RU2751837C2

RU2751837C2 - Method for activation of cytotoxic lymphocytes

Info

Publication number: RU2751837C2
Application number: RU2019128494A
Authority: RU
Inventors: Сергей Иванович Черныш; Дмитрий Валентинович Тулин
Original assignee: Черныш Людмила Егоровна
Priority date: 2019-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2021-07-19
Also published as: RU2019128494A; RU2019128494A3

Abstract

FIELD: immunotherapy.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the field of immunotherapy and can be used to increase the antitumor activity of NK-cells and T-lymphocytes in the treatment and prevention of lung cancer, leukemia, cancer of viral etiology and other oncological diseases. Proposed is a method for activating cytotoxic lymphocytes by treating blood cells with a peptide containing amino acid sequence His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1), or its pharmacologically acceptable salts in a concentration that enhances the ability of cytotoxic lymphocytes to lyse transformed body cells, such as cancer cells or virus-infected cells. The method increases the expression of activation receptors CD25, CD69, NKG2D, CD226 CD244 and NKp80 on the surface of lymphocytes and reduces the expression of inhibitory receptors KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1, also increases the sensitivity of lymphocytes to IL-2 and IL-12, stimulates the production of IFNγ, maintains populations of NK-cells in a functionally active state during cytotoxic reaction with transformed cells.

EFFECT: method can be used in combination with IL-2 or IL-12 to enhance their antitumor effect. Activation of lymphocytes by the proposed method increases the number of tumor target cells with injuries from 13.5 to 73%.

20 cl, 12 dwg, 14 tbl, 14 ex

Description

Изобретение относится к области иммунотерапии и может быть использовано для повышения цитотоксической активности NK клеток (естественных киллеров) и Т лимфоцитов в отношении опухолевых и инфицированных вирусами клеток. Приоритетной областью применения изобретения является лечение онкологических и вирусных заболеваний человека и других теплокровных животных. The invention relates to the field of immunotherapy and can be used to increase the cytotoxic activity of NK cells (natural killer cells) and T lymphocytes against tumor and virus-infected cells. The priority field of application of the invention is the treatment of oncological and viral diseases of humans and other warm-blooded animals.

Известны различные способы активации иммунокомпетентных клеток крови, предназначенные для повышения эффективности иммунотерапии и клеточной терапии онкологических и инфекционных заболеваний [1, 2]. Особое внимание уделяется активации NK клеток - главных эффекторов системы естественного противоопухолевого и противовирусного иммунитета человека и других млекопитающих [3-6]. В частности, известны способы активации цитотоксических NK клеток и Т лимфоцитов с помощью клеточных препаратов, цитокинов и других веществ, стимулирующих переход этих клеток в функционально активное состояние. Так, известны способы активации NK клеток путем их контакта с дендритными клетками [7], препаратом убитых облучением опухолевых клеток [8], генетически модифицированными опухолевыми клетками [9], антителами к CD27 рецептору [10]. Известен способ активации Т лимфоцитов веществами из группы сфинголипидов [11]. Известен также способ одновременной активации NK клеток и цитотоксических Т лимфоцитов, включающий обработку клеток крови комбинацией стимуляторов клеточной пролиферации, противовоспалительных агентов и синтетических пептидов [12].There are various methods of activating immunocompetent blood cells designed to increase the effectiveness of immunotherapy and cell therapy for oncological and infectious diseases [1, 2]. Particular attention is paid to the activation of NK cells - the main effectors of the system of natural antitumor and antiviral immunity in humans and other mammals [3-6]. In particular, methods of activating cytotoxic NK cells and T lymphocytes using cell preparations, cytokines and other substances that stimulate the transition of these cells to a functionally active state are known. Thus, there are known ways to activate NK cells by their contact with dendritic cells [7], a preparation of tumor cells killed by radiation [8], genetically modified tumor cells [9], antibodies to the CD27 receptor [10]. A known method of activating T lymphocytes with substances from the group of sphingolipids [11]. There is also known a method of simultaneous activation of NK cells and cytotoxic T lymphocytes, including the treatment of blood cells with a combination of cell proliferation stimulants, anti-inflammatory agents and synthetic peptides [12].

Известным способом активации Т лимфоцитов и NK клеток является их обработка провоспалительным цитокином интерлейкином-2 (IL-2). Сущность, достоинства и недостатки данного способа детально описаны в литературе [13]. По своей технической сущности он является наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения среди известных технических решений, применяемых в настоящее время в клинической практике лечения различных онкологических заболеваний. Общим с заявляемым изобретением признаком является то, что противоопухолевый эффект достигается путем введения в кровь пациента, или место локализации опухоли, или питательную среду для культивирования клеток крови вне организма фармакологически активного вещества, стимулирующего цитотоксическую активность Т лимфоцитов и NK клеток в отношении клеток опухоли. Недостатками известного способа являются высокая токсичность, низкий уровень терапевтической эффективности при применении в режиме монотерапии, высокая стоимость лечения. Высокая токсичность IL2 не позволяет создать и поддерживать терапевтически эффективную концентрацию препарата в организме пациента и создает риск тяжелых побочных эффектов, включая вероятность летального исхода. Применение IL2 в относительно безопасной концентрации обеспечивает лишь временную задержку развития опухоли у части пациентов (порядка 15% при метастазирующем раке или карциноме почки), однако окончательное выздоровление происходит в редких случаях. Разработаны способы применения IL2 в комбинации с другими лекарственными средствами или методами клеточной терапии, которые позволяют повысить долю пациентов, положительно реагирующих на лечение, примерно до 50%, однако и в этих случаях положительный эффект в большинстве случаев носит временный характер. Кроме того, терапевтическая эффективность IL2 ограничена известной особенностью его действия на систему Т лимфоцитов: наряду с желательным эффектом - стимуляцией активности цитотоксических лимфоцитов - IL2 также стимулирует активность регуляторных Т лимфоцитов (T_reg), которые подавляют противоопухолевый иммунный ответ и таким образом ограничивают терапевтическое действие IL2 у онкологических больных. Известным недостатком этого способа является также высокая стоимость лечения, обусловленная большими затратами на производство активного вещества (рекомбинантного IL2), а также необходимость проведения лечения в условиях специализированной клиники. Известное применение IL2 в комбинации с другими препаратами (например, цитокинами или моноклональными антителами) или методами клеточной терапии делает данный способ еще более дорогостоящим и малодоступным. Перечисленные выше и другие известные способы активации цитотоксических лимфоцитов также характеризуются рядом недостатков, включая техническую сложность, высокую стоимость и нежелательные побочные эффекты. Наличие этих недостатков затрудняет применение способов активации NK и Т клеток в клинической практике и делает необходимым продолжение поиска новых технических решений. Заявляемый способ позволяет устранить недостатки, присущие прототипу, путем использования в известном способе усиления противоопухолевой активности цитотоксических лимфоцитов вместо IL2 пептида из группы аллостатинов или его фармацевтически приемлемых солей в концентрации, усиливающей цитотоксическую активность лимфоцитов в отношении трансформированных клеток организма, представляющие собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки. Преимущества заявляемого способа состоят в следующем. Аллостатин, в отличие от IL2, практически полностью лишен токсичности для здоровых клеток организма и не препятствует осуществлению функций лимфоцитов даже в концентрации, в 100 000 раз превышающей терапевтически эффективную концентрацию. Кроме того, аллостатин, являясь простым линейным олигопептидом, производится методом химического синтеза, который позволяет резко (на порядки) снизить стоимость получения фармацевтической субстанции по сравнению с рекомбинантными белками, к которым относится IL2. Важным преимуществом заявленного способа является возможность лечения форм рака, при которых IL2 не применяется. В настоящее время терапия IL2 используется главным образом при раке почки и меланоме. Приведенные в заявке результаты исследований показывают, что заявленный способ может найти применение при лечении рака легких, рака шейки матки и ано-генитальной области, миелолейкоза, а также для профилактики онкологических заболеваний вирусной этиологии путем элиминации зараженных вирусом папилломы человека клеток. Кроме того, заявленный способ обеспечивает комплексную перестройку рецепторного аппарата NK клеток и Т лимфоцитов, усиливая экспрессию активационных рецепторов CD25, CD69, NKG2D, CD226 и снижая экспрессию ингибирующих рецепторов KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1. Такая перестройка обеспечивает полноценный переход цитотоксических лимфоцитов в функционально активное состояние и для IL2 не описана. Показано также, что заявленный способ обеспечивает повышение чувствительности цитотоксических лимфоцитов к IL2 и интерлейкину 12 и, следовательно, может применяться в комбинации с этими цитокинами для усиления их противоопухолевого действия. Важным преимуществом заявленного способа является также возможность поддержания популяции NK клеток в функционально активном состоянии в процессе цитотоксической реакции с трансформированными клетками, представляющими собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки. В противоположность этому, IL2, наряду с активацией цитотоксических лимфоцитов, вызывает активацию T_reg лимфоцитов, блокирующих реакции противоопухолевого иммунитета и снижающих таким образом эффективность лечения.A known method of activating T lymphocytes and NK cells is their treatment with the pro-inflammatory cytokine interleukin-2 (IL-2). The essence, advantages and disadvantages of this method are described in detail in the literature [13]. In its technical essence, it is the closest analogue (prototype) of the proposed invention among the known technical solutions currently used in clinical practice for the treatment of various oncological diseases. A common feature with the claimed invention is that the antitumor effect is achieved by introducing into the patient's blood, or the site of tumor localization, or a nutrient medium for the cultivation of blood cells outside the body, a pharmacologically active substance that stimulates the cytotoxic activity of T lymphocytes and NK cells in relation to tumor cells. The disadvantages of this method are high toxicity, low level of therapeutic efficacy when used in monotherapy, high cost of treatment. The high toxicity of IL2 does not allow the creation and maintenance of a therapeutically effective concentration of the drug in the patient's body and creates the risk of severe side effects, including the likelihood of death. The use of IL2 in a relatively safe concentration provides only a temporary delay in tumor development in some patients (about 15% in metastatic cancer or renal carcinoma), but the final recovery occurs in rare cases. Methods of using IL2 in combination with other drugs or cell therapy methods have been developed, which allow increasing the proportion of patients who respond positively to treatment, up to about 50%, however, in these cases, the positive effect in most cases is temporary. In addition, the therapeutic efficacy of IL2 is limited by the known feature of its action on the T lymphocyte system: along with the desired effect of stimulating the activity of cytotoxic lymphocytes, IL2 also stimulates the activity of regulatory T lymphocytes (T _reg ), which suppress the antitumor immune response and thus limit the therapeutic effect of IL2 in cancer patients. A known disadvantage of this method is also the high cost of treatment, due to the high costs of the production of the active substance (recombinant IL2), as well as the need for treatment in a specialized clinic. The known use of IL2 in combination with other drugs (for example, cytokines or monoclonal antibodies) or cell therapy methods makes this method even more expensive and inaccessible. The above and other known methods for activating cytotoxic lymphocytes are also characterized by a number of disadvantages, including technical complexity, high cost, and undesirable side effects. The presence of these drawbacks complicates the application of methods for activating NK and T cells in clinical practice and makes it necessary to continue the search for new technical solutions. The inventive method eliminates the disadvantages inherent in the prototype by using in the known method of enhancing the antitumor activity of cytotoxic lymphocytes instead of IL2 peptide from the group of allostatin or its pharmaceutically acceptable salts in a concentration that enhances the cytotoxic activity of lymphocytes in relation to transformed body cells, which are cancer cells or infected with a virus cells. The advantages of the proposed method are as follows. Allostatin, in contrast to IL2, is almost completely devoid of toxicity to healthy cells of the body and does not interfere with the functioning of lymphocytes even at a concentration 100,000 times higher than the therapeutically effective concentration. In addition, allostatin, being a simple linear oligopeptide, is produced by chemical synthesis, which allows dramatically (by orders of magnitude) to reduce the cost of obtaining a pharmaceutical substance in comparison with recombinant proteins, which include IL2. An important advantage of the claimed method is the ability to treat cancer forms in which IL2 is not used. Currently, IL2 therapy is used mainly in renal cancer and melanoma. The research results presented in the application show that the claimed method can be used in the treatment of lung cancer, cancer of the cervix and ano-genital region, myeloid leukemia, as well as for the prevention of oncological diseases of viral etiology by eliminating cells infected with the human papillomavirus. In addition, the claimed method provides a complex restructuring of the receptor apparatus of NK cells and T lymphocytes, enhancing the expression of activation receptors CD25, CD69, NKG2D, CD226 and decreasing the expression of inhibitory receptors KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1. This rearrangement provides a full-fledged transition of cytotoxic lymphocytes to a functionally active state and has not been described for IL2. It has also been shown that the claimed method provides an increase in the sensitivity of cytotoxic lymphocytes to IL2 and interleukin 12 and, therefore, can be used in combination with these cytokines to enhance their antitumor effect. An important advantage of the claimed method is also the ability to maintain the population of NK cells in a functionally active state during a cytotoxic reaction with transformed cells, which are cancer cells or cells infected with a virus. In contrast, IL2, along with the activation of cytotoxic lymphocytes, induces the activation of T _reg lymphocytes, which block antitumor immunity responses and thus reduce the effectiveness of treatment.

