RU2762265C1 - Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293 - Google Patents

Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293 Download PDF

Info

Publication number
RU2762265C1
RU2762265C1 RU2020140349A RU2020140349A RU2762265C1 RU 2762265 C1 RU2762265 C1 RU 2762265C1 RU 2020140349 A RU2020140349 A RU 2020140349A RU 2020140349 A RU2020140349 A RU 2020140349A RU 2762265 C1 RU2762265 C1 RU 2762265C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cell line
hek293
oat1
gene
transport
Prior art date
Application number
RU2020140349A
Other languages
English (en)
Inventor
Владимир Александрович Евтеев
Алексей Борисович Прокофьев
Руслан Евгеньевич Казаков
Ирина Анатольевна Мазеркина
Ольга Валерьевна Муслимова
Елена Юрьевна Демченкова
Светлана Юрьевна Сереброва
Наталья Дмитриевна Бунятян
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России)
Priority to RU2020140349A priority Critical patent/RU2762265C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2762265C1 publication Critical patent/RU2762265C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, фармакологии и молекулярной биологии. Может быть использовано при экспертизе лекарственных средств, имеющих почечный путь выведения, а также на доклиническом этапе при разработке новых лекарственных средств, изобретение позволяет оценить транспорт отрицательно заряженных лекарственных средств – субстратов транспортера ОАТ1 путем сравнения уровней экспрессии гена SLC22A6 клеточной линии HEK293-ОАТ1 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. 9 ил., 1 табл., 4 пр.

