RU2752872C1

RU2752872C1 - SARS-CoV-2 CORONAVIRUS REPLICATION INHIBITOR BASED ON HUMIC SUBSTANCES

Info

Publication number: RU2752872C1
Application number: RU2020136343A
Authority: RU
Inventors: Тамара Владимировна Теплякова; Олег Викторович Пьянков; Максим Олегович Скарнович; Николай Иванович Бормотов; Алевтина Леонидовна Потешкина; Алена Сергеевна Овчинникова; Анастасия Викторовна Магеррамова; Екатерина Игоревна Филиппова; Анастасия Алексеевна Черемискина
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2021-08-11

Abstract

FIELD: pharmaceutical industry.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the pharmaceutical industry, namely to the use of water-soluble humic substances from brown coal or from chaga to inhibit the replication of the SARS-CoV-2 coronavirus. The use of water-soluble humic substances from brown coal obtained as a result of the exothermic reaction of crushed brown coal in a mixture of 2% ammonia and hydrogen peroxide, followed by precipitation and re-precipitation of humic substances with hydrochloric acid, dilution in water at pH 7.0-8.0, drying, with or without trypsin treatment, to inhibit the replication of the SARS-CoV-2 coronavirus, which, at concentrations in the range of 14.34-23.1 mcg/ml, exhibit a 50% antiviral dose-dependent activity against SARS-CoV-2 in tests on Vero cell cultures. The use of water-soluble humic substances from the chaga, basid fungus Inonotus obliquus, obtained as a result of the exothermic reaction of crushed chaga in a mixture of 2% ammonia and hydrogen peroxide, followed by precipitation and re-precipitation of humic substances with hydrochloric acid, dilution in water at pH 7.0-8.0, drying, treatment with trypsin, to inhibit the replication of the SARS-CoV-2 coronavirus, which at a concentration of 23.447 mcg/ml exhibit 50% antiviral dose-dependent inhibitory activity against SARS-CoV-2 in Vero cell culture tests.

EFFECT: above-described use of humic substances is effective for inhibiting the replication of the SARS-CoV-2 coronavirus.

2 cl, 1 dwg, 1 tbl, 8 ex

Description

Настоящее изобретение относится к ингибитору репликации нового коронавируса SARS-CoV-2 на основе гуминовых веществ природного происхождения.The present invention relates to a replication inhibitor of the novel SARS-CoV-2 coronavirus based on humic substances of natural origin.

Вспышка пандемии Covid-19, начавшаяся в конце 2019 г. в Китае и распространившаяся по всему миру, представляет угрозу для человечества, поэтому актуален поиск субстанций, ингибирующих репликацию вируса, для создания новых лекарственных средств.The outbreak of the Covid-19 pandemic, which began at the end of 2019 in China and spread throughout the world, poses a threat to humanity, so the search for substances that inhibit the replication of the virus is relevant for the creation of new drugs.

Гуминовые вещества (ГВ)- необходимая и обязательная составляющая часть всех обменных процессов в биосфере, они представляют собой высокомолекулярные гетерополимеры и являются частью объектов природного происхождения. Все гуминовые вещества образуются из органических остатков. Этот процесс получил название гумификация. Одним из наиболее вероятных в биосфере механизмов гумификации может быть признан биосинтез бактериями и грибами меланинов - предшественников гуминовых веществ [Попов А.И. Гуминовые вещества: свойства, строение, образование / Под ред. Е.И. Ермакова. - СПб.: Изд-во С. - Петерб. ун-та, 2004. - 248 с.].Humic substances (HS) are a necessary and indispensable part of all metabolic processes in the biosphere; they are high molecular weight heteropolymers and are part of natural objects. All humic substances are formed from organic residues. This process is called humification. One of the most probable mechanisms of humification in the biosphere can be recognized as the biosynthesis of melanins by bacteria and fungi - precursors of humic substances [Popov A.I. Humic substances: properties, structure, education / Ed. E.I. Ermakova. - SPb .: Publishing house of St. Petersburg. University, 2004. - 248 p.].

Известно, что гриб чага Inonotusobliquus, растущий на живых березах, содержит в черных наростах (склероциях) не только меланин, но и гуминовые вещества, которые во многом определяют лекарственные свойства этого гриба [Шиврина А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги //Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М-Л., Наука, 1966. - С. 49-56; Шашкина Н.Я., Шашкин П.Н., Сергеев А.В. Химические и медико-биологические свойства чаги (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - Т. 40. - №10. - С. 37-44].It is known that the chaga mushroom Inonotusobliquus, growing on live birches, contains not only melanin, but also humic substances in black growths (sclerotia), which largely determine the medicinal properties of this mushroom [Shivrina A.N. Chemical characteristics of the active principles of chaga // Products of biosynthesis of higher fungi and their use. M-L., Science, 1966. - S. 49-56; Shashkina N.Ya., Shashkin P.N., Sergeev A.V. Chemical and medico-biological properties of chaga (review) // Chemical and pharmaceutical journal. - 2006. - T. 40. - No. 10. - S. 37-44].

Основная часть гуминовых веществ устойчива к биохимическому расщеплению, поэтому они накапливаются в почве, а также входят в состав торфов, бурых углей, сапропелей. Гуминовые вещества есть почти повсюду в природе. Их содержание в морских водах 0,1-3 мг/л, в речных - 20 мг/л, а в болотах - до 200 мг/л. В почвах гуминовых веществ 1-12%, при этом больше всего их в черноземах. Лидеры по содержанию этих соединений - органогенные породы, к которым относятся уголь, торф, сапропель, горючие сланцы. Обычно гуматы получают из окисленного бурого угля (его еще называют леонардитом), потому что в нем гуминовых веществ содержится до 85%. Еще этот уголь удобен тем, что у него низкая теплотворная способность, поэтому его обычно сгребают в отвалы. Получается, что основной источник гуминовых веществ - отходы добычи бурого угля, а это полностью соответствует основным принципам «зеленой химии». Запасы бурого угля в мире превышают 1 трлн.т [Перминова И.В. Гуминовые вещества - вызов химикам XXI века // Химия и жизнь. - 2008. - 1. - С. 50-55].The main part of humic substances is resistant to biochemical degradation, so they accumulate in the soil, and are also part of peat, brown coal, sapropel. Humic substances are found almost everywhere in nature. Their content in sea waters is 0.1-3 mg / l, in river waters - 20 mg / l, and in swamps - up to 200 mg / l. In soils, humic substances are 1-12%, while most of them are in chernozems. The leaders in the content of these compounds are organogenic rocks, which include coal, peat, sapropel, and oil shale. Usually humates are obtained from oxidized brown coal (it is also called leonardite), because it contains up to 85% of humic substances. This coal is also convenient because it has a low calorific value, so it is usually raked into dumps. It turns out that the main source of humic substances is waste from brown coal mining, and this fully corresponds to the basic principles of "green chemistry". The reserves of brown coal in the world exceed 1 trillion tons [Perminova I.V. Humic substances - a challenge to chemists of the XXI century // Chemistry and Life. - 2008. - 1. - S. 50-55].