В настоящем изобретении предлагается использовать для активации NK клеток и Т лимфоцитов неизвестные ранее свойства пептидов из группы аллостатинов. История создания аллостатинов связана с обнаружением одним из авторов настоящего изобретения аллоферонов - природных пептидов, обладающих противовирусной и противоопухолевой активностью [14, 15]. Аллоферон-1 нашел применение в медицине в качестве противовирусного лекарственного средства. Однако возможности создания на основе аллоферона-1 противоопухолевого лекарственного средства ограничивает то обстоятельство, что аллоферон в зависимости от концентрации может как ингибировать (в области высоких концентраций), так и стимулировать (в области низких концентраций) пролиферацию опухолевых клеток. На следующем этапе были проведены исследования с целью устранения этого недостатка аллоферонов. В результате были разработаны аллостатины - синтетические аналоги аллоферонов с выраженной антипролиферативной активностью, способные подавлять рост опухолевых клеток лимфоидного происхождения [16, 17]. Изучая влияние пептида аллостатин-1, аминокислотная последовательность которого представлена в прилагаемом Перечне последовательностей под номером SEQ ID №1 (далее по тексту аллостатин) на функциональное состояние клеток крови человека, авторы настоящего изобретения обнаружили новое неизвестное ранее свойство аллостатинов - способность усиливать реакции NK клеток и Т лимфоцитов на опухолевые клетки. Основываясь на этом наблюдении, мы предположили, что пептиды, соответствующие структурным формулам аллостатинов [16], могут найти применение в иммунотерапии рака в качестве фармакологических активаторов цитотоксических лимфоцитов. С целью проверки и развития этой гипотезы авторами была проведена серия исследований, результаты которых подтверждают применимость аллостатинов для решения этой важной задачи и обосновывают сущность способов и области их использования в иммунотерапии на примерах 1-14, представленных ниже. Основные результаты этих исследований состоят в следующем:The present invention proposes to use previously unknown properties of peptides from the group of allostatins to activate NK cells and T lymphocytes. The history of the creation of allostatins is associated with the discovery by one of the authors of the present invention alloferons - natural peptides with antiviral and antitumor activity [14, 15]. Alloferon-1 has found application in medicine as an antiviral drug. However, the possibility of creating an antitumor drug based on alloferon-1 is limited by the fact that alloferon, depending on the concentration, can both inhibit (in the region of high concentrations) and stimulate (in the region of low concentrations) the proliferation of tumor cells. At the next stage, studies were carried out in order to eliminate this deficiency of alloferons. As a result, allostatins, synthetic analogs of alloferons with pronounced antiproliferative activity, capable of suppressing the growth of tumor cells of lymphoid origin, were developed [16, 17]. Studying the effect of the peptide allostatin-1, the amino acid sequence of which is presented in the attached Sequence Listing under the number SEQ ID No. 1 (hereinafter referred to as allostatin) on the functional state of human blood cells, the authors of the present invention discovered a new previously unknown property of allostatin - the ability to enhance the reactions of NK cells and T lymphocytes to tumor cells. Based on this observation, we suggested that peptides corresponding to the structural formulas of allostatins [16] could find application in cancer immunotherapy as pharmacological activators of cytotoxic lymphocytes. In order to test and develop this hypothesis, the authors carried out a series of studies, the results of which confirm the applicability of allostatins for solving this important problem and substantiate the essence of the methods and the area of their use in immunotherapy in examples 1-14 presented below. The main results of these studies are as follows:

1) Активация мононуклеаров периферической крови1) Activation of peripheral blood mononuclear cells

Установлено, что обработка фракции мононуклеаров периферической крови человека аллостатином приводит к увеличению доли клеток, несущих на своей поверхности маркеры активации CD69 (пример 1) и CD25 (пример 2). Согласно общепринятой в иммунологии интерпретации, это свидетельствует о переходе соответствующей группы лимфоцитов в активное состояние. Важно также отметить, что белок CD25 является составной частью рецептора интерлейкина-2 (ILR2) и его экспрессия составляет необходимое условие чувствительности клетки к этому цитокину. Поскольку IL2 широко используется в иммунотерапии и клеточной терапии рака, повышение чувствительности к нему путем предварительной обработки лимфоцитов аллостатином может быть эффективным способом повышения терапевтической эффективности лекарственных средств на основе IL2.It was found that the treatment of a fraction of human peripheral blood mononuclear cells with allostatin leads to an increase in the proportion of cells carrying activation markers CD69 (example 1) and CD25 (example 2) on their surface. According to the interpretation generally accepted in immunology, this indicates the transition of the corresponding group of lymphocytes into an active state. It is also important to note that the CD25 protein is an integral part of the interleukin-2 receptor (ILR2) and its expression is a necessary condition for the cell's sensitivity to this cytokine. Since IL2 is widely used in immunotherapy and cancer cell therapy, sensitization to it by pretreating lymphocytes with allostatin may be an effective way to increase the therapeutic efficacy of IL2-based drugs.

Кроме того, было изучено влияние обработки фракции мононуклеаров аллостатином на количество клеток, экспрессирующих рецепторы семейства KIR (пример 3). В результате было установлено, что обработка аллостатином резко снижает количество мононуклеаров, несущих на своей поверхности рецепторы KIR2DL3 и KIR3DL1. Эти рецепторы характерны для NK клеток и части Т лимфоцитов и оказывают ингибирующее действие на их цитотоксическую активность. В этих же условиях было показано, что обработка фракции мононуклеаров аллостатином приводит к резкому снижению количества клеток, экспрессирующих рецептор KLRG1, который также относится к числу ингибиторов цитотоксической активности NK и Т лимфоцитов. Известно, что лигандом этого рецептора являются белки из группы кадхеринов, представленные на поверхности многих опухолевых клеток. Связываясь с кадхеринами на поверхности опухолевой клетки, например, клетки рака легкого, KLRG1 блокирует активность цитотоксического лимфоцита. Соответственно, снижение экспрессии KLRG1 под влиянием аллостатина может являться способом специфической активации цитотоксических лимфоцитов в отношении опухолей этого типа.In addition, the effect of treatment of the mononuclear fraction with allostatin on the number of cells expressing receptors of the KIR family was studied (example 3). As a result, it was found that treatment with allostatin sharply reduces the number of mononuclear cells carrying KIR2DL3 and KIR3DL1 receptors on their surface. These receptors are characteristic of NK cells and part of T lymphocytes and have an inhibitory effect on their cytotoxic activity. Under the same conditions, it was shown that treatment of the mononuclear fraction with allostatin leads to a sharp decrease in the number of cells expressing the KLRG1 receptor, which is also among the inhibitors of the cytotoxic activity of NK and T lymphocytes. It is known that the ligand of this receptor are proteins from the cadherin group, which are present on the surface of many tumor cells. By binding to cadherins on the surface of a tumor cell, such as a lung cancer cell, KLRG1 blocks the activity of a cytotoxic lymphocyte. Accordingly, the decrease in the expression of KLRG1 under the influence of allostatin may be a way of specifically activating cytotoxic lymphocytes against tumors of this type.

Таким образом, обработка аллостатином вызывает два типа изменений во фракции мононуклеаров периферической крови - увеличение количества клеток, экспрессирующих активационные рецепторы CD25 и CD69, и снижение количества клеток, снабженных ингибирующими рецепторами KIR2DL3, KIR3DL1 и KLRG1. Тот и другой тип изменений и особенно их совокупность свидетельствуют о переходе клеток в активное состояние. Следует также отметить, что все пять рецепторов характерны для NK и Т лимфоцитов и играют важную роль в регуляции их активности.Thus, treatment with allostatin causes two types of changes in the fraction of peripheral blood mononuclear cells - an increase in the number of cells expressing the activation receptors CD25 and CD69, and a decrease in the number of cells equipped with inhibitory receptors KIR2DL3, KIR3DL1, and KLRG1. Both types of changes and especially their combination indicate the transition of cells into an active state. It should also be noted that all five receptors are characteristic of NK and T lymphocytes and play an important role in the regulation of their activity.

2) Активация NK клеток2) Activation of NK cells

Далее была проведена серия экспериментов с популяцией NK клеток, выделенных из фракции мононуклеаров периферической крови. В этих экспериментах NK клетки инкубировали с клетками-мишенями (клетки миелолейкоза человека линии K562) в присутствии или отсутствии аллостатина и замеряли количество клеток, экспрессирующих активационные рецепторы, которые, как известно, необходимы для осуществления функций NK клеток. В серии экспериментов, описанных в примерах 4-6, показано, что аллостатин усиливает экспрессию белков CD25, CD226, NKG2D, CD244 и NKp80 на поверхности NK клеток. CD25 (ILR2) обеспечивает чувствительность NK клеток к активирующим сигналам IL2. Белок межклеточной адгезии CD226 необходим NK клетке для образования контакта с клеткой-мишенью и продукции цитокинов. NKG2D является ключевым активационным рецептором NK клеток, распознающим белки семейства MICA, MICB и другие сигнальные молекулы трансформированных и поврежденных клеток. NKp80 и CD244 также входят в пул активационных рецепторов NK клеток. Таким образом, обработка NK клеток аллостатином приводит к усиленной экспрессии активационных рецепторов, которая служит необходимым условием распознавания, атаки и уничтожения ими трансформированных клеток-мишеней.Next, a series of experiments was carried out with a population of NK cells isolated from the fraction of peripheral blood mononuclear cells. In these experiments, NK cells were incubated with target cells (human myeloid leukemia cells of the K562 line) in the presence or absence of allostatin and the number of cells expressing activation receptors known to be required for the functioning of NK cells was measured. In a series of experiments described in examples 4-6, it was shown that allostatin enhances the expression of proteins CD25, CD226, NKG2D, CD244 and NKp80 on the surface of NK cells. CD25 (ILR2) makes NK cells sensitive to IL2 activating signals. The intercellular adhesion protein CD226 is required by the NK cell to form contact with the target cell and produce cytokines. NKG2D is a key NK cell activation receptor that recognizes proteins of the MICA, MICB families and other signaling molecules of transformed and damaged cells. NKp80 and CD244 are also included in the pool of NK cell activation receptors. Thus, treatment of NK cells with allostatin leads to increased expression of activation receptors, which is a necessary condition for their recognition, attack, and destruction of transformed target cells.

Далее следовало установить, достигается ли при этом конечная цель - усиление цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток. Для получения ответа на этот вопрос была проведена еще одна серия экспериментов, в которых активированные аллостатином NK клетки инкубировали с опухолевыми клетками различного происхождения: рака легкого, шейки матки и миелолейкоза (примеры 7-9). В примере 7 проанализировано методом проточной цитометрии влияние аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток в отношении трансформированных вирусом папилломы человека (ВПЧ) клеток суспензионной культуры рака шейки матки линии HeLa. В контроле доля летально поврежденных (окрашиваемых пропидиум йодидом) опухолевых клеток составляла около 15%. При инкубации в присутствии аллостатина доля поврежденных опухолевых клеток HeLa возрастала до 60% (Р<0.001, Z-тест). Повторный эксперимент дал аналогичный результат.Next, it was necessary to establish whether this achieved the ultimate goal - an increase in cytotoxic activity against tumor cells. To obtain an answer to this question, another series of experiments was carried out in which allostatin-activated NK cells were incubated with tumor cells of various origins: lung cancer, cervical cancer, and myeloid leukemia (examples 7-9). Example 7 analyzed by flow cytometry the effect of allostatin on the cytotoxic activity of NK cells against transformed human papillomavirus (HPV) cells of a suspension culture of cervical cancer of the HeLa line. In the control, the proportion of lethally damaged (stained with propidium iodide) tumor cells was about 15%. Upon incubation in the presence of allostatin, the proportion of damaged HeLa tumor cells increased to 60% (P <0.001, Z-test). A repeated experiment gave a similar result.

В опытах с адгезивной культурой клеток рака легкого А549 (пример 8) цитотоксическую активность NK клеток анализировали спектрофотометрически, поскольку адгезивный характер этой культуры не позволил использовать метод проточной цитометрии. В этих условиях также отмечено статистически значимое снижение выживаемости опухолевых клеток под влиянием аллостатина (Р=0.008). При этом микроскопический анализ состояния монослоя опухолевых клеток показал, что монослой после контакта с активированными аллостатином NK клетками, в отличие от контроля с неактивированными NK клетками, был полностью разрушен и содержал лишь остатки погибших опухолевых клеток.In experiments with an adhesive culture of lung cancer cells A549 (example 8), the cytotoxic activity of NK cells was analyzed spectrophotometrically, since the adhesive nature of this culture did not allow the use of flow cytometry. Under these conditions, a statistically significant decrease in the survival of tumor cells under the influence of allostatin was also noted (P = 0.008). At the same time, microscopic analysis of the state of the monolayer of tumor cells showed that the monolayer after contact with allostatin-activated NK cells, in contrast to the control with non-activated NK cells, was completely destroyed and contained only the remains of dead tumor cells.

Наконец, в опыте с суспензионной культурой клеток миелолейкоза К562 (пример 9), опухолевые клетки окрашивали смесью AnnexinV_PE/PI и с помощью проточного цитофлуориметра подсчитывали процент поврежденных клеток (с фенотипами AnnexinV+/PI- AnnexinV+/PI+, AnnexinV-/PI+). Такой способ анализа показал, что активация NK клеток аллостатином увеличивает количество опухолевых клеток-мишеней с повреждениями различного уровня (от индукции апоптоза до гибели) с 13.5 до 73%.Finally, in an experiment with a suspension culture of K562 myeloid leukemia cells (example 9), tumor cells were stained with AnnexinV_PE / PI and the percentage of damaged cells was calculated using a flow cytometer (with phenotypes AnnexinV + / PI- AnnexinV + / PI +, AnnexinV- / PI +). This method of analysis showed that activation of NK cells with allostatin increases the number of target tumor cells with damage of various levels (from induction of apoptosis to death) from 13.5 to 73%.

Таким образом, как показали результаты исследований, обработка аллостатином обеспечивает переход NK клеток периферической крови в активное состояние, необходимое и достаточное для элиминации раковых клеток различного происхождения.Thus, as shown by the research results, treatment with allostatin ensures the transition of NK cells of peripheral blood into an active state, which is necessary and sufficient for the elimination of cancer cells of various origins.

3. Влияние аллостатина на продукцию IFNγ3. Effect of allostatin on IFNγ production

Помимо прямого действия на функциональное состояние цитотоксических лимфоцитов (экспрессию активирующих и ингибирующих рецепторов, цитотоксическую активность), авторами было изучено влияние аллостатина на продукцию интерферона-гамма (IFNγ). Как известно, IFNγ синтезируют NK, NKT и Т-лимфоциты (CD4 Т-хелперы и CD8 цитотоксические лимфоциты). Т-лимфоциты продуцируют IFNγ в ответ на стимуляцию специфическим антигеном, а его продукция NK и NKT лимфоцитами не зависит от антигенной стимуляции. В примере 10 рассмотрено влияние аллостатина на количество Т-лимфоцитов, продуцирующих IFNγ в условиях стимуляции специфическим для Т клеток активатором Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28. В этих условиях обработка аллостатином более чем вдвое увеличивала долю продуцирующих IFNγ Т-лимфоцитов. В примере 11 рассмотрено влияние аллостатина на количество NK клеток, продуцирующих IFNγ в ответ на стимуляцию интерлейкином 12 (IL-12), специфическим активатором продукции IFNγ. При обработке IL-12 продукция наблюдалась в 26% NK клеток, в то время как комбинированное действие IL-12 и аллостатина увеличивало этот показатель до 60% (Р<0.001).In addition to the direct effect on the functional state of cytotoxic lymphocytes (expression of activating and inhibiting receptors, cytotoxic activity), the authors studied the effect of allostatin on the production of interferon-gamma (IFNγ). As you know, IFNγ is synthesized by NK, NKT and T-lymphocytes (CD4 T-helpers and CD8 cytotoxic lymphocytes). T-lymphocytes produce IFNγ in response to stimulation with a specific antigen, and its production by NK and NKT lymphocytes does not depend on antigenic stimulation. Example 10 discusses the effect of allostatin on the number of T-lymphocytes producing IFNγ under stimulation with the T cell specific activator Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28. Under these conditions, treatment with allostatin more than doubled the proportion of IFNγ-producing T-lymphocytes. Example 11 examines the effect of allostatin on the number of NK cells producing IFNγ in response to stimulation with interleukin 12 (IL-12), a specific activator of IFNγ production. Upon treatment with IL-12, production was observed in 26% of NK cells, while the combined effect of IL-12 and allostatin increased this indicator to 60% (P <0.001).

