RU2759652C1

RU2759652C1 - Method for determining the energy metabolism enzyme dysfunction in respiratory pathology in children and application thereof

Info

Publication number: RU2759652C1
Application number: RU2020134186A
Authority: RU
Inventors: Нинель Ивановна Косякова; Марина Владимировна Акуленко
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2021-11-16

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: inventions relate to medicine, namely to clinical laboratory diagnostics, and can be used to determine the energy metabolism enzyme dysfunction in respiratory pathology in children. The activities of mitochondrial dehydrogenases and glycolysis in unaffected capillary blood lymphocytes are determined on a smear stained with nitroblue tetrazolium dye, subjected to microscopy. A morphological analysis of lymphocytes is conducted in each smear, and the amount and distribution of dye is determined in each cell. The activity of enzymes in lymphocytes is assessed by the determined amount of dye in conditional units. The conclusion about the presence of energy metabolism enzyme dysfunction is made by the values of the activities of succinate dehydrogenase and lactate dehydrogenase enzymes. The value of succinate dehydrogenase of 1 to 1.3 conditional units and the value of lactate dehydrogenase of 8 to 11 conditional units are taken as the norm. The activity of dehydrogenases can be determined by conducting quantitative morphological analysis of colour images using the computer program "Cell Composer". The method is used for executing control of the effectiveness of the assigned therapy, individually selecting medicinal products for pathogenetic therapy and correcting the therapy in time, as well as for the prognostic purposes in order to form risk groups for future development of allergic diseases.EFFECT: method provides a possibility of creating an effective and informative method for clinical practice for diagnostics of cellular energy metabolism disorders and prognostic assessment of the course of the disease in respiratory pathology in children by determining the dysfunction of mitochondrial and glycolytic energy metabolism enzymes in lymphocytes from the capillary blood, as well as a possibility for application of the method for different clinical tasks.4 cl, 2 dwg, 2 tbl, 4 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей и может быть использовано для индивидуального выбора тактики энерготропной терапии в педиатрической практике.The invention relates to medicine, namely to the diagnosis of dysfunction of enzymes of energy metabolism in respiratory pathology in children and can be used for the individual choice of tactics of energotropic therapy in pediatric practice.

Постепенно накапливаются данные, что при болезнях легких патологическим признаком, который появляется на ранних стадиях и развивается последовательно, являются нарушения клеточной биоэнергетики.Data are gradually accumulating that in lung diseases, a pathological symptom that appears in the early stages and develops sequentially is a violation of cellular bioenergetics.

Респираторные патологии - чаще всего хронические заболевания, характеризующиеся постоянными воспалительными процессами и частично обратимой обструкцией верхних дыхательных путей. Токсины окружающей среды, такие как табачный дым, выхлопные газы и пр. являются высоко окисляющими по своей природе и вызывают повреждения легких окислительным стрессом (Герасимова Н.Г., Ахвердиева Т.Б., Шувалова Ю.В. и др. О роли перекисной и антиоксидантной систем в патогенезе бронхиальной астмы // Самарский научный вестник. 2015. 2. (11): 65-68.).Respiratory pathologies are most often chronic diseases characterized by persistent inflammatory processes and partially reversible obstruction of the upper respiratory tract. Environmental toxins such as tobacco smoke, exhaust gases, etc. are highly oxidizing in nature and cause damage to the lungs by oxidative stress (Gerasimova N.G., Akhverdieva T.B., Shuvalova Yu.V. et al. About the role of peroxide and antioxidant systems in the pathogenesis of bronchial asthma // Samara Scientific Bulletin. 2015.2 (11): 65-68.).

Именно окислительный стресс является ведущим фактором в развитии стойкого воспаления при респираторных патологиях. Хорошо известно, что митохондрии - главные сенсоры окислительного стресса и воспаления в клетке; также эти органеллы играют важную роль при адаптивном иммунном ответе лимфоцитов в дыхательных путях и легочной ткани и регулировании клеточного воспалительного ответа. Нарушение функции митохондрий приводит к снижению захвата богатых энергией субстратов (жирные кислоты, пируват, углеродный скелет аминокислот) из цитоплазмы и их окислительному расщеплению с образованием СO₂ и Н₂O, сопряженному с синтезом АТФ. Это в итоге приводит к дисфункции ферментов энергетического обмена. Таким образом, повреждение биоэнергетики наряду с увеличением производства активных форм кислорода в митохондриях и повреждением эпителия легких становится новым ключевым аспектом патогенеза заболеваний дыхательных путей.It is oxidative stress that is the leading factor in the development of persistent inflammation in respiratory pathologies. It is well known that mitochondria are the main sensors of oxidative stress and inflammation in the cell; also, these organelles play an important role in the adaptive immune response of lymphocytes in the airways and lung tissue and in the regulation of the cellular inflammatory response. Dysfunction of mitochondria leads to a decrease in the uptake of energy-rich substrates (fatty acids, pyruvate, carbon skeleton of amino acids) from the cytoplasm and their oxidative degradation with the formation of CO ₂ and H ₂ O, coupled with the synthesis of ATP. This ultimately leads to dysfunction of energy metabolism enzymes. Thus, damage to bioenergetics along with an increase in the production of reactive oxygen species in mitochondria and damage to the epithelium of the lungs is becoming a new key aspect of the pathogenesis of respiratory diseases.

Следует обратить внимание на то, что процессы в организме детей протекают иначе, чем у взрослых. Для обеспечения значительных энергетических потребностей ребенка необходимы относительно большие энергетические резервы организма. На протяжении первого года жизни ребенка происходят качественные изменения в характере энергообеспечения тканей: снижается удельный вес анаэробного гликолиза и нарастает интенсивность процессов окислительного фосфорилирования, что ведет к повышенному расходованию АТФ. Следствием этого является высокая интенсивность биоэнергетических процессов, наиболее выраженная у детей раннего возраста (особенно у новорожденных). В дальнейшем она постепенно снижается (Тамбовцева Р.В. Биохимические особенности онтогенетического развития энергообеспечения мышечной деятельности // Новое исследование. 2014.1 (38): 68-75.)It should be noted that the processes in the body of children proceed differently than in adults. To meet the significant energy needs of a child, relatively large energy reserves of the body are needed. During the first year of a child's life, qualitative changes occur in the nature of tissue energy supply: the specific gravity of anaerobic glycolysis decreases and the intensity of oxidative phosphorylation processes increases, which leads to an increased consumption of ATP. The consequence of this is the high intensity of bioenergetic processes, which is most pronounced in young children (especially in newborns). In the future, it gradually decreases (Tambovtseva R.V. Biochemical features of the ontogenetic development of energy supply to muscle activity // New research. 2014.1 (38): 68-75.)

У детей в процессе роста и развития происходят значительные изменения морфологических характеристик тканей, их химического состава и метаболизма, поэтому детский организм нельзя рассматривать как уменьшенную копию взрослого организма. И показатели активности ферментов, которые определяют у взрослых, нельзя механически переносить на растущий детский организм и назначение патогенетической терапии у них требует особой осторожности.In children, in the process of growth and development, significant changes occur in the morphological characteristics of tissues, their chemical composition and metabolism, therefore, the child's body cannot be considered as a reduced copy of an adult body. And the indicators of enzyme activity, which are determined in adults, cannot be mechanically transferred to a growing child's body, and the appointment of pathogenetic therapy in them requires special care.

Терапия детей с респираторной патологией требует комплексного подхода и наряду с препаратами базисной терапии, необходимо дополнительно проводить и коррекцию метаболических нарушений.Therapy of children with respiratory pathology requires an integrated approach and, along with basic therapy drugs, it is necessary to additionally correct metabolic disorders.

В реальной клинической практике антиоксидантная терапия назначается эмпирически, без учета степени нарушений активности ферментов энергетического обмена, что может привести к прооксидантному эффекту и вызвать еще большее повреждение тканей.In real clinical practice, antioxidant therapy is prescribed empirically, without taking into account the degree of disturbance in the activity of enzymes of energy metabolism, which can lead to a prooxidant effect and cause even greater tissue damage.