Гумификацию-процесс превращения органических остатков в гуминовые вещества, ученые считают одним из величайших изобретений природы. В природе частично идет минерализация остатков, СО₂ возвращается в атмосферу, вода - растениям. Многочисленность функций гуминовых веществ обусловлены многообразием их по составу, молекулярным массам, свойствам. Наличие в ГВ разнообразных функциональных групп обуславливает, во-первых, участие этих соединений в химических реакциях окисления-восстановления, а во-вторых, реакционную способность в целом, включая ионный обмен и образование хелатных соединений. Будучи коллоидами, ГВ проявляют поверхностно-активные и электро-поверхностные свойства [Орлов Д.С. Гуминовые вещества в биосфере. Соросовский образовательный Журнал. - 1997. - №2 - С. 56-63].Humification is the process of converting organic residues into humic substances, scientists consider one of the greatest inventions of nature. The nature of the mineralization is partially residues, CO ₂ is returned to the atmosphere, water - plants. The multiplicity of functions of humic substances is due to their diversity in composition, molecular weights, and properties. The presence of various functional groups in HS determines, firstly, the participation of these compounds in chemical oxidation-reduction reactions, and, secondly, the reactivity in general, including ion exchange and the formation of chelate compounds. As colloids, HS exhibit surface-active and electro-surface properties [Orlov DS. Humic substances in the biosphere. Soros Educational Journal. - 1997. - No. 2 - S. 56-63].

В настоящее время, как в России, так и за рубежом, широко применяются БАД на основе гуминовых веществ: «Гумивит», «Мумие очищенное алтайское», «Гимилан», «Фульвомил» (Россия), «Oxyhumatek» (ЮАР), «Avirol™» (США), «Humic&FulvicAcid» (США), «VitalityBoostHA» (США), «ColloidalMineralsXLwithFulvicAcid» (Австралия), «RF2 LiquidPlantMinerals» (Канада). Ученые изучают фармакологические свойства гуминовых соединений с целью разработки на их основе лекарственных препаратов. Разработка методологических основ стандартизации гуминовых веществ в ряду «сырье - субстанция - препарат» является актуальной задачей. [Савченко И.А. Дорнеева И.Н., Лукша Е.А., Пасечник К.К. Биологическая активность гуминовых веществ: перспективы и проблемы их применения в медицине (обзор). // Медиаль, 2019. - №1 (23). - С. 54-60].Currently, both in Russia and abroad, dietary supplements based on humic substances are widely used: "Gumivit", "Purified Mumiyo Altai", "Gimilan", "Fulvomil" (Russia), "Oxyhumatek" (South Africa), " Avirol ™ (USA), Humic & FulvicAcid (USA), VitalityBoostHA (USA), ColloidalMineralsXLwithFulvicAcid (Australia), RF2 LiquidPlantMinerals (Canada). Scientists are studying the pharmacological properties of humic compounds in order to develop drugs based on them. The development of methodological foundations for the standardization of humic substances in the row "raw material - substance - preparation" is an urgent task. [Savchenko I.A. Dorneeva I.N., Luksha E.A., Pasechnik K.K. Biological activity of humic substances: prospects and problems of their application in medicine (review). // Medial, 2019. - №1 (23). - S. 54-60].

Известны несколько групп гуминовых веществ: гуминовые кислоты, растворяемые только в щелочных растворах; гиматомелановые кислоты, извлекаемые из сырого остатка (геля) гуминовых кислот этиловым спиртом; фульвокислоты, растворимые в воде, щелочных и кислых растворах; гумин - практически нерастворимое и неизвлекаемое вещество.Several groups of humic substances are known: humic acids, which are soluble only in alkaline solutions; hymatomelanic acids extracted from the crude residue (gel) of humic acids with ethyl alcohol; fulvic acids, soluble in water, alkaline and acidic solutions; humin is a practically insoluble and non-recoverable substance.

Для гуминовых кислот характерны нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперстность. Структурные единицы гуминовых кислот представляют собой ароматические конденсированные системы с боковыми цепями и гетероциклами. Функциональными группами являются карбоксильные, карбонильные, фенольные и спиртовые гидроксиды, хиноидные группировки, метоксилы, амино- и амидогруппы, моно-, ди-, полисахариды, пептиды, минеральные компоненты. Биологическая активность гуминовых кислот может быть обусловлена наличием в этих соединениях разнообразных функциональных групп; коллоидными свойствами и компонентным составом. Гуминовые кислоты связывают в прочные комплексы ионы металлов и органических токсикантов в воде и почве. Связанные вещества не так опасны, поскольку теряют биодоступность. Гуминовые кислоты имеют высокую сорбционную способность. Адсорбция гуминовыми кислотами включает не только физическое, но и химическое взаимодействие.Irregular structure, heterogeneity of structural elements and polydispersity are characteristic of humic acids. The structural units of humic acids are aromatic condensed systems with side chains and heterocycles. Functional groups are carboxyl, carbonyl, phenolic and alcohol hydroxides, quinoid groups, methoxyls, amino and amido groups, mono-, di-, polysaccharides, peptides, mineral components. The biological activity of humic acids may be due to the presence of various functional groups in these compounds; colloidal properties and component composition. Humic acids bind metal ions and organic toxicants in water and soil into strong complexes. The related substances are not as dangerous as they lose their bioavailability. Humic acids have a high sorption capacity. Adsorption by humic acids includes not only physical, but also chemical interactions.

Гуминовые вещества из морских и озерных донных отложений и воды фракционировали на гуминовые кислоты и фульвокислоты. Установлено антимикробное действие 12 препаратов из этих соединений в отношении 11 штаммов анаэробных и 8 штаммов аэробных бактерий, а также 2 штаммов дрожжеподобных грибов. Это свидетельствует об участии гуминовых соединений в самоочищении морских и озерных вод [Kupryszewski G., Pempkowiak J., Kedzia A. The effect of humic substances isolatedfrom a variety ofmarine and lacustrineenvironments on differentmicroorganisms//Oceanologia, 43 (2), 2001. - 3. pp. 257-261].Humic substances from sea and lake bottom sediments and water were fractionated into humic acids and fulvic acids. The antimicrobial effect of 12 preparations of these compounds was established against 11 strains of anaerobic bacteria and 8 strains of aerobic bacteria, as well as 2 strains of yeast-like fungi. This indicates the participation of humic compounds in the self-purification of sea and lake waters [Kupryszewski G., Pempkowiak J., Kedzia A. The effect of humic substances isolated from a variety of marine and lacustrineenvironments on different microorganisms // Oceanologia, 43 (2), 2001. - 3 . pp. 257-261].

