RU2750933C1 - Method for testing the biological activity of aerosol preparations - Google Patents
Method for testing the biological activity of aerosol preparations Download PDFInfo
- Publication number
- RU2750933C1 RU2750933C1 RU2020119330A RU2020119330A RU2750933C1 RU 2750933 C1 RU2750933 C1 RU 2750933C1 RU 2020119330 A RU2020119330 A RU 2020119330A RU 2020119330 A RU2020119330 A RU 2020119330A RU 2750933 C1 RU2750933 C1 RU 2750933C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aerosol
- aprotinin
- condensate
- activity
- active substances
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/12—Aerosols; Foams
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к медицине. Изобретение раскрывает способ, который позволяет исследовать аэрозольные препараты активных веществ медицинского применения, после их аэрозольного распыления с помощью систем с принудительной выталкивающей силой в устройствах пропеллентного, механического, ультразвукового мембранного типов. Разработанный способ основан на конденсации жидкой водосодержащей фазы генерируемого аэрозольного облака в открытой емкости с последующим испытанием биологической активности фармацевтических и других активных веществ, находящихся в исходном аэрозольном составе в устройстве для генерации аэрозоля.The present invention relates to medicine. The invention discloses a method that allows you to study aerosol preparations of active substances for medical use, after their aerosol spraying using systems with forced buoyancy force in devices of propellant, mechanical, ultrasonic membrane types. The developed method is based on the condensation of the liquid water-containing phase of the generated aerosol cloud in an open container, followed by testing the biological activity of pharmaceutical and other active substances in the initial aerosol composition in the device for generating aerosol.
Известны аэрозольные системы, в которых движущей выталкивающей силой служит пропеллент, находящийся под давлением в устройстве с клапаном [1, 2], и аэрозольные устройства (небулайзеры) с механическим или ультразвуковым возбуждением и мембранным распылителем, такие как настольные небулайзеры эжекторного или ультразвукового типов и ручные ингаляторы механического типа «респимат» или ручной ингалятор мембранного типа Micro-Air «Омрон» [3]. При открытии клапана или при запуске аэрозольного возбуждения происходит выталкивание аэрозольного состава и его распыление, так называемое генерирование аэрозоля.Known aerosol systems in which the propellant, which is under pressure in a device with a valve [1, 2], and aerosol devices (nebulizers) with mechanical or ultrasonic excitation and a membrane nebulizer, such as tabletop nebulizers of ejector or ultrasonic types and manual inhalers of mechanical type "respimat" or manual inhaler of membrane type Micro-Air "Omron" [3]. When the valve is opened or when aerosol excitation is started, the aerosol composition is ejected and sprayed, the so-called aerosol generation.
Известен способ оценки физических свойств генерируемого аэрозоля, таких как дисперсность частиц генерируемого аэрозоля либо стабильность аэрозольных частиц на различном удалении от распыляющего устройства после выпуска аэрозольного облака [4]. Такие измерения дисперсности или дистанционной стабильности аэрозоля проводят либо автоматически по рассеиванию лазерного луча облаком аэрозоля на лазерном детекторе частиц (ряда фирм: "Horiba", "Malvern", "Shimadzu", "Sympatec Helos"), работающем на принципе лазерной дифракции и оптического контроллера [4, 5], либо с помощью светового или электронного микроскопа при исследовании аэрозольных капель, выпавших на стекле или подложке, размещенных на различном расстоянии от аэрозольного устройства (небулайзера) [6]. Однако данные способы не позволяют оценить структурную и биологическую сохранность фармацевтических и других биологически активных веществ, включенных в аэрозольный состав, после их распыления в результирующем аэрозольном облаке.A known method for assessing the physical properties of the generated aerosol, such as the particle size of the generated aerosol or the stability of aerosol particles at different distances from the spray device after the release of the aerosol cloud [4]. Such measurements of dispersion or distance stability of aerosol are carried out either automatically by scattering the laser beam by a cloud of aerosol on a laser particle detector (a number of companies: Horiba, Malvern, Shimadzu, Sympatec Helos), operating on the principle of laser diffraction and an optical controller [4, 5], or with the help of a light or electron microscope when studying aerosol drops that have fallen on glass or a substrate, placed at different distances from the aerosol device (nebulizer) [6]. However, these methods do not allow assessing the structural and biological safety of pharmaceutical and other biologically active substances included in the aerosol composition after being sprayed in the resulting aerosol cloud.
Нами разработан простой и удобный способ, позволяющий исследовать структурную стабильность и биологическую активность фармацевтических, дезинфицирующих и других биологически активных веществ в результирующем аэрозольном облаке, генерируемом из аэрозольного состава в устройстве с пропеллентной системой или других типов устройств с принудительным аэрозолированием. Сущность метода состоит в конденсации жидкой водосодержащей фазы аэрозольного облака в открытую емкость, позволяющую собрать результирующий конденсат и осуществить естественное испарение пропеллента и других летучих веществ аэрозольного состава. Разработанный способ применим как для водносодержащих аэрозолей (так называемые аэрозоли влажного типа), так и для пропеллентных составов с микронизированными активными веществами (так называемые сухие аэрозоли). После сбора конденсата производят определение концентрации, структуры и биологической активности содержащихся фармацевтических и других биологически активных субстанций и их перерасчет на исходный аэрозольный состав. Для более эффективного растворения и предотвращения агрегации и денатурации исследуемых активных веществ в результирующем конденсате, в емкость аэрозоля вносят дополнительное количество деионизованной воды или буферного раствора с рН 2,0-12,0, содержащих поверхностно-активные вещества из группы сурфактантов или органических растворителей, таких как твин-20, твин-80, спан-20, спан-80, додецил сульфат натрия, нонидет-Р40, тритон Х-100, бета-октилглюкозид, диметилсульфоксид, формамид, ацетонитрил и другие.We have developed a simple and convenient method that makes it possible to study the structural stability and biological activity of pharmaceutical, disinfecting and other biologically active substances in the resulting aerosol cloud generated from an aerosol composition in a device with a propellant system or other types of devices with forced aerosolization. The essence of the method is the condensation of the liquid water-containing phase of the aerosol cloud into an open container, which allows collecting the resulting condensate and natural evaporation of the propellant and other volatile substances of the aerosol composition. The developed method is applicable both for aqueous aerosols (so-called wet aerosols) and propellant compositions with micronized active substances (so-called dry aerosols). After collecting the condensate, the concentration, structure and biological activity of the contained pharmaceutical and other biologically active substances are determined and recalculated to the original aerosol composition. For more effective dissolution and prevention of aggregation and denaturation of the studied active substances in the resulting condensate, an additional amount of deionized water or a buffer solution with a pH of 2.0-12.0 containing surfactants from the group of surfactants or organic solvents, such as tween-20, tween-80, span-20, span-80, sodium dodecyl sulfate, nonidet-P40, triton X-100, beta-octylglucoside, dimethyl sulfoxide, formamide, acetonitrile and others.
Достоинство разработанного метода состоит в том, что он позволяет тестировать структуру и активность фармацевтических и других биологически активных веществ аэрозольного состава после его аэрозольного распыления (генерирование аэрозоля), т.е. в результирующем аэрозольном облаке. Таким образом, способ позволяет оценить влияние процесса аэрозолирования на свойства биологически активных веществ и их структурно-функциональную стабильность в аэрозольном облаке. Полученный по представленному способу конденсат, лишенный газообразных компонентов аэрозольного состава, дает возможность определения биологической активности фармацевтических, дезинфицирующих и других веществ прямыми методами оценки соответствующих ферментативных активностей или оценки различных физиологических активностей, таких как противовирусной, антимикробной или метаболической активностей в клеточных культурах, органных культурах, питательных средах, на животных и т.п.The advantage of the developed method is that it allows testing the structure and activity of pharmaceutical and other biologically active substances of aerosol composition after aerosol spraying (aerosol generation), i.e. in the resulting aerosol cloud. Thus, the method makes it possible to assess the effect of the aerosolization process on the properties of biologically active substances and their structural and functional stability in an aerosol cloud. The condensate obtained according to the presented method, devoid of gaseous components of the aerosol composition, makes it possible to determine the biological activity of pharmaceutical, disinfectants and other substances by direct methods of assessing the corresponding enzymatic activities or assessing various physiological activities, such as antiviral, antimicrobial or metabolic activities in cell cultures, organ cultures, nutrient media, animals, etc.
