RU2757639C1 - Method for isolation of tumor cells from peripheral blood - Google Patents

Method for isolation of tumor cells from peripheral blood Download PDF

Info

Publication number
RU2757639C1
RU2757639C1 RU2021103540A RU2021103540A RU2757639C1 RU 2757639 C1 RU2757639 C1 RU 2757639C1 RU 2021103540 A RU2021103540 A RU 2021103540A RU 2021103540 A RU2021103540 A RU 2021103540A RU 2757639 C1 RU2757639 C1 RU 2757639C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
tumor cells
track membrane
cells
peripheral blood
membrane
Prior art date
Application number
RU2021103540A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Святослав Владимирович Зиновьев
Максим Андреевич Москвичев
Олег Владимирович Уткин
Ирина Александровна Круглова
Софья Алексеевна Кузнецова
Иван Валерьевич Гребенник
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью «ЭНЕРДЖИН»
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью «ЭНЕРДЖИН» filed Critical Общество с ограниченной ответственностью «ЭНЕРДЖИН»
Priority to RU2021103540A priority Critical patent/RU2757639C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2757639C1 publication Critical patent/RU2757639C1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16—Injection
    • G01N30/18—Injection using a septum or microsyringe
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Abstract

FIELD: biology.
SUBSTANCE: invention relates to the field of biology and medicine, and is intended for the isolation of tumor cells from peripheral blood. Peripheral blood is diluted with buffer and filtered through a track membrane with pores under reduced pressure, on which antibodies to the surface antigens of secreted tumor cells, epithelial adhesion molecule (EpCAM), are preliminarily immobilized. The track membrane with the tumor cells trapped on it is poured with a solution that preserves the cell structure, which is human or animal blood serum, dried by rotating the track membrane around the axis, and cytological examination of tumor cells is carried out directly on the track membrane.
EFFECT: invention provides an increase in the reliability of determining the pathological nature of tumor cells circulating in the peripheral blood, due to the preservation and improvement of the quality of the cytological picture of the cells retained by the track membrane.
2 cl, 5 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к области молекулярной/клеточной биологии и диагностической медицины, а именно к разработке способов выделения клеток определенного типа из биологических образцов и может быть использовано для диагностики онкологических заболеваний, пренатальной диагностики и др.The invention relates to the field of molecular / cell biology and diagnostic medicine, namely to the development of methods for isolating cells of a certain type from biological samples and can be used for the diagnosis of cancer, prenatal diagnosis, etc.

Задачи выделения малочисленных диагностически значимых клеток из периферической крови актуальны в различных областях медицины. В частности, разработка методов выделения и характеризации опухолевых клеток, отделившихся от основной опухоли и циркулирующих в периферической крови (так называемых циркулирующих клеток опухоли), является активно развивающейся областью науки и биотехнологии. Хотя происхождение метастазов и факторы, определяющие их развитие в том или другом органе, до конца не изучены, не вызывает сомнения, что циркулирующие опухолевые клетки играют основную роль в их образовании. В то время как обнаружение микрометастазов является дорогостоящим и ограничено по чувствительности возможностями существующих методов визуализации, анализ периферической крови для обнаружения циркулирующих клеток опухоли призван обнаружить предпосылки к метастазированию до фактического образования метастазов, а в силу своей малоинвазивности может проводиться так часто, как требуется. Поэтому, в случае достаточной чувствительности и специфичности, выделение и исследование циркулирующих клеток опухоли может быть в дальнейшем использовано для контроля прогресса и хода лечения онкологических заболеваний. Установление опухолевой принадлежности детектируемых клеток требует цитологического, а в ряде случаев иммуноцитохимического и генетического анализа обнаруженных клеток. Поэтому среди способов выделения циркулирующих опухолевых клеток из периферической крови наиболее пригодными для клинического применения являются те из них, которые позволяют проведение цитологического исследования выделенных клеток с целью подтверждения их опухолевой природы.The tasks of isolating small diagnostically significant cells from peripheral blood are relevant in various fields of medicine. In particular, the development of methods for the isolation and characterization of tumor cells separated from the main tumor and circulating in the peripheral blood (the so-called circulating tumor cells) is an actively developing area of science and biotechnology. Although the origin of metastases and the factors determining their development in one or another organ are not fully understood, there is no doubt that circulating tumor cells play a major role in their formation. While the detection of micrometastases is expensive and limited in sensitivity by the capabilities of existing imaging methods, the analysis of peripheral blood for the detection of circulating tumor cells is designed to detect the prerequisites for metastasis before the actual formation of metastases, and due to its minimally invasiveness, it can be performed as often as required. Therefore, in the case of sufficient sensitivity and specificity, the isolation and study of circulating tumor cells can be further used to monitor the progress and course of cancer treatment. Establishing the tumor identity of the detected cells requires a cytological and, in some cases, immunocytochemical and genetic analysis of the detected cells. Therefore, among the methods for isolating circulating tumor cells from peripheral blood, the most suitable for clinical use are those that allow carrying out a cytological study of the isolated cells in order to confirm their tumor nature.