Description

Изобретение относится к области фармации, фармакологии и молекулярной биологии, в частности к созданию экспериментальной модели клеточной линии для оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств (ЛС).
Лекарственная нефротоксичность является важной причиной скрининга ЛС и часто обнаруживается только на клинических стадиях исследования. Связано это с тем, что экстраполяция результатов доклинических исследований, в частности функциональной активности почечных транспортеров, на клинику на данный момент не имеет высокой степени предсказуемости. Поэтому на стадии доклинических исследований существует проблема поиска экспериментальной модели, которая должна наиболее правдоподобно отражать процессы in vivo, связанные с выведением почками ЛС посредством транспортеров.
Среди двух наиболее распространенных типов экспериментальных моделей, используемых в доклинических исследованиях: лабораторные животные и клеточные линии, последние начинают приобретать все большее распространение из-за того, что использование моделей лабораторных животных требует высокой квалификации персонала, имеет высокую стоимость исследования, а также создает проблемы этического характера. Клеточные линии лишены этих недостатков.
В частности, экспериментальная модель на основе клеточной линии должна показывать стабильный уровень экспрессии широкого спектра транспортеров и метаболических ферментов, которые действуют совместно при элиминации ЛС.
Аналогом заявляемого изобретения является патент RU 2677286 С1 «Способ оценки функциональной активности гликопротеина-р в гематоэнцефалическом барьере», сущность которого состоит в измерении транспорта маркерного субстрата фексофенадина на модели лабораторных животных. К недостаткам этого аналога следует отнести саму экспериментальную модель, так как опыты на лабораторных животных требуют высокой квалификации персонала, имеют высокую стоимость исследования, и результаты подобных экспериментов могут сильно различаться, также стоит учитывать проблемы этического характера.
Клеточная линия HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) является одной из наиболее распространенных экспериментальных моделей в научной практике. Она была получена из эмбриональных почек человека. Широко применяется в научных исследованиях благодаря простоте культивирования, а также хорошо подходит для трансфекции. Стоит отметить, что HEK293 является одной из клеточных линий, рекомендованных FDA (Food and Drug Administration) и EMA (European Medical Agency) для проведения доклинических исследований ЛС [Clinical drug interaction studies - cytochrome P450 enzyme- and transporter-mediated drug interactions guidance for industry, 2020 (URL: https://www.fda.gov/media/134581/download); CPMP/EWP/560/95/Rev. 1 Corr. 2. Guideline on the investigation of drug interactions, 2012 (URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-investigation-drug-interactions-revision-l_en.pdf]. Тем не менее, у этой клеточной линии есть ряд недостатков в отношении изучения транспорта, а именно: пониженный уровень экспрессии генов транспортеров, а также несоответствия в морфологии по сравнению с клетками эпителия проксимальных почечных канальцев.
Технической проблемой является поиск экспериментальной модели in vitro для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС, так как их транспорт является одним из факторов, определяющих их нефротоксические свойства.
Техническим результатом изобретения является оценка транспорта отрицательно заряженных ЛС.
Достижение технического результата обеспечивается благодаря следующим техническим решениям:
- трансфекция гена SLC22A6 при модификации клеточной линии HEK293 повышает уровень экспрессии гена SLC22A6, что позволяет повысить сродство транспортера органических анионов ОАТ1 к изучаемым ЛС - субстратам транспортера ОАТ1, таким образом, повысив чувствительность способа оценки, а также производить более точную оценку транспорта отрицательно заряженных ЛС;
- получение клеточной линии HEK293-ОАТ1 (т.е. экспериментальной модели клеточной линии HEK293, модифицированной путем трансфекции гена SLC22A6) со стабильным уровнем экспрессии гена SLC22A6;
- использование клеточной линии HEK293-ОАТ1 позволяет проводить оценку транспорта отрицательно заряженных ЛС in vitro;
- стабильный уровень экспрессии гена SLC22A6 позволяет получать схожие результаты в экспериментах по транспорту ЛС на протяжении длительного промежутка времени без необходимости проведения контроля уровня экспрессии.
