RU2759232C1

RU2759232C1 - Method for evaluating the effectiveness of leprosy therapy using polymerase chain reaction for amplification of species-specific sections of the leprosy, human or mouse genomes

Info

Publication number: RU2759232C1
Application number: RU2021101046A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Анатольевич Вербенко; Виктория Сергеевна Соломка; Дмитрий Геннадиевич Дерябин; Алексей Алексеевич Кубанов
Priority date: 2021-01-20
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2021-11-11

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine and concerns a method for evaluating the effectiveness of leprosy chemotherapy by quantitative analysis of Mycobacterium leprae DNA in laboratory animal or human tissues, where in a real-time polymerase chain reaction using highly specific primers and hydrolyzable probes, a parallel amplification of a species-specific section of the carrier gene selected from a section of the human beta-actin gene (ACTB) or a section of the mouse B2-microglobulin gene (B2M) is performed, and a variable section of the RLEP genome of the pathogen, followed by the calculation of the ratio of the obtained values of threshold Ct cycles, on the basis of its changes in the dynamics of treatment, a decrease, stabilization or growth of the bacterial load is judged, where an increase in the ratio of the obtained values of threshold Ct cycles during therapy, an increase in the bacterial load is stated, while remaining unchanged: stabilization of the state, with a decrease a reduction in the bacterial load, which makes it possible to evaluate the effectiveness of leprosy therapy, inversely proportional to the bacterial load.

EFFECT: invention provides an assessment of the effectiveness of leprosy chemotherapy.

1 cl, 5 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Область техники настоящего изобретенияTECHNICAL FIELD OF THE PRESENT INVENTION

Изобретение относится медицине, а именно к лепрологии, и можетThe invention relates to medicine, namely to leprology, and can

быть использовано для изучения эффективности как отдельных лекарственных, препаратов так и их комбинаций для лечения больных лепрой.be used to study the effectiveness of both individual drugs, drugs and their combinations for the treatment of patients with leprosy.

Лепра (болезнь Гансена) - хроническое гранулематозное заболевание, вызываемое микобактериями Mycobacterium leprae и Mycobacterium lepromatosis, поражающее преимущественно кожные покровы и периферическую нервную систему. Несмотря на относительно невысокую заболеваемость и эндемичность, до настоящего времени лепра является актуальной проблемой здравоохранения. Инкубационный период варьирует от 3 месяцев до 40 лет, что создает определенные сложности в выявлении инфицированных лиц и проведении противоэпидемических мероприятий [1 - World health organization/Leprosy. Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs101/en/].Lepra (Hansen's disease) is a chronic granulomatous disease caused by the mycobacterium Mycobacterium leprae and Mycobacterium lepromatosis, affecting mainly the skin and the peripheral nervous system. Despite the relatively low incidence and endemicity, leprosy is still an urgent public health problem. The incubation period varies from 3 months to 40 years, which creates certain difficulties in identifying infected individuals and conducting anti-epidemic measures [1 - World Health Organization / Leprosy. Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs101/en/].

В Российской Федерации заболеваемость имеет спорадический характер, в последние годы регистрируются единичные новые случаи лепры. Однако, в мире ежегодно выявляется около 200 тыс.новых случаев лепры, в том числе в странах, имеющих тесные социально-экономические контакты с Российской Федерацией. Постановлением правительства Российской Федерации от 1 декабря 2004 г. №715 лепра включена в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих, а приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 29 июня 2015 г. №384н лепра отнесена к инфекционным заболеваниям, представляющим опасность для окружающих и являющихся основанием для отказа в выдаче либо аннулирования разрешения на временное проживание иностранных граждан и лиц без гражданства, или вида на жительство, или патента, или разрешения на работу в Российской Федерации [2 - Приказ Министерства здравоохранения РФ от 29.06.2015 №384н].In the Russian Federation, the incidence is sporadic; in recent years, isolated new cases of leprosy have been recorded. However, about 200 thousand new cases of leprosy are detected annually in the world, including in countries with close socio-economic contacts with the Russian Federation. By Decree of the Government of the Russian Federation No. 715 of December 1, 2004, leprosy is included in the list of diseases that pose a danger to others, and by order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 384n of June 29, 2015, leprosy is classified as an infectious disease posing a danger to others and is the basis to refuse to issue or cancel a temporary residence permit for foreign citizens and stateless persons, or a residence permit, or a patent, or a work permit in the Russian Federation [2 - Order of the Ministry of Health of the Russian Federation of June 29, 2015 No. 384n].

Согласно рекомендациям ВОЗ [1], стандартизованная комбинированная лекарственная терапия лепры включает три препарата: дапсон, рифампицин, клофазимин, но только два из этих препаратов зарегистрированы в Российской Федерации (дапсон и рифампицин). В настоящее время в случае выявления больного лепрой - гражданина Российской Федерации обеспечить оказание лекарственной терапии в точном соответствии с рекомендациями ВОЗ не представляется возможным. Неполная комбинированная лекарственная терапия не защищает полностью от таких явлений, как рецидив заболевания, а также развитие резистентности возбудителя к препаратам химиотерапии. Большинство исследований схем комбинированной терапии фокусируются на попытках создания и тестирования новых схем лечения лепры, которых отличало бы меньшая длительность терапии и в то же время эффективность по отношению к возможной резистентности и рецидивам. В настоящее время курс комбинированной специфической терапии больных лепрой длится 6 месяцев [3 - Приказ МЗ РФ №1681 от 29.12.2012].According to the WHO recommendations [1], standardized combined drug therapy for leprosy includes three drugs: dapsone, rifampicin, clofazimine, but only two of these drugs are registered in the Russian Federation (dapsone and rifampicin). At present, if a patient with leprosy is identified as a citizen of the Russian Federation, it is not possible to provide drug therapy in strict accordance with the WHO recommendations. Incomplete combination drug therapy does not completely protect against such phenomena as relapse of the disease, as well as the development of resistance of the pathogen to chemotherapy drugs. Most studies of combination therapy regimens focus on attempts to create and test new treatment regimens for leprosy, which would be characterized by a shorter duration of therapy and at the same time being effective in relation to possible resistance and relapse. Currently, the course of combined specific therapy for patients with leprosy lasts 6 months [3 - Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 1681 of 12/29/2012].

