RU2753018C1

RU2753018C1 - Nanostructured composition for oral delivery of insulin and method for production thereof

Info

Publication number: RU2753018C1
Application number: RU2020124291A
Authority: RU
Inventors: Ирина Андреевна Глазова; Алла Евгеньевна Мочалова; Сергей Дмитриевич Зайцев; Лариса Александровна Смирнова
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2021-08-11

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the field of medicine, namely to a nanostructured composition for oral delivery of insulin, containing nanoparticles with a core-shell structure, wherein the core is made in form of gold nanoparticles sequentially coated with chitosan and insulin, characterised by the fact that the core of the composition is additionally coated with a chitosan shell, wherein the size of the formed gold nanoparticles constitute 3 to 15 nm, gold nanoparticles-chitosan 130 to 143 nm, gold nanoparticles-chitosan-insulin 148 to 160 nm, gold nanoparticles-chitosan-insulin-chitosan 175 to 190 nm, and also relates to a method for producing a nanostructured composition for oral delivery of insulin, including forming cors and producing shells of nanoparticles included in the composition, characterised by the fact that the cores of nanoparticles are formed by complete reduction of trivalent gold Au³⁺ to a zerovalence state under UV irradiation from a dopant of chloroauric acid HAuCl₄ in an aqueous acetic acid solution of chitosan at the following ratio of components, % wt.: chitosan 3, acetic acid 1.5, HAuCl₄ 4.5 relative to the weight of dry polysaccharide, water the rest, followed by applying an insulin layer to the surface of the obtained nanospheres of gold stabilised with a chitosan layer, by introducing an insulin solution directly into the nanosphere dispersion, wherein a ratio of the weight of chitosan-coated gold nanospheres to the weight of insulin of 3:1 is used, and the shells of nanoparticles of the insulin-chitosan composition are obtained by adding a "gold nanospheres-chitosan-insulin" dispersion to the excess chitosan solution.

EFFECT: present invention ensures development of a nanostructured composition for oral delivery of insulin with increased time of effect of insulin, prolonged reduction in blood glucose level, increased safety and biocompatibility, reduced toxicity.

5 cl, 2 dwg, 1 tbl

Description

Предлагаемая группа изобретений относится к медицине, фармакологии и биотехнологии, и касается наноструктурированной инсулин-хитозановой композиции для пероральной системы доставки инсулина и способа ее изготовления, которая может быть использована, например, для лечения сахарного диабета.The proposed group of inventions relates to medicine, pharmacology and biotechnology, and concerns a nanostructured insulin-chitosan composition for an oral insulin delivery system and a method for its manufacture, which can be used, for example, for the treatment of diabetes mellitus.

Диабет - серьезная хроническая болезнь, которая значительно увеличилась за последние годы. Инсулин представляет собой белок с большой молекулярной массой, он является наиболее используемым и эффективным препаратом для лечения диабета. Молекула инсулина была открыта в 1922 году, с тех пор пептиды и белки стали использоваться в качестве биофармацевтических препаратов благодаря их преимуществам, таким как высокая активность, специфичность и эффективность по сравнению с обычными лекарственными средствами, но пероральные составы белков все еще находятся в стадии разработки. Основная проблема заключается в том, что пищеварительная система метаболизирует инсулин, прежде чем он сможет достичь русла крови. Вдоль желудочно-кишечного тракта существует несколько барьеров, которые необходимо преодолеть, чтобы увеличить биодоступность инсулина. Например, уровень pH в желудке, ферментативная активность, присутствие слизи и плохая проницаемость через кишечный эпителий являются основными проблемами для активности и эффективности белка (Hosseininasab S. et al. Retracted : Synthesis, Characterization, and In vitro Studies of PLGA - PEG Nanoparticles for Oral Insulin Delivery // Chem Biol Drug Des. 2014. Vol. 84, № 3. P. 307-315).Diabetes is a serious chronic disease that has increased significantly in recent years. Insulin is a protein with a high molecular weight and is the most used and effective drug for the treatment of diabetes. The insulin molecule was discovered in 1922, since then peptides and proteins have been used as biopharmaceuticals due to their advantages, such as higher potency, specificity and efficacy compared to conventional drugs, but oral protein formulations are still under development. The main problem is that the digestive system metabolizes insulin before it can reach the bloodstream. There are several barriers along the gastrointestinal tract that must be overcome in order to increase the bioavailability of insulin. For example, gastric pH, enzymatic activity, the presence of mucus, and poor intestinal permeability are major concerns for protein activity and efficiency (Hosseininasab S. et al. Retracted: Synthesis, Characterization, and In vitro Studies of PLGA - PEG Nanoparticles for Oral Insulin Delivery // Chem Biol Drug Des. 2014. Vol. 84, No. 3. P. 307-315).