Американская компания LaubBioChemicalsCorp.(Ньюпорт-Бич, Калифорния) была основана в 1996 году доктором Р. Дж. Лаубом, в первую очередь, для разработки синтетических и природных гуминовых соединений торговой марки HEPSYL для лечения ВИЧ- инфекции и других вирусных заболеваний. Показана высокая степень ингибирования таких вирусов, как HSV-1 и HSV-2 (вирус герпеса 1-го и 2-го типов, патент US 6,524,566, 2003), вирусов гриппа (типа А и В, патент №US 6,576,229, 2003 г.),вируса геморрагической лихорадки (патент US 6,524,567,2003), вируса HIV - вирус иммунодефицита человека(патент US 6,534,049,2003). Известно противовирусное средство на основе гуминовых кислот, полученных из медицинского лигнина (марки "Полифепан", рег. N 80/1211/3 - неспецифического энтерального сорбента) путем его окисления при 150-170°С в течение 0,5-1,5 ч и давлении 2,0-2,5 МПа [патент РФ №2172176, МПК А61К 35/78, опубл. 20.08.2001 г.]. Препарат эффективен против вируса простого герпеса 2-го типа, вируса гриппа типа A (PR-8), а также вируса саркомы Рауса BH-RSV(RAV-l) серологической подгруппы А.The American company LaubBioChemicalsCorp. (Newport Beach, California) was founded in 1996 by Dr. R. J. Laub, primarily to develop synthetic and natural humic compounds of the HEPSYL trademark for the treatment of HIV infection and other viral diseases. A high degree of inhibition of viruses such as HSV-1 and HSV-2 (herpes virus types 1 and 2, US patent 6,524,566, 2003), influenza viruses (type A and B, patent No. US 6,576,229, 2003) has been shown. ), hemorrhagic fever virus (US patent 6,524,567,2003), HIV virus - human immunodeficiency virus (US patent 6,534,049,2003). Known antiviral agent based on humic acids obtained from medical lignin (brand "Polyphepan", reg. N 80/1211/3 - nonspecific enteral sorbent) by oxidation at 150-170 ° C for 0.5-1.5 hours and a pressure of 2.0-2.5 MPa [RF patent No. 2172176, IPC A61K 35/78, publ. 08/20/2001]. The drug is effective against herpes simplex virus type 2, influenza type A virus (PR-8), and Rous sarcoma virus BH-RSV (RAV-l) serological subgroup A.

Гуминовые вещества, являясь гетерополимерами, могут служить источником структурных фрагментов органических макромолекул при биосинтезе, происходящем в живых организмах [Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 1. Биохимический аспект (обзор литературы)// Вестник Российской Академии естественных наук, 2016. - №1. - С. 11-18].Humic substances, being heteropolymers, can serve as a source of structural fragments of organic macromolecules in biosynthesis occurring in living organisms [AI Popov, VN Zelenkov, TV Teplyakova. Biological activity and biochemistry of humic substances. Part 1. Biochemical aspect (literature review) // Bulletin of the Russian Academy of Natural Sciences, 2016. - №1. - S. 11-18].

Известно, что гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия: адаптогенным, антитоксическим, гепатопротекторным, противомикробным, диуретическим и противовоспалительным действием [Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект. Обзор литературы)// Вестник Российской Академии естественных наук, 2016. - №5. - С. 9-15.It is known that humic substances have a wide spectrum of therapeutic action: adaptogenic, antitoxic, hepatoprotective, antimicrobial, diuretic and anti-inflammatory action [Popov A.I., Zelenkov V.N., Teplyakova T.V. Biological activity and biochemistry of humic substances. Part 2. Biomedical aspect. Literature review) // Bulletin of the Russian Academy of Natural Sciences, 2016. - No. 5. - S. 9-15.

Было показано, что гуминовые кислоты обладают противовирусной активностью в отношении вирусов иммунодефицита человека [Корнилаева Г.В., Перминова И.В., Гилязова А.В. и др. Гуминовые вещества как перспективные соединения для создания микробицидных препаратов // Российский иммунологический журнал. 2010. Т. 4 (13), №3. С. 255-260]. Наиболее активные фракции гуминовых соединений обладали выраженной противовирусной активностью в отношении пандемического вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1 pdm09): ID50=3,75 Mg/ml, IS=266; высокопатогенного вируса гриппа птиц A/Commongull/Chany/06 (H5N1): ID50=9,5 Mg/ml, IS=105; против Herpes simplex virus (HSVII): ID50=3,5 Mg/ml, IS=285; против Human immunodeficiency virus I (HIVI): ID50=2,7 Mg/ml, IS=370. [Ilycheva T.N., Balakhnin S.M., Gashnikova N.M., Durymanov A.G., Ananko G.G., Kosogova T.A, Miloshenko T.P., Redkin B.A., Teplyakova T.V. Antiviral Activity of Humic Substances// Third International Conference of CISIHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference da Rostim «Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture)) EQT-daRostim-2014 November 19-23, 2014, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia. P. 42].It has been shown that humic acids have antiviral activity against human immunodeficiency viruses [Kornilaeva G.V., Perminova I.V., Gilyazova A.V. et al. Humic substances as promising compounds for the creation of microbicidal preparations // Russian Journal of Immunology. 2010. T. 4 (13), No. 3. S. 255-260]. The most active fractions of humic compounds had a pronounced antiviral activity against the pandemic influenza virus A / California / 04/09 (H1N1 pdm09): ID50 = 3.75 Mg / ml, IS = 266; highly pathogenic avian influenza virus A / Commongull / Chany / 06 (H5N1): ID50 = 9.5 Mg / ml, IS = 105; against Herpes simplex virus (HSVII): ID50 = 3.5 Mg / ml, IS = 285; against Human immunodeficiency virus I (HIVI): ID50 = 2.7 Mg / ml, IS = 370. [Ilycheva T.N., Balakhnin S.M., Gashnikova N.M., Durymanov A.G., Ananko G.G., Kosogova T.A, Miloshenko T.P., Redkin B.A., Teplyakova T.V. Antiviral Activity of Humic Substances // Third International Conference of CISIHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference da Rostim “Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture)) EQT-daRostim-2014 November 19-23, 2014, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia. P. 42].

Известно применение природных гуминовых кислот, выделенных из почвы, для лечения ВИЧ-инфекции [заявка США №20040137085, МПК А61К 35/78, опубл. 15.07.2004 г.]. Препарат изготавливается американской компанией Aldrich Chemical Company и упоминается в заявке как AVC. Подавление ВИЧ-инфекции происходит при контакте лейкоцитов ВИЧ-инфицированного человека с препаратом гуминовой кислоты. Заявлен также метод иммуностимуляции интерлейкина-2, метод усиления иммунного ответа на вакцинацию с использованием гуминовой кислоты в качестве адъюванта при вакцинации пациента с ВИЧ-инфекцией.Known use of natural humic acids isolated from the soil for the treatment of HIV infection [US application No. 20040137085, IPC A61K 35/78, publ. July 15, 2004]. The drug is manufactured by the American company Aldrich Chemical Company and is referred to in the application as AVC. Suppression of HIV infection occurs when the leukocytes of an HIV-infected person come into contact with a preparation of humic acid. Also claimed is a method of immunostimulation of interleukin-2, a method of enhancing the immune response to vaccination using humic acid as an adjuvant when vaccinating a patient with HIV infection.

Однако в указанной заявке США рассматривается применение гуминовых кислот только для лечения ВИЧ-инфекции и нет данных об их применении для лечения других вирусных заболеваний.However, this US application considers the use of humic acids only for the treatment of HIV infection and there is no data on their use for the treatment of other viral diseases.

