RU2762431C1 - Method for isolation of biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of spiny eleuterococcus eleutherococcus senticosus rupr. maxim. - Google Patents

Method for isolation of biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of spiny eleuterococcus eleutherococcus senticosus rupr. maxim. Download PDF

Info

Publication number
RU2762431C1
RU2762431C1 RU2021102178A RU2021102178A RU2762431C1 RU 2762431 C1 RU2762431 C1 RU 2762431C1 RU 2021102178 A RU2021102178 A RU 2021102178A RU 2021102178 A RU2021102178 A RU 2021102178A RU 2762431 C1 RU2762431 C1 RU 2762431C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
biologically active
active substances
suspension
callus
spiny
Prior art date
Application number
RU2021102178A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Александр Юрьевич Просеков
Людмила Константиновна Асякина
Ирина Сергеевна Милентьева
Наталья Сергеевна Величкович
Наталья Вячеславовна Фотина
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) filed Critical федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ)
Priority to RU2021102178A priority Critical patent/RU2762431C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2762431C1 publication Critical patent/RU2762431C1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
    • A61K36/254—Acanthopanax or Eleutherococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. A method for isolating biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of spiny eleuterococus Eleutherococcus senticosus Rupr. Maxim. is proposed, which includes the cultivation of cellular callus, suspension or root cultures of spiny eleuterococus in vitro, extraction of biologically active substances from the callus culture with ethyl alcohol or methanol, with diethyl ether from suspension or root cultures, stirring in a shaker for 60 minutes at room temperature or at a temperature of 60°C, separation of the dry mass by filtration, centrifugation and evaporation at reduced pressure.EFFECT: invention provides for the production of an extract of biologically active substances of a callus, suspension or root culture of spiny eleutherococus, which has antimicrobial activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms.1 cl, 3 tbl, 4 dwg

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения биологически активных веществ антимикробного действия из клеточных культур элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.).The invention relates to the field of biotechnology and can be used in the pharmaceutical industry to obtain biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of Eleutherococcus spiny (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.).

Данные ВОЗ свидетельствуют о том, что состояние среды обитания, качество продуктов питания и лекарственных препаратов во многом не удовлетворяют потребности современного человека [1-3]. В России неуклонно растет число лиц, страдающих или склонных к различным неинфекционным заболеваниям (болезни сердца и сосудов, рак, бронхиальная астма, сахарный диабет и др.), которые, как правило, имеют длительную продолжительность и являются результатом сочетания генетических, физиологических, экологических и поведенческих факторов [4].The WHO data indicate that the state of the environment, the quality of food and medicines, in many respects, does not meet the needs of a modern person [1-3]. In Russia, the number of people suffering or prone to various non-infectious diseases (heart and vascular diseases, cancer, bronchial asthma, diabetes mellitus, etc.) is steadily growing, which, as a rule, have a long duration and are the result of a combination of genetic, physiological, environmental and behavioral factors [4].

Несбалансированное питание, стрессовое воздействие, экологическое неблагополучие и другие негативные факторы перегружают и истощают регуляторные системы организма человека. Одной из актуальных проблем медицины и здравоохранения является поиск и создание новых лекарственных препаратов на основе растительного сырья, а также использование растительных объектов в качестве промышленных продуцентов целевых метаболитов [5].Unbalanced nutrition, stress, environmental problems and other negative factors overload and deplete the regulatory systems of the human body. One of the urgent problems of medicine and health care is the search and creation of new medicinal preparations based on plant raw materials, as well as the use of plant objects as industrial producers of target metabolites [5].

Элеутерококк колючий (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.) - один из представителей группы растений-адаптогенов [6, 7]. Растение широко используется в медицинской практике благодаря высокому спектру фармакологических свойств: повышение тонуса нервной системы, антистрессовой активности и адаптационной резистентности. Свойства элеутерококка колючего характеризуются наличием определенных биологически активных веществ (БАВ), а именно элеутерозидов А, В, B1, Е, E1, I, K, L и М, которые являются гликозидами кумаринов (элеутерозид В1), лигнанов (элеутерозид В, Е, Е1), стеринов (элеутерозид А) и тритерпеновых кислот (элеутерозид I, K, L, М). К другим БАВ элеутерококка колючего относят: фенолы, флавоноиды, фенольные кислоты и др. [8-10]. Для получения экологически чистого сырья с повышенным содержанием БАВ перспективно внедрять современные методы биотехнологии растений - культивирование клеток и органов растений (каллусные, суспензионные, корневые культуры) в условиях in vitro [11]. Для максимального выделения вторичных метаболитов из клеточных культур необходимо подбирать оптимальные условия экстракции.Eleutherococcus spiny (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.) Is one of the representatives of the group of adaptogenic plants [6, 7]. The plant is widely used in medical practice due to its high range of pharmacological properties: increased tone of the nervous system, anti-stress activity and adaptive resistance. The properties of Siberian ginseng are characterized by the presence of certain biologically active substances (BAS), namely, eleutheroside A, B, B1, E, E1, I, K, L and M, which are glycosides of coumarins (eleutheroside B1), lignans (eleutheroside B, E, E1), sterols (eleutheroside A) and triterpenic acids (eleutheroside I, K, L, M). Other BASs of eleutherococcus prickly include: phenols, flavonoids, phenolic acids, etc. [8-10]. To obtain environmentally friendly raw materials with an increased content of biologically active substances, it is promising to introduce modern methods of plant biotechnology - the cultivation of plant cells and organs (callus, suspension, root cultures) in vitro [11]. To maximize the release of secondary metabolites from cell cultures, it is necessary to select the optimal extraction conditions.