В настоящее время для диагностики (митохондриальной) дисфункции ферментов энергетического обмена имеются различные методы.Currently, various methods are available to diagnose (mitochondrial) dysfunction of energy metabolism enzymes.

1. Биохимические методы позволяют выявлять в биологических жидкостях метаболиты, указывающие на нарушение энергетического обмена.1. Biochemical methods make it possible to identify metabolites in biological fluids that indicate a violation of energy metabolism.

Биохимические показатели, свидетельствующие о нарушении процессов клеточного энергообмена (метаболический ацидоз, увеличение содержания в крови лактата, пирувата натощак и после нагрузки глюкозой, снижение содержания общего карнитина, активация перекисного окисления липидов, увеличение экскреции ряда органических кислот), к сожалению, могут служить лишь дополнительными критериями диагностики.Biochemical indicators indicating a violation of the processes of cellular energy exchange (metabolic acidosis, an increase in the blood lactate, pyruvate on an empty stomach and after glucose load, a decrease in the total carnitine content, activation of lipid peroxidation, an increase in the excretion of a number of organic acids), unfortunately, can only serve as additional diagnostic criteria.

Их изменение не отличается стабильностью, не обладает высокой специфичностью, могут встречаться при различных заболеваниях, не позволяют дифференцировать первичные митохондриальные заболевания от сопутствующей митохондриальной недостаточности. (Barshop В.A. Metabolomic approaches to mitochondrial disease: correlation of organic acids. Mitochondrion 2004; 4: 521-527.) Кроме того, эти способы часто малоспецифичны и требуют уточняющих исследований - определение концентрации молочной и пировиноградной кислот с вычислением коэффициента лактат/пируват;Their change is not stable, does not have high specificity, can occur in various diseases, do not allow differentiating primary mitochondrial diseases from concomitant mitochondrial insufficiency. (Barshop V.A. Metabolomic approaches to mitochondrial disease: correlation of organic acids. Mitochondrion 2004; 4: 521-527.) In addition, these methods are often poorly specific and require clarifying studies - determination of the concentration of lactic and pyruvic acids with the calculation of the coefficient of lactate / pyruvate;

Биохимическим и морфологическим методами оценки дисфункции митохондрий проводилось исследование состояния мембранного потенциала митохондрий при внебольничной пневмонии у детей (Ли Л.А., Лебедъко О.А., Козлов В.К. Оценка дисфункции митохондрий при внебольничной пневмонии у детей Дальневосточный медицинский журнал 2015. 1:30-35).Biochemical and morphological methods for assessing mitochondrial dysfunction were carried out to study the state of the membrane potential of mitochondria in community-acquired pneumonia in children (Li L.A., Lebedko O.A., Kozlov V.K. Assessment of mitochondrial dysfunction in community-acquired pneumonia in children Far Eastern Medical Journal 2015.1 : 30-35).

Однако, в основе патогенеза внебольничной пневмонии лежит острая воспалительная реакция в паренхиме легких, которая зависит от количества и вирулентности микроорганизмов, состояния защитных механизмов дыхательных путей и организма в целом. Нарушения проходимости бронхов, расстройства микроциркуляции, воспалительная инфильтрация, интерстициальный отек и снижение воздушности легочной паренхимы приводят к нарушению перфузии газов и гипоксемии. Последняя, сопровождается респираторным ацидозом, гиперкапнией, компенсаторной одышкой и появлением других клинических признаков дыхательной недостаточности.However, the pathogenesis of community-acquired pneumonia is based on an acute inflammatory reaction in the lung parenchyma, which depends on the number and virulence of microorganisms, the state of the defense mechanisms of the respiratory tract and the body as a whole. Disorders of bronchial patency, microcirculation disorders, inflammatory infiltration, interstitial edema and a decrease in the airiness of the pulmonary parenchyma lead to impaired gas perfusion and hypoxemia. The latter is accompanied by respiratory acidosis, hypercapnia, compensatory dyspnea, and the appearance of other clinical signs of respiratory failure.

Пневмония у детей нередко сопровождается не только дыхательной, но и сердечно-сосудистой недостаточностью, возникающей в результате циркуляторных нарушений, перегрузки малого круга кровообращения (Crawford S.Е., Daum R.S. Bacterial pneumonia, lung abscess and empyema / Pediatric respiratory medicine / ed. Taussig L.M., Landau L.I. Mosby, Inc., 2008: 501-553)Pneumonia in children is often accompanied not only by respiratory, but also by cardiovascular failure resulting from circulatory disorders, overload of the pulmonary circulation (Crawford S.E., Daum RS Bacterial pneumonia, lung abscess and empyema / Pediatric respiratory medicine / ed. Taussig LM, Landau LI Mosby, Inc., 2008: 501-553)

Биолюминесцентным методом у взрослых пациентов изучалась ферментативная активность лимфоцитов, выделенных из венозной крови при хронических риносинуситах, ассоциированных с хламидийной инфекцией у взрослых пациентов (Капустина Т.А. Ферментативная активность лимфоцитов при хронических риносинуситах, ассоциированных с хламидийной инфекцией. // Российская ринология. 2013; 21(1): 16-18)The bioluminescence method in adult patients was used to study the enzymatic activity of lymphocytes isolated from venous blood in chronic rhinosinusitis associated with chlamydial infection in adult patients (Kapustina T.A. Enzymatic activity of lymphocytes in chronic rhinosinusitis associated with chlamydial infection. // Russian Rhinology. 2013; 21 (1): 16-18)

Исследование проводилось у взрослых пациентов и изученные ферменты не могли дать полную картину нарушений энергетического обмена.The study was carried out in adult patients and the studied enzymes could not give a complete picture of energy metabolism disorders.

Ранее также изучалась ферментативная активность лимфоцитов, выделенных из венозной крови биолюминесцентным методом при хронических риносинуситах, ассоциированных с хламидийной инфекцией у взрослых пациентов (Капустина Т.А. Ферментативная активность лимфоцитов при хронических риносинуситах, ассоциированных с хламидийной инфекцией. // Российская ринология. 2013; 21(1): 16-18)Previously, the enzymatic activity of lymphocytes isolated from venous blood by the bioluminescent method in chronic rhinosinusitis associated with chlamydial infection in adult patients was also studied (Kapustina T.A. Enzymatic activity of lymphocytes in chronic rhinosinusitis associated with chlamydial infection. // Russian rhinology. 2013; 21 (1): 16-18)

2. Способ хроматомасс-спектрометрии предназначен для количественного и качественного определения отдельных компонентов в сложных смесях. Это позволит получить информацию о тех процессах, ключевым участником которых является синтез АТФ.2. The method of gas chromatography-mass spectrometry is intended for the quantitative and qualitative determination of individual components in complex mixtures. This will provide information on those processes in which the synthesis of ATP is a key participant.

Карнитин, один из компонентов сложной смеси, транспортирует длинноцепочечные жирные кислоты в митохондрии через внутреннюю мембрану последних, в которых происходит их β-окисление до ацетил-КоА с последующей его утилизацией. В частности, используют способ, заключающийся в том, что определяют соотношение в крови общего и свободного карнитина и по показателю их соотношения судят о митохондриальной дисфункции, то есть о степени нарушений энергетического обмена. (Barshop В.А. Metabolomic approaches to mitochondrial disease: correlation of organic acids. Mitochondrion 2004; 4: 521-527.)Carnitine, one of the components of a complex mixture, transports long-chain fatty acids into mitochondria through the inner membrane of the latter, in which they are β-oxidized to acetyl-CoA with its subsequent utilization. In particular, a method is used, which consists in determining the ratio of total and free carnitine in the blood and judging by the indicator of their ratio about mitochondrial dysfunction, that is, about the degree of energy metabolism disorders. (Barshop V.A. Metabolomic approaches to mitochondrial disease: correlation of organic acids. Mitochondrion 2004; 4: 521-527.)

