RU2761137C1

RU2761137C1 - Способ синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте

Info

Publication number: RU2761137C1
Application number: RU2021112690A
Authority: RU
Inventors: Владимир Михайлович Покровский; Евгений Александрович Патраханов; Михаил Владимирович Покровский; Петр Романович Лебедев; Анастасия Викторовна Белашова; Иван Сергеевич Архипов; Анастасия Юрьевна Карагодина; Олеся Андреевна Пученкова; Артем Иванович Голиусов; Андрей Сергеевич Нагих
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2021-12-06

Abstract

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и может быть использовано для коррекции эстрального цикла у самок мышей для дальнейшего изучения различных патологий беременности и постнатального периода у человека и сельскохозяйственных животных. Способ синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте заключается в том, что осуществляют внутримышечное введение самкам мышей суспензии на основе прогестерона в дозе 4,5 мг/100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла. Далее вводят через 6 суток простагландин F2а в дозе 0,083 мг/100 г. Изобретение позволяет осуществлять гормон-регулирующую синхронизацию овуляторного цикла у самок мышей и получить большее количество оплодотворенных особей в запланированные сроки с минимальной погрешностью в дате родов и, как следствие, большее количество экспериментальных животных. 1 пр., 3 табл.

Description

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и может быть использовано для коррекции эстрального цикла у самок мышей для дальнейшего изучения различных патологий беременности и постнатального периода у человека и сельскохозяйственных животных.

В настоящее время, увеличивается темп работы лабораторий, основным модельным организмом которых являются мыши различных линий. В связи с чем всё более актуальной становится необходимость в создании эффективного и экономически менее затратного способа получения экспериментальных животных, в частности мышей.

Известно применение простагландина F2α, который способствует овуляции у телок препубертатного возраста (C.E.P. Leonardi L.F.M., Pfeifer M.I.B., Rubin J., SinghR.J., Mapletoft G.A., Pessoa A.M., Bainy C.A.M. Silva. Prostaglandin F2α promotes ovulation in prepubertal heifers Theriogenology. 2012. V. 78, N 7. P. 1578–82. DOI:10.1016/j.theriogenology), которое заключалось в том, чтобы определить влияние экзогенного простагландина F (2α) (PGF) с или без лечения прогестероном на первую овуляцию у телок препубертатного возраста. Телкам вводили интравагинальную вставку, высвобождающую прогестерон (CIDR; Pfizer Animal Health, Монреаль, Квебек, Канада), и вызывали фолликулярную волну с помощью 50 мг прогестерона + 2 мг эстрадиолбензоата внутримышечно, а также вводили аналог PGF в больнице. время удаления CIDR, на 5 день фолликулярной волны (в среднем 8,6 ± 0,5 дня после введения CIDR); и (3) телки контрольной группы не получали лечения (N = 14). Телок обследовали ежедневно с помощью трансректального ультразвукового исследования с начала эксперимента для подтверждения того, что овуляция произошла, или до 5 дней после инъекции PGF (группы PG и PPG) или до тех пор, пока доминантные фолликулы следующей фолликулярной волны не достигли 8 мм (контрольная группа).

Также известна роль простагландина F2α в функции и структуре жёлтого тела при лютеолизе у тёлок. (Pinaffi F.L.V., Araujo E.R., Ginther O.J. Role of luteal biosynthesis of prostaglandin F2α on function and structure of the corpus luteum during luteolysis in heifers. Domest Anim Endocrinol. 2018. N 63. P.10–14. DOI: 10.1016/j.domaniend ). Группы были контрольными (n = 8), обработанными PGF (n = 8) и обработанными FM + PGF (n = 9). Лечение проводилось через 10 дней постовуляции в 0, 8 и 16 часов. Протокол был основан на предположении, что лютеолитические характеристики экзогенного PGF будут изменены, если синтез эндогенного PGF будет одновременно подавляться, и сообщения о том, что Лютеолиз включает прямое действие маточного PGF на большие лютеиновые клетки с последующим воздействием крупных клеток на мелкие. На 48 час концентрация прогестерона была выше в контрольной группе (7,6 ± 0,8 нг / мл), чем в группе FM + PGF (3,0 ± 0,5 нг / мл), и ниже в группе PGF (0,7 ± 0. 3 нг / мл), чем в группе FM + PGF (взаимодействие, P <0,0001).

Данные способы синхронизации эстрального цикла невозможно применить на мышиной модели в эксперименте, так как эстральные циклы крупного рогатого скота, в частности коров, существенно отличается от такового у мышей. Так у крупного рогатого скота эстральный цикл длится от 18 до 24 дней, в то время как у мышей эстральный цикл длится 4-5 дней.

Задачей изобретения является создание эффективного способа фармакологической гормон-регулирующей синхронизации эстрального цикла самок мышей в эксперименте.