Из существующего уровня техники известен способ производства пищевого лекарственного порошка на основе астрагала и элеутерококка (Патент KR №1020080016053, опубл. 21.02.2008). Способ производства экстракта элеутерококка колючего заключается в следующем. Корневище элеутерококка колючего тщательно высушивают, чтобы содержание влаги было не больше 5%. Далее смешивают высушенные корневища и дистиллированную воду (соотношение 1: 18-22) при нагревании в течение 2-3 ч., используя обратный холодильник. После смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, полученный фильтрат концентрируют путем выпаривания растворителя с использованием роторного испарителя при пониженном давлении. Затем концентрат сушат в сублимационной сушилке для получения концентрированного порошка элеутерококка колючего.From the existing level of technology, a method for the production of an edible medicinal powder based on astragalus and eleutherococcus is known (Patent KR No. 1020080016053, publ. 02/21/2008). The method for the production of an extract of Eleutherococcus prickly is as follows. The rhizome of Eleutherococcus prickly is carefully dried so that the moisture content is not more than 5%. Next, mix the dried rhizomes and distilled water (ratio 1: 18-22) with heating for 2-3 hours using a reflux condenser. After the mixture was filtered through filter paper, the resulting filtrate was concentrated by evaporation of the solvent using a rotary evaporator under reduced pressure. Then the concentrate is dried in a freeze dryer to obtain a concentrated powder of Eleutherococcus prickly.

В данном способе неполно описываются параметры экстракции: отсутствует информация о размере частиц и температуре экстракции.This method does not fully describe the extraction parameters: there is no information on the particle size and extraction temperature.

Известен метод извлечения функциональных компонентов из элеутерококка колючего (Патент KR №1020170049984, опубл. 11.05.2017). Способ заключается в следующем. Высушенную кору веток растения измельчают до размера частиц от 3 до 5 мм. Очищенную воду добавляют в пылевидный продукт элеутерококка колючего, после суспендируют. Гидромодуль составляет 1:14-17. Стерилизацию суспензии проводят при 121°С в течение 10-20 мин. Далее суспензию охлаждают до 50°С и добавляют фермент (вискозим, либо пектиназа, либо лактозим, либо пектинекс, либо целлюлакс) для проведения ферментации в течение 0,5-3,0 ч. Для инактивации фермента суспензию нагревают до 121°С в течение 15 мин.There is a known method for extracting functional components from Eleutherococcus spiny (KR Patent No. 1020170049984, publ. 05/11/2017). The method is as follows. The dried bark of plant branches is crushed to a particle size of 3 to 5 mm. Purified water is added to the eleutherococcus prickly pulverulent product, then suspended. The hydromodule is 1: 14-17. The suspension is sterilized at 121 ° C for 10-20 minutes. Next, the suspension is cooled to 50 ° C and an enzyme (viscose, or pectinase, or lactose, or pectinex, or celluax) is added to ferment for 0.5-3.0 hours. To inactivate the enzyme, the suspension is heated to 121 ° C for 15 minutes.

Данный способ характеризуется недостаточной выборкой параметров экстрагирования БАВ (варьируются только используемые ферменты), вследствие чего относительно сложно использовать эти параметры в качестве оптимальных для извлечения БАВ из клеточных культур элеутерококка колючего.This method is characterized by an insufficient selection of parameters for the extraction of biologically active substances (only the enzymes used vary), as a result of which it is relatively difficult to use these parameters as optimal for the extraction of biologically active substances from cell cultures of Eleutherococcus spines.

Наиболее близким к заявляемому способу (ближайшим аналогом) является способ приготовления адаптогенной композиции на основе экстракта элеутерококка колючего (Патент WO № 2020065428, опубл. 02.04.2020). Экстракт получают следующим образом. 10 г измельченных корней элеутерококка колючего трижды подвергают ультразвуковой экстракции с хлороформом (по 50 мл). После каждого цикла экстракции (15 мин) экстракт декантируют и фильтруют. Сырье снова погружают в хлороформ и проводят экстракцию. После третьего цикла сырье сушат в потоке жидкого азота для удаления хлороформа, а затем трижды экстрагируют 75% метанолом (по 50 мл). После каждого цикла экстракции (15 мин) экстракт декантируют и фильтруют. Сырье снова погружают в 75% метанол и проводят экстракцию. Получают 150 мл хлороформного экстракта и 150 мл 75% метанольного экстракта. Экстракты концентрируют с использованием вакуумного испарителя и затем лиофилизируют.Closest to the claimed method (closest analogue) is a method of preparing an adaptogenic composition based on an extract of Eleutherococcus prickly (Patent WO No. 2020065428, publ. 02.04.2020). The extract is obtained as follows. 10 g of crushed roots of Eleutherococcus prickly are subjected to ultrasonic extraction three times with chloroform (50 ml each). After each extraction cycle (15 min), the extract is decanted and filtered. The raw material is again immersed in chloroform and extraction is carried out. After the third cycle, the feedstock is dried in a stream of liquid nitrogen to remove chloroform, and then extracted three times with 75% methanol (50 ml each). After each extraction cycle (15 min), the extract is decanted and filtered. The raw material is again immersed in 75% methanol and extraction is carried out. Get 150 ml of chloroform extract and 150 ml of 75% methanol extract. The extracts are concentrated using a vacuum evaporator and then lyophilized.

