевого продукта выполняют растворение высушенной фракции липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в ДМСО для контроля качества антимикробной активности против тест-культур.After obtaining the target product, the dried fraction of lipopeptides of the bacterium B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 is dissolved in DMSO to control the quality of antimicrobial activity against test cultures.

Заявитель поясняет, что температура культивирования ограничена пределами от +37°С до +42°C, так как +37°С является естественной температурой тела человека, а +42°C естественная температура тела цыплят-бройлеров. The applicant explains that the cultivation temperature is limited to +37°C to +42°C, since +37°C is the natural body temperature of a person, and +42°C is the natural body temperature of broiler chickens.

Далее заявителем приведена общая последовательность действий заявленного способа использования суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в качестве профилактического средства от болезней сельскохозяйственных птиц: Further, the applicant provides a general sequence of actions of the claimed method of using the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 as a prophylactic against diseases of farm birds:

- вносят высушенную суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в полнорационный комбикорм в количестве от 10 до 50 мг на 1 кг корма в зависимости от возраста сельскохозяйственных птиц в течение периода откорма,- add the dried total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 to the complete feed in the amount of 10 to 50 mg per 1 kg of feed, depending on the age of farm birds during the fattening period,

- перемешивают, - mix

- проводят кормление птиц.- Feed the birds.

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения.Further, the applicant provides examples of the implementation of the claimed technical solution.

Пример 1. Получение суммарной фракции липопептидовExample 1. Obtaining the total fraction of lipopeptides B. subtilis B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при температуре культивирования клеток штамма в термостате-шейкере + 37°С MG-8 VKPM V-12476 at a temperature of cultivating cells of the strain in a thermostat-shaker + 37°C

Сначала получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 известным способом [Hadieva, G., Lutfullin, M., Pudova, D., Akosah, Y., Shagimardanova, E., Gogoleva, N., Sharipova M., Mardanova, A. Supplementation of Bacillus subtilis GM5 enhances broiler body weight gain and modulates cecal microbiota. 3Biotech 11, 126 (2021)].First, the biomass of cells of the bacterial producer strain B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 is obtained by a known method [Hadieva, G., Lutfullin, M., Pudova, D., Akosah, Y., Shagimardanova, E., Gogoleva, N. , Sharipova M., Mardanova, A. Supplementation of Bacillus subtilis GM5 enhances broiler body weight gain and modulates cecal microbiota. 3Biotech 11, 126 (2021)].

Для этого берут известные как таковые реактивы маннит - 26.2 г/л, соевую муку - 21.9 г/л, NaNO3 - 3.1 г/л, MnSO4 × 4H2O - 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду.To do this, take the reagents known as such mannitol - 26.2 g / l, soy flour - 21.9 g / l, NaNO 3 - 3.1 g / l, MnSO 4 × 4H 2 O - 0.2 g / l at pH 7.5, autoclave at 121 ° C and 1 atm, while creating a nutrient medium.

Далее выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, получают 2%-ю концентрацию клеток штамма в питательной среде. Next, seeding is performed on the nutrient medium of the culture of B. subtilis MG-8 VKPM B-12476, a 2% concentration of cells of the strain in the nutrient medium is obtained.

Далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере, например, фирмы “IKA®KS 4000” (Германия), при температуре, например, + 37°С и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.Next, the cells of the strain are cultivated in a thermostat-shaker, for example, by IKA®KS 4000 (Germany), at a temperature, for example, + 37 ° C and a swing intensity of 200 rpm for 96 hours, a biomass of cells of the producer strain is obtained bacteria B. subtilis MG-8 VKPM B-12476.

Заявитель поясняет, что интенсивность качания термостата-шейкера 200 об/мин, использованного в проведенных исследованиях, ограничивается параметрами термостата-шейкера, и при использовании более низких оборотов уменьшается и процент выхода целевого продукта. The applicant explains that the swing intensity of the 200 rpm shaker thermostat used in the studies is limited by the parameters of the shaker thermostat, and when using lower speeds, the yield of the target product also decreases.

Далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученной биомассы, например, центрифугированием, например, на центрифуге фирмы Eppendorf при 14000 об/мин в течение 30 мин при + 4°С, получают бесклеточную культуральную жидкость.Next, cells of the B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 strain are removed from the obtained biomass, for example, by centrifugation, for example, in an Eppendorf centrifuge at 14,000 rpm for 30 min at + 4°C, a cell-free culture liquid is obtained.

Для целей проверки чистоты эксперимента, заявителем проводилось определение антимикробной активности каждые 24 часа, посредством отбора из колбы по 100 мл бесклеточной культуральной жидкости. For the purpose of checking the purity of the experiment, the applicant carried out the determination of antimicrobial activity every 24 hours, by sampling from a flask of 100 ml of cell-free culture fluid.

Далее выполняют выделение собственно целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости известным как таковым методом кислотного осаждения, для чего бесклеточную культуральную жидкость подкисляют, например, добавлением 6 N HCl до конечного pH 2.5 для осаждения тяжелых по молекулярной массе белков. Далее полученный осадок удаляют центрифугированием, например, при 10000 об/мин в течение 10 мин при + 4°С. Далее отделенный осадок растворяют в 50% этаноле (22.5 мл), после чего выполняют подщелачивание осадка добавлением 1 N NaOH до конечного pH 7.5. Получают промежуточный продукт - раствор белков. Next, the actual target lipopeptide product is isolated from the cell-free culture fluid by the acid precipitation method known as such, for which the cell-free culture fluid is acidified, for example, by adding 6 N HCl to a final pH of 2.5 to precipitate proteins heavy in molecular weight. Next, the resulting precipitate is removed by centrifugation, for example, at 10,000 rpm for 10 min at + 4°C. Next, the separated precipitate is dissolved in 50% ethanol (22.5 ml), after which the precipitate is alkalized by adding 1 N NaOH to a final pH of 7.5. Get an intermediate product - a solution of proteins.

