RU2756764C1

RU2756764C1 - Method for determining the functional activity of the human complement system for predicting the severity of the course of a systemic inflammatory reaction

Info

Publication number: RU2756764C1
Application number: RU2021116711A
Authority: RU
Inventors: Батожаб Батожаргалович Шойбонов; Оксана Михайловна Драпкина; Татьяна Павловна Баронец; Лиана Резовна Дзодзуашвили; Чимит Батожабовна Раднаева; Софья Олеговна Елиашевич; Михаил Юрьевич Карганов; Ирина Борисовна Алчинова; Марина Сергеевна Деморжи; Наталия Васильевна Терешкина; Диана Викторовна Григорьева; Саид Ибрагимович Каба; Светлана Михайловна Толпыго
Priority date: 2021-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2021-10-05

Abstract

FIELD: diagnostics.

SUBSTANCE: invention relates to diagnostics, namely to a method for determining the functional activity of the classical pathway of the human complement system for predicting the severity of the course of the systemic inflammatory response. A method for determining the functional activity of the classical pathway of the human complement system for predicting the severity of the course of a systemic inflammatory reaction includes carrying out a lysis reaction of human erythrocytes of group A of the AB0 system (E(A)), sensitized with anti-A monoclonal IgM antibodies (E(A)mAb) and serum under conditions of veronal saline buffer (VBS²⁺), incubation of the obtained sample, then the reaction of complement-dependent lysis of E(A)mAb is evaluated turbidimetrically, by reducing the optical density of the suspension E(A)mAb at a wavelength of 620 nm determines the degree of erythrocyte lysis in experimental samples according to the calibration graph, where the control E(A)mAb represents 0% lysis, and the control of complete lysis E(A)mAb is 100% lysis, under certain conditions, while the increased functional activity of the classical pathway of the human complement system is noted with a degree of lysis of more than 60%, with a degree lysis from 31% to 59% as normal and with a degree of lysis less than 30% as reduced functional activity of the human complement system.

EFFECT: above-described method allows increasing the accuracy of the method for studying the functional activity of the classical pathway of the complement system, as well as to simplify the registration of the results of the analysis of the functional activity of the classical pathway of the complement system in routine studies and adaptation of the method for screening studies in the conditions of clinical diagnostic laboratories.

1 cl, 5 dwg, 2 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может быть использовано для прогноза тяжести системной воспалительной реакции у человека при COVID-19 путем определения функциональной активности системы комплемента.The invention relates to medical immunology and can be used to predict the severity of a systemic inflammatory response in humans with COVID-19 by determining the functional activity of the complement system.

Коронавирус человека был впервые выделен D. Tyrrell и М. Bynoe в 1965 г. от больного острым респираторным заболеванием, им удалось культивировать человеческий коронавирус на клетках трахеи [Tyrrell D.A.J., Bynoe М.А. Cultivation of novel type of commoncold virus in organ culture. Br. Med. J. - 1965. - №1. - P. 1467-1470]. После открытия в 1965 году коронавирусы почти не привлекали внимание исследователей, поскольку выделенные штаммы 229Е и ОС43 вызывали относительно легкие заболевания. Врачи лечили их как обычную простуду, пока в Китае в 2002-2003 годах не была зафиксирована вспышка атипичной пневмонии, или тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС, SARS). Заболевание зарегистрировано в 32 странах, наибольшее количество в Китае, Сингапуре, Канаде. Всего заболело 8273 человека, а 775 умерло (летальность 9,6%). 17 марта 2003 года ВОЗ была объявлена «глобальная тревога» в связи с распространением «атипичной пневмонии». Были привлечены 13 лабораторий из 9 стран для проведения объединенных исследований этого заболевания. В качестве приоритетных задач ставилось определение этиологического агента, и затем на основании этого - разработка диагностических тест систем. В результате тесного сотрудничества ученых из лабораторий разных стран первая часть поставленной задачи была выполнена поразительно быстро. 16 апреля 2003 года ВОЗ было объявлено, что этиологическим агентом "атипичной пневмонии" является новый патоген, вирус SARS, относящийся к семейству коронавирусов, но не родственный ни одному из известных штаммов этого вируса [Coronavirus never before seen in humans is the cause SARS. 2003. Сайт ВОЗ. http://www.who.int/mediacentre/releases/2003/pr31/en/print.html]. С тех пор обнаружилось еще два коронавируса, которые тоже вызывают простуду - NL63 и HKU1. В 2012 году - почти через 50 лет после его открытия - был окончательно секвенирован полный геном штамма 229Е.Human coronavirus was first isolated by D. Tyrrell and M. Bynoe in 1965 from a patient with acute respiratory disease, they managed to cultivate human coronavirus on tracheal cells [Tyrrell D.A.J., Bynoe M.A. Cultivation of novel type of commoncold virus in organ culture. Br. Med. J. - 1965. - No. 1. - P. 1467-1470]. After their discovery in 1965, coronaviruses almost did not attract the attention of researchers, since the isolated strains 229E and OC43 caused relatively mild diseases. Doctors treated them like a common cold, until an outbreak of SARS, or severe acute respiratory syndrome (SARS), was recorded in China in 2002-2003. The disease has been registered in 32 countries, the largest number in China, Singapore, Canada. In total, 8273 people fell ill, and 775 died (mortality 9.6%). On March 17, 2003, WHO declared a "global alert" in connection with the spread of "SARS". Were involved 13 laboratories from 9 countries to conduct joint research on this disease. The identification of the etiological agent was set as a priority task, and then, based on this, the development of diagnostic test systems. As a result of close collaboration of scientists from laboratories in different countries, the first part of the task was completed with amazing speed. On April 16, 2003, WHO announced that the etiological agent of SARS is a new pathogen, the SARS virus, which belongs to the coronavirus family, but is not related to any known strain of this virus [Coronavirus never before seen in humans is the cause of SARS. 2003. WHO website. http://www.who.int/mediacentre/releases/2003/pr31/en/print.html]. Since then, two more coronaviruses have been discovered that also cause the common cold - NL63 and HKU1. In 2012 - almost 50 years after its discovery - the complete genome of the 229E strain was finally sequenced.

В 2012 году были зарегистрированы первые случаи заболевания, вызванного коронавирусом. Заболевание в дальнейшем получило название ближневосточного респираторного синдрома (MERS), возбудителем которого являлся коронавирус MERSCoV [Enserink Μ. SARS: chronology of the epidemic, (англ.) // Science (New York, N.Y.). - 2013. - 15 March (vol. 339, no. 6125). - P. 1266-1271. - doi:10.126/science.339.6125.1266]. В 2015 году в Южной Корее произошла вспышка ближневосточного респираторного синдрома, в ходе которой заболело 183 человека, умерло 33.In 2012, the first cases of the disease caused by the coronavirus were recorded. The disease was later called the Middle East respiratory syndrome (MERS), the causative agent of which was the MERSCoV coronavirus [Enserink Μ. SARS: chronology of the epidemic, (English) // Science (New York, N.Y.). - 2013 .-- 15 March (vol. 339, no. 6125). - P. 1266-1271. - doi: 10.126 / science.339.6125.1266]. In 2015, South Korea experienced an outbreak of Middle East respiratory syndrome, during which 183 people fell ill and 33 died.

В декабре 2019 года несколько медицинских учреждений в китайском городе Ухань (провинция Хубэй) сообщили о пациентах с пневмонией [Huang С, Wang Y., Li X. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China // Lancet. - 2020. - Feb 15;395(10223):497-506. doi: 10.1016/S0140-6736(20) 30183-5]; клинические проявления напоминали симптомы тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), заболевания, появившегося в 2002 году в соседнем районе - провинции Гуандун, вызванного коронавирусом SARS-CoV [Peiris J.S.M, Guan Y., Yuen K.Y. Severe acute respiratory syndrome // Nat Med. - 2004;10 (suppl 12):S88-S97. DOI: 10,1038 / nm1143, 10; CDC, 2019 Novel Coronavirus, Wuhan, China. CDC. Available at https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/abaut/index.html.; Accessed: January 27, 2020].In December 2019, several medical institutions in the Chinese city of Wuhan (Hubei province) reported patients with pneumonia [Huang C, Wang Y., Li X. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China // Lancet. - 2020. - Feb 15; 395 (10223): 497-506. doi: 10.1016 / S0140-6736 (20) 30183-5]; clinical manifestations resembled those of severe acute respiratory syndrome (SARS), a disease that appeared in 2002 in the neighboring area - Guangdong province, caused by the SARS-CoV coronavirus [Peiris J.S.M, Guan Y., Yuen K.Y. Severe acute respiratory syndrome // Nat Med. - 2004; 10 (suppl 12): S88-S97. DOI: 10.1038 / nm1143.10; CDC, 2019 Novel Coronavirus, Wuhan, China. CDC. Available at https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/abaut/index.html .; Accessed: January 27, 2020].

7 января 2020 г. был выделен новый штамм коронавируса, названный SARS-CoV-2, который вызывает коронавирусную болезнь 2019 года COVID-19. Полный геном SARS-CoV-2 уже достаточно изучен, его первая широкая публикация китайскими органами здравоохранения была сделана вскоре после обнаружения вируса, что облегчило процесс диагностики и идентификации возбудителя инфекции.On January 7, 2020, a new strain of coronavirus, named SARS-CoV-2, which causes the 2019 coronavirus disease COVID-19, was isolated. The complete genome of SARS-CoV-2 has already been sufficiently studied, its first widespread publication by the Chinese health authorities was made shortly after the discovery of the virus, which facilitated the process of diagnosis and identification of the infectious agent.

