RU2750940C1 - Method for determining level of expression of gene encoding ccl-2 in tissues of eye of rabbit oryctolagus cuniculus, and kit for its determination - Google Patents
Method for determining level of expression of gene encoding ccl-2 in tissues of eye of rabbit oryctolagus cuniculus, and kit for its determination Download PDFInfo
- Publication number
- RU2750940C1 RU2750940C1 RU2020126498A RU2020126498A RU2750940C1 RU 2750940 C1 RU2750940 C1 RU 2750940C1 RU 2020126498 A RU2020126498 A RU 2020126498A RU 2020126498 A RU2020126498 A RU 2020126498A RU 2750940 C1 RU2750940 C1 RU 2750940C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mcl
- ccl
- gene
- gapdh
- amplification
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно, иммунологии и молекулярной биологии, и касается способа определения уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 в тканях глаза кролика (Oryctolagus cuniculus), с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени и может быть использовано в экспериментальной офтальмологии для определения характера воспалительной реакции, а также на этапе доклинических исследований, в частности, при тестировании противовоспалительных препаратов.The invention relates to medicine, namely, immunology and molecular biology, and relates to a method for determining the level of expression of a gene encoding CCL-2 in the tissues of a rabbit eye (Oryctolagus cuniculus) using RT-PCR in real time and can be used in experimental ophthalmology to determine the nature of the inflammatory reaction, as well as at the stage of preclinical studies, in particular, when testing anti-inflammatory drugs.
CCL-2 (С-С motif ligand 2) или МСР-1 (Monocyte Chemoattractant Protein 1) - моноцитарный хемотаттрактантный протеин-1 относится к СС-хемокинам, является индуцибельным белком, оказывает мощное хемотаксическое и активирующее действие на моноциты/макрофаги, рекрутируя их в очаг воспаления. Помимо моноцитов и макрофагов, к продукции CCL-2 способны многие типы клеток, в том числе и оболочек глаза: периваскулярные макрофаги хориоидеи, ретинальный погментный эпителий, глиальные элементы сетчатки. Синтез МСР-1 индуцируют липополисахариды, интерлейкин -1β (IL-1β), фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерферон-γ (IFNγ) [Satish L. Deshmane, Sergey Kremlev, Shohreh Amini, Bassel E. Sawayal. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. // J. of interferon & cytokine research. - 2009. - Vol. 29. - №6. - P. 3313-326.]. Гиперпродукция МСР-1 приводит к поражению клеток провоспалительными цитокинами и свободными радикалами, что способствует апоптозу, некрозу, воспалению. Показано, что выраженность некровоспалительных изменений гистологически прямо коррелирует с уровнем экспрессии МСР-1.CCL-2 (C-C motif ligand 2) or MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein 1) - monocyte chemotattractant protein-1 belongs to CC-chemokines, is an inducible protein, has a powerful chemotactic and activating effect on monocytes / macrophages, recruiting them into the focus of inflammation. In addition to monocytes and macrophages, many types of cells, including the membranes of the eye, are capable of producing CCL-2: perivascular macrophages of the choroid, retinal epithelium, glial elements of the retina. The synthesis of MCP-1 is induced by lipopolysaccharides, interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFNγ) [Satish L. Deshmane, Sergey Kremlev, Shohreh Amini, Bassel E. Sawayal. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. // J. of interferon & cytokine research. - 2009. - Vol. 29. - No. 6. - P. 3313-326.]. Overproduction of MCP-1 leads to cell damage by proinflammatory cytokines and free radicals, which promotes apoptosis, necrosis, and inflammation. It was shown that the severity of necroinflammatory changes is histologically directly correlated with the level of MCP-1 expression.
Метод ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) один из самых востребованных методов молекулярной биологии, позволивший не только исследовать геном РНК- содержащих микроорганизмов, изучить их роль в развитии инфекционных болезней, но и определять уровень экспрессии генов экспериментальных животных и человека, что обеспечило возможность молекулярной оценки состояния органов и тканей. [Reverse-transcription PCR (RT-PCR) - Bachman J. - Methods Enzymol. 2013;530:67-74. doi: 10.1016/В978-0-12-420037-1.00002-6]. В настоящее время исследования уровней транскрипции индуцибельных генов, кодирующих цитокины, факторы роста, хемоаттрактантные белки, гормоны применяется в различных областях медицины, ветеринарии и молекулярной биологии и является перспективным направлением ПЦР-диагностики.The reverse transcription PCR (RT-PCR) method is one of the most popular methods of molecular biology, which made it possible not only to study the genome of RNA-containing microorganisms, to study their role in the development of infectious diseases, but also to determine the level of gene expression in experimental animals and humans, which made it possible molecular assessment of the state of organs and tissues. [Reverse-transcription PCR (RT-PCR) - Bachman J. - Methods Enzymol. 2013; 530: 67-74. doi: 10.1016 / B978-0-12-420037-1.00002-6]. Currently, studies of the levels of transcription of inducible genes encoding cytokines, growth factors, chemoattractant proteins, hormones are used in various fields of medicine, veterinary medicine and molecular biology and is a promising area of PCR diagnostics.
