RU2751482C2

RU2751482C2 - Method for producing recombinant herpesviruses for simultaneous transduction and immortalization of primary t-lymphocytes and nk cells

Info

Publication number: RU2751482C2
Application number: RU2019144191A
Authority: RU
Inventors: Степан Петрович Чумаков; Юлия Евгеньевна Кравченко; Дмитрий Сергеевич Кравченко; Елена Ивановна Фролова
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2021-07-14
Also published as: RU2019144191A; RU2019144191A3

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, namely to a method for producing recombinant herpesviruses for simultaneous transduction and immortalization of primary T-lymphocytes and NK cells. The recombinant plasmid DNA of pUC-HVS-OFP consists of the following key genetic elements: puromycin resistance gene (pac); orange fluorescent protein (OFP) gene; flanking parts (600 bp) homologous to vCD59 area of HVS genome; ampicillin antibiotic resistance gene (AmpR) and bacterial promoter of ampicillin resistance gene (AmpR promoter); origin of replication of bacteriophage f1 (ori); cytomegalovirus (CMV) promoter. A cell culture permissive to lytic infection with Herpesvirus Saimiri virus is infected with Herpesvirus Saimiri HVS-C488 virus strain. Another interweaved cell line is transfected with a mixture of expression plasmids and pUC-HVS-OFP plasmid. Then the permissive cell culture infected with Herpesvirus Saimiri and the cell culture transfected with expression plasmids are mixed and subjected to co-cultivation.EFFECT: combining the productive development of the virus in the cells of lines permissive to lytic HVS infection with the high efficiency of cell transfection with expression plasmids encoding genetic sequences intended for introduction into genome of the “wild” virus strain makes it possible to obtain recombinant herpesviruses with increased efficiency of development.6 cl, 6 dwg

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в исследовательских и диагностических целях для эффективного получения генетически-модифицированных иммортализованных первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток.The invention relates to biotechnology and can be used for research and diagnostic purposes for the efficient production of genetically modified immortalized primary T-lymphocytes and NK cells.

Лабораторно-клиническая практика создания аутологичных или гетерологичных пациент-специфичных лимфоидных линий требует разработки и оптимизации протоколов, обеспечивающих возможность эффективной иммортализации и генетической модификации первичных культур. Эффективным методом иммортализации первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток является их заражение Гамма-2 герпесвирусом беличьих обезьян Herpesvirus saimiri (HVS), обеспечивающим антигеннезависимую пролиферацию инфицированных культур при сохранении ими функциональной активности и зрелого фенотипа. Использование рекомбинантного HVS также возможно для доставки в клетки протяженных экспрессионных конструкций, благодаря наличию в геноме вируса участков, использование которых в качестве сайтов интеграции целевых рекомбинантных последовательностей не оказывает влияния на жизнеспособность вируса. Сочетание этих особенностей Herpesvirus Saimiri позволяет рассматривать получение рекомбинантных герпесвирусов в качестве перспективного подхода по совмещению методик трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток.The laboratory and clinical practice of creating autologous or heterologous patient-specific lymphoid lines requires the development and optimization of protocols that provide the possibility of effective immortalization and genetic modification of primary cultures. An effective method of immortalization of primary T-lymphocytes and NK-cells is their infection with Gamma-2 herpesvirus of squirrel monkeys Herpesvirus saimiri (HVS), which provides antigen-independent proliferation of infected cultures while maintaining their functional activity and mature phenotype. The use of recombinant HVS is also possible for the delivery of extended expression constructs into cells, due to the presence of regions in the virus genome, the use of which as sites for integration of target recombinant sequences does not affect the viability of the virus. The combination of these features of Herpesvirus Saimiri allows us to consider the production of recombinant herpes viruses as a promising approach for combining the methods of transduction and immortalization of primary T-lymphocytes and NK cells.

В настоящее время разработаны различные алгоритмы использования герпесвирусов для трансдукции первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток; наиболее близкими к заявленному изобретению по технической сущности и результатам, достигаемым аналогами, являются технические решения, описанные в заявках: US5670352А (C12N15/65, опубл. 23.09.1997), JPH02171190A (C12N15/86, опубл. 14.08.1991) и WO2004078911A3 (C12N15/65, опубл. 16.12.2004).Currently, various algorithms have been developed for the use of herpes viruses for transduction of primary T-lymphocytes and NK cells; the closest to the claimed invention in terms of the technical essence and the results achieved by analogues are the technical solutions described in the applications: US5670352A (C12N15 / 65, publ. 09/23/1997), JPH02171190A (C12N15 / 86, publ. 08/14/1991) and WO2004078911A3 ( C12N15 / 65, publ. 12.16.2004).

Применение существующих методик сопряжено с рядом ограничений, обусловленных, главным образом, особенностями линий клеток, служащих для получения рекомбинантного вируса. Используемые культуры клеток должны эффективно подвергаться трансфекции экспрессионными плазмидами, кодирующими генетические последовательности, предназначенные для введения в геном “дикого” штамма вируса, а также должны быть пермиссивны к литической инфекции Herpesvirus Saimiri. Необходимость сочетания этих свойств является серьезным ограничением, значительно сужающим спектр клеточных линий, подходящих для наработки рекомбинантного вируса.The use of existing techniques is associated with a number of limitations, mainly due to the characteristics of the cell lines used to obtain the recombinant virus. The cell cultures used must be efficiently transfected with expression plasmids encoding genetic sequences intended for introduction into the genome of a wild-type virus strain, and must also be permissive to lytic infection with Herpesvirus Saimiri. The need to combine these properties is a serious limitation, significantly narrowing the range of cell lines suitable for the production of a recombinant virus.

