RU2768737C1 - Humanized antibody 6h8hu, binding to tumour antigen prame, dna fragments coding said antibody and antigen-binding antibody fragment - Google Patents

Humanized antibody 6h8hu, binding to tumour antigen prame, dna fragments coding said antibody and antigen-binding antibody fragment Download PDF

Info

Publication number
RU2768737C1
RU2768737C1 RU2020139037A RU2020139037A RU2768737C1 RU 2768737 C1 RU2768737 C1 RU 2768737C1 RU 2020139037 A RU2020139037 A RU 2020139037A RU 2020139037 A RU2020139037 A RU 2020139037A RU 2768737 C1 RU2768737 C1 RU 2768737C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
antigen
prame
binding
humanized
Prior art date
Application number
RU2020139037A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Теймур Кантамирович Алиев
Михаил Петрович Кирпичников
Екатерина Николаевна ЛАРИНА
Мария Викторовна Ларина
Всеволод Андреевич Мисюрин
Ольга Николаевна Солопова
Юлия Павловна Финашутина
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (МГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (МГУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (МГУ)
Priority to RU2020139037A priority Critical patent/RU2768737C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2768737C1 publication Critical patent/RU2768737C1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, in particular to a humanised monoclonal antibody which selectively binds human tumour antigen, as well as to its antigen-binding fragment. Also disclosed is an isolated DNA fragment coding a variable portion of the heavy chain, and an isolated DNA fragment coding the variable portion of the light chain of said antibody.
EFFECT: invention is effective for binding to human PRAME tumour antigen with antigen-antibody complex dissociation constant of 1,2 nM with allowable error value of 10 % and can be used for human treatment.
4 cl, 6 dwg, 6 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к биотехнологии и биохимии, а именно к гуманизированному моноклональному антителу, селективно связывающемуся с опухолевым антигеном PRAME человека, с константой диссоциации комплекса 1,2×10-9 М, а также изолированному фрагменту ДНК, кодирующему участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела, и антиген-связывающему фрагменту указанного моноклонального антитела. Специфичность моноклонального антитела к опухолевому антигену PRAME человека подтверждена методами иммуноблоттинга и измерения константы диссоциации комплекса антитела с антигеном с использованием биосенсора в реальном времени.The invention relates to biotechnology and biochemistry, namely to a humanized monoclonal antibody selectively binding to the human tumor antigen PRAME, with a complex dissociation constant of 1.2×10 -9 M, as well as an isolated DNA fragment encoding the light and heavy chain regions of the indicated antibody, and an antigen-binding fragment of said monoclonal antibody. The specificity of the monoclonal antibody to the human PRAME tumor antigen was confirmed by immunoblotting and measurement of the dissociation constant of the antibody-antigen complex using a real-time biosensor.

Уровень техникиState of the art

Антиген PRAME, представляющий собой значимую мишень для моноклональных антител, является онкоспецифическим маркером, который активен на всех стадиях дифференцировки опухолевых клеток, и вызывает спонтанный T-клеточный ответ. Иммуногенность опухолевых клеток во многом опосредована активностью раково-тестикулярных антигенов. Эти антигены экспрессируются в различных тканях эмбриона, но неактивны у взрослого человека, за исключением клеток гамет. Поскольку гаметы расположены в иммунопривилегированных областях организма человека, раково-тестикулярные антигены не могут быть представлены иммунной системе.The PRAME antigen, which is a significant target for monoclonal antibodies, is an oncospecific marker that is active at all stages of tumor cell differentiation and causes a spontaneous T-cell response. The immunogenicity of tumor cells is largely mediated by the activity of cancer-testicular antigens. These antigens are expressed in various tissues of the embryo, but are inactive in the adult, with the exception of gamete cells. Because gametes are located in immune-privileged areas of the human body, cancer-testicular antigens cannot be presented to the immune system.

Белок PRAME был открыт при исследовании причин спонтанной ремиссии меланомы у человека. Опухолевые клетки больного LB33, из которых была получена клеточная линия, подвергались атаке аутологичных CD8-позитивных T-клеток. Белок PRAME состоит из 509 аминокислотных остатков, в его структуре было выявлено большое количество потенциальных T-клеточных эпитопов. Наиболее изученным является взаимодействие пептидов белка PRAME с молекулой главного комплекса гистосовместимости HLA-A2, которая является наиболее распространенным вариантом в генотипе европейцев. Из множества предсказанных пептидов 19 демонстрировали высокую аффинность связывания с молекулой HLA-A2 [ Kessler J.H., Beekman N.J., Bres-Vloemans S.A., Verdijk P., van Veelen P.A., Kloosterman-Joosten A.M., Vissers D.C., ten Bosch G.J., Kester M.G., Sijts A., Wouter Drijfhout J., Ossendorp F., Offringa R., and Melief C.J. (2001) Efficient identification of novel HLA-A(*)0201-presented cytotoxic T lymphocyte epitopes in the widely expressed tumor antigen PRAME by proteasome-mediated digestion analysis. J Exp Med. 193(1): p. 73-88]. Большое разнообразие иммуногенных эпитопов делает белок PRAME очень привлекательным для использования в терапии. При сопоставлении иммуногенности белков PRAME и BCR-ABL, характерного для хронического миелоидного лейкоза, последний показал очень низкую иммуногенность. Объясняется это тем, что BCR-ABL образован двумя белками, которые экспрессируются в соматических тканях человека и поэтому являются неиммуногенными. Однако остальные известные раково-тестикулярные антигены (РТА), такие как MAGE-A3, SSXIP2, HAGE и некоторые другие, реже по сравнению с PRAME вызывают T-клеточный иммунный ответ [Greiner J., Schmitt M., Li L., Giannopoulos K., Bosch K., Schmitt A., Dohner K., Schlenk R.F., Pollack J.R., Dohner H., and Bullinger L. (2006) Expression of tumor-associated antigens in acute myeloid leukemia: Implications for specific immunotherapeutic approaches. Blood. 108(13): p. 4109-4117.]; [ Schneider V., Zhang L., Rojewski M., Fekete N., Schrezenmeier H., Erle A., Bullinger L., Hofmann S., Gotz M., Dohner K., Ihme S., Dohner H., Buske C., Feuring-Buske M., and Greiner J. (2015) Leukemic progenitor cells are susceptible to targeting by stimulated cytotoxic T cells against immunogenic leukemia-associated antigens. Int J Cancer. 137(9): p. 2083-2092.]; [ Babiak A., Steinhauser M., Gotz M., Herbst C., Dohner H., and Greiner J. (2014) Frequent T cell responses against immunogenic targets in lung cancer patients for targeted immunotherapy. Oncol Rep. 31(1): p. 384-390.]. Белок PRAME относится к группе РТА, экспрессирующихся в основном в клетках гамет и в опухолевых клетках.The PRAME protein was discovered while studying the causes of spontaneous remission of melanoma in humans. Patient LB33 tumor cells from which the cell line was derived were attacked by autologous CD8-positive T cells. The PRAME protein consists of 509 amino acid residues; a large number of potential T-cell epitopes have been identified in its structure. The most studied is the interaction of PRAME protein peptides with the HLA-A2 major histocompatibility complex molecule, which is the most common variant in the European genotype. Of the many predicted peptides, 19 showed high binding affinity for the HLA-A2 molecule [ Kessler JH, Beekman NJ, Bres-Vloemans SA, Verdijk P., van Veelen PA, Kloosterman-Joosten AM, Vissers DC, ten Bosch GJ, Kester MG, Sijts A., Wouter Drijfhout J., Ossendorp F., Offringa R., and Melief CJ (2001) Efficient identification of novel HLA-A(*)0201-presented cytotoxic T lymphocyte epitopes in the widely expressed tumor antigen PRAME by proteasome-mediated digestion analysis . J Exp Med . 193(1): p. 73-88]. The wide variety of immunogenic epitopes makes the PRAME protein very attractive for use in therapy. When comparing the immunogenicity of PRAME and BCR-ABL proteins, characteristic of chronic myeloid leukemia, the latter showed very low immunogenicity. This is explained by the fact that BCR-ABL is formed by two proteins that are expressed in human somatic tissues and therefore are non-immunogenic. However, other known cancer-testicular antigens (PTA), such as MAGE-A3, SSXIP2, HAGE, and some others, rarely cause a T-cell immune response compared to PRAME [Greiner J., Schmitt M., Li L., Giannopoulos K ., Bosch K., Schmitt A., Dohner K., Schlenk RF, Pollack JR, Dohner H., and Bullinger L. (2006) Expression of tumor-associated antigens in acute myeloid leukemia: Implications for specific immunotherapeutic approaches . Blood . 108(13) : p. 4109-4117.]; [ Schneider V., Zhang L., Rojewski M., Fekete N., Schrezenmeier H., Erle A., Bullinger L., Hofmann S., Gotz M., Dohner K., Ihme S., Dohner H., Buske C., Feuring-Buske M., and Greiner J. (2015) Leukemic progenitor cells are susceptible to targeting by stimulated cytotoxic T cells against immunogenic leukemia-associated antigens . Int J Cancer . 137(9) : p. 2083-2092.]; [Babiak A., Steinhauser M., Gotz M., Herbst C., Dohner H., and Greiner J. (2014) Frequent T cell responses against immunogenic targets in lung cancer patients for targeted immunotherapy . Oncol Rep . 31(1) : p. 384-390]. The PRAME protein belongs to the group of PTAs, which are expressed mainly in gamete cells and in tumor cells.