Известен способ селективного выделения популяции жизнеспособных клеток из биологических жидкостей, защищенный патентом РФ № 2 423 698 C1, кл. G01N 33/48, G01N 33/53 , опубл 10.07.2011.The known method of selective isolation of a population of viable cells from biological fluids, protected by RF patent No. 2 423 698 C1, class. G01N 33/48, G01N 33/53, publ. 07/10/2011.

Для выделения популяции жизнеспособных клеток образец биологической жидкости помещают в ячейку микрофлюидного устройства, содержащую в качестве фильтрующего материала кремниевую микроканальную матрицу со сквозными отверстиями размером 3-30 мкм и длиной каналов 50-300 мкм, и пропускают ее через матрицу со скоростью 0,1-4 мл/мин. В случае разделения клеток по размеру, фракцию клеток, имеющих размер меньше, чем размер сквозных отверстий в матрице, собирают после прохождения микроканальной матрицы, а более крупные клетки элюируют с каналов микроканальной матрицы обратным током элюента. В случае рецептор-специфичного выделения клеток поверхность матрицы предварительно модифицируют антителами против специфических рецепторов клеток, а целевые клетки элюируют с каналов матрицы изотипическими иммуноглобулинами или гаптенами.To isolate a population of viable cells, a sample of biological fluid is placed in a cell of a microfluidic device containing a silicon microchannel matrix as a filtering material with through holes 3-30 μm in size and a channel length of 50-300 μm, and passed through the matrix at a rate of 0.1-4 ml / min. In the case of separation of cells by size, the fraction of cells having a size smaller than the size of the through holes in the matrix is collected after passing through the microchannel matrix, and larger cells are eluted from the channels of the microchannel matrix by a reverse flow of the eluent. In the case of receptor-specific isolation of cells, the surface of the matrix is pre-modified with antibodies against specific cell receptors, and the target cells are eluted from the channels of the matrix with isotypic immunoglobulins or haptens.

Недостатком известного способа является непрозрачность используемой кремниевой матрицы и, как следствие, невозможность цитологического исследования задержанных ей клеток.The disadvantage of this method is the opacity of the silicon matrix used and, as a consequence, the impossibility of cytological examination of the cells detained by it.

Известен способ обнаружения или выделения/получения циркулирующей опухолевой клетки, использующий метод пролиферации клеток, защищенный патентом РФ № 2 707 083 С1, кл. G01N 33/487, C12N 5/09, C12N 5/095, опубл. 03.03.2016. A known method of detecting or isolating / obtaining a circulating tumor cell using the method of cell proliferation, protected by RF patent No. 2 707 083 C1, class. G01N 33/487, C12N 5/09, C12N 5/095, publ. 03.03.2016.

В известном способе для выделения циркулирующих опухолевых клеток сначала производят выделение мононуклеарной фракции периферической крови, затем производят посев полученной фракции в луночный планшет, в который предварительно вводят культуральную среду для культивирования циркулирующих опухолевых клеток и инкубируют посеянные клетки. После инкубации культуральную среду удаляют и обнаруживают адгезивные опухолевые клетки, прикрепленные к лунке планшета. In the known method, for the isolation of circulating tumor cells, the mononuclear fraction of peripheral blood is first isolated, then the obtained fraction is inoculated into a well plate, into which the culture medium is preliminarily introduced for the cultivation of circulating tumor cells and the seeded cells are incubated. After incubation, the culture medium is removed and adherent tumor cells are found attached to the well of the plate.

Недостатком описанного способа является длительность проведения анализа.The disadvantage of the described method is the duration of the analysis.

Наиболее близким к заявляемому изобретению, выбранным в качестве прототипа, является способ осторожного отделения жизнеспособных спорадических клеток из жидкостей организма, таких как кровь, от злокачественных выпотов, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, жидкости перитонеального лаважа и околоплодных вод. описанный в WO 2014/198242 Al, опубл.2014.12.18. AlClosest to the claimed invention, selected as a prototype, is a method of carefully separating viable sporadic cells from body fluids such as blood from malignant effusions, bronchoalveolar lavage fluid, peritoneal lavage fluid and amniotic fluid. described in WO 2014/198242 Al, publ. 2014.12.18. Al

В способе используется фильтрующая мембрана, которая находится в тесном контакте с абсорбирующим материалом. Используя настоящий способ, можно изолировать, например, циркулирующие и диссеминированные опухолевые клетки, клетки эндометрия и циркулирующие клетки трофобласта, что дает возможность последующего обнаружения, количественной оценки, характеризации и культивирования указанных клеток.The method uses a filter membrane that is in close contact with an absorbent material. Using the present method, it is possible to isolate, for example, circulating and disseminated tumor cells, endometrial cells and circulating trophoblast cells, which allows subsequent detection, quantification, characterization and culturing of these cells.

Недостатком известного способа является недостаточная достоверность определения опухолевой принадлежности изолированных клеток, связанная с невозможностью их полноценного цитологического анализа непосредственно на трековой мембране, без их культивирования. The disadvantage of this method is the lack of reliability in determining the tumor belonging of isolated cells, associated with the impossibility of their full cytological analysis directly on the track membrane, without their cultivation.