ДНК большинства организмов наряду с экзонами - участками, кодирующими аминокислотную последовательность белков, содержит интроны, которые не несут информации о строении белков и удаляются в процессе сплайсинга из зрелой матричной РНК (мРНК) после транскрипции. Использование мРНК как матрицы в реакции ОТ-ПЦР и синтез праймеров к ее участкам, кодирующим определенный белок, лежит в основе метода экспрессии гена и позволяет оценить цитокиновый статус исследуемой ткани.The DNA of most organisms, along with exons - regions encoding the amino acid sequence of proteins, contains introns that do not carry information about the structure of proteins and are removed during splicing from mature messenger RNA (mRNA) after transcription. The use of mRNA as a template in the RT-PCR reaction and the synthesis of primers for its regions encoding a certain protein underlies the method of gene expression and makes it possible to assess the cytokine status of the tissue under study.
Постановка ОТ-ПЦР включает несколько основных этапов: выделение молекул мРНК из биоматериала, обработку ДНКазой проб с мРНК, синтез молекул кДНК при помощи обратной транскриптазы, определение уровня экспрессии исследуемого гена методом ПЦР, проверку специфичности ПЦР-продукта с помощью электрофореза и анализ полученных результатов.The RT-PCR procedure includes several main stages: isolation of mRNA molecules from biomaterial, DNAse treatment of samples with mRNA, synthesis of cDNA molecules using reverse transcriptase, determination of the expression level of the gene under study by PCR, verification of the specificity of the PCR product using electrophoresis, and analysis of the results obtained.
Количество кДНК в анализируемой пробе зависит от наличия веществ, ингибирующих обратную транскрипцию, скорости разрушения мРНК и др. Для учета всех факторов и их влияния на ход реакции требуется параллельное измерение уровня экспрессии конститутивных генов или генов домашнего хозяйства (housekeeping gene), обычно используемых для нормализации, из которых наиболее стабильной экспрессией обладают гены гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT), глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), b- актина [Foss D.L., Baarsch Μ. J., Murtaugh M.P. Regulation of hypoxanthine phosphoribosyl transferase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and beta-actin mRNA expression in porcine immune cells and tissues. // Anim Biotechnol. - 1998. - N1. - P. 67-78.], а так же субъединицы А сукцинатдегидрогеназы [Nachar W., Busseuil D., Shi Y., Mihalache-Avram Т., Mecteau M., Rheaume E., Tardif J.C. Optimisation of reference genes for gene-expression analysis in a rabbit model of left ventricular diastolic dysfunction. PLoS One. 2014 Feb 18; 9(2)].The amount of cDNA in the analyzed sample depends on the presence of substances that inhibit reverse transcription, the rate of destruction of mRNA, etc. To take into account all factors and their influence on the course of the reaction, a parallel measurement of the expression level of constitutive genes or housekeeping genes, usually used for normalization, is required. , of which the genes hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT), glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), b-actin [Foss DL, Baarsch Μ. J., Murtaugh M.P. Regulation of hypoxanthine phosphoribosyl transferase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and beta-actin mRNA expression in porcine immune cells and tissues. // Anim Biotechnol. - 1998. - N1. - P. 67-78.], As well as the subunit A of succinate dehydrogenase [Nachar W., Busseuil D., Shi Y., Mihalache-Avram T., Mecteau M., Rheaume E., Tardif J.C. Optimization of reference genes for gene-expression analysis in a rabbit model of left ventricular diastolic dysfunction. PLoS One. 2014 Feb 18; 9 (2)].
Способ оценки уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 в тканях аорты кроликов описан в работе Optimized RT-PCR method for assaying expression of monocyte chemotactic protein type 1 (MCP -1) in rabbit aorta [Sekalska B, Ciechanowicz A, Dolegowska B, Naruszewicz M. Biochem Genet. 2006 Apr;44(3-4): 133-43. Epub 2006 Jun 20]. Авторы исследования изучают роль CCL-2 в рекрутинге клеток иммунной системы в сосудистую стенку с последующим формированием атеросклеротической бляшки. В этой работе для оценки результатов ПНР используется метод электрофореза в 3% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием - более старый, трудоемкий и менее информативный способ, чем ПЦР в реальном времени. На одну реакцию авторы предлагают тратить 10 мкл кДНК, что является нерациональным в случае работы с малыми объемами биоматериала, получаемого от мелких лабораторных животных.A method for assessing the level of expression of the gene encoding CCL-2 in the tissues of the aorta of rabbits is described in the Optimized RT-PCR method for assaying expression of monocyte chemotactic protein type 1 (MCP -1) in rabbit aorta [Sekalska B, Ciechanowicz A, Dolegowska B, Naruszewicz M. Biochem Genet. 2006 Apr; 44 (3-4): 133-43. Epub 2006 Jun 20]. The authors of the study are investigating the role of CCL-2 in recruiting cells of the immune system into the vascular wall, followed by the formation of atherosclerotic plaque. In this work, to evaluate the results of PCR, the method of electrophoresis in 3% agarose gel stained with ethidium bromide is used - an older, laborious and less informative method than real-time PCR. For one reaction, the authors propose to spend 10 μl of cDNA, which is irrational in the case of working with small volumes of biomaterial obtained from small laboratory animals.