При меланоме и некоторых других солидных опухолях экспрессия PRAME в основном ассоциирована с метастазированием и лекарственной устойчивостью, а также с неблагоприятным исходом заболевания [ Ikeda H., Lethe B., Lehmann F., van Baren N., Baurain J.F., de Smet C., Chambost H., Vitale M., Moretta A., Boon T., and Coulie P.G. (1997) Characterization of an antigen that is recognized on a melanoma showing partial HLA loss by CTL expressing an NK inhibitory receptor. Immunity. 6(2): p. 199-208.]; [ Greiner J., Ringhoffer M., Simikopinko O., Szmaragowska A., Huebsch S., Maurer U., Bergmann L., and Schmitt M. (2000) Simultaneous expression of different immunogenic antigens in acute myeloid leukemia. Exp Hematol. 28(12): p. 1413-1422.]. При солидных опухолях негативное влияние на прогноз заболевания объясняется функциями белка. Так, PRAME блокирует сигнальный путь ретиноевой кислоты, в результате чего останавливается дифференцировка клеток [Epping M.T., Wang L., Edel M.J., Carlee L., Hernandez M., and Bernards R. (2005) The human tumor antigen PRAME is a dominant repressor of retinoic acid receptor signaling. Cell. 122(6): p. 835-847.]. Экспрессия PRAME наблюдается при меланоме (100% случаев), раке головы и шеи (в 39% случаев), мелкоклеточном раке легких (25%), аденокарциноме легких (46%), раке почки (61%), раке простаты (10%), раке мочевого пузыря (9%), раке щитовидной железы (60%), cаркомах (29%), хроническом лимфоидном лейкозе (16-50%), нейробластоме (67%), медуллабластоме (30%), детских острых милеомных лейкозах (75%), множественной миеломе (25%), неходжкинских лимфомах, в том числе при лимфогрануломатозе (лимфоме Ходжкина) (67%). Клетки Березовского - опухолевый субстрат лимфомы Ходжкина.In melanoma and some other solid tumors, PRAME expression is mainly associated with metastasis and drug resistance, as well as with poor disease outcome [Ikeda H., Lethe B., Lehmann F., van Baren N., Baurain JF, de Smet C., Chambost H., Vitale M., Moretta A., Boon T., and Coulie PG (1997) Characterization of an antigen that is recognized on a melanoma showing partial HLA loss by CTL expressing an NK inhibitory receptor . Immunity . 6(2): p. 199-208.]; [ Greiner J., Ringhoffer M., Simikopinko O., Szmaragowska A., Huebsch S., Maurer U., Bergmann L., and Schmitt M. (2000) Simultaneous expression of different immunogenic antigens in acute myeloid leukemia . Exp Hematol . 28(12): p. 1413-1422.]. In solid tumors, the negative impact on the prognosis of the disease is explained by the functions of the protein. Thus, PRAME blocks the retinoic acid signaling pathway, resulting in cell differentiation [Epping MT, Wang L., Edel MJ, Carlee L., Hernandez M., and Bernards R. (2005) The human tumor antigen PRAME is a dominant repressor of retinoic acid receptor signaling . cell . 122(6): p. 835-847]. PRAME expression is observed in melanoma (100% of cases), head and neck cancer (39% of cases), small cell lung cancer (25%), lung adenocarcinoma (46%), kidney cancer (61%), prostate cancer (10%) , bladder cancer (9%), thyroid cancer (60%), sarcomas (29%), chronic lymphoid leukemia (16-50%), neuroblastoma (67%), medullablastoma (30%), childhood acute myleoma leukemia ( 75%), multiple myeloma (25%), non-Hodgkin's lymphomas, including lymphogranulomatosis (Hodgkin's lymphoma) (67%). Berezovsky's cells are the tumor substrate of Hodgkin's lymphoma.

Из уровня техники известны антитела, связывающиеся с антигеном PRAME, описанные в патенте США № 8846872 B2, опубл. 30.09.2014 года. Данные антитела являются мышиными мАТ, полученными с использованием гибридомной технологии. Данное изобретение относится к антителам к преимущественно экспрессируемому антигену при меланоме (PRAME) и антигенам синовиальной саркомы X breakpoint 2 (SSX-2), способам их применения и диагностическим наборам [https://patents.google.com/patent/US8846872B2/en US 8846872 B2 от 30.09.2014]. Данное изобретение описывает мАТ, либо один или несколько его антиген-связывающих фрагментов, специфично связывающихся с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 123-132 белка PRAME. Также изобретение описывет мАТ, либо один или несколько его антиген-связывающих фрагментов, специфично связывающихся с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 276-286 белка PRAME.The prior art antibodies that bind to the PRAME antigen, described in US patent No. 8846872 B2, publ. September 30, 2014. These antibodies are mouse mAbs obtained using hybridoma technology. This invention relates to antibodies to predominantly expressed melanoma antigen (PRAME) and synovial sarcoma X breakpoint 2 antigens (SSX-2), methods of their use and diagnostic kits [https://patents.google.com/patent/US8846872B2/en US 8846872 B2 dated 09/30/2014]. The present invention describes a mAb, or one or more antigen-binding fragments thereof, that specifically binds to an epitope comprising amino acid residues 123-132 of the PRAME protein. The invention also describes a mAb, or one or more antigen-binding fragments thereof, that specifically bind to an epitope comprising amino acid residues 276-286 of the PRAME protein.

Известно терапевтическое антитело Pr20, имитирующее T-клеточный рецептор, и связывающее пептид опухоле-ассоциированного белка PRAME в комплексе с молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса (HLA-I) [Chang AY, Dao T, Gejman RS, Jarvis CA, Scott A, Dubrovsky L, Mathias MD, Korontsvit T, Zakhaleva V, Curcio M, Hendrickson RC. A therapeutic T cell receptor mimic antibody targets tumor-associated PRAME peptide/HLA-I antigens. The Journal of clinical investigation. 2017 Jun 30;127(7):2705-18]. Описано человеческое антитело подкласса IgG1, связывающее пептид PRAME 300-309 с аминокислотной последовательностью ALYVDSLFFL, представленный в комплексе с HLA-A2 на поверхности опухолевых клеток, экспрессирующих белок PRAME и HLA-A2. A therapeutic antibody Pr20 is known that mimics the T-cell receptor and binds the peptide of the tumor-associated protein PRAME in complex with the major histocompatibility complex class I (HLA-I) molecule [Chang AY, Dao T, Gejman RS, Jarvis CA, Scott A, Dubrovsky L, Mathias MD, Korontsvit T, Zakhaleva V, Curcio M, Hendrickson RC. A therapeutic T cell receptor mimic antibody targets tumor-associated PRAME peptide/HLA-I antigens. The Journal of Clinical Investigation. 2017 Jun 30;127(7):2705-18]. Described is a human IgG1 subclass antibody that binds the PRAME 300-309 peptide with the amino acid sequence ALYVDSLFFL, presented in complex with HLA-A2 on the surface of tumor cells expressing PRAME and HLA-A2 proteins.

Известны генетически модифицированные T-клетки с T-клеточным рецептором, специфически связывающим пептид белка PRAME в комплексе с HLA-A2. Описано получение таких клеток и их противоопухолевое действие по отношению к клеткам линии медулобластомы (HLA-A2+) in vitro. Также описано терапевтическое действие в модели медуллобластомы in vivo при использовании клеточной линии DAOY и мышей NSG [Orlando D, Miele E, De Angelis B, Guercio M, Boffa I, Sinibaldi M, Po A, Caruana I, Abballe L, Carai A, Caruso S. Adoptive immunotherapy using PRAME-specific T cells in medulloblastoma. Cancer research. 2018 Jun 15;78(12):3337-49]. В отличие от моноклональных антител, генетически модифицированные T-клетки с T-клеточным рецептором, специфически связывающим пептид белка PRAME, связываются только с пептидом в комплексе с молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса (MHC I). Для дальнейшей активации таких клеток и элиминации экспрессирующих PRAME опухолевых клеток требуется получение T-клетками костимуляторных сигналов. Однако известно, что опухолевые клетки могут влиять на костимуляторные сигналы и блокировать активацию T-клеток, а также для многих типов опухолей характерно снижение экспрессии MHC I, что помогает опухолевым клеткам маскировать их присутствие от генетически-модифицированных T-клеток. Также получение генетически модифицированных T-клетки с T-клеточным рецептором, специфически связывающим пептид белка PRAME, является трудоемким и очень дорогим процессом, требующим выделения аутологичных T-клеток из крови пациента, их генетической модификации и выращивания ex vivo.Known genetically modified T-cells with a T-cell receptor that specifically binds the PRAME protein peptide in complex with HLA-A2. The production of such cells and their antitumor activity against meduloblastoma cells (HLA-A2+) in vitro are described. A therapeutic effect has also been described in an in vivo model of medulloblastoma using the DAOY cell line and NSG mice [Orlando D, Miele E, De Angelis B, Guercio M, Boffa I, Sinibaldi M, Po A, Caruana I, Abballe L, Carai A, Caruso S. Adoptive immunotherapy using PRAME-specific T cells in medulloblastoma. cancer research. 2018 Jun 15;78(12):3337-49]. Unlike monoclonal antibodies, genetically modified T-cells with a T-cell receptor that specifically binds the PRAME protein peptide bind only to the peptide in complex with the major histocompatibility complex class I (MHC I) molecule. Further activation of such cells and elimination of PRAME-expressing tumor cells requires T-cells to receive co-stimulatory signals. However, it is known that tumor cells can interfere with costimulatory signals and block T cell activation, and many types of tumors are characterized by a decrease in MHC I expression, which helps tumor cells mask their presence from genetically modified T cells. Also, obtaining genetically modified T cells with a T cell receptor specifically binding the PRAME protein peptide is a laborious and very expensive process requiring the isolation of autologous T cells from the patient's blood, their genetic modification and ex vivo cultivation.

