RU2755493C1 - Method for evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes - Google Patents

Method for evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes Download PDF

Info

Publication number
RU2755493C1
RU2755493C1 RU2021105730A RU2021105730A RU2755493C1 RU 2755493 C1 RU2755493 C1 RU 2755493C1 RU 2021105730 A RU2021105730 A RU 2021105730A RU 2021105730 A RU2021105730 A RU 2021105730A RU 2755493 C1 RU2755493 C1 RU 2755493C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
monocytes
pro
inflammatory activity
diameter
suspension
Prior art date
Application number
RU2021105730A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Елена Федоровна Васильева
Олег Сергеевич Брусов
Татьяна Петровна Секирина
Зоя Викторовна Сарманова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр психического здоровья"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр психического здоровья" filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр психического здоровья"
Priority to RU2021105730A priority Critical patent/RU2755493C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2755493C1 publication Critical patent/RU2755493C1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention relates to the field of medicine. A method for evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes involves the isolation of monocytes as part of mononuclear cells from peripheral venous blood by centrifugation in a density gradient of ficoll-urografin, followed by layering in Petri dishes, separation of stuck cells and their diluting, analysis of the obtained monocyte suspension. In this case, samples are prepared by diluting and mixing the resulting suspension of monocytes in an isotonic solution. The number of monocytes with a diameter of 9 to 15 mcm and the number of monocytes with a diameter of 12.5 to 15 mcm are counted in them by means of a cell counter. Then the index of pro-inflammatory activity of monocytes is calculated as its criterion as a percentage of the number of monocytes with a diameter of 12.5 to 15 mcm to the number of monocytes with a diameter of 9 to 15 mcm. As its final value, the average value of the index of pro-inflammatory activity of monocytes obtained as a result of at least twice counting the number of monocytes in each sample is used.
EFFECT: simplifies the method and reduces its complexity while maintaining the reliability of the results of evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes.
3 cl, 3 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к области клинической иммунологии, и может использоваться, например, в клинических исследованиях, направленных на определение роли моноцитов с провоспалительной активностью в развитии различных заболеваний.The invention relates to medicine, and more specifically to the field of clinical immunology, and can be used, for example, in clinical studies aimed at determining the role of monocytes with pro-inflammatory activity in the development of various diseases.

Моноциты являются наиболее крупными клетками крови (диаметр около 9-15 мкм) и выполняют в организме важные функции. Они состоят по крайней мере из двух фенотипически различных субпопуляций, которые обладают различными видами активности, например, фагоцитарной активностью («классические моноциты» с фенотипом CD14++/CD16-), или антигенпредставляющей и провоспалительной активностью («неклассические моноциты» с фенотипом CD14+/CD16+). При этом у здоровых людей CD14++/CD16- моноциты составляют более 95% моноцитов периферической крови, а субпопуляция моноцитов с фенотипом CD14+/CD16+ составляет соответственно около 5%.Monocytes are the largest blood cells (about 9-15 microns in diameter) and perform important functions in the body. They consist of at least two phenotypically distinct subpopulations that have different types of activity, for example, phagocytic activity ("classic monocytes" with the CD14 ++ / CD16 - phenotype), or antigen-presenting and pro-inflammatory activity ("non-classical monocytes" with the CD14 + phenotype / CD16 + ). At the same time, in healthy people, CD14 ++ / CD16 - monocytes make up more than 95% of peripheral blood monocytes, and the subpopulation of monocytes with the CD14 + / CD16 + phenotype is, respectively, about 5%.

Известны различные способы оценки активности моноцитов, включающие операции, связанные с выделением моноцитов из периферической крови и их последующим анализом.There are various methods for assessing the activity of monocytes, including operations associated with the isolation of monocytes from peripheral blood and their subsequent analysis.

Методы выделения моноцитов из крови достаточно разнообразны, но основные методические приемы преимущественно связаны с выделением моноцитов в составе мононуклеарных клеток центрифугированием в градиенте плотности с последующим фракционированием чистой популяции моноцитов, основанным на способности моноцитов прилипать к стеклу или пластиковой поверхности (например, Ковальчук Л.В. и др. Иммунология. Практикум. М., «ГЕОТАР-Медиа», 2010, с. 27-28).Methods for isolating monocytes from blood are quite diverse, but the main methodological techniques are mainly associated with the isolation of monocytes in the composition of mononuclear cells by centrifugation in a density gradient with subsequent fractionation of a pure population of monocytes, based on the ability of monocytes to adhere to glass or a plastic surface (for example, Kovalchuk L.V. and other Immunology. Practicum. M., "GEOTAR-Media", 2010, pp. 27-28).

Методы анализа активности моноцитов также разнообразны и связаны с оценкой функционального состояния разных субпопуляций моноцитов.Methods for analyzing the activity of monocytes are also diverse and are associated with the assessment of the functional state of different subpopulations of monocytes.