Одной из причин плохого контроля диабета является необходимость ежедневных инъекций пациентам. Подкожное введение инсулина в принципе не физиологично, потому что оно осуществляется в место, не самое подходящее с анатомической и физиологической точки зрения. В естественной физиологии млекопитающих инсулин, вырабатываемый поджелудочной железой, доставляется в систему воротной вены и транспортируется в печень. При подкожном введении инсулина он вначале проходит по большому и малому кругам кровообращения, и для достижения физиологической концентрации инсулина в печени необходим гораздо более высокий уровень инсулина в периферической крови, чем это бывает у здорового человека, что приводит к периферической гиперинсулинемии. Пероральная же доставка имитирует эндогенный путь инсулина после секреции, так как он подвергается первому прохождению в печень, а не в системный кровоток. Кроме того, пероральная доставка инсулина обеспечит следующие преимущества по сравнению с подкожным введением инсулина: уменьшение боли, снижение вероятности кожных инфекций и раздражений; уменьшение тревоги и травм, связанных с инъекциями; предотвращение развития диабета (лечение низкими дозами инсулина перорально предполагает это); улучшение контроля диабета за счет непрерывного всасывания и доступности инсулина в течение многих часов. Несмотря на ряд исследований по преодолению барьеров для пероральной доставки инсулина, до сих пор ни одно из них не вышло за пределы лабораторного стенда и не получило коммерческого применения ввиду использования сложных и наукоемких препаратов из-за нестабильности белков в условиях желудочно-кишечного тракта и риска получения побочных эффектов.One of the reasons for poor diabetes control is the need for daily injections in patients. In principle, the subcutaneous administration of insulin is not physiological, because it is carried out in a place that is not the most suitable from an anatomical and physiological point of view. In the natural physiology of mammals, insulin produced by the pancreas is delivered to the portal vein system and transported to the liver. When insulin is injected subcutaneously, it first passes through the large and small circles of blood circulation, and to achieve the physiological concentration of insulin in the liver, a much higher level of insulin in the peripheral blood is required than in a healthy person, which leads to peripheral hyperinsulinemia. Oral delivery, on the other hand, mimics the endogenous pathway of insulin after secretion, as it undergoes a first pass to the liver rather than to the systemic circulation. In addition, oral delivery of insulin will provide the following advantages over subcutaneous administration of insulin: reduced pain, reduced likelihood of skin infections and irritation; reducing anxiety and injury associated with injections; preventing the development of diabetes (treatment with low-dose oral insulin suggests this); improving diabetes control through continuous absorption and availability of insulin over many hours. Despite a number of studies on overcoming barriers to oral delivery of insulin, so far none of them have gone beyond the laboratory bench and have not received commercial application due to the use of complex and science-intensive drugs due to the instability of proteins in the gastrointestinal tract and the risk of obtaining side effects.

При решении проблемы низкой стабильности инсулина в желудочно-кишечном тракте и низкой кишечной проницаемости хорошей стратегией улучшения пероральной биодоступности инсулина представляется инкапсуляция инсулина в наночастицах на полимерной основе. В последние годы различные стратегии и полимеры использовались для инкапсуляции инсулина и его пероральной доставки: хитозан, декстран, альгинат, поли (γ-глутаминовая кислота), гиалуроновая кислота, полилактид, полилактидглиголид (PLGA), поликапролактон (PCL), акриловые полимеры, полиаллиламин. Были выполнены многообещающие исследования и получены положительные результаты, но пока еще нет системы наночастиц на полимерной основе для перорального введения инсулина на рынке. Также отсутствуют долгосрочные исследования токсичности разработанных носителей. (Fonte P. et al. Polymer-based nanoparticles for oral insulin delivery: Revisited approaches // Biotechnology Advances. 2015. Vol. 33, № 6. P. 1342-1354).In addressing the problem of low stability of insulin in the gastrointestinal tract and low intestinal permeability, encapsulation of insulin in polymer-based nanoparticles appears to be a good strategy for improving the oral bioavailability of insulin. In recent years, various strategies and polymers have been used to encapsulate insulin and deliver it orally: chitosan, dextran, alginate, poly (γ-glutamic acid), hyaluronic acid, polylactide, polylactide glygolide (PLGA), polycaprolactone (PCL), acrylic polymers, polyallylamine. There have been promising studies and positive results, but as yet there is no polymer-based nanoparticle system for oral administration of insulin on the market. There are also no long-term toxicity studies of the developed carriers. (Fonte P. et al. Polymer-based nanoparticles for oral insulin delivery: Revisited approaches // Biotechnology Advances. 2015. Vol. 33, No. 6. P. 1342-1354).

В настоящее время перспективным средством пероральной доставки инсулина считаются наночастицы на основе хитозана. К преимуществам наночастиц на основе хитозана можно отнести следующее. Хитозан является нетоксичным и биосовместимым полисахаридом, полученным из раковин ракообразных и насекомых, его безопасность продемонстрирована как на животных моделях, так и на людях. Хитозан, доступный в форме таблеток для перорального применения, может снизить потребление жира и холестерина в рационе. В дополнение к защите инсулина от кислотной денатурации и ферментативной деградации, наночастицы на основе хитознана обладают мукоадгезивным свойством, способным продлить время их пребывания в тонкой кишке. Более того, хитозан может опосредовать открытие плотных контактов между эпителиальными клетками, тем самым способствуя параклеточному транспорту инсулина.Currently, chitosan-based nanoparticles are considered a promising means of oral insulin delivery. The advantages of chitosan-based nanoparticles include the following. Chitosan is a non-toxic and biocompatible polysaccharide derived from crustacean and insect shells and has been demonstrated to be safe in both animal and human models. Chitosan, available as an oral tablet, can reduce the intake of fat and cholesterol in the diet. In addition to protecting insulin from acid denaturation and enzymatic degradation, chitosnan nanoparticles have mucoadhesive properties that can prolong their residence time in the small intestine. Moreover, chitosan may mediate the opening of tight junctions between epithelial cells, thereby facilitating paracellular insulin transport.

