RU2770284C1 - Method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer - Google Patents

Method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer Download PDF

Info

Publication number
RU2770284C1
RU2770284C1 RU2021129117A RU2021129117A RU2770284C1 RU 2770284 C1 RU2770284 C1 RU 2770284C1 RU 2021129117 A RU2021129117 A RU 2021129117A RU 2021129117 A RU2021129117 A RU 2021129117A RU 2770284 C1 RU2770284 C1 RU 2770284C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
sample
tumor cells
circulating tumor
minutes
buffer
Prior art date
Application number
RU2021129117A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Ольга Евгеньевна Савельева
Любовь Александровна Таширева
Евгения Сергеевна Григорьева
Владимир Валерьевич Алифанов
Наталья Анатольевна Тарабановская
Сергей Владимирович Вторушин
Евгений Владимирович Денисов
Надежда Викторовна Чердынцева
Владимир Михайлович Перельмутер
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ)
Priority to RU2021129117A priority Critical patent/RU2770284C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2770284C1 publication Critical patent/RU2770284C1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine diagnostic methods.
SUBSTANCE: invention relates to diagnostic methods in medicine and can be used in oncology to determine circulating tumor cells in patients in order to determine the sensitivity of circulating tumor cells to chemotherapy and predict the likelihood of hematogenous metastases in breast cancer. The expression on nucleated cells of the common leukocyte marker CD45, epithelial markers CD326 (EpCAM) and pan-cytokeratin AE1/AE3 and erythrocyte marker CD235a (glycophorin A) is determined, for this a sample of EDTA-stabilized venous blood in a volume of 9 ml is taken in the morning on an empty stomach, the first ml blood samples are not taken, then, the population of circulating tumor cells (CTCs) is enriched using the negative selection method, polystyrene particles with adsorbed antibodies to CD45, CD66b and CD235a (glycophorin A) are added to the blood sample at a concentration of 50 mcl per 1 ml of blood and incubated at room temperature for 20 minutes, then the sample is diluted 1:1 with phosphate buffered saline, applied to a density gradient with p equal to 1.077 at a ratio of 1 part of the gradient and 2 parts of the diluted sample, then the samples are centrifuged at 1200g for 20 minutes, then 2/3 of the upper fraction is removed and the contents are collected rings at the gradient-plasma phase boundary, then the resulting cell suspension is washed in 3 ml of phosphate-buffered saline containing 5% fetal bovine serum by centrifugation at 300g for 10 minutes and twice at 110g for 10 minutes, the supernatant is removed, to the cell sediment add 150 µl of buffer, then the sample is divided into two parts: an unstained control sample in a volume of 50 μl and a colored sample in a volume of 100 mcl, 25 mcl of PerFix-nc Buffer 1 fixing buffer are added to both samples, mixed on a vortex and incubated for 15 minutes at 18-25°C, then 300 mcl of permeabilizing buffer PerFix-nc Buffer 2 is added, mixed on a vortex, antibodies anti-CD45-APC-Cy7 (clone HI30, mouse IgG1), anti-CD326 (EpCAM)-AF488 (clone 9C4 , mouse IgG2b), anti-pan-cytokeratin-AP647 (clone AE1/AE3, mouse IgG1) and anti-CD235a (glycophorin A)-PerCP-Cy5.5 (clone HI264, mouse IgG2a) are immediately added at the rate of 5 mcl of antibodies per 106 cells, then incubated in the dark for 20-30 minutes at 18-25°C, then 3 ml of PerFix-nc Buffer 3 are added to the samples and centrifuged at 300g for 6 minutes, the supernatant is removed, then 100 mcl of buffer are added to the samples , after which the entire volume of the sample obtained is analyzed on a flow cytometer, the signals of fluorescent labels are simultaneously detected: AF488, RegCP-Cy5.5, AF647, APC-Cy7, and the concentration of circulating tumor cells per 1 ml of whole blood is calculated using the following formula.
EFFECT: application of the invention provides an increase in the information content and sensitivity of the method.
1 cl, 2 ex, 2 dwg, 2 tbl

Description

Изобретение относится к диагностическим методам в медицине и может быть использовано в онкологии для определения циркулирующих опухолевых клеток у больных с целью определения чувствительности циркулирующих опухолевых клеток к химиотерапии и прогнозирования вероятности возникновения гематогенных метастазов при раке молочной железы.The invention relates to diagnostic methods in medicine and can be used in oncology to determine circulating tumor cells in patients in order to determine the sensitivity of circulating tumor cells to chemotherapy and predict the likelihood of hematogenous metastases in breast cancer.

В настоящее время существуют трудности в наиболее точном определении циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) чувствительных к химиотерапии для прогнозирования вероятности возникновения гематогенных метастазов при раке молочной железы. Известные методы определения ЦОК основаны на выявлении ЕрСАМ-позитивных клеток и не учитывают многообразную субпопуляцию ЕрСАМ-негативных циркулирующих опухолевых клеток в связи с чем не обладают достаточной специфичностью и не позволяют более точно идентифицировать пациентов, у которых действительно отсутствуют циркулирующие опухолевые клетки, что создаются трудности в персонифицированном подходе к лечению пациентов. Также, существует проблема доступности методов диагностики обусловленная необходимостью приобретения дополнительного дорогостоящего оборудования, что обуславливает выполнение исследований только на базе исследовательских и крупных лечебных учреждений.Currently, there are difficulties in the most accurate determination of circulating tumor cells (CTCs) sensitive to chemotherapy to predict the likelihood of hematogenous metastases in breast cancer. Known methods for determining CTCs are based on the detection of EpCAM-positive cells and do not take into account the diverse subpopulation of EpCAM-negative circulating tumor cells, and therefore do not have sufficient specificity and do not allow more accurate identification of patients who really do not have circulating tumor cells, which creates difficulties in personalized approach to patient care. Also, there is a problem of the availability of diagnostic methods due to the need to purchase additional expensive equipment, which leads to the implementation of studies only on the basis of research and large medical institutions.

Известно достаточно много методов выделения и исследования циркулирующих опухолевых клеток в крови онкологических больных.There are quite a lot of methods for isolating and studying circulating tumor cells in the blood of cancer patients.