Известен, например, способ оценки фагоцитарной активности моноцитов крови человека, в котором из суспензии мононуклеарных клеток, выделяемых из венозной крови человека в градиенте плотности фиколл-верографина, с использованием прилипания к стеклу получают препарат моноцитов, инкубируют с опсонизированными частицами зимозана, окрашивают по Романовскому, микроскопируют в световом микроскопе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток и по их количеству, равному 94,8±4,7%, определяют функциональное состояние моноцитов крови как нормальное (RU 2089899 С1, 1997). Способ позволяет оценить функциональное состояние моноцитов крови здоровых людей и его нарушение при патологии. Однако этот способ не позволяет определить количество моноцитов с провоспалительной активностью, которые осуществляют в организме воспалительные реакции и участвуют в механизмах развития хронического иммунного воспаления.There is, for example, a method for assessing the phagocytic activity of human blood monocytes, in which a monocyte preparation is obtained from a suspension of mononuclear cells isolated from human venous blood in a ficoll-verographin density gradient using adhesion to glass, incubated with opsonized zymosan particles, stained according to Romanovsky, microscoped in a light microscope, the percentage of phagocytic cells is calculated and, according to their number, equal to 94.8 ± 4.7%, the functional state of blood monocytes is determined as normal (RU 2089899 C1, 1997). The method allows to assess the functional state of blood monocytes of healthy people and its impairment in pathology. However, this method does not allow determining the number of monocytes with pro-inflammatory activity, which carry out inflammatory reactions in the body and are involved in the mechanisms of the development of chronic immune inflammation.

Известны способы оценки провоспалительной активности моноцитов, основанные преимущественно на измерении количества моноцитов с фенотипом CD14+/CD16+ методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител у здоровых людей и у больных с разными соматическими заболеваниями (например, Waschbisch A. et al. Pivotal Role for CD16+ Monocytes in Immune Surveillance of the Central Nervous System. «The Journal of Immunology», 2016, v. 196, №4, p. 1558-1567). Основной недостаток этих способов заключается в их высокой трудоемкости и необходимости использования сложного дорогостоящего оборудования.Known methods for assessing the pro-inflammatory activity of monocytes, based mainly on measuring the number of monocytes with the CD14 + / CD16 + phenotype by flow cytometry using monoclonal antibodies in healthy people and in patients with various somatic diseases (for example, Waschbisch A. et al. Pivotal Role for CD16 + Monocytes in Immune Surveillance of the Central Nervous System. The Journal of Immunology, 2016, v. 196, no. 4, p. 1558-1567). The main disadvantage of these methods is their high labor intensity and the need to use complex expensive equipment.

Из известных способов наиболее близким к предложенному является способ оценки провоспалительной активности моноцитов, включающий выделение моноцитов в составе мононуклеарных клеток из периферической венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина с последующим наслаиванием в чашки Петри, отделением прилипших клеток и их разведением, и проведение анализа полученной взвеси моноцитов (Васильева Е.Ф. и др. Оценка уровня субпопуляции моноцитов CD14+/CD16+ у больных с юношескими депрессиями. «Медицинская иммунология», 2019, т. 21, №2, с. 257-268). В этом способе выделенные центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографина мононуклеарные клетки разводят в питательной среде 1640 с глутаматом (ПанЭко, РФ). Взвесь мононуклеарных клеток наслаивают в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм (Nunclon, Delta, Denmark) и инкубируют в CO2 инкубаторе до концентрации 5×106/мл при температуре 37°С в течение 1 часа, затем сливают надосадочную жидкость, а прикрепившиеся клетки (моноциты) открепляют со дна чашки Петри с помощью охлажденного раствора Версена (ПанЭко) в течение 20 минут. Полученные клетки отмывают средой 1640 с добавлением 10% FCS (Serva, USA) и разводят до концентрации 1.106/мл в среде 1640. Полученную таким образом взвесь моноцитов используют для последующего анализа. При этом проводят фенотипирование методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител CD16-FITCH и CD14-PE, которые добавляют к выделенным моноцитам. Цитофлуориметрический анализ выполняют на проточном лазерном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, USA), оценивая уровень субпопуляции моноцитов с провоспалительной активностью с фенотипом CD14+/CD16+. Уровень моноцитов с провоспалительной активностью оценивают в процентах относительно общего количества моноцитов, которое принимают за 100%.Of the known methods, the closest to the proposed one is a method for assessing the pro-inflammatory activity of monocytes, including the isolation of monocytes in the composition of mononuclear cells from peripheral venous blood by centrifugation in a density gradient of ficoll-urografin followed by layering in Petri dishes, separating adhered cells and their dilution, and conducting an analysis the obtained suspension of monocytes (Vasilyeva EF et al. Assessment of the level of the subpopulation of monocytes CD14 + / CD16 + in patients with juvenile depression. "Medical Immunology", 2019, vol. 21, No. 2, pp. 257-268). In this method, mononuclear cells isolated by centrifugation in a density gradient of ficoll-urografin are diluted in 1640 nutrient medium with glutamate (PanEko, RF). A suspension of mononuclear cells is layered into plastic Petri dishes 60 mm in diameter (Nunclon, Delta, Denmark) and incubated in a CO 2 incubator to a concentration of 5 × 10 6 / ml at 37 ° C for 1 hour, then the supernatant is decanted, and the adherent cells (monocytes) are detached from the bottom of the Petri dish using chilled Versene solution (PanEco) for 20 minutes. The resulting cells are washed with medium 1640 with the addition of 10% FCS (Serva, USA) and diluted to a concentration of 1.10 6 / ml in medium 1640. The thus obtained suspension of monocytes is used for subsequent analysis. In this case, phenotyping is carried out by flow cytometry using monoclonal antibodies CD16 - FITCH and CD14-PE, which are added to the isolated monocytes. Cytofluorometric analysis is performed on an FC-500 laser flow cytometer (Beckman Coulter, USA), assessing the level of a subpopulation of monocytes with proinflammatory activity with the CD14 + / CD16 + phenotype. The level of monocytes with pro-inflammatory activity is estimated as a percentage relative to the total number of monocytes, which is taken as 100%.