SARS-CoV-2 - одноцепочечный РНК-содержащий вирус, относится к семейству Coronaviridae, группе 2b бета-коронавирусов, который имеет по меньшей мере 70% сходство в генетической последовательности с SARS-CoV, его размер составляет около 100 нм [Hui D.S.I., Azhar Ε., Madani Τ.Α., Ntoumi F., Kock R., Dar O., et al The Continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health-The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China // Int. J. Infect. Dis. - 2020 Jan 14.91:264-266]. Все известные коронавирусы (CoV) делятся на четыре рода, включая α-, β-, γ-, и δ-CoV. Представители первых двух родов способны инфицировать млекопитающих, тогда как γ- и δ-CoV инфицируют преимущественно птиц. Ранее было известно о шести коронавирусах, которые способны инфицировать человека. Это HCoV-229E и HCoVNL63 (оба α-CoV), HCoV-HKU1 и HCoV-OC43 (оба β-CoV), - они вызывают легкие респираторные симптомы, сходные с простудой [Larson Н.Е., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - №5. - P. 221-229]. Два других β-коронавируса, SARSCoV и MERS-CoV, приводят к тяжелым и потенциально смертельным инфекциям дыхательных путей человека [Yin Υ., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia//Respirology. - 2018 Feb; 23(2):130-137. doi: 10.1111/resp.13196. Epub 2017 Oct 20; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. -№6. - P. 385-399; Информационный Экспресс-Бюллетень. Коронавирус SARS-возбудитель атипичной пневмонии (временные методические рекомендации). - СПб-Москва, 2003]. Несмотря на тщательное изучение коронавирусов после вспышки ТОРС, пока не совсем ясно, почему три из них - SARS-CoV-1, MERSCoV и SARS-CoV-2 (источник пандемии COVID-19) - вызывают более тяжелые симптомы и приводят к более высокому уровню смертности, в то время как другие известные четыре коронавируса человека гораздо слабее.SARS-CoV-2 is a single-stranded RNA virus, belongs to the Coronaviridae family, group 2b beta coronaviruses, which has at least 70% similarity in genetic sequence to SARS-CoV, its size is about 100 nm [Hui DSI, Azhar Ε., Madani Τ.Α., Ntoumi F., Kock R., Dar O., et al The Continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health-The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China // Int ... J. Infect. Dis. - 2020 Jan 14.91: 264-266]. All known coronaviruses (CoV) are classified into four genera, including α-, β-, γ-, and δ-CoV. Representatives of the first two genera are capable of infecting mammals, while γ- and δ-CoV infect mainly birds. Previously, it was known about six coronaviruses that are capable of infecting humans. These are HCoV-229E and HCoVNL63 (both α-CoV), HCoV-HKU1 and HCoV-OC43 (both β-CoV), - they cause mild respiratory symptoms similar to a cold [Larson H.E., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - No. 5. - P. 221-229]. Two other β-coronaviruses, SARSCoV and MERS-CoV, lead to severe and potentially fatal human respiratory tract infections [Yin Υ., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia // Respirology. - 2018 Feb; 23 (2): 130-137. doi: 10.1111 / resp.13196. Epub 2017 Oct 20; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. 1982. 99. P, 165-200; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. -№6. - P. 385-399; Information Express Bulletin. SARS coronavirus-causative agent of SARS (temporary guidelines). - SPb-Moscow, 2003]. Despite careful study of coronaviruses following the SARS outbreak, it is not yet clear why three of them - SARS-CoV-1, MERSCoV, and SARS-CoV-2 (the source of the COVID-19 pandemic) - cause more severe symptoms and lead to higher rates. mortality, while the other four known human coronaviruses are much weaker.

Коронавирусы обладают широким тропизмом и могут поражать помимо дыхательных путей печень, почки, кишечник, нервную систему, сердце и глаза [Yin Υ., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia // Respirology. -2018 Feb; 23(2):130-137. doi: 10.111 l/resp.13196. Epub 2017 Oct 20; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. -1982. - 99. - P, 165-200; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. - №6. - P. 385-399; Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия // Под редакцией О.И. Киселева, И.Г. Маринича, А.А. Сомининой). - СПб.: «Боргес», 2003; Постановление Правительства РФ от 01.12.2004 №715]. Типичная коронавирусная инфекция клинически проявляется гриппоподобным синдромом и/или кишечными расстройствами. При коронавирусной инфекции поражается альвеолярный эпителий. Коронавирусы, обладая способностью к индукции апоптоза, вызывают некроз пораженных тканей, а у пациентов после выздоровления остаются фиброзные рубцы в легких. Коронавирусы, индуцируя слияние клеток, оказывают сильное воздействие на проницаемость клеток, что приводит к нарушению водно-солевого баланса и транспорта белков. Вероятно, в этих условиях развиваются недостаточность сурфактанта (антиателектатический фактор), что приводит к коллапсу альвеол, и легочному дистресс-синдрому. Наиболее опасным свойством коронавирусов является их способность поражать макрофаги. Вероятнее всего, заболевание в особо тяжелой форме развивается на фоне блокирования основных звеньев иммунного ответа [Информационный Экспресс-Бюллетень. Коронавирус SARS-возбудитель атипичной пневмонии (временные методические рекомендации). - СПб-Москва, 2003; Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия // Под редакцией О.И. Киселева, И.Г. Маринича, А.А. Сомининой). - СПб.: «Боргес», 2003; World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19-11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opemng-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 march 2020 (accessed April 2020); Callegos A. WHO Declares Public Health Emergency for novel coronavirus // Medscape medical news. Available at https://www.Medscape, com/viewarticle/924596; Accessed: January31, 2020].Coronaviruses have a wide tropism and can affect, in addition to the respiratory tract, the liver, kidneys, intestines, nervous system, heart and eyes [Yin Υ., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia // Respirology. -2018 Feb; 23 (2): 130-137. doi: 10.111 l / resp. 13196. Epub 2017 Oct 20; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. -1982. - 99. - P, 165-200; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. - No. 6. - P. 385-399; Influenza and other respiratory viral infections: epidemiology, prevention, diagnosis and therapy // Edited by O.I. Kiseleva, I. G. Marynich, A.A. Sominina). - SPb .: "Borges", 2003; Resolution of the Government of the Russian Federation of 01.12.2004 No. 715]. A typical coronavirus infection is clinically manifested by influenza-like syndrome and / or intestinal disorders. With coronavirus infection, the alveolar epithelium is affected. Coronaviruses, having the ability to induce apoptosis, cause necrosis of the affected tissues, and after recovery in patients, fibrous scars remain in the lungs. Coronaviruses, by inducing cell fusion, have a strong effect on cell permeability, which leads to disruption of the water-salt balance and protein transport. Probably, in these conditions, surfactant deficiency (antiatelectatic factor) develops, which leads to collapse of the alveoli, and pulmonary distress syndrome. The most dangerous property of coronaviruses is their ability to infect macrophages. Most likely, the disease in a particularly severe form develops against the background of blocking the main links of the immune response [Express Information Bulletin. SARS coronavirus-causative agent of SARS (temporary guidelines). - SPb-Moscow, 2003; Influenza and other respiratory viral infections: epidemiology, prevention, diagnosis and therapy // Edited by O.I. Kiseleva, I. G. Marynich, A.A. Sominina). - SPb .: "Borges", 2003; World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19-11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opemng-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 March 2020 (accessed April 2020); Callegos A. WHO Declares Public Health Emergency for novel coronavirus // Medscape medical news. Available at https: //www.Medscape, com / viewarticle / 924596; Accessed: January31, 2020].

Коронавирусы домашних и лабораторных животных вызывают инфекционный бронхит птиц, гепатит мышей, пневмонии у крыс, гастроэнтериты и энцефаломиелиты у свиней, часто заканчивающихся у животных смертельным исходом, что приводит к большим экономическим потерям [Wege Η., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200].Coronaviruses of domestic and laboratory animals cause infectious bronchitis of birds, hepatitis of mice, pneumonia in rats, gastroenteritis and encephalomyelitis in pigs, often fatal in animals, which leads to large economic losses [Wege Η., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200].

Постановлением Главного санитарного врача РФ вирус SARS-CoV-2, как и некоторые другие представители этого семейства (вирусы SARS-CoV, MERS-CoV), отнесен ко II группе патогенности (патогенные биологические агенты, в отношении которых известны случаи летальных исходов заболевания и/или имеются сведения о высоком эпидемическом потенциале). SARS-CoV-2 включен в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих [Постановление Правительства РФ от 01.12.2004 №715; Ramzy Α., McNeil D.G. W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Available at https://nyti.ms/2RER70M; Accessed: January 30, 2020].By the decree of the Chief Sanitary Doctor of the Russian Federation, the SARS-CoV-2 virus, like some other members of this family (SARS-CoV, MERS-CoV viruses), is assigned to the II pathogenicity group (pathogenic biological agents for which there are known cases of lethal outcomes of the disease and / or there is evidence of a high epidemic potential). SARS-CoV-2 is included in the list of diseases that pose a danger to others [Decree of the Government of the Russian Federation of 01.12.2004 No. 715; Ramzy Α., McNeil D.G. W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Available at https://nyti.ms/2RER70M; Accessed: January 30, 2020].