Известен способ определения уровня экспрессии CCL-2 в культуре клеток роговицы кроликаA known method for determining the level of expression of CCL-2 in a cell culture of the cornea of a rabbit
[Quiescent keratocytes fail to repair MMC induced DNA damage leading to the long-terminhibition of myofibroblast differentiation and wound healing.Jester JV, Nien CJ, Vasiliou V, Brown DJ. Mol Vis. 2012;18:1828-39. Epub 2012 Jul 4.], в котором для постановки ОТ-ПЦР используется коммерческая тест система - QuantiTect Syber Green reagents (Qiagen), упрощающая проведение реакции, но увеличивающая ее стоимость. Авторами представлены нуклеотидные последовательности праймеров исследуемого и нескольких референсных генов, что подразумевает постановку мультиплексной ПЦР, требующей синтеза гибридизационных зондов, меченных флуорохромом и расчета «нормировочного коэффициента». Выяснение уровня экспрессии всех нормировочных генов требует многократной постановки ОТ-ПЦР, большого количества реагентов, а главное больших объемов биоматериала, что не всегда рационально, а иногда и невозможно, особенно, когда проведение исследования планируется в малом объеме биологического материала.[Quiescent keratocytes fail to repair MMC induced DNA damage leading to the long-terminhibition of myofibroblast differentiation and wound healing. Jester JV, Nien CJ, Vasiliou V, Brown DJ. Mol Vis. 2012; 18: 1828-39. Epub 2012 Jul 4.], which uses a commercial test system for RT-PCR - QuantiTect Syber Green reagents (Qiagen), which simplifies the reaction, but increases its cost. The authors present the nucleotide sequences of the primers of the investigated and several reference genes, which implies the setting of multiplex PCR, which requires the synthesis of hybridization probes labeled with fluorochrome and the calculation of the "normalization factor". Elucidation of the level of expression of all normalizing genes requires multiple RT-PCR, a large number of reagents, and most importantly large volumes of biomaterial, which is not always rational, and sometimes impossible, especially when the study is planned in a small amount of biological material.
Известен способ оценки уровня экспрессии CCL-2 на модели переднего увеита у крыс [Expression of СС chemokines and their receptors in the eye in autoimmune anterior uveitisassociated with EAE. Adamus G, Manczak M, Machnicki M. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Nov; 42(12):2894-903]. Авторами представлен полный протокол исследования, нуклеотидные последовательности исследуемого и референсного генов, подробно описаны этапы ступенчатой ПЦР, однако метод детекции - электрофорез в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, более трудоемкий и менее точный, чем ПЦР в реальном времени. Использование крыс для моделирования опыта в офтальмологии широко распространено, однако ввиду малого размера глазного яблока, в сравнении, например, с кроликом, едва ли позволяет точно дифференцировать разные ткани и отрезки глаза необходимые для анализа. Известно, что глаза кроликов - одна из лучших моделей для офтальмологических опытов, так как они, помимо достаточно крупных размеров, меньше смачиваются секретом слезной железы, что позволяет лучше визуализировать эффект опыта [Statistics of Scientific Procedures on Living Animals Great - Britain, 2004].A known method for assessing the level of expression of CCL-2 on the model of anterior uveitis in rats [Expression of CC chemokines and their receptors in the eye in autoimmune anterior uveitisassociated with EAE. Adamus G, Manczak M, Machnicki M. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Nov; 42 (12): 2894-903]. The authors presented the complete protocol of the study, the nucleotide sequences of the studied and reference genes, the stages of stepwise PCR are described in detail, however, the detection method - electrophoresis in 2% agarose gel stained with ethidium bromide, is more laborious and less accurate than real-time PCR. The use of rats to simulate an experiment in ophthalmology is widespread, however, due to the small size of the eyeball, in comparison, for example, with a rabbit, it hardly makes it possible to accurately differentiate different tissues and segments of the eye required for analysis. It is known that the eyes of rabbits are one of the best models for ophthalmological experiments, since, in addition to being large enough, they are less wetted by the secretion of the lacrimal gland, which makes it possible to better visualize the effect of the experiment [Statistics of Scientific Procedures on Living Animals Great - Britain, 2004].
Задачей настоящего изобретения является разработка простого, доступного, легко воспроизводимого и экономичного способа оценки экспрессии гена CCL-2 в малом объеме биологического материала кроликов.The object of the present invention is to provide a simple, accessible, easily reproducible and economical method for assessing the expression of the CCL-2 gene in a small volume of biological material from rabbits.