Этот способ позволяет оценивать провоспалительную активность моноцитов. Однако он является сложным, имеет высокую трудоемкость и требует использования дорогостоящего и сложного в настройке оборудования, для обслуживания которого и работы на нем необходима высокая квалификация оператора. Проточный цитофлуориметр требует проведения его первоначальной настройки с участием представителя фирмы-изготовителя. Работа на нем также требует проведения до начала анализа каждого образца трудоемких настроек программного обеспечения. Для проведения анализа на проточном цитофлуориметре необходима пробоподготовка для каждого образца, занимающая определенное время (до 20 минут). Для оценки количества провоспалительных моноцитов CD14+/CD16+ необходимо использование по крайней мере двух видов моноклональных антител и сопутствующих реактивов. При этом моноклональные антитела обладают невысоким сроком годности, что дополнительно ограничивает возможности проведения анализа. Сам же анализ на проточном цитофлуориметре состоит из достаточно сложных манипуляций.This method makes it possible to assess the pro-inflammatory activity of monocytes. However, it is complex, has a high labor intensity and requires the use of expensive and difficult to configure equipment, for the maintenance of which and work on it, a high qualification of the operator is required. The flow cytometer requires initial setup with a representative from the manufacturer. It also requires time-consuming software tweaks to be performed prior to analyzing each sample. For analysis on a flow cytometer, sample preparation is required for each sample, which takes a certain time (up to 20 minutes). To assess the number of pro-inflammatory CD14 + / CD16 + monocytes, at least two types of monoclonal antibodies and related reagents must be used. At the same time, monoclonal antibodies have a short shelf life, which additionally limits the possibilities of analysis. The analysis itself on a flow cytometer consists of rather complex manipulations.

Техническая проблема, решаемая изобретением, заключается в создании способа оценки провоспалительной активности моноцитов, лишенного недостатков прототипа. Технический результат изобретения состоит в упрощении способа и снижении его трудоемкости при сохранении высокой достоверности результатов оценки провоспалительной активности моноцитов (на уровне способа-прототипа).The technical problem solved by the invention is to create a method for assessing the pro-inflammatory activity of monocytes, devoid of the disadvantages of the prototype. The technical result of the invention consists in simplifying the method and reducing its labor intensity while maintaining high reliability of the results of assessing the pro-inflammatory activity of monocytes (at the level of the prototype method).