Случаи заболевания COVID-19 зарегистрированы в большинстве стран мира на всех континентах. 30 января ВОЗ признала вспышку нового коронавируса глобальной чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение [Larson Н.Е., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - №5. - P. 221-229; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200; Yin Y., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia//Respirology. -2018 Feb; 23(2): 130-137. doi: 10.1111/resp.13196. Epub 2017 Oct 20;Cases of COVID-19 have been reported in most countries of the world on all continents. On January 30, WHO recognized the outbreak of a new coronavirus as a global public health emergency of international concern [Larson H.E., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - No. 5. - P. 221-229; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. 1982. 99. P, 165-200; Yin Y., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia // Respirology. -2018 Feb; 23 (2): 130-137. doi: 10.1111 / resp.13196. Epub 2017 Oct 20;

World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 - 11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 march 2020 (accessed April 2020); Callegos A. WHO Declares Public Health Emergency for novel coronavirus // Medscape medical news. Available at https://www.Medscape, com/viewarticle/924596; Accessed: January 31, 2020; Ramzy Α., McNeil D.G. W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Available at https://nyti.ms/2RER70M; Accessed: January 30, 2020]. 11 марта 2020 года Президент ВОЗ объявил COVID-19 глобальной пандемией, впервые назвав пандемией инфекционный процесс после пандемии гриппа H1N1 в 2009 году [Larson Н.Е., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - №5. - P. 221-229; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. - №6. - P. 385-399; World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 -11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 march 2020 (accessed April 2020); The New York Times. Coronavirus Live Updates: W.H.O. Declares Pandemic as Number of Infected Countries Crows. The New York Times. Available at https:// www.nytimes.com/2020/03/1 l/world/coronavirus-news.html#link-282e5b06. Accessed: March 11, 2022].World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 - 11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 March 2020 (accessed April 2020); Callegos A. WHO Declares Public Health Emergency for novel coronavirus // Medscape medical news. Available at https: //www.Medscape, com / viewarticle / 924596; Accessed: January 31, 2020; Ramzy Α., McNeil D.G. W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Available at https://nyti.ms/2RER70M; Accessed: January 30, 2020]. On March 11, 2020, the WHO President declared COVID-19 a global pandemic, for the first time calling an infectious process a pandemic after the H1N1 influenza pandemic in 2009 [Larson H.E., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - No. 5. - P. 221-229; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. - No. 6. - P. 385-399; World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 -11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 March 2020 (accessed April 2020); The New York Times. Coronavirus Live Updates: W.H.O. Declares Pandemic as Number of Infected Countries Crows. The New York Times. Available at https: // www.nytimes.com/2020/03/1 l / world / coronavirus-news.html # link-282e5b06. Accessed: March 11, 2022].

Большинство пациентов, заболевших тяжелой формой Covid-19 находятся в критическом состоянии из-за развития острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Ухудшение функции легких объясняется дезадаптивным иммунным ответом, а не повышенной вирусной нагрузкой. Одна из теорий заключается в том, что активация резидентных иммунных клеток в легких посредством распознавания рецепторов стимулируют высвобождение провоспалительных цитокинов, выход нейтрофилов и моноцитов из сосудистого русла в бронхи. Эти клетки могут нарушить барьер между воздухом и кровью, вызывая повреждение коллатеральных тканей, особенно эпителиальных клеток дыхательных путей и эндотелиальные клетки сосудов, которые экспрессируют рецептор входа, ангиотензин-превращающий фермент 2 (АСЕ2) для SARS-CoV-2. Повреждение клеток эндотелия сосудов могут быть причиной тромботических микроангиопатий.Most patients with severe Covid-19 are in critical condition due to the development of acute respiratory distress syndrome (ARDS). The deterioration in lung function is due to a maladaptive immune response rather than an increased viral load. One theory is that the activation of resident immune cells in the lungs through receptor recognition stimulates the release of pro-inflammatory cytokines, the release of neutrophils and monocytes from the vascular bed into the bronchi. These cells can disrupt the air-blood barrier, causing damage to collateral tissues, especially airway epithelial cells and vascular endothelial cells, which express the entry receptor, angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) for SARS-CoV-2. Damage to vascular endothelial cells can cause thrombotic microangiopathies.

В недавних исследованиях SARS-CoV, которые тесно связаны с SARS-CoV-2, было показано, что активация компонента комплемента С3 обостряет заболевание при ОРДС, ассоциированном с SARS-CoV-2. С3- дефицитные мыши, инфицированные SARS-CoV, имели меньше респираторных дисфункций, несмотря на эквивалентную вирусную нагрузку в легких, и это было связано с уменьшением инфильтрации легких нейтрофилами и моноцитами, более низким уровнем цитокинов и хемокинов в легких и сыворотке крови [Gralinski, L. Ε. Etal. Complement activation contributes to severe acuteRecent studies on SARS-CoV, which are closely related to SARS-CoV-2, have shown that activation of the complement component C3 exacerbates disease in SARS-CoV-2-associated ARDS. C3-deficient mice infected with SARS-CoV had fewer respiratory dysfunctions, despite an equivalent viral load in the lungs, and this was associated with a decrease in lung infiltration by neutrophils and monocytes, lower levels of cytokines and chemokines in the lungs and serum [Gralinski, L . Ε. Etal. Complement activation contributes to severe acute

respiratory syndrome coronavirus pathogenesis. mBiohttps://doi.org/10.1128/mBio.01753-18 (2018)]. Полученные данные свидетельсвуют о том, что ингибирование ключевого компонента С3 комплемента может также уменьшить воспалительные легочные повреждения, обусловленные SARS-CoV-2 инфекцией. Заметное снижение инфильтрации легких нейтрофилами и снижение уровней как внутрилегочного, так и плазменного IL-6, наблюдаемый у инфицированных SARS-CoVC3-дефицитных мышей предполагает возможность комбинирования ингибиторов С3 в схемах лечения для снижения уровня IL-6. Более того, восходящее позиционирование передачи сигналов С3 во врожденном иммунном каскаде также свидетельствует в пользу более широкого противовоспалительного потенциала блокады С3 с такими агентами как компстатин (AMY-101) [Mastellos, D. С, Ricklin, D., Lambris, J. D. Clinical promise of next- generation complement therapeutics. Nat. Rev. DrugDiscov. 18, 707-729 (2018)], который в настоящее время проходит испытания у пациентов с COVID-19. Подавление активации С3 вызывает блокаду генерации С3а и С5а анафилатоксинов, а также внутрилегочной активации С3 и высвобождению IL-6 из альвеолярных макрофагов или других клеток, экспрессирующих СЗа рецепторы (C3aR) и/или рецепторы С5а (C5aR), тем самым снижая повреждение легких.respiratory syndrome coronavirus pathogenesis. mBiohttps: //doi.org/10.1128/mBio.01753-18 (2018)]. These findings suggest that inhibition of the key component C3 of complement may also reduce inflammatory lung damage associated with SARS-CoV-2 infection. The marked decrease in neutrophil infiltration of the lungs and the decrease in both intrapulmonary and plasma IL-6 levels observed in SARS-CoVC3-deficient mice infected suggest the possibility of combining C3 inhibitors in treatment regimens to lower IL-6 levels. Moreover, the upward positioning of C3 signaling in the innate immune cascade also supports the broader anti-inflammatory potential of C3 blockade with agents such as compstatin (AMY-101) [Mastellos, D. C, Ricklin, D., Lambris, JD Clinical promise of next-generation complement therapeutics. Nat. Rev. DrugDiscov. 18, 707-729 (2018)], which is currently being tested in patients with COVID-19. Suppression of C3 activation blocks the generation of C3a and C5a anaphylatoxins, as well as intrapulmonary activation of C3 and the release of IL-6 from alveolar macrophages or other cells expressing C3a receptors (C3aR) and / or C5a receptors (C5aR), thereby reducing lung damage.

Ex vivo инфицирования цельной крови SARS-CoV в присутствии ингибитора С3, AMY-101, показали, что это препятствует высвобождению IL-6 [Mastellos, D. С, Ricklin, D., Lambris, J. D. Clinical promise of next- generation complement therapeutics. Nat. Rev. DrugDiscov. 18, 707-729 (2018)].Ex vivo whole blood infections with SARS-CoV in the presence of the C3 inhibitor, AMY-101, have been shown to inhibit the release of IL-6 [Mastellos, D. C, Ricklin, D., Lambris, J. D. Clinical promise of next-generation complement therapeutics. Nat. Rev. DrugDiscov. 18, 707-729 (2018)].

Хотя роль активации комплемента в патофизиологии ОРДС, вызванного различными тяжелыми заболеваниями убедительно доказана. Клинические же данные о роли гиперактивации комплемента в развитие ОРДС, ассоциированного с SARS-CoV-2, в настоящее время немногочисленны [Zilow, G. et al. Generation of anaphylatoxin СЗа in plasma and bronchoalveolar lavage fluid in trauma patients at risk for the adult respiratory distress syndrome. Crit. CareMed. 20, 468-73(1992)].Although the role of complement activation in the pathophysiology of ARDS caused by various serious diseases has been convincingly proven. Clinical data on the role of complement hyperactivation in the development of ARDS associated with SARS-CoV-2 are currently scarce [Zilow, G. et al. Generation of anaphylatoxin СЗа in plasma and bronchoalveolar lavage fluid in trauma patients at risk for the adult respiratory distress syndrome. Crit. CareMed. 20, 468-73 (1992)].

Недавние исследования образцов легких, умерших пациентов с тяжелой формой COVID-19, показали гиперактивацию комплемента, которая характеризовалась генерацией С3а в бронхо-альвеолярной жидкости, обнаружением большого количества C3B-фрагментов в тканях легких и повышением уровня С5а в сыворотке крови [Gao, Т. et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over- activation. medRxiv Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20041962 (2020)].Recent studies of lung samples from deceased patients with severe COVID-19 showed complement hyperactivation, which was characterized by the generation of C3a in the broncho-alveolar fluid, the detection of a large number of C3B fragments in lung tissues and an increase in the level of C5a in the blood serum [Gao, T. et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over-activation. medRxiv Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20041962 (2020)].

Важно отметить, что лечение пациентов с тяжелой формой Ковид-19 анти-С5а моноклональными антителами приводит к быстрому улучшению состояния больных с ОРДС, увеличению степени оксигенации крови и снижению системной воспалительной реакции в организме больного [Gao, Т. et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over- activation. medRxiv Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20041962 (2020)].It is important to note that the treatment of patients with severe Covid-19 with anti-C5a monoclonal antibodies leads to a rapid improvement in the condition of patients with ARDS, an increase in the degree of blood oxygenation and a decrease in the systemic inflammatory response in the patient's body [Gao, T. et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over-activation. medRxiv Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20041962 (2020)].