Возможным решением проблемы являются технические решения, приведенные в заявках US5670352A и JPH02171190A, описывающие использование Herpesvirus saimiri для трансформации и генетической модификации Т-лимфоцитов. Для наработки вируса авторами изобретений предложено использование клеточной линии OMK (ATCC® CRL-1556™), пермиссивной к литической инфекции Herpesvirus Saimiri. Вместе с тем, удобство использования клеток этой линии для введения в них высокомолекулярной рекомбинантной ДНК вызывает сомнения, значительно уступая культурам, традиционно использующимся в лабораторной практике, таким как как HEK-293 (CRL-1573) или CHO (CRL-11965).A possible solution to the problem is the technical solutions given in applications US5670352A and JPH02171190A, describing the use of Herpesvirus saimiri for the transformation and genetic modification of T lymphocytes. For the production of the virus, the authors of the inventions proposed the use of the OMK cell line (ATCC® CRL-1556 ™), which is permissive to the lytic infection of Herpesvirus Saimiri. At the same time, the convenience of using cells of this line for the introduction of high molecular weight recombinant DNA into them raises doubts, being significantly inferior to cultures traditionally used in laboratory practice, such as HEK-293 (CRL-1573) or CHO (CRL-11965).

Заявка на изобретение JPH11513565A раскрывает возможности использования рекомбинантных генетических векторов на основе вируса герпеса, в частности, Herpesvirus saimiri (HVS), с целью трансдукции и генетической модификации широкого спектра культур клеток человека и животных, в частности, клеток лимфоидных линий. В заявке не раскрываются способы преодоления трудностей введения генетических конструкций в вирус-пермиссивные линии, а также не оговаривается возможность использования изобретения с целью одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток.Application for invention JPH11513565A discloses the possibility of using recombinant genetic vectors based on the herpes virus, in particular, Herpesvirus saimiri (HVS), for the purpose of transduction and genetic modification of a wide range of human and animal cell cultures, in particular, cells of lymphoid lines. The application does not disclose methods of overcoming the difficulties of introducing genetic constructs into virus-permissive lines, nor does it stipulate the possibility of using the invention for the simultaneous transduction and immortalization of primary T-lymphocytes and NK cells.

Другие аналоги, в частности, техническое решение WO2004078911A3, раскрывающее способ трансформации Т-лимфоцитов штаммом Herpesvirus saimiri, модифицированным с целью обеспечения их стабильной интерлейкин-независимой пролиферации, не предусматривают доставку генетических конструкций в клетки инфицируемых линий, что не позволяет использовать данный метод для выполнения задач, решаемых заявленным изобретением, в частности, для одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток.Other analogs, in particular, the technical solution WO2004078911A3, which discloses a method for transforming T-lymphocytes with the Herpesvirus saimiri strain, modified to ensure their stable interleukin-independent proliferation, do not provide for the delivery of genetic constructs into the cells of infected lines, which does not allow the use of this method for performing tasks , solved by the claimed invention, in particular, for the simultaneous transduction and immortalization of primary T-lymphocytes and NK-cells.

Таким образом, проведенные исследования патентной литературы позволяют заключить, что заявленное техническое решение характеризуется научной новизной, не имеет полных аналогов и обладает конкурентными преимуществами для получения рекомбинантных герпесвирусов, обеспечивающих возможность одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток.Thus, the conducted studies of the patent literature allow us to conclude that the claimed technical solution is characterized by scientific novelty, has no complete analogs and has competitive advantages for the production of recombinant herpes viruses, which provide the possibility of simultaneous transduction and immortalization of primary T-lymphocytes and NK cells.

Техническая проблема, решаемая настоящим изобретением - совмещение производительной наработки вируса в клетках линий, пермиссивных к литической инфекции HVS, с высокой эффективностью трансфекции клеток экспрессионными плазмидами, кодирующими генетические последовательности, предназначенные для введения в геном “дикого” штамма вируса, для получения рекомбинантных герпесвирусов.The technical problem solved by the present invention is the combination of the productive production of the virus in cells of lines permissive to the lytic infection of HVS with a high efficiency of cell transfection with expression plasmids encoding genetic sequences intended for introduction into the genome of a “wild” virus strain to obtain recombinant herpes viruses.

Техническим результатом изобретения является оптимизация процесса получения иммортализованных генетически модифицированных первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток, имеющих потенциал использования в терапевтических и исследовательских целях, за счет усовершенствования методики эффективного получения рекомбинантных герпесвирусов.The technical result of the invention is to optimize the process of obtaining immortalized genetically modified primary T-lymphocytes and NK cells, which have the potential to be used for therapeutic and research purposes, by improving the method of efficiently producing recombinant herpes viruses.

Техническая проблема решается за счет того, что пермиссивную к литической инфекции вирусом Herpesvirus Saimiri культуру клеток заражают штаммом вируса Herpesvirus Saimiri HVS-C488, а другую перевиваемую линию клеток трансфицируют смесью экспрессионных плазмид, одна из которых содержит целевой участок, предназначенный для введения в геном вируса штамма Herpesvirus Saimiri HVS-C488 и фланкированный последовательностями протяженностью 300-900 пар нуклеотидных оснований, гомологичных тому участку генома Herpesvirus Saimiri, в который производится введение целевого участка, а две другие экспрессионные плазмиды кодируют поверхностные гликопротеины F и H вакцинного штамма вируса кори, после чего инфицированную Herpesvirus Saimiri пермиссивную клеточную культуру и трансфицированную экспрессионными плазмидами клеточную культуру смешивают и подвергают ко-культивации, в результате чего происходит образование многоядерных синцитиев из клеток обеих культур, что обеспечивает прохождение рекомбинации гомологичных участков, внедрение целевого гена в геном Herpesvirus Saimiri и выход во внеклеточную жидкость рекомбинантных герпесвирусов; в качестве пермиссивной к литической инфекции Herpesvirus Saimiri культуры клеток может быть использована культура клеток ОМК (owl monkey kidney cells, почечный эпителий ночных обезьян); в качестве перевиваемой клеточной линии, которую трансфицируют смесью экспрессионных плазмид, может быть использована клеточная линия HEK-293, либо ее производные; в качестве последовательности протяженностью 300-900 пар нуклеотидных оснований, гомологичной участку генома Herpesvirus Saimiri, может быть использована последовательность вирусного гена vCD59; в состав целевого участка, предназначенного для введения в геном штамма вируса Herpesvirus Saimiri HVS-C488, может входить последовательность, кодирующая флуоресцентный белок; в состав целевого участка, предназначенного для введения в геном штамма вируса Herpesvirus Saimiri HVS-C488, может входить последовательность, кодирующая химерный антигенный рецептор.The technical problem is solved due to the fact that the cell culture, which is permissive to lytic infection with the Herpesvirus Saimiri virus, is infected with the Herpesvirus Saimiri HVS-C488 virus strain, and another continuous cell line is transfected with a mixture of expression plasmids, one of which contains the target site intended for introduction into the genome of the virus of the strain Herpesvirus Saimiri HVS-C488 and flanked by sequences of 300-900 base pairs in length homologous to the region of the Herpesvirus Saimiri genome, into which the target region is introduced, and the other two expression plasmids encode the surface glycoproteins F and H of the measles virus vaccine strain Herpes, and then infected Saimiri permissive cell culture and the cell culture transfected with expression plasmids are mixed and co-cultured, resulting in the formation of multinucleated syncytia from the cells of both cultures, which ensures the passage of recombination and homologous regions, introduction of the target gene into the genome of Herpesvirus Saimiri and release of recombinant herpes viruses into the extracellular fluid; as a permissive cell culture to lytic infection with Herpesvirus Saimiri, a cell culture of OMK (owl monkey kidney cells, renal epithelium of nocturnal monkeys) can be used; as a continuous cell line, which is transfected with a mixture of expression plasmids, the HEK-293 cell line or its derivatives can be used; as a sequence of 300-900 base pairs in length, homologous to a region of the genome of Herpesvirus Saimiri, the sequence of the viral gene vCD59 can be used; the composition of the target site intended for introduction into the genome of the Herpesvirus Saimiri HVS-C488 virus strain may include a sequence encoding a fluorescent protein; the composition of the target region intended for introduction into the genome of the Herpesvirus Saimiri HVS-C488 virus strain may include a sequence encoding a chimeric antigenic receptor.