Разработанный способ имеет особую ценность для тестирования аэрозольных составов, содержащих лабильные вещества, такие как белковые, олигопептидные или мультикомпонентные вещества, которые могут инактивироваться при фазовых переходах из жидкой фазы в газообразную в процессе аэрозолирования. Создание белок содержащих аэрозольных составов с применением методов генетической инженерии представляет быстро развивающееся направление в современной медицинской аэрозольной биотехнологии и других областей промышленной и бытовой техники. Этот этап в аэрозольной биотехнологии ставит новые проблемы, одна из которых решена в настоящем изобретении, что повышает актуальность изобретения.The developed method is of particular value for testing aerosol formulations containing labile substances, such as protein, oligopeptide or multicomponent substances, which can be inactivated during phase transitions from a liquid to a gaseous phase during aerosolization. The creation of protein-containing aerosol compositions using genetic engineering methods is a rapidly developing trend in modern medical aerosol biotechnology and other areas of industrial and household appliances. This stage in aerosol biotechnology poses new problems, one of which is solved in the present invention, which increases the relevance of the invention.
Для осуществления поставленной задачи предлагается следующий способ и подходы для ее решения, а именно:For the implementation of the task, the following method and approaches for its solution are proposed, namely:
• Способ тестирования биологической активности аэрозольных препаратов, в котором аэрозольные препараты являются медицинскими или техническими, отличающийся тем, что аэрозоль, генерируемый под действием принудительной выталкивающей силы выпускают в открытую емкость и инкубируют в течение 0,01 мин или более для конденсирования жидкой фазы аэрозольного облака и испарения летучих компонентов аэрозольного состава, определяют количественный выход аэрозольного состава, концентрацию активных веществ, их биологическую активность, при этом для предотвращения агрегации и денатурации исследуемых активных веществ в емкость добавляют 10 мкл или более деионизованной воды или буферного раствора с диапазоном рН от 2,0 до 13.0.• A method for testing the biological activity of aerosol preparations, in which aerosol preparations are medical or technical, characterized in that the aerosol generated by the forced buoyancy force is released into an open container and incubated for 0.01 min or more to condense the liquid phase of the aerosol cloud and evaporation of volatile components of the aerosol composition, determine the quantitative yield of the aerosol composition, the concentration of active substances, their biological activity, while in order to prevent aggregation and denaturation of the active substances under study, 10 μl or more of deionized water or a buffer solution with a pH range of 2.0 to 13.0.
• Для более эффективного растворения и предотвращения агрегации и денатурации исследуемых активных веществ в результирующем конденсате в емкость добавляют 10 мкл или более деионизованной воды или буферного раствора с рН в диапазоне 2,0-13,0, содержащих 0,01 - 99% поверхностно-активных веществ и сорастворителей, преимущественно твин-20, твин-80, спан-20, спан-80, додецил сульфат натрия, нонидет-Р40, тритон Х-100, бета-октилглюкозид, диметилсульфоксид, формамид, ацетонитрил.• For more effective dissolution and prevention of aggregation and denaturation of the studied active substances in the resulting condensate, add 10 μl or more of deionized water or a buffer solution with a pH in the range of 2.0-13.0, containing 0.01 - 99% surfactants to the container substances and co-solvents, mainly tween-20, tween-80, span-20, span-80, sodium dodecyl sulfate, nonidet-P40, triton X-100, beta-octylglucoside, dimethyl sulfoxide, formamide, acetonitrile.
Описание рисунковDescription of figures
Рис. 1. Электрофоретический профиль апротинина после аэрозольного распыления и белковых маркеровFig. 1. Electrophoretic profile of aprotinin after aerosol spray and protein markers
Дорожки показывают профиль апротинина из препарата после хранения в течение 1 года (дорожка 3) и 7 лет (4) в составе аэрозольного состава в устройстве с клапаном при комнатной температуре) и стандартный апротинин (Sigma; дорожка 2). Дорожка 1-белковые маркеры молекулярных весов. Квадратами выделены зоны полиакриламидного геля, соответствующие нативному апротинину с м.м. 6кД и высокомолекулярной зоне с м.м. 60-250 кД (ВМЗ) для количественного сканирования. Высокомолекулярная зона содержит менее 5% массы белков в зоне апротинина.The lanes show the profile of aprotinin from the formulation after storage for 1 year (lane 3) and 7 years (4) in an aerosol formulation in a valve device at room temperature) and standard aprotinin (Sigma; lane 2). Lane 1 - Protein molecular weight markers. The squares mark the zones of the polyacrylamide gel corresponding to the native aprotinin with mm. 6kD and high molecular weight zone with mm. 60-250 kD (VMZ) for quantitative scanning. The high molecular weight zone contains less than 5% of the mass of proteins in the aprotinin zone.
Рис. 2. Титрование стандартного апротинина SigmaFig. 2. Titration of Sigma standard aprotinin
Доза около 0,3 КИЕ апротинина (показана пунктирной линией) вызывала 50% ингибирование трипсина в условиях реакции.A dose of about 0.3 CIU of aprotinin (shown by the dotted line) caused 50% inhibition of trypsin under the reaction conditions.
Рис. 3. Титрование испытуемого конденсата аэрозольного апротинина.Fig. 3. Titration of the test condensate of aerosol aprotinin.
Рис. 4. Тестирование антивирусной активности апротинина в генерируемом аэрозоле с помощью разработанного способа с использованием культуры клетокFig. 4. Testing the antiviral activity of aprotinin in the generated aerosol using the developed method using cell culture
Окрашенные с помощью антивирусных антител клеточные культуры фотографировали в световом микроскопе под увеличением ×80. Лунки 1, 2, 3 - показывают клеточные пробы, инкубированные без конденсата (1), с 30 мкл конденсата, полученного распылением из устройства, хранившегося с аэрозольным составом 1 год (2) и с 30 мкл конденсата, полученного распылением из аэрозольного устройства, хранившегося с аэрозольным составом в течение 7 лет, соответственно.Cell cultures stained with antiviral antibodies were photographed under a light microscope at a magnification of × 80. Wells 1, 2, 3 - show cell samples incubated without condensation (1), with 30 μl of condensate obtained by nebulization from the device, stored with an aerosol formulation for 1 year (2) and with 30 μl of condensate obtained by nebulization from an aerosol device, stored with aerosol composition for 7 years, respectively.
Рис. 5. Тестирование анти-трипсиновой активности испытуемого конденсата аэрозольного леупептина.Fig. 5. Testing the anti-trypsin activity of the test condensate of aerosol leupeptin.
Рис. 6. Тестирование конденсата аэрозольного апротинина.Fig. 6. Testing of condensate of aerosol aprotinin.
Рис. 7. Определение содержания рибавирина в аэрозольном облакеFig. 7. Determination of the content of ribavirin in the aerosol cloud
Оптическую плотность контрольных растворов и проб конденсата аэрозольного рибавирина измеряли при 270 нм. Столбцы: 1 - проба 30% глицерина в деионизованной воде; 2 - проба 75% раствора глицерина; 3 - проба 30 мкл конденсата аэрозольного рибавирина в 500 мкл деионизованной воды; 4 - проба 70 мкл конденсата аэрозольного рибавирина в 500 мкл деионизованной воды.The absorbance of control solutions and samples of aerosol ribavirin condensate was measured at 270 nm. Columns: 1 - sample of 30% glycerin in deionized water; 2 - sample of 75% glycerin solution; 3 - sample of 30 μl of aerosol ribavirin condensate in 500 μl of deionized water; 4 - sample of 70 μl of aerosol ribavirin condensate in 500 μl of deionized water.
Рис. 8. Электрофоретический профиль апротинина после аэрозольного распыления и конденсации при рН 11,5 в присутствии ДМСОFig. 8. Electrophoretic profile of aprotinin after aerosol spraying and condensation at pH 11.5 in the presence of DMSO
Дорожки показывают профиль апротинина из препарата после хранения в течение 1 года (дорожка 2) и 7 лет (3) в составе аэрозольного состава в устройстве с клапаном при комнатной температуре) и исходный апротинин (Sigma; дорожка 1). Слева показаны позиции маркерных белков с известной молекулярной массой.The lanes show the profile of aprotinin from the formulation after storage for 1 year (lane 2) and 7 years (3) in an aerosol formulation in a valve device at room temperature) and the original aprotinin (Sigma; lane 1). On the left, the positions of marker proteins with known molecular weights are shown.