Известно средство против передачи ВИЧ/СПИД половым путем, выполненное в виде суппозитория, содержащего фармакологически приемлемую основу и активную субстанцию (патент РФ №2531945, МПК А61К 35/02, опубл. 27.07.2014 г.). В качестве активной субстанции с анти-ВИЧ-активностью используют фракцию гуминовых кислот, выделенных из окисленного бурого угля, а в качестве основы используется масло какао или твердый кондитерский жир и эмульгатор. Выделение фракции гуминовых кислот (НАС-1) осуществляют путем обработки бурого угля 1%-ным раствором гидроксида натрия (NaOH) и нагревании смеси в течение 2 часов на кипящей водяной бане (при температуре 80°С). После охлаждения продукты реакции центрифугируют, раствор декантируют, нерастворившийся остаток промывают один - два раза 100 мл 1%-ого раствора гидроксида натрия и вновь центрифугируют, собирая основной экстракт и промывные воды в один приемник. К полученному раствору добавляют раствор концентрированной соляной кислоты до рН 2 для осаждения гуминовых кислот. Образовавшийся осадок гуминовых кислот отделяют центрифугированием и обессоливают с помощью диализа. Полученный препарат гуминовых кислот высушивают при 80°С в сушильном шкафу.Known agent against sexual transmission of HIV / AIDS, made in the form of a suppository containing a pharmacologically acceptable base and an active substance (RF patent No. 2531945, IPC A61K 35/02, publ. 27.07.2014). A fraction of humic acids isolated from oxidized brown coal is used as an active substance with anti-HIV activity, and cocoa butter or hard confectionery fat and an emulsifier are used as a base. Isolation of the fraction of humic acids (HAC-1) is carried out by treating brown coal with a 1% sodium hydroxide solution (NaOH) and heating the mixture for 2 hours in a boiling water bath (at a temperature of 80 ° C). After cooling, the reaction products are centrifuged, the solution is decanted, the insoluble residue is washed once or twice with 100 ml of 1% sodium hydroxide solution and centrifuged again, collecting the main extract and washings in one receiver. To the resulting solution is added a solution of concentrated hydrochloric acid to pH 2 to precipitate humic acids. The formed precipitate of humic acids is separated by centrifugation and desalted by dialysis. The resulting preparation of humic acids is dried at 80 ° C in a drying oven.

Известен патент на противовирусное средство на основе гуминовых кислот, полученных из окисленного бурого угля [Теплякова Т.В., Ананько Г.Г., Казачинская Е.И., Носик Н.Н., Носик Д.Н., Лобач О.А., Киселева И.А., Противовирусное средство на основе гуминовых кислот: пат. 2678986 С1 Рос. Федерация. №20118110484, заявл. 23.03.2018; опубл. 05.02.2019, Бюл. №4]. Средство обладает активностью против вируса гриппа A/H1N1/California/2009 (в концентрации 3-4 мкг/мл); против вируса герпеса 1 типа (в концентрации 45-55 мкг/мл); вируса герпеса 2 типа (в концентрации 100-150 мкг/мл); вируса Западного Нила (в концентрации 4,2-5,4 мкг/мл); вируса иммунодефицита человека (в концентрации 45-55 мкг/мл).Техническим результатом данного изобретения является получение препарата гуминовых кислот из окисленного бурого угля с более низким содержанием токсичных веществ и более широким спектром противовирусного действия в отношении вирусов, патогенных для человека.Known patent for an antiviral agent based on humic acids obtained from oxidized brown coal [Teplyakova T.V., Ananko G.G., Kazachinskaya E.I., Nosik N.N., Nosik D.N., Lobach O.A. ., Kiseleva I.A., Antiviral agent based on humic acids: Pat. 2678986 C1 Rus. Federation. No. 20118110484, app. 03/23/2018; publ. 02/05/2019, Bul. No. 4]. The agent has activity against the influenza A / H1N1 / California / 2009 virus (at a concentration of 3-4 μg / ml); against herpesvirus type 1 (at a concentration of 45-55 μg / ml); herpes virus type 2 (at a concentration of 100-150 μg / ml); West Nile virus (at a concentration of 4.2-5.4 μg / ml); human immunodeficiency virus (at a concentration of 45-55 μg / ml). The technical result of this invention is to obtain a preparation of humic acids from oxidized brown coal with a lower content of toxic substances and a wider spectrum of antiviral action against viruses pathogenic for humans.

Однако активность против коронавируса SARS-CoV-2 указанного средства на основе гуминовых кислот не проверялась.However, the activity against the SARS-CoV-2 coronavirus of this agent based on humic acids has not been tested.

Известны природные соединения, такие как флавоноиды [https://bioflavit.ru/wp-content/uploads/Taxifolin-basel-rus2.pdf], которые ингибируют основную протеазу SARS-CoV-1, и их эффективность была продемонстрирована с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) [Pillaiyar, Т.; Manickam, М; Namasivayam, V.; Hayashi, Y.; Jung, S. H. An over view of severe acute respiratory syndrome - coronavirus (SARS-CoV) 3CL protease inhibitors: Peptidomimetic sand small molecule chemotherapy. Journal of Medicinal Chemistry 2016, 59, 6595-6628.].Natural compounds are known such as flavonoids [https://bioflavit.ru/wp-content/uploads/Taxifolin-basel-rus2.pdf] that inhibit the main protease SARS-CoV-1, and their effectiveness has been demonstrated using resonance transfer fluorescence energy (FRET) [Pillaiyar, T .; Manickam, M; Namasivayam, V .; Hayashi, Y .; Jung, S. H. An over view of severe acute respiratory syndrome - coronavirus (SARS-CoV) 3CL protease inhibitors: Peptidomimetic sand small molecule chemotherapy. Journal of Medicinal Chemistry 2016, 59, 6595-6628.].

Кроме того, в экспериментах in vivo биофлавоноид (-) таксифолин (дигидрокверцетин) проявляет активность против других вирусов, таких как вирус Коксаки В4. Известно, что лиственница сибирская (Larixsibirica) вырабатывает (-) - таксифолин, являющийся природным ресурсом для его экстракции. Кроме того, пищевые препараты, содержащие (-) - таксифолин, легко доступны в аптеках и некоторых компаниях, обеспечивая прямой и быстрый доступ к потенциальному противовирусному препарату. Примечательно, что (-) - таксифолин переносит семь водородных связей, что является самым высоким показателем в выборе противовирусных соединений. Поскольку водородные связи являются ключевым фактором, определяющим особенность лекарственного средства (-) - таксифолин может являться природной альтернативой предлагаемым ингибиторам СР-1-CP-11 [Wade, R.C.; Goodford, P.J. The role of hydrogen-bonds in drug binding. Progress in clinical and biological research. 1989, 289, P. 433-444].In addition, in in vivo experiments, the bioflavonoid (-) taxifolin (dihydroquercetin) is active against other viruses, such as the Coxsackie B4 virus. It is known that Siberian larch (Larixsibirica) produces (-) - taxifolin, which is a natural resource for its extraction. In addition, food preparations containing (-) - taxifolin are readily available from pharmacies and some companies, providing direct and quick access to a potential antiviral drug. It is noteworthy that (-) - taxifolin carries seven hydrogen bonds, which is the highest in the choice of antiviral compounds. Since hydrogen bonds are a key factor determining the specificity of a drug (-) - taxifolin can be a natural alternative to the proposed CP-1-CP-11 inhibitors [Wade, R.C .; Goodford, P.J. The role of hydrogen-bonds in drug binding. Progress in clinical and biological research. 1989, 289, P. 433-444].