Далее раствор белков центрифугируют, например, при 10000 об/мин в течение, например, 10 мин при + 4°С. Получают легкие по молекулярной массе липопептиды.Next, the protein solution is centrifuged, for example, at 10,000 rpm for, for example, 10 min at + 4°C. Get light molecular weight lipopeptides.

Полученные легкие липопептиды разбавляют в 20 мл дистиллированной воды, далее повторно осаждают добавлением 6 N HCl до конечного pH 2.5. The obtained light lipopeptides are diluted in 20 ml of distilled water, then re-precipitated by adding 6 N HCl to a final pH of 2.5.

Далее легкие липопептиды центрифугируют, например, при 10000 об/мин в течение, например, 10 мин при + 4°С.Next, light lipopeptides centrifuged, for example, at 10,000 rpm for, for example, 10 min at + 4°C.

Таким образом получают суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.Thus, the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 is obtained.

Далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, для чего их лиофильно высушивают, например, на роторном испарителе при температуре не более + 60°C, предпочтительно +37°C, т.к. эта температура является рекомендованной для используемого роторного испарителя. Next, drying and sterilization of the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 is performed, for which they are freeze-dried, for example, on a rotary evaporator at a temperature of not more than + 60 ° C, preferably + 37 ° C, because this temperature is recommended for the rotary evaporator used.

Получают целевой продукт в виде высушенной суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476. Get the target product in the form of a dried total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476.

Выход = 0.106 ± 0.029 г/л культуральной жидкости.Yield = 0.106 ± 0.029 g/L of culture liquid.

Далее выполняют фасовку целевого продукта на фасовочном аппарате для фасовки сыпучих продуктов, и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его применения по назначению. Продукт хранится в упаковке в стерильных условиях при температуре в диапазоне от - 40°С до + 40°С, и сохраняет свою эффективность в течение 24 месяцев после вскрытия упаковки.Next, the target product is packed on a packing machine for packing bulk products, and the resulting dry fraction of lipopeptides is stored until it is used for its intended purpose. The product is stored in packaging under sterile conditions at a temperature ranging from -40°C to +40°C, and remains effective for 24 months after opening the package.

Далее проводят контроль качества полученного целевого продукта для определения антимикробной активности против тест-культур, для чего растворяют высушенную фракцию липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в ДМСО и проводят контроль качества по известным методикам - см. Примеры № 5, 6. При этом заявитель поясняет, что данное действие используется исключительно для контроля качества антимикробной активности против тест-культур. Next, the quality of the obtained target product is controlled to determine the antimicrobial activity against test cultures, for which the dried fraction of lipopeptides of the bacterium B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 is dissolved in DMSO and quality control is carried out according to known methods - see Examples No. 5, 6 However, the applicant explains that this action is used solely for quality control of antimicrobial activity against test cultures.

Пример 2. Получение суммарной фракции липопептидовExample 2. Obtaining the total fraction of lipopeptides B. subtilis B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при температуре культивирования клеток штамма в термостате-шейкере + 42°С MG-8 VKPM V-12476 at a temperature of cell cultivation of the strain in a thermostat-shaker + 42°C

Проводят последовательность действий аналогично Примеру 1, отличающуюся тем, что культивирование клеток штамма в термостате-шейкере проводят при температуре + 42°C.Spend the sequence of actions similar to Example 1, characterized in that the cultivation of the cells of the strain in a thermostat-shaker is carried out at a temperature of + 42°C.

Получают целевой продукт в виде высушенной суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.Get the target product in the form of a dried total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476.

Выход = 0.107 ± 0.029 г/л культуральной жидкости.Yield = 0.107 ± 0.029 g/L of culture liquid.

Далее проводят контроль качества полученного целевого продукта для определения антимикробной активности против тест-культур, для чего растворяют высушенную фракцию липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в ДМСО и проводят контроль качества по известным методикам - см. Примеры № 5, 6. При этом заявитель поясняет, что данное действие используется исключительно для контроля качества антимикробной активности против тест-культур. Next, the quality of the obtained target product is controlled to determine the antimicrobial activity against test cultures, for which the dried fraction of lipopeptides of the bacterium B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 is dissolved in DMSO and quality control is carried out according to known methods - see Examples No. 5, 6 However, the applicant explains that this action is used solely for quality control of antimicrobial activity against test cultures.

Пример 3. Получение суммарной фракции липопептидовExample 3. Obtaining the total fraction of lipopeptides B. subtilis B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при температуре культивирования клеток штамма в термостате-шейкере + 40°С MG-8 VKPM V-12476 at a temperature of cultivating cells of the strain in a thermostat-shaker + 40°C

Проводят последовательность действий аналогично Примеру 1, отличающуюся тем, что культивирование клеток штамма в термостате-шейкере проводят при температуре + 42°C.Spend the sequence of actions similar to Example 1, characterized in that the cultivation of the cells of the strain in a thermostat-shaker is carried out at a temperature of + 42°C.

Получают целевой продукт в виде высушенной суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.Get the target product in the form of a dried total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476.

Выход = 0.106 ± 0.029 г/л культуральной жидкости.Yield = 0.106 ± 0.029 g/L of culture liquid.

Далее проводят контроль качества полученного целевого продукта для определения антимикробной активности против тест-культур, для чего растворяют высушенную фракцию липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в ДМСО и проводят контроль качества по известным методикам - см. Примеры № 5, 6. При этом заявитель поясняет, что данное действие используется исключительно для контроля качества антимикробной активности против тест-культур. Next, the quality of the obtained target product is controlled to determine the antimicrobial activity against test cultures, for which the dried fraction of lipopeptides of the bacterium B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 is dissolved in DMSO and quality control is carried out according to known methods - see Examples No. 5, 6 However, the applicant explains that this action is used solely for quality control of antimicrobial activity against test cultures.