Существенным недостатком предложенного способа является сложность технологического процесса. Кроме того, в данном патенте рассмотрены только оптимальные параметры для извлечения БАВ из корней, следовательно, представленные параметры не могут быть рабочими для извлечения БАВ из других клеточных культур элеутерококка колючего.A significant disadvantage of the proposed method is the complexity of the technological process. In addition, this patent discusses only the optimal parameters for the extraction of biologically active substances from the roots, therefore, the presented parameters cannot be working for the extraction of biologically active substances from other cell cultures of Eleutherococcus spines.

Техническая задача, решаемая использованием разработанного изобретения, состоит в разработке нового способа выделения БАВ антимикробного действия из клеточных культур элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.).The technical problem solved by the use of the developed invention is to develop a new method for isolating biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.).

Техническим результатом, полученным при реализации заявленного способа, является получение экстракта биологически активных веществ каллусной, суспензионной, корневой культуры элеутерококка колючего, обладающего антимикробной активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.The technical result obtained during the implementation of the claimed method is to obtain an extract of biologically active substances of callus, suspension, root culture of Eleutherococcus prickly, which has antimicrobial activity against pathogenic and opportunistic microorganisms.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ выделения биологически активных веществ антимикробного действия из клеточных культур элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.), включающий культивирование каллусной, суспензионной, корневой культуры на питательных средах в условиях in vitro. Экстракция БАВ клеточных культур осуществляется при следующих условиях: гидромодуль 1:10, температура 60°С, продолжительность 60 мин. В качестве экстрагента для каллусной культуры используется метанол, для суспензионной и корневой - диэтиловый эфир.To achieve the specified technical result, it is proposed to use a method for isolating biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.), Including the cultivation of callus, suspension, root culture on nutrient media in vitro. Extraction of biologically active substances in cell cultures is carried out under the following conditions: hydromodule 1:10, temperature 60 ° C, duration 60 min. Methanol is used as an extractant for callus culture, and diethyl ether is used for suspension and root cultures.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. На первом этапе осуществляют культивирование каллусных, суспензионных и корневых культур элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.). Для получения каллусной культуры образцы (листовые пластины элеутерококка колючего) стерилизуют в 0,1% растворе сулемы в течение 1 мин, далее промывают трехкратно в течение 20 мин в бидистиллированной воде. Листовую пластину разрезают на сегменты размером 5×5 мм и помещают на агаризованную питательную среду. Цикл субкультивирования составляет 28 суток. Культивирование проводят в стерильных условиях, в темноте, при температуре 26°С и влажности 60-70%.Example 1. At the first stage, callus, suspension and root cultures of Eleutherococcus spiny (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.) Are cultivated. To obtain a callus culture, samples (leaf plates of Eleutherococcus prickly) are sterilized in a 0.1% solution of mercuric chloride for 1 minute, then washed three times for 20 minutes in bidistilled water. The leaf plate is cut into 5 × 5 mm segments and placed on agar nutrient medium. The subcultivation cycle is 28 days. The cultivation is carried out under sterile conditions, in the dark, at a temperature of 26 ° C and a humidity of 60-70%.

Для получения суспензионной культуры подготовку образца осуществляют аналогично предыдущей методике для каллуса. Суспензионные культуры клеток выращивают в жидких питательных средах в колбах объемом 250 мл (30-40 мл суспензии в колбе), на качалке (100 об./мин.). При пересеве на 1 объем инокулюма вносят от 3 до 10 частей свежей среды. Цикл выращивания суспензионных культур составляет 14-21 суток. Культивирование проводят в стерильных условиях, в темноте, при 26°С и влажности 60-70%. Для культивирования каллусной и суспензионной культуры используется среда Мурасиге и Скуга (MS). Состав среды MS (1000 мл): сахароза - 30 г; макросоли по MS - 50 мл; витамины по MS - 1 мл; микроэлементы по MS - 1 мл; Fe-хелат - 5 мл; мезоинозит - 5 мл; агар-агар (для каллусной культуры) - 7 г, гидролизат казеина - 0,5 г; хитозан, жасмоновая кислота, Tween 80, рН 5,6-5,8. Состав солей (1000 мл): NH4NO3 - 33,0 г; KNO3 - 38,0 г; CaCl2 - 24,4 г; MgSO4⋅7H2O - 14,8 г; KH2PO4 - 13,6 г. Состав микроэлементов (1000 мл): MnSO4⋅4H2O - 22,3 г; H3BO3 - 6,2 г; ZnSO4⋅7H2O - 11,5 г; Na2MoO4⋅2H2O - 0,25 г; CuSO4⋅5H2O - 0,025 г; CoCl2⋅6H2O - 0,025 г; KI - 0,825 г. Состав витаминов (1000 мл): тиамин - 0,1 г; пиридоксин - 0,1 г; никотиновая кислота - 0,5 г.To obtain a suspension culture, sample preparation is carried out similarly to the previous method for callus. Suspension cultures of cells are grown in liquid nutrient media in flasks with a volume of 250 ml (30-40 ml of suspension in a flask), on a shaker (100 rpm). When subcultured, 3 to 10 parts of fresh medium are added per volume of inoculum. The growing cycle of suspension cultures is 14-21 days. The cultivation is carried out under sterile conditions, in the dark, at 26 ° C and humidity 60-70%. For the cultivation of callus and suspension culture, the medium of Murashige and Skoog (MS) is used. The composition of the MS medium (1000 ml): sucrose - 30 g; MS macrosalts - 50 ml; MS vitamins - 1 ml; microelements according to MS - 1 ml; Fe-chelate - 5 ml; meso-inositol - 5 ml; agar-agar (for callus culture) - 7 g, casein hydrolyzate - 0.5 g; chitosan, jasmonic acid, Tween 80, pH 5.6-5.8. The composition of the salts (1000 ml): NH 4 NO 3 - 33.0 g; KNO 3 38.0 g; CaCl 2 - 24.4 g; MgSO 4 ⋅ 7H 2 O - 14.8 g; KH 2 PO 4 - 13.6 g. The composition of trace elements (1000 ml): MnSO 4 ⋅4H 2 O - 22.3 g; H 3 BO 3 6.2 g; ZnSO 4 ⋅7H 2 O 11.5 g; Na 2 MoO 4 ⋅2H 2 O - 0.25 g; CuSO 4 ⋅5H 2 O - 0.025 g; CoCl 2 ⋅6H 2 O - 0.025 g; KI - 0.825 g. The composition of vitamins (1000 ml): thiamine - 0.1 g; pyridoxine - 0.1 g; nicotinic acid - 0.5 g.