Разработанная методика получения рекомбинантных герпесвирусов для одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов и The developed method for the production of recombinant herpes viruses for the simultaneous transduction and immortalization of primary T-lymphocytes and

НК-клетокNK cells

1. Заражение пермиссивной к литической HVS инфекции культуры клеток №1 штаммом вируса Herpesvirus Saimiri HVS-C488.1. Infection of permissive to lytic HVS infection of cell culture No. 1 with the Herpesvirus Saimiri HVS-C488 virus strain.

2. Подготовка генетических конструкций:2. Preparation of genetic constructs:

a. экспрессионная плазмида, содержащая целевой участок, предназначенный для введения в геном вируса штамма Herpesvirus Saimiri HVS-C488, фланкированный последовательностями протяженностью 300-900 пар нуклеотидных оснований, гомологичных тому участку генома Herpesvirus Saimiri, в который производится введение целевого участка;a. an expression plasmid containing a target site intended for introduction into the genome of the virus of the Herpesvirus Saimiri HVS-C488 strain, flanked by sequences of 300-900 base pairs in length, homologous to the site of the Herpesvirus Saimiri genome, into which the target site is introduced;

b. экспрессионная плазмида, кодирующая поверхностный гликопротеин F вакцинного штамма вируса кори;b. an expression plasmid encoding the surface glycoprotein F of a measles virus vaccine strain;

c. экспрессионная плазмида, кодирующая поверхностный гликопротеин H вакцинного штамма вируса кори.c. an expression plasmid encoding the surface glycoprotein H of the measles virus vaccine strain.

3. Трансфекция перевиваемой линии клеток №2 смесью экспрессионных плазмид, перечисленных в п. 2 методики.3. Transfection of the continuous cell line No. 2 with a mixture of expression plasmids listed in item 2 of the method.

4. Совместная культивация культур №1 и 2; визуальный контроль формирования многоядерных синцитиев из клеток обеих культур.4. Joint cultivation of crops No. 1 and 2; visual control of the formation of multinucleated syncytia from cells of both cultures.

5. Отбор и центрифугирование ростовой среды совместно культивируемых культур.5. Selection and centrifugation of the growth medium of co-cultivated crops.

6. Заражение вируссодержащим супернатантом пермиссивной культуры, сортировка GFP-позитивных клеток.6. Infection with vaccinated supernatant of permissive culture, sorting of GFP-positive cells.

7. Клонирование и экспансия клонов, наработка и выделение рекомбинантного вируса, определение титра.7. Cloning and expansion of clones, production and isolation of the recombinant virus, titer determination.

8. Секвенирование участка генома рекомбинантного вируса, содержащего сайт интеграции целевых рекомбинантных последовательностей.8. Sequencing of the region of the genome of the recombinant virus containing the site of integration of the target recombinant sequences.

9. Трансдукция первичных культур Т-клеток/NK-клеток наработанным рекомбинантным герпесвирусом.9. Transduction of primary cultures of T-cells / NK-cells with accumulated recombinant herpesvirus.

10. Оценка пролиферативной активности трансдуцированных клеток.10. Evaluation of the proliferative activity of transduced cells.

11. Верификация экспрессии целевых трансгенов в трансдуцированных клетках.11. Verification of the expression of target transgenes in transduced cells.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

1. Пермиссивная к литической инфекции HVS культура клеток OMK была инфицирована “диким” штаммом вируса HVS-C488 (VR-1414) ATCC (США).1. Permissive to lytic infection of HVS, the OMK cell culture was infected with the “wild” virus strain HVS-C488 (VR-1414) ATCC (USA).

2. Использованные генетические конструкции:2. Genetic constructs used:

a. Рекомбинантная плазмидная ДНК pUC-HVS-OFP (Фиг.1), состоящая из следующих ключевых генетических элементов:a. Recombinant plasmid DNA pUC-HVS-OFP (Figure 1), consisting of the following key genetic elements:

1. гена устойчивости к пуромицину (pac);1. gene for resistance to puromycin (pac);

2. гена оранжевого флуоресцентного белка (OFP);2. gene of orange fluorescent protein (OFP);

3. фланкирующими участками (600 п.н.), гомологичными области vCD59 генома HVS (SEQ ID NO : 1 и SEQ ID NO : 2);3. flanking regions (600 bp) homologous to the vCD59 region of the HVS genome (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2);

4. гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter);4. the antibiotic resistance gene ampicillin (AmpR) and the bacterial promoter of the ampicillin resistance gene (AmpR promoter);