При этом заявитель поясняет, что в Примерах 1 - 3 температура культивирования в термостате-шейкере в условиях эксперимента варьировалась в широком диапазоне а именно - в диапазоне от 37°С до 42°C. При этом заявитель поясняет, что не выявлено влияние темпратуры на результаты выхода целевого продукта, т.е. на собственно синтез липопептидов бактерии B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, из чего можно сделать логический вывод о том, что результаты исследования, полученные на цыплятах-бройлерах, могут быть транслированы в организм млекопитающих, в том числе и человека. The applicant explains that in Examples 1 to 3, the temperature of cultivation in a thermostat-shaker under experimental conditions varied over a wide range, namely, in the range from 37°C to 42°C. At the same time, the applicant explains that no effect of temperature on the results of the release of the target product has been revealed, i.e. on the actual synthesis of lipopeptides of the bacterium B. subtilis MG-8 VKPM B-12476, from which it can be logically concluded that the results of the study obtained on broiler chickens can be translated into the body of mammals, including humans.

Пример 4. Использование суммарной фракции липопептидов бактерий Example 4 Use of Total Bacterial Lipopeptide Fraction Bacillus subtilisBacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в качестве профилактического средства от болезней на примере цыплят-бройлеров MG-8 VKPM B-12476 as a prophylactic against diseases on the example of broiler chickens

Эксперименты на цыплятах-бройлерах провели в условиях фермерского хозяйства «Лачын» («КФХ Алимчуева З.И.», Медведевский район, республика Марий Эль, Россия). Для эксперимента из местного коммерческого инкубатора (Медведевский район, Марий Эл, Россия).Experiments on broiler chickens were carried out in the conditions of the Lachyn farm (KFH Alimchueva Z.I., Medvedevsky district, Republic of Mari El, Russia). For an experiment from a local commercial incubator (Medvedevsky district, Mari El, Russia).

Цыплят-бройлеров содержали в одинаковых вентилируемых клетках при комнатной температуре и освещении. Все эксперименты с цыплятами проводили с соблюдением биоэтических норм. Содержание, кормление и уход за животными, а также умерщвление животных для отбора проб проводили согласно требованиям Директивы Европейского парламента и Совета о защите животных, используемых в научных целях, от 22 сентября 2010 года (Директива 2010/63 / UE о защите животных, используемых в научных целях) по уходу и использованию экспериментальных животных.Broiler chickens were kept in identical ventilated cages at room temperature and light. All experiments with chickens were carried out in compliance with bioethical standards. The housing, feeding and care of animals, as well as the killing of animals for sampling were carried out in accordance with the requirements of the Directive of the European Parliament and of the Council on the protection of animals used for scientific purposes, of September 22, 2010 (Directive 2010/63 / UE on the protection of animals used in scientific purposes) for the care and use of experimental animals.

В ходе эксперимента проводили ежедневное взвешивание цыплят-бройлеров 4-х групп для определения как веса так и среднесуточного прироста массы тела отдельного цыпленка. Количество потребляемого корма определено путем измерения остатка корма на еженедельной основе с начала эксперимента. Коэффициент конверсии корма (Фиг. 3) рассчитан путем деления потребленного корма на прирост массы тела.During the experiment, daily weighing of broiler chickens of 4 groups was carried out to determine both the weight and the average daily weight gain of an individual chicken. The amount of feed consumed was determined by measuring the remaining feed on a weekly basis from the start of the experiment. The feed conversion ratio (FIG. 3) was calculated by dividing feed intake by body weight gain.

Так как по Примерам 1 - 3 получен равноценный целевой продукт (порошок суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476), для изучения использования суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в качестве профилактического средства от болезней птиц был произвольно выбран целевой продукт, полученный по Примеру 1, в виде порошка суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 (далее - порошок).Since, according to Examples 1 - 3, an equivalent target product was obtained (powder of the total fraction of lipopeptides of Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 bacteria), to study the use of the total fraction of lipopeptides of Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 bacteria as a prophylactic against diseases birds, the target product obtained according to Example 1 was randomly selected in the form of a powder of the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 (hereinafter referred to as powder).

Порошок вносили в полнорационный комбикорм посредством простого механического перемешивания, например, на мешалке для комбикормов Push Pumps, при этом цыплята-бройлеры получали от 10 до 50 мг порошка на 1 кг корма в зависимости от от возраста.The powder was introduced into the complete feed by simple mechanical mixing, for example, on a Push Pumps feed mixer, while broiler chickens received from 10 to 50 mg of powder per 1 kg of feed, depending on age.

Для исследования взяли 120 суточных цыплят-бройлеров кросса Кобб 500. Из них сформировали 4 группы по 30 цыплят без разделения по полу: For the study, 120 day old broiler chickens of the Cobb 500 cross were taken. Of these, 4 groups of 30 chickens were formed without segregation by sex:

№ 1 - контрольная группа, получала полнорационный комбикорм,No. 1 - control group, received a complete feed,

№ 2 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 10 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма,No. 2 - experimental group, received a complete mixed feed with the addition of 10 mg of the total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides per 1 kg of feed,

№ 3 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 30 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма,No. 3 - experimental group, received a complete mixed feed with the addition of 30 mg of the total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides per 1 kg of feed,

№ 4 - опытная группа, получала полнорационный комбикорм с добавлением 50 мг суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 на 1 кг корма.No. 4 - experimental group, received a complete mixed feed with the addition of 50 mg of the total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides per 1 kg of feed.

Результат использования суммарной фракции липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 выявлен путем сравнительного анализа параметров роста цыплят-бройлеров контрольной и опытных групп. The result of using the total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides was revealed by a comparative analysis of the growth parameters of broiler chickens in the control and experimental groups.