Ингибиторы C5 эффективно используются в клинике почти 15 лет, и их использование в клинических испытаниях при тяжелом течении SARS-CoV-2 подкреплены хорошо известной ролью оси С5а - C5aR в патофизиологии ОРДС. Однако ингибирование С5 может быть частичным, что позволяет остаточной активности терминального пути снижать эффективность при гиперактивации комплемента, который наблюдается при инфекциях. Также эти препараты не будут влиять на ось С3а - C3aR. Ингибиторы проксимального комплемента (которые нацелены на С3 или его предшествующие активаторы) могут быть более эффективными, но они все еще находятся на стадии разработки, и ни один из них не одобрен для применения, хотя имеются обнадеживающие данные фазы II клинических испытаний.C5 inhibitors have been effectively used in the clinic for almost 15 years, and their use in clinical trials in severe SARS-CoV-2 is supported by the well-known role of the C5a-C5aR axis in the pathophysiology of ARDS. However, inhibition of C5 may be partial, allowing residual terminal pathway activity to reduce efficacy in complement hyperactivation that occurs in infections. Also, these drugs will not affect the C3a - C3aR axis. Proximal complement inhibitors (which target C3 or its precursor activators) may be more effective, but they are still in development and none are approved for use, although there are encouraging data from phase II clinical trials.

Остаются дополнительные вопросы относительно терапевтического использование ингибиторов комплемента при COVID-19. Лишь у небольшой части пациентов развивается тяжелая форма болезни в виде ОРДС. Однако надежные клинические маркеры для прогнозирования тяжести течения на ранней стадии заболевания в настоящий момент отсутствуют. Биомаркеры активации системы комплемента обычно не используется, так как большинство из них нестабильны и имеют очень короткий период полураспада [Mastellos D.C., Pires da Silva B.G.P., Fonseca B.A.L., Fonseca N.P. et al. Complement C3 vs C5 inhibition in severe COVID-19: Early clinical findings reveal differential biological efficacy //Clin Immunol. 2020 Nov; 220:108598. doi: 10.1016/j.clim.2020.108598. Epub 2020 Sep 19. PMID: 32961333].Additional questions remain regarding the therapeutic use of complement inhibitors in COVID-19. Only a small proportion of patients develop severe ARDS. However, there are currently no reliable clinical markers for predicting the severity of the course at an early stage of the disease. Biomarkers of the complement system activation are usually not used, since most of them are unstable and have a very short half-life [Mastellos D.C., Pires da Silva B.G.P., Fonseca B.A.L., Fonseca N.P. et al. Complement C3 vs C5 inhibition in severe COVID-19: Early clinical findings reveal differential biological efficacy // Clin Immunol. 2020 Nov; 220: 108598. doi: 10.1016 / j.clim.2020.108598. Epub 2020 Sep 19. PMID: 32961333].

Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из более чем 30 компонентов, которые действуют каскадным механизмом. Эта система играет ключевую роль, как в клиренсе иммунных комплексов, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки. Система комплемента может активироваться тремя путями: классическим, альтернативным и лектиновым.The complement system is part of the immune system and consists of more than 30 components that act in a cascading mechanism. This system plays a key role both in the clearance of immune complexes and in the immune response to infectious agents, foreign antigens, tumor and virus-infected cells. The complement system can be activated in three ways: classical, alternative and lectin.

Классический путь является Ca²⁺/Mg²⁺-зависимым каскадом, который в норме активируется при формировании иммунного комплекса (ИК). Компонент С1, первый ферментный комплекс в каскаде, является пентамолекулярным комплексом. Включает одну молекулу C1q и по две молекулы C1r и C1s. С1 комплекс связывается с Fc-фрагментом иммуноглобулинов в составе ИК через C1q и инициирует ферментативный каскад системы комплемента. Как только активируется С1 комплекс, C1s расщепляет компонент С4, приводя к образованию C4b, который затем связывает компонент С2. Иммобилизованный компонент С2 расщепляется при помощи фермента C1s с образованием С3-конвертазы (C4bC2a) классического пути.The classical pathway is a Ca ²⁺ / Mg ²⁺ -dependent cascade, which is normally activated during the formation of the immune complex (IC). Component C1, the first enzyme complex in the cascade, is a pentamolecular complex. Includes one C1q molecule and two C1r and C1s molecules. The C1 complex binds to the Fc-fragment of immunoglobulins in the IC through C1q and initiates the enzymatic cascade of the complement system. As soon as the C1 complex is activated, C1s cleaves the C4 component, leading to the formation of C4b, which then binds the C2 component. The immobilized C2 component is cleaved by the C1s enzyme to form the C3 convertase (C4bC2a) in the classical pathway.

Альтернативный путь является Mg²⁺-зависимым и активируется рядом разнообразных веществ, включающих полисахариды клеточных стенок дрожжей и бактерий, определенные биополимерные материалы. При иммобилизации C3b на поверхности на него садится фактор В, который под действием фермента, фактора D, расщепляется и образуется С3-конвертаза (C3bBb) альтернативного пути.The alternative pathway is Mg ²⁺ -dependent and is activated by a variety of substances, including polysaccharides of the cell walls of yeast and bacteria, and certain biopolymer materials. When C3b is immobilized on the surface, factor B is deposited on it, which, under the action of the enzyme, factor D, is cleaved and C3 convertase (C3bBb) of an alternative pathway is formed.

Пектиновый путь активирует комплемент при помощи маннан-связывающего лектина (МСЛ) и двух ассоциированных с ним сериновых протеаз (МАСП-1 и МАСП-2) (подобно c C1r и C1s в классическом пути активации комплемента). Как и в классическом пути активации комплемента, для лектинового пути также требуются компоненты С2 и С4. Активация лектинового пути приводит к формированию С3-конвертазы, аналогичной с С3-конвертазой классического пути (C4bC2a) [Ройт Α., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с.].The pectin pathway activates complement with the help of mannan-binding lectin (MBL) and two associated serine proteases (MASP-1 and MASP-2) (similar to C1r and C1s in the classical complement activation pathway). As in the classic pathway of complement activation, the lectin pathway also requires components C2 and C4. Activation of the lectin pathway leads to the formation of C3-convertase, similar to the C3-convertase of the classical pathway (C4bC2a) [Royt Α., Brostoff J., Mail D. Immunology: Trans. from English M .: Mir, 2000. - 592 p.].

Субстратом С3-конвертазы трех путей активации является ключевой компонент комплемента, компонент С3, при гидролизе которого образуется С3а (анафилатоксин) и C3b (опсонин). Присоединяя дополнительно молекулу C3b, С3конвертаза обретает способность гидролизовать компонент С5, который запускает реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).The substrate of C3-convertase of the three activation pathways is the key component of complement, component C3, during the hydrolysis of which C3a (anaphylatoxin) and C3b (opsonin) are formed. By attaching an additional C3b molecule, the C3 convertase acquires the ability to hydrolyze the C5 component, which triggers the reaction of the formation of a membrane-attacking complex (MAC).

При активации комплемента генерируются биологически активные фрагменты белков С3 и С5 (С3а и С5а - анафилатоксины) и C5b-9 (МАК), которые опосредуют воспалительные активности, включающие лейкоцитарный хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости, цитолиз и тканевое повреждение [SahuA., LambrisJ.D. Complement inhibitors are surget conceptin anti-inflamatory therapeutics // Immunopharmacology - 2000. - V.49. - P. 133-148.].When complement is activated, biologically active fragments of proteins C3 and C5 (C3a and C5a are anaphylatoxins) and C5b-9 (MAC) are generated, which mediate inflammatory activities, including leukocyte chemotaxis, activation of macrophages, neutrophils and platelets, mast and endothelial cells, increased vascular permeability , cytolysis and tissue damage [Sahu A., Lambris J. D. Complement inhibitors are surget conceptin anti-inflamatory therapeutics // Immunopharmacology - 2000 .-- V. 49. - P. 133-148.].

Избыточная (неконтролируемая) активация системы комплемента является частью патогенеза большого числа воспалительных заболеваний. Патологические эффекты могут быть обусловлены повышенной, продолжительной активацией, например, вызванной присутствием иммунных комплексов (системная красная волчанка и связанные с ней заболевания), а также сниженной экспрессией и функцией различных ингибиторов комплемента, или комбинацией этих двух факторов [Carroll M.V., R. В. Sirn R.B. Complement in health and disease //Advanced Drug Delivery Reviews. - 2011.-V.63, №12.-P. 965-975].Excessive (uncontrolled) activation of the complement system is part of the pathogenesis of a large number of inflammatory diseases. Pathological effects can be due to increased, prolonged activation, for example, caused by the presence of immune complexes (systemic lupus erythematosus and related diseases), as well as decreased expression and function of various complement inhibitors, or a combination of these two factors [Carroll MV, R. B. Sirn RB Complement in health and disease // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2011.-V.63, No. 12.-P. 965-975].

Ишемия и последующая реперфузия органов и тканей наблюдается при таких состояниях как инфаркт миокарда или инсульт. Неконтролируемая активация системы комплемента играет важную роль при реперфузионном повреждении. Результатом чего является мультифункциональный воспалительный процесс, вовлекающий генерацию анафилатоксинов, повышенную экспрессию адгезивных белков и тканевых факторов на эндотелиальных клетках и выход из сосудов полиморфно-ядерных лейкоцитов [Banz Υ., Rieben R. Role of complement and perspectives for intervention in ischemia-reperfusion damage // Annals of Medicine. - 2012. - V. 44, №3. - P. 205-217].Ischemia and subsequent reperfusion of organs and tissues is observed in conditions such as myocardial infarction or stroke. Uncontrolled activation of the complement system plays an important role in reperfusion injury. The result is a multifunctional inflammatory process involving the generation of anaphylatoxins, increased expression of adhesive proteins and tissue factors on endothelial cells and the release of polymorphonuclear leukocytes from the vessels [Banz Υ., Rieben R. Role of complement and perspectives for intervention in ischemia-reperfusion / damage / Annals of Medicine. - 2012. - V. 44, No. 3. - P. 205-217].