Техническая проблема, решаемая предлагаемым изобретением, - создание эффективного способа выделения опухолевых клеток из периферической крови с помощью фильтрации.The technical problem solved by the proposed invention is the creation of an effective method for isolating tumor cells from peripheral blood using filtration.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении достоверности определения патологической природы опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови, за счет сохранности и повышения качества цитологической картины задерживаемых трековой мембраной клеток.The technical result from the use of the invention consists in increasing the reliability of determining the pathological nature of tumor cells circulating in the peripheral blood, due to the preservation and improvement of the quality of the cytological picture of the cells trapped by the track membrane.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе выделения опухолевых клеток из периферической крови, включающем разбавление буфером периферической крови и фильтрацию через трековую мембрану с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, фильтрацию осуществляют из разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками заливают раствором, сохраняющим структуру клеток, таким как сыворотка крови человека или животных, высушивают путем вращения трековой мембраны вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности и проводят цитологическое исследование опухолевых клеток непосредственно на трековой мембране .The specified technical result is achieved by the fact that in the method of isolating tumor cells from peripheral blood, including dilution with a buffer of peripheral blood and filtration through a track membrane with pores with a diameter smaller than the diameter of the cells to be isolated, filtration is carried out from diluted peripheral blood into a buffer under reduced pressure, the membrane with tumor cells trapped on it is poured with a solution that preserves the cell structure, such as human or animal blood serum, dried by rotating the track membrane around an axis perpendicular to its surface, and cytological examination of tumor cells is carried out directly on the track membrane.

В качестве раствора, сохраняющего структуру клеток, используют фетальную телячью сыворотку.Fetal calf serum is used as a solution that preserves the cell structure.

Предварительно на трековой мембране могут быть иммобилизованы антитела к поверхностным антигенам выделяемых опухолевых клеток, отсутствующим на поверхности нормальных клеток крови, например, к эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM).Preliminarily, antibodies against the surface antigens of secreted tumor cells that are absent on the surface of normal blood cells, for example, epithelial adhesion molecule (EpCAM), can be immobilized on the track membrane.

Изобретение поясняется клиническими примерами и иллюстрациями.The invention is illustrated by clinical examples and illustrations.

На фиг. 1 изображена фильтр-кассета, общий вид FIG. 1 shows a filter cassette, general view

На фиг. 2 – цитологическая картина к примеру 2 задержанных трековой мембраной клеток, когда до фильтрации фильтр-кассету не заполняют фосфатным буфером;FIG. 2 - cytological picture, for example, of 2 cells retained by the track membrane, when the filter cassette is not filled with phosphate buffer before filtration;

На фиг. 3 – цитологическая картина к примеру 3 задержанных трековой мембраной клеток, когда после окончания фильтрации трековую мембрану высушивают на воздухе и окрашивают по Паппенгейму, FIG. 3 - a cytological picture, for example, of 3 cells retained by the track membrane, when, after the end of filtration, the track membrane is dried in air and stained according to Pappenheim,

На фиг. 4 - цитологическая картина к примеру 1 задержанных трековой мембраной клеток, когда фильтрацию осуществляют предлагаемым способом. FIG. 4 is a cytological picture for example 1 of cells retained by the track membrane when filtration is carried out by the proposed method.

Фиг. 5 - цитологическая картина к примеру 4 задержанных трековой мембраной циркулирующих опухолевых клеток пациента с плоскоклеточной карциномой слизистой оболочки полости рта.FIG. 5 is a cytological picture, for example 4 of circulating tumor cells retained by the track membrane of a patient with squamous cell carcinoma of the oral mucosa.

Фильтр-кассета (фиг. 1) состоит из верхней части 1, содержащей трубку для загрузки образца периферической крови 2, расположенной между двумя кольцевыми силиконовыми прокладками 3 трековой мембраны 4 с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, и нижней части 5, содержащей трубку 6 для подключения к шприцевому насосу 7. Винты 8 и гайки 9 служат для скрепления обеих половин 1 и 5 фильтр-кассеты между собой. В шприцевом насосе 7 установлен шприц 10.The filter cassette (Fig. 1) consists of an upper part 1 containing a tube for loading a sample of peripheral blood 2, located between two annular silicone gaskets 3 of the track membrane 4 with pores with a diameter smaller than the diameter of the secreted cells, and the lower part 5 containing the tube 6 for connection to a syringe pump 7. Screws 8 and nuts 9 are used to fasten both halves 1 and 5 of the filter cassette to each other. A syringe 10 is installed in the syringe pump 7.

Способ выделения опухолевых клеток из периферической крови осуществляют следующим образом.The method for isolating tumor cells from peripheral blood is as follows.