Техническим результатом является получение протокола пробоподготовки, постановки и расчетов результатов ОТ-ПЦР с оптимально подобранным для этого комплектом реагентов, позволяющих с высокой точностью воспроизвести реакцию в условиях ПЦР-лабораторий, для дальнейшего использования в экспериментальной офтальмологии, в доклинических исследованиях медицинских изделий и, в частности, при испытании противовоспалительных лекарственных средств. Технический результат достигается за счет:The technical result is to obtain a protocol for sample preparation, formulation and calculation of RT-PCR results with an optimally selected set of reagents that allow high accuracy to reproduce the reaction under the conditions of PCR laboratories, for further use in experimental ophthalmology, in preclinical studies of medical devices and, in particular when testing anti-inflammatory drugs. The technical result is achieved due to:
1) Подбора оригинальных пар праймеров для CCL-2 и GAPDH, обеспечивающих специфическую амплификацию без образования побочных структур.1) Selection of original primer pairs for CCL-2 and GAPDH, providing specific amplification without the formation of side structures.
2) Определения компонентов реакционной смеси - концентраций пары прямого и обратного праймеров, установки оптимальных температур элонгации, денатурации и отжига (методом градиента) и количества циклов амплификации.2) Determination of the components of the reaction mixture - the concentrations of a pair of forward and reverse primers, setting the optimal temperatures for elongation, denaturation and annealing (using the gradient method) and the number of amplification cycles.
3) Использования одного нормировочного гена GAPDH, как наиболее универсального, стабильно экспрессируемого практически всеми клетками организма.3) The use of one normalizing gene GAPDH, as the most universal, stably expressed by almost all cells of the body.
4) Подбора наиболее доступных и экономичных реагентов, их минимального количества без потери эффективности реакции.4) Selection of the most accessible and economical reagents, their minimum quantity without loss of reaction efficiency.
5) Снижения временных затрат для каждого этапа постановки.5) Reduced time spent for each stage of the production.
При выборе пар праймеров в электронной базе данных NCBI Gen Bank с использованием программного обеспечения: Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator и Standard Nucleotide BLAST отбирались наиболее перспективные последовательности олигонуклеотидов для исследуемых генов. Выбранные последовательности праймеров синтезировались на автоматическом синтезаторе ДНК («Евроген»). В результате были получены 2 пары олигонуклеотидов для измерения экспрессии GAPDH и 2 пары олигонуклеотидов для измерения экспрессии CCL-2.When selecting pairs of primers in the NCBI Gen Bank electronic database using the software: Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator, and Standard Nucleotide BLAST, the most promising oligonucleotide sequences for the genes under study were selected. Selected primer sequences were synthesized on an automatic DNA synthesizer (Evrogen). As a result, 2 pairs of oligonucleotides were obtained for measuring the expression of GAPDH and 2 pairs of oligonucleotides for measuring the expression of CCL-2.
Заданные параметры конструкции (последовательность и молекулярная масса) праймеров требуют индивидуального подбора количества вспомогательных компонентов реакции, а также определения параметров постановки амплификации на всех этапах реакции (элонгация, отжиг и т.д.).The specified design parameters (sequence and molecular weight) of primers require an individual selection of the number of auxiliary reaction components, as well as determination of the parameters for setting amplification at all stages of the reaction (elongation, annealing, etc.).
Для определения оптимальных условий проведения реакции осуществлялся ряд постановок с разной компоновкой реагентов по концентрации и объему, позволившим в итоге опытным путем выбрать наиболее удачный и эффективный вариант. Температура отжига олигонуклеотидных праймеров и продолжительность этапов реакции определялись в режиме выполнения температурного градиента, где ряд пробирок с одинаковым содержимым подвергался одновременной амплификации, но с индивидуальной температурой отжига для каждой пробы, отличающихся между собой на 0,5°С.To determine the optimal conditions for the reaction, a number of settings were carried out with different configurations of reagents in terms of concentration and volume, which eventually made it possible to experimentally choose the most successful and effective option. The annealing temperature of oligonucleotide primers and the duration of the reaction stages were determined in the mode of performing a temperature gradient, where a number of tubes with the same contents were subjected to simultaneous amplification, but with an individual annealing temperature for each sample, differing from each other by 0.5 ° C.
Для проведения ОТ-ПЦР использовался термоциклер с оптическим блоком для детекции флуоресценции в режиме реального времени (амплификатор) CFX96 Touch (Bio-Rad). Реакция проводилась в течение 2 часов, одновременно фиксировался флуоресцентный сигнал, полученные данные, обработанные в программе Bio-Rad CFX Manager, в дальнейшем представлялись в таблицах и графиках.For RT-PCR, a CFX96 Touch (Bio-Rad) thermal cycler with an optical unit for real-time fluorescence detection (amplifier) was used. The reaction was carried out for 2 hours, at the same time the fluorescent signal was recorded, the data obtained, processed in the Bio-Rad CFX Manager program, were subsequently presented in tables and graphs.
Эффективность реакции амплификации определялась построением калибровочной кривой.The efficiency of the amplification reaction was determined by constructing a calibration curve.
Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is carried out as follows.