Рис. 9. Тестирование конденсата аэрозольного апротинина после распыления «в мягком облаке»Fig. 9. Testing of condensate of aerosol aprotinin after spraying "in a soft cloud"
Столбцы: 1 - контрольная проба с буфером без трипсина и без конденсата (нулевой контроль); 2 - проба с трипсином без добавления конденсата (100% контроль); 3 - проба, содержащая трипсин и 10 мкл исследуемого аэрозольного конденсата с апротинином.Columns: 1 - buffer control sample without trypsin and without condensation (zero control); 2 - sample with trypsin without adding condensate (100% control); 3 - sample containing trypsin and 10 μl of the investigated aerosol condensate with aprotinin.
Рис. 10. Тестирование конденсата аэрозольного фавипиравира после распыления «в мягком облаке»Fig. 10. Testing the condensate of aerosol favipiravir after spraying "in a soft cloud"
Оптическую плотность контрольных растворов и проб конденсата аэрозольного фавипиравира измеряли при 360 нм в кюветах 0,5 мл. Столбцы: 1 - проба деионизованной воды; 2 - проба контрольного препарата без фавипиравира; 3 - проба 25 мкл конденсата аэрозольного фавипиравира в 500 мкл деионизованной воды; 4 - проба 60 мкл конденсата аэрозольного фавипиравира в 500 мкл деионизованной воды.The optical density of control solutions and condensate samples of aerosol favipiravir was measured at 360 nm in 0.5 ml cuvettes. Columns: 1 - deionized water sample; 2 - sample of the control drug without favipiravir; 3 - sample of 25 μl of aerosol favipiravir condensate in 500 μl of deionized water; 4 - sample of 60 μl of aerosol favipiravir condensate in 500 μl of deionized water.
Примеры реализации изобретенияExamples of implementation of the invention
Пример 1. Оценка общей водо-содержавшей жидкой фракции генерируемого аэрозольного облакаExample 1. Evaluation of the total water-containing liquid fraction of the generated aerosol cloud
Разработанный способ позволяет оценить общее содержание активной жидкой аэрозольной фракции после распыления пропеллентного аэрозольного состава. С этой целью производят выпуск аэрозольного состава разработанным способом в емкость и после испарения летучих компонентов состава определяют весовое и объемное количество сформировавшегося конденсата. Параллельно определяют количество распыленного состава взвешиванием аэрозольного баллона (или другого устройства с клапаном) до и после генерации аэрозоля. Результаты полученных измерений представлены в таблице 1.The developed method makes it possible to estimate the total content of the active liquid aerosol fraction after spraying the propellant aerosol composition. For this purpose, the aerosol composition is released into the container using the developed method, and after evaporation of the volatile components of the composition, the weight and volumetric amount of the formed condensate is determined. In parallel, the amount of the sprayed composition is determined by weighing the aerosol can (or other device with a valve) before and after generating the aerosol. The results of the obtained measurements are presented in table 1.
1) Аэрозольный состав готовили в устройстве весом 297,165 г с дозированным клапаном, позволяющим выпуск за одно нажатие около 55 мкл аэрозольного состава.1) An aerosol formulation was prepared in a device weighing 297.165 g with a metered valve allowing the release of about 55 μl of the aerosol formulation per press.
2) Аэрозольный состав готовили по следующей прописи из расчета на одну дозу (выпуск): пропеллент А134 (0,047 мл); этанол (0,0075 мл), глицерол (0,0035 мл), апротинин (0,0005 мл; 95 КИЕ).2) An aerosol composition was prepared according to the following recipe per dose (release): A134 propellant (0.047 ml); ethanol (0.0075 ml), glycerol (0.0035 ml), aprotinin (0.0005 ml; 95 KIE).
3) Проводили три серии испытаний, в каждом испытании делали по 10 выпусков в коническую пробирку объемом 10 мл. После выпуска аэрозоля конденсат со стенок собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2 минут. Полученный конденсат инкубировали 30 мин при постоянном помешивании для испарения летучих компонентов и исследовали, как указано в таблице. Стандартное отклонение показывает средний разброс меду значениями по прописи и в опытном определении, выраженное в % от значения по прописи приготовления аэрозольного состава.3) Three series of tests were carried out, in each test 10 releases were made into a 10 ml conical tube. After the aerosol was released, the condensate from the walls was collected by centrifugation at 1500 rpm for 2 minutes. The resulting condensate was incubated for 30 min with constant stirring to evaporate volatile components and examined as indicated in the table. The standard deviation shows the average spread of honey by the values according to the recipe and in the experimental determination, expressed in% of the value according to the recipe for the preparation of the aerosol composition.
Пример 2. Оценка нативной структуры активного фармацевтического вещества в генерируемом аэрозолеExample 2. Evaluation of the native structure of an active pharmaceutical substance in a generated aerosol
Для исследования сохранения нативных свойств активного вещества белковой природы использовали аэрозольный состав, приготовленный с водным раствором природного ингибитора протеаз (апротинина), выделенного из легких коров, смешанного с пропеллентом 134А, глицерином и спиртом в соотношении веществ: пропеллент А134 (0,047 мл); этанол (0,0075 мл), глицерол (0,0035 мл), апротинин (0,0005 мл; 95 КИЕ). Содержимое баллончика выпускали в коническую пробирку объемом 10 мл посредством 25 выпусков и конденсат собирали на дно пробирки центрифугированием при 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 20°С с открытой крышкой, при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта), затем объем конденсата доводили до 350 мкл раствором 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). Структуру апротинина определяют по подвижности в геле в высокоразрешающем электрофорезе в полиакриламидном геле (ПАГе), содержащем додецил-сульфат натрия (ДСН), в Трис-глициновой буферной системе Laemmli (1970). Для анализа берут 2, 5 и 10 мкл испытуемого раствора в пробы прибавляют 13, 10 и 5 мкл деионизованной воды, соответственно, прибавляют по 6 мкл диссоциирующего буферного раствора, содержащего 10% додецил сульфата натрия и 5% меркаптоэтанола, для полного раскручивания молекулы апротинина и разрыва всех дисульфидных связей. Полученные образцы прогревают при температуре 75°С в течение 10 мин для лучшей диссоциации молекул апротинина. Пробы наносят в лунки из 3,5% фокусирующего полиакриламидного геля, приготовленного над 12% полиакриламидным разделительным гелем, и проводят электрофорез в электрическом поле при 50V на гель в течение 3 часов.To study the preservation of the native properties of the active substance of a protein nature, an aerosol composition was used prepared with an aqueous solution of a natural protease inhibitor (aprotinin) isolated from cow lungs, mixed with propellant 134A, glycerin and alcohol in the ratio of substances: propellant A134 (0.047 ml); ethanol (0.0075 ml), glycerol (0.0035 ml), aprotinin (0.0005 ml; 95 KIE). The contents of the can was discharged into a 10 ml conical tube through 25 outlets and the condensate was collected at the bottom of the tube by centrifugation at 1500 rpm for 2 minutes. Then the condensate was incubated for 30 min at a temperature of 20 ° C with the lid open, with constant shaking (to evaporate the residues of the propellant and alcohol), then the volume of the condensate was brought to 350 μL with a solution of 0.02 M Tris-HCl (pH 7.5) ... The structure of aprotinin is determined by the mobility in the gel in high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAG) containing sodium dodecyl sulfate (SDS) in the Tris-glycine buffer system of Laemmli (1970). For analysis, take 2, 5 and 10 μl of the test solution, add 13, 10 and 5 μl of deionized water to the samples, respectively, add 6 μl of dissociating buffer solution containing 10% sodium dodecyl sulfate and 5% mercaptoethanol to completely unwind the aprotinin molecule and breaking all disulfide bonds. The obtained samples are heated at a temperature of 75 ° C for 10 min for better dissociation of aprotinin molecules. Samples are applied to wells of 3.5% focusing polyacrylamide gel prepared over 12% polyacrylamide separating gel, and electrophoresis is carried out in an electric field at 50V on the gel for 3 hours.