Таким образом, спектр фармакологической активности аллостатина включает усиление продукции IFNy NK и Т-лимфоцитами в ответ на специфические для них активирующие сигналы (IL-12 для NK клеток и антиген для Т-лимфоцитов). Как известно, IFNγ считается одной из перспективных фармакологических мишеней для лечения рака и вирусных инфекций [18]. Соответственно, обнаруженное свойство аллостатина позволяет использовать его в качестве адъюванта IFNγ и лекарственных средств на его основе. IL-12 также относится к числу перспективных средств иммунотерапии онкологических и вирусных заболеваний в качестве активатора продукции IFNγ. Полученные результаты указывают на возможность использования аллостатина в качестве адъюванта (усилителя действия) лекарственных препаратов на основе IL-12.Thus, the spectrum of pharmacological activity of allostatin includes an increase in IFNy production by NK and T-lymphocytes in response to their specific activating signals (IL-12 for NK cells and antigen for T-lymphocytes). As is known, IFNγ is considered one of the promising pharmacological targets for the treatment of cancer and viral infections [18]. Accordingly, the discovered property of allostatin allows it to be used as an IFNγ adjuvant and drugs based on it. IL-12 is also one of the promising agents for immunotherapy of oncological and viral diseases as an activator of IFNγ production. The results obtained indicate the possibility of using allostatin as an adjuvant (enhancer) of drugs based on IL-12.

4. Влияние аллостатина на изменения функционального состояния NK клеток в процессе цитотоксической реакции с опухолевыми клетками4. Influence of allostatin on changes in the functional state of NK cells during a cytotoxic reaction with tumor cells

Как показали исследования, результаты которых приведены в примере 6, контакт с опухолевыми клетками приводит к снижению доли NK клеток фенотипа NKG2D+с 72 до 26%, фенотипа CD244+/NKp80+с 93 до 35%. Следовательно, контакт с опухолевыми клетками в условиях данного эксперимента приводил к резкому ограничению доли функционально активных NK клеток. Блокирование активности цитотоксических лимфоцитов в результате контакта с клетками опухоли, как известно, составляет один из важных механизмов прогрессирования рака и снижения эффективности его иммунотерапии. При обработке аллостатином доля NK клеток фенотипа NKG2D+ составляла 40%, фенотипа CD244+/NKp80+ 51%, превышая показатели необработанных клеток примерно в 1.5 раза. Отличия между обработанными и необработанными аллостатином NK клетками были высокодостоверны (Р<0.001). Таким образом, действие аллостатина обеспечило сохранение функциональной активности значительной части NK клеток после контакта с опухолевыми клетками. При лечении опухолей, для которых характерно подавление активности инфильтрующих опухоль NK клеток, интратуморальное введение аллостатина может оказаться особенно эффективным способом иммунотерапии.As shown by the studies, the results of which are given in example 6, contact with tumor cells leads to a decrease in the proportion of NK cells of the NKG2D + phenotype from 72 to 26%, of the CD244 + / NKp80 + phenotype from 93 to 35%. Consequently, contact with tumor cells under the conditions of this experiment led to a sharp limitation in the proportion of functionally active NK cells. Blocking the activity of cytotoxic lymphocytes as a result of contact with tumor cells is known to be one of the important mechanisms of cancer progression and a decrease in the effectiveness of its immunotherapy. When treated with allostatin, the proportion of NK cells of the NKG2D + phenotype was 40%, of the CD244 + / NKp80 + phenotype by 51%, exceeding the indices of untreated cells by about 1.5 times. The differences between NK cells treated and untreated with allostatin were highly significant (P <0.001). Thus, the action of allostatin ensured the preservation of the functional activity of a significant part of NK cells after contact with tumor cells. In the treatment of tumors that are characterized by suppression of the activity of tumor-infiltrating NK cells, intratumoral administration of allostatin may be a particularly effective method of immunotherapy.

5. Влияние аллостатина на клеточный иммунный ответ in vivo.5. Influence of allostatin on the cellular immune response in vivo.

Для изучения влияния аллостатина на Т-клеточный иммунный ответ использована реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей в соответствии с рекомендациями по изучению новых лекарственных средств [19]. Результаты исследования приведены в примере 12. В качестве антигена использовали клетки эритроидной лейкемии человека К562, инактивированные летальной дозой облучения. Аллостатин вводили одновременно с сенсибилизирующей или разрешающей дозами антигена. Это позволяет проанализировать влияние препарата на различные стадии клеточного иммунного ответа: в первом случае - на процесс образования клона антиген-специфических Т-лимфоцитов, во втором - на способность этих лимфоцитов при встрече с антигеном продуцировать провоспалительные цитокины. Иммунизация опухолевыми клетками индуцировала у мышей выраженную реакцию ГЗТ. Эти данные свидетельствуют о формировании клона Т-лимфоцитов, специфически распознающего антигены клеток К562. Введение аллостатина после разрешающей дозы антигена достоверно усиливало реакцию ГЗТ. Достоверного влияния на показатель ГЗТ при введении аллостатина после сенсибилизирующей дозы отмечено не было. В соответствии с общепринятой в иммунологии интерпретацией, полученные данные указывают на усиление способности Т-лимфоцитов продуцировать провоспалительные цитокины под влиянием аллостатина и отсутствие достоверного влияния на формирование клона К562 позитивных Т-клеток.To study the effect of allostatin on the T-cell immune response, the delayed-type hypersensitivity (HRT) reaction was used in mice in accordance with the recommendations for the study of new drugs [19]. The results of the study are shown in example 12. The cells of human erythroid leukemia K562, inactivated by a lethal dose of radiation, were used as antigen. Allostatin was administered simultaneously with sensitizing or resolving doses of the antigen. This makes it possible to analyze the effect of the drug on various stages of the cellular immune response: in the first case, on the formation of a clone of antigen-specific T-lymphocytes, in the second, on the ability of these lymphocytes to produce pro-inflammatory cytokines when they encounter an antigen. Immunization with tumor cells induced a pronounced HRT response in mice. These data indicate the formation of a T-lymphocyte clone that specifically recognizes the antigens of K562 cells. The introduction of allostatin after a permissive dose of antigen significantly increased the HRT response. There was no significant effect on HRT with the introduction of allostatin after a sensitizing dose. In accordance with the interpretation generally accepted in immunology, the data obtained indicate an increase in the ability of T-lymphocytes to produce pro-inflammatory cytokines under the influence of allostatin and the absence of a significant effect on the formation of the K562 clone of positive T-cells.

Наряду с влиянием аллостатина на реакцию ГЗТ, была изучена неспецифическая реакция на однократное введение опухолевого антигена при одновременном введении животным аллостатина. Как известно, ключевую роль в этой реакции играют NK клетки при участии некоторых субпопуляций Т клеток (NKT лимфоциты и др.), и макрофагов. Результаты этого исследования приведены в примере 13. Методика постановки эксперимента в целом соответствовала описанной в примере 12 с тем отличием, что антиген вводился животным однократно, а реакция воспаления анализировалась в течение суток после введения антигена. Следовательно, речь о формировании специфического иммунитета в данном случае не идет, а наблюдаемые эффекты относятся к области естественного (врожденного) иммунитета. Однократное введение опухолевого антигена в этих условиях не вызвало у животных заметной воспалительной реакции. В том случае, если введение антигена в область левой задней лапы сопровождалось подкожной инъекцией аллостатина в область спины, у всех животных отмечалась воспалительная реакция в этой лапе, в то время как правая лапа, в которую вводился только растворитель, оставалась интактной. Таким образом, аллостатин достоверно усиливал неспецифическое распознавание опухолевого антигена, который никогда ранее данному организму не предъявлялся и без дополнительной стимуляции оставался нераспознанным. Этот факт, в соответствии с общепринятыми в иммунологии представлениями, подтверждает эффективность активации NK клеток (и, возможно, NKT клеток, макрофагов) аллостатином в условиях in vivo.Along with the effect of allostatin on the HRT response, a nonspecific response to a single administration of a tumor antigen with the simultaneous administration of allostatin to animals was studied. It is known that NK cells play a key role in this reaction, with the participation of some subsets of T cells (NKT lymphocytes, etc.), and macrophages. The results of this study are shown in example 13. The experimental procedure was generally consistent with that described in example 12 with the difference that the antigen was administered to the animals once, and the inflammation reaction was analyzed within a day after the antigen administration. Consequently, we are not talking about the formation of specific immunity in this case, and the observed effects belong to the field of natural (innate) immunity. A single injection of a tumor antigen under these conditions did not cause a noticeable inflammatory reaction in the animals. If the injection of antigen into the left hind paw was accompanied by a subcutaneous injection of allostatin into the back, all animals showed an inflammatory reaction in this paw, while the right paw, into which only the solvent was injected, remained intact. Thus, allostatin significantly enhanced the nonspecific recognition of a tumor antigen, which had never been presented to a given organism before and remained unrecognized without additional stimulation. This fact, in accordance with generally accepted concepts in immunology, confirms the effectiveness of the activation of NK cells (and, possibly, NKT cells, macrophages) with allostatin in vivo.

6. Анализ возможного цитотоксического действия аллостатина на клетки человека6. Analysis of the possible cytotoxic effect of allostatin on human cells

Цитотоксическое действие аллостатина было изучено на примере культуры фибробластов человека (пример 14). Фибробласты культивировали в течение 24 часов в присутствии аллостатина в концентрациях от 1 до 1000 мг/Л питательной среды. Ни в одном из вариантов опытов не было отмечено увеличения количества погибших клеток. Терапевтически эффективная концентрация аллостатина, необходимая и достаточная для активации NK клеток (примеры 7-8) составляет 0.01 мг/Л питательной среды. Таким образом, превышение терапевтически эффективной концентрации аллостатина в 100000 раз не оказывало прямого цитотоксического действия на культуру фибробластов человека. Следует также отметить, что концентрация аллостатина 10 мг/Л, в 1000 раз превышающая указанную терапевтически эффективную, не оказывала прямого токсического действия на мононуклеары периферической крови и не препятствовала их функциональной активности (пример 10). Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные позволяют считать аллостатин продуктом, практически лишенным прямой цитотоксической активности и, соответственно, характеризуемым высоким уровнем безопасности.The cytotoxic effect of allostatin was studied using the example of a culture of human fibroblasts (example 14). Fibroblasts were cultured for 24 hours in the presence of allostatin at concentrations from 1 to 1000 mg / L of nutrient medium. In none of the experiments was there an increase in the number of dead cells. The therapeutically effective concentration of allostatin required and sufficient for the activation of NK cells (examples 7-8) is 0.01 mg / L of culture medium. Thus, an excess of the therapeutically effective concentration of allostatin by a factor of 100,000 did not have a direct cytotoxic effect on the culture of human fibroblasts. It should also be noted that the concentration of allostatin 10 mg / L, 1000 times higher than the indicated therapeutically effective, did not have a direct toxic effect on peripheral blood mononuclear cells and did not interfere with their functional activity (example 10). The currently available experimental data allow us to consider allostatin a product practically devoid of direct cytotoxic activity and, accordingly, characterized by a high level of safety.

Рассмотренные выше результаты исследований обосновывают три варианта использования аллостатина в иммунотерапии и клеточной терапии рака и вирусных инфекций:The above research results substantiate three options for the use of allostatin in immunotherapy and cell therapy for cancer and viral infections:

1) Путем введения аллостатина в кровь пациента, страдающего онкологическим заболеванием или вирусной инфекцией, с целью повышения активности лимфоцитов периферической крови, направленной на элиминацию патологически измененных клеток организма (клеток опухоли, инфицированных вирусом клеток). При этом желаемый эффект достигается за счет прямой активации цитотоксического действия NK клеток, а также путем увеличения количества NK и Т лимфоцитов, продуцирующих IFNγ и повышения их чувствительности к активирующим сигналам IL-2 и IL-12.1) By introducing allostatin into the blood of a patient suffering from an oncological disease or a viral infection in order to increase the activity of peripheral blood lymphocytes aimed at eliminating pathologically altered body cells (tumor cells infected with a virus cell). In this case, the desired effect is achieved due to the direct activation of the cytotoxic effect of NK cells, as well as by increasing the number of NK and T lymphocytes producing IFNγ and increasing their sensitivity to the activating signals of IL-2 and IL-12.

2) Путем интратуморального введения аллостатина с целью поддержания в активном состоянии инфилырующих опухоль (резидентных) NK и Т лимфоцитов, находящихся в непосредственном контакте с раковыми клетками.2) By intratumoral administration of allostatin in order to maintain active tumor-infiltrating (resident) NK and T lymphocytes in direct contact with cancer cells.

3) Путем введения аллостатина в питательную среду, используемую для культивирования клеток крови вне организма, с целью повышения функциональной активности лимфоцитов, применяемых в клеточной терапии рака. Концентрацию аллостатина в культуральной среде подбирают, начиная с концентрации 10 микрограммов/Л и изменяя ее в сторону увеличения или уменьшения в зависимости от условий и целей культивирования.3) By introducing allostatin into a nutrient medium used for the cultivation of blood cells outside the body, in order to increase the functional activity of lymphocytes used in cell therapy for cancer. The concentration of allostatin in the culture medium is selected starting from a concentration of 10 micrograms / L and changing it upward or downward, depending on the conditions and purposes of cultivation.