Трековую мембрану 4 с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, например, трековую мембрану в виде диска диаметром 25 мм из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 105/см2 производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, вкладывают между двумя кольцевыми прокладками 3, например, кольцами из пищевого силикона толщиной 1 мм с внешним диаметром 25 мм и внутренним диаметром 16 мм. Кольцевые прокладки 3 с трековой мембраной 4 между ними вкладывают между верхней частью 1 фильтр-кассеты и нижней частью 5 фильтр-кассеты и скрепляют с помощью винтов 8 и гаек 9. Track membrane 4 with pores with a diameter smaller than the diameter of the secreted cells, for example, a track membrane in the form of a disk 25 mm in diameter made of polyethylene terephthalate with a thickness of 18 μm with pores with a diameter of 7 ± 0.4 μm and a pore density of 10 5 / cm 2 manufactured by the Laboratory of Nuclear Reactions, JINR , Dubna, put between two O-rings 3, for example, food-grade silicone rings with a thickness of 1 mm with an outer diameter of 25 mm and an inner diameter of 16 mm. Ring gaskets 3 with a track membrane 4 between them are inserted between the upper part 1 of the filter cassette and the lower part 5 of the filter cassette and fastened with screws 8 and nuts 9.

Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7, например SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., со шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца в верхней части 1 фильтр-кассеты образец периферической крови пациента, разбавленной в 2 – 2,5 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4. Начинают фильтрацию разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, созданном за счет включения шприцевого насоса 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной периферической крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 50-100 мкл раствора, сохраняющего структуру клеток, таким как сыворотка крови человека или животных (например, фетальная телячья сыворотка, Sigma-Aldrich, USA). Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки раствора, сохраняющего структуру клеток, кладут мембрану 4 клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения мембраны на предметном стекле вокруг оси, перпендикулярной его поверхности со скоростью 4000-6000 об/мин с помощью специальной центрифуги, например Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования, которое проводят непосредственно на трековой мембране 4.Then, using a silicone tube 6, connect the lower part 5 of the filter cassette to a syringe pump 7, for example SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., with a syringe 10 filled with phosphate buffer pH 7.2-7.4, and turning on the syringe pump 7 for infusion in the direction from the syringe 10, fill the filter cassette with buffer. After that, a sample of the patient's peripheral blood diluted 2 to 2.5 times with phosphate buffer pH 7.2-7.4 is poured into the tube 2 for loading the sample in the upper part 1 of the filter cassette. Start filtration of the peripheral blood diluted with buffer into the buffer under reduced pressure created by turning the syringe pump 7 into the infusion mode towards the syringe 10 at a rate of no more than 0.5 ml / min. After all the diluted peripheral blood has passed through the track membrane 4, the filter cassette is disassembled, the track membrane 4 with the tumor cells trapped on it is removed and 50-100 μL of a solution that preserves the cell structure is poured into it, such as human or animal blood serum (for example, fetal calf serum, Sigma-Aldrich, USA). Then, the excess solution that preserves the structure of the cells is poured from the track membrane 4, the membrane is placed 4 cells up on a glass slide, and it is dried by rotating the membrane on the slide around an axis perpendicular to its surface at a speed of 4000-6000 rpm using a special centrifuge, e.g. Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. After drying, the track membrane 4 on glass is stained according to Pappenheim for cytological examination, which is carried out directly on the track membrane 4.

Использование буфера с рН 7.2-7.4 объясняется тем, что данный диапазон рН является физиологическим для плазмы крови, при другом рН возможно изменение объема или повреждение клеток. При разбавлении периферической крови перед фильтрацией менее, чем в два раза, могут забиваться поры трековой мембраны 4 вследствие слишком высокой концентрации клеток в образце. Разбавление более, чем в два раза, возможно, но большее, чем в 2,5 раза, разбавление приводит к увеличению общего объема фильтруемого образца и, как результат, к увеличению времени фильтрации. The use of a buffer with a pH of 7.2-7.4 is explained by the fact that this pH range is physiological for blood plasma; at a different pH, a change in the volume or damage to cells is possible. When the peripheral blood is diluted less than twice before filtration, the pores of the track membrane 4 may become clogged due to an excessively high concentration of cells in the sample. Dilution more than twice, possibly, but more than 2.5 times, dilution leads to an increase in the total volume of the filtered sample and, as a result, to an increase in filtration time.

Давление, создаваемое в буфере под трековой мембраной, определяется скоростью откачки жидкости и параметрами системы, например, диаметром трубок.The pressure created in the buffer under the track membrane is determined by the pumping rate and system parameters, for example, the diameter of the tubes.

Максимальная рекомендуемая скорость откачки 0.5 мл/мин выбрана как приблизительно в 10 раз меньшая, чем скорость фильтрации в той же фильтр-кассете, если не подключать шприцевой насос 7, и трубка 6, присоединенная к нижней части 5 фильтр-кассеты, будет открытой снизу. Поскольку фильтрация эритроцитов и лейкоцитов через трековую мембрану 4 сопряжена с значительной обратимой деформацией клеток, увеличение скорости фильтрации выше определенного порога может приводить к повреждению фильтруемых клеток за счет создания высокой концентрации клеток и повышенного давления в области непосредственно над мембраной. Фильтрация со скоростью меньшей, чем 0.5 мл/мин, не влияет на результаты, но увеличивает общее время фильтрации. The maximum recommended pumping rate of 0.5 ml / min is selected as approximately 10 times lower than the filtration rate in the same filter cassette, if the syringe pump 7 is not connected, and the tube 6, connected to the bottom 5 of the filter cassette, will be open at the bottom. Since the filtration of erythrocytes and leukocytes through the track membrane 4 is associated with significant reversible deformation of cells, an increase in the filtration rate above a certain threshold can damage the filtered cells by creating a high concentration of cells and increased pressure in the area immediately above the membrane. Filtration at a rate less than 0.5 ml / min does not affect the results, but increases the overall filtration time.