Но такой способ не позволяет достоверно судить о полноте происходящих нарушений функции митохондриальных ферментов энергетического обмена. Такие исследования в нашей стране практически не проводятся. Отчасти это можно объяснить отсутствием современного оборудования в клинических лабораториях, отчасти - инвазивностью процедуры, проводимой на биопсийном материале мышц, печени и фибробластах.But this method does not allow one to reliably judge the completeness of the dysfunctions of mitochondrial enzymes of energy metabolism. Such studies are practically not carried out in our country. This can partly be explained by the lack of modern equipment in clinical laboratories, and partly by the invasiveness of the procedure performed on biopsy material of muscles, liver and fibroblasts.

3. Гистологические исследования.3. Histological examinations.

Проводится определение комплексов дыхательной цепи на полученном инвазивным путем биопсийном материале мышц, печени и фибробластах, включающее анализ ультраструктуры митохондрий с помощью электронной микроскопии или гистохимического выявления активности (митохондриальных) ферментов энергетического обмена в мышце.The determination of the complexes of the respiratory chain is carried out on the biopsy material of muscles, liver and fibroblasts obtained by invasive means, including analysis of the ultrastructure of mitochondria using electron microscopy or histochemical detection of the activity of (mitochondrial) enzymes of energy metabolism in the muscle.

Выделение митохондрий из клетки для проведения исследований приводит к разрушению ультраструктуры митохондрий, изменению величины, формы и внутренней структуры в их митохондриальном аппарате. (Сухорукое B.C. Проблемы диагностики митохондриальной недостаточности. Клинико-лабораторный консилиум 2012)Isolation of mitochondria from the cell for research leads to the destruction of the ultrastructure of mitochondria, a change in the size, shape and internal structure of their mitochondrial apparatus. (Sukhorukoye B.C. Problems of diagnostics of mitochondrial insufficiency. Clinical and laboratory council 2012)

Результаты, получаемые на выделенных in vitro митохондриях, очевидно, существенно отличаются от соответствующих параметров, характерных для этих органелл в живой клетке (Kondrashova М., Zakharchenko М., Khunderyakova N. Preservation of the in vivo state of mitochondrial network for ex vivo physiological study of mitochondria. IntJBiochem Cell Biol 2009; 41: 2036-2050.).The results obtained on mitochondria isolated in vitro obviously differ significantly from the corresponding parameters characteristic of these organelles in a living cell (Kondrashova M., Zakharchenko M., Khunderyakova N. Preservation of the in vivo state of mitochondrial network for ex vivo physiological study of mitochondria. IntJ Biochem Cell Biol 2009; 41: 2036-2050.).

Указанные диагностические способы, используемые в педиатрии для диагностики митохондриальных дисфункций, далеки от совершенства. Так, с одной стороны, выявление лабораторных признаков митохондриальной недостаточности у больных с различными заболеваниями зачастую приводит к гипердиагностике первичных митохондриальных болезней. С другой стороны, недостаточная надежность ряда ранее использовавшихся диагностических критериев ведет к их гиподиагностике.These diagnostic methods used in pediatrics to diagnose mitochondrial dysfunctions are far from perfect. So, on the one hand, the identification of laboratory signs of mitochondrial insufficiency in patients with various diseases often leads to overdiagnosis of primary mitochondrial diseases. On the other hand, the lack of reliability of a number of previously used diagnostic criteria leads to their underdiagnosis.

4. Цитохимические исследования.4. Cytochemical studies.

Еще в 60-х годах, прошлого века советский ученый Р.П. Нарциссов показал, что лимфоциты периферической крови можно рассматривать не только как клетки специальной иммунной защиты, но и как элементы единой информационной системы, отражающей состояние организма.Back in the 60s, the last century, the Soviet scientist R.P. Narcissov showed that peripheral blood lymphocytes can be considered not only as cells of special immune defense, but also as elements of a single information system that reflects the state of the body.

Но его исследования не получили широкого распространения за рубежом, и только в последнее десятилетие начали появляться независимые исследования зарубежных коллег, о том, что множество патологий, которые клинически проявляются симптомами преимущественно в одном органе, таком как, например, мозг, сердце или легкие, также могут модулировать энергетику митохондрий в циркулирующих лейкоцитах крови.But his research was not widely disseminated abroad, and only in the last decade independent studies of foreign colleagues began to appear, stating that many pathologies that are clinically manifested by symptoms mainly in one organ, such as, for example, the brain, heart or lungs, also can modulate the energy of mitochondria in circulating blood leukocytes.

Хорошо известно, что лейкоциты крови постоянно подвергаются множеству факторов, ассоциированных с метаболическим стрессом, чувствуют и отвечают на системные метаболические и воспалительные стрессоры. Вероятно, поэтому они и могут служить функциональными биомаркерами для клинической биоэнергетики, являясь при этом идеальными объектами для исследований. Таким образом, мониторинг биоэнергетики иммунных клеток может стать диагностическим инструментом для количественной оценки митохондриальных функций и общего биоэнергетического здоровья индивидуума.It is well known that blood leukocytes are constantly exposed to a variety of factors associated with metabolic stress, sensing and responding to systemic metabolic and inflammatory stressors. This is probably why they can serve as functional biomarkers for clinical bioenergy, while being ideal objects for research. Thus, monitoring the bioenergetics of immune cells can become a diagnostic tool for quantifying mitochondrial functions and general bioenergetic health of an individual.

Известен цитобиохимический способ определения адренергической регуляции в организме, включающий определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ), путем измерения на мазке крови величины восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в лимфоцитах после их инкубации в водной среде, отличающийся тем, что измерения проводят в комплексе проб: в основной среде инкубации, которая содержит КСl 100-150 мМ, преимущественно 125 мМ, HEPES 5-15 мМ, преимущественно 10 мМ, НСТ 0,8-1,5 мМ, преимущественно 1,22 мМ рН 7,2±0,05; в основной среде инкубации в присутствии 5 мМ малоната; в основной среде инкубации в присутствии 5 мМ янтарной кислоты (ЯНТ); в основной среде инкубации в присутствии 5 мкМ ЯНТ; в основной среде инкубации в присутствии 5 мМ ЯНТ и 50 мкМ - 5 мМ, преимущественно 5 мМ природной формы изолимонной кислоты (ИЗЛ) (Патент РФ 2364868, G01N 33/50, 20.08.2009).Known cytobiochemical method for determining adrenergic regulation in the body, including the determination of the activity of succinate dehydrogenase (SDH), by measuring on a blood smear the amount of reduction of nitro blue tetrazolium (NBT) in lymphocytes after incubation in an aqueous medium, characterized in that the measurements are carried out in a complex of samples: in the main incubation medium, which contains KCl 100-150 mM, mainly 125 mM, HEPES 5-15 mM, mainly 10 mM, NBT 0.8-1.5 mM, mainly 1.22 mM pH 7.2 ± 0.05; in the main incubation medium in the presence of 5 mM malonate; in the main incubation medium in the presence of 5 mM succinic acid (YNT); in the main incubation medium in the presence of 5 μM JNT; in the main incubation medium in the presence of 5 mM JNT and 50 μM - 5 mM, mainly 5 mM of the natural form of isolic acid (IZL) (RF Patent 2364868, G01N 33/50, 08/20/2009).