В патенте US 8445225 В2 опубл. 21.05.2013 г. содержится информация о методе проведения анализа одной или нескольких циркулирующих опухолевых клеток, включая характеристику морфологии одной или нескольких циркулирующих опухолевых клеток посредством анализа изображений, при этом учитываются клетки только с мембранными эпителиальными маркерами.US Pat. No. 8,445,225 B2 publ. 05/21/2013 contains information on the method of analysis of one or more circulating tumor cells, including the characterization of the morphology of one or more circulating tumor cells through image analysis, while only cells with membrane epithelial markers are taken into account.

В патентной заявке WO 2017060784 А1 опубл. 13.04.2017 г. описан способ детекции циркулирующих опухолевых клеток с помощью системы, включающей механизм изоляции клеток по их размеру в диапазоне 12-40 мкм и подсчет клеток на основе электрического импеданса, при этом не учитывается их фенотип и в анализ не попадают циркулирующие опухолевые клетки меньшего и большего размера.In patent application WO 2017060784 A1 publ. On April 13, 2017, a method was described for detecting circulating tumor cells using a system that includes a mechanism for isolating cells by their size in the range of 12-40 μm and counting cells based on electrical impedance, while their phenotype is not taken into account and circulating tumor cells are not included in the analysis smaller and larger.

В описаниях изобретений по патентным заявкам US 6365362 B1 опубл. 02.04.2002, US 6623982 В1 опубл. 23.09.2003 г., US 7282350 В2 опубл. 16.10.2007 г., US 5993665 А опубл. 30.11.1999 г., US 6790366 В2 опубл. 14.09.2004 г. и US 6645731 В2 опубл. 11.11.2003 г. указаны способы использования CellSearch® System. В патентах US 5985153 А опубл. 16.11.1999 г., US 6660159 В1 опубл. 09.12.2003 г., US 6890426 В2 опубл. 10.05.2005 г., US 6136182 А опубл. 24.10.2004 г. имеется описание устройства, которое можно использовать для реализации системы CellSearch. Система CellSearch Circulating Tumor Cell system (Veridex LLC) основана на использовании комбинации иммуномагнитной маркировки ЕрСАМ и автоматизированной цифровой микроскопии для идентификации и подсчета количества редких циркулирующих опухолевых клеток с фенотипом DAPI+CK+CD45- в образце крови. Это система наряду с другими методами используется для оценки прогноза онкологического заболевания и позволяет предсказать выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость у пациентов с метастатическим раком молочной железы, колоректальным раком и раком простаты.In the descriptions of inventions according to patent applications US 6365362 B1 publ. 04/02/2002, US 6623982 B1 publ. September 23, 2003, US 7282350 B2 publ. 10/16/2007, US 5993665 A publ. 11/30/1999, US 6790366 B2 publ. 09/14/2004 and US 6645731 B2 publ. 11/11/2003 How to use the CellSearch® System. In US Pat. No. 5,985,153 A publ. 11/16/1999, US 6660159 B1 publ. 09.12.2003, US 6890426 B2 publ. 05/10/2005, US 6136182 A publ. On 10/24/2004, there is a description of a device that can be used to implement the CellSearch system. The CellSearch Circulating Tumor Cell system (Veridex LLC) uses a combination of EpCAM immunomagnetic labeling and automated digital microscopy to identify and enumerate rare circulating tumor cells with the DAPI+CK+CD45- phenotype in a blood sample. This system, along with other methods, is used to assess cancer prognosis and predict progression-free survival and overall survival in patients with metastatic breast cancer, colorectal cancer, and prostate cancer.

Известные аналоги имеют ряд существенных недостатков. Так, принцип выявления циркулирующих опухолевых клеток с помощью существующих методов основан на обнаружении клеток, экспрессирующих только мембранный домен CD326 (ЕрСАМ). Однако, известно, что молекула ЕрСАМ состоит из мембранного (ЕрЕХ) и внутриклеточного (EpICD) доменов. При наличии активационных сигналов происходит расщепление молекулы с шеддингом ЕрЕХ домена и высвобождением в цитоплазму EpICD домена (The Emerging Role of ЕрСАМ in Cancer and Stem Cell Signaling [Text] / Munz M., Baeuerle P.A., Gires O. // Cancer Research, Vol. 69: (14), July 15, 2009). При этом не определяются циркулирующие опухолевые клетки с внутриклеточным доменом, потерявшие мембранный ЕрЕХ домен, а также клетки негативные по экспрессии CD326 (ЕрСАМ), но экспрессирующие другие эпителиальные маркеры, например, цитокератины. При использовании имеющихся способов высока вероятность ложноотрицательных случаев, когда циркулирующие опухолевые клетки представлены только клетками, не экспрессирующими мембранный CD326 (ЕрСАМ), а также ложноположительных результатов вследствие интерференции попадающими в образец для анализа эритроцитами.Known analogues have a number of significant drawbacks. Thus, the principle of detecting circulating tumor cells using existing methods is based on the detection of cells expressing only the CD326 membrane domain (EpCAM). However, it is known that the EpCAM molecule consists of membrane (EpEX) and intracellular (EpICD) domains. In the presence of activation signals, the molecule is cleaved with shedding of the EpEX domain and release of the EpICD domain into the cytoplasm (The Emerging Role of EpCAM in Cancer and Stem Cell Signaling [Text] / Munz M., Baeuerle P.A., Gires O. // Cancer Research, Vol. 69: (14), July 15, 2009). At the same time, circulating tumor cells with an intracellular domain that have lost the membrane EpEX domain, as well as cells negative for CD326 expression (EpCAM), but expressing other epithelial markers, such as cytokeratins, are not detected. When using the available methods, there is a high probability of false-negative cases, when circulating tumor cells are represented only by cells that do not express membrane CD326 (EpCAM), as well as false-positive results due to interference from erythrocytes entering the sample for analysis.

Таким образом, известные способы обладают недостаточной точностью и информативностью вследствие ограниченного инструментария для детекции клеток.Thus, the known methods have insufficient accuracy and information content due to limited tools for cell detection.