Ряд исследований показывает [R. Fagnani, Immunol. Ser. 61 (1994) 3-22; M.B. Khazaeli, R.M. Conry, A.F. LoBuglio, J Immunother. 15 (1994) 42-52; K. Kuus-Reichel, L.S. Grauer, L.M. Karavodin, C. Knott, M. Krusemeier, N.E. Kay, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 (1994) 365-372], что введение чужеродного антитела может вызывать сильный иммунный ответ у пациента, прежде всего образование анти-мышиных антител (HAMA - human anti-mose antibody). В результате мышиные антитела оказываются нейтрализованы человеческими и довольно быстро выводятся из организма, что в конечном итоге приводит к ограниченной эффективности терапии уже на ранней стадии лечения. Более того, при использовании мышиных или других чужеродных (для человека) антител для лечения различных заболеваний, последующее лечение другими мышиными антителами может быть неэффективно или даже опасно из-за кросс-реактивности используемых антител.A number of studies show [R. Fagnani, Immunol. Ser. 61 (1994) 3-22; M.B. Khazaeli, R.M. Conry, A.F. LoBuglio, J Immunother. 15 (1994) 42-52; K. Kuus-Reichel, L.S. Grauer, L.M. Karavodin, C. Knott, M. Krusemeier, N.E. Kay, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 (1994) 365-372] that the introduction of a foreign antibody can cause a strong immune response in the patient, primarily the formation of anti-mouse antibodies (HAMA - human anti-mose antibody). As a result, mouse antibodies are neutralized by human ones and are quickly eliminated from the body, which ultimately leads to a limited effectiveness of therapy already at an early stage of treatment. Moreover, when murine or other foreign (human) antibodies are used to treat various diseases, subsequent treatment with other murine antibodies may be ineffective or even dangerous due to the cross-reactivity of the antibodies used.

Для снижения иммуногенности мышиных мАТ и возможных неблагоприятных реакций, обусловленных иммуногенностью, антитела или их части могут быть гуманизированы для того, чтобы быть менее иммуногенными, чем их мышиные прототипы. Клинические исследования показали, что гуманизированные антитела в целом являются значительно менее иммуногенными, чем мышиные и химерные мАТ, более безопасны и лучше переносятся пациентами [C. Mateo, E. Moreno, K. Amour, J. Lombardero, W. Harris, R. Perez, Immunotechnology 3 (1997) 71-81; S. Stephens, S. Emtage, O. Vetterlein, L. Chaplin, C. Bebbington, A. Nesbitt, M. Sopwith, D. Athwal, C. Novak, M. Bodmer, Immunology 85 (1995) 668-674]. Так, авторы настоящего изобретения сконструировали на основе мышиного мАТ, обладающего способностью с высокой специфичностью и высоким аффинитетом связываться с антигеном PRAME человека, и каркасных участков антител человека гуманизированное антитело к белку PRAME. Для гуманизации мАТ 6H8 использовали метод пересадки CDR-участков. Этот метод достаточно широко используется для получения гуманизированных терапевтических мАТ. Хотя известно, что пересадка CDR-участков была успешна в некоторых случаях, было показано, что большинство гуманизироваванных антител, полученных таким методом, не сохраняют антиген-связывающие свойства (аффинность) по отношению к антигену по сравнению с родительскими мышиными антителами. Потеря аффинности связана с заменой определенных аминокислотных остатков каркасных областей мАТ, тесно взаимодействующих с аминокислотными остатками CDR-участков в вариабельных доменах, и, таким образом влияют на структуру антиген-связывающего сайта. Поэтому перенос только CDR-участков при гуманизации антител часто приводит к потере антиген-связывающих свойств [C. Queen, W.P. Schneider, H.E. Selick, P.W. Payne, N.F. Landolfi, J.F. Duncan, N.M. Avdalovic, M. Levitt, R.P. Junghans, T.A. Waldmann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]. Queen с соавторами предположили наличие ключевых аминокислотных остатков в каркасных областях, взаимодействующих с CDR-участками и, таким образом, влияющих на правильную структуру антигенсвязывающего сайта. Такие остатки по мнению авторов, должны быть перенесены в гуманизированную версию антитела наряду с CDR-участками мышиных мАТ. Для того, чтобы установить, какие из аминокислотных остатков являются ключевыми, используют полученные in silico трехмерные модели мАТ и различные методы анализа. Такие методы часто позволяют установить аминокислотные остатки, замена которых в гуманизированном антителе приводит к значительному изменению его структуры. Однако, такие методы не всегда могут предсказать ключевые аминокислотные остатки. Очень важным этапом процесса гуманизации мышиных антител является построение надежных трехмерных моделей вариабельных доменов антитела. Также необходимо выбрать источник человеческих последовательностейй каркасных областей мАТ, на которые будет осуществляться пересадка CDR-участков мышиного мАТ. Источником таких последовательностей могут быть как мАТ с известной первичной последовательностью, так и гены зародышевой линии антител человека. Преимуществом использования последовательностей известных мАТ является доступность их пространственных моделей, полученных на основе экспериментальных данных (рентгено-структурного анализа). В то же время использование генов зародышевой линии позволяет избежать потенциальной иммуногенности, связанной с гиперсоматичекими мутациями, которые присутствуют в генах известных ранее антител. При гуманизации антител также могут быть использованы консенсусные последовательности каркасных областей вариабельных доменов антител.To reduce the immunogenicity of murine mAbs and possible adverse reactions due to immunogenicity, antibodies or portions thereof can be humanized to be less immunogenic than their murine counterparts. Clinical studies have shown that humanized antibodies are generally significantly less immunogenic than mouse and chimeric mAbs, safer, and better tolerated by patients [C. Mateo, E. Moreno, K. Amour, J. Lombardero, W. Harris, R. Perez, Immunotechnology 3 (1997) 71-81; S. Stephens, S. Emtage, O. Vetterlein, L. Chaplin, C. Bebbington, A. Nesbitt, M. Sopwith, D. Athwal, C. Novak, M. Bodmer, Immunology 85 (1995) 668-674]. Thus, the present inventors constructed a humanized antibody against the PRAME protein based on a mouse mAb having high specificity and high affinity to bind to the human PRAME antigen and human antibody framework regions. MAB 6H8 was humanized using the CDR grafting method. This method is widely used to obtain humanized therapeutic mAbs. While it is known that transplantation of CDR regions has been successful in some cases, it has been shown that most humanized antibodies produced by this method do not retain antigen-binding properties (affinity) for antigen compared to parental mouse antibodies. The loss of affinity is associated with the replacement of certain amino acid residues of the framework regions of the mAb, which closely interact with the amino acid residues of the CDR regions in the variable domains, and thus affect the structure of the antigen-binding site. Therefore, the transfer of only CDR regions during the humanization of antibodies often leads to a loss of antigen-binding properties [C. Queen, W.P. Schneider, H.E. Selick, P.W. Payne, N.F. Landolfi, J.F. Duncan, N.M. Avdalovic, M. Levitt, R.P. Junghans, T.A. Waldmann, Proc. Natl. Acad. sci. USA 86 (1989) 10029-10033]. Queen et al suggested that there are key amino acid residues in the framework regions that interact with the CDRs and thus influence the correct structure of the antigen-binding site. Such residues, in the opinion of the authors, should be transferred to the humanized version of the antibody along with the CDR regions of the mouse mAbs. In order to establish which amino acid residues are key, three-dimensional mAb models obtained in silico and various analysis methods are used. Such methods often make it possible to identify amino acid residues whose substitution in a humanized antibody results in a significant change in its structure. However, such methods cannot always predict key amino acid residues. A very important step in the process of humanization of mouse antibodies is the construction of reliable three-dimensional models of the variable domains of the antibody. It is also necessary to select a source of human mAb framework sequences to which mouse mAb CDR regions will be transplanted. The source of such sequences can be either a mAb with a known primary sequence or germline genes of human antibodies. The advantage of using sequences of known mAbs is the availability of their spatial models obtained on the basis of experimental data (X-ray diffraction analysis). At the same time, the use of germline genes avoids the potential immunogenicity associated with hypersomatic mutations that are present in the genes of previously known antibodies. When humanizing antibodies, consensus sequences of the framework regions of the variable domains of antibodies can also be used.

Авторы настоящего изобретения использовали гены зародышевой линии антител человека для гуманизации мышиного мАТ 6H8. С помощью сервиса ROSETTA были построены, а затем оптимизированы пространственные модели мышиного и различных вариантов гуманизированного мАТ 6H8. В результате были выявлены 3 ключевых аминокислотных остатка каркасных областей мышиного антитела (2 в тяжелой цепи мАТ и 1 в легкой цепи), необходимых для поддержания структуры антиген-связывающего центра мАТ 6H8. Совместная пересадка CDR-участков с четырьмя ключевыми аминокислотными остатками каркасных областей мышиного мАТ 6H8 позволила получить авторам изобретения гуманизированное мАТ 6H8Hu, характеризующееся аффинностью, не уступающей родительскому мышиному мАТ.The present inventors used human germline antibody genes to humanize the mouse mAb 6H8. Using the ROSETTA service, spatial models of the murine and various variants of the humanized mAb 6H8 were built and then optimized. As a result, 3 key amino acid residues of the framework regions of the mouse antibody (2 in the heavy chain of the mAb and 1 in the light chain) were identified, which are necessary to maintain the structure of the antigen-binding center of the mAb 6H8. Co-grafting of the CDRs with four key amino acid residues of the mouse mAb 6H8 framework regions provided the inventors with a humanized mAb 6H8Hu with an affinity equal to that of the parental mouse mAb.

Наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является мышиное мАТ 6H8, селективно связывающееся с опухолевым антигеном PRAME человека, описанное в статье [В. А. Мисюрин, Ю. П. Финашутина, А. А. Турба, М. В. Ларина, О. Н. Солопова, Н. А. Лыжко, Л. А. Кесаева, Н. Н. Касаткина, Т. К. Алиев, А. В. Мисюрин, М. П. Кирпичников. (2019) Эпитопный анализ мышиных и химерных моноклональных антител, распознающих раково-тестикулярный антиген PRAME. Доклады академии наук, Том 492, номер. 1, стр. 135-138]. В статье описано мАТ, связывающееся с антигеном PRAME, полученное с помощью гибридомной технологии при иммунизации мышей рекомбинантным белком PRAME. Данное антитело характеризуется высокой аффинностью 1.2 нМ по отношению к антигену PRAME. Однако, использование моноклональных антител животного происхождения имеет ряд недостатков при терапии заболеваний человека, особенно выраженных при повторных введениях препарата. Например, мышиные моноклональные антитела имеют короткое время циркуляции в организме человека, а также вследствие неспособности их Fc-фрагмента связываться с человеческими рецепторами на поверхности эффекторных клеток не обладают важными функциональными характеристиками. Так, например, такие антитела не могут обеспечивать развитие антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, которая является важным механизмом разрушения опухолевых клеток.Closest to the claimed invention (prototype) is a murine mAb 6H8, selectively binding to the human tumor antigen PRAME, described in the article [C. A. Misyurin, Yu. P. Finashutina, A. A. Turba, M. V. Larina, O. N. Solopova, N. A. Lyzhko, L. A. Kesaeva, N. N. Kasatkina, T. K. Aliev, A. V. Misyurin, M. P. Kirpichnikov. (2019) Epitope analysis of murine and chimeric monoclonal antibodies recognizing the PRAME cancer-testicular antigen. Reports of the Academy of Sciences, Volume 492, no. 1, pp. 135-138]. The article describes the mAb that binds to the PRAME antigen, obtained using hybridoma technology when mice are immunized with the recombinant PRAME protein. This antibody has a high affinity of 1.2 nM for the PRAME antigen. However, the use of monoclonal antibodies of animal origin has a number of disadvantages in the treatment of human diseases, especially pronounced with repeated injections of the drug. For example, mouse monoclonal antibodies have a short circulation time in the human body and, due to the inability of their Fc fragment to bind to human receptors on the surface of effector cells, do not have important functional characteristics. For example, such antibodies cannot ensure the development of antibody-dependent cellular cytotoxicity, which is an important mechanism for the destruction of tumor cells.

Также важной особенностью мышиных моноклональных антител является то, что они содержат аминокислотные последовательности, которые являются иммуногенными для человека.Also an important feature of mouse monoclonal antibodies is that they contain amino acid sequences that are immunogenic in humans.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, было получение гуманизированного моноклонального антитела, способного к селективному связыванию с опухолевым антигеном PRAME человека, и отличающегося по аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей от известных из предшествующего уровня техники моноклональных антител к антигену PRAME человека и обладающих низкой иммуногенностью для человека по сравнению с мышиными моноклональными антителами.The technical problem solved by the present invention was to obtain a humanized monoclonal antibody capable of selectively binding to the human PRAME tumor antigen, and differing in the amino acid sequence of the light and heavy chain variable domains from the monoclonal antibodies known from the prior art against the human PRAME antigen and having low immunogenicity. for humans compared with mouse monoclonal antibodies.

А также получение изолированных фрагментов ДНК, кодирующих участки легкой и тяжелой цепей указанного антитела и антигенсвязывающего фрагмента указанного гуманизированного моноклонального антитела.As well as obtaining isolated DNA fragments encoding sections of the light and heavy chains of the specified antibody and the antigen-binding fragment of the specified humanized monoclonal antibody.

Техническим результатом является получение нового гуманизированного моноклонального антитела IgG1-изотипа, способного к связыванию с опухолевым антигеном PRAME человека, и характеризующегося константой диссоциации комплекса антиген-антитело 1,2 нМ с допустимой величиной погрешности 10%, что не уступает константе диссоциации ближайшего аналога, мышиного мАТ 6H8. При этом гуманизированное мАТ 6H8Hu можно использовать для лечения человека. The technical result is to obtain a new humanized monoclonal antibody of the IgG1 isotype capable of binding to the human tumor antigen PRAME, and characterized by a dissociation constant of the antigen-antibody complex of 1.2 nM with an allowable error of 10%, which is not inferior to the dissociation constant of the closest analogue, mouse mAb 6H8. However, the humanized mAb 6H8Hu can be used for human treatment.

Техническая проблема решается получением гуманизированного мАТ 6H8Hu, селективно связывающего белок PRAME человека, включающего вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), который содержит последовательность гипервариабельных регионов CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (VL), который содержит последовательность гипервариабельных регионов CDRL1, CDRL2 и CDRL3. При этом, гуманизированное антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO:1; а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO:2, а также фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей указанного антитела.The technical problem is solved by obtaining a humanized mAb 6H8Hu that selectively binds the human PRAME protein, including the variable domain of the heavy chain of immunoglobulin (VH), which contains the sequence of hypervariable regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and the variable domain of the light chain of immunoglobulin (VL), which contains the sequence of hypervariable regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3. Wherein, the humanized antibody comprises a heavy chain variable region (VH) of said antibody containing an amino acid sequence at least 90% homologous to SEQ ID NO:1; and the light chain variable region (VL) of said antibody contains an amino acid sequence at least 90% homologous to SEQ ID NO:2, as well as DNA fragments encoding variable light and heavy chain fragments of said antibody.

Техническая проблема решается также тем, что получен фрагмент ДНК, кодирующий антитело или его фрагмент. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VH указанного антитела, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VL указанного антитела, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.The technical problem is also solved by the fact that a DNA fragment encoding an antibody or a fragment thereof has been obtained. An isolated DNA fragment encoding the VH of the indicated antibody, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. An isolated DNA fragment encoding the VL of the indicated antibody, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

Техническая проблема решается также тем, что получен антиген-связывающий фрагмент указанного гуманизированного антитела, представляющий собой комбинацию вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, и вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.The technical problem is also solved by the fact that an antigen-binding fragment of the indicated humanized antibody is obtained, which is a combination of the variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody with an amino acid sequence that is at least 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and the variable region of the light chain (VL) said antibody with an amino acid sequence at least 90% homologous to SEQ ID NO: 2.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На Фиг. 1 показано расположение участков CDRs в вариабельном домене легкой 6H8HuL и тяжелой 6H8HuH цепей гуманизированного мАТ 6H8Hu. Участки CDRs подчеркнуты.On FIG. 1 shows the location of CDRs in the variable domain of the 6H8HuL light and 6H8HuH heavy chains of the humanized 6H8Hu mAb. Areas of CDRs are underlined.

На Фиг. 2 показана гель-электрофореграмма гуманизированного мАТ 6H8Hu в 10%-м полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), а также без или в присутствии β-меркаптоэтанола; М - белковые маркеры молекулярного веса, (-) - мАТ 6H8Hu без β-меркаптоэтанола, (+) - мАТ 6H8Hu в присутствии β-меркаптоэтанола.On FIG. 2 shows a gel electropherogram of humanized mAb 6H8Hu in 10% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) and also without or in the presence of β-mercaptoethanol; M - protein molecular weight markers, (-) - mAb 6H8Hu without β-mercaptoethanol, (+) - mAb 6H8Hu in the presence of β-mercaptoethanol.

На Фиг. 3 показан иммуноблот связывания гуманизированного мАТ 6H8Hu. 1 - рекомбинантный белок NY-ESO-1, 2 - рекомбинантный белок PRAME в восстанавливающих условиях, 3 - рекомбинантный белок PRAME в невосстанавливающих условиях.On FIG. 3 shows a humanized mAb 6H8Hu binding immunoblot. 1 - recombinant NY-ESO-1 protein, 2 - recombinant PRAME protein under reducing conditions, 3 - recombinant PRAME protein under non-reducing conditions.

На Фиг. 4 показано измерение аффинности гуманизированного мАТ 6H8Hu по отношению к рекомбинантному белку PRAME. Измерение проводили на биосенсоре Attana Cell A200.On FIG. 4 shows the measurement of the affinity of the humanized 6H8Hu mAb for the recombinant PRAME protein. The measurement was carried out on an Attana Cell A200 biosensor.

На Фиг. 5 показана схема экспрессионной плазмиды, кодирующей легкую цепь гуманизированного мАТ 6H8Hu.On FIG. 5 shows a schematic of an expression plasmid encoding the humanized mAb 6H8Hu light chain.

На Фиг. 6 показана схема экспрессионной плазмиды, кодирующей тяжелую цепь гуманизированного мАТ 6H8Hu.On FIG. 6 shows a schematic of an expression plasmid encoding the heavy chain of the humanized mAb 6H8Hu.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Как хорошо известно, минорные изменения аминокислотной последовательности, такие как делеция, добавление или замена одной, небольшого количества или даже нескольких аминокислот, могут приводить к получению аллельной формы исходного белка, которая обладает практически идентичными свойствами.As is well known, minor changes in the amino acid sequence, such as deletion, addition or substitution of one, a small number or even a few amino acids, can lead to an allelic form of the original protein, which has almost identical properties.

Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированными с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата [Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office] в сочетании c данными рентгеноструктурного анализа, как указано в заявке WO 91/09967. Участки CDRs и каркасные участки антител могут также быть определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org).Antibodies usually consist of two heavy chains linked by disulfide bonds and light chains associated with the N-terminus of each of the heavy chains. Each heavy chain contains a variable domain at the N-terminus with a constant domain at the other end. Each light chain contains a variable domain at the N-terminus with a constant domain at the other end. The variable domains of each pair of light and heavy chains form an antigen-binding site. The light and heavy chain variable domains have a similar overall structure, and each domain includes a framework of four regions, the sequences of which are relatively conserved, linked through three complementarity determining regions (CDRs). The four framework regions form a conformation such as a beta sheet. The CDRs are located in close proximity to each other due to the framework regions and contribute to the formation of the antigen-binding site. CDRs and framework regions of antibodies can be defined by reference to the Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office] in combination with X-ray diffraction data as described in WO 91/09967. CDRs and framework regions of antibodies can also be defined according to the nomenclature of the International Immunogenetics Information System (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org).