Культивирование корневых культур осуществляют по следующей методике. Предварительно получают трансформированные генами агробактерий корни. Для этого семена обезжиривают, погружая их на несколько минут в 96%-й этиловый спирт, и просушивают на фильтровальной бумаге либо в токе воздуха в ламинарном боксе. Стерилизацию семян проводят в стерильном ламинарном боксе. В качестве стерилизатора используют диоцид: обезжиренные семена помещают в стерильную колбу с раствором диоцида на 15-20 минут. Для лучшего соприкосновения семян со стерилизующим веществом колбу периодически встряхивают. По окончании стерилизации семена тщательно промывают стерильной дистиллированной водой (4-5 промываний), помещают в чашки Петри на среду Стрита и проращивают в темноте при температуре 26°С. Проклюнувшиеся семена переносят в отдельные пробирки или специальные стеклянные банки со средой того же состава и помещают на свет.The cultivation of root cultures is carried out according to the following method. The roots transformed by Agrobacterium genes are obtained beforehand. To do this, the seeds are defatted by immersing them for a few minutes in 96% ethyl alcohol, and dried on filter paper or in a stream of air in a laminar flow hood. Seeds are sterilized in a sterile laminar flow hood. Diocide is used as a sterilizer: defatted seeds are placed in a sterile flask with diocide solution for 15-20 minutes. For better contact of the seeds with the sterilizing substance, the flask is periodically shaken. At the end of sterilization, the seeds are thoroughly washed with sterile distilled water (4-5 washes), placed in Petri dishes on Street medium and germinated in the dark at a temperature of 26 ° C. The hatched seeds are transferred into separate test tubes or special glass jars with a medium of the same composition and placed in the light.

Для инокуляции эксплантов проростков используют дикий (не модифицированный) штамм Agrobacterium rhizogenes А4, который наращивают на питательной среде YEV в течение 48 часов в темноте при температуре 26°С на качалке с круговым движением (амплитуда 5-10 см, скорость вращения 90 об/мин). Состав питательной среды для культивирования A. rhizogenes (1000 мл): мясной бульон + пептон - 5 г; дрожжевой экстракт - 1 г; сахароза - 6,6 г; MgSO4⋅7H2O - 3 г. Затем готовят питательную среду Мурасиге и Скуга MS