Наиболее близким к предлагаемому, является выбранный в качестве прототипа, способ определения циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком молочной железы (RU 2522923 С1, опубл. 20.07.2014 г.). Способ описывает определение циркулирующих раковых клеток, чувствительных к адъювантной гормональной терапии, в крови больных раком молочной железы и включает выделение и обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител с магнитными метками, получение лизатов циркулирующих опухолевых клеток, извлечение мРНК из лизатов циркулирующих опухолевых клеток, получение кДНК, получение амплифицированной ДНК, определение экспрессии маркерных генов, при этом в случае наличия одного из маркеров GA733-2, MUC-1, HER2 делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток, и при обнаружении маркеров ESR1, PGR делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к гормональной терапии.Closest to the proposed is selected as a prototype method for determining circulating tumor cells in the blood of patients with breast cancer (RU 2522923 C1, publ. 20.07.2014). The method describes the determination of circulating cancer cells sensitive to adjuvant hormone therapy in the blood of breast cancer patients and includes the isolation and enrichment of circulating tumor cells using antibodies with magnetic labels, obtaining lysates of circulating tumor cells, extracting mRNA from lysates of circulating tumor cells, obtaining cDNA , obtaining amplified DNA, determining the expression of marker genes, in the case of the presence of one of the markers GA733-2, MUC-1, HER2, a conclusion is made about the presence of circulating tumor cells, and when ESR1 markers, PGR are detected, a conclusion is made about the presence of circulating tumor cells, sensitive to hormone therapy.

Недостатком данного способа является использование в качестве маркеров, по которым обогащают популяцию циркулирующих опухолевых клеток с помощью магнитных частиц, GA733-2, MUC-1, HER2. Указанные молекулы не являются обязательными для ЦОК. Известно, что при люминальном А и трижды-негативном подтипах опухолевые клетки не экспрессируют Her2neu. Независимо от молекулярного типа среди гетерогенной популяции циркулирующих опухолевых клеток может присутствовать значимая доля клеток, не экспрессирующих MUC1. Еще одним недостатком метода является отсутствие среди маркеров для выявления ЦОК цитокератинов, которые конститутивно присутствуют в эпителиальных клетках. Кроме того, поскольку в способе не проводится исключения CD45+ клеток возможно искажение результатов за счет костномозговых предшественников, которые могут экспрессировать эпителиальные маркеры (Bone Marrow-Derived Cells Contribute to the Maintenance of Thymic Stroma including Thymic Epithelial Cells [Text] / Shami Chakrabarti, Mohammed Hoque, Nawshin Zara Jamil, Varan J Singh, Neelab Meer, Mark T. Pezzano. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.29.319426v1). Ограничение на чувствительность данного метода накладывает и сама методика детекции ЦОК, поскольку для получения кДНК для проведения ПЦР требуется более одной клетки.The disadvantage of this method is the use as markers, which enrich the population of circulating tumor cells using magnetic particles, GA733-2, MUC-1, HER2. These molecules are not required for CSCs. It is known that in luminal A and triple-negative subtypes, tumor cells do not express Her2neu. Regardless of molecular type, among a heterogeneous population of circulating tumor cells, there may be a significant proportion of cells that do not express MUC1. Another disadvantage of the method is the absence of cytokeratins among the markers for the detection of CTCs, which are constitutively present in epithelial cells. In addition, since the method does not exclude CD45+ cells, it is possible to distort the results due to bone marrow progenitors that can express epithelial markers (Bone Marrow-Derived Cells Contribute to the Maintenance of Thymic Stroma including Thymic Epithelial Cells [Text] / Shami Chakrabarti, Mohammed Hoque , Nawshin Zara Jamil, Varan J Singh, Neelab Meer, Mark T. Pezzano, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.29.319426v1). The sensitivity of this method is also limited by the CTC detection technique itself, since more than one cell is required to obtain cDNA for PCR.

Новый технический результат - повышение информативности и чувствительности способа, повышение доступности диагностики.The new technical result is an increase in the information content and sensitivity of the method, an increase in the availability of diagnostics.