Пример 1Example 1

Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 по предлагаемому способу.Isolation of tumor cells from a mixture of normal peripheral blood and breast cancer cell line MCF7 according to the proposed method.

На трековой мембране 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 105/см2 производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, иммобилизуют антитела к поверхностному антигену выделяемых опухолевых клеток, эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM), отсутствующему на поверхности нормальных клеток крови. On track membrane 4 made of polyethylene terephthalate with a thickness of 18 microns with pores with a diameter of 7 ± 0.4 microns and a pore density of 10 5 / cm 2 produced by the Laboratory of Nuclear Reactions, Dubna, antibodies to the surface antigen of secreted tumor cells, epithelial adhesion molecule (EpCAM ), which is absent on the surface of normal blood cells.

Для этого трековую мембрану обрабатывают кислородной плазмой (Harrick plasma PDC-002-CE, давление кислорода в камере - 400 mTorr, режим “HIGH” (частота 12 МГц)) в течении 3 минут. Затем заливают обработанную плазмой трековую мембрану 4 раствором антител к EpCAM в концентрации 50 мкг/мл в фосфатном буфере рН 7.2-7.4. Залитую раствором антител трековую мембрану 4 помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 10-14 часов при +4 0С, затем отмывают 3 раза пятикратным объемом фосфатного буфера рН 7.2-7.4 и высушивают. For this, the track membrane is treated with oxygen plasma (Harrick plasma PDC-002-CE, oxygen pressure in the chamber - 400 mTorr, “HIGH” mode (frequency 12 MHz)) for 3 minutes. Then the plasma-treated track membrane 4 is poured with a solution of antibodies to EpCAM at a concentration of 50 μg / ml in phosphate buffer pH 7.2-7.4. The track membrane 4 flooded with the antibody solution is placed in a humid chamber and incubated for 10-14 hours at +4 0 C, then washed 3 times with a five-fold volume of phosphate buffer pH 7.2-7.4 and dried.

Клеточную линию MCF7 культивируют при температуре 37 0С при 5% СО2 в среде DMEM с GlutaMAX-1, Gibco, USA, с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA, и раствора пенициллина-стрептомицина, BioWest, USA. Клетки отделяют от стенок культивационных флаконов с использованием раствора TrypLE, Gibco, USA, и определяют их концентрацию с помощью камеры Горяева. Венозную кровь здорового донора, взятую на К3ЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема.The MCF7 cell line was cultured at 37 ° C at 5% CO 2 in DMEM with GlutaMAX-1, Gibco, USA, supplemented with 10% fetal bovine serum, Sigma-Aldrich, USA, and penicillin-streptomycin solution, BioWest, USA. The cells are separated from the walls of the cultivation flasks using TrypLE solution, Gibco, USA, and their concentration is determined using a Goryaev chamber. Venous blood of a healthy donor, taken on K 3 EDTA as an anticoagulant, is diluted 2 times with phosphate buffer pH 7.2-7.4, and a cell suspension of the MCF7 cell line is added at the rate of 100 cells per 1 ml of final volume.

Сборку фильтр-кассеты (фиг. 1) осуществляют следующим образом. Модифицированную трековую мембрану 4 вкладывают между двумя кольцевыми прокладками 3. Кольцевые прокладки 3 и трековую мембрану 4 помещают между верхней частью 1 и нижней частью 5 фильтр-кассеты и скрепляют обе части фильтр-кассеты с помощью винтов 8 и гаек 9. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., со шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4. После этого, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной периферической крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA. The assembly of the filter cassette (Fig. 1) is carried out as follows. The modified track membrane 4 is inserted between two O-rings 3. The O-rings 3 and the track membrane 4 are placed between the upper part 1 and the lower part 5 of the filter cassette and fasten both parts of the filter cassette with screws 8 and nuts 9. Then, using a silicone tube 6 connect the lower part 5 of the filter cassette to a syringe pump 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., with a syringe 10 filled with phosphate buffer pH 7.2-7.4. After that, turning on the syringe pump 7 for infusion in the direction from the syringe 10, fill the filter cassette with a buffer. After that, the previously prepared mixture of diluted blood of a healthy donor with the MCF7 cell line is poured into the tube 2 for loading the sample. Filtration is started by turning on the syringe pump 7 in the infusion mode towards the syringe 10 at a rate of no more than 0.5 ml / min. After all the diluted peripheral blood has passed through the track membrane 4, the filter cassette is disassembled, the track membrane with the tumor cells trapped on it is removed, and 100 μl of fetal calf serum is poured into it, Sigma-Aldrich, USA.

Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат проведения описанной процедуры представлен на фиг. 4. На фиг. 4 можно видеть мономорфную популяцию эпителиальных клеток с частично вакуолизированной цитоплазмой, ядрами округлой формы с одним или несколькими ядрышками, полностью соответствующую виду клеточной линии MCF7 в стандартных цитологических препаратах. Then, the excess fetal calf serum is drained from the track membrane 4, the membrane is placed with cells up on a glass slide, and it is dried by rotating around an axis perpendicular to its surface at a speed of 5000 rpm using a Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. After drying, the track membrane 4 on glass is stained according to Pappenheim for cytological examination of cells directly on the track membrane. A typical result of the described procedure is shown in FIG. 4. In FIG. 4, one can see a monomorphic population of epithelial cells with partially vacuolated cytoplasm, rounded nuclei with one or more nucleoli, completely corresponding to the type of the MCF7 cell line in standard cytological preparations.

Пример 2. Example 2.

Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 с фильтрацией из жидкой фазы в воздушную Isolation of tumor cells from a mixture of normal peripheral blood and MCF7 breast cancer cell line with filtration from the liquid phase to the air

Модификацию трековой мембраны 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 105/см2 производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, осуществляют аналогично примеру 1. Клеточную линию MCF7 культивируют аналогично примеру 1. Венозную кровь здорового донора, взятую на К3ЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема. Фильтр-кассету (фиг. 1) собирают аналогично примеру 1. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., с шприцем 10. Заливают в трубку 2 для загрузки образца приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей фильтруемой клеточной смеси через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA. Затем сливают с трековой мембраны излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат проведения описанной процедуры представлен на фиг. 3. На фиг. 3 можно видеть голое ядро клетки (внизу) и безъядерный фрагмент цитоплазмы (в центре), что свидетельствует о повреждении клеток в процессе фильтрации по данному протоколу.The modification of the track membrane 4 made of polyethylene terephthalate with a thickness of 18 μm with pores with a diameter of 7 ± 0.4 μm and a pore density of 10 5 / cm 2 produced by the Laboratory of Nuclear Reactions of JINR, Dubna, is carried out analogously to example 1. The MCF7 cell line is cultivated analogously to example 1. Venous blood of a healthy donor, taken on K 3 EDTA as an anticoagulant, is diluted 2 times with phosphate buffer pH 7.2-7.4, and a cell suspension of the MCF7 cell line is added at the rate of 100 cells per 1 ml of final volume. The filter cassette (Fig. 1) is assembled analogously to example 1. Then, using a silicone tube 6, the lower part of the filter cassette is connected to a syringe pump 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., with a syringe 10. Poured into a tube 2 for loading a previously prepared mixture of diluted blood from a healthy donor with the MCF7 cell line. Filtration is started by turning on the syringe pump 7 in the infusion mode towards the syringe 10 at a rate of no more than 0.5 ml / min. After passing the entire filtered cell mixture through the track membrane 4, the filter cassette is disassembled, the track membrane with the tumor cells trapped on it is removed, and 100 μl of fetal calf serum is poured into it, Sigma-Aldrich, USA. Then, excess fetal calf serum is decanted from the track membrane, the membrane is placed cells upwards on a glass slide, and it is dried by rotating around an axis perpendicular to its surface at 5000 rpm using a Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. After drying, the track membrane 4 on glass is stained according to Pappenheim for cytological examination of cells directly on the track membrane. A typical result of the described procedure is shown in FIG. 3. In FIG. 3, one can see the naked nucleus of the cell (bottom) and the nuclear-free fragment of the cytoplasm (center), which indicates cell damage during the filtration process according to this protocol.

Пример 3.Example 3.

Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 без последующей сушки в цитоцентрифуге.Isolation of tumor cells from a mixture of normal peripheral blood and MCF7 breast cancer cell line without subsequent drying in a cytocentrifuge.

Модификацию трековой мембраны 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 105/см2 производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, осуществляют аналогично примеру 1. Клеточную линию MCF7 культивируют аналогично примеру 1. Венозную кровь здорового донора, взятую на К3ЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема. Фильтр-кассету (фиг. 1) собирают аналогично примеру 1. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., с шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4. После этого, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию в буфер при пониженном давлении, созданном за счет включения шприцевого насоса 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей фильтруемой клеточной смеси через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками, помещают на предметное стекло и высушивают на воздухе при комнатной температуре. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат проведения описанной процедуры представлен на фиг. 4. На фиг. 4 видна полностью разрушенная клетка (внизу), а также клетки с частично отсутствующей цитоплазмой и разрыхленной структурой хроматина ядра (в центре).The modification of the track membrane 4 made of polyethylene terephthalate with a thickness of 18 μm with pores with a diameter of 7 ± 0.4 μm and a pore density of 10 5 / cm 2 produced by the Laboratory of Nuclear Reactions of JINR, Dubna, is carried out analogously to example 1. The MCF7 cell line is cultivated analogously to example 1. Venous blood of a healthy donor, taken on K 3 EDTA as an anticoagulant, is diluted 2 times with phosphate buffer pH 7.2-7.4, and a cell suspension of the MCF7 cell line is added at the rate of 100 cells per 1 ml of final volume. The filter cassette (Fig. 1) is assembled analogously to example 1. Then, using a silicone tube 6, the lower part 5 of the filter cassette is connected to a syringe pump 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., with a syringe 10 filled with phosphate buffer pH 7.2. -7.4. After that, turning on the syringe pump 7 for infusion in the direction from the syringe 10, fill the filter cassette with a buffer. After that, the previously prepared mixture of diluted blood of a healthy donor with the MCF7 cell line is poured into the tube 2 for loading the sample. Start filtration into a buffer under reduced pressure created by turning the syringe pump 7 into the infusion mode towards the syringe 10 at a rate of no more than 0.5 ml / min. After passing all the filtered cell mixture through the track membrane 4, the filter cassette is disassembled, the track membrane 4 with the tumor cells trapped on it is removed, placed on a glass slide and dried in air at room temperature. After drying, the track membrane 4 on glass is stained according to Pappenheim for cytological examination of cells directly on the track membrane. A typical result of the described procedure is shown in FIG. 4. In FIG. 4, a completely destroyed cell is visible (below), as well as cells with a partially absent cytoplasm and a loosened structure of nuclear chromatin (in the center).