Современные схемы лечения - это фиксировано-временные схемы комбинированной лекарственной терапии, с комбинацией различных препаратов. Как правило, такие схемы имеют преимущества в комплаентности и эффективности при других заболеваниях, связанных с микобактерией (туберкулез), однако их использование имеет особенности при лечении лепры. Так, при лечении завершающей стадии малобактериальной формы лепры, когда результаты мазков негативны, сложнее принять решение о прекращении терапии, чем при многобактериальной форме, при которой результаты мазков - показатель активности заболевания. Кроме того, продолжавшаяся видимая клиническая активность процесса наблюдается по истечению 6 месяцев терапии, находясь в диапазоне от 10 до 67%.Modern treatment regimens are fixed-time regimens of combination drug therapy, with a combination of different drugs. Typically, such regimens have advantages in compliance and effectiveness in other diseases associated with mycobacterium (tuberculosis), but their use is specific in the treatment of leprosy. So, in the treatment of the final stage of the low-bacterial form of leprosy, when the results of smears are negative, it is more difficult to make a decision to discontinue therapy than in the multi-bacterial form, in which the results of smears are an indicator of the activity of the disease. In addition, the continued visible clinical activity of the process is observed after 6 months of therapy, being in the range from 10 to 67%.

Еще одним аспектом является развитие нежелательных явлений от применения современной схемы комбинированной лекарственной терапии, таких как дапсон-индуцируемая гемолитическая анемия и клофазимин-индуцируемая пигментация. Возможно, значимость таких явлений недооценена и разработка новых схем терапии могла бы их уменьшить; более того, офлоксацин и миноциклин показали себя более эффективными в отношении бактерицидных свойств по сравнению с дапсоном и клофазимином в клинических испытаниях и испытаниях на мышах. Например, клофазимин не зарегистрирован на территории Российской Федерации, и в качестве альтернативных схем лечения лепры можно применять комбинацию препаратов рифампицина и фторхинолонов (РОМ), выпускающихся на территории нашей страны. Отдельно стоит упомянуть сочетанное с рекомендованной ВОЗ терапией использование статинов для предотвращения образования покоящейся формы микобактерий лепры, существенно улучшающих показатель эффективности терапии [4 - Lobato et al., Statins increase rifampin mycobactericidal effect. Antimicrob. Agents Chemother. 2014. 58(10):5766-74]. Таким образом, для обеспечения лекарственной терапией больных лепрой, необходимо разработать схемы лечения заболевания препаратами с доказанной эффективностью. При этом оценка эффективности терапии должна быть точной и надежной, поскольку она является одним из основных критериев выбора терапии.Another aspect is the development of adverse events from the use of a modern combination drug therapy regimen, such as dapsone-induced hemolytic anemia and clofazimine-induced pigmentation. Perhaps the significance of such phenomena is underestimated and the development of new therapy regimens could reduce them; moreover, ofloxacin and minocycline have been shown to be more effective in bactericidal properties than dapsone and clofazimine in clinical trials and mouse trials. For example, clofazimine is not registered in the Russian Federation, and a combination of rifampicin and fluoroquinolones (POM) preparations produced in our country can be used as an alternative treatment for leprosy. Separately, it is worth mentioning the use of statins combined with the therapy recommended by WHO to prevent the formation of a dormant form of mycobacterium leprosy, which significantly improves the rate of effectiveness of therapy [4 - Lobato et al., Statins increase rifampin mycobactericidal effect. Antimicrob. Agents Chemother. 2014.58 (10): 5766-74]. Thus, in order to provide drug therapy for patients with leprosy, it is necessary to develop treatment regimens for the disease with drugs with proven efficacy. At the same time, the assessment of the effectiveness of therapy must be accurate and reliable, since it is one of the main criteria for choosing a therapy.

Моделирование лепрозной инфекции в эксперименте позволяет осуществлять скринирование препаратов с потенциальной противолепрозной активностью. Моделирование лепры в лабораторных условиях остается актуальной задачей еще и потому, что М. leprae не культивируется на искусственных питательных средах, и это в значительной степени затрудняет изучение его биологических свойств. С. Shepard в 1960 г. предложил первый успешный метод культивирования лепры на мышах [5 - Shepard С.С. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice. J. Exp.Med. - 1960. - Vol. 112. - P. 445-454]. Этот метод позволил выделить жизнеспособные бактерии из лепрозных высыпаний, разработать новые препараты для лечения лепры, изучить фармакологическую резистентность возбудителя лепры, а также провести множество иммунологических исследований этого заболевания, и продолжает использоваться в настоящее время для оценки эффективности разрабатываемых схем терапии лепры.Simulation of leprosy infection in the experiment allows screening of drugs with potential antileprosy activity. Simulation of leprosy in laboratory conditions remains an urgent task also because M. leprae is not cultivated on artificial nutrient media, and this greatly complicates the study of its biological properties. S. Shepard in 1960 proposed the first successful method of cultivating leprosy in mice [5 - Shepard S.S. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice. J. Exp. Med. - 1960. - Vol. 112. - P. 445-454]. This method made it possible to isolate viable bacteria from leprosy eruptions, to develop new drugs for the treatment of leprosy, to study the pharmacological resistance of the causative agent of leprosy, as well as to carry out many immunological studies of this disease, and continues to be used now to assess the effectiveness of the developed treatment regimens for leprosy.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияPrior art of the present invention

Анализ предшествующего уровня техники показал наличие нескольких близких прототипов патентуемого способа, каждый из которых уступает по описанным параметрам разработанному способу и алгоритму его применения.The analysis of the prior art showed the presence of several close prototypes of the patented method, each of which is inferior in the described parameters to the developed method and the algorithm for its application.