В заявляемом изобретении способ оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС на экспериментальной модели клеточной линии HEK293 реализуется следующим образом.
Путем трансфекции гена SLC22A6 получают клеточную линию HEK293-ОАТ1 (экспериментальную модель клеточной линии HEK293, т.е. модифицированный клон клеточной линии HEK293) и используют ее для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС - субстратов транспортера ОАТ1. Для этого к полученной клеточной линии HEK293-ОАТ1 добавляют субстрат (лекарственное средство) и инкубируют. Далее выделяют тотальную РНК из клеток (исходных, то есть до внесения субстрата (лекарственного средства), а также после инкубации клеток с субстратом (лекарственным средством)). Проводят реакцию обратной транскрипции для получения кДНК, затем проводят полимеразную цепную реакцию (ПНР) со специфическими праймерами к гену SLC22A6. Далее проводят разделение полученных ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле и затем проводят измерение уровня экспрессии гена SLC22A6 по оптической плотности электрофореграмм. По уровню экспрессии гена SLC22A6 судят об активности кодируемого им транспортера ОАТ1. Сравнивают уровни экспрессии гена SLC22A6 клеточной линии HEK293-ОАТ1 до и после инкубации с ЛС - субстратами транспортера ОАТ1.
Существенными отличительными признаками заявляемого изобретения, достаточными для решения указанной технической проблемы и получения указанного технического результата, являются:
- возможность контролировать функциональное состояние клеточной линии HEK293-ОАТ1 по измерению уровня экспрессии гена SLC22A6, а также по изменению транспорта ЛС - субстратов транспортера ОАТ1 (оценивая транспорт ЛС косвенно - по уровню экспрессии гена SLC22A6);
- возможность оценки широкого спектра ЛС, обладающих следующими характеристиками: наличие в молекуле отрицательно заряженной группы, молекулярная масса 300-600 г/моль, возможно наличие гидрофобного участка;
- стабильная экспрессия гена SLC22A6, сохраняющаяся при длительном (более 20 пассажей) пассировании клеточной линии HEK293-ОАТ1;
- клеточная линия HEK293-ОАТ1 - более чувствительная экспериментальная модель для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС, выявляющая более широкий спектр ЛС в качестве субстратов ОАТ1 с расширенным диапазоном концентраций ЛС благодаря повышенному уровню экспрессии гена SLC22A6;
- возможность работы in vitro (без животных).
Краткое описание чертежей и иных материалов.
Рис. 1. Уровень экспрессии гена SLC22A6, нормализованный по гену β-actin, в исходной клеточной линии HEK293 и трансфецированной геном SLC22A6 клеточной линии HEK293-ОАТ1 (10-й пассаж).
Рис. 2. Схема лунки в планшете для эксперимента по транспорту флуоресцеина.
Рис. 3. Схема опыта по транспорту маркерного субстрата ОАТ1 - флуоресцеина (в секундах показано время экспозиции с флуоресцеином).
Рис. 4. Транспорт флуоресцеина клетками исходной клеточной линии HEK293 и клеточной линии HEK293-ОАТ1. Транспорт флуоресцеина выражен в количестве вещества, помноженном на массу общего клеточного белка в мкг и на время инкубации (10 мин).
Рис. 5. Схема эксперимента по влиянию транспорта цефалоспориновых антибиотиков на экспрессию гена SLC22A6.
Рис. 6. Экспрессия мРНК гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 при добавлении цефуроксима 50 мкг/мл 2 раза в сут на протяжении 4 сут (К - отрицательный контроль).
Рис. 7. Экспрессия мРНК гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 при добавлении цефтриаксона 70 мкг/мл 2 раза в сут на протяжении 4 сут (К - отрицательный контроль).
Рис. 8. Экспрессия мРНК гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 при добавлении цефепима 30 мкг/мл 2 раза в сут на протяжении 4 сут (К - отрицательный контроль).
Рис. 9. Уровень экспрессии гена SLC22A, нормализованный по гену β-actin, при пассировании клеточных линий HEK293 и HEK293-ОАТ1.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 1. Получение клеточной линии HEK293-ОАТ1 (экспериментальной модели клеточной линии HEK293, т.е. модифицированного клона клеточной линии HEK293 путем трансфекции гена SLC22A6).
Проверка исходной клеточной линии HEK293 на генетическую чистоту
Для подтверждения генетической чистоты проводят анализ STR-локусов. Для анализа STR-фрагментов используют тест-систему COrDIS Plus (ООО «ГОРДИЗ»).
Культивирование
Клетки культивируют в культуральной среде - модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; «Gibco», США), содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят («HyClone», США), 50 ед./мл гентамицина («ПанЭко», Россия) и 0,1 мг/мл пирувата натрия («Santa Cruz», США) при 37°С, 5% СО2 и относительной влажности 80-85%. В экспериментах используют культуры в логарифмической стадии роста.