Известно также, что содержащийся в водорослях гепарин способен блокировать коронавирус SARS-CoV-2 лучше, чем, например, препарат "Ремдесивир", который активно используют в США для лечения COVID-19 [Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 inv itro/ PaulS. Kwon, HanseulOh, Seok-JoonKwon, WeihuaJin, FumingZhang, KeithFraser, JungJooHong, Robert J. Linhardt&Jonathans. Dordick.CellDiscovery, volume 6, Article number: 50 (2020)]. Ученые целенаправленно исследовали свойства гепарина - известного всем антикоагулянта. Было доказано, что это вещество обладает исключительным связывающим свойством к спайковому белку (S-белку) SARS-CoV-2 и снижает активность данного вируса.It is also known that the heparin contained in algae is able to block the SARS-CoV-2 coronavirus better than, for example, the drug Remdesivir, which is actively used in the United States to treat COVID-19 [Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 inv itro / PaulS. Kwon, HanseulOh, Seok-JoonKwon, WeihuaJin, FumingZhang, KeithFraser, JungJooHong, Robert J. Linhardt & Jonathans. Dordick.CellDiscovery, volume 6, Article number: 50 (2020)]. Scientists have purposefully investigated the properties of heparin, an anticoagulant known to all. This substance has been proven to have exceptional binding properties to the spike protein (S-protein) of SARS-CoV-2 and reduces the activity of this virus.

Наиболее близким аналогом по назначению (прототипом) является ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV на основе водного растительного экстракта, проявляющего доза-зависимую активность против SARS-CoV в тестах на клеточных культурах [заявка США №20080038382, МПК А61Р 31/12, опубл. 14.02.2008 г.]. В качестве водного растительного экстракта он содержит водный экстракт многолетнего травянистого растения Scutellariaspp, (вид рода Шлемник) эффективный для лечения пациента с инфекцией SARS-CoV. Указанное средство ингибирует инфекционность SARS-CoV приблизительно на 50% при самой высокой использованной концентрации (200 мкг/мл). Эффект зависит от дозы, учитывая, что при испытанной более низкой дозе наблюдается меньшее ингибирование. Значительно ингибирование на более высоком уровне было больше, чем рибавирин (100 мкг/мл).The closest analogue for the intended purpose (prototype) is a SARS-CoV coronavirus replication inhibitor based on an aqueous plant extract exhibiting dose-dependent activity against SARS-CoV in cell culture tests [US application No. 20080038382, IPC A61P 31/12, publ. February 14, 2008]. As an aqueous plant extract, it contains an aqueous extract of the perennial herb Scutellariaspp, (a species of the Shlemnik genus) effective for treating a patient with SARS-CoV infection. This agent inhibits the infectivity of SARS-CoV by about 50% at the highest concentration used (200 μg / ml). The effect is dose dependent, given that less inhibition is observed at the lower dose tested. The significantly higher inhibition was greater than ribavirin (100 μg / ml).

Однако указанный наиболее близкий аналог -ингибитор коронавируса SARS-CoV не исследовался на активность против нового коронавируса SARS-CoV-2.However, this closest analogue, the inhibitor of the SARS-CoV coronavirus, has not been tested for activity against the novel SARS-CoV-2 coronavirus.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение нового природного ингибитора репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе гуминовых веществ природного происхождения и расширение спектра средств против указанного коронавируса.The technical result of the claimed invention is to obtain a new natural inhibitor of the replication of the coronavirus SARS-CoV-2 based on humic substances of natural origin and to expand the range of drugs against said coronavirus.

Указанный технический результат достигается тем, что в ингибиторе репликации коронавируса на основе водорастворимых веществ природного происхождения, проявляющих доза-зависимую противовирусную активность в тестах на клеточных культурах, согласно изобретения, в качестве водорастворимых веществ природного происхождения он содержит водорастворимые гуминовые вещества, полученные из бурого угля, или базидального гриба Inonotus obliquus, или смеси в соотношении 1:1 гуминовых веществ из бурого угля и меланина, полученного из базидального гриба Inonotus obliquus, ингибирующий водный раствор которого в диапазоне 8,279-23,447 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную доза-зависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточной культуре Vero.The specified technical result is achieved by the fact that in the inhibitor of coronavirus replication based on water-soluble substances of natural origin, exhibiting dose-dependent antiviral activity in tests on cell cultures, according to the invention, as water-soluble substances of natural origin, it contains water-soluble humic substances obtained from brown coal, or the basidal fungus Inonotus obliquus, or a 1: 1 mixture of humic substances from brown coal and melanin obtained from the basidal fungus Inonotus obliquus, the inhibitory aqueous solution of which in the range 8.279-23.447 μg / ml exhibits 50% antiviral dose-dependent activity against SARS-CoV-2 in Vero cell culture tests.

Изобретение поясняется чертежами, приведенными на фиг. 1, А, Б - результаты измерения ОП (соответственно для образцов 20-51,20-55 ингибитора) в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат. По оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения.The invention is illustrated by the drawings shown in FIG. 1, A, B - OD measurement results (respectively for samples 20-51, 20-55 of the inhibitor), depending on the concentration of the drug, are presented in a semi-logarithmic coordinate system. The abscissa (X) shows the concentration of drugs in a logarithmic scale, and the ordinate (Y) shows OD in a linear scale.

Ниже приведены варианты получения заявляемого ингибитора репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водорастворимой фракции гуминовых веществ природного происхождения.Below are the options for obtaining the claimed inhibitor of replication of the coronavirus SARS-CoV-2 based on a water-soluble fraction of humic substances of natural origin.

Пример 1.Получение водорастворимой фракции гуминовых веществ из бурого угля, образец 20-50.Example 1 Obtaining a water-soluble fraction of humic substances from brown coal, sample 20-50.

Образец приготовлен по патенту Тепляковой Т.В и др. (RU 2678986 С1, 2019), но без обработки трипсином.The sample was prepared according to the patent of Teplyakova T.V. et al. (RU 2678986 C1, 2019), but without trypsin treatment.

Бурый уголь взят с ТЭЦ-5 г. Новосибирска, привезенный с разреза Бородинский им. М.И. Щадова, поставщик - Акционерное общество « СУЭК- Красноярск».Brown coal was taken from the TPP-5 in Novosibirsk, brought from the Borodinsky mine named after M.I. Shchadova, supplier - Joint Stock Company SUEK-Krasnoyarsk.

К 25 г бурого угля (помол 0,25 мм на мельнице универсальной MF-10 basik IKA) добавляют 50 мл 2%-ного аммиака и 40 мл перекиси водорода (29-32% ГОСТ 10929-76, изм. №1,2.). Перемешивают до завершения экзотермической реакции и полного осаждения пены, центрифугируют на центрифуге Centra CL3 20 мин при 4000 об/мин, осаждают гуминовые вещества соляной кислотой, последовательно переосаждают пять раз. Осадок разводят в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят рН до значения 7-8 ед. Далее высушивают при +30°С. Образец для испытаний содержит гуминовых веществ в количестве 2 мг в 1 мл стерильной воды.To 25 g of brown coal (grinding 0.25 mm on a universal mill MF-10 basik IKA) add 50 ml of 2% ammonia and 40 ml of hydrogen peroxide (29-32% GOST 10929-76, rev. No. 1.2. ). The mixture is stirred until the exothermic reaction is complete and the foam is completely precipitated, centrifuged in a Centra CL3 centrifuge for 20 min at 4000 rpm, humic substances are precipitated with hydrochloric acid, successively re-precipitated five times. The precipitate is diluted in a small amount of distilled water and the pH is adjusted to a value of 7-8 units. Then it is dried at + 30 ° C. The sample for testing contains humic substances in an amount of 2 mg in 1 ml of sterile water.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор гуминовых веществ, имеющий ингибирующую дозу в концентрации 23,1 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.An inhibitor was obtained containing an aqueous solution of humic substances, having an inhibitory dose at a concentration of 23.1 μg / ml, providing 50% antiviral protection in tests on Vero cell culture against SARS-CoV-2 coronavirus.