Прототипом способа оценки эффективности лечения лепры может рассматриваться способ [6 - Патент RU 2688156 С2. Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции. Сароянц Л.В., Арнаудова К.Ш.], разработанный в ФГБУ "Научно-исследовательский институт по изучению лепры" в 2019 г., основанный на определении жизнеспособности Mycobacterium leprae, включающий применение ОТ-ПЦР с внешними и внутренними праймерами к участку гена 16 субъединицы рибосомальной РНК, с использованием выделения ДНК/РНК из биоптатов и скарификатов кожи, осуществления синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции и проведения такого анализа до начала и по истечении сроков 6 и 9 месяцев по окончании терапии. Согласно формуле изобретения, антибактериальная терапия лепры считается эффективной при снижении бактериоскопического индекса и процента положительных образцов, полученных через 6 и 9 месяцев после начала лечения.The prototype of a method for assessing the effectiveness of treatment of leprosy can be considered a method [6 - Patent RU 2688156 C2. A method for evaluating the effectiveness of leprosy treatment using polymerase chain reaction. Saroyants L.V., Arnaudova K.Sh.], developed at the Research Institute for the Study of Leprosy in 2019, based on the determination of the viability of Mycobacterium leprae, including the use of RT-PCR with external and internal primers to the gene site 16 subunits of ribosomal RNA, using DNA / RNA isolation from biopsies and skin scarification, cDNA synthesis in the reverse transcription reaction and such analysis before and after 6 and 9 months after the end of therapy. According to the claims, antibacterial therapy for leprosy is considered effective in reducing the bacterioscopic index and the percentage of positive samples obtained 6 and 9 months after the start of treatment.

Недостатками этого способа являются: быстрая деградация молекул мРНК после гибели клетки, высокая чувствительность очищенных препаратов РНК к воздействию окружающей среды, необходимость оценки бактериоскопического индекса, длительный период проведения терапии. Главным препятствием применения способа служит оценка присутствия жизнеспособных бактерий Mycobacterium leprae в анализируемом образце, в то время как оценка содержания микобактерий в покоящейся форме [7 - Шлеева и др. Покоящиеся формы микобактерий. Микробология 2010, том 79, №1, с. 3-15] не производится вообще.The disadvantages of this method are: rapid degradation of mRNA molecules after cell death, high sensitivity of purified RNA preparations to environmental influences, the need to assess the bacterioscopic index, and a long period of therapy. The main obstacle to the application of the method is the assessment of the presence of viable bacteria Mycobacterium leprae in the analyzed sample, while the assessment of the content of mycobacteria in a dormant form [7 - Shleeva et al. Resting forms of mycobacteria. Microbology 2010, volume 79, no. 1, p. 3-15] is not produced at all.

Эти недостатки не представляют возможности получения конкретного технического результата - надежной оценки эффективности применения терапевтической схемы лечения.These disadvantages do not represent the possibility of obtaining a specific technical result - a reliable assessment of the effectiveness of the use of a therapeutic regimen.

Другим прототипом предлагаемого изобретения является способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой [8 - Патент RU 2247374 С1. Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой. Ющенко и др.], разработанный в НИИ лепры Минздрава России в 2005 году, состоящий в исследовании метаболизма клеток гемопоэтического происхождения, отличающийся тем, что определяют средний цитохимический коэффициент степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови в условных единицах до начала терапии, и через 2-3 или 5-6, 10-12, 20-24 месяцев терапии. Соотношение коэффициентов позволяет упростить прогнозирование эффективности терапии у больных лепрой.Another prototype of the present invention is a method for predicting the effectiveness of therapy in patients with leprosy [8 - Patent RU 2247374 C1. A method for predicting the effectiveness of therapy in patients with leprosy. Yushchenko and others], developed at the Research Institute of Leprosy of the Ministry of Health of Russia in 2005, consisting in the study of the metabolism of cells of hematopoietic origin, characterized in that they determine the average cytochemical coefficient of the degree of lipid accumulation in peripheral blood leukocytes in arbitrary units before the start of therapy, and after 2 3 or 5-6, 10-12, 20-24 months of therapy. The ratio of the coefficients makes it possible to simplify the prediction of the effectiveness of therapy in patients with leprosy.

Недостатками этого способа являются сложность проведения анализа, его низкая точность вследствие большой погрешности из-за влияния дополнительных факторов, напрямую не связанных с развитием лепрозной инфекции. Использование современного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) как правило, позволяет повысить точность результатов и достоверность анализа.The disadvantages of this method are the complexity of the analysis, its low accuracy due to large errors due to the influence of additional factors that are not directly related to the development of leprosy infection. The use of the modern method of polymerase chain reaction (PCR), as a rule, improves the accuracy of the results and the reliability of the analysis.