С помощью программного обеспечения Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator и Standard Nucleotide BLAST подобраны 2 пары праймеров для измерения экспрессии GAPDH и одна пара олигонуклеотидов для измерения экспрессии CCL-2. Ткани кролика О. cuniculus гомогенизируют в течение 90 секунд при скорости 45000 об./мин., с последующим выделением мРНК из образцов. В пробы с полученной мРНК добавляют 1 мкл ингибитора РНКаз, а затем синтезируют кДНК методом обратной транскрипции.Using the software Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator and Standard Nucleotide BLAST, 2 pairs of primers were selected for measuring GAPDH expression and one pair of oligonucleotides for measuring CCL-2 expression. Rabbit tissues of O. cuniculus are homogenized for 90 seconds at 45,000 rpm, followed by isolation of mRNA from the samples. 1 μl of an RNase inhibitor is added to the samples from the obtained mRNA, and then cDNA is synthesized by the method of reverse transcription.
Для амплификации исследуемого и референсного генов при помощи ПЦР в режиме реального времени используют следующие пары праймеров:For amplification of the studied and reference genes using PCR in real time, the following pairs of primers are used:
GAPDHF-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3'GAPDHF-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3 '
GAPDH_R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'GAPDH_R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3 '
CCL2_1F-5'-ATGAAGGTCTCTGCAACGCT-3'CCL2_1F-5'-ATGAAGGTCTCTGCAACGCT-3 '
CCL2_1R-5'-CCCTTGGCCAGTTTGGTCAT-3'CCL2_1R-5'-CCCTTGGCCAGTTTGGTCAT-3 '
Реакционная смесь для амплификации гена CCL- 2 содержит:The reaction mixture for amplification of the CCL-2 gene contains:
- вода дистиллированная 9,4 мкл- distilled water 9.4 μl
- буфер 1,5 мкл (Евроген)- buffer 1.5 μl (Evrogen)
- прямой праймер CCL-2_F (концентрация 1 мкМ; Mw 60,98 г/моль) 1 мкл- forward primer CCL-2_F (concentration 1 μM; Mw 60.98 g / mol) 1 μl
- обратный праймер CCL-2_R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,56 г/моль) 1 мкл- reverse primer CCL-2_R (concentration 1 μM; Mw 60.56 g / mol) 1 μl
- dNTP 0,5 мкл- dNTP 0.5 μl
- кДНК 1 мкл- cDNA 1 μl
- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл- SYBR Green I [1: 25000] 0.3 μl
- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)- Taq-polymerase (0.5 unit / μl) 0.3 μl (Biosan)
Реакционная смесь для амплификации гена GAPDH содержит:The reaction mixture for amplification of the GAPDH gene contains:
- вода дистиллированная 9,4 мкл- distilled water 9.4 μl
- буфер 1,5 мкл (Евроген)- buffer 1.5 μl (Evrogen)
- прямой праймер GAPDH F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл- forward primer GAPDH F (concentration 1 μM; Mw 63.86 g / mol) 1 μl
- обратный праймер GAPDH R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл- reverse primer GAPDH R (concentration 1 μM; Mw 60.83 g / mol) 1 μl
- dNTP 0,5 мкл- dNTP 0.5 μl
- кДНК 1 мкл- cDNA 1 μl
- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл- SYBR Green I [1: 25000] 0.3 μl
- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)- Taq-polymerase (0.5 unit / μl) 0.3 μl (Biosan)
Протокол реакции амплификации генов CCL-2 и GAPDH, включает:The reaction protocol for the amplification of the CCL-2 and GAPDH genes includes:
- первичная денатурация- 3 минуты 95°С- primary denaturation - 3 minutes 95 ° С
- амплификационный цикл (х45)- amplification cycle (x45)
- денатурация - 15 секунд 95°С- denaturation - 15 seconds 95 ° С
- отжиг праймеров - 20 секунд 56,2°С- annealing of primers - 20 seconds 56.2 ° С
- элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 секунд 72°С- elongation and removal of a fluorescent signal - 30 seconds 72 ° С
Эффективность реакции ОТ-ПЦР определяется уравнением калибровочной кривой, построенной при амплификации образца с известной концентрацией ДНК пятикратно разведенного в 4 раза. Значение эффективности используется в формуле расчета нормированной экспрессии исследуемого гена.The efficiency of the RT-PCR reaction is determined by the equation of the calibration curve constructed by amplifying a sample with a known concentration of DNA, five times diluted 4 times. The efficiency value is used in the formula for calculating the normalized expression of the gene under study.
Пример.Example.
Материал исследования - 16 образцов тканевого комплекса сетчатка -хориоидея кроликов, 12 из которых были получены при моделировании атрофии ретинального пигментного эпителия. Образцы забираются в чистые эппендорфы и замораживаются в камере глубокой заморозки при температуре -70°С.Research material - 16 samples of the tissue complex of the retina-choroid of rabbits, 12 of which were obtained by modeling the atrophy of the retinal pigment epithelium. Samples are collected in clean Eppendorfs and frozen in a deep-freeze chamber at -70 ° C.
Для получения мРНК замороженная ткань глаза предварительно доводится до однородного дисперсного состояния на гомогенизаторе (например, Silent Crusher S (Heidolph) в течение 90 секунд при скорости 45000 об./мин. мРНК из образцов ткани выделяется по протоколу (Part 1) коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Затем к образцам добавляется 1 мкл ингибитора РНКаз RNase Inhibitor (Qiagen) и обрабатывается ДНКазой DNase Max Kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя.To obtain mRNA, frozen eye tissue is preliminarily brought to a homogeneous dispersed state on a homogenizer (for example, Silent Crusher S (Heidolph) for 90 seconds at a speed of 45000 rpm. MRNA is isolated from tissue samples according to the protocol (Part 1) of the commercial RNeasy Mini kit Kit (Qiagen) Then 1 µl of RNase Inhibitor (Qiagen) is added to the samples and treated with DNase Max Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions.