Figure 00000001
N. Состав среды MS
Figure 00000001
N (1000 мл): сахароза - 20 г; макросоли по MS
Figure 00000001
N - 50 мл; витамины по MS - 1 мл; микроэлементы по MS - 1 мл; Fe-хелат - 5 мл; мезоинозит - 5 мл; агар-агар -7 г, рН 5,6-5,8. Состав солей (1000 мл): NH4NO3 - 16,5 г; KNO3 - 19,0 г; CaCl2 - 13,2 г; MgSO4⋅7H2O - 7,4 г; KH2PO4 - 3,4 г. Состав микроэлементов (1000 мл): MnSO4⋅4H2O - 22,3 г; H3BO3 - 6,2 г; ZnSO4⋅7H2O - 11,5 г; Na2MoO4⋅2H2O - 0,25 г; CuSO4⋅5H2O - 0,025 г; CoCl2⋅6H2O - 0,025 г; KI - 0,825 г. Состав витаминов (1000 мл): тиамин - 0,1 г; пиридоксин - 0,1 г; никотиновая кислота - 0,5 г. Питательную среду MS
Figure 00000001
N разливают в 2 колбы по 500 мл. Одну колбу оставляют без введения агара, во вторую вводят агар. Обе колбы автоклавируют 20 минут при 2 атм. Слегка остужают и разливают питательную среду с агаром по чашкам Петри. На следующем этапе помещают часть выросших микроорганизмов (A. rhizogenes) в стерильную воду (объем 100 мл). Подготавливают биоматериал: после появления пары настоящих листьев отделяют от корней надземную часть проростков; разрезают листья, подсемядольное колено и гипокотиль на сегменты размером 1,0-1,5 см. После этого осторожно накалывают иглой инсулинового шприца вдоль жилки по листу, вдоль эпикотиля и гипокотиля, стараясь достать иглой до центра, где проходит сосудистая система растений. Затем переносят экспланты в среду для бактерий YEB и выдерживают в магнитной ванночке 10-100 секунд для более эффективной трансформации. Инкубируют экспланты в течение 48 часов. После инкубации эксплантов с агробактерией растительный материал продолжительно отмывают стерильной питательной средой MS
Figure 00000001
N. Переносят отмытые экспланты на агаризованную среду того же состава, содержащую (250 мг/0,5 л) клафорана для элиминирования A. rhizogenes. Чашки Петри с эксплантами выставляют в «световую» комнату», в которой они находятся до образования трансформированных корней. После достижения определенных размеров образовавшиеся корни пересаживают на свежую питательную среду. Корни доращивают в «темновой» комнате (температура 26°С, влажность 60-70%). После 3-5 последующих пересадок непосредственно корневых эксплантов на агаризованную среду и достижения полной асептичности культуры корни переносят в жидкую питательную среду того же состава. Полученные трансформированные корни выращивают в условиях качания (90 об/мин) в темноте при температуре 26°С. Пересадку полученных корней проводят через каждые 6-8 недель, используя для этого корневую культуру массой 500-750 мг, которую надо помещать в колбы с 50 мл жидкой питательной среды.For inoculation of seedling explants, a wild (unmodified) strain of Agrobacterium rhizogenes A4 is used, which is grown on YEV nutrient medium for 48 hours in the dark at a temperature of 26 ° C on a rocking chair with a circular motion (amplitude 5-10 cm, rotation speed 90 rpm ). The composition of the nutrient medium for the cultivation of A. rhizogenes (1000 ml): meat broth + peptone - 5 g; yeast extract - 1 g; sucrose - 6.6 g; MgSO 4 ⋅7H 2 O - 3 g. Then prepare the culture medium Murashige and Skoog MS
Figure 00000001
N. Composition of MS medium
Figure 00000001
N (1000 ml): sucrose - 20 g; macrosols according to MS
Figure 00000001
N - 50 ml; MS vitamins - 1 ml; microelements according to MS - 1 ml; Fe-chelate - 5 ml; meso-inositol - 5 ml; agar-agar -7 g, pH 5.6-5.8. The composition of the salts (1000 ml): NH 4 NO 3 - 16.5 g; KNO 3 - 19.0 g; CaCl 2 - 13.2 g; MgSO 4 ⋅ 7H 2 O 7.4 g; KH 2 PO 4 - 3.4 g. The composition of trace elements (1000 ml): MnSO 4 ⋅4H 2 O - 22.3 g; H 3 BO 3 6.2 g; ZnSO 4 ⋅7H 2 O 11.5 g; Na 2 MoO 4 ⋅2H 2 O - 0.25 g; CuSO 4 ⋅5H 2 O - 0.025 g; CoCl 2 ⋅6H 2 O - 0.025 g; KI - 0.825 g. The composition of vitamins (1000 ml): thiamine - 0.1 g; pyridoxine - 0.1 g; nicotinic acid - 0.5 g. MS culture medium
Figure 00000001
N is poured into 2 flasks of 500 ml. One flask is left without the addition of agar, the second is injected with agar. Both flasks are autoclaved for 20 minutes at 2 atm. Cool slightly and pour the nutrient medium with agar into Petri dishes. At the next stage, a part of the grown microorganisms (A. rhizogenes) is placed in sterile water (volume 100 ml). The biomaterial is prepared: after the appearance of a pair of true leaves, the aerial part of the seedlings is separated from the roots; the leaves, hypocotyl knee and hypocotyl are cut into 1.0-1.5 cm segments.After that, the insulin syringe is carefully pricked with a needle along the vein along the leaf, along the epicotyl and hypocotyl, trying to reach with the needle to the center where the vascular system of plants passes. The explants are then transferred to the YEB bacteria medium and kept in a magnetic bath for 10-100 seconds for more efficient transformation. The explants are incubated for 48 hours. After incubation of explants with Agrobacterium, the plant material is continuously washed with sterile MS medium
Figure 00000001
N. Transfer the washed explants onto agar medium of the same composition containing (250 mg / 0.5 L) claforan to eliminate A. rhizogenes. Petri dishes with explants are placed in a "light" room, in which they are kept until the formation of transformed roots. After reaching a certain size, the resulting roots are transplanted into a fresh nutrient medium. The roots are grown in a "dark" room (temperature 26 ° C, humidity 60-70%). After 3-5 subsequent transplants of root explants directly onto an agar medium and achieving complete asepticity of the culture, the roots are transferred into a liquid nutrient medium of the same composition. The resulting transformed roots are grown under rocking conditions (90 rpm) in the dark at a temperature of 26 ° C. The resulting roots are transplanted every 6-8 weeks using a root culture weighing 500-750 mg, which must be placed in flasks with 50 ml of liquid nutrient medium.

Сушку клеточных культур осуществляют при температуре 59±2°С до остаточной влажности 10-15%.Drying of cell cultures is carried out at a temperature of 59 ± 2 ° C to a residual moisture content of 10-15%.

