RU2769567C1 - Technology for creating t-cell resistance to hiv-1 based on genetically encoded gpi-anchored peptides from gp41 - Google Patents
Technology for creating t-cell resistance to hiv-1 based on genetically encoded gpi-anchored peptides from gp41 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2769567C1 RU2769567C1 RU2020142800A RU2020142800A RU2769567C1 RU 2769567 C1 RU2769567 C1 RU 2769567C1 RU 2020142800 A RU2020142800 A RU 2020142800A RU 2020142800 A RU2020142800 A RU 2020142800A RU 2769567 C1 RU2769567 C1 RU 2769567C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- peptide
- hiv
- sequence
- cxcr4
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title description 11
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 title description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 11
- 101150066398 CXCR4 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims abstract 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 70
- 102000013135 CD52 Antigen Human genes 0.000 claims description 15
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 4
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 28
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 28
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 7
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 6
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 4
- QBEPTBMRQALPEV-MNXVOIDGSA-N Lys-Ile-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QBEPTBMRQALPEV-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 4
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 4
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- GAHJXEMYXKLZRQ-AJNGGQMLSA-N Lys-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O GAHJXEMYXKLZRQ-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 3
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 3
- WSOKZUVWBXVJHX-CIUDSAMLSA-N Asp-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WSOKZUVWBXVJHX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 108010032976 Enfuvirtide Proteins 0.000 description 2
- GQZDDFRXSDGUNG-YVNDNENWSA-N Gln-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GQZDDFRXSDGUNG-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N Glu-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- BKMOHWJHXQLFEX-IRIUXVKKSA-N Glu-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O BKMOHWJHXQLFEX-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QYZYJFXHXYUZMZ-UGYAYLCHSA-N Ile-Asn-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N QYZYJFXHXYUZMZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- XGUAUKUYQHBUNY-SWRJLBSHSA-N Thr-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XGUAUKUYQHBUNY-SWRJLBSHSA-N 0.000 description 2
- CZWIHKFGHICAJX-BPUTZDHNSA-N Trp-Glu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 CZWIHKFGHICAJX-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- OBAMASZCXDIXSS-SZMVWBNQSA-N Trp-Glu-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N OBAMASZCXDIXSS-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N Tyr-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- PEASPLKKXBYDKL-FXEVSJAOSA-N enfuvirtide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(C)=O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PEASPLKKXBYDKL-FXEVSJAOSA-N 0.000 description 2
- 229960002062 enfuvirtide Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940125777 fusion inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- CMLGVVWQQHUXOZ-GHCJXIJMSA-N Asn-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CMLGVVWQQHUXOZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- XQQVCUIBGYFKDC-OLHMAJIHSA-N Asn-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XQQVCUIBGYFKDC-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- PQAIOUVVZCOLJK-FXQIFTODSA-N Asn-Gln-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PQAIOUVVZCOLJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QYXNFROWLZPWPC-FXQIFTODSA-N Asn-Glu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QYXNFROWLZPWPC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000002702 GPI-Linked Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010043685 GPI-Linked Proteins Proteins 0.000 description 1
- TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N Gln-Asn-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PNENQZWRFMUZOM-DCAQKATOSA-N Gln-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PNENQZWRFMUZOM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MAGNEQBFSBREJL-DCAQKATOSA-N Gln-Glu-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MAGNEQBFSBREJL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YHOJJFFTSMWVGR-HJGDQZAQSA-N Glu-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YHOJJFFTSMWVGR-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- DAHLWSFUXOHMIA-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Gln Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O DAHLWSFUXOHMIA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asn-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JVWPPCWUDRJGAE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FMVLWTYYODVFRG-BQBZGAKWSA-N Gly-Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN FMVLWTYYODVFRG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- CMNMPCTVCWWYHY-MXAVVETBSA-N Ile-His-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N CMNMPCTVCWWYHY-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N Ile-His-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-DKIMLUQUSA-N Ile-Phe-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XLXPYSDGMXTTNQ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N Ile-Phe-Leu Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HGFGEMSVBMCFKK-MNXVOIDGSA-N Leu-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HGFGEMSVBMCFKK-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- JFSGIJSCJFQGSZ-MXAVVETBSA-N Leu-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N JFSGIJSCJFQGSZ-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- YAWKHFKCNSXYDS-XIRDDKMYSA-N Met-Glu-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N YAWKHFKCNSXYDS-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- XLTSAUGGDYRFLS-UMPQAUOISA-N Met-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N)O XLTSAUGGDYRFLS-UMPQAUOISA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- HPECNYCQLSVCHH-BZSNNMDCSA-N Phe-Cys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N HPECNYCQLSVCHH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- GRVMHFCZUIYNKQ-UFYCRDLUSA-N Phe-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GRVMHFCZUIYNKQ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 description 1
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YMEXHZTVKDAKIY-GHCJXIJMSA-N Ser-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(O)=O YMEXHZTVKDAKIY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- SNVIOQXAHVORQM-WDSKDSINSA-N Ser-Gly-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SNVIOQXAHVORQM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HEUVHBXOVZONPU-BJDJZHNGSA-N Ser-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HEUVHBXOVZONPU-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- TUUXFNQXSFNFLX-XIRDDKMYSA-N Trp-Met-Glu Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N TUUXFNQXSFNFLX-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108010059722 Viral Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108010038279 peptide C34 Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
- C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
- C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии и клеточных технологий. Изобретение потенциально может быть использовано для лечения ВИЧ.The invention relates to the fields of molecular biology, virology and cell technology. The invention can potentially be used to treat HIV.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019 и при финансовой поддержке РФФИ по соглашению 18-29-07052.The work was financially supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation under Agreement No. 075-15-2019-1661 of October 31, 2019 and with the financial support of the Russian Foundation for Basic Research under agreement 18-29-07052.
Уровень техникиState of the art
Выбор gp41-зависимого слияния в качестве мишени для противовирусной терапии.Selection of gp41-dependent fusion as a target for antiviral therapy.
В терапии вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) широко используются пептидные ингибиторы слияния. Они препятствуют последнему этапу проникновения ВИЧ в клетку-мишень за счет блокирования образования шестиспирального пучка, который участвует в слиянии вирусной и клеточной мембраны. In the treatment of human immunodeficiency virus (HIV), peptide fusion inhibitors are widely used. They prevent the last stage of HIV penetration into the target cell by blocking the formation of a six-helix bundle, which is involved in the fusion of the viral and cell membranes.
Первым одобренным препаратом этой группы стал Энфувиртид (Lalezari et al., 2003), короткий пептид из С-концевого гептадного повтора gp41 (С-пептид). Этот препарат обладает рядом недостатков, включая появление резистентных штаммов ВИЧ и развитием побочных эффектов у пациентов.Enfuvirtide (Lalezari et al., 2003), a short peptide from the C-terminal heptad repeat of gp41 (C-peptide), was the first approved drug in this group. This drug has a number of disadvantages, including the emergence of resistant strains of HIV and the development of side effects in patients.
После его одобрения эта сфера науки стала активно развиваться, появилось большое количество исследований. Однако ни один из опубликованных растворимых пептидов (US2005089840A1, WO2016171980A1) не может полностью и пожизненно защитить клетки от инфицирования.After his approval, this area of science began to develop actively, a large number of studies appeared. However, none of the published soluble peptides (US2005089840A1, WO2016171980A1) can completely protect cells from infection for life.
Вследствие этого начали появляться системы доставки пептида на мембрану клетки-мишени.As a result, systems for delivering the peptide to the membrane of the target cell began to appear.