5. ориджина репликации бактериофага f1 (ori);5. origin of replication of bacteriophage f1 (ori);

6. промотора цитомегаловируса (CMV).6. cytomegalovirus (CMV) promoter.

b. Рекомбинантная плазмидная ДНК pMD2-F∆30 (Фиг. 2) состоящая из следующих ключевых генетических элементов:b. Recombinant plasmid DNA pMD2-F∆30 (Fig. 2) consisting of the following key genetic elements:

1. ориджина репликации ColE1/pMB1/pBR322/pUC;1. origin of replication ColE1 / pMB1 / pBR322 / pUC;

2. гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter);2. the gene for antibiotic resistance ampicillin (AmpR) and the bacterial promoter of the gene for resistance to ampicillin (AmpR promoter);

3. промотора цитомегаловируса (CMV);3. cytomegalovirus (CMV) promoter;

4. последовательности, кодирующей поверхностный гликопротеин F вакцинного штамма вируса кори с укороченным на 30 аминокислот С-концевым цитоплазматическим доменом (F∆30).4. the sequence encoding the surface glycoprotein F of the measles virus vaccine strain with the C-terminal cytoplasmic domain shortened by 30 amino acids (F∆30).

c. Плазмидная ДНК pCG-4AHc∆24 (Journal of Virology Jul 2002, 76 (14) 7174-7186), кодирующая поверхностный гликопротеин H вакцинного штамма вируса кори (Фиг. 3).c. Plasmid DNA pCG-4AHc∆24 (Journal of Virology Jul 2002, 76 (14) 7174-7186) encoding the surface glycoprotein H of the measles virus vaccine strain (Fig. 3).

3. Перечисленными плазмидными ДНК (Фиг. 1, 2 и 3) с использованием полиэтиленимина 25 кДА (PEI-25, Polysciences, США) были котрансфицированы клетки линии HEK-293T; плазмиды смешивались в соотношении 8 : 7 : 1, соответственно.3. The listed plasmid DNAs (Fig. 1, 2 and 3) using polyethyleneimine 25 kDa (PEI-25, Polysciences, USA) were co-transfected into HEK-293T cells; plasmids were mixed in a ratio of 8: 7: 1, respectively.

4. Культуры инфицированных клеток OMK и трансфицированных клеток HEK-293 были подвергнуты совместному культивированию в соотношении 1:7, соответственно; для пассирования клеток была использована ростовая среда Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30-2003. В ходе микроскопического исследования совместно культивируемых линий было зафиксировано формирование многоядерных синцитиев из клеток обеих культур.4. Cultures of infected OMK cells and transfected HEK-293 cells were co-cultured at a ratio of 1: 7, respectively; Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30-2003. Microscopic examination of co-cultured lines revealed the formation of multinucleated syncytia from cells of both cultures.

5. Совместно культивируемые клетки, сформировавшие многоядерные синцитии, были использованы для многократного отбора ростовой среды, содержащей рекомбинантные вирионы. Вируссодержащая среда была подвергнута центрифугированию (5000 g; 15 минут) для удаления клеточного дебриса с последующим определением вирусного титра методом Рида-Менча (1.28E+04).5. Co-cultured cells that formed multinucleated syncytia were used for multiple selection of the growth medium containing recombinant virions. The virus-containing medium was centrifuged (5000 g; 15 minutes) to remove cell debris, followed by determination of the viral titer by the Reed-Mench method (1.28E + 04).

6. Вируссодержащим супернатантом были заражены культуры ОМК; по прошествии семи дней в конфлюэнтной клеточной культуре было зафиксировано формирование бляшек, сформированных преимущественно флуоресцентными клетками. 6. Virus-containing supernatant was infected with OMC cultures; After seven days, the formation of plaques, formed mainly by fluorescent cells, was recorded in a confluent cell culture.

7. Для клонирования рекомбинантного HVS-OFP, на лунки 96-луночного планшета, в которые за 24 часа до этого были рассеяны свежие клетки линии ОМК в субконфлюэнтном количестве, была добавлена культуральная среда, содержащая отсортированные инфицированные и флуоресцирующие клетки ОМК из расчета 0.1 инфицированная клетка на лунку. Через 10 дней после инфекции в образцах, подвергшихся заражению, были зафиксированы единичные флуоресцентные бляшки, образованные индивидуальными рекомбинировавшими вирусными частицами. Вируссодержащая среда с лунок, в которых наблюдалось наиболее выраженное развитие литического процесса, была использована для наработки препаративных количеств рекомбинантного вирусного препарата и его анализа. 7. To clone the recombinant HVS-OFP, a culture medium containing sorted infected and fluorescent OMK cells at the rate of 0.1 infected cell was added to the wells of a 96-well plate, into which fresh OMK cells in a sub-confluent amount were scattered 24 hours before. per hole. 10 days after infection, single fluorescent plaques formed by individual recombined viral particles were observed in the infected samples. The virus-containing medium from the wells, in which the most pronounced development of the lytic process was observed, was used to develop preparative amounts of the recombinant viral preparation and its analysis.

8. Наработанный образец вируса был проанализирован в ходе секвенирования, показавшего успешную интеграцию целевой экспрессионной кассеты в области vCD59 генома (SEQ ID NO : 3).8. The generated virus sample was analyzed during sequencing, which showed successful integration of the target expression cassette in the vCD59 region of the genome (SEQ ID NO: 3).

9. Заражение полученным препаратом рекомбинантного герпесвируса Т-лимфоцитов и НК-клеток было проведено из расчета 10 вирусных частиц на 1 клетку. Процесс заражения был проведен в течение 8 часов в бессывороточной питательной среде AIM-V, после чего клетки были осаждены центрифугированием и были рассажены на свежую порцию питательной среды AIM-V.9. Infection with the obtained preparation of the recombinant herpesvirus T-lymphocytes and NK-cells was carried out at the rate of 10 viral particles per 1 cell. The infection process was carried out for 8 hours in a serum-free AIM-V culture medium, after which the cells were pelleted by centrifugation and seeded on a fresh portion of AIM-V culture medium.

10. Пролиферативная активность инфицированных культур была оценена в ходе стандартизированных протоколов систематического подсчета клеток в камере Горяева.10. The proliferative activity of infected cultures was assessed using standardized protocols for systematic cell counting in a Goryaev chamber.