На втором этапе осуществляют экстрагирование БАВ из клеточных культур следующим образом. Навеску 3,0 г сухого растительного сырья (каллусная, суспензионная, корневая культура), взвешенную с точностью до 0,001 г, помещают в пластиковую пробирку объемом 50 мл, добавляют 40 мл 70% этилового спирта, помещают в шейкер и перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. Сухую массу отделяют от раствора фильтрованием, фильтрат дополнительно центрифугируют при 3900 об/мин для удаления взвешенных частиц. Растворитель из экстракта упаривают при пониженном давлении из предварительно взвешенной колбы объемом 100 мл. Колбу взвешивают и определяют выход экстракта (таблица 1).At the second stage, biologically active substances are extracted from cell cultures as follows. A portion of 3.0 g of dry plant material (callus, suspension, root culture), weighed to the nearest 0.001 g, is placed in a 50 ml plastic test tube, 40 ml of 70% ethanol is added, placed in a shaker and stirred for 60 minutes at room temperature. The dry mass is separated from the solution by filtration, the filtrate is additionally centrifuged at 3900 rpm to remove suspended particles. The solvent from the extract is evaporated under reduced pressure from a pre-weighed 100 ml flask. The flask is weighed and the yield of the extract is determined (Table 1).

Пример 2. Аналогичен примеру 1, но в качестве экстрагента для каллусной культуры используется метанол, для суспензионной и корневой культуры - диэтиловый эфир.Example 2. Similar to example 1, but methanol is used as an extractant for a callus culture, and diethyl ether is used for a suspension and root culture.

Пример 3. Аналогичен примеру 2, но экстракция БАВ из каллусной, суспензионной, корневой культуры осуществляется при температуре 60°С.Example 3. Similar to example 2, but the extraction of biologically active substances from callus, suspension, root culture is carried out at a temperature of 60 ° C.

Пример 4. Аналогичен примеру 3, но гидромодуль для каждого образца (каллусная, суспензионная, корневая культура) составляет 1:10.Example 4. Similar to example 3, but the hydromodule for each sample (callus, suspension, root culture) is 1:10.

Экстракты клеточных культур элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.), полученные методами, указанными в примерах 1-5, анализировали по следующим параметрам: выход сухого экстракта (таблица 1), содержание отдельных БАВ (таблица 2), антимикробная активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам (таблица 3). Показано, что максимальные параметры экстрактов клеточных культур достигались при использовании способа экстракции по примеру 4. Также клеточные культуры экстрагировали по методу, представленному в ближайшем аналоге. Суммарный выход сухого экстракта клеточных культур по примеру 4 на 20,77% больше по сравнению с ближайшим аналогом, суммарное содержание отдельных БАВ - на 7,99%, суммарная антимикробная активность - на 3,84%.Extracts of cell cultures of Eleutherococcus spiny (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.), Obtained by the methods specified in examples 1-5, were analyzed according to the following parameters: the yield of dry extract (table 1), the content of individual biologically active substances (table 2), antimicrobial activity by relation to pathogenic and opportunistic microorganisms (table 3). It was shown that the maximum parameters of the extracts of cell cultures were achieved using the extraction method according to example 4. Cell cultures were also extracted according to the method presented in the closest analogue. The total yield of dry extract of cell cultures according to example 4 is 20.77% more than the closest analogue, the total content of individual biologically active substances - by 7.99%, the total antimicrobial activity - by 3.84%.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает высокий выход биологически активных веществ из экстрактов клеточных культур элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.), характеризующихся высокой антиоксидантной и антимикробной активностью.Thus, the claimed method provides a high yield of biologically active substances from extracts of cell cultures of Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim., Characterized by high antioxidant and antimicrobial activity.

Список литературыBibliography

1. Chapter 25 - Traffic-related environmental risk factors and their impact on oxidative stress and cardiovascular health / A. Daiber, J. Lelieveld, S. Steven et al. // Eustress and Distress. - 2020. - P. 489-510.1. Chapter 25 - Traffic-related environmental risk factors and their impact on oxidative stress and cardiovascular health / A. Daiber, J. Lelieveld, S. Steven et al. // Eustress and Distress. - 2020. - P. 489-510.

2. The impact of oxidative stress damage induced by the environmental stressors on COVID-19 / B.M. Bakadia, B.O.O. Boni, A.Ahmed et al. // Life Sciences. - 2021. - V. 264. - P. 118653.2. The impact of oxidative stress damage induced by the environmental stressors on COVID-19 / B.M. Bakadia, B.O.O. Boni, A. Ahmed et al. // Life Sciences. - 2021. - V. 264. - P. 118653.

3. Inflammation response, oxidative stress and DNA damage caused by urban air pollution exposure increase in the lack of DNA repair XPC protein / N. de Oliveira Alves, G.M. Pereira, M. Di Domenico et al. // Environment International. - 2020. - V. 145. - P. 106150.3. Inflammation response, oxidative stress and DNA damage caused by urban air pollution exposure increase in the lack of DNA repair XPC protein / N. de Oliveira Alves, G.M. Pereira, M. Di Domenico et al. // Environment International. - 2020. - V. 145. - P. 106150.

4. Здравоохранение в России. 2019: Стат. сб. / Росстат. - М. - 2019. - 170 с.4. Healthcare in Russia. 2019: Stat. Sat. / Rosstat. - M. - 2019 .-- 170 p.