Как маркер состояния митохондрий этот цитобиохимический способ гораздо чувствительнее, чем принятые биохимические методы. В частности, с его помощью можно определять активность отдельных комплексов дыхательной цепи. Интерес к цитобиохимическому анализу активности (митохондриальных) ферментов энергетического обмена в лимфоцитах для диагностики полисистемных митохондриальных нарушений объясняется сравнительной простотой и малой травматичностью взятия и обработки крови. Таким образом, у многих больных с полисистемной митохондриальной недостаточностью диагностическая биопсия мышц может быть заменена цитобиохимическим анализом клеток периферической крови. Комплексный цитобиохимический анализ является ценным диагностическим инструментом при подборе медикаментозного лечения и при оценке динамики митохондриальной недостаточности в процессе терапии.As a marker of the state of mitochondria, this cytobiochemical method is much more sensitive than the accepted biochemical methods. In particular, it can be used to determine the activity of individual complexes of the respiratory chain. Interest in the cytobiochemical analysis of the activity of (mitochondrial) enzymes of energy metabolism in lymphocytes for the diagnosis of polysystemic mitochondrial disorders is explained by the comparative simplicity and low trauma of taking and processing blood. Thus, in many patients with polysystemic mitochondrial insufficiency, a diagnostic muscle biopsy can be replaced by a cytobiochemical analysis of peripheral blood cells. Comprehensive cytobiochemical analysis is a valuable diagnostic tool in the selection of drug treatment and in assessing the dynamics of mitochondrial insufficiency during therapy.

Известно, что изучение активности митохондриальных дегидрогеназ проводилось цитохимическим, а не цитобиохимическим методом в различных популяциях лимфоцитов из венозной крови у детей с респираторными и кожными проявлениями аллергии (Капустина Е.Ю. Активность митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови у детей с респираторными и кожными проявлениями аллергиии, автореф. дисс. к.м.н., Москва, 2006. 270 с.)It is known that the study of the activity of mitochondrial dehydrogenases was carried out by the cytochemical, and not by the cytobiochemical method in various populations of lymphocytes from venous blood in children with respiratory and skin manifestations of allergy (Kapustina E.Yu. Activity of mitochondrial enzymes of peripheral blood lymphocytes in children with respiratory and skin manifestations of allergy, Ph.D. thesis, Moscow, 2006.270 p.)

Описываемый способ не использовался для анализа изменений активности митохондриальных ферментов в динамике у обследованных детей и отсутствует сравнительный анализ выявленных изменений с другой патологией, например, с группой часто и длительно болеющих детей. Известно, что иммунная система у таких детей характеризуется крайней напряженностью, нарушением межклеточной кооперации и недостаточностью резервных возможностей., что, по-видимому, является результатом длительного и массивного антигенного воздействия на организм ребенка. (Заплатников А.Л. Клинико-патогенетическое обоснование иммунотерапии и иммунопрофилактики вирусных и бактериальных заболеваний у детей: Автореф. дисс… докт. мед. наук. - М., 2003.)The described method was not used to analyze changes in the activity of mitochondrial enzymes in dynamics in the examined children, and there is no comparative analysis of the revealed changes with another pathology, for example, with a group of frequently and long-term ill children. It is known that the immune system in such children is characterized by extreme tension, impaired intercellular cooperation and insufficient reserve capacity, which, apparently, is the result of a long and massive antigenic effect on the child's body. (Zaplatnikov A.L. Clinical and pathogenetic substantiation of immunotherapy and immunoprophylaxis of viral and bacterial diseases in children: Abstract of the thesis ... doctor of medical sciences. - M., 2003.)

Наиболее близким к заявляемому решению можно отнести способ, описанный в работе, в которой применялся цитобиохимический способ для определения дисфункции митохондриальных ферментов у детей с онкологическими заболеваниями. (Хундерякова Н.В., Плясунова С.А., Литвинова Е.Г., Ячкула Т.В., Захарченко М.В., Ковзан А.В., Федотчева Н.И., Шварцбурд П.М., Кондрашова М.Н. Изменения в лимфоцитах под действием субстратов окисления. // Биофизика. 2014. (59). вып. 6: 1101-1107) Этот способ заключается в том, что проводят отбор крови, затем на мазке крови окрашивание по методике с часовой инкубацией клеток в биохимической среде для определении активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, при этом величины активности рассчитывают по восстановлению нитросинего тетразолия при компьютерной обработке микроскопических изображений (М. Кондрашова, М. Захарченко, Н. Хундерякова и др., в кн.: Инновационные методы диагностики в медицине.НП «Сибак», Новосибирск, 2013), сс.1058). Исследование проводилось цитобиохимическим методом с измерением активности митохондриального дыхания и гликолиза именно у детей с онкологическими процессами без локализации его в органах респираторного тракта. Активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы лимфоцитов являются показателями основных процессов энергообеспечения в клетке - митохондриального дыхания и гликолиза.Closest to the claimed solution can be attributed to the method described in the work, which used a cytobiochemical method to determine the dysfunction of mitochondrial enzymes in children with cancer. (Khunderyakova N.V., Plyasunova S.A., Litvinova E.G., Yachkula T.V., Zakharchenko M.V., Kovzan A.V., Fedotcheva N.I., Shvartsburd P.M., Kondrashova M.N. Changes in lymphocytes under the action of oxidation substrates. // Biophysics. 2014. (59). Issue 6: 1101-1107) This method consists in the fact that blood sampling is carried out, then staining on a blood smear according to the technique with an hour incubation of cells in a biochemical environment to determine the activity of succinate dehydrogenase and lactate dehydrogenase, while the activity values are calculated by the reduction of nitro blue tetrazolium during computer processing of microscopic images (M. Kondrashova, M. Zakharchenko, N. Khunderyakova et al., in the book: Innovative diagnostic methods in medicine. NP "Sibak", Novosibirsk, 2013), pp. 1058). The study was carried out by the cytobiochemical method with the measurement of the activity of mitochondrial respiration and glycolysis in children with oncological processes without its localization in the organs of the respiratory tract. The activities of succinate dehydrogenase and lactate dehydrogenase of lymphocytes are indicators of the main processes of energy supply in the cell - mitochondrial respiration and glycolysis.

Однако следует отметить, что метаболизм раковой клетки значительно отличается от метаболизма клеток здоровых детей.However, it should be noted that the metabolism of cancer cells is significantly different from that of healthy children.

У детей с онкопатологией преобладает доминирование гликолиза над дыханием.In children with oncopathology, the dominance of glycolysis over respiration prevails.

При использовании описываемого способа определение активностей указанных ферментов не проводилось в динамике для контроля эффективности назначенной терапии, индивидуального выбора препаратов патогенетической терапии и своевременной ее коррекции.When using the described method, the determination of the activities of these enzymes was not carried out in dynamics to control the effectiveness of the prescribed therapy, the individual choice of drugs for pathogenetic therapy and its timely correction.

Заявляемый способ определения дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей характеризуется использованием цитобиохимического метода (ЦБХ) для определения активности сукцинатдегидрогеназы - основного фермента митохондриального дыхания и лактатдегидрогеназы - цитоплазматического фермента, характеризующего гликолиз и процессы восстановления энергетического баланса организмаThe inventive method for determining the dysfunction of enzymes of energy metabolism in respiratory pathology in children is characterized by the use of the cytobiochemical method (CBH) to determine the activity of succinate dehydrogenase - the main enzyme of mitochondrial respiration and lactate dehydrogenase - a cytoplasmic enzyme that characterizes glycolysis and the processes of restoring the energy balance of the body

Он обеспечивает возможность выявления нарушений энергетического обмена клеток, что способствует индивидуализации патогенетической терапии.It provides the ability to identify violations of the energy metabolism of cells, which contributes to the individualization of pathogenetic therapy.

Кроме того, этот способ позволяет формировать группы риска развития аллергических заболеваний у детей группы часто и длительно болеющих.In addition, this method allows the formation of risk groups for the development of allergic diseases in children of the group with frequent and long-term illnesses.

Раскрытие изобретения.Disclosure of the invention.