Для исследования системы комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения исследуемой сыворотки добавляют к эритроцитам барана, сенсибилизированным антителами кролика (ЕА); 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор после центрифугирования. Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну гемолитическую единицу комплемента (СН₅₀) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% 0,5 мл стандартной суспензии ЕА при 37°С за 45 мин. В 1 мл сыворотки крови человека содержится 20-40 СН₅₀ [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 368 с.].To study the complement system, its hemolytic activity is determined. The essence of the method is as follows: 1) different dilutions of the test serum are added to sheep erythrocytes sensitized with rabbit antibodies (EA); 2) the degree of hemolysis is assessed photometrically by the release of hemoglobin into the solution after centrifugation. Complement activity is expressed in hemolytic units. One hemolytic unit of complement (CH ₅₀ ) is taken to be such an amount that causes hemolysis of 50% 0.5 ml of a standard EA suspension at 37 ° C in 45 minutes. In 1 ml of human blood serum contains 20-40 CH ₅₀ [Laboratory research methods in the clinic: Handbook / Menshikov V.V., Deletorskaya L.N., Zolotnitskaya R.P. and others: Ed. V.V. Menshikov. M .: Medicine, 1987. - 368 p.].

Существенным недостатком этого метода является использование гетерологичных эритроцитов барана с коротким сроком их хранения, длительность выполнения теста, недостаточная точность (колебания нормальных значений в два раза), для оценки степени лизиса требуется центрифугирование и определение гемоглобина в супернатанте (дополнительный контакт оператора с биоматериалом).A significant drawback of this method is the use of heterologous sheep erythrocytes with a short shelf life, the duration of the test, insufficient accuracy (fluctuations in normal values by two times), centrifugation and determination of hemoglobin in the supernatant are required to assess the degree of lysis (additional contact of the operator with the biomaterial).

Из уровня техники известен способ определения чувствительности эритроцитов человека к лизису по тромбиновому пути активации комплемента [патент РФ №2 696 981, опубл. 08.08.2019 Бюл. №22, МПК G01N 31/00]. Суть метода заключается в том, что для определения чувствительности эритроцитов человека к лизису при активации системы комплемента по тромбиновому пути используют цитратную плазму с высокой активностью тромбина, связанного с фибрином. Для ингибирования активации комплемента по одному из известных трех путей (классическому, альтернативному или лектиновому) используют цитрат натрия в качестве хелатора для связывания Са²⁺и Mg²⁺. В присутствии активного тромбина, связанного с фибрином, активируется компонент С5 и формируется мембрано-атакующий комплекс, который определяют по лизису эритроцитов человека (ЭЧ). Параллельно определяют стандартным методом группу крови ЭЧ по системе АВ0. Наиболее чувствительными к лизису по тромбиновому пути активации комплемента оказались эритроциты человека с группой крови А, на втором месте - АВ, на третьем месте - В. Наиболее устойчивыми к лизису оказались эритроциты человека 0 группой крови.From the prior art, a method is known for determining the sensitivity of human erythrocytes to lysis by the thrombin pathway of complement activation [RF patent No. 2 696 981, publ. 08.08.2019 Bul. No. 22, IPC G01N 31/00]. The essence of the method is that to determine the sensitivity of human erythrocytes to lysis when the complement system is activated via the thrombin pathway, citrate plasma with high activity of thrombin associated with fibrin is used. To inhibit complement activation by one of the three known pathways (classical, alternative, or lectin), sodium citrate is used as a chelator for the binding of Ca ²⁺ and Mg ²⁺ . In the presence of active thrombin bound to fibrin, the C5 component is activated and a membrane-attacking complex is formed, which is determined by the lysis of human erythrocytes (HRC). In parallel, the blood group ECH is determined by the standard method according to the AB0 system. The most sensitive to lysis by the thrombin pathway of complement activation turned out to be human erythrocytes with blood group A, in second place - AB, in third place - B. The most resistant to lysis were human erythrocytes with blood group 0.

Таким образом, авторами убедительно показан лизис эритроцитов человека мембрано-атакующим комплексом, который формируется на эритроцитах человека кроме О группы, под действием тромбина, связанного с фибрином и вызывает лизис.Thus, the authors convincingly demonstrated the lysis of human erythrocytes by the membrane-attacking complex, which is formed on human erythrocytes, in addition to the O group, under the action of thrombin bound to fibrin and causes lysis.

Также из уровня техники известен тест определения функциональной активности системы комплемента по классическому пути, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА). Суть теста заключается в определении активности классического пути системы комплемента по сорбции мембрано-атакующего комплекса (МАК) на подложке 96-ти луночной планшеты, сорбированной агрегированными иммуноглобулинами. Связывание МАК проявляют моноклональными антителами, конъюгированными с ферментом, щелочной фосфатазой, с использованием его субстрата. В качестве стандарта используют лиофильно высушенный препарат сыворотки крови человека. Рассчитывают в процентах функциональную активность классического пути активации комплемента относительно стандарта [WIESLAB Complement system Classical pathway. "TuroDiagnostica"].Also known from the prior art is a test for determining the functional activity of the complement system by the classical pathway, based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The essence of the test is to determine the activity of the classical pathway of the complement system by sorption of the membrane-attacking complex (MAC) on the support of a 96-well plate, sorbed by aggregated immunoglobulins. The binding of MAC is shown by monoclonal antibodies conjugated to an enzyme, alkaline phosphatase, using its substrate. A freeze-dried preparation of human blood serum is used as a standard. Calculate as a percentage the functional activity of the classical pathway of complement activation relative to the standard [WIESLAB Complement system Classical pathway. "TuroDiagnostica"].

Существенным недостатком ИФΑ-теста скрининга комплемента по классическому пути является длительность проведения анализа (не менее 3 часов), использование моноклональных антител, которые делают данный анализ недоступным для рутинных исследований. Также использование лиофильно высушенной сыворотки в качестве стандарта требуют специальных условий для хранения и транспортировки (-20°С), а также подобный стандарт может завышать активность комплемента при анализе из-за потери функциональной активности самого стандарта при лиофилизации, хранении и транспортировке.A significant drawback of the IFΑ-test for complement screening by the classical route is the duration of the analysis (at least 3 hours), the use of monoclonal antibodies, which make this analysis inaccessible for routine studies. Also, the use of lyophilized serum as a standard requires special conditions for storage and transportation (-20 ° C), and such a standard can overestimate the complement activity in the analysis due to the loss of the functional activity of the standard itself during lyophilization, storage and transportation.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является скрининг-тест определения активности классического пути активации системы комплемента человека методом турбидиметрии [патент на изобретение РФ №2 704 121, опубл. 24.10.2019 Бюл. №30, МПК G01N 33/50]; - Суть метода заключается в определении функциональной активности классического пути системы комплемента с использованием реакции лизиса эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), в условиях вероналового солевого буфера (VBS²⁺) при температуре (37,0±0,5)°С в течение 10 мин. Реакцию комплемент-зависимого лизиса ЕА определяют турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии ЕА при длине волны 620 нм, затем определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по калибровочному графику, где контроль ЕА представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса ΕА - 100% лизис.The closest analogue (prototype) is a screening test for determining the activity of the classical pathway of activation of the human complement system by the method of turbidimetry [RF patent for invention No. 2 704 121, publ. 24.10.2019 Bul. No. 30, IPC G01N 33/50]; - The essence of the method is to determine the functional activity of the classical pathway of the complement system using the reaction of lysis of sheep erythrocytes sensitized with rabbit antibodies (EA), under conditions of veronal saline buffer (VBS ²⁺ ) at a temperature of (37.0 ± 0.5) ° С in within 10 minutes. The reaction of complement-dependent lysis of EA is determined turbidimetrically by the decrease in the optical density of the EA suspension at a wavelength of 620 nm, then the degree of lysis of erythrocytes in the experimental samples is determined according to the calibration graph, where control EA represents 0% lysis, and control of complete lysis A - 100% lysis.

Недостатком данного гемолитического теста является использование также эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика, которые не всегда доступны для рутинных исследований и ограничены в сроках использования.The disadvantage of this hemolytic test is the use of sheep erythrocytes sensitized with rabbit antibodies, which are not always available for routine research and are limited in terms of use.

Таким образом, на настоящий момент не существует доступного теста для скрининга функциональной активности классического пути системы комплемента для рутинных исследований.Thus, at the moment there is no test available for screening the functional activity of the classical complement system pathway for routine research.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности метода исследования функциональной активности классического пути системы комплемента, а также упрощения регистрации результатов анализа функциональной активности классического пути системы комплемента в рутинных исследованиях и адаптации способа для скрининг-исследований в условиях клинико-диагностических лабораторийThe technical result of the proposed method is to improve the accuracy of the method for studying the functional activity of the classical pathway of the complement system, as well as to simplify the registration of the results of the analysis of the functional activity of the classical pathway of the complement system in routine research and adaptation of the method for screening studies in the conditions of clinical diagnostic laboratories

Указанный результат достигается тем, что определение функциональной активности классического пути системы комплемента проводят с использованием 1% суспензии эритроцитов человека с группой А по системе АВО Е(А), сенсибилизированных анти-А моноклональными антителами [Е(А)мАт], 12,5% сыворотки в условиях вероналового солевого буфера (VBS²⁺) при температуре (37,0±0,5)°С в течение 15 мин. Реакцию комплемент-зависимого лизиса Е(А)мАт оценивают турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии Е(А)мАт при длине волны 620 нм, затем определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по графику, где контроль Е(А)мАт представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса Е(А)мАт - 100% лизис, при этом повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента считают при степени лизиса более 60%, при степени лизиса от 31% до 59% как нормальную, а при степени лизиса менее 30% как пониженную активность.This result is achieved by the fact that the determination of the functional activity of the classical pathway of the complement system is carried out using a 1% suspension of human erythrocytes with group A according to the ABO E (A) system, sensitized with anti-A monoclonal antibodies [E (A) mAb], 12.5% serum in the conditions of veronal saline buffer (VBS ²⁺ ) at a temperature of (37.0 ± 0.5) ° С for 15 min. The reaction of complement-dependent lysis of E (A) mAb is estimated turbidimetrically by the decrease in the optical density of the E (A) mAb suspension at a wavelength of 620 nm, then the degree of erythrocyte lysis in experimental samples is determined according to the graph, where the control E (A) mAb represents 0% lysis , and control of complete lysis of E (A) mAb - 100% lysis, while the increased functional activity of the classical pathway of the complement system is considered when the degree of lysis is more than 60%, when the degree of lysis is from 31% to 59% as normal, and when the degree of lysis is less than 30 % as decreased activity.