5. Any war, G. Chapter 2 - Factors affecting the choice for plant-based products in drug discoveries / G. Anywar, J. Namukobe // Phytochemicals as Lead Compounds for New Drug Discovery. - 2020. - P. 15-24.5. Any war, G. Chapter 2 - Factors affecting the choice for plant-based products in drug discoveries / G. Anywar, J. Namukobe // Phytochemicals as Lead Compounds for New Drug Discovery. - 2020. - P. 15-24.

6. Davydova, M. Eleutherococcus senticosus (Rupr. & Maxim.) Maxim. (Araliaceae) as an adaptogen: a closer look / M. Davydova, A.D/ Krikorian // Journal of Ethnopharmacology. - 2000. - V. 72,1. 3. - P. 345-393.6. Davydova, M. Eleutherococcus senticosus (Rupr. & Maxim.) Maxim. (Araliaceae) as an adaptogen: a closer look / M. Davydova, A.D / Krikorian // Journal of Ethnopharmacology. - 2000. - V. 72.1. 3. - P. 345-393.

7. Medicinal Plants from the 14th edition of the Russian Pharmacopoeia, recent updates / A.N. Shikov, I.A. Narkevich, E.V. Flisyuk, V.G. Luzhanin, O.N. Pozharitskaya // Journal of Ethnopharmacology. - 2020. - 113685. - 112 p.7. Medicinal Plants from the 14th edition of the Russian Pharmacopoeia, recent updates / A.N. Shikov, I.A. Narkevich, E.V. Flisyuk, V.G. Luzhanin, O.N. Pozharitskaya // Journal of Ethnopharmacology. - 2020. - 113685. - 112 p.

8. Eleutherococcus species cultivated in Europe: A New Source of Compounds with Antiacetylcholinesterase, Antihyaluronidase, anti-DPPH, and cytotoxic activities / K. Adamczyk, M. Olech, J. Abramek et al. // Oxid. Med. Cell Longev. - 2019. - 8673521.8. Eleutherococcus species cultivated in Europe: A New Source of Compounds with Antiacetylcholinesterase, Antihyaluronidase, anti-DPPH, and cytotoxic activities / K. Adamczyk, M. Olech, J. Abramek et al. // Oxid. Med. Cell Longev. - 2019. - 8673521.

9. Zaluski, D. HPTLC-profiling of eleutherosides, mechanism of antioxidative action of eleutheroside E1, the PAMPA test with LC/MS detection and the structure-activity relationship / D. Zaluski, R. Kuzniewski, Z. Janeczkoa // Saudi J. Biol. Sci. - 2016. - 25 (3). - P. 520-528.9. Zaluski, D. HPTLC-profiling of eleutherosides, mechanism of antioxidative action of eleutheroside E1, the PAMPA test with LC / MS detection and the structure-activity relationship / D. Zaluski, R. Kuzniewski, Z. Janeczkoa // Saudi J Biol. Sci. - 2016 .-- 25 (3). - P. 520-528.

10. Кароматов, И.Д. Адаптоген - элеутерококк, свободоягодник колючий (обзор литературы) / И.Д. Кароматов, З.Т. Набиева // Биология и интегративная медицина. - 2017. - №11. - С. 147-160.10. Karomatov, I. D. Adaptogen - Eleutherococcus, prickly free berry (literature review) / I.D. Karomatov, Z.T. Nabieva // Biology and Integrative Medicine. - 2017. - No. 11. - S. 147-160.

11. Srivastava, P. Chapter 30 - Herbal medicine and biotechnology for the benefit of human health / P. Srivastava, M. Singh, R. Chaturvedi // Models in Discovery and Translation. - 2020. - P. 613-629.11. Srivastava, P. Chapter 30 - Herbal medicine and biotechnology for the benefit of human health / P. Srivastava, M. Singh, R. Chaturvedi // Models in Discovery and Translation. - 2020. - P. 613-629.

Figure 00000002
Figure 00000002

Figure 00000003
Figure 00000003

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Figure 00000006
Figure 00000006

Claims (1)

Способ выделения биологически активных веществ антимикробного действия из клеточных культур элеутерококка колючего Eleutherococcus senticosus Rupr. Maxim., включающий культивирование клеточных каллусных, суспензионных или корневых культур элеутерококка колючего в условиях in vitro, экстрагирование биологически активных веществ из клеточных культур, отличающийся тем, что при экстрагировании биологически активных веществ из клеточных культур навеску 3,0 г сухого растительного сырья каллусной, суспензионной или корневой культуры помещают в пластиковую пробирку объемом 50 мл, добавляют 40 мл 70% этилового спирта или метанола для каллусной культуры или диэтиловый эфир для суспензионной и корневой культуры, помещают в шейкер и перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре или при температуре 60°С, сухую массу отделяют от раствора фильтрованием, фильтрат дополнительно центрифугируют при 3900 об/мин для удаления взвешенных частиц, растворитель из экстракта упаривают при пониженном давлении из предварительно взвешенной колбы объемом 100 мл.A method of isolating biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of Eleutherococcus spiny Eleutherococcus senticosus Rupr. Maxim., Including the cultivation of cell callus, suspension or root cultures of eleutherococcus prickly in vitro, the extraction of biologically active substances from cell cultures, characterized in that when extracting biologically active substances from cell cultures, weighed 3.0 g of dry plant material callus, suspension or a root culture is placed in a 50 ml plastic tube, 40 ml of 70% ethyl alcohol or methanol for callus culture or diethyl ether for suspension and root culture is added, placed in a shaker and stirred for 60 minutes at room temperature or at a temperature of 60 ° C , the dry mass is separated from the solution by filtration, the filtrate is additionally centrifuged at 3900 rpm to remove suspended particles, the solvent from the extract is evaporated under reduced pressure from a pre-weighed 100 ml flask.
RU2021102178A 2021-01-29 2021-01-29 Method for isolation of biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of spiny eleuterococcus eleutherococcus senticosus rupr. maxim. RU2762431C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021102178A RU2762431C1 (en) 2021-01-29 2021-01-29 Method for isolation of biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of spiny eleuterococcus eleutherococcus senticosus rupr. maxim.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021102178A RU2762431C1 (en) 2021-01-29 2021-01-29 Method for isolation of biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of spiny eleuterococcus eleutherococcus senticosus rupr. maxim.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2762431C1 true RU2762431C1 (en) 2021-12-21