Предлагается способ диагностики дисфункций ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей, включающий определение активности дегидрогеназ митохондрий и гликолиза в неповрежденных лимфоцитах капиллярной крови на мазке по концентрации продукта реакции восстановления нитросинего тетразолия - формазана в каждой клетке, путем проведения количественного морфологического анализа цветных изображений. При этом вывод о митохондриальной дисфункции делают по полученным значениям активностей ферментов сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), принимая за норму значение активности СДГ - 1-1,3 условных единиц, а значение активности ЛДГ - 8-11 условных единиц.A method for diagnosing dysfunctions of energy metabolism enzymes in respiratory pathology in children is proposed, including determining the activity of mitochondrial dehydrogenases and glycolysis in intact capillary blood lymphocytes on a smear based on the concentration of the nitro blue tetrazolium reduction reaction product - formazan in each cell, by quantitative morphological analysis of color images. In this case, the conclusion about mitochondrial dysfunction is made according to the obtained values of the activities of the enzymes succinate dehydrogenase (SDH) and lactate dehydrogenase (LDH), taking as the norm the value of SDH activity - 1-1.3 conventional units, and the value of LDH activity - 8-11 conventional units.

Морфологический анализ цветных изображений проводят с использованием специализированной компьютерной программы, позволяющей определить количество и распределение красителя в клетке на основе вычисления декомпозиции красителей по данным цветового пространства.Morphological analysis of color images is carried out using a specialized computer program that makes it possible to determine the amount and distribution of the dye in the cell based on the calculation of the dye decomposition according to the color space data.

Способ осуществляют следующим образом.The method is carried out as follows.

Проводят забор образца капиллярной крови из пальца ребенка. Мазки крови после фиксации и окрашивания красителем нитросиний тетразолий (НСТ) подвергают микроскопии на микроскопе при увеличении х100 под масляной иммерсией. В каждом мазке проводят морфологический анализ 100-150 лимфоцитов и определяют количество и распределение красителя в каждой клетке.A capillary blood sample is taken from the child's finger. After fixation and staining with nitroblue tetrazolium (NBT) dye, blood smears are subjected to microscopy under a microscope at a magnification of x100 under oil immersion. In each smear, a morphological analysis of 100-150 lymphocytes is carried out and the amount and distribution of the dye in each cell is determined.

Об активности ферментов в лимфоцитах судят по определяемому количеству красителя в условных единицах.The activity of enzymes in lymphocytes is judged by the determined amount of dye in arbitrary units.

Способ предоставляет достоверную информацию об энергообменных процессах в клетке при различных патогенетических механизмах воспаления, в том числе позволяет выявлять нарушения активности ферментов энергетического обменаThe method provides reliable information about energy exchange processes in the cell with various pathogenetic mechanisms of inflammation, including the detection of disturbances in the activity of enzymes of energy metabolism

При использовании предлагаемого способа исследование проводится на лимфоцитах из капиллярной крови. Взятие крови из пальца - несомненно более щадящий способ при работе с больными детьми.When using the proposed method, the study is carried out on lymphocytes from capillary blood. Fingertip sampling is undoubtedly a more gentle method when working with sick children.

Технической проблемой, решаемой изобретением, является индивидуальный выбор методов коррекции нарушений энергообмена клеток у детей при респираторной патологии, основанный на определении дисфункции митохондриальных и гликолитических ферментов энергетического обмена.The technical problem solved by the invention is the individual choice of methods for correcting disorders of cellular energy exchange in children with respiratory pathology, based on the determination of the dysfunction of mitochondrial and glycolytic enzymes of energy metabolism.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является создание для клинической практики более эффективного и информативного способа диагностики нарушения энергообмена в клетке и прогностической оценки течения заболевания при респираторной патологии у детей.The technical result to which the claimed invention is directed is the creation for clinical practice of a more effective and informative method for diagnosing disorders of energy exchange in a cell and for predicting the course of the disease in respiratory pathology in children.

Предлагаемый способ дает возможность формировать группы риска развития аллергических заболеваний у детей группы часто и длительно болеющих и индивидуально подбирать патогенетическую терапию для коррекции этих нарушений.The proposed method makes it possible to form risk groups for the development of allergic diseases in children of the group who are often and for a long time ill and individually select pathogenetic therapy for the correction of these disorders.

Из уровня техники не было известно, что цитобиохимический метод может быть использован для определения дисфункции ферментов при респираторной патологии у детей.It was not known from the prior art that the cytobiochemical method can be used to determine enzyme dysfunction in respiratory pathology in children.

Особенностью нашего исследования стало изучение (митохондриальной) дисфункции энергетического обмена у детей группы часто и длительно болеющих (ЧДБ) в сравнении с детьми с атопической бронхиальной астмой и группой практически здоровых детей.A feature of our study was the study of the (mitochondrial) dysfunction of energy metabolism in children of the group of frequently and long-term illnesses (CDI) in comparison with children with atopic bronchial asthma and a group of practically healthy children.

Было установлено, что у детей группы ЧДБ выявлены такие же нарушения активности ферментов энергетического обмена, как и при легком течении атопической бронхиальной астмы.It was found that in children of the BDS group, the same disturbances in the activity of enzymes of energy metabolism were revealed, as in the mild course of atopic bronchial asthma.

Таким образом, определение активности дегидрогеназ лимфоцитов становится прогностическим маркером для формирования групп риска развития в дальнейшем аллергических заболеваний.Thus, the determination of the activity of lymphocyte dehydrogenases becomes a prognostic marker for the formation of risk groups for the development of allergic diseases in the future.

Краткое описание чертежей.Brief description of the drawings.

Изобретения поясняются графическими материалами, подтверждающими возможность реализации изобретения с достижением заявленного технического результата, которые более подробно изложены в примерах.The inventions are illustrated by graphic materials confirming the possibility of implementing the invention with the achievement of the claimed technical result, which are described in more detail in the examples.

Фиг. 1. Активность СДГ (А) и ЛДГ (Б) у детей до (2016 и 2017 гг.) и после лечения (2019 г). Диапазон нормы находится между пунктирными линиями.FIG. 1. Activity of SDH (A) and LDH (B) in children before (2016 and 2017) and after treatment (2019). The normal range is between the dotted lines.

Фиг. 2. Распределение показателей у обследуемых детей выделенных групп по активности СДГ и ЛДГ. Заштрихованные участки показывают зону нормы для этих ферментов.FIG. 2. Distribution of indicators in the examined children of the selected groups according to the activity of SDH and LDH. The shaded areas show the normal zone for these enzymes.

Был проведен ЦБХ анализ энергетического обмена на мазках капиллярной крови у 19 детей -14 мальчиков и 5 девочек возраста 6-14 лет. Из них 12 детей было обследовано повторно (первое обследование - 2016 и 2017 гг.), 7 человек -впервые.The Central Biochemistry Center conducted an analysis of energy metabolism on capillary blood smears in 19 children - 14 boys and 5 girls aged 6-14 years. Of these, 12 children were examined again (the first examination was in 2016 and 2017), 7 people were examined for the first time.

Измерялись активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.The activities of succinate dehydrogenase and lactate dehydrogenase were measured.

Данные проведенного анализа для первой группы повторно обследованных детей представлены на фиг. 1.The data of the analysis performed for the first group of re-examined children are presented in Fig. 1.

Линией на рисунке показан диапазон нормы: СДГ от 1,0 до 1,3 ус.ед. и ЛДГ от 8,0 до 11,0 ус.ед.The line in the figure shows the normal range: SDG from 1.0 to 1.3 us.units. and LDH from 8.0 to 11.0 us.units.

Как видно из данных фиг. 1 А, у большинства детей при первом обследовании активность СДГ была значительно выше нормы (7 человек), незначительно превышала уровень нормы (3 человека) и у двух человек была ниже нормы.As seen from the data in FIG. 1A, in the majority of children at the first examination, the activity of SDH was significantly higher than the norm (7 people), slightly exceeded the level of the norm (3 people), and in two people it was below the norm.

При повторном обследовании после лечения у подавляющего большинства (10 человек) активность СДГ нормализовалась, у одного активность СДГ снизилась незначительно и осталась выше нормы и у одного снизилась ниже нормы.On re-examination after treatment, in the vast majority (10 people), the activity of SDH returned to normal, in one, the activity of SDH decreased slightly and remained above the norm, and in one it decreased below the norm.