11. Верификация эффективности введения в клетки экспрессионной кассеты была проведена с помощью флуоресцентной микроскопии, в ходе которой был определен процент OFP-позитивных лимфоцитов к общему числу инфицированных клеток.11. Verification of the efficiency of the introduction of the expression cassette into the cells was carried out using fluorescence microscopy, during which the percentage of OFP-positive lymphocytes was determined to the total number of infected cells.

Анализ эффективности разработанной методики получения рекомбинантных герпесвирусов для одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов и НК-клетокAnalysis of the effectiveness of the developed technique for the production of recombinant herpes viruses for the simultaneous transduction and immortalization of primary T-lymphocytes and NK cells

Конкурентное преимущество предложенной методики базируется на использовании системы из двух линий клеток: линии, пермиссивной к литической инфекции вирусом Herpesvirus Saimiri, и вспомогательной линии, характеризующейся высокой эффективностью трансфекции. Верификация ценности изобретения была построена на сопоставлении предложенной методики с традиционными способами наработки рекомбинантных герпесвирусов, подразумевающими использование одной линии клеток.The competitive advantage of the proposed technique is based on the use of a system of two cell lines: a line that is permissive to lytic infection with the Herpesvirus Saimiri virus, and an auxiliary line, characterized by a high transfection efficiency. Verification of the value of the invention was based on a comparison of the proposed methodology with traditional methods for the production of recombinant herpes viruses, implying the use of a single cell line.

В рамках тестирования традиционной методики вирус-пермиссивные клетки линии ОМК были трансфицированы экспрессионной плазмидой pUC-HVS-OFP, несущей ген устойчивости к пуромицину (pac), ген оранжевого флуоресцентного белка (OFP), фланкированные участками (600 п.н.), гомологичными области vCD59 генома HVS; процедура была проведена с использованием катионного полимера PEI-25 в заранее подобранных условиях (соотношение PEI:ДНК 6:1, 10 мкг ДНК на 2 млн клеток). Ростовая среда, собранная с трансфицированных и зараженных вирусом ОМК клеток, была использована для реинфекции клеток. Эффективность получения рекомбинантного вируса была оценена по процентному соотношению флуоресцентных клеток в реинфицированной популяции ОМК; полученные значения не превышали 3% (Фиг. 4 А).As part of testing the traditional method, virus-permissive cells of the OMK line were transfected with the expression plasmid pUC-HVS-OFP carrying the puromycin resistance gene (pac), the gene for orange fluorescent protein (OFP), flanked by regions (600 bp) homologous to the region vCD59 of the HVS genome; the procedure was carried out using the cationic polymer PEI-25 under preselected conditions (PEI: DNA ratio 6: 1, 10 μg DNA per 2 million cells). The growth medium collected from the cells transfected and infected with the BMC virus was used for the reinfection of the cells. The efficiency of obtaining a recombinant virus was assessed by the percentage of fluorescent cells in the reinfected population of OMC; the obtained values did not exceed 3% (Fig. 4A).

Тестирование эффективности изобретения было проведено согласно пунктам 1-6 разработанной методики получения рекомбинантных герпесвирусов, также подробно описанным в разделе “Осуществление изобретения”. Эффективность получения рекомбинантного вируса была оценена по процентному соотношению флуоресцентных клеток в инфицированной популяции ОМК; полученные результаты (Фиг. 4 В) достоверно превышали значения, полученные при использовании традиционного протокола.Testing the effectiveness of the invention was carried out in accordance with paragraphs 1-6 of the developed method of obtaining recombinant herpes viruses, also described in detail in the section "Implementation of the invention". The efficiency of obtaining a recombinant virus was assessed by the percentage of fluorescent cells in the infected population of OMC; the results obtained (Fig. 4B) significantly exceeded the values obtained using the traditional protocol.

Для оценки возможности использования вируса для одновременной трансдукции и иммортализации лимфоцитов, полученный препарат был использован для трансдукции периферических мононуклеарных клеток, а также линии А549, использованной в качестве контроля. Анализ популяций клеток в ходе проточной цитометрии показал образование фракций, флуоресцирующих OFP-позитивных клеток: их доля для линии А549 сохранялась постоянной в течение 5 недель после инфекции, а для PBMC - постоянно увеличивалась (Фиг. 5, 6). Полученные данные позволяют заключить, что вирус вызвал иммортализацию человеческих периферических мононуклеарных клеток, в то время как введенная в геном вируса экспрессионная кассета сохранила работоспособность как в процессе литической инфекции, так и в латентной форме существования герпесвируса. To assess the possibility of using the virus for the simultaneous transduction and immortalization of lymphocytes, the resulting preparation was used for the transduction of peripheral mononuclear cells, as well as the A549 line used as a control. Analysis of cell populations during flow cytometry showed the formation of fractions of fluorescent OFP-positive cells: their fraction for the A549 line remained constant for 5 weeks after infection, and for PBMC, it constantly increased (Fig. 5, 6). The data obtained allow us to conclude that the virus caused the immortalization of human peripheral mononuclear cells, while the expression cassette introduced into the genome of the virus retained its operability both in the process of lytic infection and in the latent form of herpesvirus existence.

Возможность использования изобретения для решения заявленных задач в сочетании с эффективностью, превосходящей эффективность существующих протоколов, подтверждают конкурентное преимущество предложенной методики и позволяют рекомендовать ее для получения рекомбинантных герпесвирусов для одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов и НК-клеток. The possibility of using the invention to solve the stated problems in combination with an efficiency that surpasses the effectiveness of existing protocols, confirm the competitive advantage of the proposed method and make it possible to recommend it for the production of recombinant herpes viruses for the simultaneous transduction and immortalization of primary T-lymphocytes and NK cells.

Изобретение иллюстрировано следующими материалами:The invention is illustrated by the following materials:

Фиг. 1 – Схематичное изображение генетической конструкции pUC-HVS-OFP.FIG. 1 - Schematic representation of the pUC-HVS-OFP genetic construct.

Фиг. 2 – Схематическое изображение генетической конструкции pMD2-Fd30.FIG. 2 - Schematic representation of the genetic construct pMD2-Fd30.