После электрофореза пластину геля фиксируют в течение 1 часа в водном растворе, содержащем 50% этанола и 10% уксусной кислоты. После фиксации гель окрашивают в течение 2 часов в 0,02% растворе Кумаси голубого G-250, приготовленного на растворе, содержащем 40% этанола и 10% уксусной кислоты. На рисунке 1 показаны результаты тестирования.After electrophoresis, the gel plate is fixed for 1 hour in an aqueous solution containing 50% ethanol and 10% acetic acid. After fixation, the gel is stained for 2 hours in 0.02% Kumasi blue G-250 solution prepared in a solution containing 40% ethanol and 10% acetic acid. Figure 1 shows the test results.
Результат анализа в ПАГе показывает, что после распыления апротинин сохраняет свои нативные свойства и имеет подвижность, соответствующую белку с м.м. 6кД, не имеет продуктов деградации и высокомолекулярных продуктов агрегации.The result of the analysis in PAG shows that after spraying, aprotinin retains its native properties and has a mobility corresponding to the protein with m.w. 6kD, does not have degradation products and high molecular weight aggregation products.
Пример 3. Оценка специфической антипротеазной активности апротинина в генерируемом аэрозолеExample 3. Evaluation of the specific antiprotease activity of aprotinin in the generated aerosol
Для тестирования сохранения специфических ферментативных свойств активного вещества белковой природы использовали аэрозольный состав, приготовленный с водным раствором природного ингибитора протеаз (апротинина), выделенного из легких коров. Приготовление пропеллентного аэрозольного состава апротинина и получение конденсата способом согласно изобретению приведено выше в примере 2. Специфическую активность ингибитора протеаз (апротинина) анализировали методом ингибирования расщепления хромогенного субстрата протеолитическим ферментом - трипсином. Метод основан на ингибировании катализированного трипсином расщепления хромогенного субстрата - N-а-бензоил-DL-арганин-4-нитроанилида (БАПНА), который при расщеплении приобретает окраску. Определяется разность активности трипсина и трипсина, инактивированного апротинином, по интенсивности цветного окрашивания, которое регистрируется при длине волны 405 нм. Одна единица ингибитора протеаз (ЕИТ) тормозит активность двух протеазных единиц трипсина на 50%. Известно, что одна ЕИТ соответствует 1330 КИЕ (Калликреин Ингибирующая Единица). 1 КИЕ - это единица активности ингибитора протеаз, которая ингибирует 2 калликреиновые единицы протеазы на 50% при оптимальных условиях). Использовали кристаллический трипсин (Sigma), гидрохлорид N-а-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилида (БАПНА) (Sigma), в качестве стандарта использовали апротинин (фирма MERK) со специфической активностью 4500-7000 КИЕ/мг (согласно сертификату).To test the preservation of the specific enzymatic properties of the active substance of a protein nature, an aerosol composition prepared with an aqueous solution of a natural protease inhibitor (aprotinin) isolated from cow lungs was used. The preparation of the propellant aerosol composition of aprotinin and the production of the condensate by the method according to the invention is given in Example 2 above. The specific activity of the protease inhibitor (aprotinin) was analyzed by inhibiting the cleavage of the chromogenic substrate by the proteolytic enzyme, trypsin. The method is based on inhibition of trypsin-catalyzed cleavage of a chromogenic substrate, N-a-benzoyl-DL-arganine-4-nitroanilide (BAPNA), which acquires a color upon cleavage. The difference in the activity of trypsin and trypsin inactivated by aprotinin is determined by the intensity of color staining, which is recorded at a wavelength of 405 nm. One unit of protease inhibitor (NIT) inhibits the activity of two protease units of trypsin by 50%. It is known that one NIT corresponds to 1330 KIE (Kallikrein Inhibitory Unit). 1 KIE is a unit of protease inhibitor activity that inhibits 2 kallikrein units of protease by 50% under optimal conditions). Crystalline trypsin (Sigma), N-a-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride (BAPNA) (Sigma) were used, aprotinin (MERK) with a specific activity of 4500-7000 KIE / mg (according to the certificate) was used as a standard ...
На первом этапе готовят двукратные разведения стандартного трипсина на буфере, содержащем 25 мМ трис-HCl (рН 7,8) и 250 мМ натрия хлорида, и по 50 мкл каждого разведения вносят в лунки 96-луночного планшета. 2-кратные разведения трипсина готовят, начиная с концентрации 160 мкг/мл и заканчивая концентрацией 1,25 мкг/мл. Далее последовательно прибавляют воду, хромогенный субстрат БАПНА (0,8 мг/мл готовят разведением исходного раствора в воде) и инкубируют в течение часа при 35°С. Реакцию останавливают прибавлением 35% уксусной кислоты и определяют оптическую плотность (ОП) при 405 нм на спектрофотометре для микропланшет (BioRad Model 550). На основании полученных значений определяют разведение трипсина, индуцирующее OD405 (оптимальный в диапазон 0,5-1,5), которое используют в титровании апротинина в исследуемом аэрозольном конденсате. Согласно данным тестирования такой дозой 50% ингибирования служила 0,3 мкг трипсина на пробу.At the first stage, two-fold dilutions of standard trypsin are prepared in a buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.8) and 250 mM sodium chloride, and 50 μl of each dilution are added to the wells of a 96-well plate. 2-fold dilutions of trypsin are prepared starting at a concentration of 160 μg / ml and ending with a concentration of 1.25 μg / ml. Then, water, the chromogenic substrate BAPNA (0.8 mg / ml is prepared by diluting the stock solution in water) are successively added and incubated for an hour at 35 ° C. The reaction is stopped by the addition of 35% acetic acid and the optical density (OD) is determined at 405 nm on a microplate spectrophotometer (BioRad Model 550). On the basis of the obtained values, trypsin dilution is determined, inducing OD405 (optimal in the range of 0.5-1.5), which is used in titration of aprotinin in the investigated aerosol condensate. According to testing data, this dose of 50% inhibition was 0.3 μg of trypsin per sample.
Для построения калибровочной кривой апротинина готовят двукратные разведения стандартного раствора апротинина, начиная с концентрации 50 мкг/мл и заканчивая 0,25 мкг/мл. Аналогичным образом готовят двукратные разведения испытуемого конденсата в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1/20, путем двукратных разведений. Калибровочные кривые для определения специфической анти-трипсиновой активности стандартного и исследуемого препаратов апротинина приведены на рисунках 2 и 3. Протокол проведения тестирования антипротеазной активности с трипсином приведен в таблице 2.To construct a calibration curve for aprotinin, two-fold dilutions of a standard aprotinin solution are prepared, starting with a concentration of 50 μg / ml and ending with 0.25 μg / ml. In the same way, prepare two-fold dilutions of the test condensate in a volume of 50 μl, starting with a dilution of 1/20, by two-fold dilutions. Calibration curves for determining the specific anti-trypsin activity of the standard and test aprotinin preparations are shown in Figures 2 and 3. The protocol for testing antiprotease activity with trypsin is shown in Table 2.
Оптическая плотность для испытуемой пробы апротинина должна составлять 50% от оптической плотности трипсиновой пробы. Вычисление общей активности апротинина X (в КИЕ), содержащейся в конденсате в пересчете на исходный аэрозольный состав, проводят по формулеThe optical density for the test sample of aprotinin shall be 50% of the optical density of the trypsin sample. The calculation of the total activity of aprotinin X (in KIE) contained in the condensate in terms of the original aerosol composition is carried out according to the formula
Аст - активность стандартного апротинина в точке 50% ингибирования на калибровочной кривой (КИЕ) с учетом специфической активности по сертификату (показана на рис. 2);A st is the activity of standard aprotinin at the point of 50% inhibition on the calibration curve (KIE), taking into account the specific activity according to the certificate (shown in Fig. 2);
Vo - общий объем исходного испытуемого раствора (конденсата) апротинина в 10 выпусках (таблица 1);V o - the total volume of the original test solution (condensate) of aprotinin in 10 outlets (table 1);
Кр - фактор разведения испытуемого раствора апротинина в точке 50% ингибирования трипсина на кривой испытуемого раствора (показан на рис. 3);K p is the dilution factor of the test solution of aprotinin at the point of 50% inhibition of trypsin on the curve of the test solution (shown in Fig. 3);
Vпp - объем испытуемого раствора апротинина в пробе (0,05 мл);V pp - the volume of the test solution of aprotinin in the sample (0.05 ml);
Кп - поправочный коэффициент, обусловленный частичной потерей препарата при сборе аэрозольного конденсата из баллончика (величина равна 1,2).K p is a correction factor due to partial loss of the drug when collecting aerosol condensate from the can (value is 1.2).
