RU2761100C1

RU2761100C1 - Method for determining the level of post-transplant chimerism by assessing the expression of rhesus and kell antigens in gel cards

Info

Publication number: RU2761100C1
Application number: RU2021110704A
Authority: RU
Inventors: Елена Александровна Попонина; Елена Владимировна Бутина; Анна Васильевна Йовдий; Наталья Александровна Зорина; Наталья Викторовна Минаева
Priority date: 2021-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2021-12-03

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, specifically to a method for assessing the number of donor erythrocytes circulating in the blood of a recipient by studying the patient's Rh phenotype, namely antigens D, C, c, E, e, and K, after allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells (allo-HSCT).EFFECT: method provides early and accurate diagnosis of the dynamics of the appearance of donor hematopoiesis after allo-HSCT, as well as the recipient's own hematopoiesis in case of relapse of the disease.1 cl, 7 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, конкретно к способу оценки количества циркулирующих в крови реципиента донорских эритроцитов путем исследования резус-фенотипа пациента, а именно антигенов D, С, с, Е, е, а также K, после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Способ включает в себя исследование резус-фенотипа в гелевых картах методом гемагглютинации моноклональными антителами в геле с последующей процентной оценкой популяций эритроцитов, несущих антиген донора либо реципиента, в соответствии с разработанной шкалой. Способ обеспечивает раннюю и точную диагностику динамики появления донорского кроветворения после алло-ТГСК, а также собственного кроветворения реципиента при рецидиве заболевания.The invention relates to medicine, specifically to a method for assessing the number of donor erythrocytes circulating in the blood of a recipient by examining the patient's Rh phenotype, namely antigens D, C, C, E, e, and K, after allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells (allo- TGSK). The method includes the study of the Rh phenotype in gel cards by the method of hemagglutination with monoclonal antibodies in the gel, followed by the percentage assessment of the erythrocyte populations carrying the donor or recipient antigen, in accordance with the developed scale. The method provides early and accurate diagnosis of the dynamics of the appearance of donor hematopoiesis after allo-HSCT, as well as the recipient's own hematopoiesis in case of relapse of the disease.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, основанной на разделении популяций эритроцитов методом гемагглютинации в геле с помощью моноклональных антител, в зависимости от присутствия антигена на поверхности исследуемых эритроцитов.The invention relates to medicine, namely to laboratory diagnostics based on the separation of erythrocyte populations by the method of hemagglutination in a gel using monoclonal antibodies, depending on the presence of antigen on the surface of the erythrocytes under study.

Цель изобретения - разработать способ оценки донорского эритроцитарного химеризма у реципиента после алло-ТГСК при помощи исследования антигенов системы Резус: D, С, с, Е, е, а также антигена K системы Келл.The purpose of the invention is to develop a method for assessing donor erythrocyte chimerism in a recipient after allo-HSCT using the study of Rhesus system antigens: D, C, C, E, e, as well as Kell antigen K.

Алло-ТГСК является важным методом лечения многих онкогематологических заболеваний и других болезней, поражающих кроветворную и иммунную системы [1]. По данным Европейского общества по трансплантации костного мозга (ЕВМТ) большинство алло-ТГСК выполняется при острых лейкозах и миелодиспластическом синдроме [2]. Несмотря на быстрое развитие альтернативных методов лечения, таких как таргетная терапия, клеточные технологии и иммуномодулирующие препараты, за последние 20 лет в мире отмечается увеличение количества алло-ТГСК [3].Allo-HSCT is an important method for the treatment of many hematological cancers and other diseases affecting the hematopoietic and immune systems [1]. According to the European Society for Bone Marrow Transplantation (EBMT), most allo-HSCT is performed in acute leukemia and myelodysplastic syndrome [2]. Despite the rapid development of alternative methods of treatment, such as targeted therapy, cell technologies and immunomodulatory drugs, an increase in the number of allo-HSCTs has been observed in the world over the past 20 years [3].

В отличие от трансплантации солидных органов и трансфузий крови, при которых совместимость донора и реципиента по антигенам эритроцитарных систем АВО и Резус обязательна, при алло-ТГСК указанная совместимость оказалась не важна. Таким образом, антигенные различия эритроцитов позволяют использовать их для оценки посттрансплантационного статуса реципиента [4].Unlike transplantation of solid organs and blood transfusions, in which the compatibility of the donor and recipient for the antigens of the ABO and Rhesus erythrocyte systems is mandatory, with allo-HSCT, this compatibility was not important. Thus, the antigenic differences in erythrocytes make it possible to use them to assess the post-transplant status of the recipient [4].