Известен способ синтеза модифицированных частиц хитозана для пероральной доставки инсулина по патенту US 9828445, МПК A61K 47/36, C08B 37/08, C08F 251/00, A61K 38/28, A61K 47/32, публ. 28.11.2017 г., включающий амидирование хитозана жирной кислотой, модифицированной жирной кислотой и/или аминокислотой. Это сложный многоступенчатый процесс химической модификации жирной кислоты или аминокислоты с использованием катализатора и с последующей сшивкой для получения модифицированных частиц хитозана. Инсулин загружают на модифицированные частицы хитозана путем смешивания частиц хитозана с инсулином для образования смеси, смесь инкубируют при температуре и по времени, достаточных для полной адсорбции инсулина на частицах, затем смесь центрифугируют для выделения частиц. Помимо сложности реакции недостатком является также использование токсичных по отношению к нервным тканям веществ - алкилакриламидов, поскольку на амидированный хитозан по данному способу прививают N-изопропилакриламид (NIPAm). Помимо этого, полученные частицы при пероральной доставке не будут достаточно защищены от действия ферментов желудочного сока.A known method for the synthesis of modified particles of chitosan for oral delivery of insulin according to US patent 9828445, IPC A61K 47/36, C08B 37/08, C08F 251/00, A61K 38/28, A61K 47/32, publ. November 28, 2017, including the amidation of chitosan with a fatty acid modified with a fatty acid and / or amino acid. This is a complex multistage process of chemical modification of a fatty acid or amino acid using a catalyst and subsequent crosslinking to obtain modified chitosan particles. Insulin is loaded onto modified chitosan particles by mixing chitosan particles with insulin to form a mixture, the mixture is incubated at a temperature and time sufficient for complete adsorption of insulin on the particles, then the mixture is centrifuged to isolate the particles. In addition to the complexity of the reaction, the disadvantage is the use of substances toxic to nerve tissues - alkylacrylamides, since N-isopropylacrylamide (NIPAm) is grafted onto the amidated chitosan using this method. In addition, the resulting particles, when delivered orally, will not be sufficiently protected from the action of gastric acid enzymes.

Известен способ получения наночастиц, нагруженных инсулином, путем самостоятельного гелеобразования на основе хитозана и водорастворимого муцина улитки в качестве природных полимеров. Для этого использовали ионное взаимодействие муцинов с хитозаном в различных концентрациях с применением плюроников и поливинилового спирта в качестве твердого поверхностно-активного вещества. Такой состав был выбран для обеспечения необходимой динамики для формирования наночастиц при сохранении свойств поверхности, которые будут способствовать инкапсуляции инсулина. (Mumuni M.A. et al. Insulin-loaded mucoadhesive nanoparticles based on mucin-chitosan complexes for oral delivery and diabetes treatment // Carbohydrate Polymers. 2020. Vol. 229. P. 115506). Смесь хитозана и муцина перемешивают с использованием гомогенизации, затем к смеси добавляют 5 мл раствора инсулина и осторожно перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 3 минут при 200 об / мин. После этого к фазе, содержащей инсулин и хитозан, добавляют водную фазу, содержащую смесь полоксамера-188 и поливинилового спирта, и гомогенизируют в течение 5 мин при 12000 об / мин. Препарат дополнительно подвергают ультразвуковой обработке при 80 Вт в течение 2 минут на ледяной бане. Затем, аликвоты наночастиц дважды промывают деионизированной водой центрифугированием (10000 об / мин, 10°С, 60 мин) и затем лиофилизируют для получения наночастиц с инсулином. Недостатком аналога, помимо сложности изготовления препарата, является то, что ультразвук разрушает хитозан до олигомера. Последний не обладает мукоадгезивными свойствами, в результате доставка инсулина в русло крови будет ограниченной. Метод также является энергозатратным. A known method of producing nanoparticles loaded with insulin by self-gelation based on chitosan and water-soluble snail mucin as natural polymers. For this, the ionic interaction of mucins with chitosan at various concentrations was used with the use of pluronics and polyvinyl alcohol as a solid surfactant. This composition was chosen to provide the necessary dynamics for the formation of nanoparticles while maintaining surface properties that would facilitate the encapsulation of insulin. (Mumuni M.A. et al. Insulin-loaded mucoadhesive nanoparticles based on mucin-chitosan complexes for oral delivery and diabetes treatment // Carbohydrate Polymers. 2020. Vol. 229. P. 115506). The mixture of chitosan and mucin is stirred using homogenization, then 5 ml of insulin solution is added to the mixture and gently stirred with a magnetic stirrer for 3 minutes at 200 rpm. Thereafter, an aqueous phase containing a mixture of Poloxamer-188 and polyvinyl alcohol is added to the phase containing insulin and chitosan, and homogenized for 5 minutes at 12,000 rpm. The drug is additionally subjected to ultrasonic treatment at 80 W for 2 minutes in an ice bath. Then, aliquots of nanoparticles are washed twice with deionized water by centrifugation (10,000 rpm, 10 ° C, 60 min) and then lyophilized to obtain nanoparticles with insulin. The disadvantage of the analogue, in addition to the complexity of the preparation of the drug, is that ultrasound destroys chitosan to an oligomer. The latter does not possess mucoadhesive properties; as a result, the delivery of insulin into the bloodstream will be limited. The method is also energy intensive.