Технический результат заключается в эффективном способе синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте, позволяющем получить большее количество оплодотворенных особей в запланированные сроки с минимальной погрешностью в дате родов, и как следствие большее количество экспериментальных животных.

Задача решается с помощью предлагаемого способа, включающего внутримышечное введение самкам мышей суспензию на основе прогестерона в дозе 4,5 мг / 100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла, а через 6 суток после введения суспензии прогестерона, осуществляют внутримышечное введение простагландина F2α в дозе 0,083 мг / 100 г. Предполагаемое время наступления овуляции – 34–72 часа после введения второго препарата.

Способ осуществляется следующим образом.

Животные трех линий были разделены на три группы: интактные (естественное спаривание) (n=20), эстральная синхронизация (цитологическое исследование вагинального секрета перед спариванием с определением фазы эструса) (n=20), гормон-регулирующая синхронизация эстрального цикла (n=20). Особи, относящиеся к контрольной группе, были отобраны в случае установления у них эструса. У самок интактной и экспериментальной группы предварительной выборки не проводилось. Самки, вне зависимости от группы, рассаживались к самцам 2:1 соответственно. Запланированной датой родов считались 22 сутки с начала спаривания.

В контрольных группах животные были допущены к спариванию после подтверждения у них фазы эструса путем оценки влагалищного секрета.

Для осуществления первого этапа гормональной синхронизации овуляции у мышей внутримышечно вводился суспензия прогестерона в дозе 4,5 мг / 100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла самок. Через 6 суток после введения прогестерона, осуществлялось внутримышечное введение простагландина F2α (ЗАО «Мосагроген», РФ) в дозе 0,083 мг / 100 г. Предполагаемое время наступления овуляции – 34–72 часа после введения второго препарата.

Оценка фармакологической синхронизации эстрального цикла самок мышей проводилась путем исследования цитологической картины влагалищного секрета. Манипуляция проводилась на следующий день после инъекции прогестерона, через 3 дня и непосредственно перед введением простагландина F2α и на следующий день после.

У фиксированной самки производится забор влагалищного секрета с целью цитологической оценки фазы эстрального цикла. Осторожно вводили во влагалище небольшое количество (20 мкл) дистиллированной воды с использованием пипетки с последующим втягиванием в пипетку ранее введенной жидкости. Данную процедуру повторяют 4–5 раз. Важно убедиться, что пипетка помещена на входе влагалищного канала и не проникает во влагалищное отверстие. Жидкость, содержащую несколько капель клеточной суспензии, после этого помещают на предметное стекло, высушивают на воздухе и окрашивают по методу Романовского-Гимзе. (Гайдай Е.А., Гайдай Д.С. Генетическое разнообразие экспериментальных мышей и крыс: история возникновения, способы получения и контроля. Лабораторные животные для научных исследований. 2019. – № 4. – 9 с. DOI: 10.29926/2618723X-2019-04-09; Achiraman S., Archunan G., Sankar Ganesh D., Rajagopal T., Rengarajan R.L., Kokilavani P., Kamalakkannan S., Kannan S. Biochemical analysis of female mice urine with reference to endocrine function: a key tool for estrus detection. Zool Sci. 2011. N 28. P. 600–605. DOI: 10.2108/zsj.28.600). Затем предметное стекло накрывали покровным стеклом и немедленно исследовали количественно и качественный состав клеток секрета под световым микроскопом (Биомед 5) при увеличении 40×.

На следующий день после инъекции суспензии прогестерона самке мыши отмечается смешанная цитологическая картина, не позволяющая отнести видимый результат к определенной фазе цикла. Полиморфноядерные лейкоциты и небольшое количество ороговевших клеток отмечается на 3 сутки после введения прогестерона, что соответствует фазе диеструса. На шестые сутки перед введением простагландина F2α, отмечается преобладание округлых ядроседержащих клеток с небольшим вкраплением между ними ороговевших эпителиальных клеток и полиморфноядерных лейкоцитов. Во влагалищном мазке взятом на следующий день после инъекции простагландина F2α отмечается преобладание обильных неядерных ороговевших эпителиальных клеток с клетками неправильной формы имеющих зернистую цитоплазму.

Пример конкретного выполнения.

Исключая племенную выборку для эксперимента, были отобраны самки мышей одинакового возраста и веса линий CBA/lac, C57BL/6, BALB/ в каждой по 60 особей, и самцы соответствующих линий в количестве 30 особей, полученные из питомника лабораторных животных «Столбовая» (Московская область, п. Столбовая).

Выбор особей данных линий обоснован наиболее частым их использованием в биомедицинских исследованиях [Auta T., Hassan A.T. Alteration in oestrus cycle and implantation in Mus musculus administered aqueous wood ash extract of Azadirachta indica (neem) Asian Pacific J Reproduction. 2016. V. 5, N 3. P. 188–192. DOI: 10.1016/j.apjr.2016.03.003 ].