Описан метод экспонирования пептидного ингибитора слияния на мембране в контексте хемокинового корецептора ВИЧ CXCR4 (Lesli et al., 2016), при котором слияние пептида с рецептором происходит через связку из двух аминокислот, лейцина и лизина, а в качестве способа доставки ингибитора используется лентивирусный вектор. Ведутся клинические испытания.A method for exposing a peptide fusion inhibitor on a membrane in the context of the HIV chemokine co-receptor CXCR4 is described (Lesli et al., 2016), in which the fusion of the peptide with the receptor occurs through a linkage of two amino acids, leucine and lysine, and a lentiviral vector is used as the inhibitor delivery method. Clinical trials are underway.
Также описан способ доставки пептида 2P23 на поверхность мембраны в контексте GPI-заякоренного белка (Xiaoran et al., 2019), однако описанная конструкция имеет больший размер, в качестве способа доставки предлагается только лентивирусный вектор. Заякоривание ингибитора слияния 2P23 на клеточной мембране может полностью блокировать инфекцию ВИЧ-1 и группы мутантов, устойчивых к энфувиртиду. Связанный с мембраной 2P23 эффективно блокирует инфекцию ВИЧ и делает CD4+ Т-клетки устойчивыми к заражению вирусом.A method for delivering the 2P23 peptide to the membrane surface in the context of a GPI-anchored protein is also described (Xiaoran et al., 2019), however, the described construct is larger, and only a lentiviral vector is proposed as a delivery method. Anchoring the 2P23 fusion inhibitor to the cell membrane can completely block infection by HIV-1 and enfuvirtide-resistant mutants. Membrane-bound 2P23 effectively blocks HIV infection and renders CD4+ T cells resistant to virus infection.
В 2019 году в нашей лаборатории была разработана система доставки эпитопных тагов на мембрану, позволяющая быстро изолировать клетки с CRISPR/Cas9-индуцированной целевой генетической модификацией методом иммунофлюоресценции и клеточной сортировки. При этом было выявлено, что наиболее короткой и эффективной конструкцией является GPI-заякоренный белок CD52, куда между сигналом экспорта и сигналом GPI-заякоривания была вставлена последовательность эпитопного тага Flag или HA (Zotova et al., 2019). Мы модифицировали экспонируемую последовательность эпитопного тага в системе доставки путем замены ее на последовательность одного из С-пептидов, ингибирующих слияние ВИЧ с клеточной мембраной, и, таким образом, придали системе не только возможность селекции редактированных клеток, но и обеспечили устойчивость модифицированных клеток к заражению ВИЧ различной тропности. In 2019, our laboratory developed a system for delivering epitope tags to the membrane, which allows for the rapid isolation of cells with CRISPR/Cas9-induced targeted genetic modification by immunofluorescence and cell sorting. It was found that the shortest and most efficient construct is the GPI-anchored CD52 protein, where the Flag or HA epitope tag sequence was inserted between the export signal and the GPI-anchoring signal (Zotova et al., 2019). We modified the exposed sequence of the epitope tag in the delivery system by replacing it with the sequence of one of the C-peptides inhibiting the fusion of HIV with the cell membrane, and thus made the system not only capable of selecting edited cells, but also ensured the resistance of the modified cells to HIV infection. various tropes.
Чтобы добиться наиболее высокой эффективности, нами разработана технология, позволяющая экспонировать на мембране одновременно два пептида и проводить селекцию клеток по двум защитным пептидам.To achieve the highest efficiency, we have developed a technology that makes it possible to expose two peptides on the membrane simultaneously and to select cells by two protective peptides.
Разработанная технология позволяет получать популяции клеток, невосприимчивых к инфицированию ВИЧ, внося минимальные внетаргетные изменения в геном нативной клетки за счет использования рибонуклеопротеинового (RNP) комплекса нуклеазы Cas9 с направляющей (гидовой) РНК. Благодаря малому размеру встраиваемой генетической конструкции, предлагаемая нами технология имеет ряд преимуществ. Во-первых, процесс наработки донорной ДНК является экономичным. Во-вторых, более эффективной оказывается доставка конструкции в клетки и ее интеграция по механизму гомологичной рекомбинации. Совместимость технологии с разными системами редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 и других позволяет легко адаптировать ее к последним разработкам в этой области.The developed technology makes it possible to obtain cell populations immune to HIV infection by introducing minimal off-target changes in the native cell genome through the use of the ribonucleoprotein (RNP) complex of Cas9 nuclease with guide (guide) RNA. Due to the small size of the embedded genetic construct, the proposed technology has a number of advantages. First, the process of producing donor DNA is economical. Second, delivery of the construct to cells and its integration by the mechanism of homologous recombination is more efficient. The compatibility of the technology with different genome editing systems based on CRISPR/Cas9 and others makes it easy to adapt it to the latest developments in this area.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention
Настоящее изобретение представляет собой технологию генотерапии ВИЧ, при которой защитный пептид из gp41 доставляется на поверхность плазматической мембраны клетки - мишени за счет внесения кодирующей его нуклеотидной последовательности в геном с помощью CRISPR/Cas9 в составе генетической конструкции, представляющей собой белок CD52, между двумя частями которого (сигналом экспорта белка и сигналом GPI-заякоривания) встроен целевой пептид, либо путем слияния целевого пептида с N-концом CXCR4.The present invention is a technology for HIV gene therapy, in which a protective peptide from gp41 is delivered to the surface of the plasma membrane of a target cell by introducing a nucleotide sequence encoding it into the genome using CRISPR/Cas9 as part of a genetic construct, which is a CD52 protein, between the two parts of which (protein export signal and GPI anchoring signal) the target peptide is inserted, either by fusion of the target peptide to the N-terminus of CXCR4.
В альтернативном варианте доставка генетической конструкции, представляющей собой белок CD52, между двумя частями которого (сигналом экспорта белка и сигналом заякоривания) встроен целевой пептид, осуществляется с помощью лентивирусного вектора. Alternatively, delivery of a genetic construct representing the CD52 protein, between the two parts of which (the protein export signal and the anchoring signal) the target peptide is inserted, is carried out using a lentiviral vector.
Для осуществления изобретения в клетки вводится три компонента: нуклеаза Cas9, гидовая РНК (gRNA) и донорная ДНК. Гидовая РНК направляет Cas9 на определенное место в геноме. Донорная ДНК содержит целевую генетическую конструкцию и плечи гомологии, окружающие место встраивания, и служит матрицей для гомологичной рекомбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения направленное редактирование можно осуществлять путем трансфекции кодирующими Cas9 и gRNA плазмидами (например, pcDNA3.3-hCas9 (Addgene #41815)), в других вариантах осуществления изобретения - с помощью комплекса RNP, включающего рекомбинантный белок Cas9 в комплексе с gRNA, полученной путем транскрипции in vitro.To implement the invention, three components are introduced into cells: Cas9 nuclease, guide RNA (gRNA) and donor DNA. Guide RNA directs Cas9 to a specific location in the genome. The donor DNA contains the target genetic construct and homology arms surrounding the insertion site and serves as a template for homologous recombination. In one of the embodiments of the invention, targeted editing can be performed by transfection with Cas9 and gRNA coding plasmids (for example, pcDNA3.3-hCas9 (Addgene #41815)), in other embodiments of the invention - using the RNP complex, including the recombinant Cas9 protein in complex with gRNA obtained by in vitro transcription.