Согласно приведенным примерам осуществления изобретения, активация NK и Т лимфоцитов аллостатином может быть использована при лечении и профилактике онкологических заболеваний различной этиологии. Одной из распространенных форм такого заболевания является рак шейки матки, вызываемый заражением клеток эпителия шейки матки онкогенным штаммом вируса папилломы человека (ВПЧ). Демонстрацией перспективности применения аллостатина для лечения рака шейки матки служат эксперименты с опухолевыми клетками линии HeLa, трансформированными высокоонкогенным штаммом ВПЧ (пример 7). Понятно также, что иммунотерапия аллостатином может проводиться на ранних, дораковых стадиях развития заболевания с целью элиминации зараженных ВПЧ клеток и предотвращения их трансформации в злокачественные клетки. По литературным данным, инфицирование ВПЧ, помимо рака шейки матки, ассоциировано с другими формами рака аногенитальной области и носоглотки. При таких формах рака активация NK и/или Т лимфоцитов аллостатином также представляется перспективным способом иммунотерапии.According to the given examples of implementation of the invention, the activation of NK and T lymphocytes by allostatin can be used in the treatment and prevention of oncological diseases of various etiologies. One of the most common forms of this disease is cervical cancer, caused by infection of the epithelial cells of the cervix with an oncogenic strain of the human papillomavirus (HPV). Experiments with HeLa tumor cells transformed with a highly oncogenic HPV strain (example 7) demonstrate the promising nature of the use of allostatin for the treatment of cervical cancer. It is also clear that immunotherapy with allostatin can be carried out in the early, pre-cancerous stages of the development of the disease in order to eliminate HPV-infected cells and prevent their transformation into malignant cells. According to the literature, HPV infection, in addition to cervical cancer, is associated with other forms of cancer of the anogenital region and nasopharynx. In these forms of cancer, the activation of NK and / or T lymphocytes by allostatin also appears to be a promising method of immunotherapy.

Другой перспективной областью применения аллостатина является иммунотерапия рака легких, наиболее распространенной и трудноизлечимой формы онкологических заболеваний. На примере клеток рака легких линии А549 (пример 8) установлено, что обработка аллостатином увеличивает способность NK клеток уничтожать опухолевые клетки этого типа. Анализ известных биологических и иммунологических особенностей рака легких подтверждает перспективность такого способа использования аллостатина в связи со следующим:Another promising area of application of allostatin is immunotherapy for lung cancer, the most common and intractable form of cancer. On the example of lung cancer cells line A549 (example 8), it was found that treatment with allostatin increases the ability of NK cells to destroy tumor cells of this type. Analysis of the known biological and immunological characteristics of lung cancer confirms the prospects of this method of using allostatin in connection with the following:

Злокачественные опухоли легких содержат большое количество инфильтрующих опухоль лимфоцитов (TIL, tumor infiltrating lymphocytes), включая NK клетки. TIL рака легких, как правило, обладают низкой литической активностью и это служит ключевым механизмом опухолевого роста [20]. Стимуляция цитотоксической активности TIL, включая NK клетки, поступающие в опухоль из периферической крови, рассматривается как перспективный подход к иммунотерапии рака легких [21].Malignant lung tumors contain a large number of tumor infiltrating lymphocytes (TIL), including NK cells. TIL lung cancer tends to have low lytic activity and this is a key mechanism of tumor growth [20]. Stimulation of the cytotoxic activity of TIL, including NK cells entering the tumor from the peripheral blood, is considered as a promising approach to immunotherapy for lung cancer [21].

Опухолевые клетки большинства больных раком легких, в отличие от нормальных клеток легкого, инфицированы ВПЧ или другими онкогенными вирусами [22, 23]. Как показано в примере 7, стимуляция аллостатином увеличивает способность NK клеток лизировать трансформированные ВПЧ раковые клетки.Tumor cells of most lung cancer patients, in contrast to normal lung cells, are infected with HPV or other oncogenic viruses [22, 23]. As shown in example 7, stimulation with allostatin increases the ability of NK cells to lyse HPV-transformed cancer cells.

Кроме NK клеток, в элиминации клеток рака легкого важную роль играют Т лимфоциты [24], активация которых под влиянием аллостатина показана в примерах (пример 10 и пример 12).In addition to NK cells, T lymphocytes play an important role in the elimination of lung cancer cells [24], whose activation under the influence of allostatin is shown in examples (example 10 and example 12).

В иммунотерапии и клеточной терапии рака легкого известно применение IL-2 с целью стимуляции цитотоксической активности NK клеток [24]. Как показано в примере 4, обработка аллостатином стимулирует экспрессию на поверхности NK клеток белка CD25, который является рецептором IL-2 и обеспечивает чувствительность клеток к этому цитокину. Следовательно, применение аллостатина может повысить чувствительность NK клеток к IL-2, применяемому в иммунотерапии и клеточной терапии рака легкого.In immunotherapy and cell therapy of lung cancer, the use of IL-2 is known to stimulate the cytotoxic activity of NK cells [24]. As shown in example 4, treatment with allostatin stimulates the expression on the surface of NK cells of the protein CD25, which is the receptor for IL-2 and makes the cells sensitive to this cytokine. Therefore, the use of allostatin can increase the sensitivity of NK cells to IL-2, which is used in immunotherapy and cell therapy for lung cancer.

Как известно из анализа уровня техники, иммунотерапия признана одним из перспективных методов лечения рака легкого [24]. Однако анализ результатов клинических исследований показывает, что эффективность разработанных методов (за исключением чек-пойнт ингибиторов) остается крайне ограниченной [25]. Таким образом, в настоящее время возможности иммунотерапии рака легкого связаны главным образом с использованием чек-пойнт ингибиторов. Механизм действия этих препаратов ограничивает их применение лечением опухолей, продуцирующих белок PDL. Такие опухоли встречаются примерно у 20% больных раком легкого [26]. Для иммунотерапии оставшихся 80% требуются другие подходы. Предлагаемый авторами вариант способа лечения аллостатином не связан с блокированием белка PDL и может быть особенно полезен для больных с PDL-отрицательными формами рака легкого, которые не поддаются лечению чек-пойнт ингибиторами.As is known from the analysis of the prior art, immunotherapy is recognized as one of the promising methods of treating lung cancer [24]. However, an analysis of the results of clinical trials shows that the effectiveness of the developed methods (with the exception of checkpoint inhibitors) remains extremely limited [25]. Thus, at present, the possibilities of immunotherapy for lung cancer are associated mainly with the use of checkpoint inhibitors. The mechanism of action of these drugs limits their use in the treatment of PDL protein-producing tumors. Such tumors are found in about 20% of lung cancer patients [26]. Other approaches are required for immunotherapy of the remaining 80%. The proposed variant of the method of treatment with allostatin is not associated with blocking the PDL protein and may be especially useful for patients with PDL-negative forms of lung cancer who do not respond to treatment with checkpoint inhibitors.

Результаты исследований, приведенные в примерах 1-14, наглядно показывают возможность конкретной реализации заявленного способа и демонстрируют в реальных экспериментальных условиях, что стимуляция NK клеток и Т лимфоцитов аллостатином представляет новый и перспективный вариант иммунотерапии и иммунопрофилактики онкологических заболеваний.The research results given in examples 1-14 clearly show the possibility of a specific implementation of the claimed method and demonstrate in real experimental conditions that stimulation of NK cells and T lymphocytes with allostatin is a new and promising option for immunotherapy and immunoprophylaxis of cancer.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention

Пример 1. Влияние аллостатина на динамику экспрессии мононуклеарами периферической крови маркера активации CD69 в отсутствие клеток-мишеней.Example 1. The effect of allostatin on the dynamics of expression by mononuclear cells of peripheral blood activation marker CD69 in the absence of target cells.

Химическая структура и метод синтеза аллостатина-1 (SEQ ID №1), использованного в этом и последующих примерах, соответствуют описанным в патенте RU 2267496 [16], одним из авторов которого является автор заявляемого изобретения.The chemical structure and method for the synthesis of allostatin-1 (SEQ ID No. 1) used in this and subsequent examples correspond to those described in patent RU 2267496 [16], one of the authors of which is the author of the claimed invention.

Мононуклеары (РВМС) выделяли из венозной крови с помощью вакутайнера, содержащего фиколл (BD Vacutainer СРТ, 362780) и инкубировали в среде RPMI1640, содержащей 5% инактивированной аутологичной сыворотки и антибиотик (Sigma-Aldrich А5955 Antibiotic Antimycotic Solution 100×). Через 3 часа в культуральную среду добавляли аллостатин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Часть мононуклеаров извлекали и окрашивали антителами к CD69 через 0, 6, 12 и 24 часа. Подсчет числа окрашенных клеток производили с помощью цитометра BD FACS Aria III. Через 3 часа после введения аллостатина (6 часов после выделения из крови) в популяции мононуклеаров значительно (Р<0.001) возрастала доля клеток, эксперссирующих маркер ранней активации CD69. Влияние аллостатина на экспрессию активационного рецептора CD69 мононуклеарами периферической крови приведено в Таблице 1. Эта реакция носила обратимый характер и примерно через 12-24 часа доля активированных клеток возвращалась к исходному уровню. В графической форме результаты данного эксперимента представлены на Фиг. 1.Mononuclear cells (PBMCs) were isolated from venous blood using a vacutainer containing ficoll (BD Vacutainer CPT, 362780) and incubated in RPMI1640 medium containing 5% inactivated autologous serum and an antibiotic (Sigma-Aldrich А5955 Antibiotic Antimycotic Solution 100 ×). After 3 hours, allostatin was added to the culture medium at a final concentration of 0.5 μg / ml. Some of the mononuclear cells were extracted and stained with antibodies to CD69 after 0, 6, 12 and 24 hours. The number of stained cells was counted using a BD FACS Aria III cytometer. In 3 hours after the administration of allostatin (6 hours after isolation from the blood), the proportion of cells expressing the early activation marker CD69 in the population of mononuclear cells significantly (P <0.001) increased. The effect of allostatin on the expression of the activation receptor CD69 by peripheral blood mononuclear cells is shown in Table 1. This reaction was reversible and after about 12-24 hours the proportion of activated cells returned to the initial level. In graphical form, the results of this experiment are presented in FIG. one.

Таким образом, обработка аллостатином вызывает переход в активное состояние части мононуклеаров периферической крови. Эта реакция носит обратимый характер и в отсутствие дополнительных стимулов количество активированных клеток возвращается к норме в течение суток после обработки аллостатином.Thus, treatment with allostatin causes a transition to the active state of a part of peripheral blood mononuclear cells. This reaction is reversible, and in the absence of additional stimuli, the number of activated cells returns to normal within a day after treatment with allostatin.

Пример 2. Влияние аллостатина на экспрессию активационного рецептора CD25 мононуклеарами периферической крови человека.Example 2. Effect of allostatin on the expression of the activation receptor CD25 by human peripheral blood mononuclear cells.

Фракция мононуклеаров была получена из венозной крови донора с помощью способа, описанного в примере 1. В опыте к мононуклеарам добавляли аллостатин в конечной концентрации 0.1 нг/мл. Через 24 часа клетки собирали, окрашивали антителами к антигену CD25 и анализировали на проточном цитофлуориметре. Как видно из Таблицы 2 и Фиг. 2, обработка мононуклеаров аллостатином вызвала более чем 6-кратное увеличение количества CD25-положительных мононуклеаров по сравнению с контролем (Р<0.001). Эти данные свидетельствуют о переходе значительной части мононуклеаров периферической крови в функционально активное состояние под влиянием аллостатина. Поскольку CD25 выполняет функцию рецептора IL-2, эти же данные указывают на приобретение способности мононуклеаров реагировать на сигналы этого ключевого цитокина.The fraction of mononuclear cells was obtained from the venous blood of a donor using the method described in example 1. In the experiment, allostatin was added to the mononuclear cells at a final concentration of 0.1 ng / ml. After 24 hours, cells were harvested, stained with antibodies to CD25 antigen and analyzed on a flow cytometer. As seen in Table 2 and FIG. 2, treatment of mononuclear cells with allostatin caused a more than 6-fold increase in the number of CD25-positive mononuclear cells compared to control (P <0.001). These data indicate the transition of a significant part of peripheral blood mononuclear cells into a functionally active state under the influence of allostatin. Since CD25 functions as an IL-2 receptor, the same data indicate the acquisition of the ability of mononuclear cells to respond to signals of this key cytokine.

Пример 3. Влияние аллостатина на экспрессию цитотоксическими лимфоцитами периферической крови ингибирующих рецепторов семейства KIR в процессе цитотоксической реакции с клетками К562Example 3. Effect of allostatin on the expression of inhibitory receptors of the KIR family by cytotoxic lymphocytes of the peripheral blood during a cytotoxic reaction with K562 cells

Мононуклеары получали из венозной крови способом, описанным в примере 1. Затем мононуклеары смешивали с клетками линии К562 в соотношении Е:Т - 10:1. Полученную смесь разделяли на две равные по объему части и инкубировали в лунках 96-луночного планшета. В одну из них предварительно вносили аллостатин в конечной концентрации 1 мкг/мл. Через 24 часа клетки обрабатывали смесью моноклональных антител к KIR-рецепторам и производили подсчет числа окрашенных клеток с помощью питометра BD FACS Aria III.Mononuclear cells were obtained from venous blood by the method described in example 1. Then mononuclear cells were mixed with K562 cells in the ratio E: T - 10: 1. The resulting mixture was divided into two parts of equal volume and incubated in the wells of a 96-well plate. One of them was preliminarily introduced with allostatin at a final concentration of 1 μg / ml. After 24 hours, cells were treated with a mixture of monoclonal antibodies to KIR receptors and the number of stained cells was counted using a BD FACS Aria III pitometer.