Family

ID=80038962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021102178A RU2762431C1 (en) 2021-01-29 2021-01-29 Method for isolation of biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of spiny eleuterococcus eleutherococcus senticosus rupr. maxim.

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2762431C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2005482C1 (en) * 1991-12-29 1994-01-15 Научно-производственное объединение "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" Method of preparing of biologically active additive from eleutherococcus senticocus max for cosmetic products
WO2020065428A1 (en) * 2018-09-24 2020-04-02 Uniwersytet Mikołaja Kopernika W Toruniu A composition having an adaptogenic activity, based on an extract of eleutherococcus senticosus and a method of preparation of a composition having an adaptogenic activity, based on an extract of eleutherococcus senticosus.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2005482C1 (en) * 1991-12-29 1994-01-15 Научно-производственное объединение "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" Method of preparing of biologically active additive from eleutherococcus senticocus max for cosmetic products
WO2020065428A1 (en) * 2018-09-24 2020-04-02 Uniwersytet Mikołaja Kopernika W Toruniu A composition having an adaptogenic activity, based on an extract of eleutherococcus senticosus and a method of preparation of a composition having an adaptogenic activity, based on an extract of eleutherococcus senticosus.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ПОПОВА Н.В., ПОТОРОКО И.Ю. "Повышение эффективности экстракции биологически активных веществ из растительного сырья методом ультразвукового воздействия" // Вестник ЮУрГУ, Серия "Пищевые и биотехнологии", 2018, т.6, N 1, с.14-22. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2440820C2 (en) Anti-cancer composition, including cell line obtained from yew (taxus) stem cambium and procambium
US10251824B2 (en) Method for inducing pluripotent stem cells and pluripotent stem cells prepared by said method
CN106591231B (en) BCG polysaccharide nucleic acid for promoting proliferation and differentiation of CIK cells, culture medium, culture method and application
WO2006051334A1 (en) Plant cells and uses thereof
AU2020103625A4 (en) Applications of bacillus calmette-guerin (bcg) polysaccharide and nucleic acid in in-vitro culture of cytokine-induced-killer (cik) cells and preparation of antitumor drugs
CN108125946A (en) Application of the dihydromyricetin in terms of kidney medicine is prepared
RU2360964C1 (en) CULTURE OF ROOT STRAIN Hed th (Hedysarum theinum Krasnob) - PRODUCER OF ISOFLAVONS
RU2762431C1 (en) Method for isolation of biologically active substances of antimicrobial action from cell cultures of spiny eleuterococcus eleutherococcus senticosus rupr. maxim.
Ushiyama et al. A mycoplasma-like organism associated with Phormium yellow leaf disease
CN109627282B (en) Deer placenta active protein, and extraction method and application thereof
JP3030782B2 (en) Method for producing podophyllotoxin compounds
CN110343656A (en) A kind of separation method of Procambius clarkii blood lymphocyte
RU2296155C1 (en) Strain of cultured cells of plants serratula coronata l
RU2639566C1 (en) CALUS STRAIN OF CULTURED TURKESTANIAN AJUGA TURKESTANICA (REGEL) Briq. PLANT CELLS IN VITRO - TURKESTERONE PRODUCER
CN111000920A (en) Application of pulsatilla chinensis decoction in preparation of medicine for reducing expression of TLR-4 gene of intestinal microvascular endothelial cell
RU2714403C1 (en) Method for producing a root culture in vitro of potentilla alba l. - a flavonoid producer
KR102551398B1 (en) Composition for promoting the generation of exosomes derived from stem cells containing Citrus junos extracts
CN113244276B (en) Use of Sang Huanghuo Phellinus linteus extract as novel coronavirus therapeutic drug or antiviral agent
CN104762253B (en) The new application of Chinese medicine compound pharmaceutical composition
JP2873023B2 (en) Method for producing podophyllotoxin compounds
CN116270803A (en) Application of toona sinensis flower extract in preparation of antioxidant drugs
CN107456471B (en) Application of pomegranate bark in preparation of medicine for promoting migration of mesenchymal stem cells, medicine and preparation method of medicine
CN116173102A (en) Application of toona sinensis flower extract in preparation of anti-heat stress drugs
JPH04202137A (en) Production of iridoid glucoside
CN118755657A (en) Method for continuously preparing plant exosomes and application thereof