Если не указано иное, любая представленная в описании полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность, которая начинается на N-конце и заканчивается на С-конце. Если антигенсвязывающий центр содержит и VH-, и VL-области, то они могут быть расположены на одной и той же полипептидной молекуле или предпочтительно каждая область может располагаться на разных цепях, VH-область может быть частью тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента, а VL-область - частью легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента. Под иммуноглобулином в данном изобретении понимается иммуноглобулин, относящийся к следующим классам: IgG, IgA, IgM, IgD. Предпочтительным является использование тяжелой цепи антитела подкласса IgG1, а легкой цепи каппа-класса. Также могут быть использованы тяжелые цепи подклассов IgG2, IgG3, IgG4. Под фрагментами антител понимают одноцепочечное антитело (вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела, объединенных с помощью линкерной белковой последовательности в любой ориентации), Fab-фрагмент антитела, (Fab)2- фрагмент антитела, а также любые другие фрагменты, включающие вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.Unless otherwise indicated, any polypeptide chain described herein has an amino acid sequence that starts at the N-terminus and ends at the C-terminus. If the antigen binding site contains both VH and VL regions, they may be located on the same polypeptide molecule, or preferably each region may be located on different chains, the VH region may be part of an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, and the VL -region - part of the light chain of an immunoglobulin or its fragment. Under the immunoglobulin in this invention refers to an immunoglobulin belonging to the following classes: IgG, IgA, IgM, IgD. It is preferable to use the heavy chain of an antibody of the IgG1 subclass and the light chain of the kappa class. Heavy chains of the IgG2, IgG3, IgG4 subclasses can also be used. Antibody fragments are understood to mean a single-chain antibody (variable domains of the light and heavy chains of an antibody combined using a linker protein sequence in any orientation), an antibody Fab fragment, (Fab) 2 - an antibody fragment, as well as any other fragments that include a heavy chain variable region (VH) of said antibody containing an amino acid sequence at least 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and the light chain variable region (VL) of said antibody contains an amino acid sequence at least 90% homologous to SEQ ID NO: 2.

Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The following examples are provided for purposes of explanation and do not limit the scope of the present invention in any way.

Пример 1. Гуманизация моноклонального антитела 6H8 и биосинтез полученного гуманизированного моноклонального антитела 6H8Hu в клетках эукариот. Example 1 Humanization of the 6H8 monoclonal antibody and biosynthesis of the resulting humanized 6H8Hu monoclonal antibody in eukaryotic cells.

Гуманизированное моноклональное антитело 6H8Hu получают на основе мышиного моноклонального антитела 6H8, полученного путем иммунизации мышей Balb/C человеческим рекомбинантным белком PRAME, экспрессированным в E.coli, дальнейшего получения и селекции линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному белку PRAME человека, анализа аффинности и специфичности отобранного моноклонального антитела, определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности его вариабельных доменов.The humanized monoclonal antibody 6H8Hu is obtained on the basis of the mouse monoclonal antibody 6H8 obtained by immunizing Balb/C mice with the human recombinant PRAME protein expressed in E. coli, further obtaining and selecting hybridoma lines producing monoclonal antibodies to the recombinant human PRAME protein, analysis of affinity and specificity selected monoclonal antibody, determining the nucleotide and amino acid sequence of its variable domains.

Метод «пересадки CDR» заключается в нахождении последовательностей зародышевых линий антител человека, наиболее гомологичных последовательностям моноклональных мышиных антител, и создании гибридных молекул, содержащих каркасные участки антител человека и гипервариабельные участки исходных мышиных антител. Путем сравнения с последовательностями зародышевых линий человека в сервисе IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) определяют наиболее гомологичные антителу 6H8 зародышевые линии антител человека и отбирают линии с большей степенью гомологии и меньшим числом неблагоприятных замен. Для легкой цепи моноклонального антитела 6H8 наибольшую степень гомологии демонстрирует последовательность линии IGKV1-39*01 для V-сегмента и IGKJ4*02 для J-сегмента, а для тяжелой цепи наиболее гомологичный V-сегмент относится к зародышевой линии IGHV1-2*02 и J-сегмент к линии IGHJ4*01.The "CDR transplant" method consists in finding human antibody germline sequences that are most homologous to the sequences of monoclonal mouse antibodies and creating hybrid molecules containing human antibody framework regions and hypervariable regions of the original mouse antibodies. By comparison with human germline sequences, the IgBLAST service (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) determines the most homologous human antibody germlines for the 6H8 antibody and selects lines with a greater degree of homology and fewer unfavorable substitutions. For the light chain of the monoclonal antibody 6H8, the highest degree of homology is shown by the sequence of the line IGKV1-39*01 for the V segment and IGKJ4*02 for the J segment, and for the heavy chain, the most homologous V segment belongs to the germ line IGHV1-2*02 and J -segment to line IGHJ4*01.

Участки CDRs оставляют без изменения, а каркасные участки мышиного антитела заменяют на гомологичные человеческие. The CDRs are left unchanged, and the framework regions of the mouse antibody are replaced with homologous human ones.

Проводят оптимизацию получаемых последовательностей путем создания моделей пространственной структуры гуманизированного антитела методом моделирования на основании гомологии (веб-сервис Rosetta Antibody). Реализация этого метода включает следующие шаги: 1) поиск шаблонов среди антител с известной пространственной структурой и сходной аминокислотной последовательностью, 2) построение начальных моделей с использованием консервативных фрагментов шаблонов и VH/VL последовательности запроса, 3) улучшение начальных моделей путем подбора оптимальных конформаций основной цепи VH/VL и боковых цепей по всем моделям в целом. Полученные стартовые модели дополнительно оптимизируют с учетом окружающего растворителя, для чего в программе Gromacs (http://www.gromacs.org/) с использованием силового поля charmm36 проводят расчет молекулярной динамики (МД) моделей в водном растворе при температуре 300К и физиологической концентрации NaCl в течение 10 нс. Анализ МД показывает, что модели принимают свои равновесные конформации уже через 1 нс. Полученные траектории МД подвергают кластерному анализу и наиболее представительные конформации для каждой из стартовых моделей в дальнейшем используются в качестве окончательных моделей, анализ которых позволяет сформулировать ряд «возвратных» замен в каркасных участках VH (R70A, T73K, R82aS) и VL (D70Q) гуманизированного моноклонального антитела к опухолевому антигену PRAME человека. The resulting sequences are optimized by creating models of the spatial structure of a humanized antibody by modeling based on homology (Rosetta Antibody web service). The implementation of this method includes the following steps: 1) searching for templates among antibodies with a known spatial structure and a similar amino acid sequence, 2) building initial models using conservative template fragments and the VH/VL query sequence, 3) improving initial models by selecting optimal main chain conformations VH/VL and side chains for all models in general. The resulting starting models are additionally optimized taking into account the surrounding solvent, for which the Gromacs program (http://www.gromacs.org/) using the charmm36 force field calculates the molecular dynamics (MD) of models in an aqueous solution at a temperature of 300 K and a physiological concentration of NaCl within 10 ns. The MD analysis shows that the models assume their equilibrium conformations after 1 ns. The resulting MD trajectories are subjected to cluster analysis, and the most representative conformations for each of the starting models are subsequently used as final models, the analysis of which allows us to formulate a number of "return" substitutions in the VH (R70A, T73K, R82aS) and VL (D70Q) framework regions of the humanized monoclonal antibodies to the human PRAME tumor antigen.

На основании полученных аминокислотных последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела 6H8Hu (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2) и путем оптимизации кодонов составляют кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела 6H8Hu (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4). Аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей полученного гуманизированного антитела 6H8Hu с отмеченными гипервариабельными участками представлены на Фиг. 1. Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела 6H8Hu получают методом химико-ферментативного синтеза [Ильина Е.Н., Солопова О.Н., Балабашин Д.С., Ларина М.В., Алиев Т.К., Гребенникова Т.В., Лосич М.А., Зайкова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение и характеризация нейтрализующего моноклонального антитела против вируса бешенства. Биоорганическая химия. 2019;45(1):58-68]. Последовательности VL и VH мАТ 6H8Hu были синтезированы из перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Олигонуклеотиды имели длину от 40 до 50 оснований, при этом они попарно перекрываются между собой (10-12 оснований) и имели приблизительно одинаковую температуру отжига (~50°С). Вариабельные домены были объединены с лидерным пептидом и соответствующими константными областями (константным доменом легкой каппа-цепи человека и константной областью антитела IgG1 человека). Также на 5’-конец каждой цепи антитела была добавлена последовательность Козак, важная для инициации трансляции. Все части перед клонированием в экспрессионный вектор объединяют методом SOE-ПЦР (Single overlap extention- ПЦР, ПЦР с перекрывающимися областями). При наработке фрагментов ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепь мАТ, лидерный пептид и последовательность Kozak используют внешние праймеры, содержащие последовательности узнавания эндонуклеаз рестрикции NheI (в прямом праймере) и XhoI (в реверсном праймере). Экспрессионные кассеты, кодирующие легкую и тяжелую цепь мАТ 6H8Hu клонируют отдельно по сайтам NheI/XhoI в экспрессионый вектор pcDNA3.4, под контроль промотора CMV [Ильина Е.Н., Солопова О.Н., Балабашин Д.С., Ларина М.В., Алиев Т.К., Гребенникова Т.В., Лосич М.А., Зайкова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение и характеризация нейтрализующего моноклонального антитела против вируса бешенства. Биоорганическая химия. 2019;45(1):58-68.]. Также могут быть использованы другие коммерческие экспрессионные векторы, содержащие последовательности промоторов CMV, EF-1alpha и других, позволяющими экспрессировать рекомбинантные белки в клетках млекопитающих. в частности в клетках CHO. Такими плазмидными векторами могут быть плазмиды pcDNA3.3, pMG, pCEP4, pOptiVec и другие. Полученные экспрессионные векторы (кодирующие легкую и тяжелую цепи мАТ 6H8Hu, схемы представлены на Фиг. 5-6) используют для биосинтеза гуманизированного моноклонального антитела 6H8Hu в клетках CHO.Based on the obtained amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of the humanized 6H8Hu antibody (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) and by codon optimization, the coding sequences of the heavy and light chains of the humanized 6H8Hu antibody (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4). The amino acid sequences of the light and heavy chains of the resulting humanized 6H8Hu antibody with hypervariable regions marked are shown in FIG. 1. The coding sequences of the heavy and light chains of the humanized 6H8Hu antibody are obtained by chemical-enzymatic synthesis [Ilyina E.N., Solopova O.N., Balabashin D.S., Larina M.V., Aliev T.K., Grebennikova T V., Losich M.A., Zaikova O.N., Sveshnikov P.G., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Preparation and characterization of a neutralizing monoclonal antibody against rabies virus. Bioorganic chemistry. 2019;45(1):58-68]. The VL and VH sequences of mAb 6H8Hu were synthesized from overlapping oligonucleotides by polymerase chain reaction (PCR). The oligonucleotides were 40 to 50 bases in length, overlapping each other in pairs (10-12 bases) and had approximately the same annealing temperature (~50°C). The variable domains were combined with the leader peptide and the corresponding constant regions (human kappa light chain constant domain and human IgG1 antibody constant region). Also, the Kozak sequence, which is important for translation initiation, was added to the 5'-end of each antibody chain. All parts before cloning into an expression vector are combined by SOE-PCR (Single overlap extention - PCR, PCR with overlapping areas). When generating DNA fragments encoding the mAb light and heavy chains, the leader peptide and the Kozak sequence, external primers containing the restriction endonuclease recognition sequences NheI (in the forward primer) and XhoI (in the reverse primer) are used. Expression cassettes encoding the light and heavy chains of mAb 6H8Hu are cloned separately at the NheI/XhoI sites in the pcDNA3.4 expression vector under the control of the CMV promoter [Ilyina E.N., Solopova O.N., Balabashin D.S., Larina M. V., Aliev T.K., Grebennikova T.V., Losich M.A., Zaikova O.N., Sveshnikov P.G., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Preparation and characterization of a neutralizing monoclonal antibody against rabies virus. Bioorganic chemistry. 2019;45(1):58-68.]. Other commercial expression vectors containing CMV, EF-1alpha and other promoter sequences that allow the expression of recombinant proteins in mammalian cells can also be used. in particular in CHO cells. Such plasmid vectors can be plasmids pcDNA3.3, pMG, pCEP4, pOptiVec and others. The resulting expression vectors (encoding the 6H8Hu mAb light and heavy chains, schemes are shown in Figures 5-6) are used to biosynthesize the humanized 6H8Hu monoclonal antibody in CHO cells.