Из предшествующего уровня техники [9 - Mullis К.В., Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction. Method Enzymol. 1987, 155, 335] известен метод ПЦР, суть которого состоит в том, в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной инфекционный агент, вносятся короткие нуклеотидные последовательности -праймеры (прямой и обратный), комплементарные специфическим фрагментам генома искомого возбудителя. При последующей температурной обработке достигается денатурация двухспиральной ДНК возбудителя, делающая ее доступной для взаимодействия с праймерами, комплементарными соответствующим участкам геномной ДНК. На следующем этапе в присутствии в реакционной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и ДНК-полимеразы происходит избирательное размножение (амплификация) участка ДНК определенного размера, который задается при выборе праймеров. Циклическое повторение денатурации и ренатурации ДНК ведет к нарастающему в геометрической прогрессии накоплению специфических фрагментов ДНК, доступных для визуальной регистрации в агарозном или акриламидном гелях. Усовершенствованные варианты данного метода используют термостабильную ДНК-полимеразу термофильного микроорганизма Thermus aquaticus [10 - Patent US 4889818 A, Purified thermostable enzyme], позволяющую проводить ПЦР без добавления фермента в каждом цикле реакции, а также флуоресцентно-меченые зонды, позволяющие проводить измерение количества амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. В частности, наиболее распространенный метод детекции - применение гидролизующихся зондов (TaqMan) основывается на использовании флуоресцентно-меченного олигонуклеотида, комплементарного внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК возбудителя, с флуоресцентной меткой в 5'-положении и гасителем флуоресценции в 3'-положении [11 - Patent US 20110300544 A1, Enhanced taqman probe based amplification].From the prior art [9 - Mullis KV, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction. Method Enzymol. 1987, 155, 335] a known PCR method, the essence of which is that short nucleotide sequences-primers (forward and reverse) complementary to specific fragments of the genome of the desired pathogen are introduced into the sample under study, presumably containing one or another infectious agent. During subsequent heat treatment, denaturation of the double-stranded DNA of the pathogen is achieved, making it available for interaction with primers complementary to the corresponding regions of genomic DNA. At the next stage, in the presence of deoxynucleotide triphosphates and DNA polymerase in the reaction mixture, selective multiplication (amplification) of a DNA region of a certain size occurs, which is specified when choosing primers. Cyclic repetition of DNA denaturation and renaturation leads to an exponentially growing accumulation of specific DNA fragments available for visual registration in agarose or acrylamide gels. Improved versions of this method use thermostable DNA polymerase of thermophilic microorganism Thermus aquaticus [10 - Patent US 4889818 A, Purified thermostable enzyme], which allows PCR to be performed without adding an enzyme in each cycle of the reaction, as well as fluorescently labeled probes that allow measuring the amount of amplified DNA. in real time after each amplification cycle. In particular, the most common detection method - the use of hydrolyzing probes (TaqMan) - is based on the use of a fluorescently labeled oligonucleotide complementary to the internal sequence of the amplified DNA fragment of the pathogen, with a fluorescent label in the 5'-position and a fluorescence quencher in the 3'-position [11 - Patent US 20110300544 A1, Enhanced taqman probe based amplification].

На основе данного универсального принципа разработано и запатентовано множество способов выявления возбудителей бактериальных инфекций, различия между которыми заключаются в первичных нуклеотидных последовательностях используемых праймеров. При этом ключевым требованием является уникальность данной последовательности: (а) комплементарная ему последовательность (ген или фрагмент гена) должна присутствовать в геноме всех представителей детектируемого бактериального вида; (б) аналогичные последовательности должны отсутствовать в геномах других бактериальных видов. Соблюдение указанных требований обеспечивает реализуемым на их основе технологий ПЦР соответствие требованию «специфичность».On the basis of this universal principle, many methods have been developed and patented for identifying causative agents of bacterial infections, the differences between which are in the primary nucleotide sequences of the primers used. In this case, the key requirement is the uniqueness of this sequence: (a) a complementary sequence (gene or gene fragment) must be present in the genome of all representatives of the detected bacterial species; (b) similar sequences should be absent in the genomes of other bacterial species. Compliance with the specified requirements ensures compliance with the “specificity” requirement for PCR technologies implemented on their basis.

Из предшествующего уровня техники известен [12 - Патент RU 263645 С1. Способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий. Образцова О.А. и др.] способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий, разработанный в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России в 2017 году. В рамках данного способа ДНК патогенных бактерий, в том числе Mycobacterium leprae, обнаруживают с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, а с целью повышения чувствительности способа в качестве праймеров и флуоресцентной пробы используют олигонуклеотиды, комплементарные специфическим повторяющимся элементам генома детектируемых бактерий, присутствующим в бактериальной хромосоме в количестве двух и более копий. При обнаружении ДНК Mycobacterium leprae используются прямой 5'-GCAGCAGTATCGTGTTAGTGAA-3', обратный 5'-CGCTAGAAGGTTGCCGTAT-3' праймеры и гидролизующийся зонд (ГЗ) 5'-CGCCGACGGCCGGATCATCGA-3' к специфическому элементу генома М. leprae имеющему 29 повторов в бактериальной хромосоме.It is known from the prior art [12 - Patent RU 263645 C1. A method for increasing the sensitivity of the polymerase chain reaction in real time when detecting the DNA of pathogenic bacteria. Obraztsova O.A. et al.] a method for increasing the sensitivity of the polymerase chain reaction in real time when detecting the DNA of pathogenic bacteria, developed at the Federal State Budgetary Institution "State Research Center for Culture" of the Ministry of Health of Russia in 2017. Within the framework of this method, the DNA of pathogenic bacteria, including Mycobacterium leprae, is detected using a polymerase chain reaction in real time, and in order to increase the sensitivity of the method, oligonucleotides complementary to specific repeating elements of the genome of the detected bacteria present in bacterial chromosome in the amount of two or more copies. When detecting DNA of Mycobacterium leprae, direct 5'-GCAGCAGTATCGTGTTAGTGAA-3 ', reverse 5'-CGCTAGAAGGTTGCCGTAT-3' primers and a hydrolyzing probe (GS) 5'-CGCCGACGGCCGGATCATCAT-specific element M.CGA-3 ' ...

Аналогичным является способ [13 - Патент RU 2641060 С1. Способ идентификации ДНК микобактерий лепры с помощью полимеразной цепной реакции. Сароянц Л.В., Арнаудова К.Ш.], позволяющий подтвердить факт инфицированности микобактериями лепры при скрининговом обследовании населения. Биологический материал анализируется посредством проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием точно таких же внешних и внутренних праймеров и флуоресцентного зонда, на основании чего идентифицируется наличие возбудителя лепры.The method is similar [13 - Patent RU 2641060 C1. Method for identifying DNA of mycobacterium leprosy using polymerase chain reaction. Saroyants LV, Arnaudova K.Sh.], which allows to confirm the fact of infection with mycobacterium leprosy during screening examination of the population. Biological material is analyzed by polymerase chain reaction (PCR) using exactly the same external and internal primers and a fluorescent probe, on the basis of which the presence of the causative agent of leprosy is identified.