Фиг. 3 – Схематическое изображение генетической конструкции pCD-4AHcd24. FIG. 3 - Schematic representation of the pCD-4AHcd24 genetic construct.

Фиг. 4 – Доля OFP-позитивных клеток в общей популяции ОМК, инфицированных препаратами рекомбинантного герпесвируса, наработанным согласно традиционному протоколу (А) и разработанной методики (В). FIG. 4 - The proportion of OFP-positive cells in the total population of OMC infected with recombinant herpesvirus preparations, accumulated according to the traditional protocol (A) and the developed method (B).

Фиг. 5 – Динамика изменения численности флуоресцентных популяций после инфекции HVS-OFP.FIG. 5 - Dynamics of changes in the number of fluorescent populations after infection with HVS-OFP.

Фиг. 6 - Доля OFP-позитивных клеток в общей популяции PBMC, инфицированных препаратом рекомбинантного герпесвируса HVS-OFP.FIG. 6 - The proportion of OFP-positive cells in the total PBMC population infected with the HVS-OFP recombinant herpesvirus preparation.

Перечень последовательностейSequence listing

SEQ ID NO: 1 – 5'-концевой фланкирующий участок, гомологичный области vCD59 генома HVS ACAGGCTGCTCTTCAGGAGCACCAGAAGAAGGTCGAATTGCGTTCCTTCTCAAAAGAGGAGGCATGTTTGCAAATGAAATGAGAATCTGGTGAGATAAGATGTATTTGCATGAAGCTTCTATTTATACTACATTAGAGGCATTTTTCAGAAGCAAAAATGCCTCTAATTATATACACTGTACTATTTACCTCTATTACACATTTTCTATTTTAAGTCTGAAAGTGATTAATCAAGAAAGAAGTTTGTGGTTCCCTGGAGATTAGTTCACAAGCTGTCTGAGGTTAAAGGTGGTTCTTTAGCACTGACACACAAGTTGCTATAAGAATTGAAGCTTGCTTTATAAAAAGTTACTTGTGTTTAATTACTATTAAAATAAAGAGAATGTATATTTTGTTTAAGTTGATGCTTGCTTCTGTTTTTTGCAAGTCAAGCTACAGCTTGCAATGCTACAACTGTTCTCACTCAACTATGCAGTGTACAACATCTACTAGTTGTACATCTAATCTTGATTCTTGTCTCATTGCTAAAGCTGGGTCAAAAGTATATTACAGGTGCTGGAAGTTTGATGACTGTAGCTTCAAACGCATCTCAAATCAATTGSEQ ID NO: 1 - 5'-terminal flanking region homologous to a region of the genome of HVS ACAGGCTGCTCTTCAGGAGCACCAGAAGAAGGTCGAATTGCGTTCCTTCTCAAAAGAGGAGGCATGTTTGCAAATGAAATGAGAATCTGGTGAGATAAGATGTATTTGCATGAAGCTTCTATTTATACTACATTAGAGGCATTTTTCAGAAGCAAAAATGCCTCTAATTATATACACTGTACTATTTACCTCTATTACACATTTTCTATTTTAAGTCTGAAAGTGATTAATCAAGAAAGAAGTTTGTGGTTCCCTGGAGATTAGTTCACAAGCTGTCTGAGGTTAAAGGTGGTTCTTTAGCACTGACACACAAGTTGCTATAAGAATTGAAGCTTGCTTTATAAAAAGTTACTTGTGTTTAATTACTATTAAAATAAAGAGAATGTATATTTTGTTTAAGTTGATGCTTGCTTCTGTTTTTTGCAAGTCAAGCTACAGCTTGCAATGCTACAACTGTTCTCACTCAACTATGCAGTGTACAACATCTACTAGTTGTACATCTAATCTTGATTCTTGTCTCATTGCTAAAGCTGGGTCAAAAGTATATTACAGGTGCTGGAAGTTTGATGACTGTAGCTTCAAACGCATCTCAAATCAATTG vCD59

SEQ ID NO: 2 – 3'-концевой фланкирующий участок, гомологичный области vCD59 генома HVSSEQ ID NO: 2 - 3'-end flanking region homologous to the vCD59 region of the HVS genome

TCTGAAACACAGTTAAAGTATCATTGTTGTAAGAAAAACTTGTGTAATGTTAACAAAGTGATTGAAAATGGAAAAAGAACAATATCAGATAAGGCTCTTTTACTATTAGCATTGTTTTTAGTAACTGCTTAGAACCTTTCTCTTTAAAAGTGAACAACATACCTATATTGTAACATTTATTTTTGCGTAGCTTATTCGTATTGCTATTACAAGTTAAAATATTGTGTTTTTAACTATAATTTTTAAAAAGATAAAATGAGATGTAGTATATTACCCATAGTCAAAATTAAAGTGCTAGATATTATTAGCATTTTTATCAACAACGCAAATAAAAGTTAAGATACATTATTTTTTTGATATTTGGATTATTGTGTGCTTTTTATCATATGTTAAAAGTTTTATGTCATTTTATTCTTACATATATAAAGCTAAATTTTAAAGCAACTTATCAGTAGCATCTTAGCTTCTGATCTGTACAGACTTATATAATATGGGTTTATCCTTAAGAAAAAACAAAGAAGAAAAAAATAACACAGTGCCAAACTTGCCAGTTAATTACATGTTAAGAAATCCTGTTTATAAAAAGAAATATCTGCCAGCTCTGAAACACAGTTAAAGTATCATTGTTGTAAGAAAAACTTGTGTAATGTTAACAAAGTGATTGAAAATGGAAAAAGAACAATATCAGATAAGGCTCTTTTACTATTAGCATTGTTTTTAGTAACTGCTTAGAACCTTTCTCTTTAAAAGTGAACAACATACCTATATTGTAACATTTATTTTTGCGTAGCTTATTCGTATTGCTATTACAAGTTAAAATATTGTGTTTTTAACTATAATTTTTAAAAAGATAAAATGAGATGTAGTATATTACCCATAGTCAAAATTAAAGTGCTAGATATTATTAGCATTTTTATCAACAACGCAAATAAAAGTTAAGATACATTATTTTTTTGATATTTGGATTATTGTGTGCTTTTTATCATATGTTAAAAGTTTTATGTCATTTTATTCTTACATATATAAAGCTAAATTTTAAAGCAACTTATCAGTAGCATCTTAGCTTCTGATCTGTACAGACTTATATAATATGGGTTTATCCTTAAGAAAAAACAAAGAAGAAAAAAATAACACAGTGCCAAACTTGCCAGTTAATTACATGTTAAGAAATCCTGTTTATAAAAAGAAATATCTGCCAGC