На 35-е сутки средний привес массы одного цыпленка контрольной группы №1 составил 1298.0 ± 49.00 г, а цыплят опытной группы №4 - 1463.0 ± 76.25 г, что на 12.7 % (≈ 13%) выше контроля (Таблица 2 на Фиг. 3). Суточное потребление корма у цыплят опытной группы №4 составляет 3227.05±124.81 г в сравнении с контрольной группой №1 (3064.57 ± 115.49 г), что на 5.30 % превышает потребление корма контрольной группы. Среднесуточный привес цыплят опытной группы №4 составил 41.80 ± 1.86 г. Среднесуточный привес цыплят контрольной группы №1 составил 37.09 ± 1.40 г. Суточный привес цыплят опытной группы №4 составляет (41,8 х 100 %) / 37,09 ≈ 114 %, то есть на 14 % превышает суточный привес цыплят контрольной группы №1. On the 35th day, the average weight gain of one chicken of the control group No. 1 was 1298.0 ± 49.00 g, and the chickens of the experimental group No. 4 - 1463.0 ± 76.25 g, which is 12.7% (≈ 13%) higher than the control (Table 2 in Fig. 3 ). The daily feed intake of the chickens of the experimental group No. 4 is 3227.05±124.81 g compared to the control group No. 1 (3064.57 ± 115.49 g), which is 5.30% higher than the feed intake of the control group. The average daily weight gain of chickens in experimental group No. 4 was 41.80 ± 1.86 g. The average daily weight gain of chickens in control group No. 1 was 37.09 ± 1.40 g. that is, 14% higher than the daily weight gain of chickens in the control group No. 1.

Конверсия корма у цыплят опытной группы №4 ниже на 6.36% и составляет 2.21 условных единиц (у.е.), в контрольной группе №1 - 2.36 у.е. (Таблица 2 на Фиг. 3). Известно - чем больше коэффициент конверсии, тем больше корма необходимо затратить на производство животноводческой продукции. Более низкий коэффициент конверсии свидетельствует о более высоком уровне усвояемости используемых кормов.Feed conversion in chickens of the experimental group No. 4 is lower by 6.36% and amounts to 2.21 conventional units (c.u.), in the control group No. 1 - 2.36 c.u. (Table 2 in Fig. 3). It is known that the higher the conversion rate, the more feed must be spent on the production of livestock products. A lower conversion rate indicates a higher level of digestibility of the feed used.

Таким образом, из Примера 4 можно сделать вывод, что суммарная фракция липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, полученная по заявленному способу, при добавлении в полнорационный комбикорм улучшает показатели продуктивности, из чего можно сделать логический вывод о благоприятном воздействии на устранение кишечных инфекций сельскохозяйственных птиц и улучшении усвояемости, что доказывает достижение заявленного технического результата.Thus, from Example 4 it can be concluded that the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476, obtained according to the claimed method, when added to a complete feed improves productivity indicators, from which we can draw a logical conclusion about a favorable effect on the elimination intestinal infections of poultry and improved digestibility, which proves the achievement of the claimed technical result.

Пример 5. Оценка фунгистатической активности суммарной фракции липопептидовExample 5. Evaluation of the fungistatic activity of the total fraction of lipopeptides B. subtilis B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 MG-8 VKPM V-12476

Экспериментально установлено, что суммарная фракция липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476, в отличие от прототипа, ингибирует (задерживает, подавляет) рост и развитие микромицетов - возбудителей микотоксикозов животных и человека. Результаты исследования зоны подавления роста микромицетов представлены на Фиг. 1.It was experimentally established that the total fraction of lipopeptides B. subtilis MG-8 B-12476, unlike the prototype, inhibits (delays, suppresses) the growth and development of micromycetes - pathogens of mycotoxicosis in animals and humans. The results of the study of the zone of inhibition of growth of micromycetes are presented in Fig. one.

Для исследования фунгистатической активности суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 стерильным пробочным сверлом вырезают блоки чистых культур микромицетов Fusarium sp. и Alternaria sp. и помещают их в центр чашки Петри на среду Чапека следующего состава: (г/л: глюкоза - 14.0, CaCO3 - 0.7, KNO3 - 0.7, MgSO4 - 0.35, NaCl - 0.35, K2HPO4 - 0.35, FeSO4 - следы; агар-агар - 20.0). Стерильным пробочным сверлом вырезают лунки диаметром 7.0 мм, в которые добавляют разные фракции липопептидов в концентрации 10 мг/мл по 25.0 мкл. В качестве контроля используют DMSO. Расстояние между лунками 15-20 мм. Чашки инкубируют при + 28°С (оптимальная температура роста микромицетов) в течение 7 суток (188 ч). Фунгистатическую активность оценивают по диаметру зоны подавления роста микромицета. To study the fungistatic activity of the total fraction of lipopeptides B. subtilis MG-8 VKPM B-12476, blocks of pure cultures of Fusarium sp. micromycetes are cut out with a sterile cork drill. and Alternaria sp. and place them in the center of the Petri dish on Chapek's medium of the following composition: (g / l: glucose - 14.0, CaCO 3 - 0.7, KNO 3 - 0.7, MgSO 4 - 0.35, NaCl - 0.35, K 2 HPO 4 - 0.35, FeSO 4 - traces; agar-agar - 20.0). Wells with a diameter of 7.0 mm are cut out with a sterile cork drill, into which different fractions of lipopeptides are added at a concentration of 10 mg/ml, 25.0 μl each. DMSO is used as a control. The distance between the holes is 15-20 mm. Cups are incubated at + 28°C (optimal growth temperature of micromycetes) for 7 days (188 hours). Fungistatic activity is assessed by the diameter of the micromycete growth inhibition zone.

Активность липопептидных фракций исследовали в отношении микромицетов Fusarium sp. 1, Fusarium sp. 2, Alternaria sp. и оценивали по диаметру зоны подавления роста колонии тест-культуры после истечения 4-х суток. The activity of lipopeptide fractions was studied in relation to micromycetes Fusarium sp. 1, Fusarium sp. 2, Alternaria sp. and was evaluated by the diameter of the growth inhibition zone of the colony of the test culture after the expiration of 4 days.