Известна наноструктурированная инсулин-хитозановая композиция наночастиц для пероральной доставки инсулина и способ ее изготовления WO 2019148810, кл. A61K 38/28, A61K 9/51, A61K 47/36, A61P 3/10, опубл. 08.08.2019. Наноструктурированная инсулин-хитозановая композиция наночастиц для пероральной доставки инсулина имеет структуру ядро-оболочка, указанное ядро представляет собой нанокомпозитное ядро, состоящее из соли четвертичного аммония хитозана и инсулина, указанная оболочка представляет собой гиалуроновую кислоту или тиолированную гиалуроновую кислоту, нанесенную на поверхность указанного ядра. Способ изготовления прототипа состоит из изготовления указанных ядер по технологии FNC и изготовления указанных оболочек путем нанесения на поверхность указанных ядер гиалуроновой кислоты. Недостатком прототипа является то, что необходимы специальные приемы для получения гиалуроновой кислоты высокой молекулярной массы, которая способна обеспечить защитные функции. Кроме того, гиалуроновая кислота быстро разлагается целым семейством ферментов, а продукты ее разложения, в отличии от высокомолекулярного полисахарида, способны индуцировать воспалительный ответ в макрофагах и дендритных клетках. Known nanostructured insulin-chitosan composition of nanoparticles for oral delivery of insulin and a method for its manufacture WO 2019148810, class. A61K 38/28, A61K 9/51, A61K 47/36, A61P 3/10, publ. 08.08.2019. The nanostructured insulin-chitosan composition of nanoparticles for oral delivery of insulin has a core-shell structure, said core is a nanocomposite core consisting of a quaternary ammonium salt of chitosan and insulin, said shell is hyaluronic acid or thiolated hyaluronic acid applied to the surface of said core. A method for manufacturing a prototype consists of manufacturing said cores using FNC technology and manufacturing said shells by applying hyaluronic acid to the surface of said nuclei. The disadvantage of the prototype is that special techniques are required to obtain hyaluronic acid of high molecular weight, which is capable of providing protective functions. In addition, hyaluronic acid is rapidly degraded by a whole family of enzymes, and its degradation products, in contrast to the high molecular weight polysaccharide, are capable of inducing an inflammatory response in macrophages and dendritic cells.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является наноструктурированная композиция для пероральной доставки инсулина, известная из источника Hrushikesh M Joshi. et al., Chitosan Reduced Gold Nanoparticles as Novel Carriers for Transmucosal Delivery of Insulin. Pharmaceutical Research, 2007, Vol.24, N.8, pp.1415-1426, принятая за ближайший аналог (прототип). Наноструктурированная композиция для пероральной доставки инсулина состоит из сферических наночастиц золота, последовательно покрытых хитозаном и инсулином. Недостатком прототипа является отсутствие оболочки, защищающей слой инсулина от разрушающего действия ЖКТ при пероральном применении. Также способ изготовления наночастиц золота прототипа не обеспечивает узкого распределения наночастиц по размерам, что является важным для транспорта наночастиц в ЖКТ. Более того, значительная часть фракций (до 40%) композиции прототипа содержит наночастицы золота с размером 30-50 нм, что будет приводить к формированию конечных многослойных инсулиносодержащих структур с размерами, препятствующими проникновению через щелевые контакты ЖКТ. Таким образом, только часть инсулиносодержащих структур будет попадать в русло крови (внутреннюю среду).Closest to the proposed invention is a nanostructured composition for oral delivery of insulin, known from the source Hrushikesh M Joshi. et al., Chitosan Reduced Gold Nanoparticles as Novel Carriers for Transmucosal Delivery of Insulin. Pharmaceutical Research, 2007, Vol. 24, No. 8, pp. 1415-1426, taken as the closest analogue (prototype). The nanostructured composition for oral delivery of insulin consists of spherical gold nanoparticles sequentially coated with chitosan and insulin. The disadvantage of the prototype is the lack of a shell that protects the insulin layer from the destructive action of the gastrointestinal tract when administered orally. Also, the method for manufacturing gold nanoparticles of the prototype does not provide a narrow nanoparticle size distribution, which is important for the transport of nanoparticles in the gastrointestinal tract. Moreover, a significant part of the fractions (up to 40%) of the prototype composition contains gold nanoparticles with a size of 30-50 nm, which will lead to the formation of final multilayer insulin-containing structures with dimensions that prevent penetration through the gap junctions of the gastrointestinal tract. Thus, only part of the insulin-containing structures will enter the bloodstream (internal environment).

Задачей, на решение которой направлена группа изобретений, является получение наноструктурированной композиции для пероральной доставки инсулина, обеспечивающей поступление инсулина в русло крови (внутреннюю среду) из полости желудочно-кишечного тракта с последующим пролонгированным выделением инсулина из препарата в кровь. The task to be solved by the group of inventions is to obtain a nanostructured composition for oral delivery of insulin, which ensures the flow of insulin into the bloodstream (internal environment) from the cavity of the gastrointestinal tract with subsequent prolonged release of insulin from the preparation into the blood.

Техническим результатом от использования предлагаемой группы изобретений является увеличение времени воздействия инсулина, пролонгированное снижение содержания глюкозы в крови, повышение безопасности и биосовместимости, снижение токсичности. The technical result from the use of the proposed group of inventions is an increase in the time of insulin exposure, a prolonged decrease in blood glucose, an increase in safety and biocompatibility, and a decrease in toxicity.

Поставленная задача достигается тем, что в наноструктурированной композиции для пероральной доставки инсулина, содержащей наночастицы со структурой ядро-оболочка, в которых ядро выполнено в виде наночастиц золота, последовательно покрытых хитозаном и инсулином, ядро композиции дополнительно покрыто оболочкой из хитозана, при этом размеры формируемых наночастиц золота составляют 3-15 нм, наночастиц золота-хитозан - 130-143 нм, наночастиц золота-хитозан-инсулин - 148-160 нм, наночастиц золота-хитозан-инсулин-хитозан - 175-190 нм.The task is achieved by the fact that in a nanostructured composition for oral delivery of insulin containing nanoparticles with a core-shell structure, in which the core is made in the form of gold nanoparticles, sequentially coated with chitosan and insulin, the core of the composition is additionally coated with a shell of chitosan, while the size of the formed nanoparticles gold nanoparticles are 3-15 nm, gold nanoparticles-chitosan - 130-143 nm, gold nanoparticles-chitosan-insulin - 148-160 nm, gold nanoparticles-chitosan-insulin-chitosan - 175-190 nm.