Трансфекция
Для увеличения уровня экспрессии гена SLC22A6 проводят трансфекцию с использованием коммерческих плазмид pDONR223. Для наработки и очистки вектора используют коммерческий набор «Invitrogen HiPure Plasmid Midiprep kit» (#K2100-04) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Для проведения трансфекции используют реагент «Lipofectamine 3000» также по протоколу, рекомендованному производителем. В качестве отрицательного контроля используют чистый вектор.
В результате получают модифицированный клон клеточной линии HEK293 - клеточную линию HEK293-ОАТ1, имеющую более высокий уровень экспрессии гена SLC22A6 по сравнению с исходной клеточной линией HEK293. Для подтверждения проводят сравнительное изучение экспрессии гена SLC22A6 в исходной и модифицированной клеточных линиях. Для этого проводят следующие процедуры.
Проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
1. Выделение тотальной РНК
Тотальную РНК выделяют из клеток (исходных, то есть до внесения субстрата (лекарственного средства), а также после инкубации клеток с субстратом (лекарственным средством)). Выделение проводят методом фенол-хлороформной экстракции на основе реагента «PureZOL» (Biorad, #7326880) по протоколу, рекомендованному производителем.
2. Проведение реакции обратной транскрипции
Тотальную РНК, выделенную по пункту 1, используют в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции. Данную реакцию проводят с использованием фермента «RevertAid Н Minus» (ThermoFisher, #ЕР0451) по протоколу, рекомендованному производителем. Во всех экспериментах проводят контрольную реакцию с использованием воды в качестве отрицательного контроля. Реакцию обратной транскрипции проводят в термоциклере «Biometra Tone 96G» (Analytik Jena). В итоге получают кДНК.
3. Проведение полимеразной цепной реакции
Реакцию ПЦР проводят для всех изучаемых генов в объеме 20 мкл. В качестве матрицы используют к ДНК, полученную по пункту 2.
Состав реакционной смеси:
1. ПЦР-буфер (10X DreamTaq Green Buffer) - 2 мкл.
2. Смесь дезоксирибонуклеотидов (dNTP Mix, 2 mM each (#R0241)) - 2 мкл.
3. Прямой праймер, 0,5 ое/мл - 1 мкл.
4. Обратный праймер, 0,5 ое/мл - 1 мкл.
5. ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start DNA Polymerase, 5 ед/мкл - 0,2 мкл.
6. Вода, очищенная от нуклеаз (#R0581) - 12,8 мкл.
7. к ДНК - 1 мкл.
Компоненты 1-6 смешивают для образования «мастер-микса», который разделяют на планируемые реакции. Последним добавляют компонент 7 -к ДНК изучаемых образцов.
Реакцию ПЦР проводят в термоциклере «Biometra Tone 96G» (Analytik Jena). Температурный режим ПЦР: начальная денатурация при 94°С в течение 2 мин; отжиг праймеров при 60°С, 30 с; синтез продукта при 72°С, 30 с; заключительная выдержка после прохождения циклов: 5 мин при 72°С. Количество циклов для референсного гена (β-actin) - 22-24; для изучаемого гена (SLC22A6) - 28-30 циклов. В качестве отрицательного контроля используют РНК вместо кДНК. При подборе последовательностей праймеров используют программу Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Последовательность полученных специфических праймеров представлена в Таблице.
Figure 00000001
4. Визуализация результатов методом электрофореза Нормирование экспрессии генов проводят по гену β-actin в качестве гена «домашнего хозяйства». ПЦР-продукты разделяют стандартным электрофоретическим методом при напряжении 150 В в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на 1xTBE-буфере. При анализе оптической плотности используют программу VisionWorks 8.20. По уровню экспрессии гена SLC22A6 судят об активности кодируемого им транспортера ОАТ1. Уровень экспрессии гена SLC22A6 в исходной клеточной линии HEK293 принимают за единицу. Сравнение уровней экспрессии гена SLC22A6 в исходной клеточной линии HEK293 и в клеточной линии HEK293-ОАТ1 показано на Рис.1. Уровень экспрессии гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 выше, чем в исходной клеточной линии HEK293, что позволяет увеличить чувствительность данной экспериментальной модели к субстратам транспортера О ATI при оценке транспорта ЛС.
Пример 2. Измерение транспорта маркерного субстрата ОАТ1 - флуоресцеина.