Активность ЛДГ (фиг. 1 Б) также у большинства детей была гиперактивна и превышала норму (7 человек), у 4-х находилась в зоне нормы и у одного - ниже нормы.LDH activity (Fig. 1B) was also hyperactive in most of the children and exceeded the norm (7 people), in 4 children it was in the normal zone and in one it was below the norm.

Как и в случае с СДГ, при повторном обследовании наблюдалось нормализация активности ЛДГ до нормы (8 человек) и у 4-х человек снизилась до нижней границы нормы.As in the case of subdural hematoma, upon repeated examination, normalization of LDH activity to normal was observed (8 people) and in 4 people it decreased to the lower limit of normal.

Данные, представленные на фиг. 2, говорят о следующем.The data presented in FIG. 2, speak of the following.

У детей контрольной группы показатели находятся в зоне нормы - как по активности ЛДГ, так и по активности СДГ.In children of the control group, the indicators are in the normal zone - both in terms of LDH activity and SDH activity.

Четверо детей из самой «тяжелой» группы №1 занимают нижнее левое положение, т.е. все они имеют активность ЛДГ значительно ниже нормы; при этом активность СДГ у двух из них также ниже нормы.Four children from the “heaviest” group # 1 occupy the lower left position, ie. they all have LDH activity significantly below normal; while the activity of SDH in two of them is also below normal.

Следующая по тяжести заболевания группа №2 занимает верхнее правое положение на диаграмме распределения: у всех детей наблюдается гиперактивация СДГ, а у 6 человек из 10 также и ЛДГ превышает норму.Group 2, next in severity of the disease, occupies the upper right position on the distribution diagram: all children have hyperactivation of SDH, and 6 out of 10 people also have LDH exceeding the norm.

Дети из группы №3 (легкое течение БА с редкими обострениями) занимают промежуточное положение между 1 и 2 группами: часть из них находится вообще в зоне нормы (4 человека), четверо имеют гиперактивную ЛДГ при нормальной СДГ, остальные по своим показателям близки к группе №2, т.е. имеют превышение нормы по обоим показателям, но меньшее по абсолютным величинам.Children from group No. 3 (mild BA with rare exacerbations) occupy an intermediate position between groups 1 and 2: some of them are generally in the normal zone (4 people), four have hyperactive LDH with normal SDH, the rest are close to the group in terms of their indicators No. 2, i.e. have an excess of the norm in both indicators, but less in absolute terms.

Дети группы №4 (часто болеющие дети - ЧБД), все их показатели находятся в зоне группы №2 (у детей с бронхиальной астмой): у всех наблюдается гиперактивная СДГ и у двух детей из пяти также и ЛДГ выше нормы.Children of group No. 4 (frequently ill children - CHBD), all their indicators are in the zone of group No. 2 (in children with bronchial asthma): all have hyperactive subdural hematoma and two out of five children also have LDH above normal.

Повторное обследование детей, проведенное через 6-9 месяцев лечения, показало у большинства из них значительные улучшения показателей энергетического обмена. Для большей наглядности данные приведены по группам.Re-examination of children, carried out after 6-9 months of treatment, showed in most of them significant improvements in energy metabolism. For clarity, the data are given by groups.

Впервые было установлено, что у часто болеющих детей имелись такие же нарушения показателей ферментов энергетического обмена, как и у детей с легким течением бронхиальной астмы.For the first time it was found that frequently ill children had the same disturbances in the parameters of energy metabolism enzymes, as in children with a mild course of bronchial asthma.

У детей группы ЧДБ под влиянием инфекционных агентов и триггеров формируется в респираторном тракте хронический воспалительный процесс, который ведет к гипоксии тканей, накоплению продуктов перекисного окисления и напряженности процессов иммунного реагирования, нарушению межклеточной кооперации и недостаточности резервных возможностей, что, по-видимому, является результатом длительного и массивного антигенного воздействия на организм ребенка. У таких детей даже в период клинического благополучия и при отсутствии признаков ОРЗ выявляются отчетливые изменения в межклеточном взаимодействии в иммунной системе: достоверно повышается содержание провоспалительных интерлейкинов (IL2, IL4), в том числе интерлейкинов, участвующих в хронизации процессов воспаления (IL6, IL8).In children of the NPH group, under the influence of infectious agents and triggers, a chronic inflammatory process is formed in the respiratory tract, which leads to tissue hypoxia, the accumulation of peroxidation products and the intensity of the immune response processes, impaired intercellular cooperation and insufficient reserve capabilities, which, apparently, is the result of long-term and massive antigenic effect on the child's body. In such children, even in the period of clinical well-being and in the absence of signs of acute respiratory infections, distinct changes in the intercellular interaction in the immune system are revealed: the content of pro-inflammatory interleukins (IL2, IL4), including interleukins involved in the chronization of inflammation (IL6, IL8), is significantly increased.

Это сопровождается снижением клеточной цитотоксичности, дисиммуноглобулинемией, недостаточностью резервных возможностей интерфероногенеза, особенно в плане синтеза интерферона-гамма, осуществляющего мощную противовирусную защиту в организме, несмотря на нормальный уровень интерферона в сыворотке крови, объясняет сохранение вялотекущей реакции воспаления в организме ребенка даже при отсутствии клинических признаков ОРВИ. Снижение активности интерферона - гамма ведет к активации Th-2 лимфоцитов, повышению уровня IL4 и как следствие формированию инфекционно-аллергического воспаления. (Заплатников А.Л. Клинико-патогенетическое обоснование иммунотерапии и иммунопрофилактики вирусных и бактериальных заболеваний у детей: Автореф. дисс… докт. мед. наук. - М, 2003)This is accompanied by a decrease in cellular cytotoxicity, dysimmunoglobulinemia, insufficient reserve capabilities of interferonogenesis, especially in terms of the synthesis of interferon-gamma, which carries out powerful antiviral protection in the body, despite the normal level of interferon in the blood serum, explains the persistence of a sluggish inflammatory reaction in the child's body even in the absence of clinical signs ARVI. A decrease in the activity of interferon - gamma leads to the activation of Th-2 lymphocytes, an increase in the level of IL4 and, as a consequence, the formation of infectious-allergic inflammation. (Zaplatnikov A.L. Clinical and pathogenetic substantiation of immunotherapy and immunoprophylaxis of viral and bacterial diseases in children: Abstract of the thesis ... doctor of medical sciences. - M, 2003)

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не исчерпывается ими.The possibility of carrying out the proposed invention is confirmed by the following examples, but not limited to them.

Пример 1Example 1

Ребенок 6 лет (пациентка под №10) с тяжелым течением атопической бронхиальной астмы, с частыми обострениями, и сопутствующей аллергической патологией - сезонным аллергическим ринитом (АР).A 6-year-old child (patient No. 10) with a severe course of atopic bronchial asthma, with frequent exacerbations, and concomitant allergic pathology - seasonal allergic rhinitis (AR).

Для определения нарушений энергетического обмена клеток (митохондриальных дисфункций) проводят забор образца крови из пальца ребенка, определение активностей СДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови путем определения интенсивности восстановления красителя нитросинего тетразолия (НСТ) до формазана в лимфоцитах при инкубации мазков крови.To determine violations of the energy metabolism of cells (mitochondrial dysfunctions), a blood sample is taken from a child's finger, the activity of SDH and LDH in blood lymphocytes is determined by determining the intensity of the reduction of the nitro blue tetrazolium dye (NBT) to formazan in lymphocytes during incubation of blood smears.

Мазки после окрашивания красителем нитросиний тетразолий (НСТ) подвергают микроскопии на микроскопе (Leica-DM 2000 с цветной фотокамерой Leica DFC 425) при увеличении х100 под масляной иммерсией. В каждом мазке проводится морфологический анализ 100-150 лимфоцитов и с помощью компьютерной программы «Cell Composer», позволяющей определить количество и распределение красителя в клетке на основе вычисления декомпозиции красителей по данным цветового пространства, для дальнейшего изучения активности СДГ и ЛДГ.The smears after staining with nitroblue tetrazolium (NBT) dye are subjected to microscopy on a microscope (Leica-DM 2000 with a Leica DFC 425 color camera) at a magnification of x100 under oil immersion. In each smear, a morphological analysis of 100-150 lymphocytes is carried out and using the "Cell Composer" computer program, which allows to determine the amount and distribution of the dye in the cell based on the calculation of the decomposition of the dyes according to the color space data, for further study of the activity of SDH and LDH.