Испытуемый раствор вызывал 50% ингибирование трипсина при разведении около 1/750 в условиях реакции (показано пунктирной линией на рис. 3). Согласно формуле расчета активности апротинина в препарате:The test solution caused 50% inhibition of trypsin at a dilution of about 1/750 under the reaction conditions (shown by the dashed line in Fig. 3). According to the formula for calculating the activity of aprotinin in the preparation:
С учетом полученных значений Аст=0,3 КИЕ и Кр ≈ 750 (показано на рисунках 2 и 3), общая активность апротинина в конденсате аэрозольного апротинина в количестве 20 выпусков составила 1720 КИЕ, что составляло около 90% от расчетного значения по прописи приготовления состава.Taking into account the obtained values Ast = 0.3 KIE and Kp ≈ 750 (shown in Figures 2 and 3), the total activity of aprotinin in the condensate of aerosol aprotinin in the amount of 20 releases was 1720 KIE, which was about 90% of the calculated value according to the recipe for preparing the composition ...
Пример 4. Оценка противовирусной активности апротинина в генерируемом аэрозоле разработанным способом с использованием культуры клетокExample 4. Evaluation of the antiviral activity of aprotinin in the generated aerosol by the developed method using cell culture
Для тестирования противовирусной активности вещества белковой природы использовали аэрозольный состав, приготовленный с водным раствором природного ингибитора протеаз (апротинина), выделенного из легких коров. Приготовление пропеллентного аэрозольного состава апротинина и получение конденсата способом согласно изобретения приведено выше в примере 2. Специфическую противовирусную активность полученного аэрозольного конденсата ингибитора протеаз (апротинина) тестировали методом редукции фокусов вируса гриппа типа А человека, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), которые он формировал при размножении в культуре клеток из легких человека (линия Calu-3).To test the antiviral activity of a protein substance, an aerosol composition prepared with an aqueous solution of a natural protease inhibitor (aprotinin) isolated from cow lungs was used. The preparation of a propellant aerosol composition of aprotinin and the production of a condensate by the method according to the invention is given above in Example 2. The specific antiviral activity of the obtained aerosol condensate of a protease inhibitor (aprotinin) was tested by the method of focus reduction of the human influenza type A virus, strain A / Aichi / 2/68 (H3N2), which he formed when multiplying in cell culture from human lungs (line Calu-3).
Клетки Calu-3 выращивали на 24-луночных планшетах в среде ДМЕМ, содержащей антибиотики и 10% фетальной бычьей сыворотки. Далее после формирования клеточного монослоя вносили питательную среду ДМЕМ без сыворотки, содержащую вирус гриппа A/Aichi/2/68 из расчета около 100 фокус образующих единиц на одну клеточную лунку, и инкубировали 1 час для заражения клеток вирусом. Затем среду удаляли и вносили новую порцию среды ДМЕМ (1,3 мл на одну лунку), содержащую различные количества исследуемого аэрозольного конденсата апротинина, и инкубировали в течение 30 часов при 37°С в CO2 термостате для формирования вирусных фокусов в клеточной культуре.Calu-3 cells were grown in 24-well plates in DMEM medium containing antibiotics and 10% fetal bovine serum. Then, after the formation of the cell monolayer, a serum-free DMEM medium containing the influenza virus A / Aichi / 2/68 was added at the rate of about 100 focus forming units per cell well, and incubated for 1 hour to infect the cells with the virus. Then the medium was removed and a new portion of the DMEM medium (1.3 ml per well) was added, containing various amounts of the investigated aerosol condensate of aprotinin, and incubated for 30 hours at 37 ° C in a CO2 incubator to form viral foci in cell culture.
Клеточную культуру фиксировали 4%-ым раствором параформальдегида и вирусные фокусы окрашивали с помощью специфических противовирусных антител (субтип анти-Н3) и пероксидазных конъюгатов, используя в качестве хромогенного субстрата препарат "True Blue". Результаты показаны на рисунке 4.The cell culture was fixed with a 4% paraformaldehyde solution and viral foci were stained with specific antiviral antibodies (anti-H3 subtype) and peroxidase conjugates, using True Blue as a chromogenic substrate. The results are shown in Figure 4.
Как показано на рисунке 4, в контрольных клеточных пробах, инкубируемых в среде без конденсата, наблюдалось формирование отчетливых вирусных фокусов с диаметром от 1,5 до 4,0 мм. В пробах, содержащих 50 мкл конденсата, фокусы были меньшего размера с диаметром 0,3-1,0 мм и их количество было более чем в 5 раз ниже, чем в контрольной пробе. Накопление инфекционного вируса в клеточной среде снижалось в присутствии конденсата более чем в 100 по сравнению с контролем. Этот результат говорил о том, что апротинин после распыления из аэрозольного устройства, хранившегося с аэрозольным составом в течение 1 года и 7 лет, сохранял свою биологическую антивирусную активность.As shown in Figure 4, in the control cell samples incubated in a medium without condensation, the formation of distinct viral foci with a diameter of 1.5 to 4.0 mm was observed. In samples containing 50 μl of condensate, foci were smaller with a diameter of 0.3-1.0 mm and their number was more than 5 times lower than in the control sample. The accumulation of the infectious virus in the cellular environment decreased in the presence of condensate by more than 100 compared with the control. This result indicated that aprotinin, after being sprayed from an aerosol device stored with an aerosol composition for 1 and 7 years, retained its biological antiviral activity.
Пример 5. Оценка антипротеазной активности леупептина в генерируемом аэрозолеExample 5. Evaluation of the antiprotease activity of leupeptin in the generated aerosol
Леупептин представляет собой трипептид (ацетил-Leu-Leu-Arg-альдегид), обладающий антипротезной активностью в отношении широкого спектра сериновых протеаз. Аэрозольный состав готовили с водным раствором леупептина, смешанного с пропеллентом 134А, глицерином и спиртом в соотношении веществ: пропеллент А134 (13 мл); этанол (1,35 мл), глицерол (2,5 мл), леупептин (1,5 мг; 0,8 мл водного раствора). Суспензию готовили в устройстве с дозирующим клапаном (60 мкл в одном выпуске) с распыляющим отверстием 0,3 мм. Специфическую активность леупептина тестировали методом ингибирования расщепления хромогенного субстрата протеолитическим ферментом - трипсином. Метод основан на ингибировании катализированного трипсином расщепления хромогенного субстрата - N-а-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилида (БАПНА), который при расщеплении приобретает окраску. Определяется разность активности трипсина и трипсина, инактивированного леупептином, по интенсивности цветного окрашивания, которое регистрируется при длине волны 405 нм.Leupeptin is a tripeptide (acetyl-Leu-Leu-Arg-aldehyde) with antiprosthetic activity against a wide range of serine proteases. An aerosol composition was prepared with an aqueous solution of leupeptin mixed with propellant 134A, glycerin and alcohol in the ratio of substances: propellant A134 (13 ml); ethanol (1.35 ml), glycerol (2.5 ml), leupeptin (1.5 mg; 0.8 ml of an aqueous solution). The suspension was prepared in a device with a metering valve (60 μl per outlet) with a 0.3 mm spray hole. The specific activity of leupeptin was tested by inhibiting the cleavage of the chromogenic substrate by the proteolytic enzyme trypsin. The method is based on inhibition of trypsin-catalyzed cleavage of a chromogenic substrate, N-a-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide (BAPNA), which acquires color upon cleavage. The difference in the activity of trypsin and trypsin inactivated by leupeptin is determined by the intensity of color staining, which is recorded at a wavelength of 405 nm.