Поставленная задача достигается также тем, что в способе изготовления наноструктурированной композиции для пероральной доставки инсулина, включающем формирование ядер и изготовление оболочек наночастиц, входящих в композицию, ядра наночастиц формируют путем полного восстановления трехвалентного золота Au³⁺ до нульвалентного состояния при УФ-облучении из допанта золотохлористоводородной кислоты HAuCl₄ в водно-уксуснокислом растворе хитозана при следующем соотношении компонентов, мас.%: хитозан - 3, уксусная кислота - 1,5, HAuCl₄ - 4,5 от массы сухого полисахарида, вода - остальное, после чего на поверхность полученных наносфер из золота, стабилизированного слоем хитозана, наносят слой инсулина, вводя раствор инсулина непосредственно в дисперсию наносфер, причем используют соотношение массы наносфер из золота, покрытых хитозаном, к массе инсулина 3:1, а оболочки наночастиц инсулин-хитозановой композиции получают добавлением дисперсии «наносферы из золота-хитозан-инсулин» в избыток раствора хитозана; в качестве высокоэффективного стабилизатора используют хитозан с молекулярной массой от 100 000 до 250 000 и степенью деацетилирования 78-82%; процесс зарождения и роста наносфер из золота контролируют спектрофотометрически, по полосе поглощения, соответствующей плазмонному резонансу наночастиц золота при λ = 520-550 нм до тех пор, пока максимум поглощения не перестает изменяться; концентрацию хитозана, соответствующую полной его адсорбции поверхностями наносфер из золота, определяют методом тонкослойной хроматографии, а также дополнительно контролируют отсутствие в растворе неадсорбированного хитозана методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.This task is also achieved by the fact that in the method of manufacturing a nanostructured composition for oral delivery of insulin, including the formation of nuclei and the production of shells of nanoparticles included in the composition, the nuclei of nanoparticles are formed by the complete reduction of trivalent gold Au ³⁺ to a zero-valence state under UV irradiation from the dopant gold chloride. acid HAuCl ₄ in an aqueous acetic acid solution of chitosan at the following ratio of components, wt%: chitosan - 3, acetic acid - 1.5, HAuCl ₄ - 4.5 from the mass of dry polysaccharide, water - the rest, after which on the surface of the resulting nanospheres of gold stabilized with a layer of chitosan, a layer of insulin is applied by introducing an insulin solution directly into the dispersion of nanospheres, and the ratio of the mass of gold nanospheres coated with chitosan to the mass of insulin is 3: 1, and the shells of nanoparticles of the insulin-chitosan composition are obtained by adding a dispersion of nanospheres from gold-chitosan-insulin "in excess of races chitosan; chitosan with a molecular weight of 100,000 to 250,000 and a degree of deacetylation of 78-82% is used as a highly effective stabilizer; the process of nucleation and growth of gold nanospheres is monitored spectrophotometrically, according to the absorption band corresponding to the plasmon resonance of gold nanoparticles at λ = 520-550 nm until the absorption maximum stops changing; the concentration of chitosan, corresponding to its complete adsorption by the surfaces of gold nanospheres, is determined by thin layer chromatography, and the absence of unadsorbed chitosan in the solution is additionally monitored by high performance liquid chromatography.

На фиг. 1 схематично представлена структура наночастиц предлагаемой наноструктурированной композиции для пероральной доставки инсулина.FIG. 1 schematically shows the structure of nanoparticles of the proposed nanostructured composition for oral delivery of insulin.

На фиг. 2 приведены ТЭМ изображения наносфер из золота (а) и распределения их по размерам по данным ТЭМ (гистограмма) и РМУ (кривая) (б), где TЭM - высокоразрешающая просвечивающая электронная микроскопия, РМУ - рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами.FIG. Figure 2 shows TEM images of gold nanospheres (a) and their size distributions according to TEM (histogram) and PMU (curve) (b) data, where TEM is high-resolution transmission electron microscopy and PMU is low-angle X-ray scattering.

Наноструктурированная композиция для пероральной доставки инсулина, содержит наносферы из золота 1 размером 3-15 нм, стабилизированные слоем хитозана 2, покрытые слоем инсулина 3 и полимолекулярной защитной оболочкой 4 из хитозана. The nanostructured composition for oral delivery of insulin contains gold nanospheres 1 with a size of 3-15 nm, stabilized with a layer of chitosan 2, coated with a layer of insulin 3 and a polymolecular protective shell 4 of chitosan.

Способ изготовления наноструктурированной композиции для пероральной доставки инсулина осуществляют следующим образом. A method of manufacturing a nanostructured composition for oral insulin delivery is carried out as follows.