Изобретение технической возможности осуществления ПЦР в реальном времени привело к раскрытию способов измерения количественной оценки содержания ДНК/РНК в анализируемом образце, что находит повсеместное применение например, в аналитической оценке присутствия чужеродной или трансгенной ДНК в образце, анализе количества представленности транскриптов и т.п. Базовый принцип расчета количества заключается в построении калибровочной кривой (уникальной для каждой комбинации праймеров при использовании конкретного прибора), имеющей вид обратной линейной зависимости концентрации исследуемого участка генома от величины порогового цикла Ct [14 - Patent USOO6303305B1-Method for quantification of an analyte].The invention of the technical feasibility of real-time PCR has led to the disclosure of methods for measuring the quantitative assessment of the content of DNA / RNA in an analyzed sample, which finds widespread application, for example, in the analytical assessment of the presence of foreign or transgenic DNA in a sample, analysis of the amount of transcript representation, etc. The basic principle for calculating the amount is to construct a calibration curve (unique for each combination of primers when using a specific device), which has the form of an inverse linear dependence of the concentration of the studied genome region on the value of the threshold cycle Ct [14 - Patent USOO6303305B1-Method for quantification of an analyte].

Все описанное выше позволяет предположить, что осуществление оценки эффективности терапии лепры может быть усовершенствовано путем расчета изменения бактериальной нагрузки с использованием анализа видоспецифичных участков генома методом количественной ПЦР, осуществляемой в реальном времени.All of the above suggests that the assessment of the effectiveness of leprosy therapy can be improved by calculating the change in bacterial load using the analysis of species-specific regions of the genome by quantitative PCR carried out in real time.

Наиболее очевидным способом оценки степени бактериального обсеменения путем ПЦР в реальном времени является проведение совместной амплификации (коамплификации) участка геномов патогена и генома носителя патогена. Однако, нами выявлен существенный недостаток системы коамплификации в случае предлагаемого изобретения. Недостаток заключается в том, что очень высокая концентрация ДНК носителя (человека или мыши) по отношению к ДНК патогена значительно влияет на параметры функции изменения концентрации в зависимости от величины порогового цикла (стандартной кривой), что приводит к получению некорректных данных о концентрациях ДНК носителя и патогена (Фиг. 1, Фиг. 2). Техническим решением данного вопроса нами предлагается одновременное осуществление реакций ПЦР в реальном времени, но с использованием отдельных реакционных объемов для ДНК носителя и ДНК патогена. При этом в обеих реакциях используется один и тот же препарат ДНК, полученный из биоптата, и содержащий в себе как геномы патогена, так и его носителя.The most obvious way to assess the degree of bacterial contamination by real-time PCR is to carry out joint amplification (co-amplification) of a portion of the pathogen genomes and the genome of the pathogen carrier. However, we have identified a significant drawback of the co-amplification system in the case of the present invention. The disadvantage is that a very high concentration of carrier (human or mouse) DNA in relation to pathogen DNA significantly affects the parameters of the concentration change function depending on the value of the threshold cycle (standard curve), which leads to incorrect data on the carrier DNA concentrations and pathogen (Fig. 1, Fig. 2). As a technical solution to this issue, we propose the simultaneous implementation of real-time PCR reactions, but using separate reaction volumes for carrier DNA and pathogen DNA. In this case, both reactions use the same DNA preparation obtained from a biopsy specimen and containing both the genomes of the pathogen and its carrier.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее: оценка эффективности химиотерапии лепры может осуществляться путем количественного анализа в тканях лабораторного животного или человека ДНК Mycobacterium leprae с осуществлением полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием видоспецифичных праймеров и гидролизующихся зондов при проведении одновременной амплификации видоспецифичного участка генома носителя и генома возбудителя заболевания. Последующий расчет отношения полученных значений пороговых циклов Ct, (либо соответствующих им результатов условного количества согласно калибровочной кривой) может быть представлен в виде коэффициэнта (К), на основании изменения которого в динамике лечения судят о снижении, стабилизации или росте бактериальной нагрузки.The essence of the proposed method, formulated at the level of functional generalization and underlying it, is the following: the assessment of the effectiveness of chemotherapy for leprosy can be carried out by quantitative analysis in the tissues of a laboratory animal or human DNA of Mycobacterium leprae with the implementation of a polymerase chain reaction in real time using species-specific primers and hydrolyzing probes during simultaneous amplification of a species-specific region of the carrier's genome and the genome of the causative agent of the disease. The subsequent calculation of the ratio of the obtained values of the threshold cycles Ct, (or the corresponding results of the conditional amount according to the calibration curve) can be presented in the form of a coefficient (K), on the basis of the change in which in the dynamics of treatment it is judged about a decrease, stabilization or increase in the bacterial load.

Коэффициент К рассчитывают исходя из отношения количества условных единиц генома патогена к количеству условных единиц генома хозяина в исследуемом объеме образца. Коэффициент К рассчитывают до начала терапии, а также в ходе ее осуществления и по окончании. При увеличении К в процессе терапии констатируется увеличение бактериальной нагрузки, при сохранении неизменным - стабилизация состояния, при снижении - уменьшение бактериальной нагрузки, что позволяет оценивать эффективность терапии лепры, обратно пропорциональную бактериальной нагрузке.Coefficient K is calculated based on the ratio of the number of conventional units of the pathogen genome to the number of conventional units of the host genome in the investigated sample volume. The K coefficient is calculated before the start of therapy, as well as during its implementation and at the end. With an increase in K during therapy, an increase in the bacterial load is noted, while maintaining unchanged - stabilization of the state, with a decrease - a decrease in the bacterial load, which makes it possible to evaluate the effectiveness of leprosy therapy, which is inversely proportional to the bacterial load.