Это достигается тем, что в способе оценки провоспалительной активности моноцитов, включающем выделение моноцитов в составе мононуклеарных клеток из периферической венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина с последующим наслаиванием в чашки Петри, отделением прилипших клеток и их разведением, и проведение анализа полученной взвеси моноцитов, провоспалительную активность моноцитов оценивают по количеству моноцитов больших размеров, при этом готовят пробы путем разведения и перемешивания полученной взвеси моноцитов в изотоническом растворе, подсчитывают в них посредством счетчика клеток количество моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм и количество моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм, и рассчитывают индекс провоспалительной активности моноцитов в качестве ее критерия как процентное отношение количества моноцитов диаметром от 12,5 до 15 мкм к количеству моноцитов диаметром от 9 до 15 мкм, а в качестве его окончательного значения используют среднее значение индекса провоспалительной активности моноцитов, полученного в результате по меньшей мере двукратного подсчета количества моноцитов в каждой пробе. Для разведения подготовленной для анализа взвеси моноцитов преимущественно отбирают 100 мкл взвеси, которую добавляют к 10 мл изотонического раствора для разведения проб Isoton в кюветах объемом 20 мл из комплекта счетчика клеток. В качестве счетчика клеток преимущественно используют автоматический счетчик Культера, настроенный на выявление клеток диаметром от 9 до 15 мкм.This is achieved by the fact that in a method for assessing the pro-inflammatory activity of monocytes, including the isolation of monocytes in the composition of mononuclear cells from peripheral venous blood by centrifugation in a density gradient of ficoll-urografin followed by layering in Petri dishes, separating adhered cells and their dilution, and analyzing the resulting suspension monocytes, the pro-inflammatory activity of monocytes is assessed by the number of large monocytes, while samples are prepared by diluting and mixing the resulting suspension of monocytes in an isotonic solution, the number of monocytes with a diameter of 9 to 15 μm and the number of monocytes with a diameter of 12 are counted in them using a cell counter, 5 to 15 μm, and the index of pro-inflammatory activity of monocytes is calculated as its criterion as the percentage of the number of monocytes with a diameter of 12.5 to 15 μm to the number of monocytes with a diameter of 9 to 15 μm, and the average value is used as its final value. calculation of the index of pro-inflammatory activity of monocytes, obtained as a result of at least two-fold counting of the number of monocytes in each sample. To dilute the monocyte suspension prepared for analysis, 100 μl of the suspension is preferably taken, which is added to 10 ml of isotonic solution for diluting Isoton samples in 20 ml cuvettes from the cell counter kit. As a cell counter, an automatic Coulter counter is used, which is configured to detect cells with a diameter of 9 to 15 μm.

Указанный технический результат обеспечивается всей совокупностью существенных признаков заявленного изобретения, каждый признак которой необходим, а вместе они достаточны для решения указанной технической проблемы и для достижения указанного технического результата.The specified technical result is provided by the entire set of essential features of the claimed invention, each feature of which is necessary, and together they are sufficient to solve the specified technical problem and to achieve the specified technical result.

Предложенный способ реализован следующим образом. Выделяют моноциты в составе мононуклеарных клеток (моноциты + лимфоциты) из периферической венозной крови больных и здоровых в градиенте плотности фиколл-урографина (ПанЭко). Полученные клетки разводят в питательной среде RPMI 1640 с L-глутамином (ПанЭко) до концентрации 5×106/мл. Взвесь мононуклеарных клеток наслаивают в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм (Nunclon, Delta), инкубируют в CO2 инкубаторе при температуре 37°С в течение 1 часа и отделяют прикрепившиеся ко дну чашки Петри моноциты путем добавления к ним охлажденного раствора Версена (ПанЭко) на 20 минут с последующим двойным отмыванием в центрифужных пробирках питательной средой 199 (ПанЭко) с добавлением 10% сыворотки FCS (Serva). Выделенные моноциты разводят питательной средой RPMI 1640 с L-глютамином до концентрации 1×106/мл. Разводят подготовленную для анализа взвесь моноцитов, для чего отбирают 100 мкл взвеси, которую добавляют к 10 мл изотонического раствора для разведения проб Isoton (Beckman Coulter) в кюветах (акуветтах) объемом 20 мл из комплекта счетчика клеток. Взвесь тщательно перемешивают. Для подсчета моноцитов кюветы помещают в автоматический счетчик Культера MS4e (Beckman Coulter), настроенный на выявление клеток диаметром от 9 до 15 мкм. Подсчитывают общее количество моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм и количество больших моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм. Подсчет в каждой пробе проводят по меньше мере два раза (преимущественно два-три раза). Рассчитывают индекс провоспалительной активности моноцитов как процентное отношение количества моноцитов диаметром от 12,5 до 15 мкм к количеству моноцитов диаметром от 9 до 15 мкм, а в качестве его окончательного значения используют среднее значение индекса провоспалительной активности моноцитов, полученного в результате по меньшей мере двукратного подсчета количества моноцитов в каждой пробе.The proposed method is implemented as follows. Monocytes are isolated as part of mononuclear cells (monocytes + lymphocytes) from the peripheral venous blood of patients and healthy people in a density gradient of ficoll-urografin (PanEco). The resulting cells are diluted in a nutrient medium RPMI 1640 with L-glutamine (PanEco) to a concentration of 5 × 10 6 / ml. A suspension of mononuclear cells is layered in plastic Petri dishes 60 mm in diameter (Nunclon, Delta), incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C for 1 hour, and monocytes adhered to the bottom of the Petri dish are separated by adding to them a chilled Versene solution (PanEco) on 20 minutes, followed by double washing in centrifuge tubes with nutrient medium 199 (PanEco) with the addition of 10% FCS serum (Serva). The isolated monocytes are diluted in a nutrient medium RPMI 1640 with L-glutamine to a concentration of 1 × 10 6 / ml. A suspension of monocytes prepared for analysis is diluted, for which 100 μl of the suspension is taken, which is added to 10 ml of isotonic solution for diluting Isoton samples (Beckman Coulter) in 20 ml cuvettes (acuvette) from the cell counter kit. The suspension is thoroughly mixed. For monocyte counting, the cuvettes are placed in an MS4e automatic Coulter counter (Beckman Coulter) configured to detect cells with a diameter of 9 to 15 μm. The total number of monocytes with a diameter of 9 to 15 µm and the number of large monocytes with a diameter of 12.5 to 15 µm are counted. Each sample is counted at least twice (preferably two to three times). The index of pro-inflammatory activity of monocytes is calculated as the percentage of the number of monocytes with a diameter of 12.5 to 15 μm to the number of monocytes with a diameter of 9 to 15 μm, and the average value of the index of pro-inflammatory activity of monocytes obtained as a result of at least two-fold counting is used as its final value. the number of monocytes in each sample.