Пример 2. Получение смеси гуминовой кислоты из бурого угля и меланина из природного сырья чаги, образец 20-51.Example 2. Obtaining a mixture of humic acid from brown coal and melanin from natural raw chaga, sample 20-51.

Для этого 10 мг гуминовой кислоты (IC₅₀=14,34 мкг/мл) и 10 мг меланина из чаги(IC₅₀=8,188 мкг/мл), смешивают в соотношении 1:1, растворяют в 10 мл стерильной воды. Образец для испытаний содержит смесь гуминовых веществ(гуминовой кислоты и меланина) в количестве 2 мг в 1 мл стерильной воды.For this, 10 mg of humic acid (IC ₅₀ = 14.34 μg / ml) and 10 mg of melanin from chaga (IC ₅₀ = 8.188 μg / ml) are mixed in a 1: 1 ratio and dissolved in 10 ml of sterile water. The sample for testing contains a mixture of humic substances (humic acid and melanin) in the amount of 2 mg in 1 ml of sterile water.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор смеси в соотношении 1:1 гуминовой кислоты из бурого угля и меланина из чаги, имеющей ингибирующую дозу в концентрации 8,279 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.An inhibitor was obtained containing an aqueous solution of a mixture in a 1: 1 ratio of humic acid from brown coal and melanin from chaga, having an inhibitory dose at a concentration of 8.279 μg / ml, providing 50% antiviral protection in Vero cell culture tests against SARS-CoV coronavirus -2.

Пример 3. Биологически активная добавка к пище (БАД) Гимилан, образец 20-53.Example 3. Biologically active food additive (BAA) Gimilan, sample 20-53.

Биологически активная добавка к пище (БАД) Гимилан производится в ООО «Биотехнологии» (660052 г. Красноярск, ул. Затонская 46 ж). Свидетельство о регистрации № RU.77.99.11.003.Е.003421.03.14; состав: комплекс гуминовых и фульвовых кислот из бурого угля. Производится на основании технических условий ТУ-9197-003-38605220-14. Дата регистрации: 26.03.2014.Biologically active food additive (BAA) Gimilan is produced in Biotechnology LLC (660052 Krasnoyarsk, Zatonskaya str. 46 g). Registration certificate No. RU.77.99.11.003.Е.003421.03.14; composition: a complex of humic and fulvic acids from brown coal. Produced on the basis of technical specifications TU-9197-003-38605220-14. Date of registration: 26.03.2014.

Препарат Гимилан в жидкой форме в количестве 40 мл высушивают при +30°С. Образец для испытаний содержит 2 мг в 1 мл стерильной воды.The drug Gimilan in liquid form in an amount of 40 ml is dried at + 30 ° C. The test specimen contains 2 mg in 1 ml of sterile water.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор гуминовых веществ, имеющий ингибирующую дозу в концентрации 23,292 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.An inhibitor was obtained containing an aqueous solution of humic substances, having an inhibitory dose at a concentration of 23.292 μg / ml, providing 50% antiviral protection in tests on Vero cell culture against SARS-CoV-2 coronavirus.

Пример 4. Получение водорастворимой фракции гуминовых кислот из бурого угля с обработкой трипсином для уменьшения токсических веществ, образец 20-55.Example 4. Obtaining a water-soluble fraction of humic acids from brown coal with trypsin treatment to reduce toxic substances, sample 20-55.

Образец приготовлен по патенту Тепляковой Т.В и др. (RU 2678986 С1, 2019 г.). Бурый уголь доставлен из Красноярского края с разреза Бородинский им. М.И. Щадова, поставщик - Акционерное общество « СУ ЭК- Красноярск».The sample was prepared according to the patent of Teplyakova T.V. et al. (RU 2678986 C1, 2019). Brown coal was delivered from the Krasnoyarsk Territory from the Borodinsky open-pit mine. M.I. Shchadova, supplier - Joint Stock Company SU EK-Krasnoyarsk.

К 25 г бурого угля(помол 0,25 мм на мельнице универсальной MF-10 basik IKA) добавляют 50 мл 2%-ного аммиака и 40 мл перекиси водорода (29-32% ГОСТ 10929-76, изм. №1,2.). Смесь перемешивают до завершения экзотермической реакции и полного осаждения пены. Продукт центрифугируют на центрифуге Centra CL3 20 мин при 4000 об/мин, осаждают гуминовые вещества соляной кислотой с последующим переосаждением пять раз. Осадок разводят в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят рН до значения 7-8 ед. Препарат сушат при +30°С.To 25 g of brown coal (grinding 0.25 mm on a universal mill MF-10 basik IKA) add 50 ml of 2% ammonia and 40 ml of hydrogen peroxide (29-32% GOST 10929-76, rev. No. 1.2. ). The mixture is stirred until the exothermic reaction is complete and the foam has completely precipitated. The product is centrifuged in a Centra CL3 centrifuge for 20 min at 4000 rpm, humic substances are precipitated with hydrochloric acid, followed by reprecipitation five times. The precipitate is diluted in a small amount of distilled water and the pH is adjusted to a value of 7-8 units. The drug is dried at + 30 ° C.

С целью уменьшения токсических веществ далее препарат обрабатывают трипсином. Для этого 1 г сухих гуминовых кислот растворяют в 20 мл стерильной воды, добавляют 1 мл Трис основания (ТУ 6.09-42-92-76 XY 1М 1.21 г в 10 мл) и 30 мкл трипсина (Trypsin-EDTA (0,05%о) in DPBS(lx) производство CAPRICORN). Смесь выдерживают 5 часов в термостате при +37С. Далее осаждают гуминовые вещества соляной кислотой, центрифугируют на центрифуге (настольная, Centra CL3) 20 мин при 4000 об/мин, доводят рН до 7-8 ед. и высушивают при +30°С. Образец для испытаний содержит 2 мг в 1 мл стерильной воды.In order to reduce toxic substances, the drug is further treated with trypsin. For this, 1 g of dry humic acids is dissolved in 20 ml of sterile water, 1 ml of Tris base (TU 6.09-42-92-76 XY 1M 1.21 g in 10 ml) and 30 μl of trypsin (Trypsin-EDTA (0.05% o ) in DPBS (lx) produced by CAPRICORN). The mixture is kept for 5 hours in a thermostat at + 37C. Then humic substances are precipitated with hydrochloric acid, centrifuged in a centrifuge (tabletop, Centra CL3) for 20 minutes at 4000 rpm, pH is adjusted to 7-8 units. and dried at + 30 ° C. The test specimen contains 2 mg in 1 ml of sterile water.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор гуминовых веществ, имеющий ингибирующую дозу в концентрации 14,34 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.An inhibitor was obtained containing an aqueous solution of humic substances, having an inhibitory dose at a concentration of 14.34 μg / ml, providing 50% antiviral protection in tests on Vero cell culture against SARS-CoV-2 coronavirus.