Заявленное изобретение поясняется фигурами:The claimed invention is illustrated by the figures:

на фиг. 1 представлен график зависимости оптической плотности суспензии эритроцитов человека при длине волны 620 нм от концентрации эритроцитов;in fig. 1 shows a graph of the dependence of the optical density of a suspension of human erythrocytes at a wavelength of 620 nm on the concentration of erythrocytes;

на фиг. 2 представлен график для определения степени лизиса эритроцитов человека в % методом турбидиметрии;in fig. 2 shows a graph for determining the degree of lysis of human erythrocytes in% by turbidimetry;

на фиг. 3 представлен график определения оптимальной концентрации моноклональных анти-А IgM антител для активации комплемента по классическому пути;in fig. 3 shows a graph for determining the optimal concentration of monoclonal anti-A IgM antibodies for activation of complement by the classical pathway;

на фиг. 4 представлена раститровка пулированной сыворотки с эритроцитами А группы человека, сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами;in fig. 4 shows titration of pooled serum with human group A erythrocytes sensitized with anti-A monoclonal IgM antibodies;

на фиг. 5 представлено влияние времени инкубации на гемолиз эритроцитов человека.in fig. 5 shows the effect of incubation time on hemolysis of human erythrocytes.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготавливают сыворотку, проводят литический тест и осуществляют расчет степени лизиса в опытных пробах. Гемолитический тест проводят с использованием 1% суспензии эритроцитов человека группы AI) [Е(А)], сенсибилизированных анти-А-моноклональными IgM антителами [Е(А)мАт] в вероналовом солевом буфере, содержащем Са²⁺и Mg²⁺(VBS²⁺). Время проведения скрининг-теста - 15 мин. Суть метода заключается в изменении светорассеивания эритроцитов при их лизисе в 96-ти луночных иммунологических плоскодонных планшетах. Изменение светорассеивания при лизисе эритроцитов определяют турбидиметрически при длине волны 620 нм с использованием фотометра для иммуноферментного анализа. Для определения степени лизиса эритроцитов в опытных образцах строят калибровочный график зависимости оптической плотности А₆₂₀ от лизиса эритроцитов человека по которому определяют степень лизиса (фиг. 2), где за 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов человека Е(А)мАт, на спонтанный лизис, соответственно за 100% лизиса принимают оптическую плотность контроля на полный лизис.Повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента считают при степени лизиса более 60%, при степени лизиса от 31% до 59% как нормальную, а при степени лизиса менее 30% как пониженную активность.The method is carried out as follows. Blood is taken, serum is prepared, a lytic test is carried out, and the degree of lysis in experimental samples is calculated. Hemolytic test is performed using a 1% suspension of human erythrocytes of group AI) [E (A)], sensitized with anti-A-monoclonal IgM antibodies [E (A) mAb] in Veronal saline buffer containing Ca ²⁺ and Mg ²⁺ (VBS ²⁺ ). The time for the screening test is 15 minutes. The essence of the method is to change the light scattering of erythrocytes during their lysis in 96-well immunological flat-bottomed plates. The change in light scattering during lysis of erythrocytes is determined turbidimetrically at a wavelength of 620 nm using an ELISA photometer. To determine the degree of erythrocyte lysis in the test samples, a calibration graph of the dependence of the optical density A ₆₂₀ on the lysis of human erythrocytes is plotted by which the degree of lysis is determined (Fig. 2), where the optical density of the control of human erythrocytes E (A) mAb is taken as 0% lysis, for spontaneous lysis, respectively, the optical density of the control for complete lysis is taken as 100% lysis. The increased functional activity of the classical pathway of the complement system is considered at a degree of lysis of more than 60%, at a degree of lysis from 31% to 59% as normal, and at a degree of lysis of less than 30% as decreased activity.

Определение оптимальной концентрации эритроцитов человека для определения функциональной активности системы комплемента. Эритроциты человека группы А [Е(А)] по системе АВ0 3 раза отмывают в вероналовом солевом буфере (VBS²⁺) центрифугированием в течение 10 мин при 2800 об/мин. Строят график зависимости оптической плотности суспензии Е(А) при длине волны 620 нм от концентрации эритроцитов, %. Для этого 4% суспензии Е(А) прогрессивно разводят в плоскодонной 96-ти луночной иммунологической планшете в объеме 50 мкл VBS²⁺. Объем доводят до 100 мкл тем же буфером. Тщательно перемешивают и измеряют на фотометре для иммуноферментного анализа при А₆₂₀ (фиг. 1).Determination of the optimal concentration of human erythrocytes to determine the functional activity of the complement system. Human erythrocytes of group A [E (A)] according to the AB0 system are washed 3 times in Veronal saline buffer (VBS ²⁺ ) by centrifugation for 10 min at 2800 rpm. A graph is plotted of the dependence of the optical density of the suspension E (A) at a wavelength of 620 nm on the concentration of erythrocytes,%. For this, 4% suspension E (A) is progressively diluted in a flat-bottomed 96-well immunological plate in a volume of 50 μl of VBS ²⁺ . The volume is made up to 100 μl with the same buffer. Mix thoroughly and measure on a photometer for enzyme-linked immunosorbent assay at A ₆₂₀ (Fig. 1).

Как видно из данных, представленных на фиг.1, наблюдается линейная зависимость оптической плотности суспензии эритроцитов человека от концентрации их в растворе до А₆₂₀ равной 0,68 единиц оптической плотности (ЕОП). Выше 0,68 ЕОП при А₆₂₀наблюдается незначительный загиб. Поэтому для теста определения функциональной активности классического пути активации системы комплемента нами выбрана концентрация эритроцитов Е(А), которая в объеме 100 мкл в лунке 96-луночного планшета дает оптическую плотность, равную 0,68, что соответствует 0,5% концентрации эритроцитов (0,5×10⁷ кл/мл). Для определения степени лизиса эритроцитов нами предложен калибровочный график (фиг. 2), где степень лизиса эритроцитов оценивают по снижению оптической плотности при длине волны 620 нм. За 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов человека на спонтанный лизис (25 мкл 2% Е(А) + 75 мкл VBS²⁺), соответственно за 100% лизис принимают оптическую плотность контроля на полный лизис (25 мкл 2% Е(А) + 75 мкл Н₂О).As can be seen from the data presented in figure 1, there is a linear dependence of the optical density of a suspension of human erythrocytes from their concentration in solution up to A ₆₂₀ equal to 0.68 optical density units (ODU). Above 0.68 EOP at A ₆₂₀ , a slight bend is observed. Therefore, for the test for determining the functional activity of the classical pathway of activation of the complement system, we selected the concentration of erythrocytes E (A), which in a volume of 100 μl in a well of a 96-well plate gives an optical density equal to 0.68, which corresponds to 0.5% of the concentration of erythrocytes (0 , 5 × 10 ⁷ cells / ml). To determine the degree of erythrocyte lysis, we proposed a calibration graph (Fig. 2), where the degree of erythrocyte lysis is assessed by the decrease in optical density at a wavelength of 620 nm. The optical density of the control of human erythrocytes for spontaneous lysis (25 μl 2% E (A) + 75 μl VBS ²⁺ ) is taken as 0% lysis, respectively, the optical density of the control for complete lysis (25 μl 2% E (A ) + 75 μL H ₂ O).

Как видно из фиг.2, построение калибровочного графика по 2 точкам и 7 точкам, полученным прогрессивным разбавлением суспензии эритроцитов человека, практически совпадают. Разброс максимальный в области 50% лизиса, но меньше 5%, что вполне допустимо для расчета степени лизиса эритроцитов при активации комплемента.As can be seen from figure 2, the construction of the calibration graph for 2 points and 7 points, obtained by progressive dilution of the suspension of human erythrocytes, practically coincide. The spread is maximum in the area of 50% lysis, but less than 5%, which is quite acceptable for calculating the degree of erythrocyte lysis during complement activation.

Таким образом, калибровочный график позволяет определять методом турбидиметрии степень лизиса эритроцитов человека в процентах по оптической плотности пробы без стадии центрифугирования и измерения гемоглобина в супернатанте и последующего расчета степени лизиса эритроцитов, что существенно упрощает регистрацию результатов анализа функциональной активности классического пути системы комплемента в рутинных исследованиях. Определение степени лизиса эритроцитов методом турбидиметрии также позволяет проводить кинетические исследования функциональной активности комплемента, т.е. исследования комплемент-опосредованного лизиса эритроцитов во времени без остановки реакции для измерения степени лизиса.Thus, the calibration graph makes it possible to determine the degree of lysis of human erythrocytes by turbidimetry as a percentage of the optical density of the sample without the stage of centrifugation and measurement of hemoglobin in the supernatant and subsequent calculation of the degree of erythrocyte lysis, which greatly simplifies the registration of the results of the analysis of the functional activity of the classical pathway of the complement system in routine studies. Determination of the degree of erythrocyte lysis by turbidimetry also allows kinetic studies of the functional activity of complement, i.e. studies of complement-mediated lysis of erythrocytes in time without stopping the reaction to measure the degree of lysis.