Затем во всех клетках измеряют активность ЛДГ и СДГ.Then, in all cells, the activity of LDH and SDH is measured.

При первом обследовании в 2019 году в период ремиссии активность СДГ и ЛДГ были снижены до 0,8 и 4,0 усл. ед., в группе контроля в этот же период - 1,1 и 8,6 усл. ед., соответственно.At the first examination in 2019, during the period of remission, the activity of SDH and LDH was reduced to 0.8 and 4.0 conv. units, in the control group in the same period - 1.1 and 8.6 conv. units, respectively.

Проводилась базисная терапия комбинированными глюкокортикостероидами (ГКС) в режиме постоянного дозирования и дополнительно топическими ГКС, с включением в программу лечения сорбента с янтарной кислотой и пре- и пробиотиков. Причем в качестве сорбента с янтарной кислотой применялся Жидкий активированный уголь по аннотации и в качестве пре- и пробиотика - синбиотик флувир, который представляет собой комбинацию пробиотиков - Lactobacillus plantarum LP01 и LP02, Lactobacillus rhamnosus LR04 и LR05, Bifidobacterium lactis BS01 и пребиотика - фруктоолигосахаридов.The basic therapy was carried out with combined glucocorticosteroids (GCS) in constant dosing mode and additionally topical GCS, with the inclusion of a sorbent with succinic acid and pre- and probiotics in the treatment program. Moreover, as a sorbent with succinic acid, liquid activated carbon was used according to the annotation and as a pre- and probiotic - a synbiotic fluvir, which is a combination of probiotics - Lactobacillus plantarum LP01 and LP02, Lactobacillus rhamnosus LR04 and LR05 and LR05, Bifactisobacterium

Через 6 месяцев использования подобранной базисной терапии комбинированными ГКС и топическими ГКС, с включением в программу лечения сорбента с янтарной кислотой и пре- и пробиотиков был проведен анализ крови, как описано выше в проведении первого обследования. Было отмечено повышение активности СДГ и ЛДГ до 1,2 и 9,3 усл. ед., при норме СДГ - 1-1,3 усл. ед. и ЛДГ 8-11 усл. ед., что указывало на восстановление активности митохондриальных ферментов.After 6 months of using the selected basic therapy with combined corticosteroids and topical corticosteroids, with the inclusion of a sorbent with succinic acid and pre- and probiotics in the treatment program, a blood test was performed, as described above in the first examination. An increase in the activity of SDH and LDH was noted up to 1.2 and 9.3 conv. units, at a rate of SDH - 1-1.3 conv. units and LDH 8-11 conv. units, which indicated the restoration of the activity of mitochondrial enzymes.

Это послужило основанием для завершения лечения.This was the basis for completing the treatment.

Пример 2.Example 2.

Ребенок 9 лет (пациент под №4) со средне тяжелым течением атопической бронхиальной астмы, с частыми не тяжелыми обострениями после ОРВИ, которые легко купировались бета-2-агонистами короткого действия через небулайзер, и с сопутствующим сезонным аллергическим ринитом.A 9-year-old child (patient No. 4) with a moderately severe course of atopic bronchial asthma, with frequent non-severe exacerbations after acute respiratory viral infections, which were easily stopped by short-acting beta-2-agonists via a nebulizer, and with concomitant seasonal allergic rhinitis.

Базисную терапию монтелукастом и топическими ГКС получал не регулярно.He did not receive basic therapy with montelukast and topical corticosteroids regularly.

Был проведен анализ крови ребенка, как описано выше в Примере 1, с определением ферментов в динамике их активности способом, который описан в примере 1The child's blood was analyzed as described above in Example 1, with the determination of enzymes in the dynamics of their activity by the method described in example 1

При первом обследовании в период ремиссии активность митохондриальных ферментов была повышена: СДГ-1,5 усл. ед. и ЛДГ - 14,0 усл. ед., что говорило о перенапряжении механизмов энергообеспечения.During the first examination during the period of remission, the activity of mitochondrial enzymes was increased: SDH-1.5 conv. units and LDH - 14.0 conv. units, which indicated the overvoltage of the power supply mechanisms.

После обучения в астмашколе и занятий с психологом, регулярного использования базисной терапии, полученные спустя 6 месяцев, показатели активности СДГ снизились до 1,3 усл. ед, но не достигла значений контрольной группы - 1,1 усл.ед. Показатели ЛДГ снизилась значительно - с 14 усл.ед. до 8,6 усл. ед., практически до значений контрольной группы - 8,6 усл. ед.After training in asthma school and classes with a psychologist, regular use of basic therapy, obtained after 6 months, the indices of SDH activity decreased to 1.3 conv. units, but did not reach the values of the control group - 1.1 conventional units. Indicators of LDH decreased significantly - from 14 conventional units. up to 8.6 conv. units, practically up to the values of the control group - 8.6 conv. units

Такая положительная динамика послужила поводом продолжить базисную терапию и курс синбиотика.Such positive dynamics was the reason to continue the basic therapy and the course of the synbiotic.

Пример 3.Example 3.

Ребенок 7 лет (пациентка под №22) с легким течением атопической бронхиальной астмы, с сопутствующим сезонным аллергическим ринитом, соблюдает гипоаллергенный быт и гипоаллергенную диету.A 7-year-old child (patient No. 22) with a mild course of atopic bronchial asthma, with concomitant seasonal allergic rhinitis, follows a hypoallergenic life and a hypoallergenic diet.

Был проведен анализ крови ребенка, как описано выше в Примере 1.The child's blood was analyzed as described in Example 1 above.

При первом обследовании в период ремиссии отмечено было повышение активности митохондриальных ферментов: СДГ - 1,6 усл. ед. и ЛДГ - 10,5 усл. ед., что указывало на активность аллергического воспаления даже при отсутствии клинических проявлений со стороны респираторного тракта.During the first examination during the period of remission, an increase in the activity of mitochondrial enzymes was noted: SDH - 1.6 conv. units and LDH - 10.5 conv. units, which indicated the activity of allergic inflammation even in the absence of clinical manifestations from the respiratory tract.

Ребенку был назначен курс монтелукаста на 2 месяца, предсезонная подготовка антигистаминовыми препаратами 2-го поколения и уход за слизистой полости носа.The child was prescribed a course of montelukast for 2 months, pre-season preparation with 2nd generation antihistamines and care of the nasal mucosa.

Через 6 месяцев после начала лечения значение СДГ снизилось до 1,3, но оставалось повышенным значение ЛДГ - 9,6 усл.ед., что послужило основанием для продолжения лечения монтелукастом и назначить курс синбиотика.6 months after the start of treatment, the value of SDH decreased to 1.3, but the value of LDH remained increased - 9.6 conventional units, which served as a basis for continuing treatment with montelukast and prescribing a course of synbiotic.

Пример 4.Example 4.