Как видно на Фиг. 1, разные штаммы Fusarium различаются по чувствительности к липопептидам. Максимальную активность фракции липопептидов проявляют в отношении изолята Fusarium sp. 2 (Фиг. 1В). Максимальную активность в отношении двух изолятов фузарий проявляет суммарная фракция липопептидов, выделенная через 48 ч культивирования при + 37°C. В отношении Fusarium sp. 1 максимальный ингибирующий эффект проявляют фракции, выделенные через 24 и 48 ч культивирования бацилл, инкубированные при + 37°C (Фиг.1А). Не выявлена зависимость активности фракции от температуры культивирования. Можно сделать вывод о том, что при + 37°C максимум активности липопептидов в отношении штаммов Fusarium sp. достигается через 48 ч культивирования В. subtilis MG-8 В-12476.As seen in FIG. 1, different strains of Fusarium differ in sensitivity to lipopeptides. The maximum activity of the lipopeptide fraction is shown against the isolate Fusarium sp. 2 (Fig. 1B). The maximum activity against two Fusarium isolates was shown by the total lipopeptide fraction isolated after 48 h of cultivation at +37°C. With respect to Fusarium sp. 1, the maximum inhibitory effect is shown by fractions isolated after 24 and 48 hours of cultivation of bacilli, incubated at + 37°C (Fig.1A). The dependence of the activity of the fraction on the cultivation temperature was not revealed. It can be concluded that at + 37°C the maximum activity of lipopeptides against strains of Fusarium sp. achieved after 48 hours of cultivation of B. subtilis MG-8 B-12476.

Максимальную активность в отношении Alternaria sp. проявляют фракции липопептидов, выделенные через 48 ч роста из культуры В. subtilis MG-8 В-12476, инкубированной при + 37°С. Установлено, что выделенные через 72 час культивирования и инкубированные при + 37°С и +42°С фракции липопептидов ингибируют рост Alternaria sp. с четвертой (4) по седьмые (7) сутки (Фиг. 1С), в отличие от фракций липопептидов, выделенных после культивирования в течение 24 и 48 ч; инкубированная при + 42°С 96-ти часовая фракция сохраняет стабильную ингибирующую активность в отношении Alternaria sp. с четвертой (4) по седьмые (7) сутки (Фиг. 1С). maximum activity againstAlternaria sp. show lipopeptide fractions isolated after 48 hours growth from cultureB. subtilis MG-8 B-12476,incubated at + 37°С. It was found that the lipopeptide fractions isolated after 72 hours of cultivation and incubated at + 37°C and + 42°C inhibit the growthAlternaria sp. from the fourth (4) to the seventh (7) days (Fig. 1C), in contrast to the fractions of lipopeptides isolated after cultivation for 24 and 48 hours; the 96-hour fraction incubated at + 42°C retains a stable inhibitory activity againstAlternaria sp. from the fourth (4) to the seventh (7) day (Fig. 1C).

Таким образом, рост микромицета Alternaria sp. эффективнее ингибируют фракции, полученные из бесклеточной культуральной жидкости B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при + 37°С.Thus, the growth of the micromycete Alternaria sp. effectively inhibit the fractions obtained from the cell-free culture fluid of B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 at + 37°C.

Пример 6. Оценка антибактериальной активности суммарной фракции липопептидовExample 6 Evaluation of the antibacterial activity of the total fraction of lipopeptides B. subtilis B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 MG-8 VKPM V-12476

Для оценки антибактериальной активности использовали фракции, полученные через 24, 48, 72 и 96 ч роста (культивирования), например, при + 37°С.To assess the antibacterial activity, fractions obtained after 24, 48, 72 and 96 h of growth (cultivation), for example, at + 37°C, were used.

Суммарная фракция липопептидов В. subtilis MG-8 В-12476 характеризуется антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных бактерий с грамположительным и грамотрицательным морфотипом строения клеточной стенки. Для исследования антибактериальной активности суммарной фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 на поверхность среды LA (г/л: триптон - 10.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaCl - 5.0, агар-агар (2 %) - 20.0) в чашке Петри газоном засевают бактериальные грамположительные тест-культуры Micrococcus luteus, Sarcina sp., Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Bacillus pumilus и грамотрицательные Enterobacter ludwigii, Serratia marcescens по 100.0 мкл. Затем стерильным пробочным сверлом в агаризованой среде вырезают лунки диаметром 7.0 мм, в которые вносят разные фракции липопептидов в концентрации 10 мг/мл по 25.0 мкл. В качестве контроля используют ДМСО. Расстояние между лунками 15 - 20 мм. Посевы в чашках Петри инкубируют при + 37°С в течение 24 часов. Антибактериальную активность оценивают по диаметру зоны подавления роста тест-культур.The total fraction of B. subtilis MG-8 B-12476 lipopeptides is characterized by antagonistic activity against a wide range of pathogenic and opportunistic bacteria with gram-positive and gram-negative cell wall morphotypes. To study the antibacterial activity of the total fraction of B. subtilis MG-8 VKPM V-12476 lipopeptides on the surface of the LA medium (g/l: tryptone - 10.0, yeast extract - 5.0, NaCl - 5.0, agar-agar (2%) - 20.0) in in a Petri dish with a lawn, bacterial gram-positive test cultures of Micrococcus luteus, Sarcina sp., Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Bacillus pumilus and gram-negative Enterobacter ludwigii, Serratia marcescens , 100.0 μl each. Then, wells with a diameter of 7.0 mm are cut out with a sterile cork drill in agar medium, into which various fractions of lipopeptides are introduced at a concentration of 10 mg/ml, 25.0 μl each. DMSO is used as a control. The distance between the holes is 15 - 20 mm. Crops in Petri dishes are incubated at + 37°C for 24 hours. Antibacterial activity is assessed by the diameter of the growth inhibition zone of the test cultures.