В одном варианте осуществления изобретения целевая генетическая конструкция, закодированная в донорной ДНК, основана на последовательности GPI-заякоренного белка CD52. SEQ ID № 1 или 2 являются сигналом экспорта белка. SEQ ID № 3 служит сигналом для мембранного заякоривания конструкции. Между SEQ ID № 1/2 и № 3 находится последовательность, кодирующая один из защитных пептидов из gp41 (SEQ ID № 4-9). Такая конструкция доставляет пептид на поверхность клетки в специфическую зону - липидный рафт, где локализуются рецептор CD4 и корецепторы CCR5 и CXCR4, распознаваемые ВИЧ и используемые им для проникновения в клетку. Пептид, экспонируемый на поверхности клетки, взаимодействует с N-концевым гептадным повтором gp41 вирусного белка слияния, и препятствует образованию шестиспирального пучка, таким образом, защищая клетку от проникновения ВИЧ (фиг. 1А).In one embodiment of the invention, the target genetic construct encoded in the donor DNA is based on the sequence of the GPI-anchored CD52 protein. SEQ ID No. 1 or 2 is a protein export signal. SEQ ID No. 3 serves as a signal for membrane anchoring of the construct. Between SEQ ID No. 1/2 and No. 3 is a sequence encoding one of the protective peptides from gp41 (SEQ ID No. 4-9). This design delivers the peptide to the cell surface in a specific zone - the lipid raft, where the CD4 receptor and co-receptors CCR5 and CXCR4 are localized, recognized by HIV and used by it to penetrate the cell. The peptide exposed on the cell surface interacts with the N-terminal gp41 heptad repeat of the viral fusion protein and prevents the formation of a six-stranded bundle, thus protecting the cell from HIV entry (Fig. 1A).
В другом варианте осуществления изобретения пептид из gp41, слитый с N-концом корецептора CXCR4, действует по такому же принципу, препятствуя образованию шестиспирального пучка (фиг. 1Б).In another embodiment of the invention, a peptide from gp41 fused to the N-terminus of the CXCR4 co-receptor acts in the same way to prevent the formation of a six-stranded bundle (Fig. 1B).
Наибольшую эффективность в качестве защитных пептидов в конструкциях проявили С34, MT-C34, HP23L, 2p23, nHP23L и n2p23 (SEQ ID № 4-9 соответственно).C34, MT-C34, HP23L, 2p23, nHP23L, and n2p23 were the most effective as protective peptides in constructs (SEQ ID nos. 4-9, respectively).
Настоящее изобретение также предлагает способы эффективной доставки целевых генетических конструкций на мембрану клетки:The present invention also provides methods for the efficient delivery of targeted genetic constructs to the cell membrane:
- встраивание в геном посредством CRISPR/Cas9 под эндогенный промотор, например, гена CXCR4, для которого подобрана gRNA (SEQ ID № 10), донорная ДНК включает в себя 5’ и 3’ плечи гомологии SEQ ID № 11 и 12 соответственно, между которыми заключена целевая последовательность CD52-пептид, после которой стоит последовательность Р2А (SEQ ID № 13), позволяющая рибосоме пропускать образование ковалентной связи между глицином и пролином, иначе говоря, позволяющей получить с одной РНК раздельную трансляцию пептида и белка CXCR4 (фиг. 2А);- insertion into the genome by means of CRISPR/Cas9 under an endogenous promoter, for example, the CXCR4 gene, for which gRNA (SEQ ID No. 10) is selected, the donor DNA includes 5' and 3' homology arms of SEQ ID No. 11 and 12, respectively, between which the target CD52-peptide sequence is enclosed, followed by the P2A sequence (SEQ ID No. 13), which allows the ribosome to skip the formation of a covalent bond between glycine and proline, in other words, allows one to obtain separate translation of the peptide and CXCR4 protein from one RNA (Fig. 2A);
- слияние пептида с N-концом хемокинового рецептора CXCR4 (фиг. 1Б) с помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9. При этом для нацеливания Cas9 используется гидовая РНК (SEQ ID № 10), донорская ДНК в этом случае включает в себя 5’ и 3’ плечи гомологии SEQ ID № 11 и 12 соответственно, между которыми расположен один из целевых пептидов (SEQ ID № 5, 6-9, фиг. 2Б). В этом случае непосредственно после трансляции пептида начинается трансляция CXCR4, что приводит к слиянию пептида с его N-концом.- fusion of the peptide to the N-terminus of the chemokine receptor CXCR4 (Fig. 1B) using the CRISPR/Cas9 genomic editing system. In this case, guide RNA (SEQ ID No. 10) is used to target Cas9, donor DNA in this case includes the 5' and 3' homology arms of SEQ ID No. 11 and 12, respectively, between which one of the target peptides is located (SEQ ID No. 5 , 6-9, Fig. 2B). In this case, immediately after translation of the peptide, translation of CXCR4 begins, which leads to the fusion of the peptide with its N-terminus.
Поскольку имеется возможность внесения модификации в два аллеля гена, то одновременно можно экспрессировать на поверхности клетки два пептида из gp41, в том числе сочетая в клетке слитый с корецептором и заякоренный на мембране пептиды, два слитых с корецептором или два заякоренных пептида. Для этого при внесении конструкций в клетку при электропорации используется одновременно две донорные ДНК, представленные на фиг. 2, в соотношении 1:1. Since it is possible to make modifications to two alleles of the gene, it is possible to simultaneously express two peptides from gp41 on the cell surface, including combining peptides fused with the coreceptor and anchored on the membrane, two fused with the coreceptor, or two anchored peptides in the cell. To do this, when constructs are introduced into a cell during electroporation, two donor DNAs are used simultaneously, shown in Fig. 2, in a ratio of 1:1.
В качестве слитых с корецептором пептидов могут быть использованы, но не ограничиваются ими, MT-C34, HP23L, 2p23, nHP23L и n2p23 (SEQ ID № 5, 6-9 соответственно).As co-receptor fusion peptides, MT-C34, HP23L, 2p23, nHP23L, and n2p23 can be used, but are not limited to (SEQ ID Nos. 5, 6-9, respectively).
В качестве заякоренного на мембране может быть использованы, но не ограничиваются им, MT-C34 (SEQ ID № 5).As a membrane anchor, MT-C34 (SEQ ID No. 5) can be used, but is not limited to.
Высокую эффективность показало сочетание заякоренного пептида MT-С34 и 2р23 или HP23L, слитого с CXCR4.The combination of the anchored MT-C34 peptide and 2p23 or HP23L fused to CXCR4 showed high efficiency.
Для осуществления альтернативного варианта доставки генетической конструкции, представляющей собой белок CD52, между двумя частями которого встроен целевой пептид C34, MT-C34, HP23L, 2p23, nHP23L и n2p23 (SEQ ID № 4-9 соответственно), используется лентивирусный вектор (фиг. 3А). Для облегчения сортировки клеток, несущих целевую конструкцию, в вектор внесена последовательность флюоресцирующего белка mClover, разделенного с целевой конструкцией последовательностью Р2А. Такая система позволяет осуществлять трансляцию mClover и защитную конструкцию с одной матричной РНК. Благодаря этому трансдуцированные клетки флюоресцируют и могут быть отсортированы.For an alternative delivery of the genetic construct, which is the CD52 protein, between the two parts of which the target peptide C34, MT-C34, HP23L, 2p23, nHP23L and n2p23 is inserted (SEQ ID no. 4-9, respectively), a lentiviral vector is used (Fig. 3A ). To facilitate sorting of cells carrying the target construct, the sequence of the fluorescent protein mClover, separated from the target construct by the P2A sequence, was introduced into the vector. This system allows translation of mClover and a protection construct from a single messenger RNA. Due to this, the transduced cells fluoresce and can be sorted.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фигура 1. Схема расположения защитных пептидов на поверхности клеточной мембраны: А - в контексте GPI-заякоренного белка CD52, Б - слитый с N-концом белка CXCR4.Figure 1. Scheme of the location of protective peptides on the surface of the cell membrane: A - in the context of the GPI-anchored CD52 protein, B - fused to the N-terminus of the CXCR4 protein.