SEQ ID NO : 3 – нуклеотидная последовательность участка генома рекомбинантного вируса HVS-OFP с интегрированной кассетой, расположенная между последовательностями вирусных генов IE14-C и vBcl-2.SEQ ID NO: 3 is the nucleotide sequence of a region of the genome of the recombinant HVS-OFP virus with an integrated cassette located between the sequences of the viral genes IE14-C and vBcl-2.

CTGGTGAGATAAGATGTATTTGCATGAAGCTTCTATTTATACTACATTAGAGGCATTTTTCAGAAGCAAAAATGCCTCTAATTATATACACTGTACTATTTACCTCTATTACACATTTTCTATTTTAAGTCTGAAAGTGATTAATCAAGAAAGAAGTTTGTGGTTCCCTGGAGATTAGTTCACAAGCTGTCTGAGGTTAAAGGTGGTTCTTTAGCACTGACACACAAGTTGCTATAAGAATTGAAGCTTGCTTTATAAAAAGTTACTTGTGTTTAATTACTATTAAAATAAAGAGAATGTATATTTTGTTTAAGTTGATGCTTGCTTCTGTTTTTTGCAAGTCAAGCTACAGCTTGCAATGCTACAACTGTTCTCACTCAACTATGCAGTGTACAACATCTACTAGTTGTACATCTAATCTTGATTCTTGTCTCATTGCTAAAGCTGGGTCAAAAGTATATTACAGGTGCTGGAAGTTTGATGACTGTAGCTTCAAACGCATCTCAAATCAATTGCTCGAGGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGGAATTCGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGTGCCCGAAGGACCGCGCGACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTCTAGAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGAACCTGAGCAAAAACGTGAGCGTGAGCGTGTATATGAAGGGGAACGTCAACAATCATGAGTTTGAGTACGACGGGGAAGGTGGTGGTGATCCTTATACAGGTAAATATTCCATGAAGATGACGCTACGTGGTCAAAATTCCCTACCCTTTTCCTATGATATCATTACCACGGCATTTCAGTATGGTTTCCGCGTATTTACAAAATACCCTGAGGGAATTGTTGACTATTTTAAGGACTCGCTTCCCGACGCATTCCAGTGGAACAGACGAATTGTGTTTGAAGATGGTGGAGTACTAAACATGAGCAGTGATATCACATATAAAGATAATGTTCTGCATGGTGACGTCAAGGCTGAGGGAGTGAACTTCCCGCCGAATGGGCCAGTGATGAAGAATGAAATTGTGATGGAGGAACCGACTGAAGAAACATTTACTCCAAAAAACGGGGTTCTTGTTGGCTTTTGTCCCAAAGCGTACTTACTTAAAGACGGTTCCTATTACTATGGAAATATGACAACATTTTACAGATCCAAGAAATCTGGCCAGGCACCTCCTGGGTATCACTTTGTTAAGCATCGTCTCGTCAAGACCAATGTGGGACATGGATTTAAGACGGTTGAGCAGACTGAATATGCCACTGCTCATGTCAGTGATCTTCCCAAGTTCGAAGCTTGACCTGCAGGTCTGAAACACAGTTAAAGTATCATTGTTGTAAGAAAAACTTGTGTAATGTTAACAAAGTGATTGAAAATGGAAAAAGAACAATATCAGATAAGGCTCTTTTACTATTAGCATTGTTTTTAGTAACTGCTTAGAACCTTTCTCTTTAAAAGTGAACAACATACCTATATTGTAACATTTATTTTTGCGTAGCTTATTCGTATTGCTATTACAAGTTAAAATATTGTGTTTTTAACTATAATTTTTAAAAAGATAAAATGAGATGTAGTATATTACCCATAGTCAAAATTAAAGTGCTAGATATTATTAGCATTTTTATCAACAACGCAAATAAAAGTTAAGATACATTATTTTTTTGATATTTGGATTATTGTGTGCTTTTTATCATATGTTAAAAGTTTTATGTCATTTTATTCTTACATATATAAAGCTAAATTTTAAAGCAACTTATCAGTAGCATCTTAGCTTCTGATCTGTACAGACTTATATAATATGGGTTTATCCTTAAGAAAAAACAAAGAAGAAAAAAATAACACAGTGCCAAACTTGCCAGTTAATTACATGTTAAGAAATCCTGTTTATAAAAAGAAATATCTGCCAGCAAATATTTGGGAATCTAGAAATTCTGTTTTTTGGAACAGTGTCTATGTTGTTAATTCAAAAGCTAAATAAAAGCTTATTTATAGCATGTTGTTATTTAGAAGAGATAATTTTATGAAAACTATAAATTTGAAAGTAAGAAATCTAATGCTTATTAAAAGTGTGTTATAAAAAGCAAGAAGCTACATTATGTACTTAAAAATAAAATTAGTATATGAATTTATGTTTAACAAGCATATTCATAACAGCAGCTGAGTTACCACATCTAAGAAAATCTGGTGAGATAAGATGTATTTGCATGAAGCTTCTATTTATACTACATTAGAGGCATTTTTCAGAAGCAAAAATGCCTCTAATTATATACACTGTACTATTTACCTCTATTACACATTTTCTATTTTAAGTCTGAAAGTGATTAATCAAGAAAGAAGTTTGTGGTTCCCTGGAGATTAGTTCACAAGCTGTCTGAGGTTAAAGGTGGTTCTTTAGCACTGACACACAAGTTGCTATAAGAATTGAAGCTTGCTTTATAAAAAGTTACTTGTGTTTAATTACTATTAAAATAAAGAGAATGTATATTTTGTTTAAGTTGATGCTTGCTTCTGTTTTTTGCAAGTCAAGCTACAGCTTGCAATGCTACAACTGTTCTCACTCAACTATGCAGTGTACAACATCTACTAGTTGTACATCTAATCTTGATTCTTGTCTCATTGCTAAAGCTGGGTCAAAAGTATATTACAGGTGCTGGAAGTTTGATGACTGTAGCTTCAAACGCATCTCAAATCAATTGCTCGAGGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGGAATTCGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGATGACCGAGTACAA GCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGTGCCCGAAGGACCGCGCGACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTCTAGAGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGAACCTGAGCAAAAACGTGAGCGTGAGCGTGTATATGAAGGGGAACGTCAACAATCATGAGTTTGAGTACGACGGGGAAGGTGGTGGTGATCCTTATACAGGTAAATATTCCATGAAGATGACGCTACGTGGTCAAAATTCCCTACCCTTTTCCTATGATATCATTACCACGGCATTTCAGTATGGTTTCCGCGTATTTACAAAATACCCTGAGGGAATTGTTGACTATTTTAAGGACTCGCTTCCCGACGCATTCCAGTGGAACAGACGAATTGTGTTTGAAGATGGTGGAGTACTAAACATGAGCAGTGATATCACATATAAAGATAATGTTCTGCATGGTGAC GTCAAGGCTGAGGGAGTGAACTTCCCGCCGAATGGGCCAGTGATGAAGAATGAAATTGTGATGGAGGAACCGACTGAAGAAACATTTACTCCAAAAAACGGGGTTCTTGTTGGCTTTTGTCCCAAAGCGTACTTACTTAAAGACGGTTCCTATTACTATGGAAATATGACAACATTTTACAGATCCAAGAAATCTGGCCAGGCACCTCCTGGGTATCACTTTGTTAAGCATCGTCTCGTCAAGACCAATGTGGGACATGGATTTAAGACGGTTGAGCAGACTGAATATGCCACTGCTCATGTCAGTGATCTTCCCAAGTTCGAAGCTTGACCTGCAGGTCTGAAACACAGTTAAAGTATCATTGTTGTAAGAAAAACTTGTGTAATGTTAACAAAGTGATTGAAAATGGAAAAAGAACAATATCAGATAAGGCTCTTTTACTATTAGCATTGTTTTTAGTAACTGCTTAGAACCTTTCTCTTTAAAAGTGAACAACATACCTATATTGTAACATTTATTTTTGCGTAGCTTATTCGTATTGCTATTACAAGTTAAAATATTGTGTTTTTAACTATAATTTTTAAAAAGATAAAATGAGATGTAGTATATTACCCATAGTCAAAATTAAAGTGCTAGATATTATTAGCATTTTTATCAACAACGCAAATAAAAGTTAAGATACATTATTTTTTTGATATTTGGATTATTGTGTGCTTTTTATCATATGTTAAAAGTTTTATGTCATTTTATTCTTACATATATAAAGCTAAATTTTAAAGCAACTTATCAGTAGCATCTTAGCTTCTGATCTGTACAGACTTATATAATATGGGTTTATCCTTAAGAAAAAACAAAGAAGAAAAAAATAACACAGTGCCAAACTTGCCAGTTAATTACATGTTAAGAAATCCTGTTTATAAAAAGAAATATCTGCCAGCAAATATTTGGGAATCTAGAAATTCTGTTTTTTGGAACAGTGTCTATGTTGTTAATTCAAAAG CTAAATAAAAGCTTATTTATAGCATGTTGTTATTTAGAAGAGATAATTTTATGAAAACTATAAATTTGAAAGTAAGAAATCTAATGCTTATTAAAAGTGTGTGTTATAAAAAGCAAGAAGCTACATTATGTACTATTAATCATAGATAGATA