Известно, что у реципиентов с несовместимостью по системам Резус и Келл, без имеющихся аллоантител, риск развития иммунологических осложнений ниже, чем при АВО-несовместимости. АВО-несовместимость, вследствие действия естественных анти-А, анти-В-антител, ведет к отсроченному приживлению донорских эритрокариоцитов с редукцией эритроидного ростка вплоть до его аплазии [5].It is known that in recipients with incompatibility in the Rhesus and Kell systems, without existing alloantibodies, the risk of developing immunological complications is lower than in ABO incompatibility. ABO incompatibility, due to the action of natural anti-A, anti-B antibodies, leads to delayed engraftment of donor erythrokaryocytes with a reduction of the erythroid lineage up to its aplasia [5].

Известен способ оценки эритроцитарного химеризма количественным методом дифференциальной агглютинации по Эшби в модификации лаборатории иммуногематологии ГНЦ РАМН. Учет эритроцитов с донорским фенотипом производится с помощью микроскопии, с определением количества агглютинированных, либо неагглютинированных клеток на плоскости. Недостатком способа является трудоемкость метода, сложность его применения в рутинной практике и невозможность автоматизации исследования и документирования результата [5].A known method for assessing erythrocyte chimerism by the quantitative method of differential agglutination according to Ashby in the modification of the laboratory of immunohematology of the State Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences. Erythrocytes with a donor phenotype are counted using microscopy, with the determination of the number of agglutinated or non-agglutinated cells on a plane. The disadvantage of this method is the complexity of the method, the complexity of its application in routine practice and the impossibility of automating the study and documenting the result [5].

Известен способ определения эритроцитарного химеризма с использованием флюоресцентных микросфер. Исследуемые эритроциты инкубируются с антителами IgG к определенным эритроцитарным антигенам (А, В, С, с, Е, D, K, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S и s), после чего подвергаются нескольким отмывкам. Далее к обработанным эритроцитам добавляются флюоресцентные микросферы, покрытые иммуноглобулинами к человеческим антителам IgG, с последующим центрифугированием. Подсчет позитивных клеток проводится с помощью флюоресцентной микроскопии. Однако использование этого метода трудоемко и требует организации специальных условий для микроскопирования [6].A known method for determining erythrocyte chimerism using fluorescent microspheres. The investigated erythrocytes are incubated with IgG antibodies to certain erythrocyte antigens (A, B, C, c, E, D, K, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S and s), after which they undergo several washes. Next, fluorescent microspheres coated with immunoglobulins to human IgG antibodies are added to the processed erythrocytes, followed by centrifugation. Positive cells are counted using fluorescence microscopy. However, the use of this method is laborious and requires the organization of special conditions for microscopy [6].

В настоящее время применяются цитогенетические и молекулярно-биологические методы оценки донорского химеризма, в качестве мишеней при которых используются различные ДНК-маркеры (повторы ДНК, либо варианты уникальных генов). Среди них выделяют метод флуоресцентной in situ гибридизации - FISH (fluorescence in situ hybridization), метод амплификации и анализа продуктов мультиплексной полимеразной цепной реакции коротких тандемных повторов (STR, short tandem repeat) и ПЦР в реальном времени (например, полиморфизмов инсерция/делеция (InDel). Эти методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, однако они не отражают состояние эритроидного ростка кроветворения у реципиента, перенесшего аллоТГСК [7].Currently, cytogenetic and molecular biological methods are used to assess donor chimerism, in which various DNA markers (DNA repeats, or variants of unique genes) are used as targets. Among them, the method of fluorescence in situ hybridization - FISH (fluorescence in situ hybridization), the method of amplification and analysis of products of multiplex polymerase chain reaction of short tandem repeats (STR, short tandem repeat) and real-time PCR (for example, insertion / deletion polymorphisms (InDel These methods are highly sensitive and specific, but they do not reflect the state of the erythroid hematopoietic line in the recipient who underwent alloHSCT [7].

Анализ резус-фенотипа методом гемагглютинации в геле с моноклональными антителами с процентной оценкой количества эритроцитов донора и реципиента, в соответствии с разработанной шкалой, позволяет быстро и точно оценить восстановление эритроидного ростка кроветворения, а возможность документирования результата исследования - отслеживать изменения в динамике.Analysis of the Rh phenotype by hemagglutination in a gel with monoclonal antibodies with a percentage estimate of the number of erythrocytes of the donor and recipient, in accordance with the developed scale, allows you to quickly and accurately assess the recovery of the erythroid hematopoietic lineage, and the possibility of documenting the study result - to track changes in dynamics.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа исследования донорского химеризма путем исследования резус-фенотипа реципиента после алло-ТГСК в гелевых картах методом гемагглютинации в геле с моноклональными антителами с последующей процентной оценкой популяций эритроцитов, несущих антиген донора либо реципиента (рис. 1), в соответствии с разработанной шкалой, что необходимо для назначения пациенту адекватной сопроводительной терапии и прогнозирования восстановления кроветворения.The technical result of the claimed invention is the creation of a method for the study of donor chimerism by studying the Rh phenotype of the recipient after allo-HSCT in gel cards by hemagglutination in a gel with monoclonal antibodies, followed by a percentage estimate of erythrocyte populations carrying the antigen of the donor or recipient (Fig. 1), in accordance with with a developed scale, which is necessary for the appointment of an adequate accompanying therapy to the patient and for predicting the restoration of hematopoiesis.