Реализация заявляемого способа осуществляется следующими действиями:The implementation of the proposed method is carried out by the following actions:

1) Производится забор образцов биоптата кожи человека либо лапки мыши, из которых выделяется образец ДНК, содержащий как ДНК носителя, так и возможно, ДНК Mycobacterium leprae, например с использованием набора «Проба-НК» (ООО «НПО ДНК-технология», Россия) либо аналогов. Перед использованием набора образцы биоптата весом от 5 до 200 мг. гомогенизируют в 400 мкл. лизирующего буфера с использованием шаровой мельницы TissueLyser (QUIAGEN, Германия), после чего 100 мкл гомогената используют для выделения ДНК. Далее экстракцию ДНК проводят согласно инструкции производителя набора.1) Biopsy samples of human skin or mouse paws are taken, from which a DNA sample containing both carrier DNA and possibly Mycobacterium leprae DNA is extracted, for example, using the Proba-NK kit (NPO DNA-Technology LLC, Russia ) or analogs. Before using the kit, biopsy specimens weighing 5 to 200 mg. homogenized in 400 μl. lysis buffer using a TissueLyser ball mill (QUIAGEN, Germany), after which 100 μl of the homogenate is used for DNA isolation. Next, DNA extraction is carried out according to the instructions of the kit manufacturer.

2) Исследование методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводят с использованием прибора StepOne5 (Applied Biosystems, США) либо его аналогов в 0,1 мл пробирках фирмы Axygen (США) с использованием отдельных реакционных объемов для ДНК носителя и ДНК патогена. При этом в обеих реакциях используется один и тот же препарат ДНК, полученный из биоптата. Реакцию осуществляют в 20 мкл смеси, включающей 0,1 мкМ каждого праймера и ГЗ пробы в объеме 1 мкл; 5 мкл реакционной смеси для ПЦР из коммерчески доступного набора qPCRMix-HS фирмы ЗАО «Евроген» (Россия), а также деионизированную воду. Амплификацию проводят по программе, включающей плавление ДНК и активацию полимеразы в течение 5 минут и последующими 40 циклами, включающими гибридизацию праймеров при 60°С (с одновременной детекцией флуоресценции) в течение минуты и плавление реакционной смеси при 95°С в течение 15 секунд. Анализ проводят в присутствии отрицательного контроля, содержащего деионизированную воду вместо ДНК. Считывание флуоресценции проводится для ГЗ RLEP по каналу FAM, для ГЗ к генам АСТВ человека и В2М мыши - по каналу ROX. Для обнаружения генетического материала М. leprae и получения количественных данных используют оригинальные праймеры и гидролизующиеся зонды к некодирующему многокопийному элементу генома лепры RLEP, для количественной оценки генома человека - участок гена бета-актина человека (АСТВ), для количественной оценки генома мыши - участок гена В2-микроглобулина мыши (В2М). Последовательности праймеров и ГЗ приведены в Таблице 1.2) Research by real-time PCR (RT-PCR) is carried out using a StepOne5 device (Applied Biosystems, USA) or its analogs in 0.1 ml tubes from Axygen (USA) using separate reaction volumes for carrier DNA and pathogen DNA. In this case, both reactions use the same DNA preparation obtained from a biopsy. The reaction is carried out in 20 µl of a mixture containing 0.1 µM of each primer and GZ sample in a volume of 1 µl; 5 µl of a PCR reaction mixture from a commercially available qPCRMix-HS kit from ZAO Evrogen (Russia), as well as deionized water. Amplification is carried out according to a program that includes DNA melting and polymerase activation for 5 minutes and subsequent 40 cycles, including primer hybridization at 60 ° C (with simultaneous fluorescence detection) for a minute and melting the reaction mixture at 95 ° C for 15 seconds. The assay is performed in the presence of a negative control containing deionized water instead of DNA. The fluorescence reading is carried out for the RLEP GB via the FAM channel, for GBs to the human ASHB and mouse B2M genes - via the ROX channel. To detect the genetic material of M. leprae and obtain quantitative data, original primers and hydrolyzing probes are used to the non-coding multicopy element of the leprosy genome RLEP, for quantitative assessment of the human genome - a region of the human beta-actin gene (ASHB), for quantitative assessment of the mouse genome - a region of the B2 gene - mouse microglobulin (B2M). The sequences of primers and GS are shown in Table 1.

Результаты ПЦР-РВ представляются в виде значений порогового цикла Ct (момент начала интенсивного роста флуоресценции в результате разрушения гидролизующихся зондов) для анализируемых участков геномов лепры и человека или мыши.The results of RT-PCR are presented in the form of values of the threshold cycle Ct (the moment of the beginning of an intensive increase in fluorescence as a result of the destruction of hydrolyzing probes) for the analyzed regions of the genomes of leprosy and humans or mice.

3) Забор материала и проведение ПЦР-РВ осуществляется повторно по окончании терапии. Таким образом, получают результат в виде значений порогового цикла Ct₂ для анализируемых участков геномов лепры и человека или мыши после проведения терапии.3) Material sampling and RT-PCR are repeated at the end of therapy. Thus, the result is obtained in the form of values of the threshold cycle Ct ₂ for the analyzed regions of the genomes of leprosy and human or mouse after therapy.

4) Бактериальная нагрузка рассчитывается как соотношение Ct RLEP по отношению к Ct АСТВ человека или В2М мыши (либо соответствующих им результатов условного количества согласно калибровочной кривой) до начала (K1) и по окончании терапии (K2). Изменение данного коэффициэнта К в динамике лечения позволяет оценить происходящее снижение, стабилизацию или рост бактериальной нагрузки в ткани, иными словами позволяет оценить эффективность химиотерапии для лечения лепры.4) The bacterial load is calculated as the ratio of Ct RLEP relative to Ct ASHB of a human or B2M mouse (or the corresponding results of a conditional amount according to the calibration curve) before the start (K1) and at the end of therapy (K2). The change in this coefficient K in the dynamics of treatment makes it possible to assess the ongoing decrease, stabilization or increase in the bacterial load in the tissue, in other words, it allows to evaluate the effectiveness of chemotherapy for the treatment of leprosy.

Пример 1.Example 1.