Для достижения нового технического результата в способе определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы, включающем выделение и обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител и последующую детекцию посредством определения экспрессии на них маркера эпителиальных клеток, определяют экспрессию общего лейкоцитарного маркера CD45, эпителиальных маркеров CD326 (ЕрСАМ) и пан-цитокератина АЕ1/АЕ3 и маркера эритроцитов CD235a (гликофорина А), для этого образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирают утром натощак, первый мл крови в исследование не берут, далее проводят обогащение популяции циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), для чего к образцу крови добавляют полистироловые частицы с сорбированными антителами к CD45, CD66b и CD235a (гликофорин А) в концентрации 50 мкл на 1 мл крови и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, затем образец разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером, наносят на градиент плотности с р=1.077 при соотношении 1 часть градиента и 2 части разбавленного образца, далее образцы центрифугируют при 1200g в течение 20 минут, затем удаляют 2/3 верхней фракции и собирают содержимое кольца на границе раздела фаз градиент-плазма, далее полученную клеточную суспензию отмывают в 3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки центрифугированием при 300g в течение 10 минут и дважды при 110g по 10 минут, супернатант удаляют, к клеточному осадку добавляют 150 мкл буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки и азида натрия, далее образец делят на две части: неокрашенную контрольную пробу в объеме 50 мкл и окрашенную пробу в объеме 100 мкл, в обе пробы добавляют по 25 мкл фиксирующего буфера, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 15 минут при 18-25°С, затем добавляют 300 мкл пермеабилизирующего буфера, перемешивают на вортексе, в пробы немедленно добавляют антитела анти-CD45-APC-Cy7 (клон HI30, мышиные IgG1), анти-CD326(EpCAM)-AF488 (клон 9С4, мышиные IgG2b), анти-пан-цитокератин-АР647 (клон АЕ1/АЕ3, мышиные IgG1) и анти-CD35а(гликофорин А)-PerСР-Су5.5 (клон HI264, мышиные IgG2a) из расчета 5 мкл антител на 106 клеток, инкубируют в темноте в течение 20-30 минут при 18-25°С, далее к образцам добавляют по 3 мл буфера PerFix-nc Buffer 3 и центрифугируют при 300g в течение 6 минут, супернатант удаляют, затем к пробам добавляют по 100 мкл буфера, после чего проводят детекцию путем анализа всего полученного объема образца на проточном цитометре, имеющем не менее двух лазеров и позволяющем одновременно детектировать сигналы флуоресцентных меток: AF488, PerCP-Cy5.5, AF647, АРС-Су7 и рассчитывают концентрацию циркулирующих опухолевых клеток на 1 мл цельной крови по следующей формуле:To achieve a new technical result in a method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer, including the isolation and enrichment of circulating tumor cells using antibodies and subsequent detection by determining the expression of an epithelial cell marker on them, the expression of the common leukocyte marker CD45, epithelial markers CD326 ( EpCAM) and pan-cytokeratin AE1/AE3 and erythrocyte marker CD235a (glycophorin A), for this, a sample of EDTA-stabilized venous blood in a volume of 9 ml is taken in the morning on an empty stomach, the first ml of blood is not taken for the study, then the population of circulating tumor cells is enriched ( CSC), for which polystyrene particles with adsorbed antibodies to CD45, CD66b and CD235a (glycophorin A) are added to the blood sample at a concentration of 50 μl per 1 ml of blood and incubated at room temperature for 20 minutes, then the sample is diluted 1:1 with phosphate- saline buffer, applied to a density gradient with p=1.077 at a ratio of 1 part of the gradient and 2 parts of the diluted sample, then the samples are centrifuged at 1200g for 20 minutes, then 2/3 of the upper fraction is removed and the contents of the ring are collected at the gradient-plasma interface, then the resulting cell suspension is washed in 3 ml of phosphate-buffered saline containing 5% fetal bovine serum by centrifugation at 300g for 10 minutes and twice at 110g for 10 minutes, the supernatant is removed, 150 μl of buffer containing 5% fetal bovine serum and sodium azide is added to the cell sediment, then the sample divided into two parts: an unstained control sample in a volume of 50 μl and a colored sample in a volume of 100 μl, 25 μl of fixing buffer are added to both samples, mixed on a vortex and incubated for 15 minutes at 18-25 ° C, then 300 μl are added permeabilizing buffer, vortexed, immediately add antibodies anti-CD45-APC-Cy7 (clone HI30, mouse IgG1), anti-CD326(EpCAM)-AF488 (clone 9C4, m murine IgG2b), anti-pan-cytokeratin-AP647 (clone AE1/AE3, mouse IgG1) and anti-CD35a(glycophorin A)-PerCP-Cy5.5 (clone HI264, mouse IgG2a) at the rate of 5 μl of antibodies per 10 6 cells , incubated in the dark for 20-30 minutes at 18-25°C, then add 3 ml of PerFix-nc Buffer 3 to the samples and centrifuge at 300g for 6 minutes, remove the supernatant, then add 100 µl of buffer to the samples , after which detection is carried out by analyzing the entire volume of the sample obtained on a flow cytometer with at least two lasers and allowing simultaneous detection of signals of fluorescent labels: AF488, PerCP-Cy5.5, AF647, APC-Cy7 and calculate the concentration of circulating tumor cells per 1 ml whole blood according to the following formula:

Figure 00000001
Figure 00000001

где А - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин - циркулирующих опухолевых клеток;where A is the number of CD45-CD235a-ErCAM+pan-cytokeratin - circulating tumor cells;

В - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;C - number of CD45-CD235a-ErCAM+pan-cytokeratin+circulating tumor cells;

С - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ-пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;C - number of CD45-CD235a-EpCAM-pan-cytokeratin + circulating tumor cells;

1,5 - коэффициент для учета деления анализируемого образца на 50 мкл (неокрашенный контроль) и 100 мкл (окрашенный образец);1.5 - coefficient for taking into account the division of the analyzed sample into 50 μl (unstained control) and 100 μl (stained sample);

8 - значение соответствует объему цельной крови, использованной для процедуры обогащения циркулирующих опухолевых клеток.8 - the value corresponds to the volume of whole blood used for the procedure of enrichment of circulating tumor cells.

Способ осуществляют следующим образом. Образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирают утром натощак, первый мл крови в исследование не берется для исключения попадания в образец клеток кожного эпителия. Для обогащения популяции ЦОК используют метод негативной селекции. К образцу крови добавляют полистироловые частицы с сорбированными антителами к CD45, CD66b и CD235a (гликофорин А) в концентрации 50 мкл на 1 мл крови и инкубируют при комнатной температуре 20 мин. Затем образец разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером, наносят на градиент плотности (р=1.077) в соотношении 1 часть градиента и 2 части разбавленного образца. Далее образцы центрифугируют при 1200g 20 мин без торможения. Затем удаляется 2/3 верхней фракции (тромбоцит-содержащей плазмы) и собирается кольцо на границе раздела фаз градиент-плазма. Далее полученную клеточную суспензию отмывают в 3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки, центрифугированием при 300g в течение 10 мин без торможения и дважды при 110g по 10 мин. Супернатант удаляют, к клеточному осадку добавляют 150 мкл буфера для окрашивания (Cell Staining Buffer).The method is carried out as follows. A sample of EDTA-stabilized venous blood in a volume of 9 ml is taken in the morning on an empty stomach, the first ml of blood is not taken into the study to exclude skin epithelial cells from entering the sample. To enrich the CSC population, the method of negative selection is used. Polystyrene particles with adsorbed antibodies to CD45, CD66b and CD235a (glycophorin A) are added to the blood sample at a concentration of 50 μl per 1 ml of blood and incubated at room temperature for 20 minutes. The sample is then diluted 1:1 with PBS, applied to a density gradient (p=1.077) at a ratio of 1 part gradient to 2 parts diluted sample. Next, the samples are centrifuged at 1200g for 20 min without braking. Then 2/3 of the upper fraction (platelet-containing plasma) is removed and a ring is collected at the gradient-plasma interface. Next, the resulting cell suspension is washed in 3 ml of phosphate-buffered saline containing 5% fetal bovine serum by centrifugation at 300g for 10 min without braking and twice at 110g for 10 min. The supernatant is removed and 150 μl of Cell Staining Buffer is added to the cell pellet.