Содержимое аэрозольного баллончика выпускали в емкость посредством 25 выпусков и конденсат собирали на дно пробирки центрифугированием при 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 20°С при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта), затем объем конденсата доводили до 200 мкл раствором 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). Для построения калибровочной кривой активности антипротеазной леупетина готовили двукратные разведения исследуемого конденсата в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1/40, путем двукратных разведений в 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). В каждую лунку вносили 50 мкл буфера, содержащего 0,3 мкг трипсина. Это количество трипсина определено на основании полученных значений для разведений трипсина, индуцирующее ОП405 (в оптимальном диапазоне 0,5-1,5). Далее согласно протоколу (таблица 2) последовательно прибавляют воду, хромогенный субстрат БАПНА и инкубируют в течение часа при 35°С. Реакцию останавливают прибавлением 35% уксусной кислоты и определяют оптическую плотность (ОП) при 405 нм на спектрофотометре BioRad Model 550. Результаты показаны на рис. 5.The contents of the aerosol can was discharged into the container through 25 outlets and the condensate was collected at the bottom of the tube by centrifugation at 1500 rpm for 2 minutes. Then the condensate was incubated for 30 min at a temperature of 20 ° C with constant shaking (to evaporate the residues of the propellant and alcohol), then the volume of the condensate was brought to 200 μL with a solution of 0.02 M Tris-HCl (pH 7.5). To construct a calibration curve for the activity of antiprotease leupetin, two-fold dilutions of the test condensate in a volume of 50 μl were prepared, starting from a dilution of 1/40, by two-fold dilutions in 0.02 M Tris-HCl (pH 7.5). Each well was filled with 50 μl of buffer containing 0.3 μg of trypsin. This amount of trypsin is determined based on the values obtained for dilutions of trypsin, inducing OP405 (in the optimal range of 0.5-1.5). Further, according to the protocol (table 2), water, the chromogenic substrate BAPNA are sequentially added and incubated for an hour at 35 ° C. The reaction is stopped by the addition of 35% acetic acid and the optical density (OD) is determined at 405 nm on a BioRad Model 550 spectrophotometer. The results are shown in Fig. five.
50% ингибирование трипсина наблюдалось при содержании леупептина около 0,003-0,0017 мкгр. Таким образом, леупептин после распыления сохранял ферментативную активность, близкую начальному уровню в исходном аэрозольном составе.50% inhibition of trypsin was observed at a leupeptin content of about 0.003-0.0017 μg. Thus, after spraying, leupeptin retained its enzymatic activity close to the initial level in the initial aerosol composition.
Пример 6. Оценка анти-протеазной активности апротинина в генерируемом аэрозоле при сборе в присутствии поверхностно-активных соединенийExample 6. Evaluation of the anti-protease activity of aprotinin in the generated aerosol when collected in the presence of surfactants
При тестировании ряда фармацевтических веществ возможна их агрегация в процессе конденсирования аэрозольного препарата. С этой целю в емкость для сбора конденсата потребуется добавление поверхностно активных соединений. С этой целью в пробирку объемом 10 мл вносили 150 мкл буфера, содержащего 0,03 М Трис-HCl (рН 7,5), 50% диметилсульфоксида, 20% твин-20. Аэрозольный состав апротинина готовился по прописи в разделе 2. Содержимое аэрозольного баллончика выпускали в приготовленную емкость посредством 25 выпусков и конденсат собирали на дно пробирки центрифугированием при 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 20°С при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта), затем объем конденсата доводили до 350 мкл раствором 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5).When testing a number of pharmaceutical substances, their aggregation is possible during the condensation of an aerosol preparation. For this purpose, the addition of surface active compounds will be required in the condensate collection tank. For this purpose, 150 μl of a buffer containing 0.03 M Tris-HCl (pH 7.5), 50% dimethyl sulfoxide, 20% tween-20 was introduced into a 10 ml test tube. The aerosol composition of aprotinin was prepared according to the prescription in
Для построения калибровочной кривой апротинина готовили двукратные разведения исследуемого конденсата в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1/40, путем двукратных разведений в 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). В каждую лунку вносили 50 мкл буфера, содержащего 0,3 мкг трипсина. Это количество трипсина определено на основании полученных значений для разведений трипсина, индуцирующее ОП405 (в оптимальном диапазоне 0,5-1,5). Согласно данным тестирования такой дозой 50% ингибирования в условиях протокола реакции служила доза 0,3 мкг трипсина на пробу. Далее согласно протоколу (таблица 2) последовательно прибавляют воду, хромогенный субстрат БАПНА и инкубируют в течение часа при 35°С. Реакцию останавливают прибавлением 35% уксусной кислоты и определяют оптическую плотность (ОП) при 405 нм на спектрофотометре BioRad Model 550. Результаты показаны на рис. 6.To construct the calibration curve of aprotinin, two-fold dilutions of the investigated condensate in a volume of 50 μl were prepared, starting from a dilution of 1/40, by two-fold dilutions in 0.02 M Tris-HCl (pH 7.5). Each well was filled with 50 μl of buffer containing 0.3 μg of trypsin. This amount of trypsin is determined based on the values obtained for dilutions of trypsin, inducing OP405 (in the optimal range of 0.5-1.5). According to the test data, such a dose of 50% inhibition under the conditions of the reaction protocol was a dose of 0.3 μg of trypsin per sample. Further, according to the protocol (table 2), water, the chromogenic substrate BAPNA are sequentially added and incubated for an hour at 35 ° C. The reaction is stopped by the addition of 35% acetic acid and the optical density (OD) is determined at 405 nm on a BioRad Model 550 spectrophotometer. The results are shown in Fig. 6.
Испытуемый раствор вызывал 50% ингибирование трипсина при разведении около 1/800 в условиях реакции (показана стрелкой). Согласно формуле расчета активности апротинина в препарате, как описано в разделе 2, общая активность апротинина в конденсате аэрозольного апротинина в количестве 40 выпусков составила 3640 КИЕ, что составляло около 93% от расчетного значения по прописи приготовления состава.The test solution caused 50% inhibition of trypsin at a dilution of about 1/800 under the reaction conditions (arrowed). According to the formula for calculating the activity of aprotinin in the preparation, as described in
Пример 7. Оценка содержания рибавирина в генерируемом пропеллентном аэрозолеExample 7. Evaluation of the content of ribavirin in the generated propellant aerosol
Рибавирин (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) обладает антивирусной активностью в отношении широкого спектра вирусов. Аэрозольный состав готовили с водным раствором рибавирина, смешанного с пропеллентом 134А, глицерином и спиртом в соотношении веществ: пропеллент А134 (13 мл); этанол (1,35 мл), глицерин (2,5 мл), рибавирин (10,0 мг; 0,8 мл водного раствора). Аэрозольный состав готовили в устройстве с дозирующим клапаном (60 мкл в одном выпуске) с распыляющим отверстием 0,3 мм. Содержание рибавирина в аэрозольном конденсате по интенсивности поглощения в ультрафиолетовом диапазоне при длине волны 270 нм. Нулевым стандартом сравнения служил водный раствор 75% глицерола и деионизованная вода.Ribavirin (1 - [(2R, 3R, 4S, 5R) -3,4-dihydroxy-5- (hydroxymethyl) oxolan-2-yl] -1H-1,2,4-triazole-3-carboxamide) has antiviral activity against a wide range of viruses. An aerosol composition was prepared with an aqueous solution of ribavirin mixed with propellant 134A, glycerin and alcohol in the ratio of substances: propellant A134 (13 ml); ethanol (1.35 ml), glycerin (2.5 ml), ribavirin (10.0 mg; 0.8 ml aqueous solution). An aerosol formulation was prepared in a device with a metering valve (60 μL per outlet) with a 0.3 mm spray hole. The content of ribavirin in aerosol condensate by the intensity of absorption in the ultraviolet range at a wavelength of 270 nm. The zero reference standard was an aqueous solution of 75% glycerol and deionized water.
Содержимое аэрозольного баллончика выпускали в емкость посредством 25 выпусков и конденсат собирали на дно пробирки центрифугированием при 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 20°С при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта), затем объем конденсата доводили до 200 мкл деионизованной водой. Для построения количественной калибровочной кривой готовили растворы с различной концентрацией рибавирина в диапазоне 0,005-5,0 мг на мл. Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре ULTRASPEC II (LKB) при 270 нм в кюветах 0,5 мл. Результаты показаны на рис. 7.The contents of the aerosol can was discharged into the container through 25 outlets and the condensate was collected at the bottom of the tube by centrifugation at 1500 rpm for 2 minutes. Then the condensate was incubated for 30 min at a temperature of 20 ° C with constant shaking (to evaporate the residues of the propellant and alcohol), then the volume of the condensate was brought to 200 μL with deionized water. To construct a quantitative calibration curve, solutions were prepared with different concentrations of ribavirin in the range of 0.005-5.0 mg per ml. Optical density (OD) was measured on an ULTRASPEC II (LKB) spectrophotometer at 270 nm in 0.5 ml cuvettes. The results are shown in Fig. 7.