В результате было отмечено снижение уровня экспрессии рецепторов KIR2DL3 (таблица 3 и рисунок 3), как это видно из Таблицы 3 и Фиг. 3, на которых представлено влияние аллостатина на экспрессию ингибирующего рецептора KIR2DL3 мононуклеарами периферической крови, и KIR3DL1, как это видно из Таблицы 4 и Фиг. 4, на которых представлено влияние аллостатина на экспрессию ингибирующего рецептора KIR3DL1 мононуклеарами периферической крови. Эти рецепторы характерны для NK клеток и небольшой части Т клеток и выполняют функцию ингибиторов их цитотоксической активности в отношении клеток, несущих на своей поверхности белки MHCI. В контроле около 9% и 11% мононуклеаров экспрессировали KIR2DL3 и KIR3DL1, соответственно. Поскольку эти величины примерно соответствуют суммарной доле во фракции мононуклеаров NK и Т клеток, несущих в состоянии покоя KIR рецепторы, можно предположить, что в контрольном варианте опыта большинство клеток этого типа находилось в неактивном состоянии и не могло осуществлять цитотоксическую реакцию в отношении MHCI-положительных клеток-мишеней. Обработка аллостатином снижала количество таких клеток (Р<0.001), что свидетельствует об их переходе в активное состояние. В частности, такое изменение фенотипа повышает цитотоксическую активность NK и Т клеток в отношении мишеней, защищенных белками главного комплекса гистосовместимости. В этой же серии опытов обнаружено снижение экспрессии ингибирующего рецептора KLRG1. На Фиг. 5 показано влияние аллостатина на экспрессию ингибирующего рецептора KLRG1 мононуклеарами периферической крови. Лигандами этого рецептора служат белки семейства кадхеринов, препятствующие атаке несущих эти маркеры клеток (например, опухолевых клеток эпителиального происхождения).As a result, a decrease in the level of expression of KIR2DL3 receptors was noted (Table 3 and Figure 3), as can be seen from Table 3 and Fig. 3, which shows the effect of allostatin on the expression of the inhibitory receptor KIR2DL3 by peripheral blood mononuclear cells, and KIR3DL1, as shown in Table 4 and FIG. 4, which shows the effect of allostatin on the expression of the inhibitory receptor KIR3DL1 by peripheral blood mononuclear cells. These receptors are characteristic of NK cells and a small part of T cells and act as inhibitors of their cytotoxic activity against cells carrying MHCI proteins on their surface. In the control, about 9% and 11% of mononuclear cells expressed KIR2DL3 and KIR3DL1, respectively. Since these values approximately correspond to the total proportion of NK and T cells in the fraction of mononuclear cells carrying KIR receptors at rest, it can be assumed that in the control variant of the experiment, most cells of this type were in an inactive state and could not carry out a cytotoxic reaction against MHCI-positive cells. -targets. Allostatin treatment reduced the number of such cells (P <0.001), which indicates their transition to an active state. In particular, such a change in the phenotype increases the cytotoxic activity of NK and T cells against targets protected by the proteins of the major histocompatibility complex. In the same series of experiments, a decrease in the expression of the inhibitory receptor KLRG1 was found. FIG. 5 shows the effect of allostatin on the expression of the inhibitory receptor KLRG1 by peripheral blood mononuclear cells. The ligands of this receptor are proteins of the cadherin family, which prevent the attack of cells carrying these markers (for example, tumor cells of epithelial origin).

Таким образом, стимуляция мононуклеаров аллостатином, наряду с усилением экспрессии активационных рецепторов CD25 и CD69, обеспечивает снижение экспрессии ингибирующих рецепторов KIR и KLRG1.Thus, the stimulation of mononuclear cells with allostatin, along with an increase in the expression of the activation receptors CD25 and CD69, provides a decrease in the expression of the inhibitory receptors KIR and KLRG1.

Пример 4. Влияние аллостатина на уровень экспрессии NK клетками маркера активации CD25 в процессе цитотоксической реакции с клетками К562.Example 4. Effect of allostatin on the expression level of NK cells of the activation marker CD25 during the cytotoxic reaction with K562 cells.

В этом и последующих примерах 5-9 и 11 для изучения влияния аллостатина использовали очищенную популяцию NK клеток, выделенную из фракции мононуклеаров периферической крови. NK клетки фенотипа CD3-/CD16+/CD56+ выделяли из фракции мононуклеаров периферической крови методом магнитной сепарации (ThermoFisher 11349D Dynabeads™ Untouched™ Human NK Cells Kit) согласно протоколу, рекомендуемому производителем. Путем истощения нецелевых фракций концентрацию NK клеток доводили до >90%. Цитофлуориметрический анализ показал, что чистота выделенной популяции NK клеток составляла в этом опыте 99%. Выделенные NK клетки инкубировали с клетками линии К562 в присутствии аллостатина (1 мкг/мл) и без него (контроль) при соотношении эффектор : мишень 10:1. Через 24 часа клетки окрашивали моноклональными антителами к CD25 и производили подсчет CD25-положительных клеток в лимфоцитарном гейте. Исходно 29,2% NK клеток экспрессировали маркер CD25 После инкубации с клетками-мишенями К562 доля CD25+NK в контроле возросла до 42,2%, как это видно из Таблицы 5 и иллюстрируется на Фиг. 6. Обработка NK клеток аллостатином увеличивала процент активированных клеток до 48,9% (Р<0.001). При этом значение десятичного логарифма Log10 геометрических средних значений флюоресценции для активированных клеток (показатель Mean) в контрольном варианте было равно 342, а в варианте с аллостатином - 523 (Фиг. 6). То есть обработанные аллостатином NK клетки после активации на 53% интенсивней экспрессировали маркер CD25 по сравнению с аналогичными контрольными клетками. Таким образом, контакт NK клеток с опухолевыми клетками-мишенями К562 приводит к увеличению количества CD25-положительных NK клеток и плотности расположения белка CD25 на их поверхности. На этом фоне обработка аллостатином вызывает дополнительное увеличение количества CD25-положительных NK клеток и среднего уровня экспрессии CD25.In this and the following examples 5-9 and 11, a purified population of NK cells isolated from the peripheral blood mononuclear cell fraction was used to study the effect of allostatin. NK cells of the CD3- / CD16 + / CD56 + phenotype were isolated from the peripheral blood mononuclear cell fraction by magnetic separation (ThermoFisher 11349D Dynabeads ™ Untouched ™ Human NK Cells Kit) according to the manufacturer's recommended protocol. By depleting off-target fractions, the concentration of NK cells was brought to> 90%. Cytofluorometric analysis showed that the purity of the isolated population of NK cells was 99% in this experiment. The isolated NK cells were incubated with K562 cells in the presence of allostatin (1 μg / ml) and without it (control) at an effector: target ratio of 10: 1. After 24 hours, cells were stained with anti-CD25 monoclonal antibodies and CD25-positive cells were counted in the lymphocyte gate. Initially, 29.2% of NK cells expressed the CD25 marker. After incubation with K562 target cells, the proportion of CD25 + NK in the control increased to 42.2%, as can be seen from Table 5 and illustrated in FIG. 6. Treatment of NK cells with allostatin increased the percentage of activated cells to 48.9% (P <0.001). In this case, the value of the decimal logarithm Log10 of the geometric mean fluorescence values for activated cells (Mean index) in the control variant was 342, and in the variant with allostatin - 523 (Fig. 6). That is, after activation, the NK cells treated with allostatin expressed the CD25 marker by 53% more intensively than the analogous control cells. Thus, contact of NK cells with K562 target tumor cells leads to an increase in the number of CD25-positive NK cells and the density of the CD25 protein on their surface. Against this background, treatment with allostatin causes an additional increase in the number of CD25-positive NK cells and the average level of CD25 expression.

Пример 5. Усиление экспрессии маркеров CD244 и CD226 NK клетками под влиянием аллостатина в процессе цитотоксической реакции с клетками К562Example 5. Enhanced expression of markers CD244 and CD226 by NK cells under the influence of allostatin in the course of a cytotoxic reaction with K562 cells

Способ получения очищенной популяции NK клеток и постановки эксперимента соответствовали описанным в примере 4 способам. Клетки окрашивали смесью моноклональных антител к маркерам CD226 и CD244. В Таблице 6 и на Фиг. 7 представлено влияние аллостатина на экспрессию NK клетками маркеров активации CD244 и CD226 в процессе цитотоксической реакции с клетками К562 в виде конкретных данных по количеству NK клеток фенотипа CD226+/CD244+ в контроле и при обработке аллостатином. Обработка аллостатином более чем в три раза увеличила количество NK клеток, одновременно экспрессирующих оба маркера активации.The method of obtaining a purified population of NK cells and setting up the experiment corresponded to the methods described in example 4. Cells were stained with a mixture of monoclonal antibodies to markers CD226 and CD244. Table 6 and FIG. 7 shows the effect of allostatin on the expression of NK cells of activation markers CD244 and CD226 during a cytotoxic reaction with K562 cells in the form of specific data on the number of NK cells of the CD226 + / CD244 + phenotype in control and after treatment with allostatin. Allostatin treatment more than threefold increased the number of NK cells simultaneously expressing both activation markers.

Пример 6. Изменение экспрессии маркеров CD25, NKG2D, CD244 и NKp80 под влиянием аллостатина в процессе цитотоксической реакции NK клеток с клетками К562 Для получения обогащенной фракции интактных NK клеток использовался способ негативной магнитной сепарации, описанный в примере 4. Полученные клетки переводили в среду RPMI-1640 (с добавлением 5% инактивированной аутологичной сыворотки и антибиотиков) и разделяли на три группы. Первая группа инкубировалась без клеток-мишеней и служила контролем функционального состояния NK клеток. Две другие группы культивировались с клетками линии К562 при соотношении Е:Т - 1:10. В одну из них также добавляли аллостатин в конечной концентрации - 1 мкг/мл. Через 18 часов все варианты окрашивались смесью моноклональных антител к маркерам NKG2D, CD244, NKp80, CD25. В Таблице 7 представлены результаты эксперимента по изменению экспрессии NK клетками рецепторов CD25, NKG2D, CD244 и NKp80 под влиянием аллостатина в процессе цитотоксической реакции с клетками опухоли К562. Графически изменение экспрессии рецепторов под влиянием аллостатина и контакта с опухолевыми клетками представлено на Фиг. 8 (CD25 и NKG2D) и Фиг. 9 (CD244 и NKp80).Example 6. Change in the expression of markers CD25, NKG2D, CD244 and NKp80 under the influence of allostatin during the cytotoxic reaction of NK cells with K562 cells. 1640 (supplemented with 5% inactivated autologous serum and antibiotics) and divided into three groups. The first group was incubated without target cells and served to control the functional state of NK cells. The other two groups were cultured with K562 cells at an E: T ratio of 1:10. Allostatin was also added to one of them at a final concentration of 1 μg / ml. After 18 hours, all variants were stained with a mixture of monoclonal antibodies to markers NKG2D, CD244, NKp80, CD25. Table 7 shows the results of an experiment on the change in the expression of NK cells of receptors CD25, NKG2D, CD244 and NKp80 under the influence of allostatin in the course of a cytotoxic reaction with tumor cells K562. Graphically, the change in receptor expression under the influence of allostatin and contact with tumor cells is shown in FIG. 8 (CD25 and NKG2D) and FIG. 9 (CD244 and NKp80).

Судя по частоте встречаемости маркера активации в контроле, подавляющее большинство NK клеток находилось в неактивном состоянии. Инкубация с клетками опухоли не вызывала увеличения числа CD25-положительных NK клеток. Однако комбинация аллостатина и опухолевых клеток обеспечивала резкое статистически значимое (Р<0.001) увеличение числа активированных NK клеток по сравнению с контролем и контактом с опухолевыми клетками в отсутствие аллостатина. Ранее в примере 2 было показано, что усиление экспрессии CD25 мононуклеарами под влиянием аллостатина не требует контакта с опухолевыми клетками. Суммируя данные этих двух примеров, можно заключить, что механизм действия аллостатина на экспрессию CD25 NK и, возможно, Т лимфоцитами не связан с реакцией на опухолевые антигены и может осуществляться в отсутствии контакта с опухолевыми клетками.Judging by the frequency of occurrence of the activation marker in the control, the vast majority of NK cells were in an inactive state. Incubation with tumor cells did not increase the number of CD25-positive NK cells. However, the combination of allostatin and tumor cells provided a dramatic statistically significant (P <0.001) increase in the number of activated NK cells compared to control and contact with tumor cells in the absence of allostatin. Earlier, in example 2, it was shown that the enhancement of CD25 expression by mononuclear cells under the influence of allostatin does not require contact with tumor cells. Summarizing the data of these two examples, we can conclude that the mechanism of action of allostatin on the expression of CD25 NK and, possibly, T lymphocytes is not associated with the response to tumor antigens and can be carried out in the absence of contact with tumor cells.

В отличие от CD25, NKG2D конститутивно экспрессируется большинством неактивированных NK клеток. Контакт с опухолевыми клетками приводит к резкому снижению экспрессии этих рецепторов. Этот эффект хорошо известен в литературе по онкоиммунологии и служит одним из важных механизмов подавления противоопухолевого иммунитета клетками опухоли. Обработка аллостатином снижает ингибирующее действие опухолевых клеток на экспрессию NKG2D и сохраняет таким образом противоопухолевую активность NK клеток. Аналогичным образом, комплекс NKp80/CD244 экспрессируется большинством интактных NK клеток, но его экспрессия резко подавляется при контакте с опухолевыми клетками. Поскольку данный комплекс также необходим для осуществления NK клетками цитотоксической реакции, это, в сочетании с подавлением экспрессии NKG2D, неизбежно приводит к блокированию противоопухолевого иммунитета. Обработка аллостатином контактирующих с опухолевыми клетками NK лимфоцитов обеспечивает повышение (или сохранение) ими экспрессии NKp80/CD244 и таким образом препятствует подавлению их цитотоксической активности опухолевыми клетками.Unlike CD25, NKG2D is constitutively expressed by most non-activated NK cells. Contact with tumor cells leads to a sharp decrease in the expression of these receptors. This effect is well known in the literature on oncoimmunology and serves as one of the important mechanisms of suppression of antitumor immunity by tumor cells. Allostatin treatment reduces the inhibitory effect of tumor cells on NKG2D expression and thus preserves the antitumor activity of NK cells. Similarly, the NKp80 / CD244 complex is expressed by most intact NK cells, but its expression is dramatically suppressed upon contact with tumor cells. Since this complex is also necessary for NK cells to carry out a cytotoxic reaction, this, in combination with suppression of NKG2D expression, inevitably leads to blocking of antitumor immunity. Allostatin treatment of NK lymphocytes in contact with tumor cells provides an increase (or maintenance) of NKp80 / CD244 expression by them and thus prevents the suppression of their cytotoxic activity by tumor cells.

Пример 7. Влияние аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток в отношении трансформированных ВПЧ клеток рака шейки матки линии HeLa.Example 7. Effect of allostatin on the cytotoxic activity of NK cells against HPV-transformed HeLa cervical cancer cells.

В качестве клеток-мишеней в этих опытах использовали клетки рака шейки матки линии HeLa, содержащие геномы ВПЧ онкогенных штаммов 16 и 18 из коллекции клеточных культур ЦИН РАН [Российская коллекция клеточных культур позвоночных (РККК П) ИНЦ РАН]. Интактные NK клетки фенотипа CD3-/CD16+/CD56+ получали из мононуклеаров периферической крови человека путем истощения нецелевых фракций лейкоцитов способом негативной магнитной сепарации, как указано в примере 4.As target cells in these experiments, we used HeLa cervical cancer cells containing the HPV genomes of oncogenic strains 16 and 18 from the collection of cell cultures of the CIN RAS [Russian collection of vertebrate cell cultures (RCCC P), ITS RAS]. Intact NK cells of the CD3- / CD16 + / CD56 + phenotype were obtained from human peripheral blood mononuclear cells by depletion of non-target leukocyte fractions by the method of negative magnetic separation, as described in example 4.