Фигура 2. Схемы последовательностей, используемых в качестве донорных ДНК для внесения целевых мутаций: А - защитный пептид из gp41 в контексте GPI-заякоренного белка CD52 встраивается перед CXCR4 через P2A, Б - пептид сливается с N-концом CXCR4.Figure 2. Schemes of sequences used as donor DNA to introduce target mutations: A - a protective peptide from gp41 in the context of the GPI-anchored CD52 protein is inserted before CXCR4 through P2A, B - the peptide is fused to the N-terminus of CXCR4.
Фигура 3. Схема лентивирусного вектора, используемого для внесения защитного пептида из gp41 в контексте GPI-заякоренного белка CD52 с возможностью сортировки клеток, несущих целевую мутацию по зеленому флюоресцентному белку mClover (A), а также вектора, который используется в качестве матрицы для ПЦР-амплификации донорной ДНК (Б).Figure 3. Scheme of a lentiviral vector used to introduce a protective peptide from gp41 in the context of the GPI-anchored CD52 protein with the ability to sort cells carrying a target mutation in the green fluorescent protein mClover (A), as well as a vector that is used as a template for PCR- donor DNA amplification (B).
Фигура 4. Примеры иммунофлюоресцентного окрашивания клеточных линий, несущих пептид, ингибирующий проникновение ВИЧ: А - клеточные линии, полученные путем лентивирусной трансдукции на основе HEK293T/CD4/R5 с пептидами С34 и MT-C34, HP23L Б - клеточные линии, полученные путем лентивирусной трансдукции на основе Raji/CD4/R5 с пептидами C34 и MT-C34. В - клеточные линии, полученные на основе CEM/R5 путем CRISPR/Cas9-опосредованного биаллельного нокина пептидов 2P23, слитого с CXCR4, и MT-C34, экспрессирующегося в липидных рафтах отдельно от CXCR4.Figure 4. Examples of immunofluorescent staining of cell lines carrying a peptide that inhibits HIV entry: A - cell lines obtained by lentiviral transduction based on HEK293T/CD4/R5 with peptides C34 and MT-C34, HP23L B - cell lines obtained by lentiviral transduction based on Raji/CD4/R5 with peptides C34 and MT-C34. B - cell lines derived from CEM/R5 by CRISPR/Cas9-mediated biallelic knockin of peptides 2P23 fused to CXCR4 and MT-C34 expressed in lipid rafts separately from CXCR4.
Фигура 5. Графическое представление результатов инфекционных тестов: А - Инфекция свободными вирусными частицами на клетках HEK293T/CD4/R5/peptide, Б - тест на межклеточную инфекцию от Raji к Raji/CD4/R5/peptide, В - тест на межклеточную инфекцию от Raji к CEM/R5/peptide. Figure 5. Graphical representation of the results of infection tests: A - Infection with free viral particles on HEK293T/CD4/R5/peptide cells, B - Intercellular infection test from Raji to Raji/CD4/R5/peptide, C - Intercellular infection test from Raji to CEM/R5/peptide.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Пример 1. Получение клеточных линий, несущих целевые конструкции, с помощью CRISPR/Cas9 и исследование эффективностиExample 1 Generation of Cell Lines Carrying Target Constructs with CRISPR/Cas9 and Efficacy Study
На основе клеточной линии CD4+ лимфобластов CEM-CCRF (CEM) была получена сублиния клеток CEM/R5, чувствительных к инфицированию ВИЧ-1 разной тропности за счет экспрессии молекул CD4, CCR5 и CXCR4, одна из которых была превнесена путем лентивирусной трансдукции CCR5-экспрессирующей конструкции.Based on the CEM-CCRF (CEM) CD4+ lymphoblast cell line, a subline of CEM/R5 cells was obtained that are susceptible to infection with HIV-1 of different tropism due to the expression of CD4, CCR5, and CXCR4 molecules, one of which was introduced by lentiviral transduction of a CCR5-expressing construct. .
На основе этой сублинии путем нокина были получены клеточные линии, несущие целевые конструкции с пептидом. Для этого использовали электропорацию с помощью прибора Neon Thermo Fisher в режиме, рекомендуемом производителем.Based on this subline, cell lines carrying the target constructs with the peptide were obtained by knockin. For this, electroporation was used using a Neon Thermo Fisher device in the mode recommended by the manufacturer.
Смесь для электропорации включала следующие компоненты:The electroporation mixture included the following components:
- pcDNA3.3-hCas9 (Addgene #41815) - плазмида, кодирующая Cas9 дикого типа;- pcDNA3.3-hCas9 (Addgene #41815) - plasmid encoding wild-type Cas9;
- вектор pKS gRNA BB, экспрессирующий гидовую РНК, в состав которого включена gRNA SEQ ID №11;- pKS gRNA BB vector expressing guide RNA, which includes gRNA SEQ ID No. 11;
- матрица-донор, полученный путем амплификации ПЦР, и представляющий собой последовательность, описанную выше (фиг. 2).- donor template obtained by PCR amplification, and representing the sequence described above (Fig. 2).
Получение ПЦР-донора: Obtaining a PCR donor:
ПЦР- доноры получены методом, описанным ранее Мазуровым Д.В. (Мазуров, 2020). В качестве матрицы для ПЦР выступают лентивирусные векторы (фиг. 3Б), несущие целевой пептид. В качестве праймеров использовались последовательности SEQ ID № 14-23, содержащие плечи гомологии (Таблица 1).PCR donors were obtained by the method described earlier by D.V. Mazurov. (Mazurov, 2020). Lentiviral vectors (Fig. 3B) carrying the target peptide serve as templates for PCR. As primers, sequences of SEQ ID nos. 14-23 containing homology arms were used (Table 1).
Таблица 1 Table 1
3’-CXCR4start-in: SEQ ID № 155'-CXCR4start-in: SEQ ID NO: 14
3'-CXCR4start-in: SEQ ID NO: 15
3’-CXCR4start-in: SEQ ID № 155'-CXCR4start-in: SEQ ID NO: 14
3'-CXCR4start-in: SEQ ID NO: 15
3’-CXCR4start-in: SEQ ID № 155'-CXCR4start-in: SEQ ID NO: 14
3'-CXCR4start-in: SEQ ID NO: 15
3’-MT34-X4-in: SEQ ID № 175'-MT34-X4-in: SEQ ID No. 16
3'-MT34-X4-in: SEQ ID No. 17
3’-2P23-X4-in: SEQ ID № 195'-2P23-X4-in: SEQ ID No. 18
3'-2P23-X4-in: SEQ ID No. 19
3’-HP23L -X4-in: SEQ ID № 215'-HP23L-X4-in: SEQ ID No. 20
3'-HP23L-X4-in: SEQ ID No. 21
3’-n2P23-X4-in:
use 3’-2P23-X4-in (SEQ ID № 19)5'-n2P23-X4-in: SEQ ID NO:22
3'-n2P23-X4-in:
use 3'-2P23-X4-in (SEQ ID No. 19)
3’-nHP23L -X4-in:
use 3’-HP23L-X4-in (SEQ ID № 21)5'-nHP23L-X4-in: SEQ ID NO:23
3'-nHP23L-X4-in:
use 3'-HP23L-X4-in (SEQ ID No. 21)
Амплификация проводилась при следующем режиме: Amplification was carried out in the following mode:
Описанным способом были получены клеточные линии с пептидом в контексте CD52: CEM/R5/MT34-CD52, слитым с CXCR4: CEM/R5/MT34-fusion, CEM/R5/2p23-fusion, CEM/R5/HP23L-fusion, CEM/R5/n2p23-fusion, CEM/R5/nHP23L-fusion и клеточные линии с биаллельным нокином: CEM/R5/MT34-CD52/2p23-fusion, CEM/R5/MT34-fusion/2p23-fusion, CEM/R5/MT34-CD52/HP23L-fusion, CEM/R5/MT34-fusion/HP23L-fusion (фиг. 4В). Сортировка клеток с целевой конструкцией проводилась путем иммунофлюоресцентного окрашивания. В качестве первичных антител были использованы антитела к соответствующим пептидам, полученные в нашей лаборатории; в качестве вторичных антител использовались коммерческие антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой. Выделение клеток с целевой конструкцией проводилось методом FACS - сортировки до достижения чистоты культуры не менее 98%. Using the described method, cell lines were obtained with a peptide in the context of CD52: CEM/R5/MT34-CD52 fused with CXCR4: CEM/R5/MT34-fusion, CEM/R5/2p23-fusion, CEM/R5/HP23L-fusion, CEM/ R5/n2p23-fusion, CEM/R5/nHP23L-fusion and biallelic knockin cell lines: CEM/R5/MT34-CD52/2p23-fusion, CEM/R5/MT34-fusion/2p23-fusion, CEM/R5/MT34- CD52/HP23L-fusion, CEM/R5/MT34-fusion/HP23L-fusion (FIG. 4B). Sorting of cells with the target construct was carried out by immunofluorescent staining. Antibodies to the corresponding peptides obtained in our laboratory were used as primary antibodies; commercial antibodies conjugated with a fluorescent label were used as secondary antibodies. Isolation of cells with the target construct was carried out by FACS - sorting to achieve a culture purity of at least 98%.