Результаты исследования антибактериальной активности фракции липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 представлены в Таблице 1 на Фиг. 2. Наибольшую антимикробную активность в отношении Sarcina sp. среди всех исследованных фракций проявляет фракция липопептида, выделенная через 96 ч культивирования. Диаметр зоны подавления роста фракции липопептидов через 24 ч культивирования существенно превышает зону подавления роста в отношении M. luteus, E. faecalis 2 и составляет 19.00±7.07 мм и 19.9±3.96 мм (Таблица 1 на Фиг. 1). Выделенная через 48 ч культивирования (роста) бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 фракция липопептидов проявляет наибольшую активность в отношении клинических изолятов E. faecalis 1, S. aureus 1, S. hominis и S. agalactiae. Выделенная на 96 ч культивирования фракция липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, в отличие от прототипа, ингибирует рост как грамположительных так и грамотрицательных тест-культур. Широкий спектр действия фракций липопептидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 обеспечивается суммарной комбинацией разных липопептидов, которые продуцируются в среду культивирования SMN на разных фазах роста штамма. Например, синтез сурфактина индуцируется в активно растущих клетках во время перехода от экспоненциальной к стационарной фазе, синтез фенгицина связан с ранней стационарной фазой, а итурины накапливаются только в более позднем стационаре [A. Sarwar. Qualitative Analysis of Biosurfactants From Bacillus Species Exhibiting Antifungal Activity / A. Sarwar, G. Brader, E. Corretto, G. Aleti, M. A. Ullah, A. Sessitsch, F. Y. Hafeez // PLoS One. - 2018. - V. 13. N. 6].The results of the study of the antibacterial activity of the lipopeptide fractionB. subtilisMG-8 VKPM B-12476 are presented in Table 1 in FIG. 2. The highest antimicrobial activity againstSarcina sp. among all the studied fractions, the lipopeptide fraction isolated after 96 hours of cultivation exhibits. The diameter of the growth inhibition zone of the lipopeptide fraction after 24 hours of cultivation significantly exceeds the growth inhibition zone in relation toM. luteus, E. faecalis 2 and is 19.00±7.07 mm and 19.9±3.96 mm (Table 1 in Fig. 1). Isolated after 48 hours of cultivation (growth) of bacteriaB. subtilisMG-8 VKPM B-12476 lipopeptide fraction shows the greatest activity against clinical isolatesE. faecalisone, S. aureusone, S. hominisandS. agalactiae. Dedicated for 96 hours cultured fraction of lipopeptidesB. subtilisMG-8 VKPM B-12476, unlike the prototype, inhibits the growth of both gram-positive and gram-negative test cultures. Broad spectrum of action of lipopeptide fractionsB. subtilisMG-8 VKPM B-12476 is provided by the total combination of different lipopeptides that are produced in the SMN culture medium at different growth phases of the strain. For example, surfactin synthesis is induced in actively growing cells during the transition from exponential to stationary phase, fengycin synthesis is associated with the early stationary phase, and iturins accumulate only in the later hospital phase [A. Sarwar. Qualitative Analysis of Biosurfactants Frombacillus Species Exhibiting Antifungal Activity / A. Sarwar, G. Brader, E. Corretto, G. Aleti, M. A. Ullah, A. Sessitsch, F. Y. Hafeez // PLoS One. - 2018. - V. 13. N. 6].

Таким образом, выделенная из культуральной среды через 96 ч культивирования (роста) фракция липопетидов B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 стабильно сохраняет антибактериальную активность в отношении тест-культур. Thus, the fraction of lipopetides isolated from the culture medium after 96 hours of cultivation (growth)B. subtilisMG-8 VKPM B-12476 stably retains antibacterial activity against test cultures.

Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат, а именно: разработан способ получения и использования профилактического средства на основе суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, обладающего широким спектром антимикробного воздействия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий с грамположительным и грамотрицательным морфотипом, микромицетов - возбудителей микотоксикозов, используемого для профилактики болезней сельскохозяйственных птиц. Thus, from the above, we can conclude that the applicant has achieved the set goals and the claimed technical result, namely: a method has been developed for obtaining and using a prophylactic agent based on the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476, which has a wide range of antimicrobial impact on pathogenic and opportunistic bacteria with gram-positive and gram-negative morphotype, micromycetes - causative agents of mycotoxicosis, used to prevent diseases of poultry.

Средство на основе липопептидов, получаемое заявленным способом, обеспечивает:The agent based on lipopeptides, obtained by the claimed method, provides:

1 - широкий спектр полезного действия суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476,1 - a wide range of beneficial effects of the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476,

2 - высокая результативность, т.е. высокая эффективность использования по назначению для профилактики кишечных инфекций,2 - high performance, i.e. high effectiveness of the intended use for the prevention of intestinal infections,

3 - легкость применения способа для массового применения (добавление в комбикорм), 3 - ease of application of the method for mass use (adding to compound feed),

4 - применимость против наиболее распространённых в животноводстве кишечных болезней - диареи, энтерита, кокцидозов, 4 - applicability against the most common intestinal diseases in animal husbandry - diarrhea, enteritis, coccidosis,

5 - проявляет активность в отношении грамотрицательных условно-патогенных бактерий и микромицетов - возбудителей микотоксикозов (результаты представлены в на Фиг.1, Таблица 1 на Фиг.2), 5 - is active against gram-negative opportunistic bacteria and micromycetes - the causative agents of mycotoxicosis (the results are presented in figure 1, table 1 in figure 2),

6 - антибактериальная активность не ограничивается ингибированием роста грамположительных микроорганизмов (результаты представлены в Таблица 1 на Фиг.2),6 - antibacterial activity is not limited to inhibition of the growth of gram-positive microorganisms (the results are presented in Table 1 in Fig.2),

7 - повышает среднесуточный привес цыплят-бройлеров на 14% (результаты представлены в Таблица 2 на Фиг. 3),7 - increases the average daily weight gain of broiler chickens by 14% (the results are presented in Table 2 in Fig. 3),

8 - повышает усвояемость корма цыплят-бройлеров на 5.3% (результаты представлены в Таблица 2 на Фиг. 3). 8 - increases the digestibility of the feed of broiler chickens by 5.3% (the results are presented in Table 2 in Fig. 3).