Полученную фракцию NK клеток инкубировали с клетками HeLa в течение 18 часов при температуре 37°С и соотношении эффектор : мишень 1:10 в отсутствии (контроль) и присутствии (10 нг/мл) аллостатина. Затем клетки окрашивались красителем пропидий иодидом (PI). Количество поврежденных (PI положительных) клеток HeLa подсчитывали способом проточной цитофлуориметрии на цитофлюориметре BD FACS Aria III. Результаты эксперимента демонстрируют резкое увеличение количества поврежденных NK клетками клеток HeLa в присутствии аллостатина (Таблица 8 и Фиг. 10). Эти результаты служат прямым доказательством того, что аллостатин эффективно стимулирует цитотоксическую активность NK клеток в отношении трансформированных ВПЧ клеток рака шейки матки.The resulting fraction of NK cells was incubated with HeLa cells for 18 hours at 37 ° C and an effector: target ratio of 1:10 in the absence (control) and presence (10 ng / ml) of allostatin. The cells were then stained with propidium iodide (PI) dye. The number of damaged (PI positive) HeLa cells was counted by flow cytometry on a BD FACS Aria III cytofluorometer. The experimental results demonstrate a dramatic increase in the number of NK-damaged HeLa cells in the presence of allostatin (Table 8 and Fig. 10). These results provide direct evidence that allostatin effectively stimulates the cytotoxic activity of NK cells against HPV-transformed cervical cancer cells.

Пример 8. Влияние аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток в отношении клеток рака легкого линии А549.Example 8. The effect of allostatin on the cytotoxic activity of NK cells against lung cancer cells of the line A549.

Интактные NK-клетки, получали способом, описанным в примере 4. Клетки линии А549 выращивали в питательной среде DMEM/F12 (1:1), с L-глутамином, с добавлением антибиотиков и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (SV30160.03, HyClone). Затем клетки линии А549 переводили в суспензию, смешивали с NK-клетками в соотношении Е:Т - 1:10 и инкубировали при 36°С в присутствии аллостатина (10 нг/мл) и без него. В контроле клетки опухоли инкубировали в тех же условиях без добавления NK клеток и аллостатина. Через 18 часов надосадок с лейкоцитами удаляли, а монослой клеток А549 промывали и окрашивали Cell Counting Kit (96992 Sigma, USA) способом, рекомендуемым производителем. Через 2 часа производили спектрофотометрическое измерение результатов. Каждый вариант опыта был повторен трижды.Intact NK cells were obtained by the method described in example 4. A549 cells were grown in DMEM / F12 nutrient medium (1: 1), with L-glutamine, antibiotics and 10% fetal calf serum (SV30160.03, HyClone) ... Then the A549 line cells were suspended, mixed with NK cells in the ratio E: T - 1:10, and incubated at 36 ° C in the presence of allostatin (10 ng / ml) and without it. In the control, tumor cells were incubated under the same conditions without the addition of NK cells and allostatin. After 18 hours, the supernatant with leukocytes was removed, and the monolayer of A549 cells was washed and stained with the Cell Counting Kit (96992 Sigma, USA) according to the manufacturer's recommended method. After 2 hours, a spectrophotometric measurement of the results was performed. Each variant of the experiment was repeated three times.

Результаты эксперимента представлены в Таблице 9 в виде абсолютной величины оптической плотности OD и нормированного показателя OD (абсолютный показатель OD в опытном варианте поделенный на показатель OD в параллельном контрольном варианте, в %). Как видно из данных Таблицы, NK клетки проявляли цитотоксическую активность, вызывая снижение жизнеспособности опухолевых клеток по сравнению с контролем. При этом обработанные аллостатином NK клетки демонстрировали более высокий уровень цитотоксической активности по сравнению с необработанными клетками (Р=0.008, ANOVA).The experimental results are presented in Table 9 in the form of the absolute value of the optical density OD and the normalized OD index (the absolute OD index in the experimental variant divided by the OD index in the parallel control variant, in%). As can be seen from the data in the Table, NK cells exhibited cytotoxic activity, causing a decrease in the viability of tumor cells in comparison with the control. At the same time, NK cells treated with allostatin showed a higher level of cytotoxic activity compared to untreated cells (P = 0.008, ANOVA).

Таким образом, NK клетки периферической крови в условиях данного эксперимента проявили цитотоксическую активность в отношении клеток рака легкого. Стимуляция аллостатином вызвала достоверное усиление цитотоксической активности NK клеток.Thus, NK cells of peripheral blood under the conditions of this experiment showed cytotoxic activity against lung cancer cells. Stimulation with allostatin caused a significant increase in the cytotoxic activity of NK cells.

В другой серии экспериментов цитотоксическое действие активированных и неактивированных аллостатином мононуклеаров на клетки рака легких А549 было исследовано способом прямого микроскопического наблюдения. Как видно из Фиг. 11, интактные клетки А549 образуют монослой клеток полигональной формы нормальной для клеток эпителиального происхождения. Добавление к монослою А549 иммуноцитов (мононуклеаров крови) и инкубация в течение 18 часов не приводили к видимому повреждению опухолевых клеток. Добавление к монослою тех же иммуноцитов в присутствии аллостатина приводило к практически полному разрушению опухолевых клеток. На препарате можно наблюдать только мертвые остатки опухолевых клеток и живые иммуноциты. Таким образом, стимуляция аллостатином вызвала массовый переход мононуклеаров периферической крови в активное состояние. В состав мононуклеаров входят, главным образом, цитотоксические клетки двух типов: NK клетки и Т-лимфоциты. Поскольку Т-лимфоциты для проявления цитотоксической активности требуют предварительного контакта с соответствующим антигеном, исключенного в условиях данного эксперимента, наиболее вероятным механизмом активации является действие аллостатина на распознавание и элиминацию опухолевых клеток NK клетками. Таким образом, эти и приведенные выше результаты исследований служат достоверным подтверждением возможности использования аллостатина в иммунотерапии рака легкого путем активации NK-клеточного звена противоопухолевого иммунитета.In another series of experiments, the cytotoxic effect of mononuclear cells activated and non-activated by allostatin on A549 lung cancer cells was investigated by direct microscopic observation. As seen in FIG. 11, intact A549 cells form a monolayer of polygonal cells normal for cells of epithelial origin. The addition of immunocytes (blood mononuclear cells) to the A549 monolayer and incubation for 18 hours did not lead to visible damage to tumor cells. The addition of the same immunocytes to the monolayer in the presence of allostatin led to almost complete destruction of tumor cells. Only dead remains of tumor cells and living immunocytes can be observed on the preparation. Thus, stimulation with allostatin caused a massive transition of peripheral blood mononuclear cells into an active state. Mononuclear cells mainly consist of two types of cytotoxic cells: NK cells and T-lymphocytes. Since T-lymphocytes for the manifestation of cytotoxic activity require preliminary contact with the corresponding antigen, excluded under the conditions of this experiment, the most likely activation mechanism is the effect of allostatin on the recognition and elimination of tumor cells by NK cells. Thus, these and the above research results provide reliable confirmation of the possibility of using allostatin in immunotherapy of lung cancer by activating the NK-cell link of antitumor immunity.

Пример 9. Влияние аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток в отношении клеток миелолейкоза линии К562Example 9. Effect of allostatin on the cytotoxic activity of NK cells against myeloid leukemia cells of the K562 line

Интактные NK-клетки, полученные способом, описанным в примере 4, инкубировали с клетками линии К562 в присутствии аллостатина (1 мкг/мл) и без него при соотношении эффектор : мишень 10:1. Через 18 часов клетки окрашивали смесью AnnexinV_PE/PI (88-8102-72 eBioscience) и с помощью цитометра подсчитывали процент апоптотических клеток (с фенотипами AnnexinV+/PI- AnnexinV+/PI+, AnnexinV-/PI+). Результаты представлены на Фиг. 12. В контрольном варианте (NK+К562) доля поврежденных клеток составила 13.5%. В варианте с аллостатином (NK+К562+AS) доля поврежденных клеток превысила 75%. Таким образом, аллостатин является высокоэффективным стимулятором цитотоксической активности NK клеток в отношении опухолевых клеток этого типа. Клетки К562 известны высокой чувствительностью к цитотоксическому действию NK клеток, обусловленной низкой плотностью белков главного комплекса гистосовместимости на их поверхности. В этих условиях стимуляция NK клеток аллостатином оказывается особенно эффективной. На этом основании можно заключить, что свойства аллостатина могут быть особенно полезными при лечении опухолей данного типа.Intact NK cells obtained by the method described in example 4 were incubated with K562 cells in the presence of allostatin (1 μg / ml) and without it at an effector: target ratio of 10: 1. After 18 hours, cells were stained with AnnexinV_PE / PI mixture (88-8102-72 eBioscience) and the percentage of apoptotic cells (with phenotypes AnnexinV + / PI- AnnexinV + / PI +, AnnexinV- / PI +) was calculated using a cytometer. The results are shown in FIG. 12. In the control variant (NK + K562), the proportion of damaged cells was 13.5%. In the variant with allostatin (NK + K562 + AS), the proportion of damaged cells exceeded 75%. Thus, allostatin is a highly effective stimulator of the cytotoxic activity of NK cells against tumor cells of this type. K562 cells are known to be highly sensitive to the cytotoxic effect of NK cells, due to the low density of MHC proteins on their surface. Under these conditions, stimulation of NK cells with allostatin is particularly effective. On this basis, it can be concluded that the properties of allostatin can be especially useful in the treatment of tumors of this type.

Пример 10. Влияние аллостатина на продукцию цитокинов активированными Т-лимфоцитамиExample 10. Effect of allostatin on cytokine production by activated T-lymphocytes

Мононуклеары (РВМС) выделяли из венозной крови с помощью способа, описанного в примере 1. В опытных группах поликлональную активацию Т-лимфоцитов производили при помощи магнитных частиц (Thermofisher 11132D, Dynabeads™ Human Т-Activator CD3/CD28) методом, рекомендованным производителем. Для оценки влияния аллостатина в соответствующем варианте опыта перед активацией в среду вносили пептид в конечной концентрации - 10 мкг/мл. Через 4 часа активирующие частицы удаляли и добавляли в среду брефендин (BD 555029, Golgi Plug™). Еще через 12 часов клетки отмывали и производили иммуноцитохимическое окрашивание на присутствие в клетках цитокинов согласно протоколу BD Immunofluorescent Staining of Intracellular Cytokines for Flow Cytometric Analysis (https://www.bdbiosciences.com/us/resources/s/cytokinesfca). Дополнительно клетки окрашивали антителами к CD69. Подсчет клеток, продуцирующих IL-2 и IFNγ, проводили на цитометре BD FACS Aria III.Mononuclear cells (PBMCs) were isolated from venous blood using the method described in example 1. In the experimental groups, polyclonal activation of T-lymphocytes was performed using magnetic particles (Thermofisher 11132D, Dynabeads ™ Human T-Activator CD3 / CD28) according to the method recommended by the manufacturer. To assess the effect of allostatin in the corresponding variant of the experiment, before activation, the peptide was added to the medium at a final concentration of 10 μg / ml. After 4 hours, the activating particles were removed and brefendin (BD 555029, Golgi Plug ™) was added to the medium. After another 12 hours, the cells were washed and immunocytochemical staining was performed for the presence of cytokines in cells according to the BD Immunofluorescent Staining of Intracellular Cytokines for Flow Cytometric Analysis protocol (https://www.bdbiosciences.com/us/resources/s/cytokinesfca). Additionally, cells were stained with antibodies to CD69. Cells producing IL-2 and IFNγ were counted on a BD FACS Aria III cytometer.

Уровень активации Т-клеток магнитными частицами оценивали по доле клеток, экспрессирующих маркер ранней активации CD69 (Таблица 10). Данные по частоте встречаемости CD69-положительных Т-клеток показывают, что обработка Т-активатором привела к резкому усилению экспрессии маркера ранней активации CD69 по сравнению с контролем и, следовательно, к переходу Т-клеток в активное состояние. При этом в варианте Т-активатор+аллостатин наблюдалось небольшое, но статистически значимое (Р<0.001) увеличение количества CD69+ по сравнению с обработкой только Т-активатором. Обработка Т-активатором также привела к статистически значимому (Р<0.001) увеличению доли клеток, продуцирующих IL-2 и IFNy. При этом в варианте Т-активатор+аллостатин количество продуцирующих IFNγ клеток почти в три раза превышало уровень в варианте с Т-активатором (Р<0.001) и в 12 раз уровень контроля. На уровень продукции IL-2 в условиях данного эксперимента аллостатин существенного влияния не оказал.The level of T-cell activation by magnetic particles was assessed by the proportion of cells expressing the early activation marker CD69 (Table 10). The data on the frequency of occurrence of CD69-positive T cells show that treatment with the T-activator led to a sharp increase in the expression of the early activation marker CD69 compared to the control and, consequently, to the transition of T cells into an active state. At the same time, in the variant T-activator + allostatin, a small but statistically significant (P <0.001) increase in the amount of CD69 + was observed in comparison with the treatment with the T-activator alone. Treatment with the T-activator also led to a statistically significant (P <0.001) increase in the proportion of cells producing IL-2 and IFNy. At the same time, in the variant T-activator + allostatin, the number of IFNγ-producing cells was almost three times higher than the level in the variant with the T-activator (P <0.001) and 12 times the level of control. Allostatin had no significant effect on the level of IL-2 production under the conditions of this experiment.

Таким образом, стимуляция аллостатином избирательно усиливает продукцию IFNγ активированными Т-лимфоцитами.Thus, allostatin stimulation selectively enhances IFNγ production by activated T-lymphocytes.

Пример 11. Влияние аллостатина на продукцию IFNγ NK клетками, активированными IL-12.Example 11. Effect of allostatin on IFNγ production by NK cells activated by IL-12.