С помощью RNP была получена клеточная линия CEM/R5/MT34-CD52/2p23-fusion-RNP путем электропорации клеток CEM/R5. Смесь для электропорации включала:Using RNP, the CEM/R5/MT34-CD52/2p23-fusion-RNP cell line was obtained by electroporation of CEM/R5 cells. The electroporation mixture included:
- белок RNP-gRNA - RNP-gRNA protein
- ПЦР-донор, включающий пептид МТ34, соответствующий схеме фиг. 2А- PCR donor including the MT34 peptide corresponding to the scheme of FIG. 2A
- ПЦР-донор, включающий пептид 2р23, соответствующий схеме фиг. 2Б- PCR donor including the 2p23 peptide according to the scheme of FIG. 2B
Использовался режим, рекомендованный Neon Thermo Fisher. The mode recommended by Neon Thermo Fisher was used.
Для исследования эффективности работы внесенных в клетку генетических конструкций, были проведены инфекционные тесты на межклеточную передачу с вирусами ВИЧ с разным тропизмом.To study the effectiveness of the genetic constructs introduced into the cell, infectious tests for intercellular transmission with HIV viruses with different tropisms were carried out.
Для этого клетки Raji электропорировали с помощью прибора Neon Thermo Fisher, используя рекомендуемый производителем режим. Смесь для электропорации включала плазмиды pUCHR-inLuc-mR, pCMV-d8.2R и одним из энвелопов: NL4-3, JRFL или ZM135. Через 6 часов электропорированные клетки смешивали с тестируемыми клетками CEM/R5/peptide в соотношении 2:1. Все результаты были получены в трех независимых экспериментах. Проведенные инфекционные тесты показали, что технология эффективно защищает клетки от проникновения ВИЧ (фиг. 5В). To do this, Raji cells were electroporated using a Neon Thermo Fisher instrument using the manufacturer's recommended regimen. The electroporation mixture included plasmids pUCHR-inLuc-mR, pCMV-d8.2R and one of the envelops: NL4-3, JRFL or ZM135. After 6 hours, the electroporated cells were mixed with the tested CEM/R5/peptide cells in a ratio of 2:1. All results were obtained in three independent experiments. Conducted infection tests showed that the technology effectively protects cells from HIV penetration (Fig. 5B).
Благодаря совместимости технологии с разными системами на основе CRISPR/Cas9, технология легко адаптируема в соответствии с последними разработками в этой области.Due to the compatibility of the technology with different systems based on CRISPR/Cas9, the technology is easily adaptable in accordance with the latest developments in this area.
Пример 2. Внесение целевой конструкции в клетку с помощью лентивирусного вектора и исследование эффективностиExample 2 Introducing Target Construct into a Cell Using a Lentiviral Vector and Efficiency Study
Для осуществления альтернативного варианта внесения конструкции в клетку на основе клеточных линий HEK293T и Raji были получены линии, чувствительные к инфицированию ВИЧ разной тропности - HEK293T/CD4/R5 и Raji/CD4/R5, экспрессирующие CD4, CCR5 и CXCR4, где CD4 и CCR5 были экзогенными и стабильно интегрированы с помощью лентивирусного вектора. Затем на их основе с помощью лентивирусного вектора, были получены клеточные линии, несущие на мембране один из GPI-заякоренных пептидов: HEK293T/CD4/R5/С34, HEK293T/CD4/R5/MT-C34, HEK293T/CD4/R5/MT-C34-R, HEK293T/CD4/R5/HP23L, HEK293T/CD4/R5/2p23 (фиг. 4А); Raji/CD4/R5/C34, Raji/CD4/R5/MT-C34, Raji/CD4/R5/HP23L, Raji/CD4/R5/2p23, Raji/CD4/R5nHP23L и Raji/CD4/R5n2p23 (фиг. 4Б).To implement an alternative option for introducing a construct into a cell, based on the HEK293T and Raji cell lines, lines were obtained that are susceptible to HIV infection of different tropisms - HEK293T/CD4/R5 and Raji/CD4/R5, expressing CD4, CCR5 and CXCR4, where CD4 and CCR5 were exogenous and stably integrated with a lentiviral vector. Then, on their basis, using a lentiviral vector, cell lines carrying one of the GPI-anchored peptides on the membrane were obtained: HEK293T/CD4/R5/С34, HEK293T/CD4/R5/MT-C34, HEK293T/CD4/R5/MT- C34-R, HEK293T/CD4/R5/HP23L, HEK293T/CD4/R5/2p23 (Fig. 4A); Raji/CD4/R5/C34, Raji/CD4/R5/MT-C34, Raji/CD4/R5/HP23L, Raji/CD4/R5/2p23, Raji/CD4/R5nHP23L, and Raji/CD4/R5n2p23 (Fig. 4B) .
Для это этого были получены лентивирусные псевдочастицы путем липофектной трансфекции HEK293T тремя плазмидами: pUCHR-mClover-P2A-CDpeptide52, содержащей последовательность целевого пептида в контексте CD52 (фиг. 3А), pCMVΔ8.2R - упаковочной плазмиды ВИЧ (Addgene # 12263) и pCMV-VSV-G (Addgene # 8454), экспрессирующей белок оболочки G вируса везикулярного стоматита. После трансфекции клетки инкубировали в течении 48 часов, после чего супернатант собирали и добавляли к клеточным линиям HEK293T/CD4/R5 и Raji/CD4/R5 в дозе, необходимой для получения не более чем 30% клеток с целевой конструкцией. Клетки с целевой конструкцией сортировали по mClover до достижения чистоты культуры не менее 98%. To do this, lentiviral pseudoparticles were obtained by lipofective transfection of HEK293T with three plasmids: pUCHR-mClover-P2A-CDpeptide52 containing the sequence of the target peptide in the context of CD52 (Fig. 3A), pCMVΔ8.2R - HIV packaging plasmid (Addgene # 12263) and pCMV- VSV-G (Addgene # 8454) expressing the G coat protein of vesicular stomatitis virus. After transfection, the cells were incubated for 48 hours, after which the supernatant was collected and added to the HEK293T/CD4/R5 and Raji/CD4/R5 cell lines at a dose required to obtain no more than 30% of cells with the target construct. Cells with the target construct were sorted by mClover until a culture purity of at least 98% was achieved.