Для дальнейшего исследования образец делят на две части: 50 мкл - неокрашенный контроль, 100 мкл - окрашенная проба. В пробу и контроль добавляют по 25 мкл фиксирующего буфера PerFix-nc Buffer 1, перемешивают на вортексе и инкубируют 15 мин при 18-25°С. Затем добавляют 300 мкл пермеабилизирующего буфера PerFix-nc Buffer 2, перемешивают на вортексе, в пробу немедленно добавляют антитела анти-CD45-АРС-Су7 (клон HI30, мышиные IgG1), анти-CD326(EpCAM)-AF488 (клон 9С4, мышиные IgG2b), анти-пан-цитокератин-АР647 (клон АЕ1/АЕ3, мышиные IgG1) и анти-CD235а(гликофорин А)-PerСР-Су5.5 (клон HI264, мышиные IgG2a) из расчета 5 мкл антител на 106 клеток. Инкубируют в темноте 20-30 мин при 18-25°С. Далее к образцам добавляют по 3 мл буфера PerFix-nc Buffer 3 и центрифугируют при 300g в течение 6 мин. Супернатант удаляют, к окрашенной пробе и неокрашенному контролю добавляют по 100 мкл буфера для окрашивания (Cell Staining Buffer), весь полученный объем образца анализируют на проточном цитометре, оснащенном как минимум 2 лазерами, позволяющем одновременно детектировать сигналы следующих флуоресцентных меток: AF488, PerСР-Су5.5, AF647, АРС-Су7. Рассчитывают концентрацию циркулирующих опухолевых клеток на 1 мл цельной крови по следующей формуле:For further research, the sample is divided into two parts: 50 µl - unstained control, 100 µl - stained sample. 25 µl of fixing buffer PerFix-nc Buffer 1 are added to the sample and control, mixed on a vortex and incubated for 15 min at 18-25°C. Then add 300 µl of permeabilizing buffer PerFix-nc Buffer 2, mix on a vortex, immediately add antibodies anti-CD45-APC-Cy7 (clone HI30, mouse IgG1), anti-CD326(EpCAM)-AF488 (clone 9C4, mouse IgG2b ), anti-pan-cytokeratin-AP647 (clone AE1/AE3, mouse IgG1) and anti-CD235a(glycophorin A)-PerCP-Cy5.5 (clone HI264, mouse IgG2a) at the rate of 5 μl of antibodies per 10 6 cells. Incubate in the dark for 20-30 min at 18-25°C. Next, 3 ml of PerFix-nc Buffer 3 are added to the samples and centrifuged at 300g for 6 min. The supernatant is removed, 100 µl of Cell Staining Buffer is added to the stained sample and the unstained control, the entire sample volume obtained is analyzed on a flow cytometer equipped with at least 2 lasers, which allows simultaneous detection of the signals of the following fluorescent labels: AF488, PerCP-Cy5 .5, AF647, ARS-Su7. Calculate the concentration of circulating tumor cells per 1 ml of whole blood using the following formula:

Figure 00000002
Figure 00000002

где А - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин - циркулирующих опухолевых клеток;where A is the number of CD45-CD235a-ErCAM+pan-cytokeratin - circulating tumor cells;

В - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;C - number of CD45-CD235a-ErCAM+pan-cytokeratin+circulating tumor cells;

С - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ-пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;C - number of CD45-CD235a-EpCAM-pan-cytokeratin + circulating tumor cells;

1,5 - коэффициент для учета деления анализируемого образца на 50 мкл (неокрашенный контроль) и 100 мкл (окрашенный образец);1.5 - coefficient for taking into account the division of the analyzed sample into 50 μl (unstained control) and 100 μl (stained sample);

8 - значение соответствует объему цельной крови, использованной для процедуры обогащения циркулирующих опухолевых клеток.8 - the value corresponds to the volume of whole blood used for the procedure of enrichment of circulating tumor cells.

Использование клона антител 9С4 позволяет выявлять циркулирующие опухолевые клетки, экспрессирующие как мембранный домен CD326 (ЕрСАМ) - ЕрЕХ, так и внутриклеточный домен EpICD.The use of the 9C4 antibody clone makes it possible to detect circulating tumor cells expressing both the CD326 membrane domain (EpCAM), EpEX, and the intracellular EpICD domain.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.The essence of the proposed method is illustrated by the following examples.

Пример 1. Больная Ш., 57 лет с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Стадия заболевания IIВ. Состояние менструальной функции - менопауза. Степень злокачественности - II. Размер первичного опухолевого узла составляет 2 см. С целью определения ЦОК проведено исследование согласно предлагаемому способу. Образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирали утром натощак, первый мл крови в исследовании не использовали. Популяции ЦОК обогащали согласно приведенной выше методике. Полученный образец окрашивали коктейлем антител и анализировали с помощью метода проточной цитометрии (Фигура 1). Анализ показал отсутствие CD45-CD235a-EpCAM+panCK-, CD45-CD235a-EpCAM+panCK+, CD45-CD235a-EpCAM-panCK+ популяций ЦОК. Использование методов, основанных на определении только ЕрСАМ-позитивных ЦОК также не позволило обнаружить ЦОК у данной больной.Example 1. Patient Sh., aged 57, with invasive carcinoma of a nonspecific type of breast. Stage of the disease IIB. The state of menstrual function is menopause. The degree of malignancy - II. The size of the primary tumor node is 2 cm. In order to determine the CTC, a study was conducted according to the proposed method. A 9 ml sample of EDTA-stabilized venous blood was taken in the morning on an empty stomach; the first ml of blood was not used in the study. CTC populations were enriched according to the above method. The resulting sample was stained with an antibody cocktail and analyzed by flow cytometry (Figure 1). The analysis showed the absence of CD45-CD235a-EpCAM+panCK-, CD45-CD235a-EpCAM+panCK+, CD45-CD235a-EpCAM-panCK+ CTC populations. The use of methods based on the detection of only EpCAM-positive CTCs also did not allow us to detect CTCs in this patient.