Claims

1. Recombinant plasmid DNA pUC-HVS-OFP, designed to introduce genetic sequences into the vCD59 region of the Herpesvirus Saimiri genome, consisting of the following key genetic elements:

a) gene for puromycin resistance (pac);

b) gene of orange fluorescent protein (OFP);

c) flanking regions (600 bp) homologous to the vCD59 region of the HVS genome having the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2;

d) the gene for antibiotic resistance ampicillin (AmpR) and the bacterial promoter of the gene for resistance to ampicillin (AmpR promoter);

e) origin of replication of bacteriophage f1 (ori);

e) a cytomegalovirus (CMV) promoter;

as shown in Fig. 1.

2. A method for producing recombinant herpes viruses, characterized by the following parameters:

a cell culture that is permissive to lytic infection with the Herpesvirus Saimiri virus is infected with the Herpesvirus Saimiri HVS-C488 virus strain, and another inoculated cell line is transfected with a mixture of expression plasmids and a plasmid according to claim 1, which contains the target site intended for introduction into the genome of the Herpesvirus Saimiri HVS strain -C488, flanked by sequences of 300-900 base pairs in length, homologous to the region of the Herpesvirus Saimiri genome, into which the target region is introduced, and the other two expression plasmids encode the surface glycoproteins F and H of the measles virus vaccine strain, after which the permissive Herpesvirus Saimiri infected culture and the cell culture transfected with expression plasmids are mixed and subjected to co-cultivation, resulting in the formation of multinucleated syncytia from the cells of both cultures, which ensures the passage of recombination of homologous regions, the introduction of left gene in the genome of Herpesvirus Saimiri and the release of recombinant herpes viruses into the extracellular fluid.

3. The method according to claim 2, characterized in that cell culture OMC (owl monkey kidney cells, renal epithelium of nocturnal monkeys) is used as a cell culture permissive to lytic infection with Herpesvirus Saimiri.

4. A method according to claim 2, characterized in that the HEK-293 cell line or its derivatives is used as a continuous cell line, which is transfected with a mixture of expression plasmids and a plasmid according to claim 1.

5. The method according to claim 2, characterized in that the sequence of the viral gene vCD59 is used as a sequence of 300-900 base pairs in length homologous to the Herpesvirus Saimiri genome region.

6. The method according to claim 2, characterized in that the target region intended for introduction into the genome of the Herpesvirus Saimiri HVS-C488 virus strain includes sequences encoding a fluorescent protein and a chimeric antigen receptor.