Обогащенную популяцию интактных NK-клеток получали способом, описанным в примере 4. Далее клетки инкубировали в среде RPMI, с добавлением антибиотика и инактивированной аутологичной сыворотки (5%). В среду также добавляли рекомбинантный IL-12 (р70) человека (Biolegend, 573002) в конечной концентрации 1 нг/мл. Часть клеток инкубировали в тех же условиях в присутствии аллостатина (10 нг/мл). Через 6 часов к клеткам добавляли блокатор везикулярного транспорта - монензин (GolgiPlug™, 555029, BD, USA), а спустя еще 12 часов их фиксировали 20 минут на льду раствором BD Fixation/Permeabilization (554714 BD, USA). Затем обрабатывали содержащим сапонин раствором (PermWash, 554723 BD, USA) и окрашивали антителами к IFNγ. Подсчет числа клеток, продуцирующих IFNγ, проводили с помощью цитометра BD FACS Aria III. Результаты эксперимента представлены в Таблице 11. Среди обработанных IL12 NK клеток IFNγ обнаружен в цитоплазме 25.6% клеток. Дополнительная обработка аллостатином увеличила долю IFNγ-позитивных клеток более чем в два раза. Таким образом, совместное действие аллостатина и IL12 позволяет значительно повысить продукцию IFNγ NK клетками. Исходя из этого факта, можно прогнозировать, что стимуляция NK клеток периферической крови аллостатином позволит значительно повысить эффективность применения IL12 в иммунотерапии рака, поскольку усиление продукции IFNγ является основным механизмом противоопухолевого действия этого цитокина.An enriched population of intact NK cells was obtained by the method described in example 4. Next, the cells were incubated in RPMI medium, with the addition of an antibiotic and inactivated autologous serum (5%). Recombinant human IL-12 (p70) (Biolegend, 573002) was also added to the medium at a final concentration of 1 ng / ml. Some of the cells were incubated under the same conditions in the presence of allostatin (10 ng / ml). After 6 hours, a vesicular transport blocker, monensin (GolgiPlug ™, 555029, BD, USA), was added to the cells, and after another 12 hours they were fixed for 20 minutes on ice with a BD Fixation / Permeabilization solution (554714 BD, USA). Then they were treated with a saponin-containing solution (PermWash, 554723 BD, USA) and stained with antibodies to IFNγ. The number of IFNγ-producing cells was counted using a BD FACS Aria III cytometer. The results of the experiment are presented in Table 11. Among the IL12 NK cells treated, IFNγ was found in the cytoplasm of 25.6% of the cells. Additional treatment with allostatin more than doubled the proportion of IFNγ-positive cells. Thus, the combined action of allostatin and IL12 can significantly increase the production of IFNγ by NK cells. Based on this fact, it can be predicted that stimulation of peripheral blood NK cells with allostatin will significantly increase the effectiveness of IL12 in cancer immunotherapy, since the enhancement of IFNγ production is the main mechanism of the antitumor action of this cytokine.

Пример 12. Влияние аллостатина на клеточный иммунный ответ in vivo. Стандартным методом оценки влияния иммунотропных препаратов на клеточный иммунный ответ служит анализ реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [19]. В данном примере рассмотрено влияние аллостатина на реакцию ГЗТ у мышей при двукратном подкожном введении антигена - ксеногенных опухолевых клеток, инактивированных летальной дозой облучения. С этой целью использовали 2-2,5-мес. самок мышей линии ДВА/2. В качестве антигена использовали клетки эритроидной лейкемии человека К562, которые культивировали в среде RPMI 1640 с 10% фетальной сывороткой теленка.Example 12. The effect of allostatin on the cellular immune response in vivo. The standard method for assessing the effect of immunotropic drugs on the cellular immune response is the analysis of delayed-type hypersensitivity (HRT) [19]. This example examines the effect of allostatin on the HRT response in mice after double subcutaneous injection of antigen - xenogenic tumor cells inactivated by a lethal dose of radiation. For this purpose, 2-2.5 months were used. female mice of the DVA / 2 line. The cells of human erythroid leukemia K562, which were cultured in RPMI 1640 medium with 10% fetal calf serum, were used as antigen.

Клетки К562 перед введением животным инактивировали высокой дозой радиации (15000 рад). При первой (сенсибилизирующей) иммунизации, которая проводилась посредством подкожной инъекции убитых клеток в область спины, доза клеток К562 составляла 0,5×10⁶/мышь в 200 мкл буфера Хенкса. Повторная (разрешающая) иммунизация проводилась через 10 суток. Для этого по 5×10⁶ убитых радиацией клеток К562 в 50 мкл буфера Хенкса вводили под апоневротическую пластинку задней левой конечности. В качестве контроля в правую заднюю лапу каждой мыши вводили 50 мкл буфера Хенкса. Интенсивность воспалительной реакции, которая является показателем уровня ГЗТ, определяли через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена, сравнивая массу отрезанных на уровне голеностопного сустава задних конечностей каждой мыши. Индекс воспаления (ИВ) рассчитывали по разнице массы опытной (О) и контрольной (К) конечностей:K562 cells were inactivated with a high dose of radiation (15,000 rad) before being administered to animals. In the first (sensitizing) immunization, which was carried out by subcutaneous injection of dead cells into the back, the dose of K562 cells was 0.5 × 10 ⁶ / mouse in 200 μl of Hanks buffer. Repeated (permissive) immunization was carried out after 10 days. For this, 5 × 10 ⁶ radiation-killed K562 cells in 50 μl of Hanks buffer were injected under the aponeurotic plate of the hind left extremity. As a control, 50 μl of Hanks buffer was injected into the right hind paw of each mouse. The intensity of the inflammatory response, which is an indicator of the HRT level, was determined 24 hours after the administration of the antigen dose, comparing the weight of the hind limbs cut off at the level of the ankle joint of each mouse. The inflammation index (IR) was calculated from the difference in the weight of the experimental (O) and control (C) limbs:

Влияние аллостатина на ГЗТ оценивали как на стадии сенсибилизации, так и на стадии разрешения. С этой целью препарат в дозе 2,5 или 25 мкг инъецировали мышам подкожно в область спины сразу после сенсибилизирующей и/или разрешающей иммунизации. Полученные результаты приведены в таблице 12.The effect of allostatin on HRT was assessed both at the stage of sensitization and at the stage of resolution. For this purpose, the drug in a dose of 2.5 or 25 μg was injected subcutaneously in the mice in the back region immediately after sensitizing and / or permissive immunization. The results are shown in Table 12.

В использованных экспериментальных условиях клетки эритроидной лейкемии человека линии К562 индуцировали у мышей выраженную реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Эти данные свидетельствуют о формировании клона Т-лимфоцитов, специфически распознающего антигены клеток К562. Введение аллостатина усиливало реакцию ГЗТ в результате повышения реактивности соответствующего клона Т-лимфоцитов. Таким образом, полученные результаты демонстрируют эффективность стимуляции Т-лимфоцитов аллостатином в условиях in vivo и возможность использования этого эффекта для усиления распознавания опухолевых антигенов и, соответственно, иммунотерапии рака.Under the experimental conditions used, human erythroid leukemia cells of the K562 line induced a pronounced delayed-type hypersensitivity reaction in mice. These data indicate the formation of a T-lymphocyte clone that specifically recognizes the antigens of K562 cells. The introduction of allostatin enhanced the HRT response as a result of an increase in the reactivity of the corresponding clone of T-lymphocytes. Thus, the results obtained demonstrate the effectiveness of stimulation of T-lymphocytes with allostatin in vivo and the possibility of using this effect to enhance recognition of tumor antigens and, accordingly, cancer immunotherapy.

Пример 13. Влияние аллостатина на распознавание опухолевых клеток системой естественного иммунитетаExample 13. Effect of allostatin on the recognition of tumor cells by the natural immunity system

Методика постановки экспериментов в целом соответствовала описанной в примере 12, посвященном анализу реакции ГЗТ. Основное отличие состояло в том, что антиген вводился животным однократно, а реакция воспаления анализировалась вскоре после введения антигена. Следовательно, речь о формировании специфического иммунитета в данном случае не идет, а наблюдаемые эффекты относятся к области естественного (врожденного) иммунитета, основными эффекторами которого являются NK клетки и некоторые субпопуляции Т-лимфоцитов, в частности, NKT.The experimental setup procedure was generally consistent with that described in example 12, devoted to the analysis of the DTH reaction. The main difference was that the antigen was administered to the animals once, and the inflammatory response was analyzed shortly after the administration of the antigen. Consequently, we are not talking about the formation of specific immunity in this case, and the observed effects relate to the field of natural (innate) immunity, the main effectors of which are NK cells and some subpopulations of T-lymphocytes, in particular, NKT.

В опытах использовали 3-месячных самцов белых беспородных мышей. Убитые летальной дозой радиации (15 тыс. рад) клетки К562 применяли в качестве чужеродных для мышей корпускулярных антигенов. Иммунизацию проводили посредством инокуляции 1,2×10⁶ клеток под апоневротическую пластинку левой задней лапы животных в 50 мкл буфера Хенкса. Для контроля в правую заднюю лапу вводили 50 мкл буферного раствора. Аллостатин в дозе 2,5 мкг на животное в 200 мкл буфера Хенкса вводили подкожно в область спины сразу после введения антигена. Интенсивность воспалительной реакции оценивали через 24 часа после инъекции антигена, сравнивая массу отрезанных по голеностопному суставу задних конечностей у каждого животного. Индекс воспаления рассчитывали по формуле, приведенной в примере 12.The experiments used 3-month-old male white outbred mice. K562 cells killed by a lethal dose of radiation (15 thousand rad) were used as corpuscular antigens foreign to mice. Immunization was performed by inoculating 1.2 × 10 ⁶ cells under the aponeurotic plate of the left hind paw of the animals in 50 μl of Hanks buffer. For control, 50 μL of buffer solution was injected into the right hind paw. Allostatin at a dose of 2.5 μg per animal in 200 μl of Hanks buffer was injected subcutaneously into the back region immediately after antigen administration. The intensity of the inflammatory response was assessed 24 hours after the antigen injection by comparing the weights of the hind limbs cut off at the ankle joint in each animal. The inflammation index was calculated using the formula given in example 12.

Результаты исследования представлены в Таблице 13. Однократное введение антигена в этих условиях не вызвало у животных заметной воспалительной реакции. В том случае, если введение антигена в область левой задней лапы сопровождалось подкожной инъекцией аллостатина в область спины, у всех животных отмечалась воспалительная реакция в этой лапе, в то время как правая лапа, в которую вводился только раствор Хенкса, оставалась интактной. Таким образом, аллостатин достоверно усиливал неспецифическое распознавание корпускулярного антигена, который никогда ранее данному организму не предъявлялся и без дополнительной стимуляции оставался нераспознанным. В контексте общепринятых представлений о механизмах естественного иммунитета наиболее вероятным объяснением наблюдаемого эффекта является стимулирующее действие аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток. Независимым экспериментальным подтверждением этой гипотезы служат результаты исследований in vitro, которые приведены выше в примерах 7-9. Таким образом, полученные результаты демонстрируют эффективность стимуляции аллостатином NK клеток в условиях in vivo и возможность использования этого эффекта в иммунотерапии рака. Механизм активации может быть связан как с прямой стимуляцией цитотоксической активности NK клеток (примеры 7-9), так и с усилением продукции IFNy Т-лимфоцитами (пример 10) и самими NK клетками (пример 11).The results of the study are presented in Table 13. A single administration of the antigen under these conditions did not cause a noticeable inflammatory reaction in the animals. If the injection of antigen into the left hind paw was accompanied by a subcutaneous injection of allostatin into the back, all animals showed an inflammatory reaction in this paw, while the right paw, into which only Hanks solution was injected, remained intact. Thus, allostatin significantly enhanced the nonspecific recognition of the corpuscular antigen, which had never been presented to a given organism before and remained unrecognized without additional stimulation. In the context of generally accepted ideas about the mechanisms of natural immunity, the most likely explanation for the observed effect is the stimulating effect of allostatin on the cytotoxic activity of NK cells. Independent experimental confirmation of this hypothesis are the results of in vitro studies, which are given above in examples 7-9. Thus, the results obtained demonstrate the effectiveness of allostatin stimulation of NK cells in vivo and the possibility of using this effect in cancer immunotherapy. The activation mechanism can be associated with both direct stimulation of the cytotoxic activity of NK cells (examples 7-9) and with an increase in the production of IFNy by T-lymphocytes (example 10) and NK cells themselves (example 11).

Пример 14. Анализ токсичности аллостатинаExample 14. Analysis of toxicity of allostatin

Для определения токсичности аллостатина использовали культуру клеток фибробластов кожи взрослого человека, пассаж 3 и 4. Клетки выращивали на среде DMEM/F12 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, USA) и антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Pen/Strep 100×, Gibco), пересевали с помощью 0,25% раствора трипсина и ЭДТА (Gibco). Для опыта высевали клетки в 96-луночные панели (Costar) в количестве 5 тысяч на лунку, объем среды 200 мкл/лунку. На следующий день плотность посева составляла 75% площади лунки. Среду полностью меняли на свежую ростовую среду в контрольном варианте и с добавками аллостатина в опытных вариантах. Растворы аллостатина готовили следующим образом: навеску препарата растворяли в ростовой среде в концентрации 1000 мг/Л, затем делали серию последовательных 10-кратных разведений. Для каждого варианта опыта использовали 3 лунки с клетками. 96-луночную панель инкубировали в стандартных условиях: 5% СО₂, 37°С, 85% влажности в течение 24 ч. Через 24 ч лунки каждого варианта последовательно промывали раствором PBS (Sigma), добавляли 200 мкл раствора трипсина, инкубировали 5 мин, затем пипетировали и приготавливали суспензию единичных клеток. Аликвоту суспензии разбавляли 0,4% раствором трипанового синего (Gibco) 1:1 и подсчитывали количество живых и мертвых клеток в камере Горяева.To determine the toxicity of allostatin, we used a culture of adult human skin fibroblasts, passage 3 and 4. The cells were grown in DMEM / F12 medium supplemented with 10% bovine embryo serum (HyClone, USA) and antibiotics penicillin and streptomycin (Pen / Strep 100 ×, Gibco) , were subcultured with 0.25% trypsin and EDTA solution (Gibco). For the experiment, cells were seeded in 96-well panels (Costar) in the amount of 5 thousand per well, the volume of medium is 200 μl / well. The next day, the seeding density was 75% of the area of the hole. The medium was completely changed to fresh growth medium in the control variant and with the addition of allostatin in the experimental variants. Allostatin solutions were prepared as follows: a weighed portion of the drug was dissolved in a growth medium at a concentration of 1000 mg / L, then a series of successive 10-fold dilutions was made. For each variant of the experiment, 3 wells with cells were used. The 96-well panel was incubated under standard conditions: 5% CO ₂ , 37 ° C, 85% humidity for 24 hours. After 24 hours, the wells of each variant were sequentially washed with PBS solution (Sigma), 200 μl of trypsin solution was added, incubated for 5 min, then pipetted and a single cell suspension was prepared. An aliquot of the suspension was diluted with 0.4% trypan blue solution (Gibco) 1: 1 and the number of living and dead cells was counted in the Goryaev chamber.