Животные трех линий были разделены на три группы: интактные (естественное спаривание) (n=20), эстральная синхронизация (цитологическое исследование вагинального секрета перед спариванием с определением фазы эструса) (n=20), гормональная синхронизации эстрального цикла (n=20). Особи, относящиеся к контрольной группе, были отобраны в случае установления у них эструса. Для осуществления первого этапа гормональной синхронизации овуляции у мышей внутримышечно вводили суспензию прогестерона (прогестерон, ЗАО «Мосагроген», РФ «Прогестомаг» рег. 32-3-4.15-2649 № ПВР-3-4.15/03139 от 27.06.2018) в дозе 4,5 мг / 100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла самок. Приготовление раствора суспензии прогестерона осуществляли следующим образом.

В предварительно подготовленную стерильную пластиковую или стеклянную объёмом не более 100 мл ёмкость с крышкой помещается 9,95 мл дистиллированной воды. Далее данная ёмкость нагревается на водяной бане до 40°С, после чего в неё помещается с помощью инсулинового шприца 0,05 мл полисорбата Твин-80 и перемешивается стеклянной палочкой до полного растворения. Полученный раствор охлаждают до температуры ниже 25°С для того, чтобы избежать разрушение гормона, оптимальная температура (20-23°С). После охлаждения, струйно, вводим в раствор 1 мл препарата прогестерона. Добиваются гомогенности среды с помощью размешивания стеклянной палочкой или быстрого взбалтывания закрытой ёмкости. Используется непосредственно после приготовления в объеме индивидуальном для каждой особи из расчёта 4,5мг/100г. Хранению и повторному использованию полученная суспензия не подлежит во избежание потери гомогенности и распада среды на фазы, потери специфических свойств гормоном, а также развитии патогенной флоры.

Через 6 суток после введения прогестерона, осуществлялось внутримышечное введение простагландина F2α (ЗАО «Мосагроген», РФ «Магестрофан» рег. 32- 3-4.15-2649 № ПВР-3-4.15/03139 от 11.06.15) в дозе 0,083 мг / 100 г. Предполагаемое время наступления овуляции – 34–72 часа после введения второго препарата. Самки, вне зависимости от группы, рассаживались к самцам 2:1 соответственно. Запланированной датой родов считались 22 сутки с начала спаривания.

В ходе исследования было установлено, что гормональная синхронизация группы самок увеличивает количество оплодотворенных особей на 55% относительно интактных групп и на 18,3% относительно контрольных групп. Отбор особей опирающийся на цитологическое исследование влагалищного секрета увеличивает количество беременных самок на 36% (р<0,05). Индекс синхронизации овуляции представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Гормон-регулирующая синхронизация увеличивает вероятность родов самки на 22 сутки на 53% (р<0,05) в сравнении с контрольной группой и на 85,5% (р<0,05) в сравнении с интактной группой. Количество самок, разродившихся на 22 сутки представлено в таблице 2.

Таблица 2.

В линии С57BL/6 в интактной группе на 14 сутки после спаривания беременность отмечалась у 25% самок. Эстральная синхронизация цикла увеличила количество беременных особей относительно контроля на 35%. Гормон-регулирующая синхронизация овуляторного цикла увеличила количество оплодотворенных особей на 50% относительно интактной и на 10% относительно эстральной синхронизации (р<0,05).

В линии СBA/lac в интактной группе на 14 сутки после спаривания беременность отмечалась у 25% самок. Эстральная синхронизация цикла увеличила количество беременных особей относительно контроля на 40%. Гормон-регулирующая синхронизация овуляторного цикла увеличила количество оплодотворенных особей на 55% относительно интактной и на 15% относительно эстральной синхронизации (р<0,05).

В линии СBA/lac в интактной группе на 14 сутки после спаривания беременность отмечалась у 25% самок. Эстральная синхронизация цикла увеличила количество беременных особей относительно контроля на 35%. Гормон-регулирующая синхронизация овуляторного цикла увеличила количество оплодотворенных особей на 35% относительно интактной и не изменилось в эстральной синхронизации (р<0,05). А также количество потомства у экспериментальных животных в группах гормон-регулирующей стимуляции выше в сравнении с интактными и группами эстральной синхронизации. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Таким образом, полученные результаты убедительно свидетельствуют о выраженном эффекте гормон-регулирующей синхронизации овуляторного цикла у самок мышей, позволяющего получить большее количество оплодотворенных особей в запланированные сроки с минимальной погрешностью в дате родов, и как следствие большее количество экспериментальных животных.

Claims

Способ синхронизации эстрального цикла у самок мышей в эксперименте, характеризующийся тем, что осуществляют внутримышечное введение самкам мышей суспензии на основе прогестерона в дозе 4,5 мг/100 г вне зависимости от фазы эстрального цикла, с последующим введением через 6 суток простагландина F2а в дозе 0,083 мг/100 г.