Возможность оценки провоспалительной активности моноцитов с помощью критерия, основанного на подсчете в пробе относительного количества моноцитов с большим диаметром, обусловлена следующим. Известно, что моноциты распределяются по объему на три субпопуляции - малые, средние и большие и что эти субпопуляции обладают разными функциональными характеристиками (например, Arenson Е.В. Jr et al. Volumetric and Functional Heterogeneity of Human Monocytes. «The Journal of Clinical Investigation)), 1980, v.65, №3, p.613-618). Крупные моноциты (около 480 мкм3) в значительно большей степени, чем другие субпопуляции (малые и средние моноциты) в сумме, способны к направленной миграции в очаг воспаления (хемотаксису). Моноциты, обладающие способностью к хемотаксису, осуществляют воспалительные реакции и участвуют в механизмах развития хронического воспаления при различных системных заболеваниях, т.е. по существу могут быть отнесены к провоспалительным моноцитам с фенотипом CD14+/CD16+. Авторами изобретения проведены экспериментальные исследования по подсчету моноцитов с фенотипом CD14+ на автоматическом счетчике Культера. При этом выделяли общее количество моноцитов из пула мононуклеарных клеток в сильном магнитном поле с помощью специфичных к моноцитам моноклональных антител CD14, меченных магнитными частицами (метод магнитной сепарации). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при подсчете клеток на автоматическом счетчике Культера моноциты с фенотипом CD14+ распределяются по диаметру от 9 до 15 мкм, а в диапазоне от 12,5 до 15 мкм существует заметный пик больших моноцитов. Например, для донора N. получено: количество всех моноцитов диаметром 9-15 мкм составило 532, суммарное количество малых и средних моноцитов диаметром 9-12,5 мкм (субпопуляции М1 и М2) составило 496, количество больших моноцитов диаметром 12,5-15 мкм (субпопуляция М3) составило 36. Поэтому индекс провоспалительной активности оценен как (36÷532)×100%=6,8%. Таким образом, выбор указанных значений диаметра моноцитов обусловлен объективными и подтвержденными экспериментально обстоятельствами. Кроме того, установка соответствующих фиксированных значений диаметров при подсчете количества моноцитов обеспечивает однозначность трактовки результатов оценки их провоспалительной активности при обследовании пациентов с различным состоянием здоровья.The possibility of assessing the pro-inflammatory activity of monocytes using a criterion based on counting the relative number of monocytes with a large diameter in a sample is due to the following. It is known that monocytes are distributed in volume into three subpopulations - small, medium and large, and that these subpopulations have different functional characteristics (for example, Arenson E.V. Jr et al. Volumetric and Functional Heterogeneity of Human Monocytes. “The Journal of Clinical Investigation )), 1980, v. 65, no. 3, p. 613-618). Large monocytes (about 480 μm 3 ), to a much greater extent than other subpopulations (small and medium monocytes) in total, are capable of directed migration to the inflammation focus (chemotaxis). Monocytes, possessing the ability to chemotaxis, carry out inflammatory reactions and are involved in the mechanisms of the development of chronic inflammation in various systemic diseases, i.e. in essence can be classified as pro-inflammatory monocytes with the CD14 + / CD16 + phenotype. The authors of the invention carried out experimental studies on the counting of monocytes with the CD14 + phenotype on an automatic Coulter counter. The total number of monocytes was isolated from the pool of mononuclear cells in a strong magnetic field using monoclonal antibodies CD14 specific to monocytes, labeled with magnetic particles (magnetic separation method). The results obtained indicate that when counting cells on an automatic Coulter counter, monocytes with the CD14 + phenotype are distributed in diameter from 9 to 15 μm, and in the range from 12.5 to 15 μm there is a noticeable peak of large monocytes. For example, for donor N. received: the number of all monocytes with a diameter of 9-15 microns was 532, the total number of small and medium monocytes with a diameter of 9-12.5 microns (subpopulations M 1 and M 2 ) was 496, the number of large monocytes with a diameter of 12.5 -15 μm (subpopulation M 3 ) was 36. Therefore, the index of pro-inflammatory activity was estimated as (36 ÷ 532) × 100% = 6.8%. Thus, the choice of the indicated values of the diameter of monocytes is due to objective and experimentally confirmed circumstances. In addition, setting the corresponding fixed values of diameters when counting the number of monocytes ensures unambiguous interpretation of the results of assessing their pro-inflammatory activity when examining patients with different health conditions.