Ребенок 9 лет (пациент под №30) из группы длительно и часто болеющих (ЧБД). За год переносил до 6-8 эпизодов ОРВИ с обострением хронического тонзиллита, которые приводили к назначению антибактериальной терапии. Аллергоанамнез не был отягощеным, аллергообследование не выявило наличия аллергического процесса. Кожные пробы методом prick-теста были отрицательные, в крови не определялись специфические иммуноглобулины класса Е (sIgE) с группой пыльцевых, пищевых, бытовых, эпидермальных и грибковых аллергенов методом ImmunoCap. Настораживающим моментом послужило наличие у ребенка повышенного уровня эозинофилов в крови (420 кл/мкл). На период обследования ребенок являлся реконвалесцентом после очередного обострения (18 день после обострения и 12 день после завершения курса антибактериальной терапии), получал витаминотерапию. В состав витаминного комплекса входило большое количество витаминов и минералов, в том числе витамин С и Е.A 9-year-old child (patient No. 30) from the group of long-term and frequently ill patients (CWD). For the year, he suffered up to 6-8 episodes of acute respiratory viral infections with exacerbation of chronic tonsillitis, which led to the appointment of antibiotic therapy. Allergic anamnesis was not burdened, allergic examination did not reveal the presence of an allergic process. Skin tests by the prick test were negative; specific immunoglobulins of class E (sIgE) with a group of pollen, food, household, epidermal and fungal allergens were not detected in the blood by the ImmunoCap method. An alarming moment was the presence in the child of an increased level of eosinophils in the blood (420 cells / μL). For the period of examination, the child was convalescent after another exacerbation (18 days after exacerbation and 12 days after completion of the course of antibiotic therapy), received vitamin therapy. The vitamin complex included a large amount of vitamins and minerals, including vitamin C and E.

Показатели СДГ и ЛДГ были повышенными, СДГ - 1,7 усл. ед. и ЛДГ - 11 усл. ед., соответственно, что указывало на перенапряжение систем клеточного энергообмена. Ребенку была отменена витаминотерапия, продолжена местная санация ЛОР-органов, скорректирована диета путем назначения гипоаллергенных продуктов и снижения количества потребления простых углеводов, соблюдения гипоаллергенного быта. Ребенок был включен в группу риска развития в дальнейшем аллергических заболеваний.The indices of SDH and LDH were increased, SDH - 1.7 conv. units and LDH - 11 conv. units, respectively, which indicated an overstrain of the systems of cellular energy exchange. Vitamin therapy was canceled for the child, the local sanitation of ENT organs was continued, the diet was adjusted by prescribing hypoallergenic foods and reducing the amount of simple carbohydrates consumed, adhering to a hypoallergenic lifestyle. The child was included in the risk group for the development of further allergic diseases.

В течение последующих 6 месяцев было 2 эпизода ОРВИ, пролеченных противовирусными препаратами без назначения антибиотиков. Обострения хронического тонзиллита не было.Over the next 6 months, there were 2 episodes of ARVI treated with antiviral drugs without prescribing antibiotics. There was no exacerbation of chronic tonsillitis.

При контрольном исследовании показатели СДГ и ЛДГ снизились до 0,8 и 7,0, соответственно, что указывало на истощение активности как митохондриальных функций, так и поддерживающего их гликолиза, количество эозинофилов оставалось повышенным - 340 кл/мкл. Ребенку продолжены были санационные процедуры ЛОР-органов и назначен курс сорбентов, содержащих, в частности, пектины, а также янтарную кислоту и синбиотик.In the control study, the indices of SDH and LDH decreased to 0.8 and 7.0, respectively, which indicated the depletion of the activity of both mitochondrial functions and the glycolysis supporting them, the number of eosinophils remained elevated - 340 cells / μL. The child continued the sanitation procedures of the ENT organs and was prescribed a course of sorbents containing, in particular, pectins, as well as succinic acid and synbiotic.

Наряду с базисной терапией в лечении детей с респираторной патологией большое значение приобретает адекватно подобранная патогенетическая терапия и в первую очередь препараты гипооксиданты, антиоксидантны, синбиотики и сорбенты. (Таблица 2.) Опираясь на полученные результаты исследования активности ферментов энергетического обмена клеток, детям индивидуально подбиралась препараты патогенетической терапии.Along with basic therapy in the treatment of children with respiratory pathology, an adequately selected pathogenetic therapy, primarily hypooxidants, antioxidants, synbiotics and sorbents, is of great importance. (Table 2.) Based on the results of the study of the activity of enzymes of energy metabolism of cells, the children were individually selected drugs for pathogenetic therapy.

Так, при активации и гиперактивации СДГ и ЛДГ назначение антиоксидантов может привести к усилению оксидативного стресса и дальнейшему повреждению клеток, при сниженной активности детям показано назначение антиоксидантов и гипооксидантов, ингибирование активности СДГ и ЛДГ требовало назначения сорбентов.Thus, upon activation and hyperactivation of SDH and LDH, the administration of antioxidants can lead to increased oxidative stress and further damage to cells; with reduced activity, children are shown the appointment of antioxidants and hypooxidants, inhibition of the activity of SDH and LDH required the administration of sorbents.

Таким образом, предлагаемое цитобиохимическое исследование ферментов лимфоцитов капиллярной крови позволило повысить диагностическую чувствительность при обследовании детей с респираторной патологией для выбора более эффективного патогенетического лечения.Thus, the proposed cytobiochemical study of capillary blood lymphocyte enzymes made it possible to increase the diagnostic sensitivity when examining children with respiratory pathology in order to choose a more effective pathogenetic treatment.

Кроме того, это позволило обратить внимание на часто болеющих детей, как группу риска по развитию аллергических заболеваний в дальнейшем.In addition, this made it possible to draw attention to frequently ill children as a risk group for the development of allergic diseases in the future.

Исследование в динамике ферментов дает возможность дифференцированно подбирать адекватную базисную и патогенетическую терапию и своевременно вносить коррекцию в процесс восстановления функций митохондриальных и гликолитических ферментов.Research in the dynamics of enzymes makes it possible to differentially select an adequate basic and pathogenetic therapy and timely correct the process of restoring the functions of mitochondrial and glycolytic enzymes.

Комплексный цитобиохимический анализ является ценным диагностическим инструментом при подборе медикаментозного лечения и при оценке динамики митохондриальной недостаточности в процессе терапии. Чувствительность вышеупомянутых показателей позволяет уже вскоре после первого назначения препарата сделать вывод об его эффективности и прогнозировать результат лечения.Comprehensive cytobiochemical analysis is a valuable diagnostic tool in the selection of drug treatment and in assessing the dynamics of mitochondrial insufficiency during therapy. The sensitivity of the aforementioned indicators allows, soon after the first prescription of the drug, to draw a conclusion about its effectiveness and predict the result of treatment.

Таким образом, достигнут технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, - создание для клинической практики более эффективного и информативного способа прогностической оценки и диагностики нарушения энергообмена в клетке при респираторной патологии у детей, что дает возможность индивидуально подбирать терапию для коррекции этих нарушений.Thus, the technical result, which the claimed invention is aimed at, has been achieved - the creation for clinical practice of a more effective and informative method for prognostic assessment and diagnosis of impaired energy exchange in a cell in respiratory pathology in children, which makes it possible to individually select therapy to correct these disorders.

Claims

1. A method for determining the dysfunction of energy metabolism enzymes in respiratory pathology in children, which consists in determining the activity of mitochondrial dehydrogenases and glycolysis in intact capillary blood lymphocytes on a smear, which is stained with nitro blue tetrazolium dye, subjected to microscopy, in each smear a morphological analysis of lymphocytes is performed and the amount and distribution of the dye in each cell is determined, the activity of enzymes in lymphocytes is judged by the determined amount of the dye in arbitrary units, while the conclusion about the presence of dysfunction of energy metabolism enzymes is made by the values of the activities of the enzymes succinate dehydrogenase and lactate dehydrogenase, while the value of succinate dehydrogenase is taken as the norm. 1.3 conventional units, and the value of lactate dehydrogenase is 8-11 conventional units.

2. The method according to claim 1, characterized in that the determination of the activity of dehydrogenases is carried out by carrying out a quantitative morphological analysis of color images using the "Cell Composer" computer program.

3. Application of the method for determining the dysfunction of energy metabolism enzymes in respiratory pathology in children according to claim 1 to monitor the effectiveness of the prescribed therapy, individual selection of pathogenetic therapy drugs and its timely correction.

4. Application of the method for determining the dysfunction of enzymes of energy metabolism in respiratory pathology in children according to claim 1 with a prognostic purpose for the formation of risk groups for the development of allergic diseases in the future.