Контроль количества полученной мРНК осуществлялся при помощи спектрофотометра длине волны 260 нм; в нашем случае - мультирежимный имиджер марки Cytation 5 imaging reader (Biotek). Набор iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) используется для следующего этапа - синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции. Для этого в эппендорф вносятся и смешиваются: 9 мкл воды свободной от нуклеаз (Nuclease-free water); 4 мкл 5х iScript Reaction Mix; 1 мкл iScript Reverse Transcriptase; 5 мкл мРНК; 1 мкл RNase Inhibitor (Qiagen).The amount of obtained mRNA was monitored using a spectrophotometer at a wavelength of 260 nm; in our case, a Cytation 5 imaging reader (Biotek). The iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) is used for the next step - cDNA synthesis in reverse transcription reaction. For this purpose, the following are introduced into the Eppendorf and mixed: 9 μl of Nuclease-free water; 4 μl 5x iScript Reaction Mix; 1 μl iScript Reverse Transcriptase; 5 μl mRNA; 1 μl RNase Inhibitor (Qiagen).
Общий объем смеси (20 мкл) обрабатывается по протоколу производителя набора iScript cDNA Synthesis Kit на амплификаторе, в нашем случае используется CFX96 Touch (Bio-Rad).The total volume of the mixture (20 μL) is processed according to the protocol of the manufacturer of the iScript cDNA Synthesis Kit on an amplifier, in our case, CFX96 Touch (Bio-Rad) is used.
Амплификация кДНК гена CCL-2 проводится так же с помощью термоциклера. Флуоресценция регистрируется за счет добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя SYBR Green I (Евроген).Amplification of cDNA of the CCL-2 gene is also carried out using a thermal cycler. Fluorescence is recorded by adding an intercalating dye SYBR Green I (Eurogen) to the reaction mixture.
Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл содержит:The reaction mixture for PCR in a volume of 15 μl contains:
- вода дистиллированная 9,4 мкл- distilled water 9.4 μl
- буфер 1,5 мкл (Евроген)- buffer 1.5 μl (Evrogen)
- прямой праймер CCL-2F (концентрация 1 мкМ; Mw 60,98 г/моль) 1 мкл- forward primer CCL-2F (concentration 1 μM; Mw 60.98 g / mol) 1 μl
- обратный праймер CCL-2_R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,56 г/моль) 1 мкл- reverse primer CCL-2_R (concentration 1 μM; Mw 60.56 g / mol) 1 μl
- dNTP 0,5 мкл- dNTP 0.5 μl
- кДНК 1 мкл- cDNA 1 μl
- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл- SYBR Green I [1: 25000] 0.3 μl
- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)- Taq-polymerase (0.5 unit / μl) 0.3 μl (Biosan)
Для амплификации используются праймеры CCL-2For amplification, primers are used CCL-2
F - 5'-ATGAAGGTCTCTGCAACGCT-3'F - 5'-ATGAAGGTCTCTGCAACGCT-3 '
R - 5'-CCCTTGGCCAGTTTGGTCAT-3'R - 5'-CCCTTGGCCAGTTTGGTCAT-3 '
Амплификация кДНК гена GAPDH проводится в объеме 15 мкл, реакционная смесь содержит:Amplification of cDNA of the GAPDH gene is carried out in a volume of 15 μl, the reaction mixture contains:
- вода дистиллированная 9,4 мкл- distilled water 9.4 μl
- буфер 1,5 мкл (Евроген)- buffer 1.5 μl (Evrogen)
- прямой праймер GAPDH_1F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл- forward primer GAPDH_1F (concentration 1 μM; Mw 63.86 g / mol) 1 μl
- обратный праймер GAPDH1R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл- reverse primer GAPDH1R (concentration 1 μM; Mw 60.83 g / mol) 1 μl
- dNTP 0,5 мкл- dNTP 0.5 μl
- кДНК 1 мкл- cDNA 1 μl
- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл- SYBR Green I [1: 25000] 0.3 μl
- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)- Taq-polymerase (0.5 unit / μl) 0.3 μl (Biosan)
Для амплификации используются олигонуклеотиды GAPDHGAPDH oligonucleotides are used for amplification
F-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3'F-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3 '
R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3 '
Протокол реакции:Reaction protocol:
- первичная денатурация- 3 минуты 95°С- primary denaturation - 3 minutes 95 ° С
- амплификационный цикл (х45)- amplification cycle (x45)
- денатурация - 15 секунд 95°С- denaturation - 15 seconds 95 ° С
- отжиг праймеров - 20 секунд 56,2°С- annealing of primers - 20 seconds 56.2 ° С
- элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 секунд 72°С- elongation and removal of a fluorescent signal - 30 seconds 72 ° С
Дополнительный контроль амплификации осуществляют методом электрофореза в 2% агарозном геле, куда вносят 10 мкл ампликонов смешанных с 6-кратным буфером для загрузки.Additional control of the amplification is carried out by electrophoresis in a 2% agarose gel, where 10 μl of amplicons are added mixed with 6-fold buffer for loading.