Процедура оценки активности моноцитов с использованием автоматического счетчика Культера является достаточно простой и не требует высокого уровня квалификации оператора. При этом не требуется применения дорогостоящих компонентов и сложных операций при подготовке к подсчету количества моноцитов в автоматическом счетчике Культера. Исследованиями авторов изобретения установлено, что оценка провоспалительной активности моноцитов предложенным способом обеспечивает достоверность результатов на уровне способа-прототипа.The procedure for assessing the activity of monocytes using an automatic Coulter counter is quite simple and does not require a high level of operator qualifications. This does not require the use of expensive components and complex operations in preparation for counting the number of monocytes in an automatic Coulter counter. The studies of the authors of the invention have found that the assessment of the pro-inflammatory activity of monocytes by the proposed method ensures the reliability of the results at the level of the prototype method.

Примеры. У 18-и больных юношеской депрессией мужского пола в возрасте от 17 до 23 лет проведен сравнительный анализ способа оценки провоспалительной активности моноцитов по измерению количества моноцитов с фенотипом CD14+/CD16+ (способ-прототип) и предложенного способа. Всех больных обследовали один раз до назначения им психотропной терапии. При этом определение процента провоспалительных моноцитов выполнено в разных вариантах - у больных в общей группе и в подгруппах больных с низким и высоким уровнем активных моноцитов, а также в группе здоровых лиц, возраст которых соответствовал возрасту больных. Статистические исследования проведены с использованием пакета программ Statistica, версия 10 (StatSoft Inc., USA). Для оценки достоверности различий между получаемыми показателями использован критерий малых выборок Стьюдента. Корреляционный анализ проведен с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Оценку статистической значимости связи между получаемыми показателями определяли по тесту Хи-квадрат и двустороннему критерию Фишера.Examples. A comparative analysis of the method for assessing the pro-inflammatory activity of monocytes by measuring the number of monocytes with the CD14 + / CD16 + phenotype (prototype method) and the proposed method was carried out in 18 male patients with juvenile depression aged 17 to 23 years. All patients were examined once before prescribing psychotropic therapy. At the same time, the percentage of pro-inflammatory monocytes was determined in different ways - in patients in the general group and in subgroups of patients with low and high levels of active monocytes, as well as in the group of healthy individuals whose age corresponded to the age of patients. Statistical studies were carried out using the Statistica software package, version 10 (StatSoft Inc., USA). To assess the reliability of differences between the obtained indicators, the Student's t test was used. Correlation analysis was carried out using Spearman's rank correlation coefficient. The assessment of the statistical significance of the relationship between the obtained indicators was determined by the Chi-square test and the two-sided Fisher's test.

Пример 1. Определялся уровень провоспалительной активности моноцитов в общей группе с количеством больных 18. При использовании способа-прототипа индекс провоспалительной активности составил 7,8±0,95%, при использовании предложенного способа - 7,7±1,1%. Статистическая обработка результатов подтвердила практическую идентичность полученных значений, поскольку значимые различия между средними значениями определяемых показателей обнаружены не были (р=0,6). Подтверждением идентичности полученных результатов послужило также выявление статистически значимой позитивной корреляции между соответствующими показателями (Spearman r=0,75, p<0,05).Example 1. Determined the level of pro-inflammatory activity of monocytes in the general group with the number of patients 18. When using the prototype method, the index of pro-inflammatory activity was 7.8 ± 0.95%, when using the proposed method - 7.7 ± 1.1%. Statistical processing of the results confirmed the practical identity of the obtained values, since no significant differences between the mean values of the determined indicators were found (p = 0.6). The identity of the results obtained was also confirmed by the identification of a statistically significant positive correlation between the corresponding indicators (Spearman r = 0.75, p <0.05).