Пример 2. Больная Ж., 65 лет с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Стадия заболевания IIВ. Состояние менструальной функции -менопауза. Степень злокачественности - II. Размер первичного опухолевого узла составляет 2,5 см. С целью определения ЦОК проведено исследование согласно предлагаемому способу (Фигура 2). Подсчет количества циркулирующих опухолевых клеток в 1 мл цельной крови рассчитывали согласно формуле, указанной выше:Example 2 Patient Zh., aged 65, with invasive carcinoma of a nonspecific type of breast. Stage of the disease IIB. The state of the menstrual function is menopause. The degree of malignancy - II. The size of the primary tumor node is 2.5 cm. In order to determine the CTC, a study was conducted according to the proposed method (Figure 2). The count of the number of circulating tumor cells in 1 ml of whole blood was calculated according to the formula above:

Figure 00000003
Figure 00000003

Таким образом, предлагаемый метод позволил детектировать 6,19 ЦОК в 1 мл цельной крови больной Ж. Использование имеющихся методов, основанных на определении только ЕрСАМ-позитивных ЦОК позволило обнаружить у данной больной только 0,83 ЦОК в 1 мл цельной крови.Thus, the proposed method made it possible to detect 6.19 CTCs in 1 ml of whole blood of patient G. The use of available methods based on the determination of only EpCAM-positive CTCs made it possible to detect only 0.83 CTCs in this patient in 1 ml of whole blood.

Предлагаемый способ основан на анализе данных протоколов цитометрической оценки популяционного состава ЦОК образцов периферической крови больных раком молочной железы.The proposed method is based on the analysis of data from protocols for cytometric assessment of the population composition of CTCs in peripheral blood samples of patients with breast cancer.

Изучались образцы крови от 58 пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Средний возраст больных составил 55,1±10,8 лет. Для выявления преимуществ предлагаемого метода наличие и количество ЦОК определяли двумя способами: основанным на методе CellSearch (по детекции только CD45 и EpCam), и предлагаемым спосорбом (по детекции CD45, EpCam и цитокератина).Blood samples from 58 patients with invasive carcinoma of a nonspecific type of breast were studied. The mean age of the patients was 55.1±10.8 years. To identify the advantages of the proposed method, the presence and amount of CTCs were determined in two ways: based on the CellSearch method (by detecting only CD45 and EpCam), and by the proposed sposorb (by detecting CD45, EpCam, and cytokeratin).

Частота выявления ЦОК была сопоставима (табл. 1), в то время как предлагаемым способом выявлялось в 2,5 раза больше ЦОК (табл. 2). Используя метод Блэнда-Алтмана (Altaian DG, Bland JM. Measurement in medicine: the analysis of method comparison studies. Statistician. 1983; 32: 307-17. 10.2307/2987937), позволяющего сравнить результаты измерений, выполненных двумя методами, было показано, что методы плохо согласуются. Средняя разность между измерениями равна - 66,11 (ДИ95% от -269,9 до 137,7), что говорит об наличии систематического расхождения в измерениях (р<0,05). Был рассчитан коэффициент корреляции между значениями количества ЦОК, полученными двумя разными методами (R2=0.1999 (95%ДИ 0.6238-0,1898). Таким образом, измерения, полученные обоими способами, не сопоставимы и преимущество имеет новый предлагаемый метод, который демонстрирует в 2,5 раза более высокую эффективность обнаружения ЦОК. Повышение специфичности и чувствительности анализа достигается за счет исключения из анализа эритроцитов, обломков клеток и CD45-позитивных клеток. Циркулирующие опухолевые клетки, определенные предлагаемым способом, являются наиболее репрезентативным объектом для протеомных и генетических исследований.The frequency of detection of CTCs was comparable (Table 1), while the proposed method revealed 2.5 times more CTCs (Table 2). Using the Bland-Altman method (Altaian DG, Bland JM. Measurement in medicine: the analysis of method comparison studies. Statistician. 1983; 32: 307-17. 10.2307/2987937), which makes it possible to compare the results of measurements performed by two methods, it was shown that that the methods do not agree well. The mean difference between measurements is -66.11 (95% CI -269.9 to 137.7), which indicates the presence of a systematic discrepancy in the measurements (p<0.05). The correlation coefficient between the values of the number of CTCs obtained by two different methods was calculated (R 2 = 0.1999 (95% CI 0.6238-0.1898). Thus, the measurements obtained by both methods are not comparable and the new proposed method has the advantage, which demonstrates in 2.5 times higher detection efficiency of CTCs.The increase in the specificity and sensitivity of the analysis is achieved by excluding erythrocytes, cell debris and CD45-positive cells from the analysis.Circulating tumor cells, determined by the proposed method, are the most representative object for proteomic and genetic studies.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет обнаружить, с чувствительностью 1 клетка, циркулирующие опухолевые клетки и обеспечивает значительное увеличение вероятности обнаружения циркулирующих опухолевых клеток, повышает точность измерений и чувствительность методов анализа, а также эффективность диагностики при работе с больными раком молочной железы для оценки прогноза и эффективности терапии.Thus, the proposed method makes it possible to detect, with a sensitivity of 1 cell, circulating tumor cells and provides a significant increase in the probability of detecting circulating tumor cells, improves measurement accuracy and sensitivity of analysis methods, as well as diagnostic efficiency when working with breast cancer patients to assess prognosis and effectiveness therapy.

ПриложениеAppendix

Фигура 1. Результат цитометрического исследования образца цельной крови больной Ш. после проведения обогащения популяций ЦОКFigure 1. The result of a cytometric study of a whole blood sample of patient Sh. after enrichment of CTC populations

Фигура 2. Результат цитометрического исследования образца цельной крови больной Ж.Figure 2. The result of a cytometric study of a whole blood sample of patient G.