Для оценки степени защиты клеток от ВИЧ, полученные клетки были проанализированы в одноцикловом псевдовирусном тесте. На клетках HEK293T/CD4/R5/peptide были поставлены инфекционные тесты с выделенными вирусными частицами. Для этого были наработаны псевдовирусные частицы, покрытые одним из трех оболочечных белков ВИЧ-1: CXCR4 - тропный NL4-3 и CCR5 - тропные JRFL и ZM-135. Клетки HEK293T были трансфицированы с помощью реагента Lipofectamine 2000 (ThermoFisher) в соответствии с инструкцией производителя тремя плазмидами: pUCHR-inLuc-mR, несущей ген люциферазы и необходимой для детекции проникновения вируса в клетку; упаковочной pCMV-d8.2R, и одним из оболочечных белков NL4-3, JRFL или ZM135. Спустя 48 часов вирусный супернатант собирали и фильтровали. Инфекционный тест проводили путем добавления вирусного супернатанта к тестируемой клеточной линии HEK293T/CD4/R5/peptide. В качестве контроля использовали клеточную линию HEK293T/CD4/R5. Спустя 48 часов клетки собирали, лизировали и измеряли люциферазную активность. Результаты представлены на фигуре 5А. Тест показал, что большинство GPI-заякоренных gp41 пептидов эффективно защищают клетку от проникновения ВИЧ-1. To assess the degree of protection of cells from HIV, the obtained cells were analyzed in a single-cycle pseudovirus test. Infection tests were performed on HEK293T/CD4/R5/peptide cells with isolated viral particles. For this, pseudoviral particles coated with one of three HIV-1 envelope proteins were produced: CXCR4 - tropic NL4-3 and CCR5 - tropic JRFL and ZM-135. HEK293T cells were transfected using the Lipofectamine 2000 reagent (ThermoFisher) according to the manufacturer's instructions with three plasmids: pUCHR-inLuc-mR, carrying the luciferase gene and necessary for detecting virus entry into the cell; packaging pCMV-d8.2R, and one of the envelope proteins NL4-3, JRFL, or ZM135. After 48 hours, the viral supernatant was collected and filtered. An infection test was performed by adding the viral supernatant to the tested HEK293T/CD4/R5/peptide cell line. The HEK293T/CD4/R5 cell line was used as a control. After 48 hours, the cells were harvested, lysed and the luciferase activity was measured. The results are shown in Figure 5A. The test showed that most of the GPI-anchored gp41 peptides effectively protect the cell from HIV-1 entry.
Для теста на межклеточную передачу ВИЧ-1 клетки Raji электропорировали плазмидами pUCHR-inLuc-mR, pCMV-d8.2R и одним из оболочечных белков Env из штаммов ВИЧ-1 NL4-3, JRFL или ZM135. Трансфецированные клетки инкубировали 6 часов и смешивали с клетками-мишенями Raji/CD4/R5/peptide в соотношении 2:1 (фиг. 5Б). Через 72 часа совместного культивирования уровень инфекции измеряли по активности люциферазы к лизированных клетках. Результаты теста показали, что изобретенные конструкции эффективно защищают клетки от проникновения ВИЧ не только при инфекции свободными вирусными частицами, но блокируют межклеточную инфекцию ВИЧ-1, передающуюся при непосредственном контакте клетки-продуцента вируса с клеткой-мишенью. Все показанные результаты были получены как минимум в трех независимых экспериментах, что подтверждает описанные эффекты и их статистическую значимость. For the HIV-1 intercellular transmission test, Raji cells were electroporated with pUCHR-inLuc-mR, pCMV-d8.2R plasmids and one of the Env envelope proteins from HIV-1 strains NL4-3, JRFL, or ZM135. Transfected cells were incubated for 6 hours and mixed with Raji/CD4/R5/peptide target cells at a ratio of 2:1 (Fig. 5B). After 72 hours of co-cultivation, the level of infection was measured by luciferase activity on lysed cells. The test results showed that the invented constructs effectively protect cells from HIV penetration not only when infected with free viral particles, but also block intercellular HIV-1 infection transmitted by direct contact of the virus producer cell with the target cell. All results shown were obtained in at least three independent experiments, which confirms the described effects and their statistical significance.
Изобретение потенциально может быть использовано на CD4+ клетках человека для терапии ВИЧ.The invention can potentially be used on human CD4+ cells for HIV therapy.
Цитируемая литератураCited Literature
1. Мазуров Д.В. Селекция редактированных клеток методом SORTS. Глава 22 в монографии "Методы редактирования генов и геномов", Новосибирск, Издательство Сибирского отделения РАН, 2020.1. Mazurov D.V. Selection of edited cells by the SORTS method. Chapter 22 in the monograph "Methods for editing genes and genomes", Novosibirsk, Publishing House of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 2020.
2. Lalezari J.P., DeJesus E., Northfelt D.W. et al. A controlled phase II trial assessing three doses of enfuvirtide (T-20) in combination with abacavir, amprenavir, ritonavir and efavirenz in nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor-naive HIV-infected adults. Antivir. Ther. 2003; 8: 279-287.2. Lalezari J.P., DeJesus E., Northfelt D.W. et al. A controlled phase II trial assessing three doses of enfuvirtide (T-20) in combination with abacavir, amprenavir, ritonavir and efavirenz in nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor-naive HIV-infected adults. antivirus. Ther. 2003; 8:279-287.