На основании сравнения с калибровочной кривой, полученной для маркерных растворов рибавирина, установлено, что концентрация рибавирина в конденсате составляла около 91% от его содержания, полученного расчетным способом согласно прописи приготовления аэрозольного состава и распыляемого объема в одном выпуске.Based on a comparison with the calibration curve obtained for marker solutions of ribavirin, it was found that the concentration of ribavirin in the condensate was about 91% of its content obtained by calculation according to the recipe for preparing the aerosol composition and the sprayed volume in one release.
Пример 8. Оценка структуры апротинина в генерируемом аэрозоле при сборе в присутствии поверхностно-активных соединений при рН 11,5Example 8. Evaluation of the structure of aprotinin in the generated aerosol when collected in the presence of surfactants at pH 11.5
Для исследования структуры вещества белковой природы использовали аэрозольный состав, приготовленный с водным раствором природного ингибитора протеаз (апротинина), смешанного с пропеллентом 134А, глицерином и спиртом в соотношении веществ: пропеллент А134 (0,047 мл); этанол (0,0075 мл), глицерол (0,0035 мл), апротинин (0,0005 мл; 95 КИЕ). Содержимое баллончика в объеме 40 аэрозольных порций выпускали в коническую пробирку объемом 10 мл, содержащую 200 мкл 0,04 М Трис-HCl (рН 11,5) и 50% ДМСО, сформировавшийся конденсат собирали на дно пробирки при центрифугировании 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 37°С при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта). Структуру апротинина тестировали по подвижности в геле в высокоразрешающем электрофорезе в полиакриламидном геле (ПАГе), содержащем додецил-сульфат натрия (ДСН), в Трис-глициновой буферной системе Laemmli (1970) [7]. Для анализа на гель наносили 10 мкл испытуемого конденсата, в который вносили 6 мкл диссоциирующего буферного раствора, содержащего 10% додецил сульфата натрия и 5% меркаптоэтанола, для полной диссоциации молекул апротинина и разрыва всех дисульфидных связей. Полученные образцы прогревали при температуре 75°С в течение 10 мин для лучшей диссоциации молекул апротинина. Пробы наносили в лунки из 3,5% фокусирующего полиакриламидного геля, расположенного над 12% разделительным гелем, и проводили электрофорез в электрическом поле при 50V на гель в течение 3 часов.To study the structure of a proteinaceous substance, an aerosol composition was used prepared with an aqueous solution of a natural protease inhibitor (aprotinin) mixed with a 134A propellant, glycerin and alcohol in a substance ratio: A134 propellant (0.047 ml); ethanol (0.0075 ml), glycerol (0.0035 ml), aprotinin (0.0005 ml; 95 KIE). The contents of the can in a volume of 40 aerosol portions were released into a 10 ml conical tube containing 200 μl of 0.04 M Tris-HCl (pH 11.5) and 50% DMSO, the formed condensate was collected at the bottom of the tube by centrifugation at 1500 rpm for 2 minutes. Then the condensate was incubated for 30 min at 37 ° C with constant shaking (to evaporate the residues of the propellant and alcohol). The structure of aprotinin was tested for mobility in a gel in high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAG) containing sodium dodecyl sulfate (SDS) in a Laemmli Tris-glycine buffer system (1970) [7]. For analysis, 10 μL of the test condensate was applied to the gel, into which 6 μL of a dissociating buffer solution containing 10% sodium dodecyl sulfate and 5% mercaptoethanol was added to completely dissociate aprotinin molecules and break all disulfide bonds. The samples obtained were heated at a temperature of 75 ° C for 10 min for better dissociation of aprotinin molecules. Samples were applied to wells of 3.5% focusing polyacrylamide gel, located over a 12% separating gel, and electrophoresis was performed in an electric field at 50V on the gel for 3 hours.
После электрофореза пластину геля фиксировали в водном растворе, содержащем 50% этанола и 10% уксусной кислоты. После фиксации гель окрашивали в течение 2 часов в 0,02% растворе Кумаси голубого G-250, приготовленного на растворе, содержащем 40% этанола и 10% уксусной кислоты. На рисунке 8 показаны результаты тестирования.After electrophoresis, the gel plate was fixed in an aqueous solution containing 50% ethanol and 10% acetic acid. After fixation, the gel was stained for 2 hours in 0.02% Kumasi blue G-250 solution prepared in a solution containing 40% ethanol and 10% acetic acid. Figure 8 shows the test results.
Результат анализа в ПАГе показывают, что после аэрозольного распыления и конденсирования в растворе с рН 11,5, содержащем 50% ДМСО, апротинин сохранял свои нативные свойства и имел подвижность стандартного апротинин, при этом не наблюдалось побочных продуктов деградации и высокомолекулярных продуктов агрегации.The results of the analysis in PAG show that after aerosol spraying and condensation in a solution with pH 11.5 containing 50% DMSO, aprotinin retained its native properties and had the mobility of standard aprotinin, while no degradation by-products and high-molecular aggregation products were observed.
Пример 9. Оценка антипротеазной активности апротинина в генерируемом аэрозоле «мягкого облака» (система «Респимат»)Example 9. Evaluation of the antiprotease activity of aprotinin in the generated "soft cloud" aerosol ("Respimat" system)
Устройство респимат заполняли через картридж водным раствором, содержащим 7000 КИЕ/мл апротинина, 3% глицерина, 3% этанола, согласно инструкции к устройству респимат (Boehringer Inhelheim, Германия). Полученный аэрозольный препарат выпускали в пробирку объемом 50 мл в количестве 30 пусков и собирали при центрифугировании 1500 об/мин в течение 2 мин, Аэрозольный конденсат инкубировали в течение 15 мин, при температуре 25°С при периодическом встряхивании (для испарения остатков этанола) и добавляли 150 мкл раствора 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). Для тестирования антипротеазной активности полученного конденсата готовили двукратные разведения в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1/10. В каждую лунку вносили 50 мкл буфера, содержащего 0,3 мкг трипсина. Далее согласно протоколу (таблица 2) последовательно прибавляли воду, хромогенный субстрат БАПНА и инкубировали в течение часа при 35°С. Реакцию останавливали прибавлением 35% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность (ОП) при 405 нм на спектрофотометре BioRad Model 550. Результаты показаны на рис. 9.The Respimat device was filled through a cartridge with an aqueous solution containing 7000 KIE / ml aprotinin, 3% glycerol, 3% ethanol, according to the instructions for the Respimat device (Boehringer Inhelheim, Germany). The resulting aerosol preparation was released into a 50 ml test tube in the amount of 30 starts and collected by centrifugation at 1500 rpm for 2 min, the aerosol condensate was incubated for 15 min at a temperature of 25 ° C with periodic shaking (to evaporate ethanol residues) and added 150 μl of 0.02 M Tris-HCl solution (pH 7.5). To test the antiprotease activity of the resulting condensate, two-fold dilutions were prepared in a volume of 50 μl, starting with a dilution of 1/10. Each well was filled with 50 μl of buffer containing 0.3 μg of trypsin. Then, according to the protocol (table 2), water and the chromogenic substrate BAPNA were sequentially added and incubated for an hour at 35 ° C. The reaction was stopped by the addition of 35% acetic acid and the optical density (OD) was determined at 405 nm on a BioRad Model 550 spectrophotometer. The results are shown in Fig. nine.
Как видно на рисунке, апротинин в аэрозольном конденсате сохранял свою антипротеазную активность и на 96% ингибировал активность трипсина.As can be seen in the figure, aprotinin in aerosol condensate retained its antiprotease activity and inhibited trypsin activity by 96%.