Определение оптимальной концентрации моноклональных анти-А IgM антител для активации комплемента по классическому пути. Предварительно моноклональные IgM анти-А антитела по 25 мкл прогрессивно разводят в иммунологических планшетах с плоским дном, затем добавляют по 25 мкл буфера VBS²⁺, пулированной сыворотки крови человека и 2% суспензии Е(А) человека. После тщательного перемешивания измеряют мутность проб при А₆₂₀ (0 мин) и инкубируют в течение 30 мин при 37°С. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (25 мкл Е(А) + 75 мкл VBS²⁺); 2 - Контроль на полный лизис (25 Е(А) + 75 мкл Н₂О). Степень лизиса Е(А) в % определяли по графику (фиг.2), где контроль Е(А) на спонтанный лизис представляет 0% лизис, а контроль на полный лизис - 100% лизис. Полученные результаты представлены на фиг.3. Как видно на фиг.3, максимальный лизис эритроцитов человека группы А наблюдается при разведении анти-А моноклональных IgM антител от 32 до 256. При дальнейшем разведении анти-А моноклональных IgM антител наблюдается снижение лизиса. При разведении 1024 раз - полное отсутствие лизиса.Determination of the optimal concentration of monoclonal anti-A IgM antibodies for complement activation by the classical pathway. Preliminarily, monoclonal IgM anti-A antibodies are progressively diluted in 25 μl of immunological plates with a flat bottom, then 25 μl of VBS ²⁺ buffer, pooled human blood serum and 2% suspension of human E (A) are added. After thorough mixing, the turbidity of the samples is measured at A ₆₂₀ (0 min) and incubated for 30 min at 37 ° C. As a control, use: 1 - control of erythrocytes for spontaneous lysis (25 μl E (A) + 75 μl VBS ²⁺ ); 2 - Control for complete lysis (25 E (A) + 75 μl H ₂ O). The degree of lysis E (A) in% was determined from the graph (Fig. 2), where control E (A) for spontaneous lysis represents 0% lysis, and control for complete lysis represents 100% lysis. The results are shown in Fig. 3. As can be seen in figure 3, the maximum lysis of human erythrocytes of group A is observed when dilution of anti-A monoclonal IgM antibodies from 32 to 256. With further dilution of anti-A monoclonal IgM antibodies, a decrease in lysis is observed. At a dilution of 1024 times, there is no lysis at all.

Таким образом, нами в дальнейших исследованиях использовано разведение в 128 раз исходного препарата анти-А моноклональных IgM антител в тестируемых пробах.Thus, in our further studies, we used a 128-fold dilution of the original preparation of anti-A monoclonal IgM antibodies in the tested samples.

Титрование пулированной сыворотки крови человека на функциональную активность классического пути системы комплемента методом турбидиметрии. Предварительно от 10 до 25 мкл пулированной сыворотки крови от 10 здоровых доноров вносят в лунки иммунологических планшет с плоским дном, затем объем в каждой пробе доводят до 50 мкл буфером VBS²⁺. В разведенные сыворотки вносят по 50 мкл 1% эритроцитов человека А группы, сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами (Е(А)мА/Т (конечный объем гемолитической системы 100 мкл), тщательно перемешивают и измеряют мутность проб при 620 нм (0 мин) на фотометре для ИФА. Затем инкубируют в течение 30 мин при 37°С. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (50 мкл Е(А)мА/Т + 50 мкл VBS²⁺); 2 - контроль на полный лизис (50 Е(А)мА/Т + 50 мкл Н₂О). После инкубации тщательно перемешивают, измеряют мутность проб и определяют степень лизиса эритроцитов в % по калибровочному графику (фиг. 2), где контроль эритроцитов на спонтанный лизис принимают за 0% лизиса, контроль на полный лизис представляет 100% лизис. Полученные результаты представлены на фиг. 4. Как видно из фиг. 4, степень лизиса от 62 до 95% зависит линейно от концентрации сыворотки в гемолитической системе при инкубации в течение 30 мин.Titration of pooled human blood serum for functional activity of the classical pathway of the complement system by turbidimetry. Preliminarily, 10 to 25 μl of pooled blood serum from 10 healthy donors is added to the wells of a flat-bottomed immunological plate, then the volume in each sample is adjusted to 50 μl with VBS ²⁺ buffer. 50 μl of 1% human A group erythrocytes sensitized with anti-A monoclonal IgM antibodies (E (A) mA / T (final volume of the hemolytic system 100 μl)) are added to the diluted sera, mix thoroughly and the turbidity of the samples is measured at 620 nm (0 min ) on a photometer for ELISA. Then incubated for 30 min at 37 ° C. As a control, use: 1 - control of erythrocytes for spontaneous lysis (50 μl E (A) mA / T + 50 μl VBS ²⁺ ); 2 - control for complete lysis (50 E (A) mA / T + 50 μl H ₂ O). After incubation, mix thoroughly, measure the turbidity of the samples and determine the degree of erythrocyte lysis in% according to the calibration graph (Fig. 2), where the control of erythrocytes for spontaneous lysis taken as 0% lysis, complete lysis control represents 100% lysis The results are shown in Fig. 4. As can be seen from Fig. 4, the degree of lysis from 62 to 95% depends linearly on the serum concentration in the hemolytic system during incubation for 30 min.

Таким образом, для дальнейших исследований использовали 12,5 мкл сыворотки в тест-системе, содержащей 0,5% суспензию группы А эритроцитов человека, сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами.Thus, for further studies, 12.5 μl of serum was used in a test system containing a 0.5% suspension of group A of human erythrocytes sensitized with anti-A monoclonal IgM antibodies.

Определение оптимального времени инкубации для определения функциональной активности системы комплемента. К 12,5 мкл сыворотки крови добавляют 37,5 мкл буфера VBS²⁺ и 50 мкл 1% суспензии Е(А)мАт) в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 30 минут при 37°С при постоянном перемешивании. В процессе инкубации измеряют оптическую плотность проб на фотометре Multiscan FC с блоком термостатирования и шейкером, при длине волны 620 нм через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (50 мкл Е(А)мАт + 50 мкл VBS²⁺); 2 - Контроль на полный лизис (50 Е(А)мАт + 50 мкл Н₂О). Степень лизиса Е(А)мАт в % определяют, как описано выше. Полученные результаты представлены на фиг. 5. Как видно на фиг. 5, максимальный лизис наблюдается первые 15 мин и при дальнейшей инкубации увеличение степени гемолиза зависит от величины 10-ти минутной инкубации. То есть, при высоком лизисе на 10 минуте инкубации продолжение инкубации незначительно увеличивает гемолиз. При слабом гемолизе на 10 минуте инкубации, дальнейшая инкубация приводит к более высокому гемолизу.Determination of the optimal incubation time to determine the functional activity of the complement system. To 12.5 μl of blood serum, 37.5 μl of VBS ²⁺ buffer and 50 μl of 1% suspension of E (A) mAb) are added to the wells of 96-well flat-bottomed plates for enzyme-linked immunosorbent assay. Mix thoroughly and incubate for 30 minutes at 37 ° C with constant stirring. During incubation, the optical density of the samples is measured on a Multiscan FC photometer with a thermostatting unit and a shaker, at a wavelength of 620 nm after 5, 10, 15, 20, 25 and 30 minutes. As a control, use: 1 - control of erythrocytes for spontaneous lysis (50 μl E (A) mAb + 50 μl VBS ²⁺ ); 2 - Control for complete lysis (50 E (A) mAb + 50 μl H ₂ O). The degree of lysis of E (A) mAb in% is determined as described above. The results are shown in FIG. 5. As seen in FIG. 5, the maximum lysis is observed for the first 15 minutes, and with further incubation, the increase in the degree of hemolysis depends on the value of the 10-minute incubation. That is, with high lysis at 10 minutes of incubation, continuation of incubation slightly increases hemolysis. With weak hemolysis at 10 minutes of incubation, further incubation leads to higher hemolysis.

Таким образом, оптимальным временем инкубации данной гемолитической системы является 15-ти минутная инкубация при 37°С.Thus, the optimal incubation time for this hemolytic system is 15 minutes incubation at 37 ° C.

Примеры осуществления.Examples of implementation.

Пример 1. Определение функциональной активности классического пути системы комплемента в сыворотках крови относительно здоровых лиц.Example 1. Determination of the functional activity of the classical pathway of the complement system in the blood serum of relatively healthy individuals.

К 12,5 мкл сыворотки крови добавляют 37,5 мкл буфера VBS²⁺ и 50 мкл 1% Е(А)мАт (эритроциты человека с группой А, сенсибилизированные моноклональными анти-А IgM антителами), в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 15 минут при 37°С при постоянном перемешивании. Степень лизиса Е(А)мАт в % определяют, как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице 1.To 12.5 μl of blood serum add 37.5 μl of VBS ²⁺ buffer and 50 μl of 1% E (A) mAb (human erythrocytes with group A sensitized with monoclonal anti-A IgM antibodies) into the wells of 96-well flat-bottomed plates for enzyme immunoassay. Mix thoroughly and incubate for 15 minutes at 37 ° C with constant stirring. The degree of lysis of E (A) mAb in% is determined as described above. The results are shown in Table 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, в 3 пробах из 30 (10%) определяется повышенная функциональная активность системы комплемента (степень лизиса более или равно 60%). В 12 пробах (40%) - нормальная активность системы комплемента (степень лизиса от 31 до 59%). В остальных 15 пробах (50%) наблюдается пониженная функциональная активность системы комплемента (степень лизиса менее 30%).As can be seen from the data presented in table 1, in 3 samples out of 30 (10%), an increased functional activity of the complement system is determined (the degree of lysis is more than or equal to 60%). In 12 samples (40%) - normal activity of the complement system (degree of lysis from 31 to 59%). In the remaining 15 samples (50%), a reduced functional activity of the complement system is observed (the degree of lysis is less than 30%).