3. Leslie GJ, Wang J, Richardson MW, Haggarty BS, Hua KL, Duong J, Secreto AJ, Jordon AP, Romano J, Kumar KE, DeClercq JJ, Gregory PD, June CH, Root MJ, Riley JL, Holmes MC, Hoxie JA. Potent and Broad Inhibition of HIV-1 by a Peptide from the gp41 Heptad Repeat-2 Domain Conjugated to the CXCR4 Amino Terminus. PLoS Pathog. 2016 Nov 17;12(11): e1005983. doi: 10.1371/journal.ppat.10059833. Leslie GJ, Wang J, Richardson MW, Haggarty BS, Hua KL, Duong J, Secreto AJ, Jordon AP, Romano J, Kumar KE, DeClercq JJ, Gregory PD, June CH, Root MJ, Riley JL, Holmes MC, Hoxie J.A. Potent and Broad Inhibition of HIV-1 by a Peptide from the gp41 Heptad Repeat-2 Domain Conjugated to the CXCR4 Amino Terminus. PLoS Pathog. 2016 Nov 17;12(11): e1005983. doi:10.1371/journal.ppat.1005983
4. Xiaoran Tang, Hongliang Jin, Yue Chen, Li Li, Yuanmei Zhu, Huihui Chong, Yuxian He. A Membrane-Anchored Short-Peptide Fusion Inhibitor Fully Protects Target Cells from Infections of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1), HIV-2, and Simian Immunodeficiency Virus, Journal of Virology Oct 2019, 93 (22) e01177-19; DOI: 10.1128/JVI.01177-194. Xiaoran Tang, Hongliang Jin, Yue Chen, Li Li, Yuanmei Zhu, Huihui Chong, Yuxian He. A Membrane-Anchored Short-Peptide Fusion Inhibitor Fully Protects Target Cells from Infections of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1), HIV-2, and Simian Immunodeficiency Virus, Journal of Virology Oct 2019, 93 (22) e01177-19; DOI: 10.1128/JVI.01177-19
5. Zotova, A., Pichugin, A., Atemasova, A. et al. Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags. Sci Rep 9, 3132 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-40219-z5. Zotova, A., Pichugin, A., Atemasova, A. et al. Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags. Sci Rep 9, 3132 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-40219-z
--->--->
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии <110> Federal State Budgetary Institution of Science Institute of Biology
гена Российской академии наук (Institute of Gene Biology Russian Academy of gene of the Russian Academy of Sciences (Institute of Gene Biology Russian Academy of
Sciences)Sciences)
<120> Технология создания Т-клеточной устойчивости к ВИЧ-1 на основе <120> Technology for creating T-cell resistance to HIV-1 based on
генетически-кодируемых GPI-заякоренных пептидов из gp41genetically encoded GPI-anchored peptides from gp41
<160> 24<160> 24
<210> 1<210> 1
<211> 28<211> 28
<212> PRT<212> PRT
<213> H.sapiens<213> H. sapiens
<400> 1<400> 1
Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met Val 16Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met Val 16
1 5 10 151 5 10 15
Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr 28Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr 28
20 25 20 25
<210> 2<210> 2
<211> 23<211> 23
<212> PRT<212> PRT
<213> H.sapiens<213> H. sapiens
<400> 2<400> 2
Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met Val 16Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met Val 16
1 5 10 151 5 10 15
Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser 23Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser 23
20 20
<210> 3<210> 3
<211> 27<211> 27
<212> PRT<212> PRT
<213> H.sapiens<213> H. sapiens
<223> Umb – стоп-кодон<223> Umb - stop codon
<400> 3<400> 3
Ser Ala Ser Ser Asn Ile Ser Gly Gly Ile Phe Leu Phe Phe Val Ala 16Ser Ala Ser Ser Asn Ile Ser Gly Gly Ile Phe Leu Phe Phe Val Ala 16
1 5 10 151 5 10 15
Asn Ala Ile Ile His Leu Phe Cys Phe Ser Umb 27Asn Ala Ile Ile His Leu Phe Cys Phe Ser Umb 27
20 25 20 25
<210> 4<210> 4
<211> 34<211> 34
<212> PRT<212> PRT
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> PEPTIDE<220> PEPTIDE
<223> C-34<223> C-34
<400> 4<400> 4
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His 16Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His 16
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 32Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 32
20 25 30 20 25 30
Leu Leu 34Leu Leu 34
<210> 5<210> 5
<211> 36<211> 36
<212> PRT<212> PRT
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> PEPTIDE<220> PEPTIDE
<223> MT C-34<223> MT C-34
<400> 5<400> 5
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu 16Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu 16
1 5 10 151 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu 32Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu 32
20 25 30 20 25 30
Gln Glu Leu Leu 36Gln Glu Leu Leu 36
35 35
<210> 6<210> 6
<211> 23<211> 23
<212> PRT<212> PRT
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> PEPTIDE<220> PEPTIDE
<223> HP23L<223> HP23L
<400> 6<400> 6
Glu Leu Thr Trp Glu Glu Trp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys 16Glu Leu Thr Trp Glu Glu Trp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys 16
1 5 10 151 5 10 15
Lys Ile Glu Glu Ile Leu Lys 23Lys Ile Glu Glu Ile Leu Lys 23
20 20
<210> 7<210> 7
<211> 23<211> 23
<212> PRT<212> PRT
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> PEPTIDE<220> PEPTIDE
<223> 2P23<223> 2P23
<400> 7<400> 7
Glu Met Thr Trp Glu Glu Trp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys 16Glu Met Thr Trp Glu Glu Trp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys 16
1 5 10 151 5 10 15
Lys Ile Glu Glu Ile Leu Lys 23Lys Ile Glu Glu Ile Leu Lys 23
20 20
<210> 8<210> 8
<211> 24<211> 24
<212> PRT<212> PRT
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> PEPTIDE<220> PEPTIDE
<223> nHP23L<223> nHP23L
<400> 8<400> 8
Gly Asn Leu Thr Trp Glu Glu Trp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr 16Gly Asn Leu Thr Trp Glu Glu Trp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr 16
1 5 10 151 5 10 15
Lys Lys Ile Glu Glu Ile Leu Lys 24Lys Lys Ile Glu Glu Ile Leu Lys 24
20 20
<210> 9<210> 9
<211> 24<211> 24
<212> PRT<212> PRT
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> PEPTIDE<220> PEPTIDE
<223> n2p23<223> n2p23
<400> 9<400> 9
Gly Asn Met Thr Trp Glu Glu Trp Glu Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu 16Gly Asn Met Thr Trp Glu Glu Trp Glu Lys Lys Val Glu Glu Glu Leu Glu 16
1 5 10 151 5 10 15
Lys Lys Ile Glu Glu Leu Leu Lys 24Lys Lys Ile Glu Glu Leu Leu Lys 24
20 20
<210> 10<210> 10
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> H.sapiens<213> H. sapiens
<400> 10<400> 10
gagaaccagc ggttaccatg g 21gagaaccagc ggttaccatg g 21
<210> 11<210> 11
<211> 89<211> 89
<212> ДНК<212> DNA
<213> H.sapiens<213> H. sapiens
<400> 11<400> 11
agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60
ccaccgcatc tggagaacca gcggttacc 89 ccaccgcatc tggagaacca gcggttacc 89
<210> 12<210> 12
<211> 96<211> 96
<212> ДНК<212> DNA
<213> H.sapiens<213> H. sapiens
<400> 12<400> 12
gag ggg atc agt gta agt cca gtt tca acc tgc ttt gtc ata aat gta caa acg ttt gaa 60gag ggg atc agt gta agt cca gtt tca acc tgc ttt gtc ata aat gta caa acg ttt gaa 60
ctt aga gcg cag ccc ctc tcc gag cgg gca gaa gcg 96ctt aga gcg cag ccc ctc tcc gag cgg gca gaa gcg 96
<210> 13 <210> 13
<211> 66<211> 66
<212> ДНК<212> DNA
<213> H.sapiens<213> H. sapiens
<400> 17<400> 17
ggatccggcg caacaaactt ctctctgctg aaacaagccg gagatgtcga agagaatcct 60ggatccggcg caacaaactt ctctctgctg aaacaagccg gagatgtcga agagaatcct 60
ggaccg 66ggaccg 66
<210> 14<210> 14
<211> 105<211> 105
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 5’-CXCR4start-in<223> 5'-CXCR4start-in
<400> 14<400> 14
agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60
ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca ccatgaagcg cttcc 105ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca ccatgaagcg cttcc 105
<210> 15<210> 15
<211> 114<211> 114
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 3’-CXCR4start-in<223> 3'-CXCR4start-in
<400> 15<400> 15
cgcttctgcc cgctcggaga ggggctgcgc tctaagttca aacgtttgta catttatgac 60cgcttctgcc cgctcggaga ggggctgcgc tctaagttca aacgtttgta catttatgac 60
aaagcaggtt gaaactggac ttacactgat cccctcggcc ggtccaggat tctc 114aaagcaggtt gaaactggac ttacactgat cccctcggcc ggtccaggat tctc 114
<210> 16<210> 16
<211> 106<211> 106
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 5’-MT34-X4-in<223> 5’-MT34-X4-in