Пример 5. Получение гуминовых кислот из аптечной чаги, образецExample 5. Obtaining humic acids from pharmacy chaga, sample

20-61. (Образец приготовлен по патенту Тепляковой Т.В и др., RU 2678986 С1, 2019 г.). К навеске 25 г сухого измельченного до 1 мм на мельнице (мельница универсальная MF-10 basik IKA) сырья аптечной чаги, добавляют 100 мл 2%-ного аммиака и 80 мл перекиси водорода (29-32%) ГОСТ 10929-76, изм. №1,2.). После завершения экзотермической реакции и полного осаждения пены смесь фильтруют через два капроновых фильтра, осаждают гуминовые кислоты соляной кислотой, последовательно переосаждают пять раз. Осадок разводят в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят рН до значения 7-8 ед. с последующей сушкой при +30°С.20-61. (The sample was prepared according to the patent of Teplyakova T.V. et al., RU 2678986 C1, 2019). Add 100 ml of 2% ammonia and 80 ml of hydrogen peroxide (29-32%) GOST 10929-76, rev. No. 1.2.). After the completion of the exothermic reaction and complete precipitation of the foam, the mixture is filtered through two nylon filters, humic acids are precipitated with hydrochloric acid, and successively re-precipitated five times. The precipitate is diluted in a small amount of distilled water and the pH is adjusted to a value of 7-8 units. followed by drying at + 30 ° С.

Далее берут 2,5 г полученных сухих гуминовых кислот из чаги, растворяют в 50 мл стерильной воды, добавляют 2,5 мл Трис основания (ТУ 6.09-42-92-76 XY 1М 1.21 г в 10 мл) и 75 мкл трипсина (Trypsin-EDTA (0,05%о) in DPBS(lx) производство CAPRICORN). Смесь выдерживают 5 часов в термостате при +37С и осаждают гуминовые соединения соляной кислотой. Осадок центрифугируют на центрифуге (настольная Centra CL3) 20 мин при 4000 об/мин, доводят рН до 7-8 ед. и высушивают при +30°С. Образец для испытаний содержит 2 мг в 1 мл стерильной воды.Next, take 2.5 g of the obtained dry humic acids from chaga, dissolve in 50 ml of sterile water, add 2.5 ml of Tris base (TU 6.09-42-92-76 XY 1M 1.21 g in 10 ml) and 75 μl of trypsin (Trypsin -EDTA (0.05% o) in DPBS (lx) manufactured by CAPRICORN). The mixture is kept for 5 hours in a thermostat at + 37C and humic compounds are precipitated with hydrochloric acid. The precipitate is centrifuged in a centrifuge (benchtop Centra CL3) for 20 min at 4000 rpm, the pH is adjusted to 7-8 units. and dried at + 30 ° C. The test specimen contains 2 mg in 1 ml of sterile water.

Получен ингибитор, содержащий водный раствор гуминовых веществ в виде кислот, имеющий ингибирующую дозу в концентрации 23,447 мкг/мл, обеспечивающую 50%-ную противовирусную защиту в тестах на клеточной культуре Vero от коронавируса SARS-CoV-2.An inhibitor was obtained containing an aqueous solution of humic substances in the form of acids, having an inhibitory dose at a concentration of 23.447 μg / ml, providing 50% antiviral protection in tests on Vero cell culture against SARS-CoV-2 coronavirus.

Пример 6. Определение противовирусной активности образцов в отношении коронавируса SARS-Cov-2в культурах клеток Vero.Example 6. Determination of the antiviral activity of samples against SARS-Cov-2 coronavirus in Vero cell cultures.

Клеточные культуры. В работе использовали перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, полученные из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ Вектор. Монослой клеток выращивали в 96-луночных планшетах (по 0,1-0,15 мл/лунку клеточной суспензии с концентрацией 1,0-1,5×10⁵кл./мл) в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия) в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США) с добавлением пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и амфотерицина В (0,25 мкг/мл) (Antibiotic-Antimycotic (100Х), («Gibco», США). При культивировании клеток с вирусом в качестве поддерживающей среды использовали питательную среду DMEM с антибиотиками, без сыворотки.Cell cultures. In the work, we used transplantable cultures of kidney cells of the African green monkey Vero, obtained from the collection of cell cultures of the FBSI SSC VB Vector. A monolayer of cells was grown in 96-well plates (0.1-0.15 ml / well of cell suspension with a concentration of 1.0-1.5 × 10 ⁵ cells / ml) in DMEM medium (OOO Biolot, Russia) in the presence of 10% fetal bovine serum (Gibco, USA) with the addition of penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml) and amphotericin B (0.25 μg / ml) (Antibiotic-Antimycotic (100X (Gibco, USA) When cells with a virus were cultured, DMEM culture medium with antibiotics, without serum, was used as a maintenance medium.

Вирус SARS-CoV-2 штамм nCov/Victoria/1/2020 с инфекционным титром 5,0±0,29 lg ТЦД₅₀/МЛ получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».The SARS-CoV-2 virus strain nCov / Victoria / 1/2020 with an infectious titer of 5.0 ± 0.29 lg TCD ₅₀ / ML was obtained from the State collection of causative agents of viral infections and rickettsioses of the FBSI SSC VB "Vector".

Концентрацию вируса определяли путем титрования в культуре клеток Vero при культивировании в течении 3 суток при 37°С, 5% СО₂ и влажности 85-90%. Титры вируса рассчитывали методом Спирмена-Кербера, выражали в десятичных логарифмах 50%-х тканевых цитопатических доз в мл (lg ТЦД₅₀/МЛ) и представляли в виде М±m (±I95) для 95%-го доверительного уровня (195) [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика. 1976; 598 с; Virology Methods Manual. Edited by: Brian W.J. Mahy and Hillar O. Kangro.AcademicPress. 1996; 374 p.].The virus concentration was determined by titration in a Vero cell culture during cultivation for 3 days at 37 ° C, 5% CO ₂ and humidity 85-90%. Virus titers were calculated by the Spearman-Kerber method, expressed in decimal logarithms of 50% tissue cytopathic doses in ml (lg TCD ₅₀ / ML) and presented as M ± m (± I95) for a 95% confidence level (195) [ Sachs L. Statistical estimation. M .: Statistics. 1976; 598 s; Virology Methods Manual. Edited by: Brian WJ Mahy and Hillar O. Kangro.AcademicPress. 1996; 374 p.].

Колориметрический метод определения цитотоксичности и противовирусной активности препаратов in vitro.Colorimetric method for in vitro determination of cytotoxicity and antiviral activity of drugs.

Исследование цитотоксичности и противовирусной эффективности препаратов проводили колориметрическим методом по изменению оптической плотности (ОП) раствора красителя, поглощенного живыми клетками в монослое [Oestereich L., Ltidtke A., Wurr S., Rieger Т., Munoz-Fontela С, GtintherS. Successful treatment of advanced Ebola virus infection with T-705 (favipiravir) in a small animal model//Antiviral Research, 2014., 105: 17-21; Baker R.O., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkey pox and other orthopox virus infections//Antiviral Research., 2003., 57:13-23; Paragas J., Whitehouse C. A., Endy T. P., Bray M. A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus// Antiviral Research. 2004, 62:21-25].The study of cytotoxicity and antiviral efficacy of drugs was carried out by the colorimetric method by changing the optical density (OD) of a dye solution absorbed by living cells in a monolayer [Oestereich L., Ltidtke A., Wurr S., Rieger T., Munoz-Fontela C, Gtinther S. Successful treatment of advanced Ebola virus infection with T-705 (favipiravir) in a small animal model // Antiviral Research, 2014., 105: 17-21; Baker R.O., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkey pox and other orthopox virus infections // Antiviral Research., 2003., 57: 13-23; Paragas J., Whitehouse C. A., Endy T. P., Bray M. A simple assay for determining antiviral activity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Antiviral Research. 2004, 62: 21-25].