Анализ результатов ОТ-ПЦР.Analysis of RT-PCR results.
Для каждой из тест-проб при помощи программы Bio-Rad CFX Manager определяется пороговый цикл (Q), при котором количество кДНК во всех реакционных пробирках достигало одинаковой пороговой величины (задавалась программным обеспечением). Воспроизводимость реакции амплификации исследуемого и референсного гена оценивалась постановкой каждой пробы в тройном повторе, где разница между пороговыми циклами составляет не более 0,5 цикла.For each of the test samples, using the Bio-Rad CFX Manager software, a threshold cycle (Q) is determined at which the amount of cDNA in all reaction tubes reaches the same threshold value (set by the software). The reproducibility of the amplification reaction of the studied and reference gene was assessed by setting each sample in a triple repetition, where the difference between the threshold cycles is no more than 0.5 cycles.
Для определения реакционной эффективности праймеров репрезентативный образец пятикратно последовательно разводился в 4 раза, с последующим измерением количества кДНК при каждом разведении на спектрофотометре (например, Cytation 5 imaging reader (Biotek) (фиг. 1 Концентрация кДНК (нг/мкл) в репрезентативной пробе пятикратно последовательно разведенной в 4 раза) при длине волны 260 нм. Эффективность амплификации образцов, отраженная в калибровочной кривой, рассчитывалась в программе Bio-Rad CFX Manager согласно формулам:To determine the reactivity of the primers, a representative sample was serially diluted fourfold fivefold, followed by measuring the amount of cDNA at each dilution on a spectrophotometer (for example, Cytation 5 imaging reader (Biotek) (Fig. 1 cDNA concentration (ng / μl) in a representative sample fivefold sequentially diluted 4 times) at a wavelength of 260 nm The amplification efficiency of the samples, reflected in the calibration curve, was calculated in the Bio-Rad CFX Manager software according to the formulas:
Уравнение калибровочной кривой представляет логарифмическую зависимость значения показателя порогового цикла (Q) пяти образцов разведения репрезентативной пробы от количества кДНК в каждом образце. На фиг. 2 приведены график калибровочной кривой, который показывает зависимость значений Ct; полученных при амплификации пяти стандартных образцов, и значений lg (Х0) этих образцов (А) и график изменения интенсивности свечения репрезентативной пробы при амплификации гена CCL-2 для 5 образцов с последовательно уменьшающейся в 4 раза концентрацией кДНК (Б).The equation of the calibration curve represents the logarithmic dependence of the value of the threshold cycle index (Q) of five dilutions of a representative sample from the amount of cDNA in each sample. FIG. 2 is a graph of the calibration curve, which shows the dependence of the values of C t; obtained during amplification of five standard samples, and lg (X 0 ) values of these samples (A) and a graph of the change in the luminescence intensity of a representative sample during amplification of the CCL-2 gene for 5 samples with a sequentially decreasing 4-fold cDNA concentration (B).
Анализ результатов исследования выполнен методом расчета относительной величины (АС) исследуемого образца (CCL-2) по формуле:The analysis of the research results was carried out by the method of calculating the relative value (AC) of the test sample (CCL-2) according to the formula:
Где:Where:
Е - эффективность набора праймеров и зондов. Q (контроля) - среднее значение Ct для нормировочного гена (GAPDH) Q (образца) - среднее значение Q исследуемого образца (CCL-2) Нормированная экспрессия (ААС) - относительная величина экспрессии исследуемого гена нормированная к величине экспрессии референсного гена в образце биоматериала, вычислялась по формуле:E is the efficiency of a set of primers and probes. Q (control) - the average value of C t for the normalizing gene (GAPDH) Q (sample) - the average value of the Q of the test sample (CCL-2) Normalized expression (AAS) - the relative value of the expression of the gene under study normalized to the value of the expression of the reference gene in the biomaterial sample , was calculated by the formula:
Полученное в ходе расчетов значение ААС использовано для оценки экспрессии гена CCL-2.The AAS value obtained in the course of calculations was used to assess the expression of the CCL-2 gene.
Таким образом, предложенный способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 кролика Oryctolagus cuniculus методом ПЦР в режиме реального времени и набор для определения позволяют при помощи доступных и экономичных реагентов, используя один референсный ген, сделать вывод о характере экспрессируемого профиля CCL-2 в исследуемой ткани.Thus, the proposed method for determining the level of expression of the gene encoding the CCL-2 of the rabbit Oryctolagus cuniculus by real-time PCR and the kit for determination make it possible, using available and economical reagents, using one reference gene, to draw a conclusion about the nature of the expressed CCL-2 profile in investigated tissue.