Корелляцию между уровнем экспрессии гена SLC22A6 и функционированием кодируемого им транспортера ОАТ1 выявляют по измерению транспорта флуоресцеина. Флуоресцеин является субстратом транспортеров органических анионов, в частности ОАТ1, кроме того, благодаря флуоресценции его концентрацию можно легко измерить, что делает его удобным маркером функциональной активности транспортеров органических анионов. Флуоресцеин в данном примере используется в качестве структурного аналога лекарственного средства (который содержит ключевые функциональные группы для связывания с транспортером).
Исходную клеточную линию HEK293 и клеточную линию HEK293-ОАТ1 культивируют в 12-луночных планшетах с мембранными вставками диаметром пор 0,4 мкм (Transwell, Costar) до образования плотного монослоя (Рис. 2). Флуоресцеин в конечной концентрации 1×10-5 М добавляют в базолатеральный отдел на следующие промежутки времени: 20 с, 40 с, 60 с, 80 с, 100 с, 120 с (Рис. 3). После каждого периода экспозиции с флуоресцеином клетки промывают 3-4 раза ледяным PBS-буфером для остановки транспорта до тех пор, пока флуоресцеин не определяется в промываемом буфере. Затем клетки лизируют в 1 мл 0,1% Triton-Х100 и измеряют флуоресценцию лизата на планшетном флуориметре «Chameleon V» («Hidex», Финляндия).
Нормирование производят по количеству общего белка, измеренного по Брэдфорду. Результаты показаны на Рис. 4. По концентрации флуоресцеина в клетках клеточной линии HEK293-ОАТ1 рассчитывают уровень его транспорта. Благодаря повышенному уровню экспрессии гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1, количественные показатели транспорта флуоресцеина находятся на более высоком уровне по сравнению с таковыми в исходной клеточной линии HEK293, что делает клеточную линию HEK293-ОАТ1 более чувствительной экспериментальной моделью для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС, и позволяет выявлять более широкий спектр ЛС в качестве субстратов ОАТ1, а также проводить эксперименты в расширенном диапазоне концентраций ЛС.
Пример 3. Оценка транспорта субстрата ОАТ1 по уровню экспрессии гена.
Культивирование клеточной линии HEK293-ОАТ1 проводят согласно Примеру 2. В качестве субстратов ОАТ1 для эксперимента используют ЛС, имеющие анионный центр, а также молекулярную массу 300-600 г/моль. Под такие условия подходят β-лактамные антибиотики группы цефалоспоринов: цефуроксим, цефтриаксон и цефепим.
Каждый препарат (растворенный в культуральной среде) добавляют в базолатеральный отдел лунки 2 раза в сут на протяжении 4 сут в следующих концентрациях: 50 мкг/мл, 70 мкг/мл и 30 мкг/мл соответственно (Рис. 5). Для «отрицательного контроля» в базолатеральный отдел лунки добавляют культуральную среду. Уровень экспрессии гена SLC22A6 в «отрицательном контроле» показан на Рис. 6-8 (обозначен К).
Каждые сутки измеряют уровень экспрессии гена SLC22A6 согласно методике из Примера 1. Результаты эксперимента представлены на Рис. 6-8. Во всех случаях видно, что со временем при воздействии субстратов ОАТ1 уровень экспрессии гена SLC22A6 понижается. По динамике понижения уровня экспрессии гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 можно косвенно судить о транспорте данного субстрата. Чем больше понижается уровень экспрессии гена SLC22A6, тем более активно переносится им данный субстрат. Если же падение уровня экспрессии гена SLC22A6 не наблюдается, то можно предположить либо низкий уровень сродства транспортера ОАТ1 к данному субстрату (изучаемому ЛС), либо полное отсутствие сродства. Исходная клеточная линия HEK293 с изначально низким уровнем экспрессии гена SLC22A6 не позволяет достоверно оценить сродство транспортера OATI к субстрату, именно поэтому для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС используют клеточную линию HEK293-ОАТ1 с высоким уровнем экспрессии гена SLC22A6, у которой сродство транспортера О ATI к субстратам (ЛС) выше.
Пример 4. Стабильность уровня экспрессии гена SLC22A6 при пассировании клеточных линий HEK293 и HEK293-ОАТ1.
Культивирование клеточных линий HEK293 и HEK293-ОАТ1 проводят аналогично Примеру 2. Культивирование обеих клеточных линий проводят до 20-го пассажа. На 4, 8, 14, 20 пассажах в обеих клеточных линиях проводят измерение уровня экспрессии гена SLC22A6 согласно Примеру 1. Результаты показаны на Рис. 9. При пассировании уровень экспрессии гена SLC22A6 в исходной клеточной линии HEK293 за 20 пассажей понижается более чем в 2 раза. В клеточной линии HEK293-ОАТ1 на протяжении 20 пассажей уровень экспрессии гена SLC22A6 остается на одном и том же уровне. Стабильность уровня экспрессии гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 позволяет получать схожие результаты в экспериментах по транспорту ЛС на протяжении длительного промежутка времени без необходимости проведения контроля уровня экспрессии.