В рамках выполнения научно-исследовательской работы Сергиево-Посадским филиалом ФГБУ «ГНЦДК» воспроизведена экспериментальная модель лепры, предложенная Shepard С.С. [5], осуществленная при интраплантарном заражении мышей суспензией, содержащей Mycobacterium leprae. Ограниченный рост Mycobacterium leprae наблюдали в подушечках лап обычных мышей, тогда как более выраженный их рост достигнут у мышей с подавленным иммунитетом, например атимичных голых мышей линии BALB/c Nude [15 - Карамова и др. Опыт экспериментального моделирования лепры на мышах линий BALB/C, BALB/C NUDE, СВА и C57BL/6TNF-/-. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2020, Т. 169. №6. С. 784-787]. В соответствие с разработанным протоколом на следующий день после заражения осуществлялась апробация схемы лечения: терапия РММ: рифампицин 10 мг/кг, моксофлоксацин 150 мг/кг, миноциклин 25 мг/кг. Препараты в виде крахмальной суспензии вводили 1 раз в сутки 5 дней в неделю. Анализ ПЦР-РВ некодирующего многокопийного элемента генома лепры RLEP и В2М генома мыши проводили в биоматериале «лапка мыши» на второй месяц после заражения, а также по истечении двух месяцев осуществления терапии по схеме РММ. Полученные в ходе ПЦР-РВ графики накопления флуоресцентного сигнала некодирующего многокопийного элемента генома лепры RLEP перед началом и по окончании терапии представлены в качестве примера на Фиг. 3. Оценка условной концентрации микобактерий осуществлялась по калибровочным графикам RLEP лепры и В2М мыши, представленным на Фиг. 4. В результате анализа показано снижение отношений значений порогового цикла Ct RLEP/Ct B2M, которое составило 1/7 до начала терапии, и 1/70 по окончании терапии. Полученный результат свидетельствует о снижении бактериальной нагрузки при проведении противолепрозной терапии РММ и является показателем высокой эффективности такой схемы.As part of the scientific research work, the Sergiev Posad branch of the State Research and Development Center of the Russian Federation has reproduced the experimental model of leprosy proposed by S.S. Shepard. [5], carried out with intraplantar infection of mice with a suspension containing Mycobacterium leprae. Limited growth of Mycobacterium leprae was observed in the paw pads of ordinary mice, while their more pronounced growth was achieved in mice with suppressed immunity, for example, athymic nude mice of the BALB / c Nude line [15 - Karamova et al. Experiment in experimental modeling of leprosy in BALB / C mice , BALB / C NUDE, CBA and C57BL / 6TNF - / -. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2020, T. 169. No. 6. S. 784-787]. In accordance with the developed protocol, the next day after infection, the treatment regimen was tested: PMM therapy: rifampicin 10 mg / kg, moxofloxacin 150 mg / kg, minocycline 25 mg / kg. The preparations in the form of a starch suspension were administered once a day, 5 days a week. The analysis of RT-PCR of a non-coding multicopy element of the leprosy genome RLEP and B2M of the mouse genome was carried out in the biomaterial “mouse paw” on the second month after infection, as well as after two months of therapy according to the PMM scheme. The graphs of the fluorescent signal accumulation of the non-coding multicopy element of the RLEP leprosy genome obtained in the course of RT-PCR before and at the end of therapy are shown as an example in FIG. 3. Evaluation of the conditional concentration of mycobacteria was carried out according to the calibration graphs of RLEP leprosy and B2M mouse, presented in Fig. 4. The analysis showed a decrease in the ratio of the threshold cycle values Ct RLEP / Ct B2M, which was 1/7 before the start of therapy, and 1/70 at the end of therapy. The obtained result indicates a decrease in the bacterial load during antileprotic therapy of PMM and is an indicator of the high efficiency of such a scheme.

Пример 2.Example 2.

Пациентка Р., 1967 г.р. находится на лечении в отделении клинической лепрологии Сергиево-Посадского филиала ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России с диагнозом «лепра многобактериальная, лепроматозная форма, активная стадия» с сентября 2017 г. С момента поступления получает комбинированную противолепрозную терапию в соответствии со Стандартом специализированной медицинской помощи при лепре, утвержденным приказом Минздрава России №1681н от 29.12.2012 (дапсон 100 мг/сутки ежедневно, рифампицин 600 мг/сутки 1 раз в месяц), адеметионин 400 мг по 2 таблетки в сутки 60 дней, актовегин 5 мл внутривенно ежедневно в течение двух недель. Через 3,5 года после начала лечения у пациентки развилось обострение лепрозного процесса по типу лепрозной узловатой эритемы [16 - Семенова и др., Узловатая эритема как лепрозная реакция. Вестник дерматологии и венерологии. 2020. Т. 96. №3. С. 68-74]. Забор биоматериала для анализа осуществлялся в 2018 и 2020 г, в т.ч. в виде кожного биоптата пораженного участка кожи правой ягодицы (вес биоптата около 100 мг). Анализ ПЦР-РВ некодирующего многокопийного элемента генома лепры RLEP и АСТВ генома человека проводили сразу после забора биоматериала и выделения ДНК. Полученные в ходе ПЦР-РВ графики накопления флуоресцентного сигнала некодирующего многокопийного элемента генома лепры RLEP перед началом и по окончании терапии представлены в качестве примера на Фиг. 5. Оценка условной концентрации микобактерий осуществлялась по калибровочным графикам RLEP лепры АСТВ генома человека, представленным на Фиг. 4. В результате анализа показана неизменность отношений значений порогового цикла Ct RLEP/Ct АСТВ, которое составило 0,55 до начала терапии, и 0,5 через два года проведения терапии. Полученный результат свидетельствует о сохранении бактериальной нагрузки на том же уровне при осуществлении противолепрозной терапии по схеме, утвержденной Стандартом специализированной медицинской помощи при лепре и является показателем эффективности такой схемы лишь в отношении стабилизации состояния пациента.Patient R., born in 1967 has been undergoing treatment at the Department of Clinical Leprology of the Sergiev Posad branch of the State Scientific Center for Dermatovenerology and Cosmetology of the Ministry of Health of Russia with a diagnosis of multibacterial leprosy, lepromatous form, active stage since September 2017. specialized medical care for leprosy, approved by order of the Ministry of Health of Russia No. 1681n dated December 29, 2012 (dapsone 100 mg / day daily, rifampicin 600 mg / day once a month), ademetionine 400 mg 2 tablets per day for 60 days, actovegin 5 ml intravenously daily for two weeks. 3.5 years after the start of treatment, the patient developed an exacerbation of the leprosy process like leprosy erythema nodosum [16 - Semenova et al., Erythema nodosum as a leprosy reaction. Bulletin of Dermatology and Venereology. 2020.Vol. 96.No. 3. S. 68-74]. The sampling of biomaterial for analysis was carried out in 2018 and 2020, incl. in the form of a skin biopsy of the affected area of the skin of the right buttock (biopsy weight about 100 mg). The analysis of RT-PCR of the non-coding multicopy element of the leprosy genome RLEP and ASHB of the human genome was carried out immediately after sampling the biomaterial and isolating DNA. The graphs of the fluorescent signal accumulation of the non-coding multicopy element of the RLEP leprosy genome obtained in the course of RT-PCR before and at the end of therapy are shown as an example in FIG. 5. Evaluation of the conditional concentration of mycobacteria was carried out according to the calibration plots of RLEP leprosy ASHV of the human genome, presented in Fig. 4. As a result of the analysis, the ratios of the values of the threshold cycle Ct RLEP / Ct ASHV remained unchanged, which was 0.55 before the start of therapy, and 0.5 after two years of therapy. The obtained result testifies to the preservation of the bacterial load at the same level during the implementation of antileprosy therapy according to the scheme approved by the Standard for specialized medical care for leprosy and is an indicator of the effectiveness of such a scheme only in relation to stabilization of the patient's condition.