Для оценки эффективности каждого использовали 8 последовательных 3-кратных разведений препаратов. Начальная концентрация экстрактов на планшетах при оценке цитотоксичности и противовирусной активности препаратов составляла 300 мкг/мл.To evaluate the effectiveness of each, 8 consecutive 3-fold dilutions of the preparations were used. The initial concentration of extracts on the plates when assessing the cytotoxicity and antiviral activity of the preparations was 300 μg / ml.

При оценке противовирусной активности препаратов в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток Vero вносили по 0,1 мл разведений экстрактов в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия), а через 2 ч инкубации при 37°С, 5% СО₂ вносили по 0,1 мл разведения вируса в среде DMEM без сыворотки с множественностью инфицирования (MOI) 0,1 ТЦД₅₀/клетку. При такой множественности заражения цитопатическое действие вируса на монослой клеток через 3 суток инкубирования достигает не менее90% (контроль вируса без внесения препарата). Кроме того, в качестве «контроля клеток» использовали интактный монослой (без внесения вируса и препаратов).When evaluating the antiviral activity of the preparations to the wells of 96-well plates with a monolayer of Vero cells was added 0.1 ml of a dilution of extracts in DMEM medium (OOO "Biolot", Russia), and after 2 hours of incubation at 37 ° C, 5% CO ₂ was introduced 0.1 ml of virus dilution in serum-free DMEM medium with a multiplicity of infection (MOI) 0.1 TCD ₅₀ / cell. With such a multiplicity of infection, the cytopathic effect of the virus on the cell monolayer after 3 days of incubation reaches at least 90% (control of the virus without adding the drug). In addition, an intact monolayer (without virus and drugs) was used as a "cell control".

Через 3 суток инкубирования в лунки планшета с монослоем клеток Vero в культуральную среду вносили витальный (прижизненный) краситель нейтральный красный 0,05 мл на1,5 часа при 37°С. После этого монослой клеток промывали двукратно физраствором, вносили лизирующий буфер и через 30 мин определяли оптическую плотность (ОП).After 3 days of incubation in the wells of the plate with a monolayer of Vero cells in the culture medium was added a vital (intravital) dye neutral red 0.05 ml for 1.5 hours at 37 ° C. After that, the cell monolayer was washed twice with saline solution, lysis buffer was added, and after 30 min the optical density (OD) was determined.

Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного ридера «Multiskan FC» (ThermoScientific, USA). Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат (фиг. 1, А, Б). При этом по оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения. По показателям ОП рассчитывали 50%-ю токсическую концентрацию (ТС₅₀ в мкг/мл) и 50%-ю ингибирующую (эффективную) концентрацию (IC₅₀ в мкг/мл) препарата при помощи ПО SoftMaxPro-4.0. ТС₅₀ - это величина концентрации препарата в лунке планшета, разрушающая50% клеток в монослое. IC₅₀ - это концентрация препарата, которая ингибирует репликацию вируса и сохраняет 50% клеток жизнеспособными.Optical density was measured using a Multiskan FC plate reader (ThermoScientific, USA). The results of measuring OD depending on the concentration of the drug are presented in a semilogarithmic coordinate system (Fig. 1, A, B). In this case, the abscissa axis (X) shows the concentration of drugs in a logarithmic measurement scale, and the ordinate axis (Y) - OD in a linear measurement scale. The OD values were used to calculate the 50% toxic concentration (TC ₅₀ in μg / ml) and 50% inhibitory (effective) concentration (IC ₅₀ in μg / ml) of the preparation using the SoftMaxPro-4.0 software. TC ₅₀ is the value of the concentration of the drug in the well of the plate, destroying 50% of the cells in the monolayer. IC ₅₀ is the concentration of drug that inhibits viral replication and keeps 50% of cells viable.

На основании этих показателей рассчитывали индекс селективности (SI) препарата: SI=TC₅₀:IC₅₀ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Хабриева Р.У. М.: ОАО «Издательство «Медицина». 2005; 832 с; Методические рекомендации по изучению специфической активности индукторов интерферонов. Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств. Часть первая/Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с].Based on these indicators, the selectivity index (SI) of the drug was calculated: SI = TC ₅₀ : IC ₅₀ [Guidelines for experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. Ed. Khabrieva R.U. M .: JSC "Publishing House" Medicine ". 2005; 832 s; Methodical recommendations for the study of the specific activity of interferon inducers. Guidelines for conducting clinical trials of medicinal products. Part One / Ed. A.N. Mironov. - M .: Grif and K, 2012. - 944 s].

Пример 8. Результаты определения противовирусной активности водорастворимых фракций гуминовых веществ в отношении коронавируса SARS-Cov-2 на клетках Vero.Example 8. Results of determining the antiviral activity of water-soluble fractions of humic substances against SARS-Cov-2 coronavirus on Vero cells.

В таблице 1 представлены результаты по оценке противовирусной активности гуминовых веществ в отношении коронавируса, штамма nCov/Victoria/1/2020.Table 1 shows the results of evaluating the antiviral activity of humic substances against coronavirus, strain nCov / Victoria / 1/2020.

Лучшими образцами по ингибированию репликации коронавируса, штамм nCov/Victoria/1/2020, в клеточной культуре Vero являются образцы: 20-51 и 0-55. Образец 20-51 - смесь гуминовой кислоты из бурого угля с меланином из чаги. Возможно, здесь проявляется синергетический эффект.The best samples for inhibition of coronavirus replication, strain nCov / Victoria / 1/2020, in Vero cell culture are samples: 20-51 and 0-55. Sample 20-51 is a mixture of humic acid from brown coal with melanin from chaga. Perhaps there is a synergistic effect here.

Образцы 20-50, 20-53 и 20-61 имеют сходные результаты (IC₅₀ составляет 23,1; 23,292 и 23, 447 мкг/ мл соответственно). У этих препаратов низкая токсичность и высокая активность против коронавируса SARS-Cov-2.Samples 20-50, 20-53 and 20-61 have similar results (IC ₅₀ is 23.1; 23.292 and 23.447 μg / ml, respectively). These drugs have low toxicity and high activity against the SARS-Cov-2 coronavirus.

Claims

1. The use of water-soluble humic substances from brown coal, obtained as a result of the exothermic reaction of crushed brown coal in a mixture of 2% ammonia and hydrogen peroxide, followed by precipitation and re-precipitation of humic substances with hydrochloric acid, dilution in water at pH 7.0-8.0, drying, with or without trypsinization, to inhibit the replication of SARS-CoV-2 coronavirus, which at a concentration in the range of 14.34-23.1 μg / ml exhibit 50% antiviral dose-dependent activity against SARS-CoV-2 in tests for cell cultures Vero.

2. The use of water-soluble humic substances from chaga - the basidal fungus Inonotus obliquus, obtained as a result of the exothermic reaction of crushed chaga in a mixture of 2% ammonia and hydrogen peroxide, followed by precipitation and re-precipitation of humic substances with hydrochloric acid, dilution in water at pH 7.0-8 , 0, drying, treatment with trypsin to inhibit the replication of SARS-CoV-2 coronavirus, which at a concentration of 23.447 μg / ml exhibit 50% antiviral inhibitory dose-dependent activity against SARS-CoV-2 in tests on Vero cell cultures.