Claims (43)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020126498A RU2750940C1 (en) | 2020-08-07 | 2020-08-07 | Method for determining level of expression of gene encoding ccl-2 in tissues of eye of rabbit oryctolagus cuniculus, and kit for its determination |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020126498A RU2750940C1 (en) | 2020-08-07 | 2020-08-07 | Method for determining level of expression of gene encoding ccl-2 in tissues of eye of rabbit oryctolagus cuniculus, and kit for its determination |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2750940C1 true RU2750940C1 (en) | 2021-07-06 |
Family
ID=76755942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020126498A RU2750940C1 (en) | 2020-08-07 | 2020-08-07 | Method for determining level of expression of gene encoding ccl-2 in tissues of eye of rabbit oryctolagus cuniculus, and kit for its determination |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2750940C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2522801C2 (en) * | 2012-09-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it |
-
2020
- 2020-08-07 RU RU2020126498A patent/RU2750940C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2522801C2 (en) * | 2012-09-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Method for detecting transcription level of gene coding human chemokine ccl2 (mcp-1) and kit for implementing it |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ADAMUS G, et al., Expression of СС chemokines and their receptors in the eye in autoimmune anterior uveitisassociated with EAE., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Nov; 42 (12): 2894-903. * |
| ADAMUS G, et al., Expression of СС chemokines and their receptors in the eye in autoimmune anterior uveitisassociated with EAE., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Nov; 42 (12): 2894-903. JESTER JV, Quiescent keratocytes fail to repair MMC induced DNA damage leading to the long-terminhibition of myofibroblast differentiation and wound healing., Mol Vis. 2012; 18: 1828-39. Epub 2012 Jul 4. * |
| JESTER JV, Quiescent keratocytes fail to repair MMC induced DNA damage leading to the long-terminhibition of myofibroblast differentiation and wound healing., Mol Vis. 2012; 18: 1828-39. Epub 2012 Jul 4. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3692173B1 (en) | Assessment of jak-stat1/2 cellular signaling pathway activity using mathematical modelling of target gene expression | |
| CN107338324A (en) | For the serum lncRNA marks of acatalepsia reason recurrent miscarriage, primer sets and application and kit | |
| CN102358900A (en) | Plasma micro-ribonucleic acid (miRNA) marker related with human Hirschsprung's disease and application of miRNA marker | |
| CN111763723B (en) | Nondestructive sex identification method for Chinese sturgeons | |
| RU2750940C1 (en) | Method for determining level of expression of gene encoding ccl-2 in tissues of eye of rabbit oryctolagus cuniculus, and kit for its determination | |
| Hao et al. | Power estimation of multiple SNP association test of case‐control study and application | |
| CN111424085B (en) | Application of tRNA source fragment in preparation of breast cancer diagnostic reagent | |
| CN104962654A (en) | Application of lncRNA-MALAT1 in preparing proliferative vitroretinopathy (PVR) diagnosis reagent | |
| RU2731062C1 (en) | METHOD FOR DETERMINING EXPRESSION LEVEL OF GENE CODING 1L-1β IN RABBIT EYE TISSUES (ORYCTOLAGUS CUNICULUS), AND KIT FOR IMPLEMENTATION THEREOF | |
| RU2745323C1 (en) | Method for determining the level of expression of the gene encoding il-18 in the tissues of the eye of the oryctolagus cuniculus rabbit, and determination kit | |
| US20140378334A1 (en) | Method for quantifying renal markers by assaying urine | |
| Hundley et al. | Skeletal muscle heavy-chain polypeptide 3 and myosin binding protein H in the pubococcygeus muscle in patients with and without pelvic organ prolapse | |
| CN108300788A (en) | A kind of micro RNA combination and its application for detecting light-duty brain trauma | |
| RU2761339C1 (en) | Method for determining the expression level of the gene encoding vegf-a in the eye tissues of the oryctolagus cuniculus rabbit, and a kit for its determination | |
| RU2765437C1 (en) | Method for determining gene expression level, coding pedf, in oryctolagus cuniculus rabbit eye tissues and a kit for its determining | |
| CN116377058A (en) | Keratoconus detection panel and application thereof | |
| CN115772524A (en) | Marker combination and application thereof in preparation of reagent for diagnosing thyroid cancer | |
| RU2766186C1 (en) | Method for determining level of expression of gene coding zo-1 in eye tissues of rabbit oryctolagus cuniculus and kit for determining thereof | |
| JPWO2011065533A1 (en) | How to determine sensitivity to breast cancer preoperative chemotherapy | |
| EP3822368A1 (en) | Assessment of pr cellular signaling pathway activity using mathematical modelling of target gene expression | |
| WO2021185660A1 (en) | Prognostic pathways for high risk sepsis patients | |
| CN111172285A (en) | miRNA group for early diagnosis and/or prognosis monitoring of pancreatic cancer and application thereof | |
| RU2521655C1 (en) | Method of assessment of gene expression of tryptophanyl - total rna synthetase as marker of overwork during training of athletes - state of overtraining | |
| US20230098637A1 (en) | Prognostic pathways for high risk sepsis patients | |
| RU2818352C1 (en) | Method for evaluating resistance of malignant neoplasms to radiation therapy and set of tests for implementation thereof |