Пример 10. Оценка содержания фавипиравира в генерируемом аэрозоле «мягкого облака» (система «Респимат»)Example 10. Evaluation of the content of favipiravir in the generated "soft cloud" aerosol ("Respimat" system)
Устройство респимат заполняли через картридж водным раствором, содержащим 3 мг/мл фавипиравира (6-флюоро-3-гидроксипиразин-2-карбоксамид), 3% глицерина, 3% этанола, 0,5% ДМСО, согласно инструкции к устройству респимат (Boehringer Inhelheim, Германия). Полученный аэрозольный состав выпускали в пробирку объемом 50 мл в количестве 25 пусков и собирали центрифугированием. Аэрозольный конденсат инкубировали в течение 20 мин, при температуре 25°С при периодическом встряхивании (для испарения остатков этанола) и добавляли 150 мкл 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). Для построения количественной калибровочной кривой готовили растворы с различной концентрацией фавипиравира в диапазоне 0,005-15,0 мг/мл. Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре ULTRASPEC II (LKB) при длине максимального поглощения 360 нм. Результаты показаны на рис. 10.The Respimat device was filled through a cartridge with an aqueous solution containing 3 mg / ml favipiravir (6-fluoro-3-hydroxypyrazine-2-carboxamide), 3% glycerol, 3% ethanol, 0.5% DMSO, according to the instructions for the Respimat device (Boehringer Inhelheim , Germany). The resulting aerosol composition was released into a 50 ml test tube in the amount of 25 runs and collected by centrifugation. The aerosol condensate was incubated for 20 min at a temperature of 25 ° C with periodic shaking (to evaporate the residual ethanol), and 150 μl of 0.02 M Tris-HCl (pH 7.5) was added. To construct a quantitative calibration curve, solutions were prepared with different concentrations of favipiravir in the range of 0.005-15.0 mg / ml. Optical density (OD) was measured on an ULTRASPEC II (LKB) spectrophotometer at a maximum absorbance of 360 nm. The results are shown in Fig. 10.
На основании сравнения с калибровочной кривой, полученной для маркерных растворов фавипиравира, установлено, что концентрация рибавирина в конденсате составляла около 94% от его содержания, полученного расчетным способом на основании прописи приготовления аэрозольного состава и распыляемого объема в одном выпуске.Based on a comparison with the calibration curve obtained for marker solutions of favipiravir, it was found that the concentration of ribavirin in the condensate was about 94% of its content obtained by calculation based on the recipe for preparing the aerosol composition and the sprayed volume in one release.
Источники литературыLiterature sources
1. Ganderton D, Lewis D, Davies R, Meakin B, Brambilla G, Church T. 2002. Modulite: a means of designing the aerosols generated by pressurized metered dose inhalers. Respir Med. 96 Suppl D: S3-8.1. Ganderton D, Lewis D, Davies R, Meakin B, Brambilla G, Church T. 2002. Modulite: a means of designing the aerosols generated by pressurized metered dose inhalers. Respir Med. 96 Suppl D: S3-8.
2. Мещерякова H.H. 2006. Модулит - новая технология в дозированных аэрозольных ингаляторах. Ингаляционная терапия. Атмосфера. Пульмонология и аллергология. №2, 40-42.2. Meshcheryakova H.H. 2006. Modulite - a new technology in metered-dose aerosol inhalers. Inhalation therapy. Atmosphere. Pulmonology and Allergology. No. 2, 40-42.
3. Терехова Е.П. 2014. Ингаляционные устройства, применяемые для лечения бронхиальной астмы. Практическая Пульмонология. №4, стр. 45-52.3. Terekhova E.P. 2014. Inhalation devices used to treat bronchial asthma. Practical Pulmonology. No. 4, pp. 45-52.
4. Black D.L., McQuay M.Q., M.P.Bonin. 1996. Laser-based techniques for particle-size measurement: A review of sizing methods and their industrial applications. Progress in Energy and Combustion Science. Vol. 22 (3), pages 267-306.4. Black D.L., McQuay M.Q., M. P. Bonin. 1996. Laser-based techniques for particle-size measurement: A review of sizing methods and their industrial applications. Progress in Energy and Combustion Science. Vol. 22 (3), pages 267-306.
5. Davies, N.M. and M.R. Feddah, 2003. A novel method for assessing dissolution of aerosol inhaler products. Int. J. Pharm., 255: 175-187.5. Davies, N.M. and M.R. Feddah, 2003. A novel method for assessing dissolution of aerosol inhaler products. Int. J. Pharm. 255: 175-187.
6. Dolovich, M., 1991. Measurement of particle size characteristics of metered dose inhaler (MDI) aerosols. J. Aerosol Med., 4: 251-263.6. Dolovich, M., 1991. Measurement of particle size characteristics of metered dose inhaler (MDI) aerosols. J. Aerosol Med. 4: 251-263.
7. Laemmli U. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970). https://doi.org/10.1038/227680a07. Laemmli U. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970). https://doi.org/10.1038/227680a0
Claims (3)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020119330A RU2750933C1 (en) | 2020-06-10 | 2020-06-10 | Method for testing the biological activity of aerosol preparations |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020119330A RU2750933C1 (en) | 2020-06-10 | 2020-06-10 | Method for testing the biological activity of aerosol preparations |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2750933C1 true RU2750933C1 (en) | 2021-07-06 |
Family
ID=76755928
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020119330A RU2750933C1 (en) | 2020-06-10 | 2020-06-10 | Method for testing the biological activity of aerosol preparations |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2750933C1 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2425691C1 (en) * | 2010-07-15 | 2011-08-10 | ВАКЕ спол с.р.о. | Aprotinin aerosol for treating viral respiratory infections |
-
2020
- 2020-06-10 RU RU2020119330A patent/RU2750933C1/en active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2425691C1 (en) * | 2010-07-15 | 2011-08-10 | ВАКЕ спол с.р.о. | Aprotinin aerosol for treating viral respiratory infections |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ABDO R.W. et al. Quality control and testing evaluation of pharmaceutical aerosols // Advances in Pharmaceutical Product Development and Research, 2019, pp.579-614. * |
SANTARPIA J.L. et al. Laboratory study of bioaerosols: Traditional test systems, modern approaches, and environmental control // AEROSOL SCIENCE AND TECHNOLOGY, 2019, V 54, pp.585-600. * |
SANTARPIA J.L. et al. Laboratory study of bioaerosols: Traditional test systems, modern approaches, and environmental control // AEROSOL SCIENCE AND TECHNOLOGY, 2019, V 54, pp.585-600. ABDO R.W. et al. Quality control and testing evaluation of pharmaceutical aerosols // Advances in Pharmaceutical Product Development and Research, 2019, pp.579-614. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2711080C2 (en) | Combined aerosol composition based on protease inhibitors and preparation thereof | |
CA2190763A1 (en) | Fluticasone propionate formulations | |
Scherer et al. | A technical feasibility study of dornase alfa delivery with eFlow® vibrating membrane nebulizers: aerosol characteristics and physicochemical stability | |
US20190031730A1 (en) | Formulation of mk2 inhibitor peptides | |
RU2750933C1 (en) | Method for testing the biological activity of aerosol preparations | |
JP2011501686A (en) | Enriched nanostructure composition | |
CN102655876B (en) | Composition, method, and kit for alpha-1 proteinase inhibitor | |
CN110272863A (en) | A kind of dry cell model and its method for building up and application | |
RU2189231C1 (en) | Emulsion preparation for prophylaxis of respiratory viral infections | |
RU2657523C2 (en) | Pharmaceutical aerosol composition of protease inhibitors with ozone-preserving propellant and its preparation | |
CN115427076A (en) | Human deubiquitinase inhibitors for the treatment of coronavirus infections | |
CN104255830A (en) | Multifunctional herbal health-benefiting mosquito-repellent liquid aromatic and preparing method thereof | |
US6436344B1 (en) | Method of inactivating pathogens | |
US6756368B1 (en) | Use of cobalt chelates for treating or preventing virus infection | |
RU2781097C1 (en) | Pharmaceutical aerosol composition of polyvalent action | |
Negi et al. | Disruption mechanisms of enveloped viruses by ionic and nonionic surfactants | |
RU2526504C1 (en) | Method of evaluation of antivariolic activity of therapeutic and prophylactic preparations | |
Scherließ et al. | Novel formulation concept for particulate uptake of vaccines via the nasal associated lymphoid tissue | |
Gooran et al. | Unraveling the Biophysical Mechanisms of How Antiviral Detergents Disrupt Supported Lipid Membranes: Toward Replacing Triton X-100 | |
JP2015521157A (en) | Method for increasing CFTR activity | |
Zaczynska et al. | Obtaining and determining antiviral and antibacterial activity of S-esters of 4-R-aminobenzenethiosulfonic acid | |
WO1995025539A1 (en) | Novel remedy for respiratory-tract viral disease | |
Rothe | Expression, purification and biophysical characterization of SARS-CoV-2 non-structural protein 6 | |
DE202012013134U1 (en) | Pharmaceutical aerosol formulation of protease inhibitors and their preparation | |
Pastenkos | Bovine Herpesvirus 1 Entry by a Low Ph-Dependent, Endocytic Pathway |