Пример 2. Определялся уровень провоспалительной активности моноцитов в подгруппе 8-и больных с высоким уровнем активных моноцитов и подгруппе из 10-и больных с низким уровнем активных моноцитов. Индекс провоспалительной активности при определении способ-прототипом и предложенным способом составил для первой подгруппы 11,8±1,3 и 11,5±1,0 соответственно, а для второй подгруппы - 4,4±0,5 и 4,9±0,6 соответственно. Статистическая обработка подтвердила практическую одинаковость показателей для двух сравниваемых способов в обоих вариантах оценки. Значимые различия между средними значениями показателей не выявлены (р=0,6). Соотношения между показателями подтверждены по критерию Хи-квадрат тесту с определением достоверности по двухстороннему точному критерию Фишера (Fisher Exact r=0,77, р=0,05).Example 2. The level of pro-inflammatory activity of monocytes was determined in a subgroup of 8 patients with a high level of active monocytes and a subgroup of 10 patients with a low level of active monocytes. The index of pro-inflammatory activity when determined by the prototype method and the proposed method was for the first subgroup 11.8 ± 1.3 and 11.5 ± 1.0, respectively, and for the second subgroup - 4.4 ± 0.5 and 4.9 ± 0 , 6, respectively. Statistical processing confirmed the practical similarity of indicators for the two compared methods in both assessment options. There were no significant differences between the mean values of the indicators (p = 0.6). The relationships between the indicators were confirmed by the Chi-square test with the determination of reliability by the two-sided Fisher's exact test (Fisher Exact r = 0.77, p = 0.05).

Пример 3. Сравнивались результаты анализа провоспалительной активности моноцитов способом-прототипом и предложенным способом в общей группе здоровых (12 человек). Индекс провоспалительной активности в первом случае составил 4,7±0,6, а во втором - 4,1±0,7. Статистическая обработка результатов показала их практическую одинаковость (р=0,6).Example 3. Compared the results of the analysis of the pro-inflammatory activity of monocytes by the prototype method and the proposed method in the general group of healthy people (12 people). The index of pro-inflammatory activity in the first case was 4.7 ± 0.6, and in the second - 4.1 ± 0.7. Statistical processing of the results showed their practical similarity (p = 0.6).

Способ оценки провоспалительной активности моноцитов в соответствии с изобретением по сравнению с известными аналогичными более прост и менее трудоемок и одновременно обеспечивает высокую достоверность результатов оценки.The method for assessing the pro-inflammatory activity of monocytes in accordance with the invention, in comparison with the known analogous ones, is simpler and less laborious and at the same time provides a high reliability of the assessment results.

Claims (3)

1. Способ оценки провоспалительной активности моноцитов, включающий выделение моноцитов в составе мононуклеарных клеток из периферической венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина с последующим наслаиванием в чашки Петри, отделением прилипших клеток и их разведением, и проведение анализа полученной взвеси моноцитов, отличающийся тем, что провоспалительную активность моноцитов оценивают по количеству моноцитов больших размеров, при этом готовят пробы путем разведения и перемешивания полученной взвеси моноцитов в изотоническом растворе, подсчитывают в них посредством счетчика клеток количество моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм и количество моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм и рассчитывают индекс провоспалительной активности моноцитов в качестве ее критерия как процентное отношение количества моноцитов диаметром от 12,5 до 15 мкм к количеству моноцитов диаметром от 9 до 15 мкм, а в качестве его окончательного значения используют среднее значение индекса провоспалительной активности моноцитов, полученного в результате по меньшей мере двукратного подсчета количества моноцитов в каждой пробе.1. A method for assessing the pro-inflammatory activity of monocytes, including the isolation of monocytes in the composition of mononuclear cells from peripheral venous blood by centrifugation in a density gradient of ficoll-urografin followed by layering in Petri dishes, separation of adhered cells and their dilution, and analysis of the resulting suspension of monocytes, characterized by that the pro-inflammatory activity of monocytes is assessed by the number of large monocytes, while samples are prepared by diluting and mixing the resulting suspension of monocytes in an isotonic solution, the number of monocytes with a diameter of 9 to 15 μm and the number of monocytes with a diameter of 12 are counted in them using a cell counter, 5 to 15 μm and calculate the index of pro-inflammatory activity of monocytes as its criterion as the percentage of the number of monocytes with a diameter of 12.5 to 15 μm to the number of monocytes with a diameter of 9 to 15 μm, and the average value is used as its final value e index of pro-inflammatory activity of monocytes, obtained as a result of at least two-fold counting of the number of monocytes in each sample. 2. Способ оценки по п. 1, отличающийся тем, что для разведения полученной взвеси моноцитов отбирают 100 мкл взвеси, которую добавляют к 10 мл изотонического раствора для разведения проб Isoton в кюветах объемом 20 мл из комплекта счетчика клеток.2. The evaluation method according to claim 1, characterized in that to dilute the obtained suspension of monocytes, 100 μl of the suspension is taken, which is added to 10 ml of isotonic solution for diluting Isoton samples in 20 ml cuvettes from the set of the cell counter. 3. Способ оценки по п. 1, отличающийся тем, что в качестве счетчика клеток используют автоматический счетчик Культера, настроенный на выявление клеток диаметром от 9 до 15 мкм.3. The evaluation method according to claim 1, characterized in that an automatic Coulter counter is used as a cell counter, configured to detect cells with a diameter of 9 to 15 μm.
RU2021105730A 2021-03-05 2021-03-05 Method for evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes RU2755493C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021105730A RU2755493C1 (en) 2021-03-05 2021-03-05 Method for evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021105730A RU2755493C1 (en) 2021-03-05 2021-03-05 Method for evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2755493C1 true RU2755493C1 (en) 2021-09-16