Устойчивую водную дисперсию наносфер из золота 1, каждая из которых стабилизирована слоем хитозана 2, получают УФ-восстановлением Au³⁺ из допанта золотохлористоводородной кислоты HAuCl₄ до нульвалентного состояния в растворах хитозана, допированных золотохлористоводородной кислотой. При разработке способа получения наносфер золота в основу были положены результаты работ Шульпина Г.Б. с соавторами по детальному исследованию фотолиза золотосодержащих соединений в водных растворах [Шульпин, Г.Б. Фотохимическое хлорирование насыщенных и ароматических углеводородов / Г.Б. Шульпин, П. Ледерер, Ю.В. Гепетий // ЖОХ - 1987. - Т. 57. - № 3 - С. 619.]. Механизм восстановления золотохлористоводородной кислоты представлен следующей схемой:A stable aqueous dispersion of gold nanospheres 1, each of which is stabilized by a layer of chitosan 2, is obtained by UV reduction of Au ³⁺ from the dopant hydrochloric acid HAuCl ₄ to a zero valence state in chitosan solutions doped with hydrochloric acid. The development of a method for producing gold nanospheres was based on the results of the work of G.B. Shulpin. with co-authors on a detailed study of the photolysis of gold-containing compounds in aqueous solutions [Shulpin, GB. Photochemical chlorination of saturated and aromatic hydrocarbons / G.B. Shulpin, P. Lederer, Yu.V. Hepety // ZhOKh - 1987. - T. 57. - No. 3 - S. 619.]. The recovery mechanism of chloroauric acid is represented by the following scheme:

Реакцию восстановления Au³⁺ из допанта золотохлористоводородной кислоты (HAuCl₄) проводили непосредственно в водно-уксуснокислом растворе хитозана при следующем соотношении компонентов, мас.%:The reduction of Au ³⁺ from the dopant chloroauric acid (HAuCl ₄ ) was carried out directly in an aqueous acetic acid solution of chitosan at the following ratio of components, wt%:

хитозан - 3,chitosan - 3,

уксусная кислота - 1.5,acetic acid - 1.5,

HAuCl₄ - 4,5 от массы сухого полисахарида, HAuCl ₄ - 4.5 by weight of dry polysaccharide,

вода - остальное. water is the rest.

Для этого, например, 0,135 г HAuCl₄ вводили в 100 г раствора хитозана, содержащих 3 г полисахарида, 1,5 г уксусной кислоты и 95,5 г дистиллированной воды. В качестве высокоэффективного стабилизатора использовали хитозан с молекулярной массой от 100 000 до 250 000 и степенью деацетилирования 78-82%.For this, for example, 0.135 g of HAuCl ₄ was introduced into 100 g of a chitosan solution containing 3 g of polysaccharide, 1.5 g of acetic acid and 95.5 g of distilled water. Chitosan with a molecular weight of 100,000 to 250,000 and a degree of deacetylation of 78-82% was used as a highly effective stabilizer.

В результате получали наносферы из золота 1 размером 3-15 нм, стабилизированные слоем хитозана 2.As a result, nanospheres of gold 1 with a size of 3-15 nm were obtained, stabilized by a layer of chitosan 2.

Процесс зарождения и роста наносфер из золота 1 контролировали спектрофотометрически, по полосе поглощения, соответствующей плазмонному резонансу наночастиц золота при λ = 520-550 нм до тех пор, пока максимум поглощения не перестает изменяться. The process of nucleation and growth of nanospheres from gold 1 was monitored spectrophotometrically using the absorption band corresponding to the plasmon resonance of gold nanoparticles at λ = 520-550 nm until the absorption maximum stops changing.

Методом тонкослойной хроматографии определяли концентрацию хитозана, при которой он полностью адсорбируется на наносферах из золота 1 и стабилизирует их. В качестве неподвижной фазы применяли, например, алюминиевую пластинку марки Silifol UV-254 с нанесенным на нее слоем силикагеля. При этом элюентом служил раствор уксусной кислоты, проявителем - пары йода. Для доказательства формирования системы «наносферы из золота-хитозан», в которой отсутствует неадсорбированный хитозан, использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, например, на приборе Shimadzu CTO-20A/20AC с программным модулем LC-Solutions- GPC, элюент - раствор уксусной кислоты. Полученная система «наносферы из золота-хитозан» (водная дисперсия) сохраняла устойчивость в течение 7 дней. The concentration of chitosan at which it is completely adsorbed on gold 1 nanospheres and stabilizes them was determined by thin layer chromatography. As a stationary phase, we used, for example, an aluminum plate of the Silifol UV-254 brand with a layer of silica gel applied to it. In this case, an acetic acid solution served as an eluent, and iodine vapor was used as a developer. To prove the formation of the system "gold nanospheres - chitosan", in which there is no unadsorbed chitosan, the method of high performance liquid chromatography was used, for example, on a Shimadzu CTO-20A / 20AC instrument with the LC-Solutions-GPC software module, the eluent was acetic acid solution. The resulting system of "gold nanospheres-chitosan" (aqueous dispersion) remained stable for 7 days.

Затем на поверхность наносфер из золота 1, стабилизированного слоем хитозана 2, наносили слой инсулина 3, вводя раствор инсулина непосредственно в дисперсию наносфер, причем соотношение массы наносфер из золота, покрытых хитозаном, к массе инсулина выбирали 3:1.Then, a layer of insulin 3 was applied to the surface of gold nanospheres 1 stabilized with a layer of chitosan 2 by injecting an insulin solution directly into the dispersion of nanospheres, and the ratio of the mass of gold nanospheres coated with chitosan to the mass of insulin was chosen 3: 1.