Получено экспериментальное подтверждение возможности использования полученных липопептидов на основе вторичных метаболитов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в качестве профилактического средства для цыплят-бройлеров, обладающего антимикробной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий как с грамположительным морфотипом, так и грамотрицательным морфотипом, микромицетов и, как следствие, обеспечивающее высокий уровень эффективности для профилактики кишечных инфекций сельскохозяйственных птиц в отличие от прототипа.Experimental confirmation of the possibility of using the obtained lipopeptides based on secondary metabolites of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 as a prophylactic agent for broiler chickens with antimicrobial activity against pathogenic and opportunistic bacteria with both gram-positive morphotype and gram-negative morphotype has been obtained. , micromycetes and, as a result, providing a high level of efficiency for the prevention of intestinal infections of poultry, in contrast to the prototype .

При этом заявитель считает целесообразным обратить внимание на факт того, что в геноме заявленного штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 выявлены генетические детерминанты, ответственные за синтез нерибосомально синтезируемых липопептидов: сурфактина, итурина, бацилломицина и фенгицина, наличие которых в геноме бактерии доказывает способность бактерии синтезировать эти группы липопептидов в среду культивирования, указанное является доказательством полученным заявителем в результате выполнения экспериментальных работ по заявленному техническому решению. At the same time, the applicant considers it appropriate to pay attention to the fact that in the genome of the claimed strain B. subtilis MG-8 VKPM B-12476, genetic determinants responsible for the synthesis of nonribosomal synthesized lipopeptides: surfactin, iturin, bacillomycin and fengycin, the presence of which in the genome of bacteria proves the ability of the bacterium to synthesize these groups of lipopeptides in the cultivation medium, this is evidence obtained by the applicant as a result of experimental work on the claimed technical solution.

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «новизна», так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, приведенным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.The claimed technical solution satisfies the "novelty" patentability condition, since when determining the level of technology, no tool was found that has features that are identical (that is, matching in the function they perform and the form of these features) to all the features given in the claims, including the purpose characteristic .

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «изобретательский уровень», поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предполагаемого изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат. The claimed technical solution satisfies the "inventive step" patentability condition, since no technical solutions have been identified that have features that coincide with the distinctive features of the proposed invention, and the influence of the distinctive features on the specified technical result has not been established.

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «промышленная применимость» вследствие того, что осуществляется с использованием известных технических устройств, материалов и оборудования, его можно реализовать в сельскохозяйственном промышленном производстве, например - птицеводстве. Заявленное техническое решение обеспечивает профилактику, предупреждение массовых заболеваний сельскохозяйственных животных, ускоренное откармливание животных для обеспечения продовольственной безопасности, более детально обеспечивает снижение количества применяемых в птицеводстве антибиотиков в 2-3 раза, повышение среднесуточного привеса цыплят-бройлеров на 14%, повышение потребления корма цыплят-бройлеров на 5.3%, снижение себестоимости получаемого продукта (мясо птицы) на 5-10%, расширение арсенала средств используемых для профилактики и лечения кишечных инфекций.The claimed technical solution satisfies the condition of patentability "industrial applicability" due to the fact that it is carried out using known technical devices, materials and equipment, it can be implemented in agricultural industrial production, for example - poultry farming. The claimed technical solution provides prevention, prevention of mass diseases of farm animals, accelerated fattening of animals to ensure food security, in more detail provides a reduction in the number of antibiotics used in poultry farming by 2-3 times, an increase in the average daily weight gain of broiler chickens by 14%, an increase in feed consumption of chickens - broilers by 5.3%, reducing the cost of the resulting product (poultry meat) by 5-10%, expanding the arsenal of tools used for the prevention and treatment of intestinal infections.

Claims (2)

1. Способ получения профилактического средства – суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, заключающийся в том, что берут маннит – 26.2 г/л, соевую муку – 21.9 г/л, NaNO3 – 3.1 г/л, MnSO4 × 4H2O – 0.2 г/л при pH 7.5, автоклавируют при 121°C и 1 атм, при этом создают питательную среду; далее выполняют посев на питательную среду культуры B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, с получением 2%-й концентрации клеток штамма в питательной среде; далее выполняют культивирование клеток штамма в термостате-шейкере при температуре от + 37°С до + 42°C и интенсивности качания 200 об/мин в течение 96 часов, получают биомассу клеток штамма-продуцента бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют удаление клеток штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из полученной биомассы клеток, получают бесклеточную культуральную жидкость; далее выполняют выделение целевого продукта липопептидов из бесклеточной культуральной жидкости методом кислотного осаждения; далее выполняют высушивание и стерилизацию суммарной фракции липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476; далее выполняют фасовку целевого продукта и хранение полученной сухой фракции липопептидов до его использования по назначению. 1. Method for obtaining a prophylactic agent - the total fraction of lipopeptides of Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476 bacteria, which consists in taking mannitol - 26.2 g/l, soy flour - 21.9 g/l, NaNO3 - 3.1 g/l, MnSO4 × 4H2O – 0.2 g/L at pH 7.5, autoclaved at 121°C and 1 atm, while creating a nutrient medium; then perform seeding on the nutrient medium culture B. subtilis MG-8 VKPM B-12476, obtaining a 2% concentration of cells of the strain in the nutrient medium; then the cells of the strain are cultivated in a thermostat-shaker at a temperature from + 37°C to + 42°C and a swing intensity of 200 rpm for 96 hours, a biomass of cells of the strain-producer of bacteria B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 is obtained ; then perform the removal of cells of the strain B. subtilis MG-8 VKPM B-12476 from the obtained cell biomass, get a cell-free culture fluid; then perform the selection of the target product of lipopeptides from the cell-free culture fluid by acid precipitation; then perform drying and sterilization of the total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476; then, the target product is packed and the resulting dry fraction of lipopeptides is stored until it is used for its intended purpose. 2. Способ защиты сельскохозяйственных птиц от болезней, заключающийся в том, что вносят высушенную суммарную фракцию липопептидов бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, полученную способом по п.1, в полнорационный комбикорм в количестве от 10 до 50 мг на 1 кг корма в зависимости от возраста сельскохозяйственных птиц в течение периода откорма, перемешивают, проводят кормление птиц.2. A method for protecting poultry from diseases, which consists in adding the dried total fraction of lipopeptides of bacteria Bacillus subtilis MG-8 VKPM B-12476, obtained by the method according to claim 1, into a complete mixed feed in an amount of 10 to 50 mg per 1 kg feed, depending on the age of farm birds during the fattening period, mix, feed the birds.
RU2021118611A 2021-06-25 2021-06-25 Method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria bacillus subtilis mg-8 vkpm b-12476 and its use as a prophylactic against diseases of poultry RU2770481C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021118611A RU2770481C1 (en) 2021-06-25 2021-06-25 Method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria bacillus subtilis mg-8 vkpm b-12476 and its use as a prophylactic against diseases of poultry