Family

ID=77745798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021105730A RU2755493C1 (en) 2021-03-05 2021-03-05 Method for evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2755493C1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2089899C1 (en) * 1994-05-05 1997-09-10 Вера Андреевна Извекова Method of evaluation of human blood monocyte phagocytic activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2089899C1 (en) * 1994-05-05 1997-09-10 Вера Андреевна Извекова Method of evaluation of human blood monocyte phagocytic activity

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IVANOVA E.A. et al. Monocyte Activation in Immunopathology: Cellular Test for Development of Diagnostics and Therapy / Journal of Immunology Research, 2016, 9 pages. *
ВАСИЛЬЕВА Е.Ф. и др. ОЦЕНКА УРОВНЯ СУБПОПУЛЯЦИИ МОНОЦИТОВ CD14+/ CD16+ У БОЛЬНЫХ ЮНОШЕСКИМИ ДЕПРЕССИЯМИ / Медицинская иммунология, 2019, т. 21, N 2, стр. 257-268. *
КОЛЕНЧУКОВА О.А. и др. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ КРОВИ В ОТВЕТ НА МЕТИЦИЛЛИНРЕЗИСТЕНТНЫЕ ШТАММЫ STAPHYLOCOCCUS AUREUS / Инфекция и иммунитет, 2020, т. 10, N 3, стр. 551-557. *
КОЛЕНЧУКОВА О.А. и др. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ КРОВИ В ОТВЕТ НА МЕТИЦИЛЛИНРЕЗИСТЕНТНЫЕ ШТАММЫ STAPHYLOCOCCUS AUREUS / Инфекция и иммунитет, 2020, т. 10, N 3, стр. 551-557. ВАСИЛЬЕВА Е.Ф. и др. ОЦЕНКА УРОВНЯ СУБПОПУЛЯЦИИ МОНОЦИТОВ CD14+/ CD16+ У БОЛЬНЫХ ЮНОШЕСКИМИ ДЕПРЕССИЯМИ / Медицинская иммунология, 2019, т. 21, N 2, стр. 257-268. IVANOVA E.A. et al. Monocyte Activation in Immunopathology: Cellular Test for Development of Diagnostics and Therapy / Journal of Immunology Research, 2016, 9 pages. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Du Bois et al. Investigation and standardization of the conditions for micro‐lymphocyte cultures
Lakschevitz et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry
US5100777A (en) Antibody matrix device and method for evaluating immune status
Harvath et al. Rapid quantitation of neutrophil chemotaxis: use of a polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate membrane in a multiwell assembly
US20210080460A1 (en) Reagents, methods and kits for diagnosing primary immunodeficiencies
JP2008178421A (en) Method for measurement of lymphocyte function
CN116699131B (en) HLA-DR+CD14+CD56+Use of monocytes for diagnosis in HLH
US20220214347A1 (en) Combined formulation kit for analyzing phenotype and function of cd1c+denrtic cell subset and use thereof
Paoliello-Paschoalato et al. Isolation of healthy individuals' and rheumatoid arthritis patients' peripheral blood neutrophils by the gelatin and Ficoll-Hypaque methods: Comparative efficiency and impact on the neutrophil oxidative metabolism and Fcγ receptor expression
JP2014112089A (en) Preparation method
CN113125755A (en) 9 antibody kit for monitoring human immune state and application thereof
RU2755493C1 (en) Method for evaluating the pro-inflammatory activity of monocytes
US20110070599A1 (en) Method for Screening of Active Tuberculosis
Subrahmanyam et al. Mass cytometry analysis of T-helper cells
Augustine et al. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin
CN113109575A (en) 40 antibody kit for monitoring human immune state and application
Liu et al. Immunoregulatory functions of mature CD10+ and immature CD10–neutrophils in sepsis patients
RU2302635C1 (en) Method for measuring mitochondrial lymphocyte activity
WO2023046111A1 (en) Basophil activation detection method and application thereof
Serpenev et al. Development of a Blood Typing Device
Zhu et al. Single-cell RNA sequencing unraveled the expression heterogeneity of hematopoietic stem and progenitor cells and immune cell development dysregulation in childhood asthma
US20230314411A1 (en) Methods and kits of assessing status, risk or prognosis of type 1 diabetes
Bsat et al. The Conversion of Human Tissue‐Like Inflammatory Monocytes Into Macrophages
Chen et al. Expansion and Polarization of Human γδT17 Cells in vitro from Peripheral Blood Mononuclear Cells
SU1464088A1 (en) Method of assessing specific sensitization of the organism to allergens