Сравнение цитологической картины клеток линии MCF7 на фиг. 2 (после фильтрации по предлагаемому способу) с результатами неполного протокола (фиг. 3-4) показывает, что проведение фильтрации из разбавленной фосфатным буфером периферической крови в фосфатный буфер, заливка трековой мембраны с задержанными на ней опухолевыми клетками фетальной телячьей сывороткой с последующим высушиванием путем вращения трековой мембраны вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности, уменьшает количество поврежденных опухолевых клеток и приближает их цитологическую картину к виду соответствующих клеток в стандартных цитологических препаратах.Comparison of the cytological picture of MCF7 cells in FIG. 2 (after filtration according to the proposed method) with the results of an incomplete protocol (Fig. 3-4) shows that filtration from peripheral blood diluted with phosphate buffer into phosphate buffer, filling the track membrane with tumor cells trapped on it with fetal calf serum, followed by drying by rotation of the track membrane around an axis perpendicular to its surface reduces the number of damaged tumor cells and brings their cytological picture closer to the appearance of the corresponding cells in standard cytological preparations.

Пример 4.Example 4.

Выделение циркулирующих опухолевых клеток из периферической крови пациента с плоскоклеточной карциномой слизистой оболочки полости рта.Isolation of circulating tumor cells from the peripheral blood of a patient with squamous cell carcinoma of the oral mucosa.

Сборку фильтр-кассеты (фиг. 1) осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что в качестве трековой мембраны 4 используют трековую мембрану iPORE из поликарбоната толщиной 19 мкм с порами диаметром 7±0,5 мкм и плотностью пор 2•104/см2 производства it4ip S.A., Belgium. После сборки фильтр-кассеты и подключению ее к шприцевому насосу 7, заполняют фильтр-кассету буфером, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10. The assembly of the filter cassette (Fig. 1) is carried out analogously to example 1, except that the track membrane iPORE made of polycarbonate with a thickness of 19 μm with pores with a diameter of 7 ± 0.5 μm and a pore density of 2 × 10 4 / cm is used as the track membrane 4 2 manufactured by it4ip SA, Belgium. After assembling the filter cassette and connecting it to the syringe pump 7, fill the filter cassette with a buffer, turning on the syringe pump 7 for infusion in the direction from the syringe 10.

После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца кровь пациента c раком слизистой оболочки дна полости рта справа T4aN2aM0 стадия IV, разбавленную в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4. Начинают фильтрацию разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA. Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования. Цитологическая картина задержанных трековой мембраной клеток, полученная непосредственно на мембране, представленная на фиг. 5, полностью соответствует цитологической картине плоскоклеточной карциномы в стандартных цитологических препаратах. Сохранность клеток на фиг. 5 и отсутствия среди них артефактов, представленных на фиг. 3-4 к примерам 2 и 3, позволяет с высокой степенью уверенности отнести представленные на фиг. 5 клетки к плоскому эпителию и сделать вывод об их патологической природе. After that, the blood of a patient with cancer of the mucous membrane of the bottom of the mouth on the right T4aN2aM0 stage IV, diluted 2 times with phosphate buffer pH 7.2-7.4, is poured into the tube 2 for loading the sample. Start filtration of the peripheral blood diluted with buffer into the buffer under reduced pressure by turning on the syringe pump 7 in the infusion mode towards the syringe 10 at a rate of no more than 0.5 ml / min. After all the diluted blood has passed through the track membrane 4, the filter cassette is disassembled, the track membrane 4 with the tumor cells trapped on it is removed, and 100 μl of fetal calf serum is poured into it, Sigma-Aldrich, USA. Then, the excess fetal calf serum is drained from the track membrane 4, the membrane is placed with cells up on a glass slide, and it is dried by rotating around an axis perpendicular to its surface at a speed of 5000 rpm using a Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. After drying, the track membrane 4 on the glass is stained according to Pappenheim for cytological examination. The cytological picture of cells trapped by the track membrane, obtained directly on the membrane, is shown in Fig. 5, fully corresponds to the cytological picture of squamous cell carcinoma in standard cytological preparations. The cell safety in FIG. 5 and the absence of the artifacts shown in FIG. 3-4 to Examples 2 and 3, makes it possible to relate with a high degree of confidence the values shown in Figs. 5 cells to squamous epithelium and draw a conclusion about their pathological nature.