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021118611A RU2770481C1 (en) 2021-06-25 2021-06-25 Method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria bacillus subtilis mg-8 vkpm b-12476 and its use as a prophylactic against diseases of poultry

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2770481C1 true RU2770481C1 (en) 2022-04-18

Family

ID=81212655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021118611A RU2770481C1 (en) 2021-06-25 2021-06-25 Method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria bacillus subtilis mg-8 vkpm b-12476 and its use as a prophylactic against diseases of poultry

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2770481C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2607526C2 (en) * 2009-11-23 2017-01-10 Кьюбист Фармасьютикалз ЭлЭлСи Lipopeptide composition and related methods
RU2663720C1 (en) * 2017-08-01 2018-08-08 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) Probiotic based on bacterial strain bacillus subtilis mg-8 vkpm v-12476 and method of application probiotic for prevention of gastrointestinal diseases in agricultural animals and poultry

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2607526C2 (en) * 2009-11-23 2017-01-10 Кьюбист Фармасьютикалз ЭлЭлСи Lipopeptide composition and related methods
RU2663720C1 (en) * 2017-08-01 2018-08-08 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) Probiotic based on bacterial strain bacillus subtilis mg-8 vkpm v-12476 and method of application probiotic for prevention of gastrointestinal diseases in agricultural animals and poultry

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WALAISIRI MUANGSIRI, The kinetic of the alkaline degradation of daptomycin, journal of pharmaceutical sciences, 2001, vol. 90, N.8, c.1066-1075. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Todorov et al. Bacteriocins of Gram-positive bacteria having activity spectra extending beyond closely-related species
Yang et al. Antimicrobial peptides produced by Brevibacillus spp.: structure, classification and bioactivity: a mini review
WO2019230183A1 (en) Lactic acid bacterium and use thereof
Ördög et al. Screening microalgae for some potentially useful agricultural and pharmaceutical secondary metabolites
Arunachalam et al. Studies on bioprospecting of endophytic bacteria from the medicinal plant of Andrographis paniculata for their antimicrobial activity and antibiotic susceptibility pattern
RU2313941C2 (en) Preparation for protecting plants against pathogens of agricultural crops and grape diseases with growth-stimulating effect, method for preparing this preparation and strains for its realization
AU2011365688C1 (en) Peptides with antimicrobial activity, drug compositions for the prophylaxis and treatment of animals, compositions for the prophylaxis and treatment of plants, uses of said peptides, and uses of Paenibacillus elgii ourofinensis extract
Agrawal Antimicrobial Activity of Nostoc calcicola (Cyanobacteria) isolated from central India against human pathogens
Tumbarski et al. Antimicrobial activity against some saprophytic and pathogenic microorganisms of Bacillus species strains isolated from natural spring waters in Bulgaria
KR101258692B1 (en) Weissella viridescens for the growth inhibiting of antibiotic resistant Staphylococcus aureus(MRSA)
KR101818859B1 (en) Pseudomonas azotoformans strain KACC 92125P and composition for comprising the same
Kumar et al. Fungal-derived xenobiotic exhibits antibacterial and antibiofilm activity against Staphylococcus aureus
RU2770481C1 (en) Method for obtaining the total fraction of lipopeptides of bacteria bacillus subtilis mg-8 vkpm b-12476 and its use as a prophylactic against diseases of poultry
KR20230079416A (en) Pseudomonas strains and their metabolites for controlling plant diseases
RU2398872C1 (en) Bacillus licheniformis BACTERIA STRAIN USED FOR MAKING PROBIOTIC SUPPLEMENT FEED USED FOR PRODUCING HIGH-QUALITY FODDER IMPROVING PERFORMANCE AND REDUCING RISK OF GASTROINTESTINAL DISTURBANCES IN ANIMALS, BIRDS AND FISHES
Dhinakaran et al. Antimicrobial potential of the marine sponge Sigmadocia pumila from the south eastern region of India
KR20210001106A (en) Bacillus subtilis BSC35 strain having antimicrobial activity and uses thereof
Babich et al. Structure and properties of antimicrobial peptides produced by antagonist microorganisms isolated from Siberian natural objects.
KR100915855B1 (en) Antimicrobial peptide KCM12 against phytopathogenic bacteria
KR100915852B1 (en) Antimicrobial peptide KCM11 against phytopathogenic bacteria
KR101970656B1 (en) Novel Streptomyces lienomycini DS620 Strain and Antimicrobial Composition Comprising Extract Thereof
RU2203947C1 (en) Strain of bacterium bacillus licheniformis used for preparing probiotic preparation designated for prophylaxis and treatment of gastroenteric diseases in animals, poultry and fishes
KR100879221B1 (en) Antimicrobial peptide krs22 against phytopathogenic bacteria
Merghache et al. Inhibitory effect of Quercus ilex wood ash on the growth of pathogenic microorganisms
Mfon PRODUCTION OF BACTERIOCIN USING LACTIC ACID BATERIAL ISOLATED FROM FERMENTED FUFU.