<400> 16<400> 16
agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60
ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tgacctggat ggagtg 106ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tgacctggat ggagtg 106
<210> 17<210> 17
<211> 112<211> 112
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 3’-MT34-X4-in<223> 3’-MT34-X4-in
<400> 17<400> 17
cgcttctgcc cgctcggaga ggggctgcgc tctaagttca aacgtttgta catttatga 60cgcttctgcc cgctcggaga ggggctgcgc tctaagttca aacgtttgta catttatga 60
aaagcaggtt gaaactggac ttacactgat cccctccagg agctcctgct cg 112aaagcaggtt gaaactggac ttacactgat cccctccagg agctcctgct cg 112
<210> 18<210> 18
<211> 110<211> 110
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 5’-2P23-X4-in<223> 5'-2P23-X4-in
<400> 18<400> 18
agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60
ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tggagatgac ctgggaagag 110ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tggagatgac ctgggaagag 110
<210> 19<210> 19
<211> 115<211> 115
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 3’-2P23-X4-in<223> 3'-2P23-X4-in
<400> 19<400> 19
cgcttctgcc cgctcggaga ggggctgcgc tctaagttca aacgtttgta catttatgac 60cgcttctgcc cgctcggaga ggggctgcgc tctaagttca aacgtttgta catttatgac 60
aaagcaggtt gaaactggac ttacactgat cccctccttg agcagctctt cgatt 115aaagcaggtt gaaactggac ttacactgat cccctccttg agcagctctt cgatt 115
<210> 20<210> 20
<211> 110<211> 110
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 5’-HP23L-X4-in<223> 5’-HP23L-X4-in
<400> 20<400> 20
agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60
ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tggagctgac ctgggaagag 110ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tggagctgac ctgggaagag 110
<210> 21<210> 21
<211> 116<211> 116
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 3’-HP23L -X4-in<223> 3'-HP23L -X4-in
<400> 21<400> 21
cgcttctgcc cgctcggaga ggggctgcgc tctaagttca aacgtttgta catttatgac 60cgcttctgcc cgctcggaga ggggctgcgc tctaagttca aacgtttgta catttatgac 60
aaagcaggtt gaaactggac ttacactgat cccctccttg aggatctctt cgattt 116aaagcaggtt gaaactggac ttacactgat cccctccttg aggatctctt cgattt 116
<210> 22<210> 22
<211> 110<211> 110
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 5’-n2P23-X4-in<223> 5'-n2P23-X4-in
<400> 22<400> 22
agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60
ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tgggcaacat gacctgggaa 110ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tgggcaacat gacctgggaa 110
<210> 23<210> 23
<211> 110<211> 110
<212> ДНК<212> DNA
<213> artificial sequence<213> artificial sequence
<220> <220>
<223> 5’-nHP23L-X4-in<223> 5'-nHP23L-X4-in
<400> 23<400> 23
agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60agtttgttgg ctgcggcagc aggtagcaaa gtgacgccga gggcctgagt gctccagtag 60
ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tgggcaacct gacctgggaa 110ccaccgcatc tggagaacca gcggttacca tgggcaacct gacctgggaa 110
<---<---
Claims (22)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020142800A RU2769567C1 (en) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Technology for creating t-cell resistance to hiv-1 based on genetically encoded gpi-anchored peptides from gp41 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020142800A RU2769567C1 (en) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Technology for creating t-cell resistance to hiv-1 based on genetically encoded gpi-anchored peptides from gp41 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2769567C1 true RU2769567C1 (en) | 2022-04-04 |
Family
ID=81076037
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020142800A RU2769567C1 (en) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Technology for creating t-cell resistance to hiv-1 based on genetically encoded gpi-anchored peptides from gp41 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2769567C1 (en) |
-
2020
- 2020-12-24 RU RU2020142800A patent/RU2769567C1/en active
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
ANASTASIA ZOTOVA et al., Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags, Scientific Reports, 2019, volume 9, Article number: 3132. * |
PANPAN HOU et al., Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection, Scientific Reports, 2015, volume 5, Article number: 15577. * |
МАЗУРОВ Д.В. и др. Конструирование ВИЧ-1-эффекторных и ВИЧ-1-резистентных Т клеток человека с помощью модифицированного метода SORTS, ACTA NATURAE, 2019, СПЕЦВЫПУСК, том 2, см. стр.12-13. * |
МАСЛЕННИКОВА А.К.Ю. и др. Генотерапия ВИЧ-1 на основе GPI-заякоренных пептидов из gp41, ACTA NATURAE, 2019, СПЕЦВЫПУСК, том 2, см. стр.34. * |
МАСЛЕННИКОВА А.К.Ю. и др. Генотерапия ВИЧ-1 на основе GPI-заякоренных пептидов из gp41, ACTA NATURAE, 2019, СПЕЦВЫПУСК, том 2, см. стр.34. МАЗУРОВ Д.В. и др. Конструирование ВИЧ-1-эффекторных и ВИЧ-1-резистентных Т клеток человека с помощью модифицированного метода SORTS, ACTA NATURAE, 2019, СПЕЦВЫПУСК, том 2, см. стр.12-13. PANPAN HOU et al., Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection, Scientific Reports, 2015, volume 5, Article number: 15577. ANASTASIA ZOTOVA et al., Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags, Scientific Reports, 2019, volume 9, Article number: 3132. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hirsch et al. | An African primate lentivirus (SIVsmclosely related to HIV-2 | |
Page et al. | Analysis of mutations in the V3 domain of gp160 that affect fusion and infectivity | |
US6099847A (en) | Chimeric Gag pseudovirions | |
Rowell et al. | Lysosome-associated membrane protein-1-mediated targeting of the HIV-1 envelope protein to an endosomal/lysosomal compartment enhances its presentation to MHC class II-restricted T cells. | |
Stewart et al. | Properties of avian retrovirus particles defective in viral protease | |
Mahalingam et al. | Identification of residues in the N-terminal acidic domain of HIV-1 Vpr essential for virion incorporation | |
Flexner et al. | Characterization of human immunodeficiency virus gag/pol gene products expressed by recombinant vaccinia viruses | |
JP2022101658A (en) | HIV vaccination and immunotherapy | |
EP0791065B1 (en) | Protein targeting into hiv virions based on hiv-1 vpr fusion molecules | |
Bibollet-Ruche et al. | Efficient SIVcpz replication in human lymphoid tissue requires viral matrix protein adaptation | |
CN101291688A (en) | A lentiviral vector-based vaccine | |
US7122180B2 (en) | DNA vectors containing mutated HIV proviruses | |
Dube et al. | The complete genomic sequence of a BLV strain from a Holstein cow from Argentina | |
Langley et al. | Nucleotide sequence analysis of puma lentivirus (PLV-14): genomic organization and relationship to other lentiviruses | |
US9707257B2 (en) | Anti-HIV group I introns and uses thereof in treating HIV infections | |
US20100099162A1 (en) | Nuclear localization signal of lentiviral integrase and method of use thereof | |
Vahlenkamp et al. | A single amino acid substitution in the transmembrane envelope glycoprotein of feline immunodeficiency virus alters cellular tropism | |
Kono et al. | Comparison of anti-viral activity of rhesus monkey and cynomolgus monkey TRIM5αs against human immunodeficiency virus type 2 infection | |
Kobinger et al. | Virion-targeted viral inactivation of human immunodeficiency virus type 1 by using Vpr fusion proteins | |
Lietz et al. | Codelivery of the chemokine CCL3 by an adenovirus-based vaccine improves protection from retrovirus infection | |
Kim et al. | Development of a safe and rapid neutralization assay using murine leukemia virus pseudotyped with HIV type 1 envelope glycoprotein lacking the cytoplasmic domain | |
RU2769567C1 (en) | Technology for creating t-cell resistance to hiv-1 based on genetically encoded gpi-anchored peptides from gp41 | |
Pérot et al. | From viruses to genes: syncytins | |
Kumar et al. | Immunogenicity testing of a novel engineered HIV-1 envelope gp140 DNA vaccine construct | |
Tu et al. | An HTLV-1 envelope mRNA vaccine is immunogenic and protective in New Zealand rabbits |