Клетки яичника китайского хомячка CHO DG44 (dhfr -/-) используют для секретируемой экспрессии рекомбинантного гуманизированного моноклонального антитела 6H8Hu. Для этого клетки культивируют в колбах Эрленмейера в CO2-инкубаторе при 37°C, 95% влажности и 8% CO2 в стандартной бессывороточной среде CD DG44 (Invitrogen) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Pluronic F-68 (Invitrogen, USA) до концентрации 4×106 клеток/мл 24 часа до трансфекции. Во флаконы Эрленмейера объемом 125 мл засевают 30 мл клеточной суспензии (4,5 млн клеток) при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об/мин и через 20-24 ч проводят трансфекцию с использованием трансфецирующего реагента Lipofectamine-3000 Transfection Kit (Invitrogen, USA) согласно стандартному протоколу производителя [Lipofectamine-3000 Reagent Protocol, https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf]. Плазмидную ДНК добавляют к клеткам в виде ДНК-липосомного преципитата. Культуральный флакон инкубируют при температуре 37°C, 95% влажности, в атмосфере 8% CO2 и непрерывном перемешивании 130 об/мин. После 7-9 дней инкубации культуры осаждают центрифугированием при 1200 оборотах/мин в течение 10 минут. Супернатант дополнительно центрифугируют при 4000 оборотов/мин в течение 15 минут.Chinese hamster ovary CHO DG44 cells ( dhfr -/-) are used for secreted expression of the recombinant humanized monoclonal antibody 6H8Hu. To do this, the cells are cultured in Erlenmeyer flasks in a CO 2 incubator at 37°C, 95% humidity and 8% CO 2 in a standard CD DG44 serum-free medium (Invitrogen) supplemented with 200 mM L-Glutamine solution to a final concentration of 8 mM and containing 0 18% (v/v) Pluronic F-68 (Invitrogen, USA) to a concentration of 4×10 6 cells/ml 24 hours prior to transfection. 30 ml of cell suspension (4.5 million cells) are inoculated into 125 ml Erlenmeyer flasks with constant stirring on an orbital shaker at a frequency of 130 rpm, and after 20-24 hours, transfection is carried out using the transfection reagent Lipofectamine-3000 Transfection Kit (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's standard protocol [Lipofectamine-3000 Reagent Protocol, https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf]. Plasmid DNA is added to the cells as a DNA-liposomal precipitate. The culture flask is incubated at 37° C., 95% humidity, 8% CO 2 , with continuous stirring at 130 rpm. After 7-9 days of incubation, the cultures are pelleted by centrifugation at 1200 rpm for 10 minutes. The supernatant is further centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes.

Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводят с использованием 0.04% раствора трипанового синего в камере Горяева. Продуктивность измеряют с помощью иммуноферментного анализа по стандартной методике.Cell concentration and viability are measured using a 0.04% trypan blue solution in a Goryaev chamber. Productivity is measured using enzyme immunoassay according to standard methods.

Проводят выделение антитела 6H8Hu из культуральной жидкости на колонке с носителем HiTrap MabSelect SuRe (GE Healtcare) объемом 5 мл. К культуральной жидкости добавляют 0,1 объема 10-кратного Tris-HCl буфера (200 мМ Tris-HCl, 1,5 М NaCl рН 7.2) и наносят на предварительно уравновешенную колонку при скорости потока 2-3 мл/мин при давлении не более 0,5 МПа. Колонку промывают буфером Tris-HCl объемом равным 5 объемам колонки. Элюцию осуществляют с помощью глицинового буфера (0.1 М глицин, рН 3.0). Элюированный раствор нейтрализуют, добавляя 0,1 объема буфера для нейтрализации (1 M Tris pH 8.0). Полученный раствор белка диализуют против фосфатного буфера (0,01 М Na2HPO4, 0.137 М NaCl, 0.0027 М KCl, рН 7,2) и стерилизуют через мембранные фильтры 0.22 мкм. Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят с использованием электрофоретического метода. Дополнительно образцы характеризуют с помощью гель-фильтрации по стандартной методике.The 6H8Hu antibody is isolated from the culture liquid on a 5 ml HiTrap MabSelect SuRe (GE Healtcare) column. 0.1 volume of 10-fold Tris-HCl buffer (200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl pH 7.2) is added to the culture liquid and applied to a pre-equilibrated column at a flow rate of 2-3 ml/min at a pressure of not more than 0 .5 MPa. The column was washed with Tris-HCl buffer equal to 5 column volumes. The elution is carried out using glycine buffer (0.1 M glycine, pH 3.0). The eluted solution is neutralized by adding 0.1 volume of neutralization buffer (1 M Tris pH 8.0). The resulting protein solution is dialyzed against phosphate buffer (0.01 M Na 2 HPO 4 , 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.2) and sterilized through 0.22 μm membrane filters. The evaluation of the homogeneity and degree of purification of the drug is carried out using the electrophoretic method. Additionally, the samples are characterized using gel filtration according to standard methods.

Антитела выделены (Фиг. 2) и их аффинность и специфичность, а также способность ингибировать рост клеточных линий, экспрессирующих белок PRAME человека изучены. Antibodies have been isolated (FIG. 2) and their affinity and specificity, as well as their ability to inhibit the growth of cell lines expressing the human PRAME protein, have been studied.

Пример 2. Анализ связывания мышиного моноклонального антитела 6H8 и гуманизированного моноклонального антитела 6H8Hu с опухолевым белком PRAME человека. Example 2 Binding assay of mouse 6H8 monoclonal antibody and humanized 6H8Hu monoclonal antibody to human PRAME tumor protein.

Электрофорез белков проводят по методу Лэммли. В лунку 1 10%-го ПААГ наносят 1 мкг рекомбинантного белка NY-ESO-1 (отрицательный контроль) в буфере с 100 мМ DTT в восстанавливающих условиях, в лунку 2 - 1 мкг рекомбинантного белка PRAME в буфере с 100 мМ DTT в восстанавливающих условиях, в лунку 3 - 1 мкг рекомбинантного белка PRAME в буфере без DTT в невосстанавливающих условиях. После электрофореза перенос белков из геля на Hybond-P PVDF мембрану (GE Healthcare, Великобритания) осуществляют методом полусухого электроблоттинга в течение часа. В качестве первичного антитела используют гуманизированное антитело 6H8Hu в концентрации 3 мкг/мл. Затем инкубируют мембрану с вторичным антителом 4G7-HRP (ОАО «ВЦМДЛ», Россия) в разведении 1:50000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммуноблот представлен на Фигуре 3.Protein electrophoresis is carried out according to the Laemmli method. In well 1 of 10% PAAG, 1 µg of recombinant NY-ESO-1 protein (negative control) in buffer with 100 mM DTT under reducing conditions is applied, in well 2 - 1 µg of recombinant PRAME protein in buffer with 100 mM DTT under reducing conditions , per well 3 - 1 µg of recombinant PRAME protein in buffer without DTT under non-reducing conditions. After electrophoresis, the transfer of proteins from the gel to a Hybond-P PVDF membrane (GE Healthcare, UK) is carried out by semi-dry electroblotting for an hour. The humanized 6H8Hu antibody at a concentration of 3 μg/ml is used as the primary antibody. Then the membrane is incubated with the secondary antibody 4G7-HRP (OAO VCMDL, Russia) at a dilution of 1:50000 for 1 h at room temperature. The immunoblot is shown in Figure 3.