Для достижения указанного результата в соответствии с прототипом исследуют наличие антигенов D, С, с, Е, е, K на эритроцитах периферической крови донора ГСК и реципиента до проведения алло-ТГСК с последующим заключением о выявленных различиях. В отличие от аналогов, в которых применяются технически сложные и требующие специального оборудования методики, в данном способе применяется рутинный для большинства лабораторий метод гемагглютинации в геле с дальнейшей визуальной оценкой процента донорских эритроцитов в соответствии с разработанной калибровочной шкалой. Возможно документирование результата с помощью автоматического иммуногематологического анализатора и фотографирования карт.To achieve this result, in accordance with the prototype, the presence of D, C, C, E, e, K antigens on the peripheral blood erythrocytes of the HSC donor and the recipient is investigated before the allo-HSCT, followed by a conclusion about the differences identified. Unlike analogs that use technically complex techniques that require special equipment, this method uses the method of hemagglutination in a gel, routine for most laboratories, with a further visual assessment of the percentage of donor erythrocytes in accordance with the developed calibration scale. It is possible to document the result using an automatic immunohematological analyzer and photographing maps.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.In the course of the patent information search, no sources discrediting the novelty of the proposed invention have been identified.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории иммуногематологии ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.The claimed invention was developed in the laboratory of immunohematology of the Federal State Budgetary Institution KNIIGiPK FMBA of Russia in accordance with the research plan.

Способ предусматривает следующую последовательность исследований:The method includes the following sequence of studies:

Этап 1. Создание калибровочной шкалы. Путем исследования методом агглютинации в геле смеси двух популяций эритроцитов (с определяемым антигеном и без такового) с заданными процентными соотношениями популяций: 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%; создается эталонная шкала (рис. 2, 3, 4, 5, 6, 7).Stage 1. Creation of a calibration scale. By a study by the method of agglutination in a gel of a mixture of two populations of erythrocytes (with and without a detectable antigen) with specified percentages of populations: 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%, 95%, 97%; a reference scale is created (Fig. 2, 3, 4, 5, 6, 7).

Этап 2. Исследование резус-фенотипа и антигена K у донора ГСК и реципиента до проведения аллоТГСК с последующим анализом различий эритроцитарных антигенов. Взятие, пробоподготовку, хранение материала проводят в соответствии с инструкцией к используемому комплекту для исследований.Stage 2. Investigation of the Rh phenotype and K antigen in the HSC donor and the recipient before the alloHSCT with the subsequent analysis of the differences in erythrocyte antigens. Taking, sample preparation, storage of material is carried out in accordance with the instructions for the used research kit.

Этап 3. После проведения аллоТГСК проводят исследование отличающихся эритроцитарных антигенов методом агглютинации в геле. Визуально сравнивая получившийся результат со шкалой, делают заключение о проценте циркулирующих донорских эритроцитов в крови реципиента.Stage 3. After carrying out alloHSCT, a study of different erythrocyte antigens is carried out by the method of agglutination in a gel. Visually comparing the result with the scale, a conclusion is made about the percentage of circulating donor erythrocytes in the recipient's blood.

Проанализированы результаты исследования эритроцитарного донорского химеризма у 82 реципиентов аллоТГСК, получавших лечение в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в 2013-2020 гг. Установлены различия по антигенам систем Резус и Келл в 61 паре донор - реципиент (73,2%). Наиболее часто встречался химеризм по эритроцитарному антигену С (28,1%). В качестве метки можно было использовать антигены E и с в 22,0% и 20,7% соответственно. По наличию антигена D донор с реципиентом отличались в 17,1% случаев алло-ТГСК. Реже встречались различия по K (9,8%).The results of the study of erythrocyte donor chimerism in 82 alloHSCT recipients who received treatment at the FGBUN KNIIGiPK FMBA of Russia in 2013-2020 were analyzed. Differences in the antigens of the Rhesus and Kell systems were found in 61 donor-recipient pairs (73.2%). The most common chimerism was erythrocyte antigen C (28.1%). E and c antigens in 22.0% and 20.7%, respectively, could be used as a label. In the presence of antigen D, donor and recipient differed in 17.1% of cases of allo-HSCT. Differences in K were less common (9.8%).