Пример 2. Сравнительные исследования функциональной активности классического пути системы комплемента предлагаемым методом и прототипом.Example 2. Comparative studies of the functional activity of the classical pathway of the complement system by the proposed method and prototype.

Проведены сравнительные исследования функциональной активности классического пути системы комплемента предлагаемым методом и прототипом.Comparative studies of the functional activity of the classical pathway of the complement system by the proposed method and prototype have been carried out.

Определения функциональной активности классического пути комплемента предлагаемым методом проводили как описано выше.Determination of the functional activity of the classical complement pathway by the proposed method was carried out as described above.

Определение функциональной активности классического пути активации системы комплемента по прототипу проводили следующим образом. К 8 мкл сыворотки крови, разведенной 1:7 буфером VBS²⁺, добавляли 42 мкл буфера VBS²⁺ и 50 мкл стандартизированных (1,5x10⁸ кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) в лунки иммунологических 96-ти луночных плоскодонных планшет для ИФА. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 10 минут при 37°С при постоянном перемешивании. Степень лизиса ЕА в % определяли по калибровочному графику зависимости оптической плотности А620 от лизиса эритроцитов барана. Полученные результаты представлены в таблице 2.Determination of the functional activity of the classical pathway of activation of the complement system according to the prototype was carried out as follows. To 8 μl of blood serum diluted 1: 7 with VBS ²⁺ buffer, 42 μl of VBS ²⁺ buffer and 50 μl of standardized (1.5x10 ⁸ cells / ml) ram erythrocytes sensitized with rabbit antibodies (EA) were added into the wells of immunological 96 well flat-bottomed plate for ELISA. Mix thoroughly and incubate for 10 minutes at 37 ° C with constant stirring. The degree of EA lysis in% was determined by the calibration graph of the dependence of the optical density of A620 on the lysis of sheep erythrocytes. The results are shown in Table 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, анализ функциональной активности системы комплемента по классическому пути с использованием прототипа выявляет в 6 пробах (20%) из тестированных 30 проб сыворотки пониженную (<50%) активность и в 3 пробах (10%) повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента (>80%). Причем повышенная гемолитическая активность в 100% совпала по двум методам. Наибольшее расхождение (почти 2 с липшим раза) наблюдается в группе с низкой активностью комплемента. Данный факт можно объяснить влиянием ингибиторов комплемента при использовании 12,5% сыворотки в тестах, т.е. в прототипе концентрация сыворотки составляет всего 1%, что приводит к снижению их роли при проведении гемолитического теста с одной стороны. И отсутствие ингибитора мембрано-атакующего комплекса (CD59) на поверхности эритроцитов барана делает их более чувствительными к комплемент-опосредованному лизису.As can be seen from the data presented in table 2, the analysis of the functional activity of the complement system along the classical path using the prototype reveals in 6 samples (20%) of the tested 30 serum samples a reduced (<50%) activity and in 3 samples (10%) an increased functional activity of the classical pathway of the complement system (> 80%). Moreover, the increased hemolytic activity in 100% coincided by two methods. The largest discrepancy (almost 2 times sticky) is observed in the group with low complement activity. This fact can be explained by the effect of complement inhibitors when using 12.5% serum in tests, i.e. in the prototype, the serum concentration is only 1%, which leads to a decrease in their role in the hemolytic test on the one hand. And the absence of an inhibitor of the membrane-attacking complex (CD59) on the surface of sheep erythrocytes makes them more sensitive to complement-mediated lysis.

Таким образом, предлагаемый способ определения и прогнозирования функциональной активности классического пути активации системы комплемента является более информативным при выявлении сниженной активности данного пути активации комплемента. Дальнейшие исследования функциональной активности классического пути системы комплемента у больных с аутоиммунными заболеваниями, связанными солюбилизацией и элиминацией иммунных комплексов (болезни иммунных комплексов, включающие ревматоидный артрит, системную красную волчанку, гломерулонефрит) позволят как контролировать эффективность проводимой терапии, так и на ранних, доклинических стадиях, выявлять скрытое течение заболеваний.Thus, the proposed method for determining and predicting the functional activity of the classical pathway of activation of the complement system is more informative in identifying reduced activity of this pathway of complement activation. Further studies of the functional activity of the classical pathway of the complement system in patients with autoimmune diseases associated with solubilization and elimination of immune complexes (diseases of immune complexes, including rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, glomerulonephritis) will allow both to control the effectiveness of the therapy, and in the early, preclinical stages, to reveal the latent course of diseases.

Повышенная функциональная активность классического пути системы комплемента свидетельствует о наличии воспалительного состояния в организме человека и является прогностическим маркером тяжести системной воспалительной реакции при COVID-19 инфекции. Данное предположение также подтверждается результатами исследования титра анти-COVID-19 антител, где убедительно показано прямая зависимость тяжести ОРДС от концентрации этих антител [Holier J.C., Pischke S.E., Eline de Boer, Andreas Lind et al. Systemic complement activation is associated with respiratory failure in COVID-19 hospitalized patients // Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Oct 6; 117(40):25018-25025. doi: 10.1073/pnas.2010540117; Noris M, Benigni A, Remuzzi G. The case of complement activation in COVID-19 multiorgan impact. Kidney Int. 2020 Aug;98(2):314-322. doi: 10.1016/j.kint.2020.05.013. Epub 2020 May 24.PMID: 32461141; Ma L, Sahu SK, Cano M, Kuppuswamy V. et al. Increased complement activation is a distinctive feature of severe SARS-CoV-2 infection // bioRxiv. 2021 Feb 23:2021.02.22.432177. doi: 10.1101/2021.02.22.432177; Vitiello A, La Porta R, D'Aiuto V, Ferrara F. Pharmacological approach for the reduction of inflammatory and prothrombotic hyperactive state in COVID-19 positive patients by acting on complement cascade // Hum Immunol. 2021 Jan 20:S0198-8859(21)00014-8. doi: 10.1016/j.humimm.2021.01.007]. Повышенный уровень антител с высокой эффекторной (комплемент-активирующей) функцией является причиной неконтролируемой активации системы комплемента по классическому пути и как итог - полиорганная недостаточность. Раннее выявление лиц с повышенной функциональной активностью классического пути системы комплемента позволит сформировать группу риска при COVID-19 инфекции и тем самым снизить тяжесть течения ОРДС путем использования Экулизумаба, моноклональных антител к С5 компоненту системы комплемента.The increased functional activity of the classical pathway of the complement system indicates the presence of an inflammatory condition in the human body and is a prognostic marker of the severity of the systemic inflammatory response in COVID-19 infection. This assumption is also confirmed by the results of a study of the titer of anti-COVID-19 antibodies, which convincingly showed a direct dependence of the severity of ARDS on the concentration of these antibodies [Holier J.C., Pischke S.E., Eline de Boer, Andreas Lind et al. Systemic complement activation is associated with respiratory failure in COVID-19 hospitalized patients // Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Oct 6; 117 (40): 25018-25025. doi: 10.1073 / pnas.2010540117; Noris M, Benigni A, Remuzzi G. The case of complement activation in COVID-19 multiorgan impact. Kidney Int. 2020 Aug; 98 (2): 314-322. doi: 10.1016 / j.kint.2020.05.013. Epub 2020 May 24. PMID: 32461141; Ma L, Sahu SK, Cano M, Kuppuswamy V. et al. Increased complement activation is a distinctive feature of severe SARS-CoV-2 infection // bioRxiv. 2021 Feb 23: 2021.02.22.432177. doi: 10.1101 / 2021.02.22.432177; Vitiello A, La Porta R, D'Aiuto V, Ferrara F. Pharmacological approach for the reduction of inflammatory and prothrombotic hyperactive state in COVID-19 positive patients by acting on complement cascade // Hum Immunol. 2021 Jan 20: S0198-8859 (21) 00014-8. doi: 10.1016 / j.humimm.2021.01.007]. An increased level of antibodies with a high effector (complement-activating) function is the cause of uncontrolled activation of the complement system along the classical pathway and, as a result, multiple organ failure. Early detection of individuals with increased functional activity of the classical pathway of the complement system will form a risk group for COVID-19 infection and thereby reduce the severity of ARDS by using Eculizumab, a monoclonal antibody to the C5 component of the complement system.

Claims

A method for determining the functional activity of the classical pathway of the human complement system to predict the severity of the course of a systemic inflammatory reaction by carrying out the lysis reaction of human erythrocytes of group A [E (A)] with human blood serum, characterized in that 12.5% human blood serum is used, 0.5 % suspension of E (A) sensitized with anti-A monoclonal IgM antibodies [E (A) mAb] under the conditions of Veronal saline buffer VBS ²⁺ at 37.0 ± 0.5 ° C, incubated for 15 min, complement reaction dependent lysis of E (A) mAb is estimated turbidimetrically by the decrease in the optical density of the E (A) mAb suspension at a wavelength of 620 nm, a calibration graph of the dependence of the optical density A ₆₂₀ on lysis of human erythrocytes is plotted, which determines the degree of erythrocyte lysis in experimental samples, where for 0% lysis take the optical density of the control E (A) mAb, for spontaneous lysis, when using 50 μl 1% E (A) mAb and 50 μl VBS ²⁺ , respectively, for 100% lysis The optical density of the control for complete lysis is measured using 50 μl of 1% E (A) mAb and 50 μl of H ₂ O, while the increased functional activity of the classical pathway of the complement system is noted with a degree of lysis of more than 60%, with a degree of lysis from 31% to 59% as normal and with a degree of lysis less than 30% as decreased functional activity of the classical pathway of the complement system.