Пример 3. Измерение константы диссоциации (Кд) комплекса гуманизированного мАТ 6H8Hu с рекомбинантным белком PRAME, полученным в E. coli. Example 3 Measurement of the dissociation constant (Kd) of the complex of the humanized mAb 6H8Hu with the recombinant PRAME protein produced in E. coli.

Аффинность моноклонального гуманизированного антитела 6H8Hu измеряли на биосенсоре, использующим технологию QCM (quartz crystal microbalance) Attana Cell A200 (Attana, Швеция). Рекомбинантный белок PRAME (40 мкг/мкл) иммобилизуют на LNB-carboxyl сенсорный чип, пришивая белок ковалентно через аминогруппы. Эксперименты по связыванию гуманизированного антитела 6H8Hu с рекомбинантным белком PRAME проводят в буферном растворе HEPES, содержащим 0.005% полисорбата 20 (25 мкл/мин, 22°C). Три серийных разведения гуманизированного антитела 6H8Hu (в концентрации 12.5-3.1 мкг/мл) наносили на чип с иммобилизованным белком PRAME в трех повторах каждая (Фиг. 4) в случайном порядке. Чип регенерировали раствором глицина 10 мМ, pH=1.5 в течение 30 секунд перед каждым циклом связывания. Перед каждой инъекцией антитела проводили инъекцию буфера, которую использовали как референс при обработке результатов с помощью программного обеспечения Attana Attester (Attana, Швеция). Для расчета константы диссоциации используют модель связывания 1:2.The affinity of the monoclonal humanized antibody 6H8Hu was measured on a biosensor using QCM technology (quartz crystal microbalance) Attana Cell A200 (Attana, Sweden). The recombinant PRAME protein (40 µg/µl) was immobilized on the LNB-carboxyl sensor chip by covalently linking the protein through the amino groups. Binding experiments of the humanized 6H8Hu antibody with the recombinant PRAME protein were carried out in a HEPES buffer solution containing 0.005% polysorbate 20 (25 μl/min, 22°C). Three serial dilutions of the humanized 6H8Hu antibody (at a concentration of 12.5-3.1 μg/ml) were applied to the chip with the immobilized PRAME protein in three repetitions each (Fig. 4) in random order. The chip was regenerated with a 10 mM glycine solution, pH=1.5 for 30 seconds before each binding cycle. Before each antibody injection, a buffer injection was performed, which was used as a reference in processing the results using the Attana Attester software (Attana, Sweden). The 1:2 binding model is used to calculate the dissociation constant.

Пример 4.Example 4

С целью подтверждения того, что при замене отдельных аминокислотных остатков (а.о.) в каркасных регионах на другие а.о. остатки было получено модифицированное антитело, в котором отдельные а.о. изменены на человеческие. Были получены модифицированные последовательности SEQ ID NO: 1М и SEQ ID NO: 2М, имеющая гомологию не менее чем на 90 % (модифицированные а.о. выделены жирным) с SEQ ID NO: 1 (степень гомологии - 93,1%) и SEQ ID NO: 2 (степень гомологии - 93,8%).In order to confirm that when replacing individual amino acid residues (a.a.) in the framework regions with other a.a. residues, a modified antibody was obtained, in which individual a.o. changed to human. Modified sequences of SEQ ID NO: 1M and SEQ ID NO: 2M were obtained, having a homology of at least 90% (modified a.a. highlighted in bold) with SEQ ID NO: 1 (homology - 93.1%) and SEQ ID NO: 2 (degree of homology - 93.8%).

Полученное антитело специфически взаимодействовало с рекомбинантным белком PRAME и значение констант диссоциации комплексов антиген-антитело, равное 1.3 нМ, не отличалось в пределах статистической погрешности от антитела с последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.The resulting antibody specifically interacted with the recombinant PRAME protein, and the value of the dissociation constants of the antigen-antibody complexes, equal to 1.3 nM, did not differ within the statistical error from the antibody with the sequences SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2.

Пример 5. Ингибирование роста клеточных линий, экспрессирующих PRAME с использованием системы xCELLigence. Example 5 Growth Inhibition of PRAME Expressing Cell Lines Using the xCELLigence System.

Анализ влияния гуманизированного антитела 6H8Hu на пролиферацию опухолевых клеток проводили в режиме реального времени с использованием системы xCELLigence.Analysis of the effect of the humanized 6H8Hu antibody on tumor cell proliferation was performed in real time using the xCELLigence system.

Изучение изменений пролиферативного потенциала клеток на приборе с использованием системы xCELLigence происходит за счет измерения прибором электрического импеданса. Электрический импеданс, который измеряется прибором при контакте плазматической мембраны клетки с поверхностью электрода, выражается в изменении электрического потенциала клетки. Изменение величины электрического импеданса под действием антител (либо других цитотоксических агентов, например, клеток) показывает изменение клеточного индекса. Данные изменения выражаются в виде графика в логарифмической системе координат в режиме реального времени.The study of changes in the proliferative potential of cells on the device using the xCELLigence system occurs by measuring the electrical impedance of the device. The electrical impedance, which is measured by the device when the plasma membrane of the cell contacts the electrode surface, is expressed as a change in the electrical potential of the cell. A change in the magnitude of the electrical impedance under the action of antibodies (or other cytotoxic agents, such as cells) indicates a change in the cellular index. These changes are expressed as a graph in a logarithmic coordinate system in real time.

Проводили серию экспериментов по изучению изменений клеточного индекса линии меланомы Mel P совместной инкубации с гуманизированным антителом 6H8Hu с конечной концентрацией в лунке 100 мкг/мл.A series of experiments was carried out to study changes in the cell index of the Mel P melanoma line co-incubated with a humanized 6H8Hu antibody with a final concentration in the well of 100 μg/ml.

В качестве отрицательного контроля использовали гуманизированное мАТ 1C5Hu (специфичное к гликопротеину вируса бешенства) с конечной концентрацией в лунке 100 мкг/мл и раствор фосфатно-солевого буфера. Клетки линии MelP снимали с подложки с помощью среды RPMI 1640 (Sigma Aldrich, США) и ресуспендировали в той же среде. Затем подсчитывали концентрации клеток в камере Горяева, клетки засевали в лунки 16 луночного культурального планшета с концентрацией клеток 25000/мл для линии MelP c содержанием фетальной бычьей сыворотки равной 10%. Время инкубации клеток в лунках прибора xCELLingence составляло 24 часа при условии температуры +37С° и содержании СО2, равном 5%. После 24 часов инкубации клеток очередной цикл работы прибора приостанавливали. К клеткам в лунках культурального 16-луночного планшета добавляли гуманизированное антитело 6H8Hu и контрольное мАТ 1C5Hu (специфичное к гликопротеину вируса бешенства).Humanized mAb 1C5Hu (specific for rabies virus glycoprotein) with a final well concentration of 100 µg/ml and phosphate buffered saline were used as a negative control. MelP cells were removed from the substrate using RPMI 1640 medium (Sigma Aldrich, USA) and resuspended in the same medium. Then the cell concentrations in the Goryaev chamber were counted, the cells were seeded in the wells of a 16-well culture plate with a cell concentration of 25,000/ml for the MelP line with a fetal bovine serum content of 10%. The cell incubation time in the wells of the xCELLingence instrument was 24 hours at a temperature of +37°C and a CO 2 content of 5%. After 24 hours of cell incubation, the next cycle of operation of the device was suspended. The humanized 6H8Hu antibody and control mAb 1C5Hu (specific for rabies virus glycoprotein) were added to the cells in the wells of a 16-well culture plate.

Полученные результаты эксперимента по совместной инкубации антител с клетками линии Mel P и изменения ее клеточного индекса показали способность гуманизированного мАТ 6H8Hu к антигену PRAME ингибировать пролиферацию меланомной клеточной линии MelP, экспрессирующей белок PRAME.The results of the experiment on co-incubation of antibodies with Mel P cells and changes in its cell index showed the ability of the humanized mAb 6H8Hu to the PRAME antigen to inhibit the proliferation of the MelP melanoma cell line expressing the PRAME protein.

Пример 6. Фрагменты ДНК, кодирующий вариабельные тяжелую и легкую цепи гуманизированного мАТ, селективно связывающего антиген PRAME, содержащего последовательность аминокислот, гомологичную SEQ ID NO: 1 и последовательность аминокислот, гомологичную SEQ ID NO: 2 приведены в перечне последовательностей - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. Example 6. DNA fragments encoding the variable heavy and light chains of a humanized mAb that selectively binds the PRAME antigen, containing an amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence homologous to SEQ ID NO: 2 are shown in the sequence listing - SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего<110> Federal State Budgetary Educational Institution of Higher

профессионального образования "Московский государственный университет имениvocational education "Moscow State University named after

М.В.Ломоносова" (МГУ)M.V. Lomonosov" (Moscow State University)

<120> ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО 6H8HU, СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С ОПУХОЛЕВЫМ АНТИГЕНОМ<120> HUMANIZED ANTIBODY 6H8HU BINDING TO TUMOR ANTIGEN

PRAME, ФРАГМЕНТЫ ДНК, КОДИРУЮЩИЕ УКАЗАННОЕ АНТИТЕЛО И АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙPRAME, DNA FRAGMENTS ENCODING SPECIFIED ANTIBODY AND ANTIGEN BINDING

ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛАANTIBODY FRAGMENT

<160> SEQ ID NО:1<160> SEQ ID NO:1

<210> 1<210> 1

<211> 117<211> 117

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Variable domain of heavy chain of monoclonal humanized antibody<223> Variable domain of heavy chain of monoclonal humanized antibody

6H8Hu to human antigen PRAME6H8Hu to human antigen PRAME

<400> 1<400> 1

1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT TSWMHWVRQA PGQGLEWMGY1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT TSWMHWVRQA PGQGLEWMGY