Результаты эксперимента представлены в Таблице 14. Количество живых и мертвых (окрашиваемых трипановым синим) клеток во всех вариантах существенно не различалось, закономерных изменений этих показателей в зависимости от концентрации аллостатина не наблюдалось.The results of the experiment are presented in Table 14. The number of living and dead (stained with trypan blue) cells in all variants did not differ significantly, no regular changes in these parameters depending on the concentration of allostatin were observed.

Таким образом, аллостатин не оказывает цитотоксического действия на фибробласты человека во всем диапазоне изученных концентраций, включая максимальную концентрацию 1000 мг/Л. По данным, приведенным в примерах 7 и 8, терапевтически эффективная концентрация аллостатина при воздействии на NK клетки не превышает 0.01 мг/Л. Сравнение этих величин показывает, что превышение терапевтически эффективной концентрации аллостатина в 100000 раз не оказывает цитотоксического действия на клетки человека.Thus, allostatin has no cytotoxic effect on human fibroblasts in the entire range of studied concentrations, including the maximum concentration of 1000 mg / L. According to the data given in examples 7 and 8, the therapeutically effective concentration of allostatin when exposed to NK cells does not exceed 0.01 mg / L. Comparison of these values shows that a 100,000-fold excess of the therapeutically effective concentration of allostatin has no cytotoxic effect on human cells.

Таблицы к примерам 1-14

Tables for examples 1-14

Использованные источники информацииSources of information used

1. Hongming Zhang, Jibei Chen Current status and future directions of cancer immunotherapy Journal of Cancer 2018, 9(10): 1773-1781.1. Hongming Zhang, Jibei Chen Current status and future directions of cancer immunotherapy Journal of Cancer 2018, 9 (10): 1773-1781.

2. Gao X, Mi Y, Guo N, Xu H, Xu L, Gou X and Jin W Cytokine Induced Killer Cells As Pharmacological Tools for Cancer Immunotherapy. Front. Immunol. 2017 8:774. doi: 10.3389/fimmu.2017.00774.2. Gao X, Mi Y, Guo N, Xu H, Xu L, Gou X and Jin W Cytokine Induced Killer Cells As Pharmacological Tools for Cancer Immunotherapy. Front. Immunol. 2017 8: 774. doi: 10.3389 / fimmu.2017.00774.

3. Richard W. Childs and Manias Carlsten Therapeutic approaches to enhance natural killer cell cytotoxicity against cancer: the force awakens Nature reviews Drug discovery 2015, 14: 487-498.3. Richard W. Childs and Manias Carlsten Therapeutic approaches to enhance natural killer cell cytotoxicity against cancer: the force awakens Nature reviews Drug discovery 2015, 14: 487-498.

4. Maelig G. Morvan and Lewis L. Lanier NK cells and cancer: you can teach innate cells new tricks, Nature reviews/Cancer, 2016,16: 7-19.4. Maelig G. Morvan and Lewis L. Lanier NK cells and cancer: you can teach innate cells new tricks, Nature reviews / Cancer, 2016,16: 7-19.

5. Hofer E and Koehl U Natural Killer Cell-Based Cancer Immunotherapies: From Immune Evasion to Promising Targeted Cellular Therapies. Front. Immunol. 2017, 8:745. doi: 10.3389/fimmu.2017.00745.5. Hofer E and Koehl U Natural Killer Cell-Based Cancer Immunotherapies: From Immune Evasion to Promising Targeted Cellular Therapies. Front. Immunol. 2017, 8: 745. doi: 10.3389 / fimmu.2017.00745.

6. Seila Lorenzo-Herrero, Alejandro Lopez-Soto, Christian Sordo-Bahamonde, Ana P Gonzalez-Rodriguez, Massimo Vitale and Segundo Gonzalez NK Cell-Based Immunotherapy in Cancer Metastasis. Cancers 2019, 11, 29; doi: 10.3390/cancers 11010029.6. Seila Lorenzo-Herrero, Alejandro Lopez-Soto, Christian Sordo-Bahamonde, Ana P Gonzalez-Rodriguez, Massimo Vitale and Segundo Gonzalez NK Cell-Based Immunotherapy in Cancer Metastasis. Cancers 2019, 11, 29; doi: 10.3390 / cancers 11010029.

7. WO 1999045102 Method for activating natural killer (NK) cells.7. WO 1999045102 Method for activating natural killer (NK) cells.

8. Patent US 2017/0071982 A1 In vivo priming of natural killer cells8. Patent US 2017/0071982 A1 In vivo priming of natural killer cells

9. WO/2018/182511 Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells9. WO / 2018/182511 Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells

10. WO 2009100942 Ligands of the natural killer (NK) cell surface marker CD27 and therapeutic uses thereof10. WO 2009100942 Ligands of the natural killer (NK) cell surface marker CD27 and therapeutic uses thereof

11. WO 2013119857 Glycosphingolipids for use in modulating immune responses11. WO 2013119857 Glycosphingolipids for use in modulating immune responses

12. Patent US 2015/0299252 Al12. Patent US 2015/0299252 Al

13. John M. Wrangle, Alicia Patterson, C. Bryce Johnson, Daniel J. Neitzke, Shikhar Mehrotra IL-2 and Beyond in Cancer Immunotherapy Journal of interferon and cytokine research, 2018, 38: 45-68 (ПРОТОТИП)13. John M. Wrangle, Alicia Patterson, C. Bryce Johnson, Daniel J. Neitzke, Shikhar Mehrotra IL-2 and Beyond in Cancer Immunotherapy Journal of interferon and cytokine research, 2018, 38: 45-68 (PROTOTYPE)

14. Chernysh S.I., S.I. Kim, G. Bekker, V.A. Pleskach, N.A. Filatova, V.B. Anikin, V.G. Platonov and Philippe Bulet. Antiviral and antitumor peptides from insects. PNAS, 2002, 99 (20): 12628-1263214. Chernysh S.I., S.I. Kim, G. Bekker, V.A. Pleskach, N.A. Filatova, V.B. Anikin, V.G. Platonov and Philippe Bulet. Antiviral and antitumor peptides from insects. PNAS, 2002, 99 (20): 12628-12632

15. Chernysh S, Kozuharova I, Artsibasheva I. Anti-tumor activity of immunomodulatory peptide alloferon-1 in mouse tumor transplantation model, Intern. Immunopharmacol., 2012; 12:312-31415. Chernysh S, Kozuharova I, Artsibasheva I. Anti-tumor activity of immunomodulatory peptide alloferon-1 in mouse tumor transplantation model, Intern. Immunopharmacol. 2012; 12: 312-314

16. Патент RU 2267496 Противоопухолевые и антивирусные пептиды16. Patent RU 2267496 Antineoplastic and antiviral peptides

17. Chernysh S., Kozuharova I. Anti-tumor activity of a peptide combining patterns of insect alloferons and mammalian immunoglobulins in naive and tumor antigen vaccinated mice, Intern. Immunopharmacol., 2013,17: 1090-109317. Chernysh S., Kozuharova I. Anti-tumor activity of a peptide combining patterns of insect alloferons and mammalian immunoglobulins in naive and tumor antigen vaccinated mice, Intern. Immunopharmacol., 2013,17: 1090-1093

18. Alspach E, Lussier DM, Schreiber RD Interferon γ and Its Important Roles in Promoting and Inhibiting Spontaneous and Therapeutic Cancer Immunity, Cold Spring Harb Perspect Biol., 2019 Mar 1;11(3). pii: a028480. doi: 10.1101/cshperspect.a028480.18. Alspach E, Lussier DM, Schreiber RD Interferon γ and Its Important Roles in Promoting and Inhibiting Spontaneous and Therapeutic Cancer Immunity, Cold Spring Harb Perspect Biol., 2019 Mar 1; 11 (3). pii: a028480. doi: 10.1101 / cshperspect.a028480.

19. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012, с. 629-63019. Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part one. - M .: Grif i K, 2012, p. 629-630

20. Dahlberg CIM, Sarhan D, Chrobok M, Duru AD and Alici E Natural Killer Cell-Based Therapies Targeting Cancer: Possible Strategies to Gain and Sustain Anti-Tumor Activity. Front. Immunol., 2015, 6:605. doi: 10.3389/fimmu.2015.0060520. Dahlberg CIM, Sarhan D, Chrobok M, Duru AD and Alici E Natural Killer Cell-Based Therapies Targeting Cancer: Possible Strategies to Gain and Sustain Anti-Tumor Activity. Front. Immunol., 2015, 6: 605. doi: 10.3389 / fimmu.2015.00605

21. Carrega P and Ferlazzo G Natural Killers Are Made Not Born: How to Exploit NK Cells in Lung Malignancies Front. Immunol., 2017, 8:277. doi: 10.3389/fimmu.2017.0027721. Carrega P and Ferlazzo G Natural Killers Are Made Not Born: How to Exploit NK Cells in Lung Malignancies Front. Immunol., 2017, 8: 277. doi: 10.3389 / fimmu.2017.00277

22. Robinson LA, Jaing CJ, Campbell CP, Magliocco A, Xiong Y, Magliocco G, Thissen JB and Antonia S Molecular evidence of viral DNA in non-small cell lung cancer and nonneoplastic lung. British Journal of Cancer 2016,115,497-504 doi: 10.1038/bjc.2016.21322. Robinson LA, Jaing CJ, Campbell CP, Magliocco A, Xiong Y, Magliocco G, Thissen JB and Antonia S Molecular evidence of viral DNA in non-small cell lung cancer and nonneoplastic lung. British Journal of Cancer 2016,115,497-504 doi: 10.1038 / bjc.2016.213

23. Hasegawaa Y, Ando M, Kubo A, Isa S, Yamamoto S, Tsujino K, Kurata T, Ou SH, Takada M, Kawaguchi T, Human papillomavirus in non-small cell lung cancer in never smokers: A systematic review of the literature Lung Cancer 2014, 83 8-1323. Hasegawaa Y, Ando M, Kubo A, Isa S, Yamamoto S, Tsujino K, Kurata T, Ou SH, Takada M, Kawaguchi T, Human papillomavirus in non-small cell lung cancer in never smokers: A systematic review of the literature Lung Cancer 2014, 83 8-13

24. Stiven A, Fischer SA, Robinson BW Immunotherapy for lung cancer Respirology 2016, 21, 821-833 doi: 10.1111/resp.l278924. Stiven A, Fischer SA, Robinson BW Immunotherapy for lung cancer Respirology 2016, 21, 821-833 doi: 10.1111 / resp.l2789

25. Zhu J, Li R, Tiselius E, Roudi R, Teghararian O, Suo C, Song H. Immunotherapy (excluding checkpoint inhibitors) for stage I to III non-small cell lung cancer treated with surgery or radiotherapy with curative intent. Cochrane Database of Systematic Reviews 2017,12. Art. No.: CD011300. DOI: 10.1002/14651858.CD011300.pub225. Zhu J, Li R, Tiselius E, Roudi R, Teghararian O, Suo C, Song H. Immunotherapy (excluding checkpoint inhibitors) for stage I to III non-small cell lung cancer treated with surgery or radiotherapy with curative intent. Cochrane Database of Systematic Reviews 2017.12. Art. No .: CD011300. DOI: 10.1002 / 14651858.CD011300.pub2

26. Chang Y-C, Hsu P-C, Li S-H, Weng S-H, Kuo C-H, Yang T-Y, et al. The Prevalence of PD-L1 Expression in Lung Cancer. Clin Oncol. 2019, 4:1591.26. Chang Y-C, Hsu P-C, Li S-H, Weng S-H, Kuo C-H, Yang T-Y, et al. The Prevalence of PD-L1 Expression in Lung Cancer. Clin Oncol. 2019, 4: 1591.

--->--->

Перечень последовательностейSequence listing

<110> Черныш Сергей Иванович; Chernysh Sergey Ivanovich<110> Chernysh Sergey Ivanovich; Chernysh Sergey Ivanovich

<120> Способ активации цитотоксических лимфоцитов<120> Method for activating cytotoxic lymphocytes

<160> 1<160> 1

<210> 1<210> 1

<211> 13<211> 13

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Аллостатин 1<223> Allostatin 1

<310> RU 2267496 C2<310> RU 2267496 C2

<311> 2004-01-15<311> 2004-01-15

<312> 2006-01-10<312> 2006-01-10

<400> 1<400> 1

His Gly Val Ser Gly Trp Gly Gln His Gly Thr His GlyHis Gly Val Ser Gly Trp Gly Gln His Gly Thr His Gly

1 5 101 5 10

<---<---

Claims

1. A method for activating cytotoxic lymphocytes, comprising treating blood cells with a peptide containing the amino acid sequence His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1), or its pharmaceutically acceptable salts in a concentration that enhances the ability of cytotoxic lymphocytes to lyse transformed body cells, which are cancer cells or virus-infected cells.

2. The method of claim 1, wherein the cancer cells are lung cancer cells.

3. The method of claim 1, wherein the cancer cells are cervical cancer cells.

4. The method of claim 1, wherein the cancer cells are leukemia cells.

5. The method of claim 1, wherein the virus is human papillomavirus.

6. The method according to claim 1, the result of which is the activation of NK lymphocytes.

7. The method according to claim 1, the result of which is the activation of T-lymphocytes.

8. The method according to claim 1, the result of which is an increase in the proportion of lymphocytes producing interferon-gamma.

9. The method according to claim 1, the result of which is an increase in the proportion of lymphocytes expressing the activation receptor CD25.

10. The method according to claim 1, the result of which is an increase in the proportion of lymphocytes expressing the activation receptor CD69.

11. The method according to claim 1, the result of which is an increase in the proportion of lymphocytes expressing the activation receptor NKG2D.

12. The method according to claim 1, the result of which is an increase in the proportion of lymphocytes expressing the activation receptor CD226.

13. The method according to claim 1, the result of which is a decrease in the proportion of lymphocytes expressing inhibitory receptors of the KIR family.

14. The method of claim 13, wherein the KIR family inhibitory receptor is KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1.

15. The method of claim 1, wherein the lymphocytes are treated by introducing the peptide His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1) into the patient's blood ...

16. The method of claim 1, wherein the lymphocytes are treated by intratumoral administration of the peptide His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1).

17. The method of claim 1, wherein the lymphocytes are isolated from peripheral blood and incubated in a nutrient medium containing the peptide His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1).

18. Application of the method according to claim 1 to increase the sensitivity of cytotoxic lymphocytes to interleukin-12.

19. Application of the method according to claim 1 to increase the sensitivity of cytotoxic lymphocytes to interleukin-2.

20. Use of the method according to claim 1 for maintaining a population of NK cells in a functionally active state during a cytotoxic reaction with transformed body cells, which are cancer cells or cells infected with a virus.