Таким образом, предлагаемый способ выделения опухолевых клеток из периферической крови является более достоверным за счет сохранности и повышения качества цитологической картины задерживаемых трековой мембраной клеток, что позволяет цитологу надежно определять опухолевое происхождение задержанных клеток.Thus, the proposed method for isolating tumor cells from peripheral blood is more reliable due to the preservation and improvement of the quality of the cytological picture of the cells trapped by the track membrane, which allows the cytologist to reliably determine the tumor origin of the trapped cells.

Claims (2)

1. Способ выделения опухолевых клеток из периферической крови, характеризующийся тем, что периферическую кровь разбавляют буфером и фильтруют через трековую мембрану с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, при пониженном давлении, на которой предварительно иммобилизуют антитела к поверхностным антигенам выделяемых опухолевых клеток, эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM), трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками заливают раствором, сохраняющим структуру клеток, представляющим собой сыворотку крови человека или животных, высушивают путем вращения трековой мембраны вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности, и проводят цитологическое исследование опухолевых клеток непосредственно на трековой мембране. 1. A method of isolating tumor cells from peripheral blood, characterized in that the peripheral blood is diluted with a buffer and filtered through a track membrane with pores with a diameter smaller than the diameter of the secreted cells, under reduced pressure, on which antibodies to the surface antigens of the secreted tumor cells, epithelial adhesion molecule (EpCAM), the track membrane with trapped tumor cells is poured with a solution that preserves the cell structure, which is human or animal blood serum, dried by rotating the track membrane around an axis perpendicular to its surface, and cytological examination of tumor cells is carried out directly on the track membrane. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сыворотки крови человека или животных используют фетальную телячью сыворотку.2. The method according to claim 1, characterized in that fetal bovine serum is used as human or animal blood serum.
RU2021103540A 2021-02-12 2021-02-12 Method for isolation of tumor cells from peripheral blood RU2757639C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021103540A RU2757639C1 (en) 2021-02-12 2021-02-12 Method for isolation of tumor cells from peripheral blood

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021103540A RU2757639C1 (en) 2021-02-12 2021-02-12 Method for isolation of tumor cells from peripheral blood

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2757639C1 true RU2757639C1 (en) 2021-10-19

Family

ID=78286444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021103540A RU2757639C1 (en) 2021-02-12 2021-02-12 Method for isolation of tumor cells from peripheral blood

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2757639C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014198242A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Metacell, S.R.O. Method for separation of sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said method
RU2539989C2 (en) * 2009-12-23 2015-01-27 Сайтовера, Инк. System and method for particle filtration

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2539989C2 (en) * 2009-12-23 2015-01-27 Сайтовера, Инк. System and method for particle filtration
WO2014198242A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Metacell, S.R.O. Method for separation of sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said method

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADAMS D.L. et al. The systematic study of circulating tumor cell isolation using lithographic microfilters. RSC Adv. 2014; 9: 4334-4342. *
I. V. Grebennik and others. Development of a filtering device and method for the isolation and cytological analysis of circulating tumor cells. Abstracts. VI St. Petersburg International Oncological Forum "White Nights 2020", June 25-28, p.86. *
ГРЕБЕННИК И.В. и др. Разработка фильтрующего устройства и метода для выделения и цитологического анализа циркулирующих опухолевых клеток. Тезисы. VI Петербургский международный онкологический форум "Белые ночи 2020", 25-28 июня, с.86. ADAMS D.L. et al. The systematic study of circulating tumor cell isolation using lithographic microfilters. RSC Adv. 2014; 9: 4334-4342. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017340293B2 (en) Apparatus for high-throughput rapid trapping of circulating tumor cells and method for purifying circulating tumor cells
CN102892900B (en) Method for separating target cell
EP3008162B1 (en) Method for separation of sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said method
US5648222A (en) Method for preserving cells, and uses of said method
US20090186341A1 (en) Receptacle for the Separation of Tumor Cells
JP2008538509A (en) Use of parylene membrane filter
NO180658B (en) Method and Device for Detecting Specific Target Cells in Specialized or Mixed Cell Populations and Solutions Containing Mixed Cell Populations
JP2002536635A (en) Method for enriching or removing tumor cells from body fluids and kits suitable for such purpose
CN106970225B (en) A kind of kit and its application for combining 8 probe identification circulating tumor cells of CEP using CD45 immunofluorescences
RU2757639C1 (en) Method for isolation of tumor cells from peripheral blood
CN111562377A (en) Kit and method for detecting expression of peripheral blood circulating tumor cells CA199 of pancreatic cancer patient
CN116273233A (en) Microfluidic chip for capturing circulating tumor cells and preparation method thereof
CN111575239A (en) Method and device for enriching circulating tumor cells
JP6173577B1 (en) Method for detection / separation acquisition of circulating tumor cells using cell proliferation method
CN212560306U (en) Enrichment device of circulating tumor cells
KR101992604B1 (en) A method for screening prostate cancer subjects based on prostate-specific membrane antigen
CN111521789A (en) Immunofluorescence kit and detection method for detecting expression of peripheral blood circulating tumor cells CA199 of pancreatic cancer patient
CN219836527U (en) Microfluidic chip for capturing circulating tumor cells