51 INPNSDYTKY NQKFKDRVTM TADKSISTAY MELSSLRSDD TAVYYCARRG51 INPNSDYTKY NQKFKDRVTM TADKSISTAY MELSSLRSDD TAVYYCARRG

101 PLALDYWGQG TLVTVSS101 PLALDYWGQG TLVTVSS

<160> SEQ ID NО:1M<160> SEQ ID NO:1M

<400> 1M<400> 1M

1 EVQLVETGSG IVQPGGSLRL SCAASGITFS DYGMVWVRQA PGKALEWVSY1 EVQLVE T G S G I VQPGGSLRL SCAASGITFS DYGMVWVRQA PGK A LEWVSY

51 ISSGSSTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNTIRAED SAVYYCAHYY51 ISSGSSTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMN TI RAED S AVYYCAHYY

101 GFGFSYWGQG TLVTVAS101 GFGFSYWGQG TLVTV A S

<160> SEQ ID NО:2<160> SEQ ID NO:2

<210> 1<210> 1

<211> 107<211> 107

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Variable domain of light chain of monoclonal humanized antibody<223> Variable domain of light chain of monoclonal humanized antibody

6H8Hu to human antigen PRAME6H8Hu to human antigen PRAME

<400> 2<400> 2

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY SNLAWYQQKP GKAPKLLIYT1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY SNLAWYQQKP GKAPKLLIYT

51 ATNLADGVPS RFSGSGSGTQ FTLTISSLQP EDFATYYCQH FWGTPLTFGG51 ATNLADGVPS RFSGSGSGTQ FTLTISSLQP EDFATYYCQH FWGTPLTFGG

101 GTKVEIK101 GTKVEIK

<160> SEQ ID NО:2M<160> SEQ ID NO:2M

<400> 2M<400> 2M

1 DVVMTQTPLS LPVSLGQPAS ISCRSSQSLV HSNGNTYSHW FQQRPGQSPR1 DVVMTQ T PLS LPV S LGQPAS ISCRSSQSLV HSNGNTYSHW FQQRPGQSPR

51 LLIYKVSNRF SGVPDRFTGS ASGTDFTLKL TRVEAEDVGV YYCSQSTHVP51 LLIYKVSNRF SGVDRF T GS A SGTDFTLK L T RVEAEDVGV YYCSQSTHVP

101 FTFGQGSKVE IK101 FTFGQG S KVE IK

<160> SEQ ID NО:3<160> SEQ ID NO:3

<210> 1<210> 1

<211> 351<211> 351

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 3<400> 3

1 CAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC1 CAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC

51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACCTTCACC ACCTCCTGGA51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACCTTCACC ACCTCCTGGA

101 TGCACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATGGGATAC101 TGCACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATGGGATAC

151 ATCAATCCTA ACAGTGATTA TACTAAATAC AATCAGAAGT TCAAGGACAG151 ATCAATCCTA ACAGTGATTA TACTAAATAC AATCAGAAGT TCAAGGACAG

201 GGTCACCATG ACCGCAGACA AATCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA201 GGTCACCATG ACCGCAGACA AATCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA

251 GCAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGACGTGGA251 GCAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGACGTGGA

301 CCCCTTGCTC TGGACTACTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCCTC A301 CCCTTGCTC TGGACTACTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCCTC A

<160> SEQ ID NО:4<160> SEQ ID NO:4

<210> 1<210> 1

<211> 321<211> 321

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 4<400> 4

1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTTGGAGA1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTTGGAGA

51 CAGAGTCACC ATCACTTGCC GAGCAAGCGA GAACATCTAC AGTAATTTAG51 CAGAGTCACC ATCACTTGCC GAGCAAGCGA GAACATCTAC AGTAATTTAG

101 CATGGTATCA GCAGAAACCA GGCAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATACT101 CATGGTATCA GCAGAAACCA GGCAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATACT

151 GCAACAAACT TAGCAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC151 GCAACAAACT TAGCAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC

201 TGGGACACAG TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG201 TGGGACACAG TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG

251 CAACTTACTA CTGTCAACAT TTCTGGGGTA CTCCGCTCAC GTTCGGCGGA251 CAACTTACTA CTGTCAACAT TTCTGGGGTA CTCCGCTCAC GTTCGGCGGA

301 GGGACCAAGG TGGAGATCAA A301 GGGACCAAGG TGGAGATCAA A

<---<---

Claims (4)

1. Гуманизированное моноклональное антитело, селективно связывающее опухолевый антиген PRAME человека, включающее вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.1. A humanized monoclonal antibody that selectively binds the human PRAME tumor antigen, comprising the heavy chain variable region (VH) of the indicated antibody, containing an amino acid sequence at least 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and the light chain variable region (VL) of the indicated The antibody contains an amino acid sequence at least 90% homologous to SEQ ID NO: 2. 2. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VH антитела по п. 1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.2. An isolated DNA fragment encoding the VH of the antibody according to claim 1, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. 3. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VL антитела по п. 1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.3. An isolated DNA fragment encoding the VL of the antibody according to claim 1, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. 4. Антигенсвязывающий фрагмент моноклонального антитела по п. 1, селективно связывающий опухолевый антиген PRAME человека, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичной SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичной SEQ ID NO: 2.4. An antigen-binding fragment of a monoclonal antibody according to claim 1, which selectively binds the human PRAME tumor antigen, containing the heavy chain variable region (VH) of the indicated antibody with an amino acid sequence of at least 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region (VL) said antibody with an amino acid sequence at least 90% homologous to SEQ ID NO: 2.
RU2020139037A 2020-11-27 2020-11-27 Humanized antibody 6h8hu, binding to tumour antigen prame, dna fragments coding said antibody and antigen-binding antibody fragment RU2768737C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020139037A RU2768737C1 (en) 2020-11-27 2020-11-27 Humanized antibody 6h8hu, binding to tumour antigen prame, dna fragments coding said antibody and antigen-binding antibody fragment

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020139037A RU2768737C1 (en) 2020-11-27 2020-11-27 Humanized antibody 6h8hu, binding to tumour antigen prame, dna fragments coding said antibody and antigen-binding antibody fragment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2768737C1 true RU2768737C1 (en) 2022-03-24

Family

ID=80819476

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020139037A RU2768737C1 (en) 2020-11-27 2020-11-27 Humanized antibody 6h8hu, binding to tumour antigen prame, dna fragments coding said antibody and antigen-binding antibody fragment

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2768737C1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8846872B2 (en) * 2009-11-18 2014-09-30 Mannkind Corporation Monoclonal antibodies and diagnostic uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8846872B2 (en) * 2009-11-18 2014-09-30 Mannkind Corporation Monoclonal antibodies and diagnostic uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AARON Y. CHANG et al., A therapeutic T cell receptor mimic antibody targets tumor-associated PRAME peptide/HLA-I antigens, Clin Invest., 2017, Vol.127, N.7, pp.2705-2718. *
AARON Y. CHANG et al., A therapeutic T cell receptor mimic antibody targets tumor-associated PRAME peptide/HLA-I antigens, Clin Invest., 2017, Vol.127, N.7, pp.2705-2718. DOMENICO ORLANDO et al., Adoptive Immunotherapy Using PRAME-Specific T Cells in Medulloblastoma, Cancer Res, 2018, Vol.78, N.12. *
DOMENICO ORLANDO et al., Adoptive Immunotherapy Using PRAME-Specific T Cells in Medulloblastoma, Cancer Res, 2018, Vol.78, N.12. *
МИСЮРИН В. А. и др., Эпитопный анализ мышиных и химерных моноклональных антител, распознающих раково-тестикулярный антиген PRAME, Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 492, N 1, стр. 293-296. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110305210B (en) Novel antibody molecules, methods of making and uses thereof
CA2956000C (en) An anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, a pharmaceutical composition and use
US20200255516A1 (en) Tigit antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
CN109843927B (en) anti-B7-H3 antibodies, antigen binding fragments thereof, and medical uses thereof
US11472882B2 (en) Anti-B7-H4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
IL264964B2 (en) Anti-ctla4 and anti-pd-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
CN111744013B (en) Methods and pharmaceutical combinations for treating diseases using anti-TIGIT antibodies in combination with PD-1 inhibitors
WO2019091449A1 (en) Cd96 antibody, antigen-binding fragment and pharmaceutical use thereof
JP7257971B6 (en) Anti-CD40 Antibodies, Antigen-Binding Fragments Thereof, and Medical Uses Thereof
JP7360720B2 (en) Anti-PD-L1 antibody and its uses
TW202126692A (en) Anti-human Claudin 182 antibody and application thereof
CN111620949A (en) Antibodies that bind human LAG-3, methods of making, and uses thereof
CA3205854A1 (en) Therapeutic and diagnostic agents and uses thereof
CN115386007A (en) anti-GPRC 5D antibody, preparation method and application thereof
WO2023045370A1 (en) Monoclonal antibody targeting tigit
WO2019238074A1 (en) Lag-3 antibody having high affinity and high biological activity, and application thereof
RU2768737C1 (en) Humanized antibody 6h8hu, binding to tumour antigen prame, dna fragments coding said antibody and antigen-binding antibody fragment
WO2022135536A1 (en) Cd3 humanized antibody and application thereof
RU2761876C1 (en) Humanised 5d3hu antibody binding to the prame tumour antigen, dna fragments encoding said antibody, and antigen-binding fragment of the antibody
CN115715297A (en) anti-FLT 3 antibodies and compositions
RU2737466C1 (en) Humanised neutralizing antibody to human interferon-beta
KR102548256B1 (en) Antibody specific for CD22 and uses thereof
WO2022247804A1 (en) Anti-gprc5d antibody, preparation method therefor, and use thereof
RU2539752C2 (en) HUMANISED ANTIBODY AND ANTIGENBINDING FRAGMENT (Fab), WHICH BINDS WITH HUMAN INTERFERON-γ, DNA FRAGMENTS CODING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT
Lee et al. Structural basis of interleukin-17B receptor in complex with a neutralizing antibody for guiding humanization and affinity maturation