Claims (1)

  1. Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293, включающий получение клеточной линии HEK293-ОАТ1 путем трансфекции гена SLC22A6 в клеточную линию HEK293, внесение к ней субстрата (лекарственного средства), инкубацию, выделение тотальной РНК из клеток, проведение реакции обратной транскрипции для получения кДНК, затем проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами к гену SLC22A6, разделение полученных ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле, измерение уровня экспрессии гена SLC22A6 по оптической плотности электрофореграмм и затем сравнение уровней экспрессии гена SLC22A6 клеточной линии HEK293-ОАТ1 до и после инкубации с лекарственными средствами – субстратами транспортера ОАТ1, а именно повышение уровня экспрессии гена SLC22A6 оценивается как повышение транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств, снижение уровня экспрессии гена SLC22A6 оценивается как понижение транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств.
RU2020140349A 2020-12-08 2020-12-08 Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293 RU2762265C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020140349A RU2762265C1 (ru) 2020-12-08 2020-12-08 Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020140349A RU2762265C1 (ru) 2020-12-08 2020-12-08 Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2762265C1 true RU2762265C1 (ru) 2021-12-17

Family

ID=79175292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020140349A RU2762265C1 (ru) 2020-12-08 2020-12-08 Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2762265C1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2693485C1 (ru) * 2018-06-13 2019-07-03 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ" (НИЯУ МИФИ) Носитель для диагностики, направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных средств

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2693485C1 (ru) * 2018-06-13 2019-07-03 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ" (НИЯУ МИФИ) Носитель для диагностики, направленной доставки и контролируемого высвобождения лекарственных средств

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Drumond N., Stegemann S. Polymer adhesion predictions for oral dosage forms to enhance drug administration safety. Part 1: In vitro approach using particle interaction methods // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2018. Т. 165. С. 9-17. *
Drumond N., Stegemann S. Polymer adhesion predictions for oral dosage forms to enhance drug administration safety. Part 1: In vitro approach using particle interaction methods // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2018. Т. 165. С. 9-17. Panchagnula R., Thomas N.S. Biopharmaceutics and pharmacokinetics in drug research // International journal of pharmaceutics. 2000. Т. 201. No. 2. С. 131-150. *
Panchagnula R., Thomas N.S. Biopharmaceutics and pharmacokinetics in drug research // International journal of pharmaceutics. 2000. Т. 201. No. 2. С. 131-150. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mistri et al. Dynamic changes in Sox2 spatio-temporal expression promote the second cell fate decision through Fgf4/Fgfr2 signaling in preimplantation mouse embryos
Tan et al. Small Maf functions in the maintenance of germline stem cells in the Drosophila testis
Tian et al. Function of basonuclin in increasing transcription of the ribosomal RNA genes during mouse oogenesis
Dowdle et al. A single KH domain in Bicaudal-C links mRNA binding and translational repression functions to maternal development
Milavec et al. Metrological framework to support accurate, reliable, and reproducible nucleic acid measurements
Kaeuferle et al. MicroRNA methodology: advances in miRNA technologies
Liu et al. AZI2 3’UTR is a new SLC6A3 downregulator associated with an epistatic protection against substance use disorders
Chulakasian et al. Translational enhancing activity in 5′ UTR of peste des petits ruminants virus fusion gene
RU2762265C1 (ru) Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293
Yamada et al. MAB21L1 modulates gene expression and DNA metabolic processes in the lens placode
Wu Recombinant DNA Methodology II
Rosenblum et al. A live-cell assay for the detection of pre-microRNA–protein interactions
Alieva et al. Whole-transcriptome analysis of dermal fibroblasts, derived from three pairs of monozygotic twins, discordant for Parkinson’s disease
Olazagoitia-Garmendia et al. Relative Quantification of Residue-Specific m 6 A RNA Methylation Using m 6 A-RT-QPCR
Ligon et al. PCOLCE deletion and expression analyses in uterine leiomyomata
Karlin-Neumann et al. Entering the Pantheon of 21 st Century Molecular Biology Tools: A Perspective on Digital PCR
Nowacki et al. A translational repression reporter assay for the analysis of RNA-binding protein consensus sites
Hoffmann et al. Identification and tissue-specific characterization of novel SHOX-regulated genes in zebrafish highlights SOX family members among other genes
Kim et al. Regulation of conceptus interferon-tau gene subtypes expressed in the uterus during the peri-implantation period of cattle
Vitiello et al. Manipulating pericyte function with microRNAs
Bryson et al. Visualizing RNA Cytidine Acetyltransferase Activity by Northern Blotting
Deng et al. Preliminary Study of microRNAs Allele-specific Targeting in Allergic Rhinitis Patients from Central China
Winata et al. Exploring Translational Control of Maternal mRNAs in Zebrafish
Williams et al. Assessing triplet repeat expansions in human SVG-A cell culture
Birnbaum et al. Using osteoclast differentiation as a model for gene discovery in an undergraduate cell biology laboratory