Таблица 1 - Частота обнаружения ЦОК при применении двух тактик гейтирования у больных РМЖTable 1 - The frequency of detection of CTCs when using two gating tactics in patients with breast cancer

Таблица 2 - Количество ЦОК при применении двух тактик гейтирования у больных РМЖTable 2 - The number of CTCs when using two gating tactics in patients with breast cancer

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Claims (7)

Способ определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы, включающий выделение и обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител и последующую детекцию посредством определения экспрессии на них маркера эпителиальных клеток, отличающийся тем, что определяют экспрессию общего лейкоцитарного маркера CD45, эпителиальных маркеров CD326 (ЕрСАМ) и пан-цитокератина АЕ1/АЕ3 и маркера эритроцитов CD235a (гликофорина А), для этого образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирают утром натощак, первый мл крови в исследование не берут, далее проводят обогащение популяции циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), для этого к образцу крови добавляют полистироловые частицы с сорбированными антителами к CD45, CD66b и CD235a (гликофорин А) в концентрации 50 мкл на 1 мл крови и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, затем образец разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером, наносят на градиент плотности с р=1.077 при соотношении 1 часть градиента и 2 части разбавленного образца, далее образцы центрифугируют при 1200g в течение 20 минут, затем удаляют 2/3 верхней фракции и собирают содержимое кольца на границе раздела фаз градиент-плазма, далее полученную клеточную суспензию отмывают в 3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки, центрифугированием при 300g в течение 10 минут и дважды при 110g по 10 минут, супернатант удаляют, к клеточному осадку добавляют 150 мкл буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки и азида натрия, далее образец делят на две части: неокрашенную контрольную пробу в объеме 50 мкл и окрашенную пробу в объеме 100 мкл, в обе пробы добавляют по 25 мкл фиксирующего буфера, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 15 минут при 18-25°С, затем добавляют 300 мкл пермеабилизирующего буфера, перемешивают на вортексе, в пробы немедленно добавляют антитела анти-CD45-APC-Cy7 (клон HI30, мышиные IgG1), анти-CD326(EpCAM)-AF488 (клон 9С4, мышиные IgG2b), анти-пан-цитокератин-АР647 (клон АЕ1/АЕ3, мышиные IgG1) и анти-CD235а(гликофорин А)-РегСР-Су5.5 (клон HI264, мышиные IgG2a) из расчета 5 мкл антител на 106 клеток, инкубируют в темноте в течение 20-30 минут при 18-25°С, далее к образцам добавляют по 3 мл буфера PerFix-nc Buffer 3 и центрифугируют при 300g в течение 6 минут, супернатант удаляют, затем к пробам добавляют по 100 мкл буфера, после чего проводят детекцию путем анализа всего полученного объема образца на проточном цитометре, имеющем не менее двух лазеров и позволяющем одновременно детектировать сигналы флуоресцентных меток: AF488, PerCP-Cy5.5, AF647, АРС-Су7, и рассчитывают концентрацию циркулирующих опухолевых клеток на 1 мл цельной крови по следующей формуле:A method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer, including the isolation and enrichment of circulating tumor cells using antibodies and subsequent detection by determining the expression of an epithelial cell marker on them, characterized in that the expression of the common leukocyte marker CD45, epithelial markers CD326 (EpCAM) is determined and pan-cytokeratin AE1 / AE3 and erythrocyte marker CD235a (glycophorin A), for this, a sample of EDTA-stabilized venous blood in a volume of 9 ml is taken in the morning on an empty stomach, the first ml of blood is not taken for the study, then the population of circulating tumor cells (CTC) is enriched , for this, polystyrene particles with adsorbed antibodies to CD45, CD66b and CD235a (glycophorin A) are added to the blood sample at a concentration of 50 μl per 1 ml of blood and incubated at room temperature for 20 minutes, then the sample is diluted 1:1 with phosphate-buffered saline , applied to the density gradient with p=1.077 at a ratio of 1 part of the gradient and 2 parts of the diluted sample, then the samples are centrifuged at 1200g for 20 minutes, then 2/3 of the upper fraction is removed and the contents of the ring are collected at the gradient-plasma interface, then the resulting cell suspension is washed in 3 ml of phosphate-buffered saline, containing 5% fetal bovine serum, by centrifugation at 300g for 10 minutes and twice at 110g for 10 minutes, the supernatant is removed, 150 μl of buffer containing 5% fetal bovine serum and sodium azide is added to the cell sediment, then the sample is divided into two parts: an unstained control sample in a volume of 50 μl and a colored sample in a volume of 100 μl, 25 μl of fixing buffer are added to both samples, mixed on a vortex and incubated for 15 minutes at 18-25°C, then 300 μl of permeabilizing buffer are added, mixed on vortex, immediately add antibodies anti-CD45-APC-Cy7 (clone HI30, mouse IgG1), anti-CD326(EpCAM)-AF488 (clone 9C4, mouse IgG2b), anti-panc itokeratin-AP647 (clone AE1 / AE3, mouse IgG1) and anti-CD235a (glycophorin A)-RegCP-Cy5.5 (clone HI264, mouse IgG2a) at the rate of 5 μl of antibodies per 10 6 cells, incubated in the dark for 20- 30 minutes at 18-25°C, then 3 ml of PerFix-nc Buffer 3 are added to the samples and centrifuged at 300g for 6 minutes, the supernatant is removed, then 100 µl of buffer is added to the samples, after which detection is carried out by analyzing the entire of the obtained sample volume on a flow cytometer with at least two lasers and allowing simultaneous detection of signals of fluorescent labels: AF488, PerCP-Cy5.5, AF647, APC-Cy7, and the concentration of circulating tumor cells per 1 ml of whole blood is calculated using the following formula:
Figure 00000006
Figure 00000006
 где А - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин-циркулирующих опухолевых клеток;where A is the number of CD45-CD235a-EpCAM+pan-cytokeratin-circulating tumor cells; В - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ+пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;C - number of CD45-CD235a-ErCAM+pan-cytokeratin+circulating tumor cells; С - количество CD45-CD235а-ЕрСАМ-пан-цитокератин+циркулирующих опухолевых клеток;C - number of CD45-CD235a-EpCAM-pan-cytokeratin + circulating tumor cells; 1,5 - коэффициент для учета деления анализируемого образца на 50 мкл (неокрашенный контроль) и 100 мкл (окрашенный образец);1.5 - coefficient for taking into account the division of the analyzed sample into 50 μl (unstained control) and 100 μl (stained sample); 8 - значение соответствует объему цельной крови, использованной для процедуры обогащения циркулирующих опухолевых клеток.8 - the value corresponds to the volume of whole blood used for the procedure of enrichment of circulating tumor cells.
RU2021129117A 2021-10-05 2021-10-05 Method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer RU2770284C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021129117A RU2770284C1 (en) 2021-10-05 2021-10-05 Method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021129117A RU2770284C1 (en) 2021-10-05 2021-10-05 Method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2770284C1 true RU2770284C1 (en) 2022-04-15