Полученные результаты подтверждают, что предлагаемый способ оценки изменения бактериальной нагрузки с использованием амплификации видоспецифичных участков генома лепры, а также человека или мыши можно использовать для оценки эффективности антимикобактериального лечения у больных лепрой и модельных животных (лабораторных мышей).The results obtained confirm that the proposed method for assessing changes in bacterial load using amplification of species-specific regions of the genome of leprosy, as well as humans or mice, can be used to assess the effectiveness of antimycobacterial treatment in patients with leprosy and model animals (laboratory mice).

Краткое описание чертежей.Brief description of the drawings.

Фиг. 1. Графики накопления интенсивности флуоресцентного сигнала в зависимости от количества циклов амплификации при исследовании образца биоматериала инфицированного суспензией М. leprae лабораторного животного мышь (сверху вниз по столбцам: разведения от 1 до 1000, максимальная концентрация приведена сверху) А: коамплификация ACTB/RLEP; Б: коамплификация B2M/RLEP.FIG. 1. Graphs of the accumulation of the intensity of the fluorescent signal depending on the number of amplification cycles in the study of a biomaterial sample infected with M. leprae suspension of a laboratory animal mouse (from top to bottom columns: dilutions from 1 to 1000, the maximum concentration is shown above) A: co-amplification of ACTB / RLEP; B: B2M / RLEP co-amplification.

Фиг. 2. Калибровочный график коамплификации гена человека АСТВ и некодирующего повторяющегося элемента генома Mycobacterium leprae RLEP.FIG. 2. Calibration graph of co-amplification of the human ASHBV gene and the noncoding repeating element of the Mycobacterium leprae RLEP genome.

Фиг. 3. Пример проведения исследования образца биоматериала инфицированного суспензией M. leprae лабораторного животного (мыши линии BALB/NUDE); А. до начала терапии; Б. по окончании терапии по схеме РММ.FIG. 3. An example of a study of a biomaterial sample of a laboratory animal infected with M. leprae suspension (mice of the BALB / NUDE line); A. before starting therapy; B. at the end of therapy according to the PMM scheme.

Фиг. 4. Стандартные графики калибровки накопления флуоресцентного сигнала гидролизуемых зондов к генам мыши и человека АСТВ и В2М (разведения от 1000 до 1). А. калибровочный график амплификации гена человека АСТВ. Б. калибровочный график амплификации гена мыши В2М. В. калибровочный график амплификации некодирующего повторяющегося элемента генома Mycobacterium leprae RLEP.FIG. 4. Standard graphs for the calibration of the fluorescent signal accumulation of hydrolyzed probes to the mouse and human genes ASHB and B2M (dilutions from 1000 to 1). A. Calibration graph of human gene ASHB amplification. B. Calibration graph of the amplification of the mouse B2M gene. B. A calibration graph for the amplification of a non-coding repeat element of the Mycobacterium leprae RLEP genome.

Фиг. 5. Пример проведения исследования образца биоматериала пациента с диагнозом A30.5 Лепра. Лепроматозная форма; А. до начала терапии; Б. по окончании терапии по схеме РОМ.FIG. 5. An example of a study of a biomaterial sample of a patient with a diagnosis of A30.5 Lepra. Lepromatous form; A. before starting therapy; B. at the end of therapy according to the POM scheme.

Claims

A method for assessing the effectiveness of chemotherapy for leprosy by quantitative analysis in the tissues of a laboratory animal or human DNA of Mycobacterium leprae, characterized in that in real-time polymerase chain reaction using highly specific primers and hydrolyzing probes, parallel amplification of a species-specific region of the carrier gene selected from the beta-gene region is carried out human actin (ASHB) or a region of the gene B2-mouse microglobulin (B2M), and the variable region of the RLEP genome of the pathogen with the subsequent calculation of the ratio of the obtained values of the threshold cycles Ct, based on the change in which in the dynamics of treatment, a decrease, stabilization or increase in the bacterial load is judged, where with an increase in the ratio of the obtained values of threshold cycles Ct in the course of therapy, an increase in the bacterial load is ascertained; proportional to the bacterial load.