Для определения концентрации инсулина, отвечающей полной его адсорбции на наносферах из золота 1, стабилизированных слоем хитозана 2, предварительно проводили в интервале соотношений от 1:1 до 40:1 по массе, соответственно. Связывание инсулина контролировали методом электрофореза в полиакриламидном геле. Исследование проводили в камере для вертикального электрофореза с заливочным устройством VE-10 с источником питания Эльф-4. Компоненты геля визуализировали спиртовым раствором йода. При этом оптимальное соотношение наносфер из золота, стабилизированных хитозаном, к инсулину было получено 3:1 по массе сухих компонентов, соответственно.To determine the concentration of insulin corresponding to its complete adsorption on nanospheres of gold 1, stabilized by a layer of chitosan 2, it was preliminarily carried out in the range of ratios from 1: 1 to 40: 1 by weight, respectively. Insulin binding was monitored by polyacrylamide gel electrophoresis. The study was carried out in a vertical electrophoresis chamber with a VE-10 casting device and an Elf-4 power source. The components of the gel were visualized with an alcohol solution of iodine. The optimal ratio of chitosan-stabilized gold nanospheres to insulin was 3: 1 by weight of dry components, respectively.

Для защиты слоя инсулина 3 ядра от разрушающего действия ферментов ЖКХ при пероральном применении формировали наружную оболочку 4 из хитозана. С этой целью дисперсию «наносферы из золота-хитозан-инсулин» добавляли в избыток раствора хитозана при следующем соотношении компонентов:To protect the insulin layer 3 of the nucleus from the destructive action of the enzymes of housing and communal services, when administered orally, the outer shell 4 of chitosan was formed. For this purpose, a dispersion of "gold nanospheres-chitosan-insulin" was added to an excess of chitosan solution at the following ratio of components:

«наносферы из золота-хитозан-инсулин»/хитозан= 1/3 по массе. Для этого, например, 100 г раствора «наносферы из золота-хитозан-инсулин», содержащего 3 мас.% хитозана, 1,5 мас.% уксусной кислоты, 4,5 % от массы сухого полисахарида HAuCl₄, остальное - вода, добавляли в 300 г водноуксуснокислого раствора хитозана, содержащего 3 мас.% хитозана, 1,5 мас.% уксусной кислоты, остальное - вода (9 г хитозана, 4.5 г уксусной кислоты, 286.5 г воды)."Gold-chitosan-insulin nanospheres" / chitosan = 1/3 by weight. For this, for example, 100 g of a solution of "gold nanospheres-chitosan-insulin" containing 3 wt.% Chitosan, 1.5 wt.% Acetic acid, 4.5% by weight of the dry polysaccharide HAuCl ₄ , the rest is water, was added in 300 g of aqueous acetic acid solution of chitosan containing 3 wt.% chitosan, 1.5 wt.% acetic acid, the rest is water (9 g of chitosan, 4.5 g of acetic acid, 286.5 g of water).

Размерные характеристики разработанной наноструктурированной инсулин-хитозановой композиции на различных стадиях процесса определяли методом динамического светорассеяния на спектрометре Photocor Complex. Размеры (диаметры) формируемых наночастиц:The dimensional characteristics of the developed nanostructured insulin-chitosan composition at various stages of the process were determined by dynamic light scattering on a Photocor Complex spectrometer. Dimensions (diameters) of the formed nanoparticles:

наносферы из золота 3-15 нм,gold nanospheres 3-15 nm,

наносферы из золота-хитозан 130-143 нм,gold-chitosan nanospheres 130-143 nm,

наносферы из золота-хитозан-инсулин 148-160 нм,nanospheres of gold-chitosan-insulin 148-160 nm,

наносферы из золота-хитозан-инсулин-хитозан 175-190 нмnanospheres of gold-chitosan-insulin-chitosan 175-190 nm

Статистические исследования, выполненные для различной повторности, показывали, что размеры наночастиц разработанной наноструктурированной инсулин-хитозановой композиции для пероральной доставки инсулина колеблются в пределах 175-190 нм.Statistical studies performed for various replications showed that the sizes of nanoparticles of the developed nanostructured insulin-chitosan composition for oral insulin delivery range from 175-190 nm.

Исследование гипогликемического действия изготовленной наноструктурированной инсулин-хитозановой композиции при пероральном применении проводили по показателям крови на экспериментальных животных (крысах), которых разделили на 4 группы: 1) интактные животные, 2) животные контрольной группы, у которых моделировали патологический процесс, 3) животные опытной группы, у которых моделировали патологический процесс и вводили разработанную наноструктурированную инсулин-хитозановую композицию перорально, 4) животные опытной группы, у которых моделировали патологический процесс и вводили инсулин инъекционно. Сахарный диабет у животных контрольной и опытных групп вызывали введением аллоксана в дозе 100 мг/кг экспериментальных животных. Это приводило к развитию стойкого сахарного диабета I типа (инсулинозависимый). Результаты исследования гипогликемического действия разработанной наноструктурированной инсулин-хитозановой композиции при пероральном применении представлены в таблице 1. Содержание инсулина в указанной композиции 50 МЕ. The study of the hypoglycemic effect of the manufactured nanostructured insulin-chitosan composition during oral administration was carried out according to blood parameters in experimental animals (rats), which were divided into 4 groups: 1) intact animals, 2) animals of the control group, in which the pathological process was simulated, 3) experimental animals. groups in which the pathological process was modeled and the developed nanostructured insulin-chitosan composition was administered orally; 4) animals of the experimental group in which the pathological process was modeled and insulin was injected. Diabetes mellitus in animals of the control and experimental groups was caused by the introduction of alloxan at a dose of 100 mg / kg of experimental animals. This led to the development of persistent type I diabetes mellitus (insulin dependent). The results of the study of the hypoglycemic effect of the developed nanostructured insulin-chitosan composition for oral administration are presented in Table 1. The insulin content in the specified composition is 50 IU.