Family

ID=81255510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021129117A RU2770284C1 (en) 2021-10-05 2021-10-05 Method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2770284C1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072269A1 (en) * 1998-02-12 2004-04-15 Rao Galla Chandra Labeled cell sets for use as functional controls in rare cell detection assays
RU2522923C1 (en) * 2012-10-23 2014-07-20 Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Московский Физико-Технический Институт (Государственный Университет)" Integrated method for detecting circulating tumour cells in blood of patients suffering from breast cancer
WO2019231567A1 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 Crititech, Inc. Methods for isolating tumor-specific immune cells from a subject for adoptive cell therapy and cancer vaccines

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072269A1 (en) * 1998-02-12 2004-04-15 Rao Galla Chandra Labeled cell sets for use as functional controls in rare cell detection assays
RU2522923C1 (en) * 2012-10-23 2014-07-20 Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Московский Физико-Технический Институт (Государственный Университет)" Integrated method for detecting circulating tumour cells in blood of patients suffering from breast cancer
WO2019231567A1 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 Crititech, Inc. Methods for isolating tumor-specific immune cells from a subject for adoptive cell therapy and cancer vaccines

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E. В. Кайгородова и др. Наличие в крови различных популяций циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы до лечения: связь с пятилетней безметастатической выживаемостью. Сибирский онкологический журнал. Том 19, N 6, 2020. *
E. В. Кайгородова и др. Наличие в крови различных популяций циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы до лечения: связь с пятилетней безметастатической выживаемостью. Сибирский онкологический журнал. Том 19, N 6, 2020. Айбатова И. С. Выпускная квалификационная работа бакалавра. ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСКРИПТОМА ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МОНОЦИТОВ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. Томск, 2020, 72с. The Emerging Role of ЕрСАМ in Cancer and Stem Cell Signaling [Text] / Munz M., Baeuerle P.A., Gires O. // Cancer Research, Vol. 69: (14), July 15, 2009. Kasimir-Bauer S. et al. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 2012 Jan 20;14(1): R15. *
Kasimir-Bauer S. et al. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 2012 Jan 20;14(1): R15. *
The Emerging Role of ЕрСАМ in Cancer and Stem Cell Signaling [Text] / Munz M., Baeuerle P.A., Gires O. // Cancer Research, Vol. 69: (14), July 15, 2009. *
Айбатова И. С. Выпускная квалификационная работа бакалавра. ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСКРИПТОМА ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МОНОЦИТОВ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. Томск, 2020, 72с. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Catenacci et al. Acquisition of portal venous circulating tumor cells from patients with pancreaticobiliary cancers by endoscopic ultrasound
KR101604649B1 (en) Automated enumeration and characterization of circulating melanoma cells in blood
Müller et al. Circulating tumor cells in breast cancer: correlation to bone marrow micrometastases, heterogeneous response to systemic therapy and low proliferative activity
CA2861437C (en) Methods for detecting 5t4-positive circulating tumor cells and methods of diagnosis of 5t4-positive cancer in a mammalian subject
US6960449B2 (en) Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids and methods of use
Watanabe et al. Circulating tumor cells expressing cancer stem cell marker CD44 as a diagnostic biomarker in patients with gastric cancer
JP5889883B2 (en) A method for predicting the clinical outcome of melanoma patients using circulating melanoma cells in the blood.
Kularatne et al. Monitoring tumour cells in the peripheral blood of small cell lung cancer patients
CN103792364A (en) Reagent for detection of ROR1 protein of circulating tumor cells in peripheral blood and application thereof
Donnenberg et al. KIT (CD117) expression in a subset of non-small cell lung carcinoma (NSCLC) patients
CN111665357A (en) Extranodal nasal NK/T cell lymphoma prognosis marker, application thereof, prognosis prediction model and construction method thereof
Borgen et al. A European interlaboratory testing of three well‐known procedures for immunocytochemical detection of epithelial cells in bone marrow. Results from analysis of normal bone marrow
KR101922322B1 (en) Detection method and detection device for circulating tumor cell
Woroniecka et al. Flow cytometric identification of tumor-infiltrating lymphocytes from glioblastoma
RU2770284C1 (en) Method for determining circulating tumor cells in patients with breast cancer
Hauswirth et al. Expression of cell surface antigens on mast cells: mast cell phenotyping
AU2003260389B2 (en) Method for the immunocytological or molecular detection of disseminated tumor cells in a body fluid and kit that is suitable therefor
WO2011058509A1 (en) Method and kit for the prevention and/or the monitoring of chemioresistance of leukaemia forms
Oklu et al. Relationship between hepatocellular carcinoma circulating tumor cells and tumor volume
KR102195212B1 (en) Kit for diagnosis of breast cancer by circulating tumor cell detection and analysis
JP2012506048A (en) A preclinical method for monitoring continuous changes in circulating breast cancer cells in mice
JP2021183958A (en) Method for detecting tumor cells of epithelial marker negative
Hauswirth et al. Indolent systemic mastocytosis associated with atypical small lymphocytic lymphoma: a rare form of concomitant lymphoproliferative disease
KR20210147994A (en) Method for isolating and culturing circulating tumor cells
Scarffe et al. Colchicine ultrasensitivity of peripheral-blood lymphocytes from patients with non-Hodgkin's lymphoma