У 26,8% пар донор - реципиент были выявлены различия по 2 и более антигенам, что повышало точность результатов исследования эритроцитарного химеризма.Differences in 2 or more antigens were found in 26.8% of donor-recipient pairs, which increased the accuracy of the results of the study of erythrocyte chimerism.

Таким образом, предлагаемый способ удобен для клинического использования и может быть применим в большинстве случаев алло-ТГСК.Thus, the proposed method is convenient for clinical use and can be applied in most cases of allo-HSCT.

Список литературыBibliography

1. Выполнение трансплантаций аллогенных гемопоэтических стволовых клеток от неродственных доноров из Российского и зарубежного регистров в одном трансплантационном центре / Васильева В.А., Кузьмина Л.А., Паровичникова Е.Н. [и др.]. // Гематология и трансфузиология. - 2020. - №65(3). - С. 299-311.1. Performing transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells from unrelated donors from the Russian and foreign registries in the same transplant center / Vasilyeva VA, Kuzmina LA, Parovichnikova EN [and etc.]. // Hematology and Transfusiology. - 2020. - No. 65 (3). - S. 299-311.

2. Hematopoietic SCT in Europe 2013: recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants / Passweg J.R., Baldomero H., Bader P. [et al.]. // Bone Marrow Transplant. - 2015. - №50(4). - P. 476-482.2. Hematopoietic SCT in Europe 2013: recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants / Passweg J.R., Baldomero H., Bader P. [et al.]. // Bone Marrow Transplant. - 2015. - No. 50 (4). - P. 476-482.

3. Use of haploidentical stem cell transplantation continues to increase: the 2015 European Society for Blood and Marrow Transplant activity survey report / Passweg J.R., Baldomero H., Bader P. [et al.]. // Bone Marrow Transplant. - 2017. - №52(6). - P. 811-817.3. Use of haploidentical stem cell transplantation continues to increase: the 2015 European Society for Blood and Marrow Transplant activity survey report / Passweg J.R., Baldomero H., Bader P. [et al.]. // Bone Marrow Transplant. - 2017. - No. 52 (6). - P. 811-817.

4. Порешина Л.П. Эритроцитарный химеризм при близкородственной аллогенной трансплантации костного мозга (особенности проявления, классификация): Автореф… дис. докт. биол. наук - М.: 2004. - 40 с.4. Poreshina L.P. Erythrocyte chimerism in closely related allogeneic bone marrow transplantation (features of manifestation, classification): Abstract of the thesis. doct. biol. Sciences - M .: 2004 .-- 40 p.

5. Бурцев А.А. Особенности трансплантации аллогенного костного мозга от доноров, отличающихся по антигенам системы АВО и резус: Автореф… дис. кан. мед. Наук - М.: 2006. - 29 с.5. Burtsev A.A. Features of allogeneic bone marrow transplantation from donors differing in antigens of the ABO and Rh systems: Abstract of the thesis. can. honey. Science - M .: 2006 .-- 29 p.

6. Red blood cell phenotyping is a sensitive technique for monitoring chronic myeloid leukaemia patients after T-cell-depleted bone marrow transplantation and after donor leucocyte infusion / Schaap N., Schattenberg A., Bar B. [et al.]. // Br J Haematol. - 2000. - №108(1). - P. 116-125.6. Red blood cell phenotyping is a sensitive technique for monitoring chronic myeloid leukaemia patients after T-cell-depleted bone marrow transplantation and after donor leucocyte infusion / Schaap N., Schattenberg A., Bar B. [et al.]. // Br J Haematol. - 2000. - No. 108 (1). - P. 116-125.

7. Количественный анализ химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток молекулярно-генетическими методами / Лавриненко В.А., Савицкая Т.В., Волочник Е.В. [и др.]. // Онкогематология. - 2014. - №2. - С. 29-36.7. Quantitative analysis of chimerism after allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells by molecular genetic methods / Lavrinenko VA, Savitskaya TV, Volochnik EV. [and etc.]. // Oncohematology. - 2014. - No. 2. - S. 29-36.

Claims

A method for assessing the level of post-transplant chimerism by assessing the expression of erythrocyte antigens of the Rhesus and Kell system in gel maps, including the determination of the expression of D, C, C, E, e, K antigens by the method of agglutination in a gel, characterized in that the percentage of donor chimerism is determined visually in according to a previously created scale.