Таблица 1Table 1

ГруппаGroup Время после введенияTime after injection Уровень глюкозы в крови, ммоль/л (ср. значение ± СОС)Blood glucose level, mmol / l (avg value ± SOS) ИнтактныеIntact -- 6,98±0,016.98 ± 0.01 КонтрольControl -- 29,1±2,4029.1 ± 2.40 Разработанная наноструктурированная инсулин-хитозановая композиция, пероральноDeveloped nanostructured insulin-chitosan composition, oral 1 час1 hour 11,00±0,7811.00 ± 0.78 2 часа2 hours 5,25±2,055.25 ± 2.05 3 часа3 hours 6,57±0,626.57 ± 0.62 6 часов6 o'clock 12,85±3,3212.85 ± 3.32 24 часа24 hours 21,80±1,7921.80 ± 1.79 Инсулин инъекционный, внутримышечно в бедроInjectable insulin, intramuscularly in the thigh 1 час1 hour 7,11±0,727.11 ± 0.72 2 часа2 hours 7,97±0,667.97 ± 0.66 3 часа3 hours 17,28±1,0617.28 ± 1.06 6 часов6 o'clock 24,57±0,8824.57 ± 0.88 24 часа24 hours 29,45±0,4629.45 ± 0.46

Как следует из таблицы 1, пероральное введение разработанной наноструктурированной инсулин-хитозановой композиции обеспечивает снижение содержание глюкозы в крови на уровне инъекционного введения инсулина в течение 3 часов. Эффект развивается несколько медленнее чем при инъекционном введении (1 час), достигая сопоставимых результатов через 2 часа. Однако, в первом случае наблюдается более выраженный пролонгированный эффект до 6 часов, по сравнению с инъекционным введением.As follows from table 1, oral administration of the developed nanostructured insulin-chitosan composition provides a decrease in blood glucose at the level of injection of insulin for 3 hours. The effect develops somewhat more slowly than with injection (1 hour), reaching comparable results after 2 hours. However, in the first case, a more pronounced prolonged effect is observed up to 6 hours, compared with injection.

Хитозан нетоксичен, безопасен и биосовместим, обладает высокими мукоадгезивными свойствами и способен раздвигать щелевые контакты стенок ЖКТ.Chitosan is non-toxic, safe and biocompatible, has high mucoadhesive properties and is able to push apart the gap junctions of the gastrointestinal tract walls.

Таким образом, полученная наноструктурированная композиция для пероральной доставки инсулина, обеспечивает поступление инсулина в русло крови из полости желудочно-кишечного тракта, обладает пролонгированным воздействием инсулина, приводит к пролонгированному снижению содержания глюкозы в крови по сравнению с инъекционным способом введения инсулина, обладает также всеми преимуществами средства для перорального применения (физиологичность, безболезненность) и состоит из нетоксичных веществ.Thus, the obtained nanostructured composition for oral delivery of insulin ensures the flow of insulin into the bloodstream from the cavity of the gastrointestinal tract, has a prolonged effect of insulin, leads to a prolonged decrease in blood glucose in comparison with the injection method of insulin administration, and also has all the advantages of the agent for oral administration (physiological, painless) and consists of non-toxic substances.

Claims

1. Nanostructured composition for oral delivery of insulin, containing nanoparticles with a core-shell structure, in which the core is made in the form of gold nanoparticles, sequentially coated with chitosan and insulin, characterized in that the core of the composition is additionally coated with a shell of chitosan, while the size of the formed gold nanoparticles are 3-15 nm, gold nanoparticles-chitosan - 130-143 nm, gold nanoparticles-chitosan-insulin - 148-160 nm, gold nanoparticles-chitosan-insulin-chitosan - 175-190 nm.

2. A method of manufacturing a nanostructured composition according to claim 1 for oral delivery of insulin, including the formation of nuclei and the manufacture of shells of nanoparticles included in the composition, characterized in that the nanoparticle nuclei are formed by the complete reduction of trivalent gold Au ³⁺ to a zero valence state under UV irradiation from dopant chloroauric acid HAuCl ₄ in an aqueous acetic acid solution of chitosan at the following ratio of components, wt%:

chitosan - 3,

acetic acid - 1.5,

HAuCl ₄ - 4.5 by weight of dry polysaccharide,

water - the rest,

After that, a layer of insulin is applied to the surface of the obtained nanospheres of gold stabilized with a layer of chitosan, by injecting an insulin solution directly into the dispersion of nanospheres, and using the ratio of the mass of gold nanospheres coated with chitosan to the mass of insulin 3: 1, and the shells of nanoparticles of the insulin-chitosan composition is obtained by adding a dispersion of "gold nanospheres-chitosan-insulin" to an excess of chitosan solution.

3. A method according to claim 2, characterized in that chitosan with a molecular weight of 100,000 to 250,000 and a degree of deacetylation of 78-82% is used as a highly effective stabilizer.

4. The method according to claim. 2, characterized in that the process of nucleation and growth of gold nanospheres is controlled spectrophotometrically, according to the absorption band corresponding to the plasmon resonance of gold nanoparticles at γ = 520-550 nm until the absorption maximum stops changing.

5. The method according to claim 2, characterized in that the concentration of chitosan corresponding to its complete adsorption by the surfaces of gold nanospheres is determined by thin layer chromatography, and the absence of non-adsorbed chitosan in the solution is additionally monitored by high performance liquid chromatography.